CN107907983A - 基于局域空心光束照明的数字全息显微装置及其工作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于局域空心光束照明的数字全息显微装置及其工作方法，属于数字全息显微术(DHM)领域。包括激光器、光学分束镜Ⅰ、光学分束镜Ⅱ、光学反射镜Ⅰ、光学反射镜Ⅱ、暗场聚光镜、显微物镜Ⅰ、显微物镜Ⅱ、空间滤波器、第一透镜L1、第二透镜L2、第三透镜L3、计算机等部件。实现方法分为四步，首先利用产生的局域空心光束入射到暗场聚光镜后形成环形光锥照明实验样品，接着，数字全息术将样品的衍射光和参考光的干涉条纹通过光电耦装置记录到计算机中，最后再利用重构技术，再现物体三维图像。与传统的数字全息显微术相比，本发明具有更高的分辨率和对比度优势，适用于生物医学检测中观察活体细胞、溶质粒子等微观领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种数字全息显微技术记录局域空心光束照明实验样品得到的散射光与球面波参考光干涉条纹，具体涉及一种基于局域空心光束照明的数字全息显微装置及其工作方法，属于数字全息显微术(DHM)领域。该发明适用于生物学、生物医学检测、环境科学等研究领域。
背景技术
近年来发展起来的数字全息显微术(DHM)，具有成本低，操作简单，能够同时获得样品定量的强度及位像信息，利用该技术可以方便的进行滤波，位相畸变校正、自动聚焦、扩展焦深等操作，并可利用数字手段获得微分对比图，增强样品细节显示能力。人们又在数字全息术基础上提出一种暗场数字全息显微成像技术，相比较传统明场数字全息显微术成像技术而言，暗场数字全息显微术不仅可以增强显微成像对比度，而且还可以提高成像的分辨率。但是传统的暗场显微成像技术是利用圆形遮光板形成环形光圈，而高斯光束的能量主要集中在光斑中心区域，上述这些方法均只保留了其边缘环形部分，丢失了大部分能量，致使照明光强度减弱，而且这些方法产生的照明光在传播过程中衍射产生旁瓣相对较强，容易受到管内壁的反射产生杂散光，使得成像时产生背景噪声，同时对微小物体成像时产生较强的衍射效应，以上因素的存在降低了系统成像对比度和分辨率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于局域空心光束照明的数字全息显微装置及其工作方法，是为了克服现有暗场数字全息显微术照明光中存在的环形照明光内外半径环径比可控调节性差、光波不均匀、成像对比度弱、光能量大量丢失等问题，本发明可有效提高系统分辨率、增强再现像对比度。
本发明采用的技术方案是：一种基于局域空心光束照明的暗场数字全息显微装置，包括激光器1、光学分束镜I 2、光学分束镜II 15、显微物镜I 11、显微物镜II 13、针孔滤波器14、光学反射镜I 5、光学反射镜II 12、第一透镜L1 3、第二透镜L2 4、第三透镜L38、光阑6、锥镜7、暗场聚光镜9、实验样品10、光电耦装置16、计算机17；其中激光器1出射的激光照射在光学分束镜I 2上；光学分束镜I 2、光学分束镜II 15、光学反射镜I 5和光学反射镜 II 12在光学平台上构成一个马赫增德尔光路系统，其中光学分束镜I 2与光学反射镜II 12在同一条水平线上，光学分束镜I 2与光学反射镜I 5在同一条垂直线上，光学反射镜II 12与光学分束镜II 15在同一条垂直线上，光学分束镜II 15与光学反射镜I 5在同一条水平线上；
光学分束镜I 2与光学反射镜I 5之间依次设有第一透镜L1 3、第二透镜L2 4，第一透镜L1 3与第二透镜L2 4之间的距离L＝f1+f2，其中f1为第一透镜的焦距，f2为第二透镜的焦距；
光学反射镜II 12与光学分束镜II 15之间依次设有显微物镜II 13、针孔滤波器14，针孔滤波器14与显微物镜II 13紧挨着；
光学反射镜I 5与光学分束镜II 15之间依此设有光阑6、锥镜7、第三透镜L3 8、暗场聚光镜9、实验样品10、显微物镜I 11，锥镜7与第三透镜L3 8之间距离满足Z0(f3<Z0<Zmax)，其中f3为第三透镜L3焦距，Zmax＝a/(n-1)γ，a为锥镜孔径，n为锥镜折射率，γ为锥镜锥角，实验样品10位于暗场聚光镜9的后焦面上，显微物镜I 11的前焦面和实验样品10平面重合，光电耦合装置16设置在光学分束镜15的后方，并与实验样品10为物像共轭关系。
优选地，所述光电耦合装置16为CCD或CMOS。
优选地，所述实验样品10为直径为550纳米的聚苯乙烯微球。
优选地，所述的激光器1与光学分束镜I 2之间的距离为0.15-0.2m，光学分束镜I2与光学反射镜II 12之间的距离、光学分束镜I 2与光学反射镜I 5之间的距离、光学反射镜 II 12与光学分束镜II 15之间的距离、光学分束镜II 15与光学反射镜I 5之间的距离均为0.9-1.0m，光学分束镜I 2与第一透镜L1 3之间的距离为0.3-0.4m，光学反射镜II 12与显微物镜II 13之间的距离为0.5-0.6m，光阑6与光学反射镜I 5之间的距离、光阑6与锥镜7之间的距离均为0.10-0.15m，光电耦合装置装置16与光学分束镜15之间的距离为0.08-0.10m。
一种基于局域空心光束照明的数字全息显微装置的工作方法，其特征在于：包括如下步骤：
A、搭建所述数字全息显微装置，打开激光器1、光电耦合器件16和计算机17电源；
B、激光器1发出的激光通过光学分束镜I 2后被分为水平和垂直两束，水平一束激光到达光学反射镜II 12后折转进入显微物镜II 13中，垂直一束激光依次通过第一透镜L13和第二透镜L2 4，并由第一透镜L1 3和第二透镜L2 4组成的扩束准直系统由高斯光束变为平面波后照射到光学反射镜I5上；
C、由光学反射镜I 5反射后的平面波依次通过光阑6，到达锥镜7后被调制为贝塞尔光束，贝塞尔光束通过第三透镜L3 8聚焦后生成局域空心光束18进入暗场聚光镜中；
D、局域空心光束18进入暗场聚光镜9后汇聚，形成环形光锥照明实验样品10，离开实验样品的衍射光由显微物镜I 11接收，通过光学分束镜II 15成像在光电耦合装置16的光敏面上，这一路光为物光；
E、激光器1发出的激光通过光学分束镜I 2后水平一束，由光学反射镜II 12折转进入显微物镜II 13中，经显微物镜II 13扩束，空间滤波器14滤波后，由高斯光束变为球面波经光学分束镜II 15折转到达光电耦合装置16表面，这一路为参考光；
F、在光电耦合装置16光敏面上，物光和参考光干涉，产生干涉条纹，调节光学分束镜 II 15对参考光的反射角度，使物光和参考光的夹角在偏折一定角度时，能使干涉条纹均匀，在光电耦合装置16光敏面上出现稳定均匀的干涉条纹时，使用计算机驱动光电耦合装置16 将干涉条纹记录到到磁盘驱动器，得到实验样品全息图；
G、将光电耦合装置16记录的全息图，读入计算机图像处理软件中，具体流程如：
a)图像读取：调入全息图，读取第二层，转成双精度；
b)频谱分离：对全息图进行傅里叶变换，得到全息图+1级和-1级频谱及零级频谱；
c)频域滤波：通过频域滤波的方式读取频谱图+1级或-1级；
d)数值再现：对提取的+1级或-1级频谱图进行逆傅里叶变换，再取绝对值，得到物光波的复振幅；
H、更换不同的实验样品，重复F-G步骤，检测观察不同样品，可得到不同样品的数字全息超分辨图像。
本发明的工作原理是：本发明实现分为四步，首先利用平面波照射到锥镜后产生类无衍射贝塞尔光束，贝塞尔光束经透镜聚焦后形成局域空心光束；接着，生成的局域空心光束进入暗场聚光镜后形成环形光锥照明实验样品得到物体的散射光；然后，数字全息术将物体的散射光与球面波参考光干涉，干涉的条纹通过光电耦合装置(CCD或CMOS)记录到计算机中，最后利用数字重构技术重构出物体的像。
本发明以数字全息技术手段，利用锥镜与透镜组合生成的局域空心光束结合暗场显微成像原理，使用马赫曾德尔干涉仪获取实验样品散射光与球面波参考光的干涉图样，即全息图，在计算机里通过图像重构手段重建物体三维再现图像；与传统的数字全息显微成像相比，本发明具有更高的分辨率，突破了衍射受限系统极限分辨率，且具有高的对比度优势，可观察未经染色过的活体细胞或微生物，适用于微生物学、生物医学、医学检测、环境科学等微光领域。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明已从实验角度上通过对传统数字全息显微术与该发明装置下数字全息显微再现像对比分析，证明相比较传统的数字全息显微术，本发明装置及方法有效的提高了数字全息显微系统成像分辨率，突破了相干照明的分辨极限；
(2)本发明可以形成暗背景下的亮物体，提高了成像对比度；
(3)本发明利用锥镜产生贝塞尔光束，贝塞尔光束经过透镜后产生局域空心光束，而锥镜是产生无衍射光束最常见光学元件，能量利用率高，制造容易且价格便宜，所以本发明推广性强；
附图说明
图1为本发明的实验装置原理图；
图2为锥镜与透镜组合及产生局域空心光束原理图；
图3为局域空心光束光强结构分布图；
图4为暗场显微成像原理图；
图5为直径为550纳米聚苯乙烯微球传统数字全息显微的小球明场全息图；
图6为直径为550纳米聚苯乙烯微球传统数字全息再现结果的小球明场再现像；
图7为直径为550纳米聚苯乙烯微球暗场数字全息的小球全息图；
图8为直径为550纳米聚苯乙烯微球暗场数字全息再现结果的小球暗场再现像。
其中各标号为：1-激光器，2-光学分束镜Ⅰ，3-第一透镜L1，4-第二透镜L2，5-光学反射镜Ⅰ，6-光阑，7-锥镜，8-第三透镜L3，9-暗场聚光镜，10-实验样品，11-显微物镜Ⅰ，12-光学反射镜Ⅱ，13-显微物镜Ⅱ，14-滤波器，15-光学分束镜Ⅱ，16-光电耦合装置，17-计算机，18-局域空心光束。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。
实施例1：如图1-8所示，一种基于局域空心光束照明的暗场数字全息显微装置，包括激光器1、光学分束镜I 2、光学分束镜II 15、显微物镜I 11、显微物镜II 13、针孔滤波器14、光学反射镜I 5、光学反射镜II 12、第一透镜L1 3、第二透镜L2 4、第三透镜L3 8、光阑6、锥镜7、暗场聚光镜9、实验样品10、光电耦装置16、计算机17；其中激光器1出射的激光照射在光学分束镜I 2上；光学分束镜I 2、光学分束镜II 15、光学反射镜I 5和光学反射镜II 12在光学平台上构成一个马赫增德尔光路系统，其中光学分束镜I 2与光学反射镜II12在同一条水平线上，光学分束镜I 2与光学反射镜I 5在同一条垂直线上，光学反射镜II12与光学分束镜II 15在同一条垂直线上，光学分束镜II 15与光学反射镜I 5在同一条水平线上；
光学分束镜I 2与光学反射镜I 5之间依次设有第一透镜L1 3、第二透镜L2 4，第一透镜 L1 3与第二透镜L2 4之间的距离L＝f1+f2，其中f1为第一透镜的焦距，f2为第二透镜的焦距；
光学反射镜II 12与光学分束镜II 15之间依次设有显微物镜II 13、针孔滤波器14，针孔滤波器14与显微物镜II 13紧挨着；
光学反射镜I 5与光学分束镜II 15之间依此设有光阑6、锥镜7、第三透镜L3 8、暗场聚光镜9、实验样品10、显微物镜I 11，锥镜7与第三透镜L3 8之间距离满足Z0(f3<Z0<Zmax)，其中f3为第三透镜L3焦距，Zmax＝a/(n-1)γ，a为锥镜孔径，n为锥镜折射率，γ为锥镜锥角，本实施例中，根据实验参数，锥镜锥角γ＝5°，第三透镜L3焦距f3＝225mm，锥镜7与第三透镜L3两者距离为0.230m，实验样品10位于暗场聚光镜9的后焦面上，显微物镜I 11的前焦面和实验样品10平面重合，光电耦合装置16设置在光学分束镜15的后方，并与实验样品10为物像共轭关系。
进一步地，所述光电耦合装置16为CCD或CMOS。
进一步地，所述实验样品10为直径为550纳米的聚苯乙烯微球。
进一步地，所述的激光器1与光学分束镜I 2之间在水平方向上的距离为0.15-0.2m，本实施例中为0.2m；光学分束镜I 2与光学反射镜II 12之间的距离、光学分束镜I 2与光学反射镜I 5之间的距离、光学反射镜II 12与光学分束镜II 15之间的距离、光学分束镜II 15与光学反射镜I 5之间的距离均为0.9-1.0m，本实施例中均为1.0m；光学分束镜I 2与第一透镜L1 3之间的距离为0.3-0.4m，本实施例中均为0.3m；光学反射镜II 12与显微物镜II 13之间的距离为0.5-0.6m，本实施例中均为0.5m；光阑6与光学反射镜I 5之间的距离、光阑6与锥镜7之间的距离均为0.10-0.15m，本实施例中均为0.1m；光电耦合装置装置16与光学分束镜15之间的距离为0.08-0.10m，本实施例中均为0.10m。
基于局域空心光束照明的数字全息显微装置的工作方法，其特征在于：包括如下步骤：
A、搭建所述数字全息显微装置，打开激光器1、光电耦合器件16和计算机17电源；
B、激光器1发出的激光通过光学分束镜I 2后被分为水平和垂直两束，水平一束激光到达光学反射镜II 12后折转进入显微物镜II 13中，垂直一束激光依次通过第一透镜L13和第二透镜L2 4，并由第一透镜L1 3和第二透镜L2 4组成的扩束准直系统由高斯光束变为平面波后照射到光学反射镜I5上；
C、由光学反射镜I 5反射后的平面波依次通过光阑6，到达锥镜7后被调制为贝塞尔光束，贝塞尔光束通过第三透镜L3 8聚焦后生成局域空心光束18进入暗场聚光镜中；
D、局域空心光束18进入暗场聚光镜9后汇聚，形成环形光锥照明实验样品10，离开实验样品的衍射光由显微物镜I 11接收，通过光学分束镜II 15成像在光电耦合装置16的光敏面上，这一路光为物光；
E、激光器1发出的激光通过光学分束镜I 2后水平一束，由光学反射镜II 12折转进入显微物镜II 13中，经显微物镜II 13扩束，空间滤波器14滤波后，由高斯光束变为球面波经光学分束镜II 15折转到达光电耦合装置16表面，这一路为参考光；
F、在光电耦合装置16光敏面上，物光和参考光干涉，产生干涉条纹，调节光学分束镜II 15对参考光的反射角度，使物光和参考光的夹角在偏折一定角度时，能使干涉条纹均匀，在光电耦合装置16光敏面上出现稳定均匀的干涉条纹时，使用计算机驱动光电耦合装置16 将干涉条纹记录到到磁盘驱动器，得到实验样品全息图；
G、将光电耦合装置16记录的全息图，读入计算机图像处理软件中，具体流程如：
a)图像读取：调入全息图，读取第二层，转成双精度；
b)频谱分离：对全息图进行傅里叶变换，得到全息图+1级和-1级频谱及零级频谱；
c)频域滤波：通过频域滤波的方式读取频谱图+1级或-1级；
d)数值再现：对提取的+1级或-1级频谱图进行逆傅里叶变换，再取绝对值，得到物光波的复振幅；
H、更换不同的实验样品，重复F-G步骤，检测观察不同样品，可得到不同样品的数字全息超分辨图像。
本发明中各装置的元件参数为：激光器1的波长473nm；显微物镜Ⅱ的放大倍率为10X，滤波器14针孔尺寸15μm；显微物镜Ⅰ11放大倍率为20X，N.A.为0.4；分光棱镜分光比为50:50；暗场聚光镜9为干式暗场聚光镜，锥镜锥角5°，第三透镜焦距f＝225mm；光电耦合装置为CCD，样品为550nm聚苯乙烯微球；
在图1中，激光从激光器1出射后经光学分束镜Ⅰ2按1:1比例分为物光和参考光两路。其中一路物光经光学分束镜Ⅰ2折转后进入第一透镜L1 3与第二透镜L2 3组成的扩束准直系统，将出射的高斯光束扩束准直为平面波照射到光学反射镜Ⅰ5上，平面波经光学反射镜Ⅰ5 折转后通过光阑6到达锥镜7表面，通过锥镜7后的平面波经调制后生成无衍射贝塞尔光束，贝塞尔光束依次通过第三透镜L3 8，聚焦后形成局域空心光束18进入暗场聚光镜9中形成环形光锥照明实验样品，携带物体低频信息的光沿原方向射出，且未通过成像显微物镜Ⅰ11，被环形光锥照明后产生的高频散射光被显微物镜Ⅰ11接收(如图4所示)并通过光学分束镜Ⅱ15成像在光电耦合装置16的光敏面上；
局域空心光束18最简单的获得方法是利用锥镜和透镜组合系统(原理图如图2所示)，即将一束经准直扩束后的激光入射到锥镜上，获得光强分布不随传播距离改变而变化的近似无衍射光束，研究发现，在透镜到锥镜的距离大于聚焦透镜的焦距，小于贝塞尔光束的最大无衍射距离Zmax时(f<Z0<Zmax)，即可产生局域空心光束，此方法结构简单，入射能量利用率高，暗中空间区域大小尺寸容易操控。可以产生局域空心光束。
其中，n为折射率；a为锥镜孔径；γ为锥镜的锥角。
图3是实验室采集的局域空心光束18光强分布图，局域空心光束18是一种在传输方向上存在着中心光强低，甚至为零的局部区域，这一区域的空间三维边界的光强较高，强度分布为环形结构，具有旋转角动量，轨道角动量和暗域尺寸大小可调节等优点，作为照明光能最大限度的提供光强强度，提高光能利用率，且消除了照明光在传播过程中衍射产生旁瓣较强，管径内壁产生的杂散光等问题，提高了系统分辨率和图像对比度。
参考光由光学反射镜II 12折转进入显微物镜II 13中，经显微物镜II 13扩束，空间滤波器14滤波，由高斯光束变为球面波经过光学分束镜II 15折转后到达光电耦合装置16光敏面上与物光干涉；
物光和参考光通过光学分束镜II 15和束后在光电耦合装置16光敏面产生干涉条纹，使用CCD将干涉条纹记录到计算机17中。
将CCD采集的全息图读入MATLAB软件中，读取图像的第二层，转为双精度，对其做傅里叶变换，通过频域滤波提取+1级或-1级图像，对滤波后的图像做逆傅里叶变换，取绝对值就可得到物光波的复振幅。
再现像分析对比(如图5-8所示)：对明场和暗场数字全息图进行对比，通过对实验样品 (直径为550纳米聚苯乙烯微球)传统明场照明和局域空心光束暗场照明的全息再现像进行对比(白色方框标记)，当两个小球挨近时，明场数字全息法明显不能分辨出，而采用该装置及工作方法的暗场全息法进行照明时明显能分辨出挨近的小球，实验样品尺寸小于极限分辨尺寸，证明，该方法能够突破辨率极限提高数字全息显微系统的分辨率，增强了再现像对比度。
此外(如图4所示)，局域空心光束18速进入暗场聚光镜9后形成环形光锥照明物体，携带物体低频信息的环形光锥沿原先方向射出去，且未通过显微物镜，高频散射光被显微物镜接收并通过光学分束镜与参考球面波在CCD光敏面上干涉形成干涉条纹，即全息图，设R 为参考光，O为物光波，两光干涉后光强用CCD等完成光电转换输入到计算机中储存下来，得到数字全息图，表达式为：
I＝|R+O|2＝|R|2+|O|2+|R*O|+|RO*| (2)
式(2)中，I为全息图光强分布，|R+O|2代表参考光R与物光O干涉，|R|2和|O|2是零级项，|R*O|和|RO*|是全息图的+1级和-1级项，其中第三项是正比于物光的实像。
在暗场数字全息再现过程中，由于物光直接成像在全息记录面上，因此再现时不需要计算空间衍射传播，但是为了消除零级项和共轭项的干扰，采用频域滤波的方式提取频域中正 +1级(或-1级)项频谱，再对提取的+1级(或-1级)频谱进行逆傅里叶变换就可得到物光波的复振幅。
局域空心光束18是一种在传输方向上存在着中心光强低，甚至为零的局部区域，这一区域的空间三维边界的光强较高，有极高的强度梯度，强度分布为环形结构(如图3所示)，具有旋转角动量，轨道角动量和暗域尺寸大小可调节等优点，利用其特殊的光强分布结构作为照明光源，根据暗场聚光镜的孔径，选择合适的锥镜-透镜组合，根据暗场聚光镜的孔径，选择合适的局域空心光束，其光束表达式为：
其中，A是复振幅常量，是波矢，kr是径向波失分量，r是径向矢量坐标，r1是径向坐标，J0是第一类零阶贝塞尔函数，f是聚焦透镜焦距，z是平面波经轴棱锥变换传输的距离。由式(2)得到聚焦后的光强分布：
根据暗场聚光镜的孔径尺寸，选择合适的锥镜-透镜组合，保证局域空心光束可以完全进入暗场聚光镜，局域空心光束入射到暗场聚光镜后形成环形光锥照明物体，离开物体后的高频散射光被显微镜接收并用于物体成像，因此可以形成暗背景下的亮物体，从而提高物体成像对比度；另外，由于暗场成像携带信息是物体的高频信息，使得物体的成像分辨率得到提高；
上面结合附图对本发明的具体实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (5)
1.一种基于局域空心光束照明的数字全息显微装置，其特征在于：包括激光器(1)、光学分束镜I(2)、光学分束镜II(15)、显微物镜I(11)、显微物镜II(13)、针孔滤波器(14)、光学反射镜I(5)、光学反射镜II(12)、第一透镜L1(3)、第二透镜L2(4)、第三透镜L3(8)、光阑(6)、锥镜(7)、暗场聚光镜(9)、实验样品(10)、光电耦装置(16)、计算机(17)；其中，
激光器(1)出射的激光照射在光学分束镜I(2)上；光学分束镜I(2)、光学分束镜II(15)、光学反射镜I(5)和光学反射镜II(12)在光学平台上构成一个马赫增德尔光路系统，其中光学分束镜I(2)与光学反射镜II(12)在同一条水平线上，光学分束镜I(2)与光学反射镜I(5)在同一条垂直线上，光学反射镜II(12)与光学分束镜II(15)在同一条垂直线上，光学分束镜II(15)与光学反射镜I(5)在同一条水平线上；
光学分束镜I(2)与光学反射镜I(5)之间依次设有第一透镜L1(3)、第二透镜L2(4)，第一透镜L1(3)与第二透镜L2(4)之间的距离L＝f1+f2，其中f1为第一透镜L1(3)的焦距，f2为第二透镜L2(4)的焦距；
光学反射镜II(12)与光学分束镜II(15)之间依次设有显微物镜II(13)、针孔滤波器(14)，针孔滤波器(14)与显微物镜II(13)紧挨着；
光学反射镜I(5)与光学分束镜II(15)之间依此设有光阑(6)、锥镜(7)、第三透镜L3(8)、暗场聚光镜(9)、实验样品(10)、显微物镜I(11)，锥镜(7)与第三透镜L3(8)之间距离满足Z0(f3<Z0<Zmax)，其中f3为第三透镜L3的焦距，Zmax＝a/(n-1)γ，a为锥镜(7)的孔径，n为锥镜(7)折射率，γ为锥镜(7)锥角，实验样品(10)位于暗场聚光镜(9)的后焦面上，显微物镜I(11)的前焦面和实验样品(10)平面重合，光电耦合装置(16)设置在光学分束镜(15)的后方，并与实验样品(10)为物像共轭关系。
2.根据权利要求1所述的基于局域空心光束照明的数字全息显微装置，其特征在于：所述的光电耦合装置(16)为CCD或CMOS。
3.根据权利要求1或2所述的基于局域空心光束照明的数字全息显微装置，其特征在于：所述的实验样品(10)为直径为550纳米的聚苯乙烯微球。
4.根据权利要求1或2所述的基于局域空心光束照明的数字全息显微装置，其特征在于：所述的激光器(1)与光学分束镜I(2)之间的距离为0.15-0.2m，光学分束镜I(2)与光学反射镜II(12)之间的距离、光学分束镜I(2)与光学反射镜I(5)之间的距离、光学反射镜II(12)与光学分束镜II(15)之间的距离、光学分束镜II(15)与光学反射镜I(5)之间的距离均为0.9-1.00m，光学分束镜I(2)与第一透镜L1(3)之间的距离为0.3-0.4m，光学反射镜II(12)与显微物镜II(13)之间的距离为0.5-0.6m，光阑(6)与光学反射镜I(5)之间的距离、光阑(6)与锥镜(7)之间的距离均为0.10-0.15m，光电耦合装置装置(16)与光学分束镜(15)之间的距离为0.08-0.10m。
5.一种基于局域空心光束照明的数字全息显微装置的工作方法，其特征在于：包括如下步骤：
A、搭建所述数字全息显微装置，打开激光器(1)、光电耦合器件(16)和计算机(17)电源；
B、激光器(1)发出的激光通过光学分束镜I(2)后被分为水平和垂直两束，水平一束激光到达光学反射镜II(12)后折转进入显微物镜II(13)中，垂直一束激光依次通过第一透镜L1(3)和第二透镜L2(4)，并由第一透镜L1(3)和第二透镜L2(4)组成的扩束准直系统由高斯光束变为平面波后照射到光学反射镜I(5)上；
C、由光学反射镜I(5)反射后的平面波依次通过光阑(6)，到达锥镜(7)后被调制为贝塞尔光束，贝塞尔光束通过第三透镜L3(8)聚焦后生成局域空心光束(18)进入暗场聚光镜(9)中；
D、局域空心光束(18)进入暗场聚光镜(9)后汇聚，形成环形光锥照明实验样品(10)，离开实验样品的衍射光由显微物镜I(11)接收，通过光学分束镜II(15)成像在光电耦合装置(16)的光敏面上，这一路光为物光；
E、激光器(1)发出的激光通过光学分束镜I(2)后分出的水平一束，由光学反射镜II(12)折转进入显微物镜II(13)中，经显微物镜II(13)扩束，空间滤波器(14)滤波后，由高斯光束变为球面波经光学分束镜II(15)折转到达光电耦合装置(16)表面，这一路为参考光；
F、在光电耦合装置(16)光敏面上，物光和参考光干涉，产生干涉条纹，调节光学分束镜II(15)对参考光的反射角度，使物光和参考光的夹角在偏折一定角度时，能使干涉条纹均匀，在光电耦合装置(16)光敏面上出现稳定均匀的干涉条纹时，使用计算机驱动光电耦合装置(16)将干涉条纹记录到到磁盘驱动器，得到实验样品全息图；
G、将光电耦合装置(16)记录的全息图，读入计算机(17)图像处理软件中，具体流程如：
a)、图像读取：调入全息图，读取第二层，转成双精度；
b)、频谱分离：对全息图进行傅里叶变换，得到全息图+1级和-1级频谱及零级频谱；
c)、频域滤波：通过频域滤波的方式读取频谱图+1级或-1级；
d)、数值再现：对提取的+1级或-1级频谱图进行逆傅里叶变换，再取绝对值，得到物光波的复振幅；
H、更换不同的实验样品，重复F-G步骤，检测观察不同样品，可得到不同样品的数字全息超分辨图像。
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