KR20160086347A

KR20160086347A - 디지털 홀로그래픽 현미경 관찰술을 이용한 정량적 위상 이미지 획득용 현미경, 방법, 및 컴퓨터 프로그램

Info

Publication number: KR20160086347A
Application number: KR1020167014454A
Authority: KR
Inventors: 에밀리오 산체스 오티가; 마누엘 마르티네즈 코랄; 아나 도블라스 엑스포지토; 제나로 사아베드라 토르토사; 조르지 가르시아 수세르쿠이아
Original assignee: 유니버시타트 데 발렌시아; 유니버시다드 나시오날 데 콜롬비아
Priority date: 2013-10-30
Filing date: 2014-10-27
Publication date: 2016-07-19
Also published as: ES2534960B1; WO2015063566A1; US20160252880A1; US9915919B2; ES2534960A1; CO7250123A1

Abstract

본 발명은 디지털 홀로그래픽 현미경 관찰술을 통해 정량적 위상 이미지 획득을 위한 현미경, 방법, 및 컴퓨터 프로그램과, 광학 현미경 적응용 키트에 관한 것이다.
현미경은,
샘플을 조명하기 위한 물체 빔(Lo)과, 기준 빔(Lr)을 생성하기 위한 간섭성 광원(1)과 빔 스플리터(3)와,
텔레센트릭 어포컬 시스템을 구성하는 주 광 경로와, 기준 광 경로를 가진 광학 시스템과,
광학 시스템의 이미지 평면에 상기 샘플의 홀로그램을 레코딩하는 레코딩 수단(12)을 포함한다.
상기 방법은 광학 텔레센트릭 어포컬 시스템의 이미지 평면에 홀로그램을 레코딩하는 단계를 포함한다.
컴퓨터 프로그램은 상기 방법의 단계들의 일부분을 구현하도록 적응된다.
키트는 기준 빔의 경사 각도를 변경시키기 위한 수단을 포함한다.

Description

디지털 홀로그래픽 현미경 관찰술을 이용한 정량적 위상 이미지 획득용 현미경, 방법, 및 컴퓨터 프로그램과, 광학 현미경 적응용 키트 {MICROSCOPE, METHOD AND COMPUTER PROGRAM FOR OBTAINING QUANTITATIVE PHASE IMAGES BY MEANS OF DIGITAL HOLOGRAPHIC MICROSCOPY, AND KIT FOR ADAPTING AN OPTICAL MICROSCOPE}

제 1 형태에서, 본 발명은 일반적으로, 광학 텔레센트릭 어포컬 시스템(optical telecentric afocal system)을 포함하는 디지털 홀로그래픽 현미경 관찰술을 이용한 정량적 위상 이미지 획득을 위한 현미경에 관한 것이며, 특히, 광학 시스템의 이미지 평면 내 홀로그램을 레코딩하는 레코딩 수단을 갖춘 현미경에 관한 것이다.

발명의 제 2 형태는 광학 텔레센트릭 어포컬 시스템의 이미지 평면에 홀로그램의 레코딩을 포함하는 디지털 홀로그래픽 현미경 관찰술을 통한 정량적 위상 이미지 획득 방법에 관련된다.

발명의 제 3 형태는 제 2 형태의 방법의 단계들의 일부분을 구현하기에 적합한 컴퓨터 프로그램에 관련된다.

발명의 제 4 형태는 다른 요소들 중에서도, 기준 빔의 경사 각도를 제어 및 변화시키기 위한 수단을 포함하는, 디지털 홀로그래픽 현미경 관찰술을 이용한 정량적 위상 이미지 획득을 위한 광학 현미경 구성 키트에 관련된다.

DHM(디지털 홀로그래픽 현미경 관찰술)을 고유하게 만드는 특성은 라벨을 붙이거나 더럽힐 필요없이 마이크로스코픽 치수로 투명 샘플의 정량적 위상 이미지를 획득하는 기능이다[3, 4, 6].위상 물체를 분석할 수 있는 다른 현미경 관찰술 방법이 존재하지만, 이들은 시편의 위상의 정성적 정보만을 제공할 뿐이며[16], Zernike 및 Nomarski-법과 같은 방법들은 이러한 카테고리에서 언급될 수 있다. DHM은 디지털 홀로그래피의 원리를 이용함으로써 물체에 의해 회절되는 복합 진폭을 불러올 수 있다. 물체에 의해 회절되는 복합 진폭을 알게됨으로써, 진폭 또는 위상 이미지를 연산하는 것이 가능하다.

종래의 DHM-법 [1-4, 6, 7, 9, 10, 18, 19]은 이미지 평면을 벗어난 레코딩을 이용하며, 및/또는 홀로그램 레코딩을 위해 어포컬-텔레센트릭 시스템을 이용하지 않는다. 이미지 평면을 벗어난 레코딩은 DHM의 현대적 발전의 시작으로부터 내려온 특성으로서, 가장 넓게 퍼져있고[4], 오늘날까지 보존되고 있다[5, 20]. 이러한 조건은 DHM에 여러 원치않는 특성을 야기한다:

- 실시간으로 시편의 정보를 획득하는 것이 불가능하다. 실험 정보를 불러들이기 위해 수치 전파 알고리즘의 적용이 요구되고, DHM 사용자는 현미경 디스플레이 상에 시편의 이미지 대신에 홀로그램을 본다.

- 레코딩된 홀로그램에 광학적 수차를 야기시키는, 켤레 물체-이미지 평면에서 작동하기 위한 현미경 대물렌즈의 최적화된 설계를 완전하게 이용하지 않는다.

- 두가지 선행 특성은 함께, 오늘날 가용한 DHM 시스템을, (종래의 광학 현미경에 의해 제공되는 이미지로 나타나는 것처럼) 회절에 의해서만 제한되는 분해능을 가진 이미지를 제공할 수 없게 하고, 대신에 훨씬 나쁜 해상도를 가진 이미지를 제공하게 된다.

이미지 평면을 벗어난 레코딩에서처럼, DHM 시스템에서 홀로그램을 레코딩하기 위한 논-어포컬(non-afocal) 텔레센트릭 기법의 이용이 시작 이래 제안되었고[3, 4], 오늘날까지 유지되고 있다[5, 21]. DHM 홀로그램 레코딩을 위한 소정의 대안들이 무헌에서 제안된 바 있다[7, 8, 22]. DHM에 흔히 사용되는 논-어포컬-텔레센트릭 구조는 시스템이 다음의 어려움을 가짐을 의미한다:

- 재구성된 DHM위상 이미지는 위상 만곡 수차[3]를 갖고, 이는 후험적 제거를 위한 복잡한 수치 계산법의 이용을 수반한다[1, 9-11, 18, 21].

- 위상 만곡 보상을 위한 수치 계산법의 복잡도에 추가하여, 상기 수치 근사가 정량적 위상 측정을 방해하는 잔류 만곡을 유지함이 입증되었다[23].

- 연구 중인 샘플 두께에 대한 중요도없이, 위상 이미지는 레코딩 시스템의 만곡으로부터 내재된 위상 래핑(phase wrapping)을 진행한다[1, 3-5, 21]

- 연구 중인 샘플의 정보를 운반하는 회절된 차수는 스펙트럼 도메인에서 산란되어, 0-차수 및 트윈 이미지의 정확한 필터링을 어렵게 한다.

- 축을 벗어난 구조에서 기준 빔의 자동 보상은 홀로그램의 회절 차수의 산란으로 인해 더 어려워진다.

- 회절된 차수의 산란은 가용 대역폭 공간을 제한하여, DHM에 의해 얻을 수 있는 제한적인 공간 분해능을 감소시키고, 이는 어느 경우에도, 동일한 대물 렌즈 시스템으로 작동되는 광학 현미경에 의해 얻을 수 있는 값보다 적을 것이다.

앞서 표시된 부정적 특성의 해법은 높은 컴퓨팅 및 경제적 비용으로 후험적 위상 정량화의 작업을 배타적으로 수행하는 DHM 시스템의 제안으로 귀결되었다. 이 방법의 높은 컴퓨팅 비용은 실시간 인증되는 위상 정보를 필요로하는 작업에 대한 적용을 제한하고, 그 높은 경제적 비용은 이 기술을 매우 드문 연구 및 개발 센터의 배타적 툴로 만들었다.

일반적으로, DHM에 의한 초기의 위상 정량화 시스템은 독립적 현미경의 개발을 통해 수행되었고, 이미지 평면-외 레코딩을 이용하였고, 일반적으로 어포컬-텔레센트릭 시스템을 이용하지 않았다. 이러한 이유로, DHM에 의한 초기 위상 정량화 방법에서는 i) 홀로그램으로부터 불러들여지는 복합 필드를 전파시켜야 하고, ii) 논-어포컬-텔레센트릭 레코딩 시스템의 이용에 의해 야기되는 위상 만곡을 수치적으로 보상해야만 한다. 이러한 조건은 현재의 DHM 시스템을 위해 매력적이지 않은 기언급한 특성들을 수반한다.

그럼에도 불구하고, DHM에 어포컬-텔레센트릭 시스템의 이용을 제안하는 논문들이 있으며[8], 수치 보상 프로세스의 잔류 위상 만곡이 정량적 위상 이미지에 대해 갖는 효과가 연구된 바 있다[23].

[8]에서 설명되는 어포컬-텔레센트릭 시스템을 가진 DHM에서, 잘 알려진 DHM에서처럼, 홀로그램은 이미지 평면에 대해 더 떨어진 평면에서 레코딩되고, 이는 예를 들어 [3, 20]에서와 같이, 당 업계에서 추천된 평면이며,

높은 공간 주파수의 송출[20] 또는 물체의 밝은 세부사항의 레코딩 시, 디지털 카메라의 동적 범위를 부적절하게 이용하는, 등의 문제를 방지하기 위해 축-외 홀로그래피를 위한 현미경의 초점 또는 이미지 평면에 대해 훨씬 더 떨어져 있는 평면 내 홀로그램을 레코딩할 것을 당 업계에서 추천한다.

이 모두는 당 업계에 알려진 홀로그래픽 현미경에서, 연구 중인 시편을 전혀 닮지 않은 홀로그램이 획득되고, 따라서 이미지가 촬영될 때 샘플이 포커싱될 수 없으며, 즉, 실시간으로 포커싱될 수 없어서, 실시간으로 시편 정보 획득이 가능하지 않고, 사후 처리[39] 및 수치 전파가 실험 정보 불러오기를 위해 필요하다.

요컨데, 샘플 상에서 포커싱할 수 있는, 그리고 2D 이미지를 얻을 수 잇는 종래의 광학 현미경이 존재하며, 다른 한편, 실시간으로 샘플에 포커싱될 수 없고, 후험적 방법을 통해 샘플의 3D 정보를 불러들일 수 있는 홀로그램의 레코딩이 불가능한 홀로그래픽 현미경이 존재한다. 현재의 DHM 사용자가 실시간으로 샘플 상에 포커싱하는 것이 불가능한데, 왜냐하면, 사용자가 시편의 실제 이미지 대신에 홀로그램을 현미경 디스플레이 상에서 보기 때문이다. 포커싱은 레코딩된 홀로그램의 서로 다른 프로세싱을 이용하여 디지털 방식으로 이루어진다.

문헌 [24-28]은 시장에서 생산되는 기존 DHM의 서로 다른 제안을 설명하며, 문헌 [29-37]은 당 업계의 서로 다른 DHM을 설명하는 특허 문서다.

다른 한편, 문헌 [19] 및 [38]은 상업용 Zeiss® axioplan 2 현미경 상의 DHM 모듈 또는 키트의 구현예를 설명한다. 상기 모듈은 문헌 [6]과 동일 저자에 의해 제시되는 원리 하에 작동하며, 이는 호스트 현미경에 의해 구축된 회절 한도를 얻을 수 없기 때문에, 공간 분해능 측면에서 우수한 결과를 실현할 수 없는 시스템을 상기 모듈의 구현을 통해 획득하는 DHM 현미경을 만든다. 마찬가지로, 시편의 정보를 불러들이는데 요구되는 작동의 수로 인해, 재구성이 실시간으로 구현될 수 없다. 명백하게도, 당 분야의 조언을 따름으로써, 홀로그램이 이미지 평면과는 다른 평면에서 레코딩된다.

문헌 [38]의 디바이스의 측방 해상도(예를 들어, USAF 1951 검사로 측정가능)는 (홀로그램이 잔류 위상 요인에 의해 오염되기 때문에 분해능 손실을 생성하는) 텔레센트릭 구조를 이용하지 않기 때문에, 이미지 평면에 대해 떨어진 평면에 홀로그램을 레코딩하기 때문에, 그리고, 최적 세팅을 이용하지 않기 때문에, 명확히 개선될 수 있다.

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실시간으로 포커싱할 수 있고, 홀로그램 레코딩 시스템의 광학계에 의해 구축되는 공간 분해능을 얻을 수 있으며, 대역폭 공간의 이용을 최적화시킬 수 있도록, 당 분야에 알려진 결과 및 성능을 넘어서는 결과 및 성능을 제공하는 DHM 및 작동 방법을 제공함으로써 알려진 결함을 해소시키는 당 분야의 대안을 제공할 필요가 있다.

이러한 용도로, 제 1 형태에서, 본 발명은 디지털 홀로그래픽 현미경 관찰술을 이용한 정량적 위상 이미지 획득을 위한 현미경에 관한 것이며,

샘플을 조명하기 위한 물체 빔과 기준 빔을 생성하기 위해 출력부에 배열되는 간섭성 광원 및 간섭성 광빔 스플리터와,

상기 물체 빔의 투과 또는 반사에 의해 상기 샘플에서 생성되는 빔 및 상기 기준 빔의 간섭 패턴으로부터 상기 샘플의 홀로그램을 레코딩하는 레코딩 수단과,

서로로부터 이격되어 배열되는 광학 요소들을 포함하는 광학 시스템을 포함하며, 상기 광학 시스템은,

텔레센트릭 어포컬 시스템을 구성하는 광학 요소들을 포함하는, 상기 레코딩 수단과 상기 물체 빔의 진입점 사이의 주 광 경로와,

상기 레코딩 수단과 상기 기준 빔의 진입점 사이에 배열되어, 상기 주 광 경로와 광학 요소들의 일부분을 공유하는, 기준 광 경로를 포함한다.

알려진 디지털 홀로그래픽 현미경과 달리, 발명의 제 1 형태에서 제안되는 현미경에서는, 레코딩 수단이 광학 시스템의 이미지 평면에 상기 홀로그램을 레코딩하는 것을 특징으로 하며, 따라서, 당 업계의 DHM이 수행할 수 없는 실시간 포커싱을 수행할 수 있다.

본 발명의 제 1 형태에 의해 제안되는 현미경은 회절에 의해서만 제한되는 이미지 획득을 위한 대역폭 공간의 이용을 최적화시킨다.

일 실시예에 따르면, 상기 광학 시스템은 상기 샘플에서 생성되는 상기 빔을 수집하는 대물 렌즈와, 상기 튜브 렌즈의 이미지 초점 평면에 상기 홀로그램을 형성하는 튜브 렌즈를, 상기 주 광 경로 내에 포함한다.

유리하게도, 광학 시스템은 상기 레코딩 수단에 물체 빔의 상기 진입점으로부터 순서대로, 물체 빔을 통과시키는 제 1 빔 스플리터와, 집광 렌즈와, 샘플 홀더와, 상기 대물 렌즈와, 미러와, 상기 튜브 렌즈와, 샘플에서 생성된 빔을 반사시키는 제 2 빔 스플리터와, 렌즈와, 스윙 미러 또는 분리판과, 이미징 렌즈를 상기 주 광 경로에 또한 포함한다.

발명의 제 1 형태에 의해 제안되는 디지털 홀로그래픽 현미경의 광학 시스템은, 일 실시예에 따라, 상기 레코딩 수단 및 상기 기준 빔의 상기 진입점으로부터 순서대로, 현미경의 광학축과 함께 기준 빔에 의해 형성되는 각도를 변경시키는 가변 경사의 시준 렌즈와, 기준 빔을 통과시키는 상기 제 2 빔 스플리터와, 상기 렌즈와, 상기 스윙 미러 또는 분리판과, 상기 이미징 렌즈를, 상기 기준 광 경로에 또한 포함한다.

일반적으로, 현미경은 기준 빔의 상기 진입점과 간섭성 광빔 스플리터의 출력들 중 하나 사이에 배열되는 세기 및 광 경로 변경기를 또한 포함한다.

일부 실시예에서, 발명의 제 1 형태에 의해 제안된 현미경이 DHM 뿐임에도 불구하고, 다른 더 선호되는 실시예에서 현미경은 광학 현미경을 이용하여 이미지를 획득하도록 또한 구성되는, 광학 현미경이며, 이러한 용도로,

상기 샘플을 조명하도록 배열되는 백색 광원과,

상기 백색 광원과 상기 레코딩 수단 사이에 배열되는 상기 광학 시스템의 상기 주 광 경로의 광학 요소들을 포함하는 광학 요소들의 배열과,

광학 시스템의 이미지 평면에서 상기 샘플의 광학 이미지를 또한 레코딩하는 상기 레코딩 수단을 포함한다.

따라서, 일 모드 또는 다른 모드로의 작동을 선택하도록 현미경에 포함되는 선택 수단으로 인해, DHM 또는 기존 광학 작동 모드의 두 모드 중 하나로 교번 방식으로 작동할 수 있는 하이브리드 현미경, 즉, DHM 및 광학 현미경이 형성된다.

일 실시예에 따르면, 상기 현미경은 상기 백색 광원의 출력부에 배열되는 렌즈와, 상기 스윙 미러 또는 분리판에 의해 반사되는 백색 광빔을 수신하도록, 그리고 상기 샘플의 광학 이미지를 직접 관찰할 수 있도록, 배열되는 접안 렌즈와, 포커싱 메커니즘을 더 포함한다.

일 실시예에 따르면, 발명의 제 1 형태의 현미경은 현미경의 요소들의 작동을 제어하는 제어 수단을 포함하고, 상기 제어 수단은 레코딩 수단과 연계하여, 디지털 포맷으로 레코딩된 홀로그램을 수신하는, 그리고, 샘플의 정량적 위상을 연산하도록 처리하는 프로세싱 수단을 포함하는, 제어 수단을 포함한다.

본 발명의 제 2 형태는 디지털 홀로그래픽 현미경 관찰술을 이용한 정량적 위상 이미지 획득 방법에 관련되며, 상기 방법은,

간섭성 광빔을 생성하여, 물체 빔 및 기준 빔으로 분리시키는 단계와,

상기 물체 빔을 샘플 상에 방사하는 단계 - 상기 샘플 상에서 상기 물체 빔의 투과 또는 반사에 의해 대응하는 빔이 상기 샘플에서 생성되고, 상기 물체 빔은 광학 시스템의 주 광 경로의 일부분을 통과하고, 상기 생성된 빔은 상기 주 경로의 나머지를 통과하며, 상기 주 경로는 튜브 렌즈와, 상기 샘플에서 생성된 상기 빔을 수집하기 위한 적어도 하나의 대물 렌즈에 의해 형성되는 텔레센트릭 어포컬 시스템을 구성하는 광학 요소들을 포함함 - 와,

샘플에서 생성되는 상기 빔 및 상기 기준 빔의 간섭 패턴으로부터 상기 샘플의 홀로그램을 레코딩하는 단계를 포함한다.

알려진 방법과 달리, 발명의 제 2 형태에 의해 제안되는 방법은, 상기 주 경로의 종료부에서 상기 광학 시스템의 이미지 평면에 상기 홀로그램을 레코딩하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

발명의 제 2 형태에 의해 제안되는 방법은, 이 방법의 여러 실시예에서, 아래 설명되는 바와 같이, 정량적 위상 이미지의 최소 섭동과, 회절에 의해서만 제한되는 이미지 획득을 위한 대역폭 공간의 이용을 최적화시킨다.

발명의 제 2 형태에 의해 제안되는 방법의 일 실시예에 따르면, 광학 시스템은 광학 현미경의 광학 시스템이고, 상기 홀로그램의 레코딩은 광학 현미경의 레코딩 수단에서 수행된다.

선호 실시예의 경우에, 상기 방법은 디지털 홀로그램의 정량적 위상 이미지가 최대 측방 분해능 및 최소 섭동(perturbation)을 갖도록, 디지털 홀로그램을 제공하기 위해 광학 현미경의 다음 파라미터들을 설정/최적화하고, 회절에 의해서만 제한되는 이미지 획득을 위한 대역폭 공간의 이용을 최적화하는 단계를 포함한다.

NA: 광학 현미경의 대물 렌즈의 개구수

M: 상기 텔레센트릭 시스템의 측방 배율,

Δp: 상기 레코딩 수단의 화소 크기,

φ: 다음 수식을 충족시키도록 현미경의 광학축과 기준 빔에 의해 형성되는 각도

및

이때, λ는 간섭성 광빔의 파장이다.

캡처 파라미터의 최적화는 정량적 위상 및 세기 분포 모두의 측면에서 가능한 최고의 품질을 가진 투명 샘플 재구성을 획득하는 방법을 가능하게 한다. 현미경의 이미지 평면서의 검출과 연계하여 기존 현미경의 광학 시스템에서 간섭성 기준 빔의 삽입은, 시스템 특성화를 촉진시키며, 다음의 사항들을 보증하는 조건들이 규정되어야 한다:

- 회절-제한 홀로그램의 캡처: 분해능은 광학 시스템 및 레코딩 수단에 의해 결정되며, 그 오사용에 의해 결정되는 것이 아니다.

- 물체-차수 내 제로-차수의 회절을 삽입하는 노이즈 가능성이 없는 재구성.

- 공간 주파수 도메인에서 사용가능 대역폭-공간의 최대화.

- 수치 전파 요인으로 인해 분해능이 변경되지 않는다.

최소 섭동은 다음 형태를 의미한다:

1. 이미지 평면 내 텔레센트릭 시스템 이용은 문헌 [8], [23]에 제시된 바와 같이, 2차 위상 항과 연관된 효과를 제거한다.

2. 앞서 표시되는 수식에서 제시된 조건들을 충족시킴으로써, 물체-차수 및 제로-차수 회절의 조합 결과로 임의의 노이즈 가능성을 제거한다. 이러한 노이즈는 디지털 홀로그래픽 현미경으로 얻을 수 있는 공간 분해능의 손상으로 나타날 수 있다. 이는 문헌 [19]가, 문헌 [19]의 저자에 의해 설명된 것과 유사한 구조를 이용함으로써 본 발명이 얻을 수 있는 분해능보다 3배 낮은 정도의 공간 분해능을 얻는다는 점에 의해 입증되었다.

3. 현미경의 공간 분해능을 감소시키는 동일 조건이 정량적 위상 이미지에 레코딩되는 값에 영향을 미친다.

4. 이미지 평면에서의 레코딩은 현미경 대물 렌즈에 의해 야기될 수 있는 광학적 수차를 최소화시킨다. 물체가 현미경 대물렌즈의 물체 평면에 위치함을 보증하고 이미지가 이미지 형성 시스템의 이미지 평면에서 생성됨을 보증하기 위해, 홀로그램 레코딩 시스템에 의해 야기될 수 있는 수차를 최소화하도록 최적화된 광학 설계의 이용이 이루어진다.

5. 이미지 평면에서의 레코딩은 물체의 포커싱된 정보를 불러들이기 위해 수치 전파 알고리즘을 적용할 필요성을 제거한다. 이는 이러한 방법들의 수치적 노이즈 특성 발생을 감소시킨다.

일 실시예에 따르면, 방법은

- 디지털 홀로그램을 레코딩하는 단계와,

- 디지털 홀로그램의 고속 퓨리에 변환을 연산하는 단계와,

- 퓨리에 도메인에서 물체-차수를 필터링하고, 축 바깥에서 작업할 경우 이에 대응하는 보상, 또는, 축 안에서 작업할 경우 위상 변이와, 기준 빔에 의해 형성되는 각도를 자동 식별하는 단계와,

- 물체-차수의 인버스 고속 퓨리에 변환을 연산하는 단계와,

- 시편 또는 샘플의 정량적 위상을 연산하는 단계를,

폐-루프에서 순차적으로 수행함으로써 상기 홀로그램을 캡처 및 처리하는 단계를 포함한다.

폐-루프에서 수행될 선행 단계들은 일 실시예의 경우에, 실제 광학 현미경의 제어 시스템에서 및/또는 추가적인 제어 시스템에서 설치될 적절한 소프트웨어를 이용하여 구현되며, 이러한 소프트웨어는 컴퓨터에서 실행될 때 상기 단계들을 구현하는 코드 명령어를 포함하는 컴퓨터 프로그램에 관한 발명의 제 3 형태를 구성한다.

발명의 제 4 형태는 문헌 [19]를 통해 알려진 바와 같이, 디지털 홀로그래픽 현미경 관찰술을 이용한 정량적 위상 이미지 획득을 위한 기존 광학 현미경 구성용 키트에 관한 것으로서, 상기 키트는,

샘플을 조명하는 물체 빔을 제 1 출력을 통해 생성하고, 기준 빔을 제 2 출력을 통해 생성하도록, 출력부에 연결되는 간섭성 광원 및 간섭성 광빔 스플리터와,

광학 현미경의 주 광 경로의 진입점과 상기 간섭성 광빔 스플리터의 상기 제 1 출력 사이에 연결될 제 1 간섭성 광 안내 수단 - 상기 광학 현미경의 광학 요소들은 텔레센트릭 어포컬 시스템을 구성하고, 상기 주 광 경로는 상기 광학 현미경의 레코딩 수단과 상기 진입점 사이에서 연장됨 - 와,

상기 레코딩 수단에서 종료되는, 상기 주 광 경로와 상기 광학 요소들의 일부분을 공유하는 기준 광 경로의 진입점과 상기 간섭성 광빔 스플리터의 상기 제 2 출력 사이에 연결되는 제 2 간섭성 광 안내 수단과,

상기 광학 현미경의 광학축에 대해 기준 빔에 대한 경사를 부여하기 위해 상기 기준 광 경로에 배열되는 광학 요소를 포함한다.

알려진 제한들과 달리, 발명의 제 4 형태에 의해 제안된 상기 키트는,

가변 경사로 상기 광학 요소를 지지하기 위한 지지 수단과,

상기 광학 요소에 또는 상기 지지 수단에 작용하는, 상기 광학 요소의 경사를 변화시키기 위한 액추에이션 수단과,

디지털 홀로그래픽 현미경 관찰술을 이용하여 정량적 위상 이미지를 획득하는데 사용될 때, 즉, DHM으로 사용될 때, 현미경의 성능을 결정하는 광학 현미경의 일련의 파라미터를 퓨리에 공간에서 자동적으로 평가하기 위한, 그리고, 상기 평가의 결과로부터 기준 빔의 경사 각도 φ의 최적 값을 결정하기 위한, 그리고, 상기 경사 각도 φ의 상기 최적 값에 따라 상기 경사 변화를 수행하도록 상기 액추에이션 수단을 제어하기 위한, 폐-루프 제어 시스템을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

폐-루프 제어 시스템의 정확한 작동을 위해, 키트가 광학 현미경 상에 장착될 때, 이러한 장착은 키트의 제어 시스템의 유입구에 이러한 파라미터를 감지하는 대응 디바이스의 출력을 (케이블 또는 무선으로) 적절히 연결하는 과정과, (케이블 또는 무선으로) 상기 출력을 통해 대응하는 전기 신호를 전송함으로써 제어 시스템의 대응 출력을 이의 제어를 위한 액추에이션 수단과 연결하는 과정을 포함할 것이다.

광학 현미경 상에 장착될 때, 발명의 제 4 형태에 의해 제안되는 키트는 발명의 제 1 형태에 의해 제안된 하이브리드 현미경을 형성하고, 제 2 형태의 방법을 구현함으로써 작동한다.

기존 광학 현미경의 레코딩 수단 이용에 대한 대안으로서 또는 상보적으로, 키트는 이미지 평면에 홀로그램을 레코딩하도록 구성되는, 현미경에 설치될 자체 레코딩 수단을 이용하고자 하며, 따라서 일 실시예의 경우, 이러한 레코딩 수단을 포함한다.

일 실시예에 따르면, 상기 지지 수단 및 상기 액추에이션 수단은 회전에 의해 광학 요소의 경사를 변화시키도록 구성되는 모터형 회전 플랫폼을 포함한다.

일 실시예에 따르면,

상기 제 1 간섭성 광 안내 수단은 광섬유 섹션과 광섬유 커넥터를 포함하고, 상기 광섬유 섹션의 제 1 단부는 간섭성 광빔 스플리터의 상기 제 1 출력에 연결되고, 상기 광섬유 커넥터는 상기 광섬유 섹션의 제 2 단부에 연결되고, 주 광 경로의 상기 진입점에 형성되는 광학 현미경의 제 1 입력 개구부에 연결되도록 구성되며,

상기 제 2 간섭성 광 안내 수단은 일체화된 세기 및 광경로 변화 요소를 가진 광섬유 전도체 - 상기 광섬유 전도체는 간섭성 광빔 스플리터의 상기 제 2 출력에 연결될 제 1 단부를 가짐 - 와, 상기 광섬유 전도체의 제 2 단부에 연결될 광섬유 커넥터를 포함하고, 상기 광섬유 커넥터는 모터형 회전 플랫폼처럼, 제 2 개구부에 연결되는 중간 요소에 또는 기준 광 경로의 상기 진입점에서 형성되는 광학 현미경의 제 2 입력 개구부에 연결되도록 구성된다.

일 실시예에 따르면, 상기 키트는 제 1 빔 스플리터 및 제 2 빔 스플리터를 더 포함하며,

상기 제 1 빔 스플리터는 상기 광학 현미경에 배열되어, 상기 광학 현미경의 집광 렌즈와 백색 광원 사이에 배열되는 제 1 미러를 대체하여, 상기 제 1 빔 스플리터가 물체 빔을 통과시키고. 그리고, 상기 백색 광원에 의해 생성되는 백색 광빔을 반사시켜서, 또는 그 역도 성립하여, 두가지 모두 집광 렌즈로 향하게 하고,

상기 제 2 빔 스플리터는 상기 광학 현미경에 배열되어, 상기 광학 현미경의 렌즈와 튜브 렌즈 사이에 배열되는 제 2 미러를 대체하여, 상기 제 2 빔 스플리터가 기준 빔을 통과시키고, 그리고, 상기 튜브렌즈로부터 빔을 반사시켜서, 또는 그 역도 성립하여, 두가지 모두 상기 광학 현미경의 상기 레코딩 수단을 향하게 한다.

선호 실시예에 따르면, 키트의 상기 폐-루프 제어 시스템은 선호 실시예의 경우에 앞서 설명된 방법의 수식을 충족시키도록 광학 현미경의 전자 시스템과 협업하여, 또는 단독으로, 경사 각도 φ의 최적값의 상기 결정을 수행하기 위한 알고리즘을 포함하며,

퓨리에 공간에서 평가될 광학 현미경의 상기 파라미터가 NA, M, 및 Δp이고, 그 의미는 앞서 설명한 바 있다.

본 발명은 4개의 형태(현미경, 방법, 컴퓨터 프로그램, 및 적용 키트)에서, 어포컬-텔레센트릭 시스템을 통해 이미지 평면에 레코딩되는 이미지와 함께 작용하기 때문에, 앞서 배경 기술 단락에서 설명한 단점들에 시달리지 않으며, 따라서, 실시간으로 정량적 위상 이미지를 획득할 수 있게 된다. 추가적으로, 하이브리드 현미경의 경우에, 정량적 위상 이미지 획득을 위해 최소로 요구되는 광학 현미경 변형은 사용자가 광학 현미경을 위상 정량화 모드로부터 기존 작동 모드로 빠르고 간단하게 변경할 수 있게 한다. 이러한 특징은 본 발명에 고유한 것이다.

폐-루프 제어 시스템 및 이와 관련된 요소들을 포함시킴에 추가하여, 본 발명의 제 4 형태에 의해 제안되는 DHM을 이용한 정량적 위상 이미지 획득을 위한 광학 현미경에 적용가능한 키트 또는 모듈이 기술적으로 다음의 형태에서 그 선행자들과 차별화된다:

- 정량적 위상 이미지 획득을 위한 광학 현미경의 최소 요건 변형은 사용자가 광학 현미경을 위상 정량화 모드로부터 기존 작동 모드로 간단하고 빠르게 변경할 수 있게 한다.

- 어포컬-텔레센트릭 시스템의 이미지 평면에 홀로그램을 레코딩하기 때문에, 정량적 위상 이미지를 획득하기 위해 견고한 오토포커스 시스템, 수치 전파, 및 위상 보상을 요하지 않는다.

- 실시간으로 시편의 정보를 획득할 수 있다. 실험으로부터 정보를 불러오기 위해 수치 전파가 요구되지 않기 때문에, 사용자들은 현미경 디스플레이 상에서 시편의 위상-정량화된 이미지를 볼 수 있다.

- 켤레 물체-이미지 평면에서 작동함으로써 현미경 대물 렌즈의 최적화된 설계를 완전하게 이용할 수 있고, 이는 레코딩된 홀로그램에서의 광학적 수차를 감소시킨다.

- 동일 대물 렌즈로 작동함으로써 기존 광학 현미경을 위해 구축된 회절 한도에서 작동시킬 수 있다.

- 재구성된 DHM 위상 이미지가 위상 만곡 수차 [3]를 갖기 않고, 이는 후험적 제거를 위한 복잡한 수치적 방법[1, 9-11, 18, 21]의 이용을 제거한다

- 위상 만복 보상을 위한 수치적 방법을 요하지 않기 때문에, 잔류 만곡[23]으로 인한 위상 이미지 섭동에 시달리지 않는다.

- 얇은 샘플의 경우, 위상 이미지가 위상 래핑(phase wrapping)을 갖지 않는다.

- 연구 중인 샘플 정보를 지닌 회절 차수는 제로-차수 및 트윈 이미지[18]의 정확한 필터링을 촉진시키는 스펙트럼 도메인의 점들이다.

- 축을 벗어난 구조로 기준 빔의 자동 보상은 홀로그램의 회절 차수의 점 형태로 인해 촉진된다.

- 가용 대역폭 공간의 이용이 최적화되어, 동일한 대물렌즈 시스템과 함께 작동하는 광학 현미경에 의해 얻을 수 있는 것에 필적할만한 공간 분해능을 실현시킬 수 있게 된다.

본 발명의 현미경, 방법, 프로그램, 및 키트 이용은 정량적 위상 이미징을 위한 다른 방법에 비해 다음의 비교적 장점들을 제공한다:

1 - 정량적 위상 이미지 획득에 필요한 비용 감소.

2 - 얼룩없이 샘플의 실시간 정량적 위상 측정.

3 - 이미지 형성 시스템에서 광학적 수차 가능성 최소화.

4 - 다른 것들 중에서도, 상업용 현미경에 의해 제공되는 샘플 조작, 안정성, 견고성, 등의 활용.

5 - 기존 호스트 현미경에 의해 제공되는 작동 모드 또는 위상 이미지 정량화 모드로 작동할 가능성.

6 - 정량적 위상 이미지 획득을 위한 사용 편이적 프로세싱 소프트웨어 이용.

7 - 호스트 현미경의 광학계에 의해 구축되는 회절 한도에서의 작동 최적화.

8 - 정량적 위상 이미지 연산을 위해 레코딩된 홀로그램을 처리할 때 수치상 노이즈 감소.

본 발명은 관심 정보가 전파 중인 광학장의 위상 정보에 있거나 그 안에 코딩되어 있을 수 있는, 그리고, 연구 중인 시편을 스테이닝(staining)하는 것이 불가능하거나 바람직하지 않은, 연구 및/또는 개발 분야에 적용된다. 적용 가능한 분야는 다양한 생명과학 및 재료 과학 분야를 포함할 수 있다. 예를 들어, 생물 분야에서, 스테이닝없이 샘플의 정량적 위상 측정은 상기 현미경 샘플의 정량적 관찰을 가능할 뿐 아니라, 이 프로세스가 상기 샘플 내에 외부 에이전트를 도입할 필요없이 수행될 수 있기 때문에, 중요한 관심사다. 본 발명을 이용하여, 현미경에 통상적으로 사용되는 장비를 DHM 기술과 조합하여, 상기 연구 방법의 유연성을 증가시키고, 다른 기술 이용을 통해 얻은 결과와 직접 비교하는 것이 가능하다. 정량적 위상 이미지 획득에 필요한 작동 횟수가 기존 DHM 시스템에서보다 훨씬 작기 때문에, 본 발명의 소프트웨어 조작이 훨씬 단순화되어, 사용자-친화적이면서, 홀로그램 레코딩의 불편한 프로세스를 미리 제거할 수 있다.

도 1은 메인 외부 요소 및 내부 요소를 가진 종래의 광학 현미경과, 현미경에 사용되는 백색 광빔에 의해 내부에 을 개략적으로 도시한다.
도 2는 발명의 제 4 형태의 키트를 이용하여 도 1의 현미경을 구성함으로써 얻어지는 일 실시예에 따른 발명의 제 1 형태의 홀로그래픽 현미경을 도시하며, 현미경에 사용되는 기준 빔의 그리고 목적 빔의 궤적이 도시된다.
도 3은 본 경우에 도 1의 경우와 유사하게, 종래의 광학 현미경으로 대안의 방식으로 작동하는 도 2와 동일한 현미경을 도시하며, 따라서, 일 실시예를 위한 발명의 제 1 형태의 현미경의 하이브리드 작동(홀로그래픽 모드 및 종래 모드)을 보여준다.
도 4는 예를 들어, 샘플의 홀로그램을 획득 및 처리하기 위해, 발명의 제 3 형태의 컴퓨터 프로그램에 의해 구현되는 적절한 알고리즘을 이용하여 수행될 서로 다른 단계들 - 일부는 본질적이고 일부는 선택적인 단계들임 - 을 개략적으로 도시하며, 알고리즘 실행시 획득되는 캡처된 홀로그램의 이미지 및 후속 일련의 이미지들이 이해를 돕기 위해 도면에 포함되었다.
도 5는 서로 다른 구조의 3개의 홀로그래픽 현미경에 대한 홀로그램 스펙트럼(좌측열) 및 장면 재구현(우측열) 예를 예시하는 이미지로서, (a) 오프-이미지-평면 만곡을 가진 텔레센트릭 구조(선행 기술)와, (b) 캡처 파라미터 최적화없이 인-이미지-평면 캡처를 이용한 텔레센트릭 구조(본 발명)와, (c) 인-이미지-평면 캡처 및 최적화된 캡처 파라미터를 가진 텔레센트릭 구조(본 발명의 선호 예)를 도시한다.
도 6은 도 5의 b) 및 c) 경우의 우측열의 2개의 이미지를 확대 포맷으로 도시한다.

복수의 실시예에 대한 상세한 설명

도 1은 상업적 광학 현미경의 다이어그램을 도시하며, 여기서 다음의 요소를 포함하는 현미경의 기본 부분들이 나타나고 점선을 이용해 광(L1)의 궤적이 도시된다:

21.- 백색 광원; 22.- 렌즈; 23, 23', 23'' - 거울; 14.- 집광 렌즈; 15.- 샘플 홀더 스테이지; 16.- 현미경 대물렌즈; 17.- 포커싱 수단; 18.- 튜브 렌즈; 9.- 렌즈; 10.- 스윙 거울 또는 분리 판; 11.- 이미지 형성 렌즈; 12.- 기록 수단, 일반적으로 CCD 카메라; 13.- 접안렌즈.

CCD 카메라(12)로의 백색 광 빔(L1)이 따르는 광학 경로(optical path)가 주 광학 경로(main optical path)라고 본 명세서에서 일컬어진다.

도 2 및 3은 하이브리드 현미경, 즉, 하나의 실시예에 따라 다음의 요소들의 키트(kit)를 장착시킴으로써 수정되면, DHM 모드(도 2 참조) 및 종래의 모드(도 3 참조)에서 동작할 수 있는 현미경을 도시한다:

- 간섭성 광원(1), 일반적으로 레이저와, (광섬유 커플러(2)에 의해) 상기 광원의 출력에 연결되어 샘플을 조명하는 물체 빔(Lo)을 제1 출력을 통해 발생시키고, 기준 빔(Lr)을 제2 출력을 통해 발생시키기 위한 간섭성 광 빔 스플리터(3),

- 간섭성 광 빔 스플리터(3)의 제1 출력으로 연결된 제1 단부를 갖는 광섬유 섹션(4), 및 상기 광섬유 섹션(4)의 제2 단부에 연결되고 주 광학 경로(도 2 및 도 3의 요소(8))의 시작점에 형성된 광학 현미경의 제1 입력 오프닝으로 연결된 광섬유 커넥터(6),

- 강도 및 광학 경로 변경 요소(5)를 포함하는 광섬유 컨덕터(4') - 상기 광섬유 컨덕터(4')는 간섭성 광 빔 스플리터(3)의 제2 출력으로 연결되는 제1 단부를 가짐 - , 및 상기 광섬유 컨덕터(4')의 제2 단부에 연결되고 기준 광학 경로의 시작점에서 정의되는 광학 현미경의 제2 입력 오프닝으로 연결되는 중간 요소(PM)에 연결되는 광섬유 커넥터(6'),

- 광학 현미경의 광축에 대한 특정 경사를 기준 빔(Lr)에 부여하기 위해 기준 광학 경로에 배열되는 가변 경사(7)의 시준 렌즈,

- 모터 회전식 플랫폼(PM)인 상기 중간 요소(PM)는 시준 렌즈(7)를 고정하고 회전 시 렌즈의 경사를 변화시킴,

- 푸리에 공간에서 광학 현미경의 파라미터의 급수를 자동으로 평가하고, 상기 평가의 결과로부터 기준 빔(Lr)에 대한 경사각(Φ)의 최적 값을 결정하고, 모터 회전식 플랫폼(PM)을 제어하여, 경사각(Φ)의 최적 값에 따라 시준 렌즈(7)의 경사의 변경을 수행하기 위한 폐쇄 루프 제어 시스템(SC).

키트는 또한 다음을 포함한다:

- 광학 현미경 내에 배열되며, 제1 거울(23)(도 1 참조)을 대체하며, 물체 빔(Lo)의 통과 및 백색 광 빔(L1)의 반사를 가능하게 하는 제1 빔 스플리터(8)

- 광학 현미경 내에 배열되고, 제2 거울(23'')(도 1 참조)을 대체하며, 기준 빔(Lr)의 통과 및 발생된 빔(Lo')의 반사를 가능하게 하는 제2 빔 스플리터(8').

더 기본적인 버전에서, 키트는 폐쇄 루프 제어 시스템(SC)과 모터 회전식 플랫폼(PM)을 포함하지 않으며, 시준 렌즈(7)가, 광학 현미경에서, 물체 빔과 기준 빔 간 각을 수정하기 위해 수동 회전 플랫폼에 장착된다.

도 2는 DHM 모드에서의 현미경의 동작을 도시하며, 여기서, 물체 빔(Lo)이 샘플(도시되지 않음)에 충돌하고, 이 경우, 물체 빔(Lo)의 투과에 의해 상기 샘플에서 발생된 빔(Lo')이 주 광학 경로의 나머지 부분을 따르고, 상기 빔(Lo')에 대해 경사진 기준 빔(Lr)이 또한 도달하는 CCD 또는 CMOS 카메라(12)(또는 감광성 요소의 어레이를 포함하는 그 밖의 다른 임의의 유형의 장치)에 도달하며, 샘플의 홀로그램이 빔(Lr)과 빔(Lo') 모두의 간섭 패턴으로부터 CCD 카메라에 기록된다.

본 발명의 현미경 및 키트에 의해 사용되는 주 특징들 중 하나가 상업적 광학 현미경의 현미경 대물렌즈(16)와 튜브 렌즈(18)의 최적화된 설계이다. 이 설계에 의해 튜브 렌즈(18)의 이미지 평면에서 기록되는 광학 필드(optical field)가 위상 만곡(phase curvature), DHM에서의 분질적 특징을 갖지 않도록 막는다.

도 1을 도 2 및 3과 비교함으로써, 수정된 현미경이 상업적 현미경과 완벽하게 연결 가능한 더 적은 개수의 요소로 만들어짐이 관찰되며, 앞서 언급된 부분을 삽입/대체하기 위한 개입이 최소한이다. 상업적 현미경에 연결될 때, 수정된 현미경이 또한 상업적 현미경에 의해 제공되는 샘플 핸들링, 안정성, 및 강건성, 그 밖의 다른 특징을 이용한다.

도 3은 도 2와 동일한 현미경을 보여주지만, 이 경우, 도 1의 것과 유사하게 종래의 광학 현미경과 교대하는 방식으로 동작하며, 따라서 하나의 실시예에 따라 본 발명의 제1 양태의 현미경의 하이브리드 동작(홀로그램 모드와 종래 모드)을 보여준다. 이 도면은 현미경 및 본 발명의 키트에 의해, 사용자가 정량적 이미지 위상 모드에서 상업적 현미경 특성 이미지 모드로 변경할 수 있게 하는 가능성을 보여준다. 상업적 동작에서, 현미경은 시장에서 이용 가능한 모드들 중 일부에서 동작할 수 있다.

DHM 모드가 활성화될 때 CCD 카메라(12)에 기록된 이미지는 도 4에 도시된 다이어그램에 따라 처리된다. 디지털 홀로그램을 획득 및 처리하기 위한 알고리즘/소프트웨어는 다음의 단계를 포함한다:

디지털 홀로그램을 기록하는 단계

디지털 홀로그램의 고속 푸리에 변환을 계산하는 단계

푸리에 영역(Fourier domain)에서 물체-차수(object-order)를 필터링하고 기준 빔 및 이에 대응하는 보상에 의해 형성된 각을 자동으로 식별하는 단계

물체-차수의 역 고속 푸리에 변환을 계산하는 단계

표본의 정량적 위상을 계산하는 단계

앞서 언급된 단계들은 폐쇄 루프를 도시하고(도 4 참조) 필수 동작의 최소한의 개수와 짧은 계산 시간 모두가 주어지면 실시간 정량적 위상 관찰을 위한 소프트웨어의 구현이 상당한 하드웨어 요건 없이 실현 가능하다. 사용자가 변경할 수 있는 자유 파라미터(free parameter)의 급수가 존재하여: 푸리에 공간에서 사용되는 필터(위치, 형태 및 크기)를 선택하는 것, 기준 빔(필요한 경우)의 각도를 미세 튜닝하는 것, 홀로그램 내 관심 영역 및 축 크기의 정량적 측정을 위한 표본의 굴절률을 선택하는 것이 가능할 것이다. 사전 현미경 교정, 가령, 사용될 상이한 현미경 대물렌즈의 정보의 교정을 수행함으로써, 이 마지막 파라미터를 제외하고, 나머지는 생략될 수 있다.

상기 표본에 수동으로 포커싱하기 위한 추가 계산으로서 표본의 진폭이 획득될 수 있고, 획득된 정량적 위상의 3차원 도시 및 실제 샘플과의 이의 대응관계가 도한 획득될 수 있다.

본 발명에 의해 제안되는 현미경 및 키트의 하나의 실시예에 있어서, 이들은 하드웨어 요소(가령, 제어 시스템(SC))에 미리 설치되거나 적합한 지원, 가령, DVD 포함되고 광학 현미경에 이미 포함된 실제 제어 시스템에 설치될 수 있는 기재된 알고리즘을 구현하는 소프트웨어를 포함한다.

도 5는 분해능 테스트(USAF 1951)의 이미지의 재구성이 획득된 실험의 결과를 보여준다.

- 도 5c: (NA, M, Δp 및 φ를 포함하는 앞서 기재된 수식과의 부합을 포함) 최적 설정 조건 하에서 홀로그램이 캡처될 때, 즉, 본 발명의 선호되는 실시예에서의 실험 결과,

도 5b는 홀로그램이 이미지 평면에서 캡처될 때, 그러나 시스템의 파라미터를 설정하지 않은 상태, 즉, 본 발명의 덜 선호되는 실시예에서의 실험 결과, 및

도 5a: 종래 기술에서 언급된 바와 같이 홀로그램이 이미지 평면 밖에서 캡처될 때의 실험 결과

도 5는 좌측 컬럼에 홀로그램의 푸리에 변환을 보여준다. 이 변환은 재구성 수행을 가능하게 하는 정보를 포함하는 것이다. 간섭 없이, 도 5c의 경우에서만 다른 교란 항이 존재한 채 (실선 원 내부의) 물체의 주파수 콘텐츠가 고립될 수 있다.

도 5c에 나타날 수 있는 바와 같이, 본 발명의 현미경이 더 낮은 NA로 동작하더라도, 분해능과 잡음 모두 측면에서 재구성 품질이 다른 두 경우에 비해 명백히 개선된다.

개선된 분해능을 더 잘 관측하기 위해, 도 6은 본 발명의 실시예에 대응하는 케이스 b) 및 c)에 대한 재구성의 확대도를 도시한다.

계산 시간과 관련하여, 4Gb RAM을 갖는 i7 프로세서에서의 MatLab 프로세싱에 의해, 세 케이스가 비교되었다(그 밖의 다른 기계에 의해서도 유사한 비율이 획득될 것이다). 특히, 홀로그램으로부터의 재구성을 계산(5c)하는 데 117밀리초(millisecond)(이는 현재 초당 8개의 이미지의 속도를 이미 제공함)가 걸리고, 반면에 재구성(5a)은 462밀리초(초당 2개의 이미지)가 걸림이 검증되었다.

본 발명의 모든 양태가 본 발명을 현재까지 알려진 위상 정량화 방법과 구별시키는 다음의 특징을 가진다:

홀로그램을 기록하기 위한 무한초점-텔레센트릭 시스템(afocal-telecentric system)의 사용[8]. 이 특징은, 상업적 현미경의 광학 부분으로 내장되며, 표준 DHM 시스템에 존재하는 위상 만곡(phase curvature)을 제거하고, 따라서 위상 정량화를 위한 어떠한 보상 방법도 수행할 필요가 없다[9-11].

현미경의 이미지 평면에서 홀로그램을 캡처한다. 이 기록 방법에 의해, 치적 방법을 이용해 캡처 평면으로부터 일정 거리에 위치하는 평면에서 필드를 계산할 필요 없이 연구중인 샘플의 즉각적인 정보를 갖는 것이 가능해진다. 또한 이 경우 제조업체가 현미경 대물렌즈의 최적화된 구성을 이용하기 때문에 캡처된 홀로그램에는 광학 수차가 없다.

수치적 재포커싱(numerical refocusing)이 가능함. 3차원 샘플을 조작하는 경우, 본 발명에 의해 수치 계산에 의해 샘플의 서로 다른 섹션을 재포커싱하는 것이 가능해진다. 이는 종래의 DHM 기법에 의해 이뤄지는 것과 유사한 방식으로 수행된다, 즉, 각 스펙트럼 전파[12] 또는 프레넬 변환[13]을 기초로 하는 알고리즘을 적용한다.

탈축(off-axis) 또는 축내(in-axis) 구성으로 동작 가능하다[13]. 탈축 구성의 경우, 기준 빔의 자동 보상이 가능해진다. 축내 구성의 경우, 위상 편이 방법이 사용된다[14, 15].

회절에 의해 배타적으로 한정되는 분해능을 갖는 이미지가 획득된다. 이미지 평면에서의 기록으로 인한 수치 전파를 제거함으로써, 분해능 열화가 발생하지 않도록 현미경을 설정하는 것이 가능하며, 이로 인해 기본으로 사용되는 광학 현미경에 의해 제공되는 분해능 전체를 사용하는 것이 가능해진다.

정량적 위상 이미지를 획득하기 위한 동작의 수가 더 적어진다. 위상 만곡의 수치 전파 및 수치 보상이 필요하지 않기 때문에, 실시간 정량적 위상 정보가 제공될 수 있다.

위상 이미지 정량화 모드 또는 종래의 호스트 현미경에 의해 제공되는 동작 모드에서 동작이 가능하다.

해당 분야의 통상의 기술자라면 이하의 특허청구범위에서 규정되는 본 발명의 범위 내에서 이뤄지는 기재된 실시예의 변경 및 수정을 도입할 수 있을 것이다.

Claims

디지털 홀로그래픽 현미경 관찰술을 이용하여 정량적 위상 이미지를 획득하기 위한 현미경에 있어서,
샘플을 조명하기 위한 물체빔(Lo)과 기준빔(Lr)을 생성하기 위해 출력부에 배열되는 간섭성 광원(1) 및 간섭성 광빔 스플리터(3)와,
상기 물체 빔(Lo)의 투과 또는 반사에 의해 상기 샘플에서 생성되는 빔(Lo') 및 상기 기준 빔(Lr)의 간섭 패턴으로부터 상기 샘플의 홀로그램을 레코딩하는 레코딩 수단(12)과,
서로로부터 이격되어 배열되는 광학 요소들을 포함하는 광학 시스템을 포함하며, 상기 광학 시스템은,
텔레센트릭 어포컬 시스템을 구성하는 광학 요소들을 포함하는, 상기 레코딩 수단(12)과 상기 물체 빔(Lo)의 진입점 사이의 주 광 경로와,
상기 레코딩 수단(12)과 상기 기준 빔(Lr)의 진입점 사이에 배열되어, 상기 주 광 경로와 광학 요소들의 일부분을 공유하는, 기준 광 경로를 포함하되,
상기 현미경은, 상기 레코딩 수단(12)이 상기 광학 시스템의 이미지 평면에 상기 홀로그램을 레코딩하는 것을 특징으로 하는
현미경.
제 1 항에 있어서,
상기 광학 시스템은, 튜브 렌즈의 이미지 초점 평면에 상기 홀로그램을 형성하도록, 상기 샘플 및 상기 튜브 렌즈(18)에서 생성되는 상기 빔(Lo')을 수집하는 대물 렌즈(16)를 상기 주 광 경로에 포함하는
현미경.
제 2 항에 있어서,
상기 광학 시스템은 상기 레코딩 수단(12)에 물체 빔(Lo)의 상기 진입점으로부터 순서대로, 물체 빔(Lo)을 통과시키는 제 1 빔 스플리터(8)와, 집광 렌즈(14)와, 샘플 홀더(15)와, 상기 대물 렌즈(16)와, 미러(23')와, 상기 튜브 렌즈(18)와, 샘플에서 생성된 빔(Lo')을 반사시키는 제 2 빔 스플리터(8')와, 렌즈(9)와, 스윙 미러 또는 분리판(10)과, 이미지 형성 렌즈(11)를 상기 주 광 경로에 포함하는
현미경.
제 3 항에 있어서,
상기 광학 시스템은 상기 레코딩 수단(12) 및 상기 기준 빔(Lr)의 상기 진입점으로부터 순서대로, 현미경의 광학축과 함께 기준 빔(Lr)에 의해 형성되는 각도를 변경시키는 가변 경사의 시준 렌즈(7)와, 기준 빔(Lr)을 통과시키는 상기 제 2 빔 스플리터(8')와, 상기 렌즈(9)와, 상기 스윙 미러 또는 분리판(10)과, 상기 이미지 형성 렌즈(11)를, 상기 기준 광 경로에 포함하는
현미경.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
기준 빔(lr)의 상기 진입점과 간섭성 광빔 스플리터(3)의 출력들 중 하나 사이에 배열되는 세기 및 광 경로 변경기(5)를 포함하는
현미경.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
광학 현미경을 이용하여 이미지를 획득하도록 구성되며,
상기 샘플을 조명하도록 배열되는 백색 광원(21)과,
상기 백색 광원(21)과 상기 레코딩 수단(12) 사이에 배열되는 상기 광학 시스템의 상기 주 광 경로의 광학 요소들을 포함하는 광학 요소들의 배열과,
광학 시스템의 이미지 평면에 상기 샘플의 광학 이미지를 또한 레코딩하는 상기 레코딩 수단을 포함하는
현미경.
제 6 항에 있어서, 제 4 항을 따를 때,
상기 백색 광원(21)의 출력부에 배열되는 렌즈(22)와, 상기 스윙 미러 또는 분리판(10)에 의해 반사되는 백색 광빔을 수신하도록, 그리고 상기 샘플의 광학 이미지를 직접 관찰할 수 있도록, 배열되는 접안 렌즈(13)와, 포커싱 메커니즘(17)을 더 포함하는
현미경.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
디지털 홀로그래픽 현미경 관찰술에 따라 또는 광학 현미경 관찰술에 따라 교번 방식으로 작동을 선택하기 위한 선택 수단을 포함하는
현미경.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 현미경은 현미경의 요소들의 작동을 제어하는 제어 수단을 포함하고, 상기 제어 수단은, 레코딩 수단과 연계하여, 디지털 포맷으로 레코딩된 홀로그램을 수신하는, 그리고, 샘플의 정량적 위상을 연산하도록 처리하는, 프로세싱 수단을 포함하는
현미경.
디지털 홀로그래픽 현미경 관찰술을 이용한 정량적 위상 이미지 획득 방법에 있어서,
간섭성 광빔을 생성하여, 물체 빔(Lo) 및 기준 빔(Lr)으로 분리시키는 단계와,
상기 물체 빔(Lo)을 샘플 상에 방사하는 단계 - 상기 샘플 상에서 상기 물체 빔(Lo)의 투과 또는 반사에 의해 대응하는 빔(Lo')이 상기 샘플에서 생성되고, 상기 물체 빔(Lo)은 광학 시스템의 주 광 경로의 일부분을 통과하고, 상기 생성된 빔(Lo')은 상기 주 경로의 나머지를 통과하며, 상기 주 경로는 튜브 렌즈와, 상기 샘플에서 생성된 상기 빔(Lo')을 수집하기 위한 적어도 하나의 대물 렌즈에 의해 형성되는 텔레센트릭 어포컬 시스템을 구성하는 광학 요소들을 포함함 - 와,
샘플에서 생성되는 상기 빔(Lo') 및 상기 기준 빔(Lr)의 간섭 패턴으로부터 상기 샘플의 홀로그램을 레코딩하는 단계를 포함하되,
상기 방법은 상기 주 경로의 종료부에서 상기 광학 시스템의 이미지 평면에 상기 홀로그램을 레코딩하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는
정량적 위상 이미지 획득 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 광학 시스템은 광학 현미경의 광학 시스템이고, 상기 홀로그램의 레코딩은 광학 현미경의 레코딩 수단에서 수행되는
정량적 위상 이미지 획득 방법.
제 11 항에 있어서,
디지털 홀로그램의 정량적 위상 이미지가 최대 측방 분해능 및 최소 섭동(perturbation)을 갖도록, 디지털 홀로그램을 젝종하기 위해 광학 현미경의 다음 파라미터들을 설정하고, 회절에 의해서만 제한되는 이미지 획득을 위한 대역폭 공간의 이용을 최적화하는 단계를 포함하며,
NA: 광학 현미경의 대물 렌즈의 개구수
M: 상기 텔레센트릭 시스템의 측방 배율,
Δp: 상기 레코딩 수단의 화소 크기,
φ: 다음 수식을 충족시키도록 현미경의 광학축과 기준 빔에 의해 형성되는 각도

및

이때, λ는 간섭성 광빔의 파장인
정량적 위상 이미지 획득 방법.
제 12 항에 있어서,
- 디지털 홀로그램을 획득하는 단계와,
- 디지털 홀로그램의 고속 퓨리에 변환을 연산하는 단계와,
- 퓨리에 도메인에서 물체-차수를 필터링하고, 축 바깥에서 작업할 경우 이에 대응하는 보상, 또는, 축 안에서 작업할 경우 위상 변이와, 기준 빔에 의해 형성되는 각도를 자동 식별하는 단계와,
- 물체-차수의 인버스 고속 퓨리에 변환을 연산하는 단계와,
- 시편 또는 샘플의 정량적 위상을 연산하는 단계를,
폐-루프에서 순차적으로 수행함으로써 상기 홀로그램을 캡처 및 처리하는 단계를 포함하는
정량적 위상 이미지 획득 방법.
컴퓨터에서 실행될 때 제 13 항에 따른 방법의 단계들을 구현하는 코드 명령어를 포함하는 컴퓨터 프로그램.
디지털 홀로그래픽 현미경 관찰술을 이용하여 정량적 위상 이미지를 획득하도록 광학 현미경을 구성하기 위한 키트에 있어서, 상기 키트는,
샘플을 조명하는 물체 빔(Lo)을 제 1 출력을 통해 생성하고, 기준 빔(Lr)을 제 2 출력을 통해 생성하도록, 출력부에 연결되는 간섭성 광원(1) 및 간섭성 광빔 스플리터(3)와,
광학 현미경의 주 광 경로의 진입점과 상기 간섭성 광빔 스플리터(3)의 상기 제 1 출력 사이에 연결될 제 1 간섭성 광 안내 수단 - 상기 광학 현미경의 광학 요소들은 텔레센트릭 어포컬 시스템을 구성하고, 상기 주 광 경로는 상기 광학 현미경의 레코딩 수단(12)과 상기 진입점 사이에서 연장됨 - 와,
상기 레코딩 수단(12)에서 종료되는, 상기 주 광 경로와 상기 광학 요소들의 일부분을 공유하는 기준 광 경로의 진입점과 상기 간섭성 광빔 스플리터(3)의 상기 제 2 출력 사이에 연결되는 제 2 간섭성 광 안내 수단과,
상기 광학 현미경의 광학축에 대해 기준 빔(Lr)에 대한 경사를 부여하기 위해 상기 기준 광 경로에 배열되는 광학 요소를 포함하되, 상기 키트는,
가변 경사로 상기 광학 요소를 지지하기 위한 지지 수단과,
상기 광학 요소에 또는 상기 지지 수단에 작용하는, 상기 광학 요소의 경사를 변화시키기 위한 액추에이션 수단과,
디지털 홀로그래픽 현미경 관찰술을 이용하여 정량적 위상 이미지를 획득하는데 사용될 때 현미경의 성능을 결정하는 광학 현미경의 일련의 파라미터를 퓨리에 공간에서 자동적으로 평가하기 위한, 그리고, 상기 평가의 결과로부터 기준 빔(Lr)의 경사 각도 φ의 최적 값을 결정하기 위한, 그리고, 상기 경사 각도 φ의 상기 최적 값에 따라 상기 경사 변화를 수행하도록 상기 액추에이션 수단을 제어하기 위한, 폐-루프 제어 시스템을 더 포함하는
키트.
제 15 항에 있어서,
상기 지지 수단 및 상기 액추에이션 수단은 회전에 의해 광학 요소의 경사를 변화시키도록 구성되는 모토형 회전 플랫폼(PM)을 포함하는
키트.
제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
상기 제 1 간섭성 광 안내 수단은 광섬유 섹션(4)과 광섬유 커넥터(6)를 포함하고, 상기 광섬유 섹션의 제 1 단부는 간섭성 광빔 스플리터(3)의 상기 제 1 출력에 연결되고, 상기 광섬유 커넥터는 상기 광섬유 섹션(4)의 제 2 단부에 연결되고, 주 광 경로의 상기 진입점에 형성되는 광학 현미경의 제 1 입력 개구부에 연결되도록 구성되며,
상기 제 2 간섭성 광 안내 수단은 일체화된 세기 및 광경로 변화 요소(5)를 가진 광섬유 전도체(4') - 상기 광섬유 전도체(4')는 간섭성 광빔 스플리터(3)의 상기 제 2 출력에 연결될 제 1 단부를 가짐 - 와, 상기 광섬유 전도체(4')의 제 2 단부에 연결될 광섬유 커넥터(6')를 포함하고, 상기 광섬유 커넥터는 제 2 개구부에 연결되는 중간 요소에 또는 기준 광 경로의 상기 진입점에서 형성되는 광학 현미경의 제 2 입력 개구부에 연결되도록 구성되는
키트.
제 17 항에 있어서,
상기 중간 요소가 상기 모토형 회전 플랫폼(PM)인
키트.
제 15 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 키트는 제 1 빔 스플리터(8) 및 제 2 빔 스플리터(8')를 더 포함하며,
상기 제 1 빔 스플리터는 상기 광학 현미경에 배열되어, 상기 광학 현미경의 집광 렌즈(14)와 백색 광원(21) 사이에 배열되는 제 1 미러(23)를 대체하여, 상기 제 1 빔 스플리터(8)가 물체 빔(Lo)을 통과시키고. 그리고, 상기 백색 광원(21)에 의해 생성되는 백색 광빔(L1)을 반사시켜서, 또는 그 역도 성립하여, 두가지 모두 집광 렌즈(14)로 향하게 하고,
상기 제 2 빔 스플리터는 상기 광학 현미경에 배열되어, 상기 광학 현미경의 렌즈(9)와 튜브 렌즈(18) 사이에 배열되는 제 2 미러(23")를 대체하여, 상기 제 2 빔 스플리터(8')가 기준 빔(Lr)을 통과시키고, 그리고, 상기 튜브렌즈(18)로부터 빔을 반사시켜서, 또는 그 역도 성립하여, 두가지 모두 상기 광학 현미경의 상기 레코딩 수단(12)을 향하게 하는
키트.
제 19 항에 있어서,
가변 경사의 상기 광학 요소는 상기 제 2 빔 스플리터(8')와 기준 빔(Lr)의 진입점 사이에 배열될 가변 경사(7)의 시준 렌즈인
키트.
제 15 항에 있어서, 상기 폐-루프 제어 시스템은 제 12 항에 따른 방법의 수식을 충족시키도록 경사 각도 φ의 최적값의 상기 결정을 수행하기 위한 알고리즘을 포함하며,

퓨리에 공간에서 평가될 광학 현미경의 상기 파라미터가 NA, M, 및 Δp인
키트.