ES2534960B1 - Microscopio, método y programa de ordenador para la obtención de imágenes cuantitativas de fase por medio de microscopía holográfica digital, y kit para adaptar un microscopio óptico - Google Patents

Abstract

Microscopio, método y programa de ordenador para la obtención de imágenes cuantitativas de fase por medio de microscopía holográfica digital, y kit para adaptar un microscopio óptico.#El microscopio comprende:#- una fuente de luz coherente (1) y un divisor de haz (3) para generar un haz objeto (Lo), para iluminar una muestra, y un haz de referencia (Lr);#- un sistema óptico con un camino óptico principal que constituye un sistema afocal y telecéntrico, y un camino óptico de referencia; y#- unos medios de registro (12) que registran un holograma de dicha muestra en el plano imagen del sistema óptico.#El método comprende registrar un holograma en el plano imagen de un sistema óptico afocal y telecéntrico.#El programa de ordenador está adaptado para implementar parte de las etapas del método.#El kit comprende unos medios para variar el ángulo de inclinación de un haz de referencia.

Description

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DESCRIPCION

Microscopio, metodo y programa de ordenador para la obtencion de imagenes cuantitativas de fase por medio de microscopia holografica digital, y kit para adaptar

un microscopio optico

Sector de la tecnica

La presente invention concierne en general, en un primer aspecto, a un microscopio para la obtencion de imagenes cuantitativas de fase por medio de microscopia holografica digital, que incluye un sistema optico afocal y telecentrico, y mas particularmente a un microscopio con unos medios de registro que registran un holograma en el plano imagen del sistema optico.

Un segundo aspecto de la invencion concierne a un metodo para la obtencion de imagenes cuantitativas de fase por medio de microscopia holografica digital, que comprende registrar un holograma en el plano imagen de un sistema optico afocal y telecentrico.

Un tercer aspecto de la invencion concierne a un programa de ordenador adaptado para implementar parte de las etapas del metodo del segundo aspecto.

Un cuarto aspecto de la invencion concierne a un kit para adaptar un microscopio optico para la obtencion de imagenes cuantitativas de fase por medio de microscopia holografica digital, que comprende, entre otros elementos, unos medios para controlar y variar el angulo de inclination de un haz de referencia.

Estado de la tecnica anterior

La caracterlstica que hace unica la MHD (Microscopia Holografica Digital) es su capacidad de obtener imagenes cuantitativas de fase [3, 4, 6] de muestras transparentes con dimensiones microscopicas sin la necesidad de marcarlas o tintarlas. Si bien existen otros metodos de microscopia que permiten analizar objetos de fase, estos solo proporcionan information cualitativa de la fase del especimen [16]; metodos como los del Zernike y Nomarsky pueden ser nombrados en esta categorla. La MHD permite la recuperation de la amplitud compleja difractada por un objeto por medio del uso de los principios de la

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holografla digital [17]. A partir del conocimiento de la amplitud compleja difractada por el objeto, es posible calcular imagenes de amplitud o fase.

Los metodos convencionales de MHD [1-4, 6, 7, 9, 10, 18, 19] hacen uso de registro fuera de plano imagen y/o no utilizan sistemas afocales-telecentricos para el registro de los hologramas. El registro fuera de plano imagen es una caracterlstica heredada desde el inicio del desarrollo moderno y mas extendido de la MHD [4] y que se ha conservado hasta nuestros dlas [5, 20]. Dicha condicion introduce en la MHD varias caracterlsticas indeseadas:

• No es posible obtener informacion del especimen en tiempo real. Se requiere la aplicacion de algoritmos de propagation numerica para recuperar la informacion del experimento, el usuario del MHD observa en la pantalla del microscopio un holograma en lugar de la imagen del especimen.

• No se aprovecha el diseno optimizado de los objetivos de microscopio para operar en sus planos objeto-imagen conjugados, introduciendo aberraciones opticas en los hologramas registrados.

• Las dos caracterlsticas anteriores sumadas hace que los sistemas de MHD disponibles en la actualidad no puedan proporcionar imagenes cuya resolucion esta limitada solo por la difraccion (como sucede con las imagenes proporcionadas por un microscopio optico convencional) sino que proporciona imagenes cuya resolution es sensiblemente peor.

Al igual que el registro fuera de plano imagen, el uso de esquemas no afocales-telecentricos para el registro de los hologramas en los sistemas de MHD, fue propuesto desde su inicio [3, 4] y se mantiene hasta nuestros dlas [5, 21]. En la literatura se han propuesto algunas alternativas para realizar el registro de los hologramas de MHD [7, 8, 22]. La arquitectura no afocal-telecentrica que se emplea comunmente en MHD hace que el sistema presente las siguientes dificultades:

• Las imagenes reconstruidas de fase de MHD presentan aberration de curvatura de fase [3], lo que impone el empleo de complejos metodos numericos para su elimination a posteriori [1, 9-11, 18, 21].

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• Adicionalmente a la complejidad de los metodos numericos para la compensation de la curvatura de fase, se ha demostrado que dichas aproximaciones numericas mantienen una curvatura remanente que perturba las medidas cuantitativas de fase [23].

• Sin importar el espesor de la muestra en estudio, las imagenes de fase sufren envolvimiento de fase heredado de la curvatura del sistema de registro [1, 3-5, 21].

• Los ordenes difractados que portan la information de la muestra en estudio se esparcen en el dominio espectral lo que dificulta el correcto filtrado de imagenes gemelas y orden cero [18].

• La compensation automatica del haz de referencia en configuraciones fuera de eje se dificulta debido al esparcimiento de los ordenes difractados del holograma.

• El esparcimiento de los ordenes difractados limita el espacio ancho de banda disponible, lo que reduce la resolution espacial llmite alcanzable por el MHD, la cual sera en cualquiera caso inferior a la alcanzable por el microscopio optico operando con el mismo sistema de lentes objetivos.

La solution de las caracterlsticas negativas arriba indicadas ha derivado en la propuesta de sistemas de MHD que hacen exclusivamente la tarea de cuantificacion de fase a-posteriori a un costo computacional y economico elevado. El alto costo computacional de la metodologla limita su aplicacion en tareas que demanden information cuantificada de fase en tiempo real y su elevado costo economico ha hecho de la tecnica una herramienta exclusiva de muy pocos centros de desarrollo e investigation.

En general, los sistemas previos de cuantificacion de fase por medio de MHD se han realizado por medio del desarrollo de microscopios independientes, con registro fuera del plano imagen y, en general, sin el uso de sistemas afocales-telecentricos. Por esta razon las metodologlas previas de cuantificacion de fase por MHD requieren i) propagation del campo complejo recuperado a partir del holograma, y ii) compensation numerica de la curvatura de fase introducida por el uso de sistemas de registro no afocales-telecentricos. Estas condiciones imponen las arriba indicadas caracterlsticas poco atractivas para los actuales sistemas de MHD.

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No obstante, existen artlcuios en los que se propuso el uso, en MHD, de sistemas afocal- telecentricos [8] y se estudio el efecto que la curvatura de fase residual de los procesos de compensation numerica tiene en las imagenes cuantitativas de fase [23].

En el MHD con sistema afocal-telecentrico descrito en [8], como en todos los MHDs conocidos, registran el holograma en un plano mas lejano al plano imagen, que es donde recomienda el estado de la tecnica, como por ejemplo se hace en [3,20], donde se establece que el estado de la tecnica aconseja registrar el holograma en un plano mucho mas lejano al plano imagen o foco del microscopio para holografla off-axis, para evitar problemas tales como: la mala utilization del rango dinamico de las camaras digitales al registrar detalles brillantes de los objetos o el ensanchamiento de las altas frecuencias espaciales [20].

Todo ello hace que, en los microscopios holograficos conocidos en el estado de la tecnica, se obtenga un holograma que no tiene parecido alguno con el especimen en estudio, por lo que no se puede enfocar la muestra cuando se toma la imagen, es decir no se puede enfocar en tiempo real, no siendo posible obtener informacion del especimen en tiempo real, resultando necesario un post-procesado [39] y propagation numerica para recuperar la information del experimento.

En resumen, existen microscopios opticos convencionales que pueden enfocar la muestra y obtener imagenes 2D y por otro lado los microscopios holograficos que no pueden enfocar la muestra en tiempo real y registran hologramas, a partir de los cuales se puede recuperar la informacion 3D de la muestra mediante metodos a-posteriori. El usuario de los MHD actuales no tiene la posibilidad de enfocar la muestra en tiempo real, puesto que el usuario observa en la pantalla del microscopio un holograma en lugar de la imagen real del especimen. El enfoque se realiza de forma digital con el procesado diferido del holograma registrado.

En las referencias [24-28] se describen diferentes propuestas de MHDs convencionales, producidos y comercializados, y en [29-37] se presentan documentos de patente que describen diferentes MHDs del estado de la tecnica.

Por otra parte, en [19] y en [38] se describe la implementation de un modulo o kit de MHD a un microscopio comercial Zeiss® axioplan 2. Dicho modulo opera bajo los principios expuestos por los mismos autores en [6], los cuales hacen del microscopio de MHD

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obtenido mediante la implementation de dicho modulo un sistema que no logra grandes resultados en terminos de la resolution espacial ya que no puede alcanzar el llmite de difraccion dictado por el microscopio huesped. Asimismo, debido al numero de operaciones requeridas para recuperar la information del especimen, la reconstruction no puede ser implementada en tiempo real. Obviamente, siguiendo los consejos del estado de la tecnica, el registro del holograma se realiza en un plano diferente al plano imagen.

La resolution lateral (la que se podrla medir, por ejemplo, con un test USAF 1951) del dispositivo de [38] es claramente mejorable, ya que no usa una configuration telecentrica (lo que genera perdidas en resolution debido a que el holograma esta contaminado por el factor de fase residual), registra el holograma en un plano lejano respecto al plano imagen, y no utiliza unos ajustes optimos.

Referencias:

1. J. Kuhn, F. Charriere, T. Colomb, E. Cuche, F. Montfort, Y. Emery, P. Marquet, and C. Depeursinge, "Axial sub-nanometer accuracy in digital holographic microscopy," Measurement Science & Technology 19, 074007 (2008).

2. P. Marquet, B. Rappaz, P. J. Magistretti, E. Cuche, Y. Emery, T. Colomb, and C. Depeursinge, "Digital holographic microscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axial accuracy," Opt. Lett. 30, 468-470 (2005).

3. E. Cuche, P. Marquet, and C. Depeursinge, "Simultaneous amplitude-contrast and quantitative phase-contrast microscopy by numerical reconstruction of Fresnel off- axis holograms," Appl. Opt. 38, 6994-7001 (1999).

4. E. Cuche, F. Bevilacqua, and C. Depeursinge, "Digital holography for quantitative phase-contrast imaging," Opt. Lett. 24, 291-293 (1999).

5. B. Kemper, P. Langehanenberg, S. Kosmeier, F. Schlichthaber, C. Remmersmann, G. von Bally, C. Rommel, C. Dierker, and J. Schnekenburger, "Digital Holographic Microscopy: Quantitative Phase Imaging and Applications in Live Cell Analysis," Handbook of Coherent-Domain Optical Methods, ISBN 978-1-4614-5175-4. Springer Science+ Business Media New York, 2013, p. 215 1, 215 (2013).

6. D. Carl, B. Kemper, G. Wernicke, and G. von Bally, "Parameter-Optimized Digital Holographic Microscope for High-Resolution Living-Cell Analysis," Appl. Opt. 43, 6536-6544 (2004).

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7. C. Mann, L. Yu, C.-M. Lo, and M. Kim, "High-resolution quantitative phase-contrast microscopy by digital holography," Opt. Express 13, 8693-8698 (2005).

8. E. Sanchez-Ortiga, P. Ferraro, M. Martlnez-Corral, G. Saavedra, and A. Doblas, "Digital holographic microscopy with pure-optical spherical phase compensation," J. Opt. Soc. Am. A 28, 1410-1417 (2011).

9. T. Colomb, F. Montfort, J. Kuhn, N. Aspert, E. Cuche, A. Marian, F. Charriere, S. Bourquin, P. Marquet, and C. Depeursinge, "Numerical parametric lens for shifting, magnification, and complete aberration compensation in digital holographic microscopy," J. Opt. Soc. Am. A 23, 3177-3190 (2006).

10. T. Colomb, E. Cuche, F. Charriere, J. Kuhn, N. Aspert, F. Montfort, P. Marquet, and C. Depeursinge, "Automatic procedure for aberration compensation in digital holographic microscopy and applications to specimen shape compensation," Appl. Opt. 45, 851863 (2006).

11. P. Ferraro, S. De Nicola, A. Finizio, G. Coppola, S. Grilli, C. Magro, and G. Pierattini, "Compensation of the Inherent Wave Front Curvature in Digital Holographic Coherent Microscopy for Quantitative Phase-Contrast Imaging," Appl. Opt. 42, 1938-1946 (2003).

12. L. Yu and M. K. Kim, "Wavelength-scanning digital interference holography for tomographic three-dimensional imaging by use of the angular spectrum method," Opt. Lett. 30, 2092-2094 (2005).

13. T. Kreis, Handbook of Holographic Interferometry: Optical and Digital Methods (Wiley- vch Verlag Ed, Weinheim, 2005).

14. T. Zhang and I. Yamaguchi, "Three-dimensional microscopy with phase-shifting digital holography," Opt. Lett. 23, 1221-1223 (1998).

15. I. Yamaguchi and T. Zhang, "Phase-shifting digital holography," Opt. Lett. 22, 12681270 (1997).

16. M. Pluta, Advanced light microscopy (PWN, 1988).

17. U. Schnars, "Direct phase determination in hologram interferometry with use of digitally recorded holograms," J. Opt. Soc. Am. A 11, 2011-2015 (1994).

18. E. Cuche, P. Marquet, and C. Depeursinge, "Spatial Filtering for Zero-Order and Twin- Image Elimination in Digital Off-Axis Holography," Appl. Opt. 39, 4070-4075 (2000).

19. B. Kemper, D. Carl, A. Hoink, G. von Bally, I. Bredebusch, and J. Schnekenburger, "Modular digital holographic microscopy system for marker free quantitative phase contrast imaging of living cells," in Biophotonics and New Therapy Frontiers, Proc. SPIE 6191 (SPIE, 2006), 61910T-61910T.

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20. D. Claus and D. Iliescu, "Optical parameters and space-bandwidth product optimization in digital holographic microscopy," Appl. Opt. 52, A410-A422 (2013).

21. K. W. Seo, Y S. Choi, E. S. Seo, and S. J. Lee, "Aberration compensation for objective phase curvature in phase holographic microscopy," Opt. Lett. 37, 4976-4978 (2012).

22. P Ferraro, G. Coppola, S. De Nicola, A. Finizio, S. Grilli, M. Iodice, C. Magro, and G. Pierattini, "Digital holography for characterization and testing of MEMS structures," in Optical MEMs, 2002. Conference Digest. 2002 IEEE/LEOS International Conference on, 2002), 125-126.

23. A. Doblas, E. Sanchez-Ortiga, M. Martlnez-Corral, G. Saavedra, P Andres, and J. Garcia-Sucerquia, "Shift-variant digital holographic microscopy: inaccuracies in quantitative phase imaging," Opt. Lett. 38, 1352-1354 (2013).

24. "Lyncee Tech DHM" (2013), retrieved
http://www.lynceetec.com/.

25. "Ovizio Imaging System" (2013), retrieved
http://www.ovizio.com/.

26. "Holographic phase imaging" (2013), retrieved
http://www.phiab.se/.

27. "Resolution Optics" (2013), retrieved
http://resolutionoptics.com/.

28. "Trimos" (2013), retrieved
http://kb.trimos.ch/.

29. A. K. Asundi, W. Qu, and O. Choo, "Digital Holographic Microscopy," US 2011/0043878 A1 (Feb. 24, 2011).

30. D. Carl, B. Kemper, and G. v. Bally, "Method of numerically reconstructing at least an object plane using a digital off-axis hologram and digital holographic microscope," EP 1748327 A1 (Jan. 31,2007).

31. J.-S. Chen, S.-H. Kuo, C. W. Su, and J.-T. Liang, "Multi-color off-axis digital holographic system and the imaging method thereof," US 8,325,400 B2 (Dec. 4, 2012).

32. E. Cuche, C. Depeursinge, P Magistretti, and P Marquet, "Apparatus and method for digital holographic imaging," US 6943924 B2 (2005).

33. B. Das, C. S. Yelleswarapu, and D. V. G. L. N. Rao, "Systems and methods of dualplane digital holographic microscopy," US 2013/0070251 A1 (Mar. 21, 2013).

34. F. Dubois and C. Yourassowsky, "Digital holographic microscope for 3D imaging and process using it," US 7362449 B2 (Apr. 22, 2008).

35. L. Gisselsson, A. Molder, and M. C. Sebeste, "Analysis of transparent biological objects," US 20110157601 A1 (Jun. 30, 2011).

36. M. Sebesta, K. Alm, A. Langberg, A. Molder, J. Persson, and L. Gisselsson, "Method for and use of digital holographic microscopy and imaging on labelled cell samples," EP 2534540 A1 (Dec. 19, 2012).

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37. M. Sebesta, J. Persson, L. Gisselsson, A. Moelder, and A. Laangberg, "Analysis of ova or embryos with digital holographic imaging," EP 2446251 A1 (May 2, 2012).

38. D. Carl, A. Hoink, B. Kemper, J. Schnekenburger, and G. v. Bally, "Digital holographic multi-focus quantitative phase contrast microscopy," in DGaO Proceedings, 2005).

39. Method for simultaneous amplitude and quantitative phase contrast imaging by numerical reconstruction of digital holograms, US 6262818 B1.

Explication de la invention

Aparece necesario ofrecer una alternativa al estado de la tecnica que cubra las deficiencias halladas en el mismo, mediante la proportion de un MHD y metodo de operation que ofrezca unos resultados y prestaciones superiores a los conocidos en el estado de la tecnica, permitiendo realizar un enfoque en tiempo real, alcanzar la resolution espacial dictada por la optica del sistema de registros del holograma y hacer uso optimizado del espacio ancho de banda.

Con tal fin, la presente invencion concierne, en un primer aspecto, a un microscopio para la obtencion de imagenes cuantitativas de fase por medio de microscopla holografica digital, que comprende, de manera en si conocida:

- una fuente de luz coherente y un divisor de haz de luz coherente dispuesto a la salida de la misma para generar un haz objeto, con el que iluminar una muestra, y un haz de referencia;

- unos medios de registro (tal como una camara CCD) que registran un holograma de dicha muestra a partir de un patron de interferencia de dicho haz de referencia y de un haz generado en dicha muestra por la transmision o reflexion de dicho haz objeto sobre la misma; y

- un sistema optico que incluye elementos opticos dispuestos distanciados entre si formando:

- un camino optico principal entre un punto de entrada de dicho haz objeto y dichos medios de registro, que incluye unos elementos opticos que constituyen un sistema afocal y telecentrico; y

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- un camino optico de referenda dispuesto entre un punto de entrada de dicho haz de referencia y dichos medios de registro, y que comparte parte de los elementos opticos con dicho camino optico principal.

A diferencia de los microscopios holograficos digitales conocidos, en el propuesto por el primer aspecto de la invention, de manera caracterlstica, los medios de registro del mismo registran dicho holograma en el plano imagen del sistema optico, permitiendo asl realizar el comentado enfoque en tiempo real que los MHDs del estado de la tecnica no permiten realizar.

El microscopio propuesto por el primer aspecto de la presente invencion hace un uso optimizado del espacio ancho de banda para obtener imagenes limitadas solamente por la difraccion.

Segun un ejemplo de realization, dicho sistema optico comprende, en dicho camino optico principal, un objetivo que recoge dicho haz generado en dicha muestra y una lente de tubo, formando dicho holograma en el plano focal imagen de dicha lente de tubo.

Ventajosamente, el sistema optico comprende tambien, en dicho camino optico principal, los siguientes elementos opticos, dispuestos en orden desde dicho punto de entrada del haz objeto hasta los medios de registro: un primer divisor de haz que permite el paso del haz objeto a su traves, una lente condensadora, un elemento porta-muestras, dicho objetivo, un espejo, dicha lente de tubo, un segundo divisor de haz que refleja el haz objeto, una lente, un espejo abatible o lamina separadora y una lente formadora de imagen.

El sistema optico del microscopio holografico digital propuesto por el primer aspecto de la invencion comprende tambien, en dicho camino optico de referencia, segun un ejemplo de realizacion, los siguientes elementos opticos, dispuestos en orden desde dicho punto de entrada del haz de referenciay los medios de registro: una lente colimadora de inclination variable que permite variar el angulo que forma el haz de referencia con el eje optico del microscopio, dicho segundo divisor de haz que permite el paso del haz de referencia a su traves, dicha lente, dicho espejo abatible o lamina separadora y dicha lente formadora de imagen.

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En general, el microscopio tambien comprende, dispuesto entre una de las salidas del divisor de haz de luz coherente y dicho punto de entrada del haz de referencia, un variador de intensidad y camino optico.

Si bien, para algunos ejemplos de realization, el microscopio propuesto por el primer aspecto de la invention es unicamente un MHD, para otro ejemplo de realizacion, mas preferido, el microscopio tambien es un microscopio optico, es decir que esta previsto tambien para la obtencion de imagenes por medio de microscopla optica, para lo cual comprende:

- una fuente de luz blanca dispuesta para iluminar dicha muestra;

- una disposition de elementos opticos que incluyen a los elementos opticos de dicho camino optico principal de dicho sistema optico dispuestos entre dicha fuente de luz blanca y los medios de registro; y

- dichos medios de registro que registran tambien una imagen optica de dicha muestra en el plano imagen del sistema optico.

Se constituye asl un microscopio hlbrido: MHD y optico, pudiendo trabajar, de manera alternativa, en cualquiera de los dos modos de operation: MHD u optico convencional, gracias a unos medios de selection incluidos en el microscopio para seleccionar trabajar en uno u otro modo.

Segun un ejemplo de realizacion, el microscopio comprende ademas una lente dispuesta a la salida de dicha fuente de luz blanca, un ocular dispuesto para recibir el haz de luz blanca reflejado por dicho espejo abatible o lamina separadora y permitir la vision directa de la imagen optica de la muestra y un mecanismo de enfoque.

De acuerdo con un ejemplo de realizacion, el microscopio del primer aspecto de la invencion comprende unos medios de control que controlan la operacion de los elementos del microscopio y que incluyen unos medios de procesamiento en conexion con los medios de registro que reciben el holograma registrado, en formato digital, y lo procesan para calcular la fase cuantitativa de la muestra.

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Un segundo aspecto de la presente invention concierne a un metodo para la obtencion de imagenes cuantitativas de fase por medio de microscopia holografica digital, que comprende, de manera en si conocida:

- generar un haz de luz coherente y dividirlo en un haz objeto y un haz de referencia;

- emitir dicho haz objeto sobre una muestra para generar en la misma un correspondiente haz por la transmision o reflexion de dicho haz objeto sobre dicha muestra, pasando dicho haz objeto por parte de un camino optico principal de un sistema optico y dicho haz generado por el resto de dicho camino principal, donde dicho camino principal comprende unos elementos opticos que constituyen un sistema afocal y telecentrico formado por al menos un objetivo, para recoger dicho haz generado en dicha muestra, y una lente de tubo; y

- registrar un holograma de dicha muestra a partir de un patron de interferencia de dicho haz de referencia y de dicho haz generado en la muestra.

A diferencia de los metodos conocidos, el propuesto por el segundo aspecto de la invencion comprende, de manera caracteristica, registrar dicho holograma en el plano imagen de dicho sistema optico, al final de dicho camino principal.

El metodo propuesto por el segundo aspecto de la invencion hace un uso optimizado del espacio ancho de banda para obtener imagenes limitadas unicamente por la difraccion y con minima perturbation de las imagenes cuantitativas de fase, segun se describira seguidamente en unos ejemplos de realization del metodo.

Segun un ejemplo de realizacion del metodo propuesto por el segundo aspecto de la invencion, el sistema optico es el sistema optico de un microscopio optico, realizandose dicho registro de dicho holograma en unos medios de registro del microscopio optico.

Para un ejemplo de realizacion preferido, el metodo comprende ajustar/optimizar los siguientes parametros del microscopio optico para proporcionar un holograma digital cuya imagen cuantitativa de fase tenga una resolution lateral maxima y perturbacion minima, y hacer un uso optimizado del espacio ancho de banda para obtener imagenes limitadas unicamente por la difraccion:

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NA: apertura numerica del objetivo del microscopio optico;

M: aumento lateral de dicho sistema telecentrico;

Ap: tamano de los plxeles de dichos medios de registro; y

^: angulo que forma el haz de referencia con el eje optico del microscopio;

de manera que se cumplan las siguientes relaciones:

NA A

----<--------------------- y

M V2 (V2 + 3^Ap

sin

'_3_ NA' M y

<$

donde X es la longitud de onda del haz de luz coherente.

La optimization de los parametros de captura permite al metodo obtener reconstrucciones de muestras transparentes con la mejor calidad posible tanto en terminos de la fase cuantitativa como de la distribution de intensidades. La insertion de un haz de referencia coherente en el sistema optico de un microscopio convencional en conjuncion con la detection en el plano imagen del microscopio facilita la caracterizacion del sistema pudiendo definir las condiciones que garanticen los siguientes puntos:

- Captura de un holograma limitado en difraccion: La resolution viene dada por el sistema optico y el medio de registro, no por el mal uso de los mismos.

- Reconstruction carente del posible ruido que introduce el orden cero de la difraccion en los ordenes objeto.

- Maximizacion del espacio-ancho de banda aprovechable en el dominio de las frecuencias espaciales.

- La resolucion no se ve alterada debido a factores de propagacion numerico.

Por perturbacion minima se hace referencia a los siguientes aspectos:

1. El uso del sistema telecentrico en plano imagen elimina los efectos asociados con los terminos cuadraticos de fase, tal cual como se ha presentado en [8] y en [23].

2. El hecho de satisfacer las condiciones presentadas en las relaciones arriba indicadas, elimina cualquier posible ruido fruto de la mezcla de los ordenes objeto y el orden cero de

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difraccion. Estos ruidos se manifiestan en un detrimento de la resolution espacial alcanzable con el microscopio holografico digital. Prueba de ello lo constituye el hecho de que en la referencia [19] se alcanza una resolution espacial que es del orden tres veces inferior a la cual la presente invention podrla alcanzar con el uso de una configuration similar a la presentada por los autores de la referencia [19].

3. La misma condition que reduce la resolution espacial del microscopio afecta a los valores registrados en las imagenes cuantitativas de fase.

4. Al registrar en el plano imagen se minimizan las aberraciones opticas que pueden ser introducidas por los objetivos de microscopio. El hecho de garantizar que el objeto esta ubicado en el plano objeto del objetivo de microscopio y su imagen se genera en el plano imagen del sistema formador de imagenes, hace uso del diseno optico optimizado para minimizar las aberraciones que podrla introducir el sistema de registro de los hologramas.

5. El registro en plano imagen elimina la necesidad de aplicar algoritmos de propagation numerica para recuperar la information enfocada del objeto. Este hecho reduce la introduction de ruido numerico propio de estos metodos.

El metodo comprende, segun un ejemplo de realization, capturar y procesar dicho holograma mediante la realization de las siguientes etapas de manera secuencial, en bucle cerrado:

- registro del holograma digital;

- calculo de la transformada de Fourier rapida del holograma digital;

- filtrado en el dominio de Fourier del orden objeto e identification automatica del angulo formado por el haz de referencia y su correspondiente compensation, si se trabaja fuera de eje, o corrimiento de fase, si se trabaja en eje;

- calculo de la transformada inversa de Fourier rapida del orden objeto; y

- calculo de la fase cuantitativa del especimen o muestra.

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Las anteriores etapas a realizar en bucle cerrado estan implementadas, para un ejemplo de realization, mediante un software adecuado a instalar en el sistema de control del propio microscopio optico y/o en un sistema de control adicional, constituyendo tal software un tercer aspecto de la invention relativo a un programa de ordenador que incluye instrucciones de codigo que cuando se ejecutan en un ordenador implementan dichas etapas.

Un cuarto aspecto de la invention concierne a un kit para adaptar un microscopio optico convencional para la obtencion de imagenes cuantitativas de fase por medio de microscopla holografica digital, que comprende, de manera en si conocida por [19]:

- una fuente de luz coherente y un divisor de haz de luz coherente conectado o a conectar a la salida de la misma para generar, por una primera salida, un haz objeto, con el que iluminar una muestra, y, por una segunda salida, un haz de referencia;

- unos primeros medios de guiado de luz coherente a conectar entre dicha primera salida de dicho divisor de haz de luz coherente y un punto de entrada de un camino optico principaldel microscopio optico que incluye unos elementos opticos que constituyen un sistema afocal y telecentrico y que discurre entre dicho punto de entrada y unos medios de registro del microscopio optico;

- unos segundos medios de guiado de luz coherente a conectar entre dicha segunda salida de dicho divisor de haz de luz coherente y un punto de entrada de un camino optico de referencia que comparte parte de los elementos opticos con dicho camino optico principal y que finaliza en dichos medios de registro; y

- un elemento optico a disponer en dicho camino optico de referencia para conferirle una inclination determinada al haz de referencia con respecto al eje optico del microscopio optico;

A diferencia de las propuestas conocidas, de manera caracterlstica, el kit propuesto por el cuarto aspecto de la invention comprende ademas:

- unos medios de soporte para soportar a dicho elemento optico con una inclination variable,

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- unos medios de actuation para variar la inclination del elemento optico, actuando sobre el mismo o sobre dichos medios de soporte, y

- un sistema de control en lazo cerrado para evaluar automaticamente en el espacio de Fourier una serie de parametros del microscopio optico que determinan el desempeno del microscopio cuando se utiliza para la obtencion de imagenes cuantitativas de fase por medio de microscopla holografica digital, es decir como MHD, determinar un valor optimo de angulo de inclination ^ para el haz de referencia, a partir del resultado de dicha evaluation, y controlar a dichos medios de actuacion para que realicen dicha variation de inclination de acuerdo con dicho valor optimo de angulo de inclination

Para la correcta operation del sistema de control en lazo cerrado, al montarse el kit en el microscopio optico, tal montaje incluira la debida conexion (via cable o de manera inalambrica) a unas entradas del sistema de control del kit de las salidas de unos correspondientes dispositivos sensores de tales parametros, asl como la conexion de una correspondiente salida del sistema de control con los medios de actuacion para el control de los mismos mediante el envlo de unas correspondientes senales electricas por dicha salida (via cable o de manera inalambrica).

El kit propuesto por el cuarto aspecto de la invention, una vez montado en el microscopio optico, constituye el microscopio propuesto por el primer aspecto de la invention en su modalidad hlbrida, y opera implementando el metodo del segundo aspecto.

Alternativa o complementariamente al uso de los medios de registro del microscopio optico convencional, el kit esta pensado para usar, y por tanto incluye, para un ejemplo de realization, unos medios de registro propios a instalar en el microscopio y adaptados para el registro de hologramas en el plano imagen.

Segun un ejemplo de realization, dichos medios de soporte y dichos medios de actuacion comprenden una plataforma de rotation motorizada configurada para variar la inclination del elemento optico por el giro de la misma.

De acuerdo con un ejemplo de realization:

- dichos primeros medios de guiado de luz coherente comprenden un tramo de fibra optica con un primer extremo a conectar a dicha primera salida del divisor de haz de luz

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coherente, y un conector de fibra optica a conectar a un segundo extremo de dicho tramo de fibra optica y previsto para acoplarse a una primera abertura de entrada del microscopio optico definida en dicho punto de entrada del camino optico principal; y

- dichos segundos medios de guiado de luz coherente comprenden un conductor de fibra optica, con un elemento variador de intensidad y camino optico incorporado, teniendo dicho conductor de fibra optica un primer extremo a conectar a dicha segunda salida del divisor de haz de luz coherente, y un conector de fibra optica a conectar a un segundo extremo de dicho conductor de fibra optica y previsto para acoplarse a una segunda abertura de entrada del microscopio optico definida en dicho punto de entrada del camino optico de referencia o a un elemento intermedio acoplado a dicha segunda abertura, tal como dicha plataforma de rotacion motorizada.

De acuerdo con un ejemplo de realization, el kit comprende ademas:

- un primer divisor de haz a disponer en el microscopio optico, reemplazando un primer espejo del mismo dispuesto entre una fuente de luz blanca y una lente condensadora del microscopio optico, de manera que dicho primer divisor de haz permita el paso del haz objeto a su traves y refleje el haz de luz blanca generado por dicha fuente de luz blanca, o viceversa, para dirigir a ambos hacia la lente condensadora; y

- un segundo divisor de haz a disponer en el microscopio optico, reemplazando un segundo espejo del mismo dispuesto entre una lente de tubo y una lente del microscopio optico, de manera que dicho segundo divisor de haz permita el paso del haz de referencia a su traves y refleje el haz proveniente de la lente de tubo, o viceversa, para dirigir a ambos hacia dichos medios de registro del microscopio optico.

Para un ejemplo de realizacion, dicho elemento optico de inclination variable es una lente colimadora de inclinacion variable a disponer entre el punto de entrada del haz de referencia y dicho segundo divisor de haz.

De acuerdo con un ejemplo de realizacion preferido, el sistema de control en lazo cerrado del kit incluye un algoritmo encargado de realizar dicha determination del valor optimo de angulo de inclinacion ^, por si solo o en colaboracion con un sistema electronico del microscopio optico, de manera que se cumpla la relation del metodo arriba expuesta para un ejemplo de realizacion preferido del mismo, en particular la relacion:

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sin

3 NA

M J

siendo los citados parametros del microscopio optico a evaluar en el espacio de Fourier: NA, M y Ap, cuyo significado ya se ha explicado anteriormente.

La presente invention, en sus tres aspectos (microscopio, metodo y kit de adaptation), al operar con imagenes registradas en plano imagen por medio de un sistema afocal- telecentrico no adolece de las desventajas descritas anteriormente en el apartado de estado de la tecnica anterior, y por ende permite obtener imagenes cuantitativas de fase en tiempo real. Adicionalmente, para el caso del microscopio hlbrido, la minima modification requerida del microscopio optico para obtener imagenes cuantitativas de fase, permite al usuario de manera simple y rapida pasar del modo de cuantificacion de fase al de operation convencional del microscopio optico. Esta caracterlstica es unica de la presente invencion.

El kit o modulo adaptable a un microscopio optico para obtener imagenes cuantitativas de fase por medio de MHD propuesto por el cuarto aspecto de la presente invencion, se diferencia tecnicamente de sus predecesores, ademas de por la inclusion del sistema de control en lazo cerrado y elementos asociados al mismo, en los siguientes aspectos:

• La minima modificacion requerida del microscopio optico para obtener imagenes cuantitativas de fase permite al usuario de manera simple y rapida pasar del modo de cuantificacion de fase al de operacion convencional del microscopio optico.

• Puesto que registra los hologramas en el plano imagen de un sistema afocal- telecentrico no demanda el uso de robustos sistemas de autoenfoque, propagation numerica y compensation de fase para obtener imagenes cuantitativas de fase.

• Permite obtener information del especimen en tiempo real. Puesto que no se requiere propagacion numerica para recuperar la informacion del experimento, el usuario puede observar en la pantalla del microscopio imagen cuantificada en fase del especimen.

• Aprovecha el diseno optimizado de los objetivos de microscopio por operar en sus planos objeto-imagen conjugados, lo que reduce las aberraciones opticas en los hologramas registrados.

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• Puede operar al llmite de la difraccion establecido para un microscopio optico convencional operando con los mismos objetivos.

• Las imagenes reconstruidas de fase de MHD no presentan aberracion de curvatura de fase [3], lo que elimina el empleo de complejos metodos numericos para su elimination a posteriori [1, 9-11, 18, 21].

• Por no requerir de metodos numericos para la compensation de la curvatura de fase, no sufre de la perturbation de las imagenes de fase debida a la curvatura remanente [23].

• Para muestras delgadas, las imagenes de fase no presentan envolvimiento de fase.

• Los ordenes difractados que portan la information de la muestra en estudio son puntos en el dominio espectral lo que facilita el correcto filtrados de imagenes gemelas y orden cero [18].

• La compensacion automatica del haz de referencia en configuraciones fuera de eje se facilita debido a la forma puntual de los ordenes difractados del holograma.

• Se hace uso optimizado del espacio ancho de banda disponible, lo que hace posible lograr resolution espacial comparable a la alcanzable por el microscopio optico operando con el mismo sistema de objetivos

El uso del microscopio, metodo y kit de la presente invention aportarla las siguientes

ventajas comparativas con respecto a los demas metodos para realizar imagenes

cuantitativas de fase:

1- Reduction de los costes necesarios para la obtencion de imagenes cuantitativas de fase.

2- Medida cuantitativa de fase en tiempo real para muestras sin tincion.

3- Minimization de posibles aberraciones opticas en el sistema formador de imagenes.

4- Utilization del manejo de muestras, estabilidad, robustez, entre otras caracterlsticas, que

ofrecen los microscopios comerciales.

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5- Posibilidad de operar en modo de cuantificacion de imagenes de fase o los modos de funcionamiento ofrecidos por el microscopio convencional huesped.

6- Utilization de software de procesamiento de facil uso, para obtener las imagenes cuantitativas de fase.

7- Operation optimizada al llmite de difraccion establecido por la optica del microscopio huesped.

8- Introduction de menor ruido numerico en el procesamiento de los hologramas registrados para calcular las imagenes cuantitativas de fase.

La presente invention tiene aplicacion en cualquier campo de la investigation y/o desarrollo en el cual la information de interes este o sea posible de codificar en information de fase de un campo optico que se propaga y no sea posible o no se desee tintar el especimen en estudio. Diversos sectores de las ciencias de la vida y de las ciencias de los materiales se pueden contar entre los posibles campos de aplicacion. Por ejemplo, en el campo de la biologla la medida cuantitativa de fase en muestras sin tintar es de gran interes ya que permite no solo la visualization cuantitativa de dichas muestras microscopicas sino que este proceso puede llevarse a cabo sin necesidad de introducir agentes externos en las mismas. Mediante la presente invencion serla posible compatibilizar la aparatologla empleada tlpicamente en microscopla con la tecnica MHD, aumentando la flexibilidad de dichas procedimientos de estudio y permitiendo la comparacion directa de los resultados obtenidos mediante el uso de otras tecnicas. Dado que el numero de operaciones necesarias para obtener las imagenes cuantitativas de fase es mucho menor que en un sistema MHD convencional, el manejo del software de la presente invencion se simplifica considerablemente haciendolo amigable al usuario y eliminando el incomodo proceso de registro previo de los hologramas.

Breve description de los dibujos

Las anteriores y otras ventajas y caracterlsticas se comprenderan mas plenamente a partir de la siguiente descripcion detallada de unos ejemplos de realization con referencia a los dibujos adjuntos, que deben tomarse a tltulo ilustrativo y no limitativo, en los que:

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la Fig. 1 muestra, de manera esquematica, un microscopio optico convencional con sus principales elementos, externos e internos, asl como la trayectoria que sigue por su interior el haz de luz blanca utilizado en el mismo;

la Fig. 2 muestra al microscopio holografico del primer aspecto de la invention, segun un ejemplo de realization, obtenido mediante la adaptation del microscopio de la Fig. 1 mediante el kit del cuarto aspecto de la invencion, ilustrandose la trayectoria del haz objeto y el haz de referencia utilizados en el mismo;

la Fig. 3 muestra al mismo microscopio de la Fig. 2, pero en este caso funcionando, de manera alternativa, como un microscopio optico convencional, de igual modo que el de la Fig. 1, demostrando asl el funcionamiento hlbrido (modo holografico y modo convencional) del microscopio del primer aspecto de la invencion, para un ejemplo de realizacion;

la Fig. 4 ilustra, de manera esquematica, las diferentes etapas, algunas esenciales y otras opcionales, a realizar, mediante un algoritmo adecuado, implementado por ejemplo por el programa de ordenador del tercer aspecto de la invencion, para adquirir y procesar el holograma de la muestra, habiendose incluido en esta Figura, para una mejor compresion de la misma, la imagen de un holograma capturado y las sucesivas imagenes que se van obteniendo al ejecutar el algoritmo;

La Fig.5 son unas imagenes que ilustran unos ejemplos de espectro del holograma (columna de la izquierda) y reconstruccion de la escena (columna de la derecha) para tres microscopios holograficos con diferentes configuraciones. (a) Configuration telecentrica con captura fuera del plano imagen (estado de la tecnica); (b) Configuracion telecentrica con captura en plano imagen, pero sin optimizar los parametros de captura (presente invencion); (c) Configuracion telecentrica con captura en plano imagen y con los parametros de captura optimizados (ejemplo preferido de la presente invencion); y

la Fig. 6 muestra, ampliadas, las dos imagenes de la columna derecha de los casos b) y c) de la Fig. 5.

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Description detallada de unos ejemplos de realization

En la Fig. 1 se ilustra un esquema de un microscopio optico comercial en el cual se muestran sus partes fundamentales y en llnea discontinua se presenta la trayectoria de la luz L1 en su interior, y que incluye los siguientes elementos: 21.-Fuente de luz blanca. 22.- Lente. 23, 23’, 23’’.-Espejos. 14.-Lente condensadora. 15.- Mesa porta-muestras. 16.- Objetivo de microscopio. 17.- Mecanismo de enfoque. 18.- Lente de tubo. 9.- Lente.10. - Espejo abatible o lamina separadora. 11.- Lente formadora de imagen. 12.- Medios de registro, en general una camara CCD. 13.- Ocular.

El camino optico que sigue el haz de luz blanca L1 hasta la camara CCD 12 es el que se ha dado en denominar en la presente descripcion como camino optico principal.

En las Figuras 2 y 3 se ilustra al microscopio hlbrido, es decir al que puede funcionar en modo MHD (ver Fig. 2) y en modo convencional (ver Fig. 3), una vez modificado, segun un ejemplo de realization, mediante el montaje de los elementos del kit del cuarto aspecto de la invencion, en particular de:

- una fuente de luz coherente 1, en general laser, y un divisor de haz de luz coherente 3 conectado a la salida de la misma (mediante un acoplador de fibra optica 2) para generar, por una primera salida, un haz objeto Lo, con el que iluminar una muestra (no ilustrada), y, por una segunda salida, un haz de referencia Lr;

- un tramo de fibra optica 4 con un primer extremo conectado a la primera salida del divisor de haz de luz coherente 3, y un conector de fibra optica 6 conectado a un segundo extremo del tramo de fibra optica 4 y acoplado a una primera abertura de entrada del microscopio optico definida en el punto de entrada del camino optico principal (por encima del elemento 8 en las Figs. 2 y 3);

- un conductor de fibra optica 4’, con un elemento variador de intensidad y camino optico 5 incorporado, teniendo dicho conductor de fibra optica 4’ un primer extremo conectado a la segunda salida del divisor de haz de luz coherente 3, y un conector de fibra optica 6’ conectado a un segundo extremo del conductor de fibra optica 4’ y acoplado a un elemento intermedio PM acoplado a un segunda abertura de entrada del microscopio optico definida en el punto de entrada del camino optico de referencia;

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- una lente colimadora de inclination variable 7 dispuesta en el camino optico de referenda para conferirle una inclination determinada al haz de referencia Lr con respecto al eje optico del microscopio optico;

- dicho elemento intermedio PM, el cual es una plataforma de rotation motorizada PM que soporta a la lente colimadora 7 y que, al girar, varla la inclination de la misma; y

- un sistema de control en lazo cerrado SC para evaluar automaticamente en el espacio de Fourier una serie de parametros del microscopio optico, determinar un valor optimo de angulo de inclination ^ para el haz de referencia Lr, a partir del resultado de dicha evaluation, y controlar a la plataforma de rotation motorizada PM para que realicen dicha variation de inclination de la lente colimadora 7 de acuerdo con el valor optimo de angulo de inclination

El kit tambien incluye:

- un primer divisor de haz 8 que se dispone en el microscopio optico reemplazando al primer espejo 23 (ver Fig. 1), y permite el paso del haz objeto Lo a su traves y la reflexion del haz de luz blanca L1; y

- un segundo divisor de haz 8’ que se dispone en el microscopio optico reemplazando al segundo espejo 23’’ (ver Fig. 1) y permite el paso del haz de referencia Lr a su traves y la reflexion del haz generado Lo’.

En una version mas basica del kit, este no incluye al sistema de control en lazo cerrado SC ni a la plataforma de rotation motorizada PM, montandose la lente colimadora 7 con una plataforma de rotation manual para modificar, en el microscopio optico, el angulo entre el haz objeto y el haz de referencia.

En la Fig. 2 se ilustra el funcionamiento del microscopio en modo MHD, donde el haz objeto Lo incide sobre la muestra (no ilustrada), y el haz generado Lo’ en dicha muestra, en este caso por la transmision del haz objeto Lo por la misma, sigue el resto del camino optico principal hasta la camara CCD o CMOS 12 (o cualquier otra clase de disposition que incorpore un arreglo matricial de elementos fotosensibles) donde tambien llega el haz de referencia Lr inclinado respecto a Lo’, registrandose en la camara CCD 12 un holograma de la muestra a partir de un patron de interferencia de ambos haces Lr y Lo’.

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Una de las caracterlsticas principales que aprovecha el microscopio y kit de la presente invencion, es el diseno optimizado de objetivo de microscopio 16 y lente de tubo 18 del microscopio optico comercial. Este diseno permite que los campos opticos registrados en el plano imagen de la lente de tubo 18 no presenten curvatura de fase, una caracterlstica esencial en MHD.

Al comparar la Fig. 1 con las Figs. 2 y 3 se observa que el microscopio modificado esta constituido por un numero pequeno de elementos perfectamente acoplables en el microscopio comercial, el cual es intervenido mlnimamente para insertar/reemplazar las mencionadas partes. Al estar acoplado a un microscopio comercial, el microscopio modificado utiliza ademas el manejo de muestras, estabilidad, y robustez, entre otras caracterlsticas, que ofrecen los microscopios comerciales.

La Fig. 3 muestra al mismo microscopio de la Fig. 2, pero en este caso funcionando, de manera alternativa, como un microscopio optico convencional, de igual modo que el de la Fig. 1, demostrando asl el funcionamiento hlbrido (modo holografico y modo convencional) del microscopio del primer aspecto de la invencion, para un ejemplo de realization. Esta figura muestra la posibilidad que brinda el microscopio y kit de la presente invencion de permitir al usuario pasar de modo de imagenes cuantitativas de fase a las imagenes tlpicas de un microscopio comercial. En su funcionamiento comercial, el microscopio podrla operar en algunos de los modos disponibles en el mercado.

Las imagenes registradas en la camara CCD 12 cuando el modo MHD esta activado, son procesadas siguiendo el esquema que se presenta en la Fig. 4. El algoritmo/software de adquisicion y procesado de los hologramas digitales incluye los siguientes pasos:

• Registro del holograma digital.

• Calculo de la transformada de Fourier rapida del holograma digital.

• Filtrado en el dominio de Fourier del orden objeto e identification automatica del angulo formado por el haz de referencia y su correspondiente compensation.

• Calculo de la transformada inversa de Fourier rapida del orden objeto.

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• Calculo de la fase cuantitativa del especimen.

Los pasos arriba mencionados representan un bucle cerrado (ver Fig.4) y dado que tanto el numero de operaciones necesarias es mlnimo y su tiempo de computo es corto, la implementation del software para visualization cuantitativa de fase en tiempo real es factible sin grandes requerimientos de hardware. Existen una serie de parametros libres que el usuario puede cambiar a voluntad: election del filtro empleado en el espacio de Fourier (position, forma y tamano), ajuste fino del angulo del haz de referencia (en caso de que fuese necesario), selection de la region de interes en el holograma e Indice de refraction del especimen a efectos de la medida cuantitativa del tamano axial del mismo. Exceptuando este ultimo parametro, el resto podrlan omitirse realizando un calibrado previo del microscopio que incluyese la information de los distintos objetivos de microscopio que se desean emplear.

Como calculos adicionales pueden obtenerse la amplitud del especimen a efectos de llevar a cabo el enfoque manual de este, asl como una representation tridimensional bien de la fase cuantitativa obtenida o de su correspondencia con el tamano real de la muestra.

Para un ejemplo de realization del microscopio y el kit propuestos por la presente invention, estos incluyen un software que implementa el algoritmo descrito, previamente instalado en un elemento de hardware (tal como el sistema de control SC), o en un medio de soporte adecuado, tal como un DVD, a partir del cual pueda instalarse en el propio sistema de control ya incluido en el microscopio optico.

En la Fig. 5 se muestra el resultado de experimentos en los que se ha obtenido la reconstruction de la imagen de un test de resolution (USAF 1951):

- Fig. 5(c): cuando el holograma se captura en las condiciones optimas de ajuste (que implican el cumplimiento de las relaciones descritas anteriormente que incluyen a NA, M, Ap y ^), es decir para un ejemplo de realizacion preferido de la presente invencion;

- Fig. 5(b):cuando se captura el holograma en plano imagen, pero sin ajustar los parametros del sistema, para un ejemplo menos preferido de la presente invencion ; y

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- Fig. 5(a): cuando el holograma se captura fuera del plano imagen, segun se aconseja en el estado de la tecnica.

Notese que en la Fig. 5 se ha mostrado en la columna de la izquierda la transformada de Fourier del holograma. Esta transformada es la que contiene la information que permite hacer la reconstruction. Solo en el caso de la Fig. 5(c) el contenido frecuencial del objeto (en el interior del clrculo continuo) se puede aislar sin interferencias con otros terminos perturbadores.

Como puede observarse en la Fig. 5, a pesar de que el microscopio de la presente invention esta trabajando con una NA menor, la calidad de la reconstruccion, tanto en terminos de resolution como de ruido, se ve claramente mejorada con respecto a los otros dos casos.

Para observar mejor la mejora en resolucion, en la Fig.6 se muestra una vista ampliada de las reconstrucciones para los casos b) y c), correspondientes a los ejemplos de realization de la presente invencion.

Con respecto a los tiempos de calculo, se ha hecho una comparacion de los tres casos realizando el procesamiento con MatLab en un procesador i7 de 4Gb de RAM (con otras maquinas se obtendrlan proporciones similares). En particular se ha comprobado que calcular la reconstruccion 5(c) a partir del holograma consume 117 mili-segundos (lo que ya en estos momentos proporciona una tasa de 8 imagenes por segundo) mientras que la reconstruccion 5(a) consume 462 mili-segundos (2 imagenes por segundo).

Todos los aspectos de la invencion presentan las siguientes caracterlsticas que lo diferencian de los metodos de cuantificacion de fase conocidos hasta el momento:

• Utilization de un sistema afocal-telecentrico para el registro de los hologramas [8]. Esta caracterlstica, que esta incorporada de forma nativa en la parte optica de los microscopios comerciales, elimina la curvatura de fase presente en los sistemas estandar de MHD, por lo cual no es necesario realizar ningun otro procedimiento de compensation para la cuantificacion de la fase [9-11].

• Captura de hologramas en el plano imagen del microscopio. Este metodo de registro permite tener informacion inmediata de la muestra en estudio, sin necesidad de

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calcular por metodos numericos el campo en un plano situado a distancia del plano de captura. Ademas el holograma capturado esta libre de aberraciones opticas, ya que en este caso el objetivo de microscopio se utiliza en su configuration optimizada por los fabricantes.

• Posibilidad de reenfoque numerico. Para aplicaciones en las cuales se trabaja con muestras tridimensionales, la presente invention permite reenfocar por medio de calculo numerico a las diferentes secciones de la muestra. Esto se ejecuta de manera analoga como lo hacen las tecnicas convencionales de MHD, es decir, aplicando los algoritmos basados en la propagation del espectro angular [12], o transformada de Fresnel [13].

• Se puede operar en configuracion fuera de eje o en eje [13]. Para la primera se permite la compensation automatica del haz de referencia. Para la segunda se emplea un metodo de corrimiento de fase [14, 15].

• La obtencion de imagenes cuya resolution esta limitada exclusivamente por la difraccion. Al eliminar la propagacion numerica por su registro en plano imagen, es posible ajustar el microscopio de forma que no se produzca un deterioro en la resolucion, lo que permite aprovechar al maximo la resolucion proporcionada por el microscopio optico usado como base.

• Menor numero de operaciones para obtener imagenes cuantitativas de fase. Puesto que no se requiere propagacion numerica ni compensacion numerica de la curvatura de fase, se puede proporcionar information cuantitativa de fase en tiempo real.

• Posibilidad de operar en modo de cuantificacion de imagenes de fase o los modos de funcionamiento ofrecidos por el microscopio convencional huesped.

Un experto en la materia podrla introducir cambios y modificaciones en los ejemplos de realization descritos sin salirse del alcance de la invencion segun esta definido en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (21)

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   REIVINDICACIONES

   1.- Microscopio para la obtencion de imagenes cuantitativas de fase por medio de microscopla holografica digital, que comprende:

   - una fuente de luz coherente (1) y un divisor de haz de luz coherente (3) dispuesto a la salida de la misma para generar un haz objeto (Lo), con el que iluminar una muestra, y un haz de referencia (Lr);

   - unos medios de registro (12) que registran un holograma de dicha muestra a partir de un patron de interferencia de dicho haz de referencia (Lr) y de un haz generado (Lo’) en dicha muestra por la transmision o reflexion de dicho haz objeto (Lo) sobre la misma; y

   - un sistema optico que incluye elementos opticos dispuestos distanciados entre si formando:

   - un camino optico principal entre un punto de entrada de dicho haz objeto (Lo) y dichos medios de registro (12), que incluye unos elementos opticos que constituyen un sistema afocal y telecentrico; y

   - un camino optico de referencia dispuesto entre un punto de entrada de dicho haz de referencia ydichos medios de registro (12), y que comparte parte de los elementos opticos con dicho camino optico principal;

   estando el microscopio caracterizado porque dichos medios de registro (12) registran dicho holograma en el plano imagen de dicho sistema optico.
2. 2. - Microscopio segun la reivindicacion 1, caracterizado porque dicho sistema optico comprende, en dicho camino optico principal, un objetivo (16) que recoge dicho haz generado (Lo’) en dicha muestra y una lente de tubo (18), formando dicho holograma en el plano focal imagen de dicha lente de tubo.
3. 3. - Microscopio segun la reivindicacion 2, caracterizado porque el sistema optico comprende, en dicho camino optico principal, los siguientes elementos opticos, dispuestos en orden desde dicho punto de entrada del haz objeto (Lo) hasta los medios de registro (12): un primer divisor de haz (8) que permite el paso del haz objeto a su traves, una lente

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   condensadora (14), un elemento porta-muestras (15), dicho objetivo (16), un espejo (23’), dicha lente de tubo (18), un segundo divisor de haz (8’) que refleja el haz objeto, una lente (9), un espejo abatible o lamina separadora (10) y una lente formadora de imagen (11).
4. 4. - Microscopio segun la revindication 3, caracterizado porque el sistema optico comprende, en dicho camino optico de referencia, los siguientes elementos opticos, dispuestos en orden desde dicho punto de entrada del haz de referencia (Lr) y los medios de registro (12): una lente colimadora de inclination variable (7) que permite variar el angulo que forma el haz de referencia con el eje optico del microscopio, dicho segundo divisor de haz (8’) que permite el paso del haz de referencia a su traves, dicha lente (9), dicho espejo abatible o lamina separadora (10) y dicha lente formadora de imagen (11).
5. 5. - Microscopio segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende, dispuesto entre una de las salidas del divisor de haz de luz coherente (3) y dicho punto de entrada del haz de referencia un variador de intensidad y camino optico (5).
6. 6. - Microscopio segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque esta previsto tambien para la obtencion de imagenes por medio de microscopla optica, para lo cual comprende:

   - una fuente de luz blanca (21) dispuesta para iluminar dicha muestra;

   - una disposition de elementos opticos que incluyen a los elementos opticos de dicho camino optico principal de dichosistema optico dispuestos entre dicha fuente de luz blanca (21) y los medios de registro (12); y

   - dichos medios de registro (12) que registran tambien una imagen optica de dicha muestraen el plano imagen del sistema optico.
7. 7. - Microscopio segun la reivindicacion 6 cuando depende de la 4, caracterizado porque comprende ademas una lente (22) dispuesta a la salida de dicha fuente de luz blanca (21), un ocular (13) dispuesto para recibir el haz de luz blanca reflejado por dicho espejo abatible o lamina separadora (10) y permitir la vision directa de la imagen optica de la muestra y un mecanismo de enfoque (17).

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8. 8. - Microscopio segun la reivindicacion 6 o 7, caracterizado porque comprende unos medios de selection para seleccionar trabajar de manera alternativa segun microscopia holografica digital o segun microscopia optica.
9. 9. - Microscopio segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende unos medios de control que controlan la operation de los elementos del microscopio y que incluyen unos medios de procesamiento en conexion con los medios de registro que reciben el holograma registrado, en formato digital, y lo procesan para calcular la fase cuantitativa de la muestra.
10. 10. - Metodo para la obtencion de imagenes cuantitativas de fase por medio de microscopia holografica digital, que comprende:

    - generar un haz de luz coherente y dividirlo en un haz objeto (Lo) y un haz de referencia (Lr);

    - emitir dicho haz objeto (Lo) sobre una muestra para generar en la misma un correspondiente haz (Lo’) por la transmision o reflexion de dicho haz objeto sobre dicha muestra, pasando dicho haz objeto (Lo) por parte de un camino optico principal de un sistema optico y dicho haz generado (Lo’) por el resto de dicho camino principal, donde dicho camino principal comprende unos elementos opticos que constituyen un sistema afocal y telecentrico formado por al menos un objetivo, para recoger dicho haz generado (Lo’) en dicha muestra, y una lente de tubo; y

    - registrar un holograma de dicha muestra a partir de un patron de interferencia de dicho haz de referencia (Lr) y de dicho haz generado (Lo’) en la muestra;

    estando el metodo caracterizado porque comprende registrar dicho holograma en el plano imagen de dicho sistema optico, al final de dicho camino principal.
11. 11. - Metodo segun la reivindicacion 10, caracterizado porque dicho sistema optico es el sistema optico de un microscopio optico, realizandose dicho registro de dicho holograma en unos medios de registro del microscopio optico.
12. 12.- Metodo segun la reivindicacion 11, caracterizado porque comprende ajustar los siguientes parametros del microscopio optico para proporcionar un holograma digital cuya

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    imagen cuantitativa de fase tenga una resolution lateral maxima y perturbation minima, y hacer un uso optimizado del espacio ancho de banda para obtener imagenes limitadas unicamente por la difraccion:

    NA: apertura numerica del objetivo del microscopio optico;

    M: aumento lateral de dicho sistema telecentrico;

    Ap: tamano de los plxeles de dichos medios de registro; y

    ^: angulo que forma el haz de referencia con el eje optico del microscopio;

    de manera que se cumplan las siguientes relaciones:

    NA

    M

    A

    (

    < :----y sin —j=-------

    -v/2 H2 + 3jAp W8^ M

    3 NA

    \

    donde X es la longitud de onda del haz de luz coherente.
13. 13. - Metodo segun la revindication 12, caracterizado porque comprende capturar y procesar dicho holograma mediante la realization de las siguientes etapas de manera secuencial, en bucle cerrado:

    - adquisicion del holograma digital;

    - calculo de la transformada de Fourier rapida del holograma digital;

    - filtrado en el dominio de Fourier del orden objeto e identification automatica del angulo formado por el haz de referencia y su correspondiente compensation, si se trabaja fuera de eje, o corrimiento de fase, si se trabaja en eje;

    - calculo de la transformada inversa de Fourier rapida del orden objeto; y

    - calculo de la fase cuantitativa del especimen o muestra.
14. 14. - Programa de ordenador que incluye instrucciones de codigo que cuando se ejecutan en un ordenador implementan las etapas del metodo segun la revindication 13.
15. 15. - Kit para adaptar un microscopio optico para la obtencion de imagenes cuantitativas de fase por medio de microscopla holografica digital, del tipo que comprende:

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    - una fuente de luz coherente (1) y un divisor de haz de luz coherente (3) conectado o a conectar a la salida de la misma para generar, por una primera salida, un haz objeto (Lo), con el que iluminar una muestra, y, por una segunda salida, un haz de referencia (Lr);

    - unos primeros medios de guiado de luz coherente a conectar entre dicha primera

    salida de dicho divisor de haz de luz coherente (3) y un punto de entrada de un camino

    optico principal del microscopio optico que incluye unos elementos opticos que constituyen un sistema afocal y telecentrico y que discurre entre dicho punto de entrada y unos medios de registro (12) del microscopio optico;

    - unos segundos medios de guiado de luz coherente a conectar entre dicha segunda

    salida de dicho divisor de haz de luz coherente (3) y un punto de entrada de un camino

    optico de referencia que comparte parte de los elementos opticos con dicho camino optico

    principal y que finaliza en dichos medios de registro (12);

    - un elemento optico a disponer en dicho camino optico de referencia para conferirle una inclination determinada al haz de referencia (Lr) con respecto al eje optico del microscopio optico;

    estando el kit caracterizado porque comprende ademas:

    - unos medios de soporte para soportar a dicho elemento optico con una inclinacion variable,

    - unos medios de actuation para variar la inclinacion del elemento optico, actuando sobre el mismo o sobre dichos medios de soporte,

    - un sistema de control en lazo cerrado para evaluar automaticamente en el espacio de Fourier una serie de parametros del microscopio optico que determinan el desempeno del microscopio cuando se utiliza para la obtencion de imagenes cuantitativas de fase por medio de microscopla holografica digital, determinar un valor optimo de angulo de inclinacion ^ para el haz de referencia (Lr), a partir del resultado de dicha evaluation, y controlar a dichos medios de actuacion para que realicen dicha variation de inclinacion de acuerdo con dicho valor optimo de angulo de inclinacion

    5

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    15

    20

    25

    30

    35
16. 16. - Kit segun la reivindicacion 15, caracterizado porque dichos medios de soporte y dichos medios de actuation comprenden una plataforma de rotation motorizada (PM) configurada para variar la inclination del elemento optico por el giro de la misma.
17. 17. - Kit segun la reivindicacion 15 o 16, caracterizado porque:

    - dichos primeros medios de guiado de luz coherente comprenden un tramo de fibra optica (4) con un primer extremo a conectar a dicha primera salida del divisor de haz de luz coherente (3), y un conector de fibra optica (6) a conectar a un segundo extremo de dicho tramo de fibra optica (4) y previsto para acoplarse a una primera abertura de entrada del microscopio optico definida en dicho punto de entrada del camino optico principal;

    - dichos segundos medios de guiado de luz coherente comprenden un conductor de fibra optica (4’), con un elemento variador de intensidad y camino optico (5) incorporado, teniendo dicho conductor de fibra optica (4’) un primer extremo a conectar a dicha segunda salida del divisor de haz de luz coherente (3), y un conector de fibra optica (6’) a conectar a un segundo extremo de dicho conductor de fibra optica (4’) y previsto para acoplarse a una segunda abertura de entrada del microscopio optico definida en dicho punto de entrada del camino optico de referencia o a un elemento intermedio acoplado a dicha segunda abertura.
18. 18. - Kit segun la reivindicacion 17 cuando depende de la 16, caracterizado porque dicho elemento intermedio es dicha plataforma de rotacion motorizada (PM).
19. 19. - Kit segun una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque comprende ademas:

    - un primer divisor de haz (8) a disponer en el microscopio optico, reemplazando un primer espejo (23) del mismo dispuesto entre una fuente de luz blanca (21) y una lente condensadora (14) del microscopio optico, de manera que dicho primer divisor de haz (8) permita el paso del haz objeto (Lo) a su traves y refleje el haz de luz blanca (L1) generado por dicha fuente de luz blanca (21), o viceversa, para dirigir a ambos hacia la lente condensadora (14); y

    - un segundo divisor de haz (8’) a disponer en el microscopio optico, reemplazando un segundo espejo (23’’) del mismo dispuesto entre una lente de tubo (18) y una lente (9) del microscopio optico, de manera que dicho segundo divisor de haz (8) permita el paso del

    10

    15

    haz de referenda (Lr) a su traves y refleje el haz proveniente de la lente de tubo (18), o viceversa, para dirigir a ambos hacia dichos medios de registro (12) del microscopio optico.
20. 20. - Kit segun la reivindicacion 19, caracterizado porque dicho elemento optico de inclinacion variable es una lente colimadora de inclinacion variable (7) a disponer entre el punto de entrada del haz de referencia y dicho segundo divisor de haz (8’).
21. 21. - Kit segun la reivindicacion 15, caracterizado porque dicho sistema de control en lazo cerrado incluye un algoritmo encargado de realizar dicha determination del valor optimo de angulo de inclinacion ^ de manera que se cumpla la relation del metodo segun la reivindicacion 12:

    sin

    ' NA'

    Ky/Stf M j

    siendo dichos parametros del microscopio optico a evaluar en el espacio de Fourier: NA, M y Ap.