JP2008292939A - 定量位相顕微鏡 - Google Patents

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Abstract

【課題】光利用効率が高く、外乱に対して強く、光量調節を容易に行え、波長に応じて専用の空間フィルタ43を用いる必要がなく、測定試料Sの厚みなどの定量的な測定を高い測定精度で行うことが可能な定量位相顕微鏡Aを提供する。
【解決手段】測定試料Sに関する位相情報を含む被測定光H1を、収束光H2に変換する集光レンズ42と、集光レンズ42の入射側に配されてなり、被測定光H1を偏光方向が互いに異なる2つの光H1a、H1bに分離する偏光分離素子41と、入射して来る前記2つの光H1a、H1bを、前記位相情報を保持したままの物体光H3として出射、及び、前記位相情報を含まない参照光H4に変換してそれぞれ出射する開口431及びピンホール432と、ピンホール432の出射側に設けられ、前記物体光H3及び参照光H4の偏光方向を揃える半波長板44と、前記半波長板44により偏光方向を揃えられた物体光H3と参照光H4とを重ね合わせて干渉縞を生成する合成レンズ45と、を具備するようにした。
【選択図】図1

Description

本発明は、例えば光学素子や細胞等の厚さ等の定量測定を行える定量位相顕微鏡に関するものである。
従来、例えば、無色透明な細胞を可視化して観察する微分干渉顕微鏡が知られている。具体的にこの種の微分干渉顕微鏡は、ウォラストンプリズムやノマルスキプリズムなどの偏光分離素子を用いて、光源からの光を、偏光面が互いに直交した2つの光波面に分離し、分離された2つの光波面を対物レンズを介して観察試料に照射し、その観察試料で反射した前記2つの光波面を前記対物レンズを経由させて前記偏光分離素子に再び導いて1つの光に合成し、合成された光の両直線偏光成分同士を干渉させ、干渉した光により観察試料の前記対物レンズによる像を形成するように構成されている(例えば、特許文献1参照。)。
しかしながら、このような構成では、無色透明な細胞を可視化して観測するには有効であるものの、観察試料の厚みなどの定量的な測定を行うことは原理的には不可能である。そのため定量的な測定には、干渉計測の手法が用いられる。
例えば、マッハチェンダー干渉計を用いた顕微鏡は、光源からの光をビームスプリッタで観察試料を通過する被測定光と通過しない参照光とに分離し、これら被測定光と参照光とを再び重ね合わせ、その光路差からなる干渉縞を生成し、その干渉縞をCCDカメラ等で取得し、解析することにより、観察試料の表面形状や透過波面の位相情報を定量的に測定することができるように構成されている。
しかし、このような顕微鏡は、振動や空気の揺らぎ等の外乱により、被測定光や参照光の光路長が変化するため測定精度が悪化するといった問題がある。
そこで、係る外乱に強い回折格子を用いたコモンパス干渉計が、顕微鏡に用いられている。
回折格子を用いたコモンパス干渉計は、光源からの光を観察試料に照射して得られる被測定光を、回折格子を用いて複数の回折光に分離し、分離した複数の回折光を集光レンズを用いて、空間フィルタに設けた開口(ある次数の回折光を通過させる孔)及びピンホール(異なる次数の回折光を一様な位相に変換する孔)にそれぞれ集光させて、前記開口を通過した物体光と前記ピンホールを通過した参照光とを生成し、これら物体光と参照光とを合成レンズで再び重ね合わせることにより干渉縞を生成し、その干渉縞をCCDカメラ等で取得して、解析することにより、観察試料の表面形状や透過波面の位相情報を、定量的に測定することができるように構成されている。このように、物体光と参照光とが殆ど同じ光路を通過するため、外乱の影響に強くなる(例えば、特許文献2参照。)。
特開2003−15042号公報 特開平10−141912号公報
ところが、回折格子とは、鏡面加工した金属板の表面に1mmに数千本の溝を平行に作ったものであるがために、平坦面を作るのとはちがって、ナノメータオーダの欠陥や傷を排除して光の波長以下の精度で製造するということは現状では困難である。そのため、被測定光の品質が低下し、精度の高い測定を行うことができないといった問題点を有している。また、回折格子により多数の高次回折光が発生するために、光利用効率が低下するといった問題点を有している。さらに、被測定光の波長を変化させた場合には、回折格子での回折効率が変化するため光量調節が困難となったり、回折格子での回折角度が変化するため波長に応じて専用の空間フィルタが必要となったりするといった問題点を有している。
そこで本発明は、振動や空気の揺らぎ等の外乱に対して強く、光利用効率が高く、光量調節を容易に行え、波長に応じて専用の空間フィルタを用いる必要がなく、測定試料の厚みなどの定量的な測定を高い測定精度で行うことができるといった、定量位相顕微鏡を提供することをその主たる課題としたものである。
すなわち、本発明に係る定量位相顕微鏡は、測定試料に照射光を照射することにより生じた、前記測定試料に関する位相情報を含む被測定光を、収束光に変換する収束光学部と、前記収束光学部の入射側若しくは出射側又は前記収束光の収束位置までの間に配されてなり、前記被測定光又は前記収束光を偏光方向が互いに異なる2つの光に分離する第1の光学素子と、前記収束光の収束位置に配されてなり、入射して来る前記2つの光を、前記位相情報を保持したままの物体光として出射、及び、前記位相情報を含まない参照光に変換してそれぞれ出射する物体光出射部及び参照光出射部と、前記各光出射部の少なくとも一方の出射側に設けられ、前記物体光及び参照光の偏光方向を揃える第2の光学素子と、前記第2の光学素子により偏光方向を揃えられた物体光と参照光とを重ね合わせて干渉縞を生成する干渉縞生成部と、を具備することを特徴とする。
このようなものによれば、第1の光学素子により被測定光を二つに分離し、分離した二つの光を物体光出射部及び参照光通過部を通過させて物体光及び参照光を生成し、第2の光学素子を用いて両者の偏光方向を等しくさせているため、光利用効率を高くすることができる。また、物体光と参照光とが殆ど同じ光路を通過するため、振動や空気の揺らぎ等の外乱の影響に対して強くすることができる。また、照明光の偏光方向を制御することにより、物体光と参照光との光強度比の調節ができるため、コントラストが高い干渉縞を生成することができる。また、第1の光学素子に例えば偏光分離素子を用いれば、波長に応じて専用の空間フィルタを用いる必要がない上、従来のような回折格子の面精度による測定精度が悪化するといった問題も生じず、測定試料の厚みなどの定量的な測定を高い測定精度で行うことができる。
簡単な構成でありながら被測定光を物体光及び参照光に分離するには、前記参照光出射部は、ピンホール状の孔であり、前記物体光出射部は、前記参照光出射部よりも拡開させた孔径を有する開口であることが好ましい。
なお、前記第1の光学素子の具体的態様としては、偏光分離素子や液晶空間光変調器が挙げられる。
また、前記第2の光学素子の具体的態様としては、半波長板や偏光子が挙げられる。
このように本発明に係る定量位相顕微鏡は、振動や空気の揺らぎ等の外乱に対して強く、光利用効率が高く、光量調節を容易に行え、波長に応じて専用の空間フィルタを用いる必要がなく、測定試料の厚みなどの定量的な測定を高い測定精度で行うことができる。
<第1実施形態>
以下、本発明の一実施形態を、図1〜図4を参照して説明する。
本実施形態の定量位相顕微鏡Aは、図1に示すように、測定試料Sを支持する試料台1、対物レンズ2、反射部3、光干渉部4を備える顕微鏡本体A1を具備するとともに、この顕微鏡本体A1の光の入射側には、図示しない光出射部からの照射光H0(レーザ光)を導く光ファイバBの出射側端面B1に臨ませたレンズA2とこのレンズA2を通過する光H0を反射する反射部A3とを備える一方、光の出射側には、光干渉部4で生成される干渉縞(図示せず、以下同様)を撮像するCCDカメラ等の撮像装置A4とこの撮像装置A4に接続され前記干渉縞を解析等するための情報処理装置A5とを備えている。以下、顕微鏡本体A1の各部を具体的に説明する。
試料台1は、例えば、中央に光を透過可能な光透過部11を備えるとともに、上向き面に測定試料Sを載置可能な載置面12を有する略板状のものである。載置面12に測定試料Sを載置した状態で上方から光を照射することにより、測定試料Sを透過した光(被測定光H1)が光透過部11を透過して対物レンズ2に向かうようにしている。なお、光透過部11は、例えばガラス等の光を透過可能な部材より形成したものであってもよいし、単なる孔であってもよい。
対物レンズ2は、例えば、操作部(図示しない)の操作に基づいて、入射してくる被測定光H1をその操作に係る所定の倍率で拡大させて平行光(被測定光H1)として出射するものである。
反射部3は、例えば全反射型のミラーであって、対物レンズ2からの被測定光H1を全反射させて光干渉部4に導入できるようにしている。
光干渉部4は、被測定光H1を、偏光方向が互いに異なる2つの光H1a、H1bに分離する第1の光学素子である偏光分離素子41と、この偏光分離素子41が出射する被測定光H1(H1a、H1b)を収束光H2(H2a、H2b)に変換する集光レンズ42(本発明の「収束光学部」に相当)と、前記収束光H2の収束位置に配した空間フィルタ43と、この空間フィルタ43の出射側に配した第2の光学素子である半波長板44と、この半波長板44により偏光方向を揃えられた後述する物体光H3と参照光H4とを重ね合わせて干渉縞を生成する合成レンズ45(本発明の「干渉縞生成部」に相当)と、を具備するものである。以下、各部をより具体的に説明する。
偏光分離素子41は、例えば、ウォラストンプリズムやノマルスキプリズムを用いて構成したものであって、例えば図3に示すように、この偏光分離素子41に、紙面左から右に向かうランダム偏光の被測定光H1を入射した場合、入射方向(x軸方向)と直交する方向(y軸方向)に振動しながら入射方向と同じ方向(x軸方向)にそのまま進む直線偏光H1aと、紙面と垂直な方向(z軸方向)に振動しながら入射方向(x軸方向)に対して角度θ方向に進む直線偏光H1bとに分離することができる。
そして、本実施形態では、分離された2つの直線偏光H1a、H1bが、集光レンズ42によって空間フィルタ43面上に距離(L1)離れて集光されるようにしている。ここで、距離(L1)は次式(1)より求められる。
L1=f1×θ1 ・・・(1)
なお、f1は集光レンズ42の焦点距離である。
集光レンズ42は、焦点距離がf1の凸レンズであって、偏光分離素子41からの2つの光H1a、H1bを、収束光H2(H2a、H2b)に変換し、空間フィルタ43の開口431及びピンホール432に集光させる。
空間フィルタ43は、図4に示すように、例えば矩形状の薄板であって、中央及びその中心から偏心させた位置に厚み方向に貫通する孔431、432をそれぞれ設けている。このうち、中央に設けた孔431(以下、「開口431」とも呼ぶ)は、収束光H2(H2a、H2b)を、前記位相情報を保持したままの物体光H3として出射する物体光出射部として機能し、中央から偏心する位置に設けた孔432(以下、「ピンホール432」とも呼ぶ)は、収束光H2(H2a、H2b)を、前記位相情報を含まず且つこれとは別の一様な位相情報のみを有する参照光H4に変換して出射する参照光出射部として機能するものである。そして、開口431とピンホール432の中心間距離をL1としている。
また、本実施形態では、開口431の直径は、被測定光H1が有する位相情報の測定に要する最大空間周波数p1により決定されることから、開口431の直径L2を次式(2)より求めるようにしている。
L2=λ×f1/p1 ・・・(2)
なお、λは光の波長である。
また、ピンホール432の直径は、高品質な点光源を作成するために、次式(3)で表される直径L3以下としている。
L3=1.22×λ×f1/D ・・・(3)
ここで、Dは被測定光H1の直径である。
半波長板44は、具体的には、ピンホール432の出射側に設けられるものであって、参照光H4の偏光方向を、物体光H3の偏光方向と同一の方向にするものである。
合成レンズ45は、焦点距離がf2の凸レンズである。
次に上記構成の定量位相顕微鏡Aの動作について説明する。
試料台1の測定試料Sにレーザ光を照射すると、そのレーザ光は測定試料Sを透過して被測定光H1として偏光分離素子41に入射する。
偏光分離素子41に入射した被測定光H1は、この偏光分離素子41によって、そのまま直進して透過する光H1aと、その光H1aに対して角度θ1で屈折した光H1bとに分離される。これら二つの光H1a、H1bは、それぞれ直交した直線偏光の光である。そして、これら二つの光H1a、H1bは集光レンズ42にて収束光H2(H2a、H2b)に変換され、空間フィルタ43の開口431及びピンホール432に集光される。
そして、開口431を通過する収束光H2(H2a、H2b)は、被測定光H1と同じ位相情報を保持したままの物体光H3として出射される。
一方、ピンホール432を通過する収束光H2(H2a、H2b)は、前記一様な位相情報のみを有する参照光H4に変換されて出射される。
参照光H4は、空間フィルタ43の後方に設置された半波長板44にて物体光H3と等しい偏光方向になる。
物体光H3と参照光H4とは合成レンズ45にて重なり合わされ干渉縞を形成し、この干渉縞を撮像装置A4が撮像する。
このとき、干渉縞のキャリア空間周波数p2は次式(4)から求められる。
p2=λ×f2/L1 ・・・(4)
ここで、f2は合成レンズ45の焦点距離である。
撮像装置A4の持つ画素間隔はp2の4倍以上であることが好ましい。
得られた干渉縞は、情報処理装置A5において、フーリエ変換法などの縞解析法を用いることにより、被測定光H1の位相情報の定量化が行える。
以上、本実施形態の定量位相顕微鏡Aによれば、偏光分離素子41により被測定光H1を二つに分離し、分離した二つの光を空間フィルタ43の開口431及びピンホール432を通過させて物体光H3及び参照光H4を生成し、半波長板44を用いて両者の偏光方向を等しくさせているため、光利用効率を高くすることができる。また、物体光H3と参照光H4とが殆ど同じ光路を通過するため、振動や空気の揺らぎ等の外乱の影響に対して強くすることができる。また、測定試料Sに照明するレーザ光の偏光方向を制御することにより、物体光H3と参照光H4との光強度比の調節ができるため、コントラストが高い干渉縞を生成することができる。また、偏光分離素子41を用いているため、波長に応じて専用の空間フィルタ43を用いる必要がない上、従来のような回折格子の面精度による測定精度が悪化するといった問題も生じず、測定試料Sの厚みなどの定量的な測定を高い測定精度で行うことができる。
すなわち、光利用効率が高く、外乱に対して強く、光量調節を容易に行え、波長に応じて専用の空間フィルタ43を用いる必要がなく、測定試料Sの厚みなどの定量的な測定を高い測定精度で行うことができるといった、定量位相顕微鏡Aを提供することができる。
なお、本発明は前記実施形態に限られるものではない。
例えば、半波長板44の配置場所を、ピンホール432の出射側にしているが、開口431の出射側にすることもできる。また、空間フィルタ43の入射側に配置してもよい。
また、ピンホールをドッテッドミラー(ドット状ミラー)にしてもよい。通常、ピンホールは薄い膜に穿孔して作られるが、このようなものであると、空気の動きや振動などの外乱で容易に膜が振動し、その振動が測定に悪影響を及ぼすところ、ドッテッドミラーであれば、安定した板状体に取り付ければよいので、安定性が高くなる。
<第2実施形態>
以下、本発明の他の実施形態を、図5〜図7を参照して説明する。
本実施形態の定量位相顕微鏡Aは、第1実施形態と同様に、被測定光H1は、偏光分離素子41により、それぞれ直交した直線偏光を有する光H2a、H2bに分離されるようにしたものである。なお、本実施形態では、偏光分離素子41は、図5に示すように、集光レンズ42と空間フィルタ43との間に配され、集光レンズ42を通過し、偏光分離素子41より分離された二つの光H2a、H2bは空間フィルタ43面上に距離L1´離れた位置に集光されるようにしている。また、空間フィルタ43の出射側には、第1実施形態の半波長板44に代えて偏光子46を配している。
距離L1´は次式(5)より求められる。
L1´=f3×θ2 ・・・(5)
なお、f3は偏光分離素子41と空間フィルタ43間の距離であり、f1>f3としている。
そして、第1実施形態と同様に、偏光分離素子41をそのまま通過してきた光H2aは、被測定光H1と同じ位相情報を保持したまま、空間フィルタ43面上の開口431から物体光H3として出射される。
ここで、開口431の直径L2は、被測定光H11が有する位相情報の測定に要する最大空間周波数p1により決定され、次式(6)より求められる。
L2=λ×f1/p1 ・・・(6)
なお、λは光の波長であり、L2<L1´である。
一方、偏光分離素子41で屈折した光H2bは、第1実施形態と同様に、空間フィルタ43面上のピンホール432から前記一様な位相情報のみを有する参照光H4に変換されて出射される。
物体光H3及び参照光H4の偏光方向は、空間フィルタ43の後方に設置された偏光子46により等しくなり、第1実施形態と同様に、物体光H31と参照光H4は合成レンズ45にて重なり合わされ干渉縞を形成し、この干渉縞を撮像装置A4が撮像する。
得られた干渉縞は、情報処理装置A5において、フーリエ変換法などの縞解析法を用いることにより、被測定光H1の位相情報の定量化が行える。
以上、第2実施形態の構成によれば、第1実施形態と同様、物体光H3及び参照光H4の偏光方向を偏光子46を用いて等しくさせているため、光利用効率を高くすることができる。また、物体光H3と参照光H4とが殆ど同じ光路を通過するため、振動や空気の揺らぎ等の外乱の影響に対して強くすることができる。また、偏光分離素子41を用いているため、波長に応じて専用の空間フィルタを用いる必要がない上、従来のような回折格子の面精度による測定精度が悪化するといった問題も生じず、測定試料Sの厚みなどの定量的な測定を高い測定精度で行うことができる。
さらに、また、偏光子46を回転させることにより、物体光H3と参照光H4の光強度比の調節ができるため、コントラストが高い干渉縞を生成することができる。偏光分離素子41を、集光レンズ42と空間フィルタ43との間に設置しているため、光干渉部4のサイズを小型化できるので顕微鏡A全体の小型化もできる。
<第3実施形態>
以下、本発明の他の実施形態を説明する。
本実施形態の定量位相顕微鏡Aは、図1において、第1実施形態の偏光分離素子41を、空間光変調器(図示せず)に変更した構成である。
空間光変調器は、平行配向液晶又は垂直配向液晶を有しており、偏光分離素子41と同様に複屈折性を有しており、液晶の配向方向と同じ方向の偏光成分の光H1aに対して、空間的な位相変調を付与することが可能である。一方、液晶の配向方向と直交する変更成分の光H1bに対しては、位相変調を付与しない。つまり、空間光変調器を用いて、偏光分離素子41と同様に、被測定光H1を光H1a、H1bに分離ができる。
ところで、被測定光H1が、波面歪みを持つ場合、空間フィルタ43上で図6に斜線pで示すような光強度分布を形成する。このとき、ピンホール432で点光源の参照光H4に変換される際の光量損失が大きくなる。そこで、空間光変調器に、被測定光H1が有する波面歪みを打ち消すような位相変調を付与することにより、図7に斜線qで示すような理想的な光強度分布を形成することが可能になる。また、空間光変調器に線形の位相成分を与えることにより、ピンホール432と光強度分布の位置調節を行うことが可能になる。
しかして、第1実施形態と同様に、物体光H3と参照光H4は合成レンズ45にて重なり合わされ干渉縞を形成し、この干渉縞を撮像装置A4が撮像する。
得られた干渉縞は、情報処理装置A5において、フーリエ変換法などの縞解析法を用いることにより、被測定光H1の位相情報の定量化が行える。
以上、第3実施形態の構成によれば、第1実施形態の効果に加え、空間光変調器による波面歪み補正によって、従来に比して光利用効率が高く調節を容易に行うことができるといった、定量位相顕微鏡Aを提供することができる。
なお、本発明は上述した各実施形態に限られるものではない。
例えば、偏光分離素子41は、被測定光H1を、偏光方向が互いに直交する2つの光に分離するようにしているが、必ずしも偏光方向が直交する光に分離する必要はなく、分離した光の偏光方向が異なっていればよい。空間光変調器についても同様である。
定量位相顕微鏡Aが、試料台1、対物レンズ2、反射部3、光干渉部4を備える顕微鏡本体A1の他に、レンズA2、反射部A3、撮像装置A4及び情報処理装置A5を備えるようにしているが、レンズA2、反射部A3、撮像装置A4又は情報処理装置A5は、必ずしも必要ではなく外部のものを用いてもよい。
また、試料台1に載置した測定試料Sに照射光H0を照射し、透過した光を被測定光として測定するようにしているが、例えば、測定試料Sによって反射した光を測定することもできる。
また、測定対象にレーザ光を照射するようにしているが、例えば、白色光やフェムト秒レーザ光などの干渉性の低い光を用いることもできる。
その他、各部の具体的構成についても上記実施形態に限られるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形が可能である。
本発明の一実施形態に係る定量位相顕微鏡の機器構成を模式的に示す図。 同実施形態における光干渉部の機器構成図。 同実施形態における偏光分離素子の作用説明図。 同実施形態における空間フィルタを示す図。 本発明の他の実施形態に係る定量位相顕微鏡の光干渉部の機器構成図。 同実施形態における空間フィルタの作用説明図。 同実施形態における空間フィルタの作用説明図。
符号の説明
A・・・・・・・・・定量位相顕微鏡
H0・・・・・・・・照射光
H1・・・・・・・・被測定光
H1a、H1b・・・偏光方向が互いに異なる2つの光
H2・・・・・・・・収束光
H2a、H2b・・・偏光方向が互いに異なる2つの光
H3・・・・・・・・物体光
H4・・・・・・・・参照光
S・・・・・・・・・測定試料
41・・・・・・・・第1の光学素子(偏光分離素子)
42・・・・・・・・収束光学部(集光レンズ)
44・・・・・・・・第2の光学素子(半波長板)
45・・・・・・・・干渉縞生成部(合成レンズ)
46・・・・・・・・第2の光学素子(偏光子)
431・・・・・・・物体光出射部(開口)
432・・・・・・・参照光出射部(ピンホール)

Claims (6)

  1. 測定試料に照射光を照射することにより生じた、前記測定試料に関する位相情報を含む被測定光を、収束光に変換する収束光学部と、
    前記収束光学部の入射側若しくは出射側又は前記収束光の収束位置までの間に配されてなり、前記被測定光又は前記収束光を偏光方向が互いに異なる2つの光に分離する第1の光学素子と、
    前記収束光の収束位置に配されてなり、入射して来る前記2つの光を、前記位相情報を保持したままの物体光として出射、及び、前記位相情報を含まない参照光に変換してそれぞれ出射する物体光出射部及び参照光出射部と、
    前記各光出射部の少なくとも一方の出射側に設けられ、前記物体光及び参照光の偏光方向を揃える第2の光学素子と、
    前記第2の光学素子により偏光方向を揃えられた物体光と参照光とを重ね合わせて干渉縞を生成する干渉縞生成部と、を具備する定量位相顕微鏡。
  2. 前記参照光出射部は、ピンホール状の孔であり、前記物体光出射部は、前記参照光出射部よりも拡開させた孔径を有する開口である請求項1記載の定量位相顕微鏡。
  3. 前記第1の光学素子は、偏光分離素子である請求項1又は2記載の定量位相顕微鏡。
  4. 前記第1の光学素子は、液晶空間光変調器である請求項1又は2記載の定量位相顕微鏡。
  5. 前記第2の光学素子は、半波長板である請求項1乃至4いずれか記載の定量位相顕微鏡。
  6. 前記第2の光学素子は、偏光子である請求項1乃至4いずれか記載の定量位相顕微鏡。
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