JP2014085530A - 撮像装置及び顕微鏡システム - Google Patents

Abstract

【課題】顕微鏡の光学出力ポートに連結するだけで透明試料の位相分布データを取得できる撮像装置を提供すること。
【解決手段】本発明の撮像装置の一例は、顕微鏡（１）の光学出力ポート（１００Ａ）に連結される撮像装置（１００）であって、前記顕微鏡（１）からの結像光束を２つの分岐光束に分岐する分岐手段（１０１）と、前記２つの分岐光束の一方を参照光束とし、他方を物体光束として干渉縞を生成する干渉手段（１０２、１０４）と、前記干渉縞を撮像して縞画像を生成する撮像手段（１０５）とを備える。
【選択図】 図１

Description

本発明は、顕微鏡に適用される撮像装置、及びそれを備えた顕微鏡システムに関する。

生体細胞を顕微鏡（特許文献１など）で観察するには、透明な物体を観察できる位相差観察、暗視野観察、微分干渉観察、蛍光観察が有効である。

しかしながら、位相差観察、暗視野観察、微分干渉観察は、透明試料中に存在する位相物体の輪郭を可視化できるものの、位相物体の位相分布自体を可視化できる訳ではない。

また、蛍光観察は、透明試料の特定部位を予め染色しておく必要があり、また、蛍光観察で可視化できるのは、特定部位の蛍光強度分布であって、特定部位の位相分布ではない。

特開２００２?１７４７７２号公報

そこで本発明は、顕微鏡の光学出力ポートに連結するだけで透明試料の位相分布データを取得できる撮像装置及びそれを備えた顕微鏡システムを提供する。

なお、顕微鏡の光学出力ポートとは、撮像ユニット等への連結口であって、顕微鏡で生成された結像光束（＝試料の光学像を表す光束）が射出するポートのことである。

本発明の撮像装置の一例は、顕微鏡の光学出力ポートに連結される撮像装置であって、前記顕微鏡からの結像光束を２つの分岐光束に分岐する分岐手段と、前記２つの分岐光束の一方を参照光束とし、他方を物体光束として干渉縞を生成する干渉手段と、前記干渉縞を撮像して縞画像を生成する撮像手段とを備える。

本発明の顕微鏡システムの一例は、前記顕微鏡と、本発明の撮像装置の一例とを備える。

本発明によれば、顕微鏡の光学出力ポートに連結するだけで透明物体の位相分布データを取得できる撮像装置及びそれを備えた顕微鏡システムが実現する。

顕微鏡システムの全体図である。 ホログラフィ観察時の顕微鏡システム（第１実施形態のホログラフィユニット１００）を詳しく説明する図である。 演算処理の手順を説明する図である。 第２実施形態のホログラフィユニット１００の構成を示す図である。 第３実施形態のホログラフィユニット３００の構成を示す図である。

［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態として顕微鏡システムを説明する。ここでは、このシステムは、明視野観察、暗視野観察、位相差観察、微分干渉観察、蛍光観察、ホログラフィ観察が可能に構成された顕微鏡システムを例に挙げる。

図１は、顕微鏡システムの全体図である。図１に示すとおり顕微鏡システムは、顕微鏡本体１と、透過照明ユニット２と、落射照明ユニット３と、撮像ユニット８と、ホログラフィユニット１００と、レーザユニット２００とを備える。透過照明ユニット２、落射照明ユニット３、撮像ユニット８、ホログラフィユニット１００、レーザユニット２００は、顕微鏡システムのポート２Ａ、３Ａ、８Ａ、１００Ａ、２００Ａを介して顕微鏡本体１に連結される。

このうち、ポート８Ａ、２００Ａは、光学出力ポートであって、特に、ポート２００Ａは、顕微鏡本体１の側面に位置するサイドポートである。

また、顕微鏡本体１の各部には、フィルタ・プリズムセット３０、蛍光フィルタブロック４３、フィルタ・プリズムセット６０が装着可能である。また、顕微鏡本体１の各部には、光路切り換え用の可動ミラー２８、４８、５７が搭載されている。

フィルタ・プリズムセット３０は、微分干渉観察時に透過照明光路の瞳共役面に挿入される。フィルタ・プリズムセット３０は、偏光子と微分干渉プリズムとを組み合わせたものである。

フィルタ・プリズムセット６０は、微分干渉観察時に観察光路の瞳共役面に挿入される。フィルタ・プリズムセット６０は、微分干渉プリズムと検光子とを組み合わせたものである。

蛍光フィルタブロック４３は、蛍光観察時に落射照明光路と観察光路との分岐箇所へ挿入される。蛍光フィルタブロック４３は、ダイクロイックミラー４５に励起フィルタ４４とバリアフィルタ４６とを組み合わせたものである。

可動ミラー２８は、レーザユニット２００と透過照明ユニット２との間の切り換えを行う。可動ミラー２８が光路へ挿入されると、透過照明ユニット２が有効となり、可動ミラー２８が離脱すると、レーザユニット２００が有効となる。

可動ミラー４８は、ホログラフィユニット１００と撮像ユニット８との間の切り換えを行う。可動ミラー４８の反射面の姿勢が図１に実線で示す姿勢（ホログラフィモード）に設定されると、ホログラフィユニット１００が有効となり、図１に点線で示す姿勢（通常モード）に設定されると、撮像ユニット８が有効となる。

可動ミラー５７は、必要に応じて双眼部７を有効にする。可動ミラー５７が光路へ挿入された状態では撮像ユニット８が有効であるが、可動ミラー５７が光路から離脱されると撮像ユニット８が無効となり、双眼部７による肉眼観察が可能となる。

また、顕微鏡本体１には、複数種類のコンデンサレンズ３２−１、３２−２、３２−３が装着されており、このうち１つのコンデンサレンズが顕微鏡本体１の光路へ挿入される。ここでは、コンデンサレンズ３２−１は、明視野観察、微分干渉観察、ホログラフィ観察（後述）に使用可能なコンデンサレンズであり、コンデンサレンズ３２−２は、暗視野観察用のコンデンサレンズ（暗視野コンデンサレンズ）であり、コンデンサレンズ３２−３は、位相差観察用のコンデンサレンズ（位相差コンデンサレンズ）であると仮定する。

また、顕微鏡本体１の不図示のステージには、標本３３が配置されている。標本３３は、透明試料であって、例えば、生体細胞を含む培養液が滴下されたプレパラートである。このような標本３３は、可視光に対してほぼ透明であるので、暗視野観察、位相差観察、微分干渉観察、蛍光観察、ホログラフィ観察が有効である。なお、蛍光観察を行う場合は、生体細胞の特定部位が蛍光色素で予め染色されている必要がある。

また、顕微鏡本体１には、複数種類の対物レンズ３４−１、３４−２、３４−３が装着されており、このうち１つの対物レンズが顕微鏡本体１の光路へ挿入される。ここでは、対物レンズ３４−１は、明視野観察、暗視野観察、微分干渉観察、蛍光観察、ホログラフィ観察に使用可能な対物レンズであり、対物レンズ３４−２は、位相差観察用の対物レンズ（位相差対物レンズ）であると仮定する。

透過照明ユニット２は、明視野観察、暗視野観察、位相差観察、微分干渉観察に使用される。透過照明ユニット２には、ハロゲンランプや水銀ランプなどの光源２１と、コレクタレンズ２２と、シャッタ２３と、リレーレンズ２４と、フィルタ２５と、リレーレンズ２６と、視野絞り２７とを備える。フィルタ２５は、光量を制限するＮＤフィルタ、色温度を制御するＮＣＢフィルタ、波長を制限する干渉フィルタなどである。これらのフィルタの各々は、必要に応じて光路に対して挿脱される。

落射照明ユニット３は、蛍光観察に使用される。落射照明ユニット３には、水銀ランプなどの光源３５と、コレクタレンズ３６と、シャッタ３７と、リレーレンズ３８と、開口絞り３９と、リレーレンズ４０と、視野絞り４１と、４２と、フィールドレンズ４２とが備えられる。

レーザユニット２００は、ホログラフィ観察に使用される。レーザユニット２００には、レーザ光源が備えられる。なお、図１では、レーザユニット２００におけるレーザ光源の数を１としたが、２以上として、レーザ波長を可変としてもよい。また、レーザユニット２００と顕微鏡本体１とは図１のとおり直接連結されてもよいし、光ファイバやリレーレンズなどを介して連結されてもよい。

ホログラフィユニット１００は、ホログラフィ観察に使用される。ホログラフィユニット１００には、回折格子１０１、リレーレンズ１０２、空間フィルタ１０３、リレーレンズ１０４、ＣＣＤやＣＭＯＳなどで構成された撮像素子１０５が備えられる。ホログラフィユニット１００の詳細は、後述する。

＜明視野観察＞
以下、明視野観察時の顕微鏡システムを説明する。

明視野観察時は、透過照明ユニット２が使用されるので、可動ミラー２８が光路へ挿入される。また、明視野観察時は、ホログラフィユニット１００は使用されないので、可動ミラー４８の姿勢は通常モード（点線）に設定される。また、明視野観察時は、明視野観察に使用可能なコンデンサレンズ３２−１、対物レンズ３４−１が光路に挿入される。また、透過照明ユニット２の光源２１としてはハロゲンランプがセットされ、透過照明ユニット２からの射出光が白色光となるようにフィルタ２５がセットされる。

透過照明ユニット２の光源２１から射出した光は、コレクタレンズ２２、シャッタ２３、リレーレンズ２４、フィルタ２５、リレーレンズ２６、視野絞り２７を介して顕微鏡本体１へ入射する。顕微鏡本体１へ入射した光は、可動ミラー２８を反射し、フィールドレンズ２９、開口絞り３１、コンデンサレンズ３２−１を介して標本３３を照明する。標本３３を透過した光は、対物レンズ３４−１、第２対物レンズ４７、可動ミラー４８、リレーレンズ４９、光路折り曲げミラー５０、リレーレンズ５１、可動ミラー５７、第２の結像レンズ５８を介して、撮像ユニット８の撮像素子５９に標本３３の明視野像を形成する。撮像素子５９は不図示のモニタに接続されており、撮像素子５９が取得する画像（明視野画像）は、取得順にモニタへ表示される。

＜暗視野観察＞
以下、暗視野観察時の顕微鏡システムを説明する。

暗視野観察時は、コンデンサレンズとして暗視野コンデンサレンズ３２−２が使用される点以外は、明視野観察時と同じである。この状態で撮像素子５９は暗視野画像を取得する。

＜位相差観察＞
以下、位相差観察時の顕微鏡システムを説明する。

位相差観察時は、コンデンサレンズとして位相差コンデンサレンズ３２−３が使用され、対物レンズとして位相差対物レンズ４３−２が使用される点以外は、明視野観察時と同じである。但し、透過照明ユニット２の光源２１としては水銀ランプがセットされ、透過照明ユニット２からの射出光が単色光となるようにフィルタ２５がセットされる。この状態で撮像素子５９は位相差画像を取得する。

＜微分干渉観察＞
以下、微分干渉観察時の顕微鏡システムを説明する。

微分干渉観察時は、フィルタ・プリズムセット３０、６０が光路へ挿入される点以外は、明視野観察時と同じである。但し、透過照明ユニット２の光源２１としては水銀ランプがセットされ、透過照明ユニット２から射出する光の種類は単色光に設定される。この状態で撮像素子５９は微分干渉が像を取得する。

＜蛍光観察＞
以下、蛍光観察時の顕微鏡システムを説明する。

蛍光観察時は、蛍光フィルタブロック４３が光路へ挿入される。また、蛍光観察時は、ホログラフィユニット１００は使用されないので、可動ミラー４８の姿勢は通常モード（点線）に設定される。また、蛍光観察時は、対物レンズ３４−１が光路に挿入される。また、蛍光観察時は、レーザユニット２００及び透過照明ユニット２はオフされる（レーザユニット２００又は透過照明ユニット２からの射出光は顕微鏡本体１へ入射しない。）。

落射照明ユニット３の光源３５から射出した光は、コレクタレンズ３６、シャッタ３７、リレーレンズ３８、開口絞り３９、リレーレンズ４０、視野絞り４１、フィールドレンズ４２を介して顕微鏡本体１へ入射する。顕微鏡本体１へ入射した光は、蛍光用フィルタブロック４３の励起フィルタ４４を介して蛍光フィルタブロック４３のダイクロイックミラー４５へ入射すると、ダイクロイックミラー４５を反射し、対物レンズ３４−１を介して標本３３を照射する。この照射により標本３３で発生した蛍光は、対物レンズ３４−１を介して蛍光フィルタブロック４３のダイクロイックミラー４５へ入射すると、ダイクロイックミラー４５を透過し、蛍光フィルタブロック４３のバリアフィルタ４６を介して第２対物レンズ４７へ入射する。第２対物レンズ４７へ入射した蛍光は、可動ミラー４８、リレーレンズ４９、光路折り曲げミラー５０、リレーレンズ５１、可動ミラー５７、第２の結像レンズ５８を介して、撮像ユニット８の撮像素子５９に標本３３の蛍光像を形成する。撮像素子５９は不図示のモニタに接続されており、撮像素子５９が取得する画像（蛍光画像）は、取得順にモニタへ表示される。

＜ホログラフィ観察＞
以下、ホログラフィ観察時の顕微鏡システムを説明する。

ホログラフィ観察時は、レーザユニット２００が使用されるので、可動ミラー２８が光路から離脱される。また、ホログラフィ観察時は、ホログラフィユニット１００が使用されるので、可動ミラー４８の姿勢はホログラフィモード（実線）に設定される。また、ホログラフィ観察時は、コンデンサレンズ３２−１、対物レンズ３４−１が光路に挿入される。

図２は、ホログラフィ観察時の顕微鏡システム（第１実施形態のホログラフィユニット１００）を詳しく説明する図である。

図２（Ａ）に示すとおり、ホログラフィ観察時、レーザユニット２００のレーザ光源から射出したレーザ光は、顕微鏡本体１へ入射すると、顕微鏡本体１のフィールドレンズ２９の集光作用を受け、開口絞り３１の中心に集光した後、発散光束となってコンデンサレンズ３２−１へ入射する。コンデンサレンズ３２−１へ入射したレーザ光は、コンデンサレンズ３２−１を射出する際に径の太い平行光束となり、標本３３の観察エリアを正面から均一な照度で照明する。

標本３３を通過したレーザ光は、対物レンズ３４−１へ入射すると、対物レンズ３４−１の瞳中心に集光した後、発散光束となって第２対物レンズ４７へ入射する。第２対物レンズ４７へ入射したレーザ光は、第２対物レンズ４７を射出する際に平行光束となる。平行光束となったレーザ光は、可動ミラー４８にて反射し、ホログラフィユニット１００へ入射する。

ホログラフィユニット１００へ入射したレーザ光は、ホログラフィユニット１００の回折格子１０１へ正面から入射する。

ここで、回折格子１０１は、透過型かつ位相型の回折格子である。この回折格子１０１は、光軸に垂直な所定方向（図２の紙面上下方向）にかけて周期構造を有した一方向回折格子であって、その周期構造のタイプはブレーズ型である（図２（Ｂ）を参照。）。

この回折格子１０１は、入射したレーザ光（平行光束）に応じて透過１次回折光束と透過０次回折光束とを発生させる。図２において、回折格子１０１から角度ゼロで射出する光束が透過０次回折光束であり、回折格子１０１から所定角度で射出する光束が透過１次回折光束である。

なお、回折格子１０１の回折効率は、透過１次回折光束及び透過０次回折光束以外の回折光束の強度がほぼゼロとなり、かつ、透過０次回折光束の強度よりも透過１次回折光束の強度の方が高くなるように設定されている。

図２（Ａ）に示すとおり、回折格子１０１から射出した透過１次回折光束及び透過０次回折光束は、リレーレンズ１０２へ入射すると、リレーレンズ１０２の集光作用を受け、瞳共役面Ａの互いに異なる位置に集光する。透過０次回折光束の集光点は光軸上であり、透過１次回折光束の集光点は光軸から離れた位置である。

ここで、瞳共役面Ａには、空間フィルタ１０３が配置されている。空間フィルタ１０３は、所定の開口パターンを有したマスクであって、その開口パターンは、図２（Ｃ）に示すとおり、透過１次回折光束の集光点近傍に位置するピンホール１０３Ａと、透過０次回折光束の集光点近傍に位置する円形開口１０３Ｂとからなる。

ピンホール１０３Ａには、透過１次回折光束を回折し、その光束の波面を理想球面に変換する機能が付与されている。そのために、ピンホール１０３Ａのサイズは十分に小さなサイズに設定されている。

円形開口１０３Ｂには、透過０次回折光束を回折せずに通過させ、かつ、余分な回折光束（回折格子１０１で発生した僅かな透過−１次回折光束及び高次回折光束）をカットする機能が付与されている。そのために、円形開口１０３Ｂのサイズは、透過０次回折光束の断面サイズと同等又は若干大きい程度に設定されている。

したがって、空間フィルタ１０３のピンホール１０３Ａからは、理想球面波に変換された光束が射出し、空間フィルタ１０３の円形開口１０３Ｂからは、標本３３の位相分布に応じた波面形状を有する光束が射出する。

そこで本実施形態のホログラフィユニット１００は、ピンホール１０３Ａから射出した光束を参照光束ＬＲとして使用し、円形開口１０３Ｂから射出した光束を物体光束ＬＯとして使用する。

空間フィルタ１０３から射出した参照光束ＬＲ及び物体光束ＬＯの各々は、リレーレンズ１０４の集光作用を受けて平行光束となり、標本共役面Ｂに対して互いに異なる角度で入射する。標本共役面Ｂに対する物体光束ＬＯの入射角度はゼロであるのに対して、参照光束ＬＲの入射角度は、ゼロ以外の所定値である。なお、標本共役面Ｂに対する参照光束ＬＲの入射角度は、回折格子１０１の構造周期（格子ピッチＰ）、レーザ光の波長λ、リレーレンズ１０２、１０４の焦点距離などによって決まる。

ここで、標本共役面Ｂには、撮像素子１０５の撮像面１０５Ａが位置している。撮像面１０５Ａには、光軸（Ｚ方向）に垂直な所定方向（Ｘ方向）にかけて複数の画素が配列されており、Ｚ方向及びＸ方向の双方に垂直な所定方向（Ｙ方向）にかけても複数の画素が配列されている。

この撮像面１０５Ａには、参照光束ＬＲと物体光束ＬＯとが互いに異なる角度で入射するので、撮像面１０５Ａにおいて参照光束ＬＲと物体光束ＬＯとが重複して入射する領域には、ストライプ状の干渉縞が生起する（図２（Ｄ）を参照。）。

なお、撮像面１０５Ａの光軸周りの回転位置は、図２（Ｄ）に示すとおり、撮像面１０５ＡのＸ方向及びＹ方向が干渉縞の縞方向に対して４５°の角度を成すように設定されている。

撮像素子１０５は、例えば１／３０秒のフレーム周期で干渉縞を繰り返し撮像すると共に、その撮像で生成した縞画像を逐次に演算装置（不図示）へ転送する。

不図示の演算装置は、撮像素子１０５から縞画像が転送されると、その縞画像に対して所定の演算処理（後述）を施すことにより、標本３３のホログラフィ画像（後述）を作成し、そのホログラフィ画像をモニタ（不図示）へ表示する。

なお、不図示の演算装置は、顕微鏡システムに外付けされてもよいし、顕微鏡システムに内蔵されてもよいし、ホログラフィユニット１００に内蔵されてもよい。

また、不図示の演算装置を顕微鏡システムに外付けする場合は、汎用のコンピュータを演算装置として動作させてもよい。その場合は、演算処理（後述）を実行するためのプログラムがコンピュータにインストールされる。なお、コンピュータに対するプログラムのインストールは、インターネットなどの通信網、又は、ＣＤ−ＲＯＭなどの記憶媒体などを介して行われる。

＜数値例＞
以下、第１実施形態の数値例を説明する。

ホログラフィユニット１００が適正な縞画像を生成するためには、干渉縞の縞ピッチと、撮像面１０５Ａの画素ピッチとの関係が適正である必要がある。具体的には、１周期分の縞をおおよそ４画素で検出することが望まれる。

そのためには、回折格子１０１の格子ピッチＰと、リレーレンズ１０２の焦点距離をｆ_１と、リレーレンズ１０４の焦点距離をｆ_２と、撮像面１０５ＡにおけるＸＹ方向の画素ピッチｐとが以下の式（１）を満たす必要がある。

Ｐ＝（ｆ_１／ｆ_２）×４ｐ／（√２） …（１）
また、空間フィルタ１０３のピンホール１０３Ａが良質な参照光束ＬＲを生成するためには、レーザ光の波長λと、回折格子１０１の格子ピッチＰと、リレーレンズ１０２の焦点距離をｆ_１と、光軸からピンホール１０３Ａまでの高さｈとは、以下の式（２）を満たす必要がある。

ｈ＝（√２）・λｆ_１／（４Ｐ） …（２）
また、空間フィルタ１０３の円形開口１０３Ｂが良質な物体光束ＬＯを生成するためには、物レンズ３４−１の倍率βと、対物レンズ３４−１の開口数ＮＡと、円形開口１０３の径φ_３とは、以下の式（３）を満たす必要がある。

φ_３＝２ＮＡ・ｆ_１／β …（３）
そこで、例えば、本数値例では、レーザ光の波長λを４８８ｎｍに設定し、対物レンズ３４−１の開口数ＮＡを０．４５に設定し、対物レンズ３４−１の倍率βを２０に設定し、回折格子１０１の格子ピッチＰを３．３７μｍに設定し、リレーレンズ１０２の焦点距離ｆ_１を５０ｍｍに設定し、リレーレンズ１０４の焦点距離ｆ_２を７０ｍｍに設定し、ピンホール１０３Ａの高さｈを７．３２ｍｍに設定し、円形開口１０３Ｂの径φ_３を２．２５ｍｍに設定し、画素ピッチｐを１．６７μｍに設定した。

因みに、本実施形態では、標本３３における観察エリアの径（視野の径）φ_１を３００μｍに設定し、第２対物レンズ４７の焦点距離ｆ_０を２００ｍｍに設定し、ピンホール１０３Ａの径φ_２を２０μmから３０μmの範囲に設定し、撮像面１０５Ａの有効径φ_４を８ｍｍに設定した。

なお、参照光束ＬＲの波面を良質にするためには、ピンホール１０３Ａの径φ_２を２０μmよりさらに小さくすることが望ましいが、ここでは参照光束ＬＲの強度が或る程度確保され、しかも、空間フィルタ１０３の製造が困難とならないように、φ_２を２０μmから３０μmの範囲とした。

＜演算処理＞
以下、演算装置による演算処理を説明する。

図３は、演算装置による演算処理の手順を説明する図である。以下、演算処理の各ステップを順に説明する。

ステップＳ１：演算装置は、縞画像（図３（Ａ））をＦＦＴによりフーリエ変換し、波数空間で表されたスペクトル画像（図３（Ｂ））を取得する。このスペクトル画像では、波数空間上の原点近傍に０次スペクトルが現れており、波数空間上の原点から外れた位置に±１次スペクトルが現れている。このうち、０次スペクトルは、縞画像のＤＣ成分であって、物体光束ＬＯの波面情報を含まない不要成分である。一方、±１次スペクトルの各々は、物体光束ＬＯの波面情報を含んだ必要成分である。

ここで、波数空間における±１次スペクトルの原点からのシフト量は、干渉縞の空間周波数Ｋに等しく、また、Ｋの値は、回折格子１０１の格子ピッチＰ、レーザ光の波長λ、リレーレンズ１０２、１０４の焦点距離ｆ_１、ｆ_２などによって一義的に決まるので、予め計算しておくことが可能である。そこで、本実施形態の演算装置は、Ｋの値を予め記憶しているものとする。

ステップＳ２：演算装置は、波数空間における±１次スペクトルの一方（１次スペクトル）を切り出すと共に、そのスペクトルを波数空間上でＫだけシフトさせることにより、波数空間上の原点に配置する。これによって、物体光束ＬＯの波面情報のみを含んだスペクトル画像（図３（Ｃ））が得られる。

ステップＳ３：演算装置は、ステップＳ２で取得したスペクトル画像を逆ＦＦＴにより逆フーリエ変換することにより、撮像面１０５Ａにおける物体光束ＬＯの波面形状と、撮像面１０５Ａにおける物体光束ＬＯの振幅分布とを求める。さらに演算装置は、求めた波面形状を、階調画像からなるホログラフィ画像（図３（Ｄ））に変換し、そのホログラフィ画像をモニタへ表示する（以上、ステップＳ３）。

このホログラフィ画像の階調分布は、標本３３の位相分布を表す。つまり、ホログラフィ画像には、標本３３中に存在する細胞の輪郭だけでなく、細胞の位相分布までもが反映されている。

なお、以上のステップＳ１からステップＳ３までの処理に要する時間は、撮像素子１０５のフレーム周期よりも短い。よって、本実施形態の演算装置は、撮像素子１０５から縞画像が転送される度にステップＳ１からステップＳ３までの処理を実行してモニタ上のホログラフィ画像を更新する。

したがって、ユーザは、標本３３中に存在する細胞の位相分布をリアルタイムで観察することができる。

なお、本実施形態の顕微鏡システムは、以上のホログラフィ観察だけでなく、暗視野観察、位相差観察、微分干渉観察、蛍光観察なども可能である。

したがって、ユーザは、暗視野観察、位相差観察、微分干渉観察、蛍光観察などの他の観察方法で標本３３を大まかに観察し、詳細な観察が必要と感じた場合には、ホログラフィユニット１００を有効にセットして、標本３３の位相分布を観察する、といった柔軟な観察を行うことも可能である。

［第１実施形態の作用効果］
以上、本実施形態の撮像装置（１００）は、顕微鏡（１）の光学出力ポート（１００Ａ）に連結される撮像装置であって、前記顕微鏡（１）からの結像光束を２つの分岐光束に分岐する分岐手段（１０１）と、前記２つの分岐光束の一方を参照光束（ＬＲ）とし、他方を物体光束（ＬＯ）として干渉縞を生成する干渉手段（１０２、１０４）と、前記干渉縞を撮像して縞画像を生成する撮像手段（１０５）とを備える。

したがって、本実施形態の撮像装置（１００）によれば、前記顕微鏡（１）の光学出力ポート（１００Ａ）を有効に利用して前記縞画像を取得することができる。この縞画像には、前記物体光束（ＬＯ）の波面形状（ひいては前記顕微鏡（１）にセットされた物体（３３）の位相分布）が反映されている。

また、本実施形態の撮像装置（１００）は、前記撮像手段（１０５）に向かう前記参照光束（ＬＲ）の波面形状を予め決められた形状に整形する整形手段（１０３Ａ）を更に備える。

このように前記参照光束（ＬＲ）の波面形状を整形しておけば、前記物体光束（ＬＯ）の波面形状（ひいては前記物体（３３）の位相分布）を、前記縞画像から簡単に算出することができる。

また、前記分岐手段（１０１）は、ブレーズ型位相回折格子であり、前記回折格子（１０１）で発生した±１次回折光束の一方が前記参照光束（ＬＲ）として使用され、前記回折格子で発生した０次回折光束が前記物体光束（ＬＯ）として使用される。

したがって、前記干渉縞に寄与する前記参照光束（ＬＲ）と前記物体光束（ＬＯ）との強度バランスを確実に制御できる。

また、前記回折格子（１０１）と前記撮像手段（１０５）との間には、前記回折格子（１０１）で発生した余分な回折光束をカットする空間フィルタ（１０３）が配置される。

この空間フィルタ（１０３）によれば、前記縞画像に対するノイズの重畳を抑えることができる。

また、前記空間フィルタ（１０３）には、前記整形手段（１０３Ａ）の機能が搭載されている。

このような空間フィルタ（１０３）を利用すれば、前記撮像装置（１００）に搭載すべき光学素子の点数が抑えられる（因みに、図２の例は、光学素子の点数は、５点に抑えられている。）。

また、前記回折格子（１０１）の回折効率は、前記回折格子（１０１）から射出する前記参照光束（ＬＲ）の強度が前記回折格子（１０１）から射出する前記物体光束（ＬＯ）の強度よりも高くなるように設定されている。

したがって、波面整形時に発生する前記参照光束（ＬＲ）の光量ロスを、補償することができる。また、前記干渉縞に寄与する前記参照光束（ＬＲ）及び前記物体光束（ＬＯ）の強度バランスを適正にすることもできる。

また、前記撮像手段（１０５）の撮像面（１０５Ａ）に対する前記参照光束（ＬＲ）の入射角度と前記物体光束（ＬＯ）の入射角度との差は、ゼロ以外の所定値に設定されており、前記撮像手段（１０５）の撮像面（１０５Ａ）の配置先は、前記顕微鏡（１）の像面と光学的に共役な面（Ｂ）である。

したがって、前記物体（３３）の位相分布を前記縞画像から簡単に算出することができる。

また、前記撮像装置（１００）は、前記縞画像に基づき前記顕微鏡にセットされた物体（３３）の位相分布を算出する演算手段を更に備え、前記演算手段は、前記位相分布をモニタへ表示する。

したがって、ユーザは、前記物体（３３）の位相分布を前記モニタ上で確認できる。

また、前記撮像手段（１０５）及び前記演算手段は、繰り返し動作する。

したがって、前記モニタ上の前記位相分布は、逐次に更新される。よって、ユーザは、前記物体（３３）の位相分布の時間変化をリアルタイム観察することができる。

また、本実施形態の顕微鏡システムは、前記顕微鏡（１）と、前記撮像装置（１００）とを備え、前記顕微鏡（１）には、レーザ光源（２００）が搭載されている。

したがって、前記撮像装置（１００）は、前記縞画像の取得に前記レーザ光源（２００）を有効利用することができる。

因みに、前記レーザ光源（２００）を利用すれば、前記参照光束（ＬＲ）と前記物体光束（ＬＯ）との可干渉性が高まるので、前記縞画像の品質も高まる。

［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態として第１実施形態の変形例を説明する。第１実施形態との相違点は、ホログラフィユニット１００の一部にある。

図４は、第２実施形態のホログラフィユニット１００の構成を示す図である。

図４に示すとおり本実施形態のホログラフィユニット１００は、第１実施形態のホログラフィユニットにおいて、回折格子１０１の代わりに回折格子１０１’を備えたものである。

回折格子１０１’は、回折格子１０１を非ブレーズ型で構成したものである。つまり、回折格子１０１’は、透明基板に溝を周期的に形成したものである。この場合、透過−１次回折光束の強度が透過＋１次回折光束の強度と同様に強くなってしまうので、レーザ光の利用効率が低下するが、安価な回折格子を利用できるという利点がある。

なお、例えば、本実施形態では、レーザ光の波長λを４８８ｎｍに設定し、対物レンズ３４−１の開口数ＮＡを０．４５に設定し、対物レンズ３４−１の倍率βを２０に設定し、回折格子１０１’の格子ピッチＰを４．７２μｍに設定し、リレーレンズ１０２の焦点距離ｆ_１を５０ｍｍに設定し、リレーレンズ１０４の焦点距離ｆ_２を５０ｍｍに設定し、ピンホール１０３Ａの高さｈを５．１６６ｍｍに設定し、円形開口１０３Ｂの径φ_３を２．２５ｍｍに設定し、画素ピッチｐを１．６７μｍに設定した。

また、本実施形態では、標本３３における観察エリアの径（視野の径）φ_１を３００μｍに設定し、第２対物レンズ４７の焦点距離ｆ_０を２００ｍｍに設定し、ピンホール１０３Ａの径φ_２を２０μmから３０μmの範囲に設定し、撮像面１０５Ａの有効径φ_４を８ｍｍに設定し、回折格子１０１’の溝深さを５００ｎｍとした。

［第３実施形態］
以下、本発明の第２実施形態として第１実施形態の変形例を説明する。第１実施形態との相違点は、ホログラフィユニットに適用される干渉計の種類にある。具体的に、第１実施形態のホログラフィユニットでは、シアリング干渉計を利用したが、本実施形態のホログラフィユニットでは、マッハツェンダー干渉計を利用する。

図５は、第３実施形態のホログラフィユニット３００の構成を示す図である。

図５に示すとおり本実施形態のホログラフィユニット３００は、リレーレンズ３０１と、ビームスプリッタ３０２と、ピンホールマスク３０３と、光路折り曲げミラー３０４、３０５と、ビームスプリッタ３０６と、リレーレンズ３０７と、撮像素子３０８とが備えられる。

図５に示すとおり、ホログラフィ観察時、ホログラフィユニット３００へ入射したレーザ光（平行光束）は、ホログラフィユニット３００のリレーレンズ３０１へ入射すると、リレーレンズ３０１の集光作用を受け、集光しながらビームスプリッタ３０２へ入射する。

ビームスプリッタ３０２へ入射したレーザ光は、ビームスプリッタ３０２を透過する透過光束と、ビームスプリッタ３０２を反射する反射光束とに分岐される。

なお、ビームスプリッタ３０２の透過／反射率は、透過光束の強度の方が反射光束の強度より高くなるように設定されている（なぜなら、本実施形態の参照光束ＬＲは、透過光束に基づき生成される。）。

先ず、ビームスプリッタ３０２から射出した透過光束は、瞳共役面Ａの中心（光軸）に向かって集光する。

ここで、瞳共役面Ａには、ピンホールマスク３０３が配置されており、ピンホールマスク３０３のピンホール３０３Ａは、その集光点の近傍に位置している。

ピンホール３０３Ａには、透過光束を回折し、その光束の波面を理想球面に変換する機能が付与されている。そのために、ピンホール３０３Ａのサイズは十分に小さなサイズに設定されている。

したがって、ピンホールマスク３０３のピンホール３０３Ａからは、理想球面波に変換された光束が射出する。本実施形態のホログラフィユニット３００は、この光束を参照光束ＬＲとして使用する。この参照光束ＬＲは、光路折り曲げミラー３０４によって偏向され、ビームスプリッタ３０６へ入射すると、ビームスプリッタ３０６を反射する。

一方、ビームスプリッタ３０２から射出した反射光束は、瞳共役面Ａ’の中心（光軸）に向かって集光すると、再び発散光束となって進行し、光路折り曲げミラー３０５によって偏向された後、ビームスプリッタ３０６へ入射し、ビームスプリッタ３０６を透過する。本実施形態のホログラフィユニット３００は、この光束を物体光束ＬＯとして使用する。

ビームスプリッタ３０６で反射した参照光束ＬＲと、ビームスプリッタ３０６を透過した物体光束ＬＯとの各々は、リレーレンズ３０７の集光作用を受けて平行光束となり、標本共役面Ｂへ入射する。

ここで、物体光束ＬＯの単独光路に配置された光路折り曲げミラー３０５は、入射光路に対して４５°の角度で配置されているのに対して、参照光束ＬＲの単独光路に配置された光折り曲げミラー３０５は、入射光路に対して４５°から所定値だけずれた角度で配置されている。

よって、標本共役面Ｂに対する物体光束ＬＯの入射角度はゼロとなるのに対して、標本共役面Ｂに対する参照光束ＬＲの入射角度は、ゼロ以外の所定値となる。

ここで、標本共役面Ｂには、撮像素子３０８の撮像面３０８Ａが位置している。撮像面１０５Ａには、光軸（Ｚ方向）に垂直な所定方向（Ｘ方向）にかけて複数の画素が配列されており、Ｚ方向及びＸ方向の双方に垂直な所定方向（Ｙ方向）にかけても複数の画素が配列されている。

この撮像面１０５Ａには、参照光束ＬＲと物体光束ＬＯとが互いに異なる角度で入射するので、撮像面３０８Ａにおいて参照光束ＬＲと物体光束ＬＯとが重複して入射する領域には、ストライプ状の干渉縞が生起する。

なお、撮像面３０８Ａの光軸周りの回転位置は、撮像面３０８ＡのＸ方向及びＹ方向が干渉縞の縞方向に対して４５°の角度を成すように設定されている。

撮像素子３０８は、例えば１／３０秒のフレーム周期で干渉縞を繰り返し撮像すると共に、その撮像で生成した縞画像を逐次に演算装置（不図示）へ転送する。

不図示の演算装置は、撮像素子３０８から縞画像が転送されると、その縞画像に対して所定の演算処理を施すことにより、標本３３のホログラフィ画像（後述）を作成し、そのホログラフィ画像をモニタ（不図示）へ表示する。

なお、不図示の演算装置、不図示のモニタは、第１実施形態におけるそれらと同様である。

また、例えば、本実施形態では、レーザ光の波長λを４８８ｎｍに設定し、対物レンズ３４−１の開口数ＮＡを０．４５に設定し、対物レンズ３４−１の倍率βを２０に設定し、リレーレンズ３０１の焦点距離ｆ_１を５０ｍｍに設定し、リレーレンズ３０６の焦点距離ｆ_２を５０ｍｍに設定し、画素ピッチｐを４．４μｍに設定した。

また、本実施形態では、標本３３における観察エリアの径（視野の径）φ_１を３００μｍに設定し、第２対物レンズ４７の焦点距離ｆ_０を２００ｍｍに設定した。

［実施形態の補足］
なお、上述した実施形態では、ホログラフィユニットの連結先を顕微鏡本体１のサイドポート１００Ａとしたが、顕微鏡本体１が光学出力ポートとして、例えば、左ポート、右ポート、ボトムポート、バックポートを備えていた場合には、ホログラフィユニットの連結先を、左ポート、右ポート、ボトムポート、バックポートの何れとしてもよいことは言うまでもない。

また、上述した実施形態では、可動ミラーを使用し、複数の光学出力ポートの間で有効な光学出力ポートを切り換えたが、複数の光学出力ポートを同時に使用可能としてもよい。複数の光学出力ポートを同時に使用するためには、可動ミラーの代わりに非可動のビームスプリッタを使用すればよい。

また、上述した実施形態では、ホログラフィユニットの観察対象を透明物体とし、透明物体の位相分布をホログラフィ画像として取得したが、ホログラフィユニットの観察対象を不透明物体とし、不透明物体の表面形状をホログラフィ画像として取得してもよい。但し、不透明物体をホログラフィユニットで観察する際の照明方法としては、透過照明ではなく落射照明を採用する必要がある。また、その場合も、光源は可干渉性の高い光源（レーザ光源）が使用されることが望ましい。

また、上述した実施形態では、撮像ユニットに搭載される撮像素子の配置先が、標本共役面に一致していたが、標本共役面からずれていても構わない。但し、上述した演算処理によって算出できるのは、撮像面の位相分布であるので、標本共役面の位相分布を知るためには、撮像面の位相分布を標本共役面の位相分布へ換算する処理を、上述した演算処理に加える必要がある。

１：顕微鏡本体、２：透過照明ユニット、３：落射照明ユニット、８：撮像ユニット、１００：ホログラフィユニット、２００：レーザユニット、２：透過照明ユニット、３：落射照明ユニット、８：撮像ユニット、１００Ａ：ポート、１０１：回折格子、１０２：リレーレンズ、１０３：空間フィルタ、１０４：リレーレンズ、１０５：撮像素子

Claims (14)

1. 顕微鏡の光学出力ポートに連結される撮像装置であって、
   前記顕微鏡からの結像光束を２つの分岐光束に分岐する分岐手段と、
   前記２つの分岐光束の一方を参照光束とし、他方を物体光束として干渉縞を生成する干渉手段と、
   前記干渉縞を撮像して縞画像を生成する撮像手段と、
   を備えることを特徴とする撮像装置。
2. 請求項１に記載の撮像装置において、
   前記撮像手段に向かう前記参照光束の波面形状を、予め決められた形状に整形する整形手段を更に備える
   ことを特徴とする撮像装置。
3. 請求項２に記載の撮像装置において、
   前記分岐手段は、ブレーズ型位相回折格子である
   ことを特徴とする撮像装置。
4. 請求項３に記載の撮像装置において、
   前記回折格子で発生した±１次回折光束の一方が前記参照光束として使用され、前記回折格子で発生した０次回折光束が前記物体光束として使用される
   ことを特徴とする撮像装置。
5. 請求項４に記載の撮像装置において、
   前記回折格子と前記撮像手段との間には、前記回折格子で発生した余分な回折光束をカットする空間フィルタが配置される
   ことを特徴とする撮像装置。
6. 請求項５に記載の撮像装置において、
   前記空間フィルタには、前記整形手段の機能が搭載されている
   ことを特徴とする撮像装置。
7. 請求項４〜請求項６の何れか一項に記載の撮像装置において、
   前記回折格子の回折効率は、前記回折格子から射出する前記参照光束の強度が前記回折格子から射出する前記物体光束の強度よりも高くなるように設定されている
   ことを特徴とする撮像装置。
8. 請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の撮像装置において、
   前記撮像手段の撮像面に対する前記参照光束の入射角度と前記物体光束の入射角度との差は、ゼロ以外の所定値に設定されている
   ことを特徴とする撮像装置。
9. 請求項１〜請求項８の何れか一項に記載の撮像装置において、
   前記撮像手段の撮像面の配置先は、前記顕微鏡の像面と光学的に共役な面である
   ことを特徴とする撮像装置。
10. 請求項１〜請求項９の何れか一項に記載の撮像装置において、
    前記縞画像に基づき前記顕微鏡にセットされた物体の位相分布を算出する演算手段を更に備える
    ことを特徴とする撮像装置。
11. 請求項１０に記載の撮像装置において、
    前記演算手段は、
    前記位相分布をモニタへ表示する
    ことを特徴とする撮像装置。
12. 請求項１１に記載の撮像装置において、
    前記撮像手段及び前記演算手段は、繰り返し動作する
    ことを特徴とする撮像装置。
13. 前記顕微鏡と、
    請求項１〜請求項１２の何れか一項に記載の撮像装置と、
    を備えることを特徴とする顕微鏡システム。
14. 請求項１３に記載の顕微鏡システムにおいて、
    前記顕微鏡には、
    レーザ光源が搭載されている
    ことを特徴とする顕微鏡システム。

Images