CN110376867A - 一种高时空分辨率的离轴数字全息显微成像系统及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高时空分辨率的离轴数字全息显微成像系统及方法，包括照明单元、显微放大单元、中继成像单元、定量相位成像单元；照明单元包括部分相干光源、第九透镜、孔径光阑和第八透镜；显微放大单元包括显微物镜、第三反射镜和第七透镜；中继成像单元包括第一透镜和第二透镜；定量相位成像单元包括第一半透半反镜、光程补偿器、一维透射光栅、第三透镜、第四透镜、第一平面反射镜、第二平面反射镜、第一滤波器、第二滤波器、第五透镜、第六透镜、第二半透半反镜和成像探测器。本发明可有效减低散斑噪声，同时能够实现相位物体的全场定量显微测量，具有时空分辨率高等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物细胞/组织原态显微成像技术领域，具体涉及一种高时空分辨率的离轴数字全息显微系统。
背景技术
生物细胞/组织的研究要点包括三个方面：三维测量、快速成像以及相位测量。一方面，生物组织具有三维分布特征，三维测量是了解组织结构构成及活动全部信息的必要条件。另一方面，细胞培养过程中的大部分细胞都是未染色的原态细胞，表现出透明或半透明性质，光透过后波长和光强(振幅)几乎不改变，仅相位发生变化，改变的光相位携带有生物组织的三维组成及活动关键信息。采用传统光学显微镜对其观测时只能看到光强(二维)信息，而不能获得细胞的相位(三维)信息。此外，生物组织具有备活体特性，其内部时刻发生着生命活动，因此需要快速测量方式获取各时刻下的组织结构，进一步确定组织内所发生的生命活动。
数字全息显微术是将数字全息技术和显微技术相结合的定量显微相位成像技术，最少采用一幅离轴全息图即可精确地获取样品的相位信息和振幅信息，时间分辨率高。然而，传统的数字全息显微术由于采用高相干照明光源(如激光照明)，会产生无法消除的激光散斑和寄生条纹噪声，影响空间分辨率的进一步提高。为了能够有效提高测量精度，通常采用低相干光源照明的数字全息显微系统。值得注意的是，由于部分相干光源的相干长度较短，例如，传统LED光源其相干长度通常在20微米左右，当使用传统的离轴干涉方法进行记录时，由于干涉区域非常小，不能得到全视场高对比度的干涉条纹，从而影响全视场的显微测量。2006年美国Gabriel Popescu教授研究小组(G.Popescu,T.Ikeda,R.R.Dasari,M.S.Feld.Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure anddynamics.Opt.Lett.2006.31.775-777)提出了一种衍射相位显微术(DPM)，集成了离轴光路和共光路的优点，具有非常好的系统稳定性和时间分辨率，但是由于采用激光作为光源，相位重构结果存在散斑，降低了空间相位的分辨率。2011年，Zhuo Wang等人[Zhuo Wang,Larry Millet,Mustafa Mir,Huafeng Ding,Sakulsuk Unarunotai,John Rogers,MarthaU.Gillette,and Gabriel Popescu.Spatial light interference microscopy(SLIM).Opt.Express.,2011,19(2):1016-1026]提出了一种空间光干涉显微技术(SLIM)，通过采用白光作为光源，有效克服了散斑效应，空间分辨率得到极大提高。但是该技术需要采集四副Gabor全息图像才能定量恢复出物体的相位信息，时间分辨率低。
发明内容
本发明提出了一种高时空分辨率的离轴数字全息显微成像系统及方法，该系统可以用来对生物细胞等微小物体进行定量相位测量，本发明解决了现有空间光干涉显微技术不适合高动态测量的局限性，同时克服了现有相干光照明数字全息成像系统存在相干噪音高、横向分辨率低等技术问题。
本发明的技术解决方案为：
一种高时空分辨率的离轴数字全息显微成像系统，其特征在于：包括沿光的入射方向依次设置的照明单元、显微放大单元、中继成像单元、定量相位成像单元；
所述照明单元包括沿光路方向依次设置部分相干光源和缩束准直系统；
所述缩束准直系统沿光路方向依次包括第九透镜94、孔径光阑95和第八透镜96；
所述的显微放大单元沿光路方向依次包括显微物镜98、第三反射镜99和第七透镜100；
所述中继成像单元沿光路方向依次包括第一透镜102和第二透镜103；所述第一透镜102的前焦面与显微放大单元的成像平面101重合；
所述定量相位成像单元沿光路方向依次包括第一半透半反镜104、光程补偿器105、一维透射光栅106、第三透镜107、第四透镜108、第一平面反射镜109、第二平面反射镜110、第一滤波器111、第二滤波器112、第五透镜113、第六透镜114、第二半透半反镜115和成像探测器116。
所述一维透射光栅106设置在第二透镜103的后焦面上；
所述的第三透镜107和第六透镜114组成为一个4f系统，且第三透镜107的前焦面与第二透镜103的后焦面重合；
所述第四透镜108和第五透镜113组成一个4f系统，且第三透镜108的前焦面与第二透镜103的后焦面重合；
所述第三透镜107和第四透镜108的焦距相同；
所述第五透镜113和第六透镜114的焦距相同，且第五透镜113和第六透镜114的后焦面重合；
所述的第一滤波器111为加工在金属薄片上的小孔，其位于第三透镜107和第六透镜114的共焦平面上；
所述的第二滤波器112为加工在金属薄片上可以使+1衍射光频谱全部通过的大孔，其位于第四透镜108和第五透镜113的共焦平面上；
所述的成像探测器116设置在第五透镜113或者第六透镜114的后焦面上。
所述的光程补偿器105可以为连续可调的光程补偿器，也可以是固定光程的光程补偿元件。
一种高时空分辨率的离轴数字全息显微成像方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一，使部分相干光源93发出的光束经由第九透镜94、孔径光阑95和第八透镜96组成的缩束准直系统后，照射被测物体97；随后光束传输至由显微物镜98、第三反射镜99和第七透镜100组成的显微放大单元，此时，被测物体97被成像到成像平面101处；
步骤二，利用由第一透镜102和第二透镜103组成的中继成像单元将成像平面101处的被测物体97像传输到第二透镜103的后焦面；
步骤三，光束经过第二透镜103后，传输至第一半透半反镜104；第一半透半反镜104的透射光束经过一维透射光栅106产生衍射光；衍射光经由第四透镜108、第一平面反射镜109反射后，在第四透镜108的后焦面得到各级衍射光的频谱分布；采用第二滤波器112进行频谱滤波，使+1级频谱完整通过，其他频谱成分全部滤掉；+1级频谱通过第五透镜113后形成第一平行光出射；所述的第一平行光由于携带有物体的相位信息，称为物光波；随后物光波由第二半透半反镜115反射；
步骤四，第一半透半反镜104的反射光束经过光程补偿器105、第三透镜107、第二平面反射镜110后形成一个汇聚光斑；采用第一滤波器111对汇聚光斑进行低通滤波后，经过第六透镜114后形成第二平行光出射；所述的第二平行光由于不携带物体的相位信息，称为参考光波；随后参考光波由第二半透半反镜115透射；
步骤五，第二半透半反镜115的反射光和透射光在第五透镜113的后焦面上发生干涉，形成离轴全息图，并由成像探测器116记录；
步骤六，成像探测器116记录的离轴全息图经数字全息的数值重构算法即可得到反映被测物体97形貌结构的相位信息。
本发明具有的有益效果：
本发明光源采用部分相干光源，有效减低散斑噪声，提高测量分辨率；本发明采用马赫-曾德尔干涉结构，便于光路调整和加入光学器件，以便能够获得对比度更高的全息图；本发明将光栅分光技术和滤波技术相结合，能够实现全视场的显微测量；因此，本发明的系统应用面广，具有很强的应用价值。
附图说明
图1是本发明高时空分辨率的离轴数字全息显微成像系统对应的光路示意图。
其中附图标记如下：93-部分相干光源，94-第九透镜，95-孔径光阑，96-第八透镜，97-被测物体，98-显微物镜，99-第三反射镜，100-第七透镜，101-成像平面，102-第一透镜、103-第二透镜、104-第一半透半反镜，105-光程补偿器，106-一维透射光栅，107-第三透镜，108-第四透镜，109-第一平面反射镜，110-第二平面反射镜，111-第一滤波器，112-第二滤波器，113-第五透镜，114-第六透镜，115-第二半透半反镜，116-成像探测器。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案做进一步详细说明。
本发明所包含的部件功能如下：
1、部分相干光源93，波长在可见光范围，输出功率稳定，用于照明被测物体97。
2、一维透射光栅106，可以为振幅光栅也可以是相位光栅；为了提高光强利用率，最好选用闪耀光栅，在+1级上具有较高衍射效率，且一维透射光栅106的光栅常数Λ满足
上式中λ为照明光源的中心波长，Mobj和NAobj分别为显微物镜98的放大倍数和数值孔径。
3、第一透镜102、第二透镜103、第三透镜107、第四透镜108、第五透镜113、第六透镜114、第七透镜100、第八透镜96、第九透镜94，要求为消色差透镜；且第六透镜(114)和第三透镜(107)的焦距之比M1，以及第五透镜(113)和第四透镜(108)的焦距之比M2应满足下式要求
上式中a为成像探测器116的像素尺寸大小。
4、第一滤波器111，为了便于安装，可以在一块金属薄片上加工出一个小孔，小孔直径应约等于第三透镜107的艾里斑直径，用于对光波进行低通滤波。
5、第二滤波器112，为了便于安装，可以在一块金属薄片上加工出一个大孔，大孔应具有合适的直径，使其他级次的衍射光频谱全部遮挡，只有+1级衍射光频谱能够通过。
6、光程补偿器105，可以为连续可调的光程补偿器，也可以是固定光程的光程补偿元件。
7、孔径光阑95，孔径大小适宜，技能保证轴向方向传播的光束通过，又可以滤掉其他方向传播的光束。
8、第一平面反射镜109、第二平面反射镜110，要求具有较高的反射效率。
9、第一半透半反镜104、第二半透半反镜115，可以是立方体分光棱镜，也可以是平面半透半反镜。
10、成像探测器116，一般为黑白CCD相机，也可是黑白CMOS相机，具有合适灰度阶、像素尺寸和像素数量。
本发明所提出的光路如图1所示。部分相干光源93发出的发散光束经由第九透镜94、孔径光阑95和第八透镜96组成的缩束准直系统准直成平行光，随后照射到被测物体97上。被测物体97放置在由显微物镜98、第三反射镜99和第七透镜100组成的显微放大单元的前焦面上，因此被测物体97放大的实像将出现在显微放大单元的后焦面上，即成像平面101处。被测物体97放大的实像经由第一透镜102和第二透镜103组成的中继成像单元传输到第二透镜103的后焦面上。
光束在经过第二透镜103后，入射到第一半透半反镜104中，其中经第一半透半反镜104透射的光束经过放置在第二透镜103后焦面上的一维透射光栅106后产生衍射光。该衍射光经由第四透镜108、第一平面反射镜109反射后，在第四透镜108的后焦面可以产生各级衍射光的频谱分布。采用放在第四透镜108后焦面上的第二滤波器112进行频谱滤波，使+1级频谱完整通过，其他频谱成分全部滤掉；+1级频谱通过第五透镜113后形成第一平行光(由于携带有物体的相位信息，作为物光波)出射；随后该物光波由第二半透半反镜115反射。其中经第一半透半反镜104反射的光束经过光程补偿器105、第三透镜107、第二平面反射镜110后，在第三透镜107的后焦面上形成一个汇聚光斑。采用放在第三透镜107后焦面上的第一滤波器111对该汇聚光斑进行滤波，使汇聚光斑的中心部分光完整通过，其他部分全部滤掉。该中心部分光经过第六透镜114后形成第二平行光(由于不携带物体的相位信息，作为参考光波)出射；随后该参考光波由第二半透半反镜115透射。经第二半透半反镜115的反射和透射的物光波和参考光波发生干涉，形成离轴全息图，并由放在第五透镜113后焦面上的成像探测器116记录。
假设物光波为O(xH,yH)，参考光波为R(xH,yH)，成像探测器116记录的离轴全息图光强分布可以表示为
利用数值重构算法(例如角谱重构算法)对成像探测器116记录的离轴全息图进行重构处理，即可得到被测物体97的物光波的复数场U(xH,yH)。最后，根据公式(2)和公式(3)分别得到被测物体97的光强和相位分布：
I(xH,yH)＝|U(xH,yH)|2 (2)
上式中Im表示虚部操作符，Re表示实部操作符。
Claims (8)
1.一种高时空分辨率的离轴数字全息显微成像系统，其特征在于：包括沿光的入射方向依次设置的照明单元、显微放大单元、中继成像单元、定量相位成像单元；
所述照明单元包括沿光路方向依次包括部分相干光源(93)和缩束准直系统；
所述缩束准直系统沿光路方向依次包括第九透镜(94)、孔径光阑(95)和第八透镜(96)；
所述的显微放大单元沿光路方向依次包括显微物镜(98)、第三反射镜(99)和第七透镜(100)；
所述中继成像单元沿光路方向依次包括第一透镜(102)和第二透镜(103)；所述第一透镜(102)的前焦面与显微放大单元的成像平面(101)重合。
所述定量相位成像单元沿光路方向依次包括第一半透半反镜(104)、光程补偿器(105)、一维透射光栅(106)、第三透镜(107)、第四透镜(108)、第一平面反射镜(109)、第二平面反射镜(110)、第一滤波器(111)、第二滤波器(112)、第五透镜(113)、第六透镜(114)、第二半透半反镜(115)和成像探测器(116)。
2.根据权利要求1所述的一种高时空分辨率的离轴数字全息显微成像系统，其特征在于：
所述的第三透镜(107)和第六透镜(114)组成为一个4f系统，且第三透镜(107)的前焦面与第二透镜(103)的后焦面重合；所述第四透镜(108)和第五透镜(113)组成一个4f系统，且第四透镜(108)的前焦面与第二透镜(103)的后焦面重合；所述第三透镜(107)和第四透镜(108)的焦距相同；所述第五透镜(113)和第六透镜(114)的焦距相同，且第五透镜(113)和第六透镜(114)的后焦面重合。
3.根据权利要求1所述的一种高时空分辨率的离轴数字全息显微成像系统，其特征在于：
所述一维透射光栅(106)设置在第二透镜(103)的后焦面上；所述一维透射光栅(106)的光栅常数Λ满足
上式中λ为照明光源的中心波长，Mobj和NAobj分别为显微物镜(98)的放大倍数和数值孔径。
4.根据权利要求1所述的一种高时空分辨率的离轴数字全息显微成像系统，其特征在于：
所述第六透镜(114)和第三透镜(107)的焦距之比M1，以及第五透镜(113)和第四透镜(108)的焦距之比M2应满足下式要求
上式中a为成像探测器(116)的像素尺寸大小。
5.根据权利要求1所述的一种高时空分辨率的离轴数字全息显微成像系统，其特征在于：
所述的第一滤波器(111)为加工在金属薄片上的小孔，其位于第三透镜(107)和第六透镜(114)的共焦平面上；所述的第二滤波器(112)为加工在金属薄片上可以使+1衍射光频谱全部通过的大孔，其位于第四透镜(108)和第五透镜(113)的共焦平面上。
6.根据权利要求1所述的一种高时空分辨率的离轴数字全息显微成像系统，其特征在于：
所述的光程补偿器(105)可以为连续可调的光程补偿器，也可以是固定光程的光程补偿元件。
7.根据权利要求1所述的一种高时空分辨率的离轴数字全息显微成像系统，其特征在于：
所述的成像探测器(116)设置在第五透镜(113)或者第六透镜(114)的后焦面上。
8.一种高时空分辨率的离轴数字全息显微成像方法，其特征在于：主要包括以下步骤：
步骤一，使部分相干光源(93)发出的光束经由第九透镜(94)、孔径光阑(95)和第八透镜(96)组成的缩束准直系统后，照射被测物体(97)；随后光束传输至由显微物镜(98)、第三反射镜(99)和第七透镜(100)组成的显微放大单元，此时，被测物体(97)被成像到成像平面(101)处；
步骤二，利用由第一透镜102和第二透镜(103)组成的中继成像单元将成像平面101处的被测物体(97)像传输到第二透镜(103)的后焦面；
步骤三，光束经过第二透镜(103)后，传输至第一半透半反镜(104)；第一半透半反镜(104)的透射光束经过一维透射光栅(106)产生衍射光；衍射光经由第四透镜(108)、第一平面反射镜(109)反射后，在第四透镜(108)的后焦面得到各级衍射光的频谱分布；采用第二滤波器(112)进行频谱滤波，使+1级频谱完整通过，其他频谱成分全部滤掉；+1级频谱通过第五透镜(113)后形成第一平行光出射；所述的第一平行光由于携带有物体的相位信息，称为物光波；随后物光波由第二半透半反镜(115)反射；
步骤四，第一半透半反镜(104)的反射光束经过光程补偿器(105)、第三透镜(107)、第二平面反射镜(110)后形成一个汇聚光斑；采用第一滤波器(111)对汇聚光斑进行低通滤波后，经过第六透镜(114)后形成第二平行光出射；所述的第二平行光由于不携带物体的相位信息，称为参考光波；随后参考光波由第二半透半反镜(115)透射；
步骤五，第二半透半反镜(115)的反射光和透射光在第五透镜(113)的后焦面上发生干涉，形成离轴全息图，并由成像探测器(116)记录；
步骤六，成像探测器(116)记录的离轴全息图经数字全息的数值重构算法即可得到反映被测物体(97)形貌结构的相位信息。
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| CN201910552174.1A Pending CN110376867A (zh) | 2019-06-25 | 2019-06-25 | 一种高时空分辨率的离轴数字全息显微成像系统及方法 |
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| CN (1) | CN110376867A (zh) |
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2019
- 2019-06-25 CN CN201910552174.1A patent/CN110376867A/zh active Pending
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Application publication date: 20191025 |