CN106442413B - 一种双光束非正交相位显微一次成像系统及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种双光束非正交相位显微一次成像系统及方法，包括依次排列的激光器、第一透镜、针孔滤波器、第二透镜、衍射光栅、样品、空间光调制器、光束扩束器、特殊镜片、波片组、显微镜和CCD，所述CCD与计算机连接；所述衍射光栅和样品之间设有轴向对称分布的第一全反镜和第二全反镜；所述光束扩束器和特殊镜片之间设有第三全反镜和第四全反镜；本发明采用衍射分光原理将光束分为作为参考光的0级以及作为物光的+1级和‑1级衍射光，继而空间光调制器对0级衍射光进行滤波整形，再经光束调节最终形成干涉图样，具有高度的稳定性，CCD只需单次曝光即可采集到两幅干涉图，经相应的相位恢复运算可快速实现双角度相位成像，能适用于所有的离轴干涉。
Description
技术领域
本发明属于成像技术研究领域，具体涉及一种双光束非正交相位显微一次成像系统及方法。
背景技术
光学显微技术为微观事物的观察开启了一扇大门，在生物学以及医学等领域发挥了重要作用。尤其是近十几年来，各种定量相位显微成像技术被相继提出，为类似于生物细胞的相位物体的显微观察与动力学行为等研究提供了强有力的工具。但传统生物细胞的定量相位信息反映的是细胞与周围环境折射率差与细胞厚度的乘积，是一个沿光传播方向的积分整体变化量，并不能反映每一点的情况，呈现的仅是一个二维分布。
三维定量相位成像技术主要是用来测量生物细胞折射率的三维分布，探索细胞内的结构信息。如美国N.Lue等人提出首先利用希尔伯特相位显微获取细胞的定量相位信息，然后采用共聚焦反射显微获得细胞的物理轮廓信息，最后由这两者全场式的计算出细胞的轴向平均折射率；又如瑞士B.Rappaz等人提出通过改变细胞周围的环境液，分别获取对应的定量相位图像，从而同时求解出细胞的轴向平均折射率和物理厚度。但这些方法中细胞的高速运动会增大测量误差。所以通常情况下都需要结合层析成像技术，通过多角度照明、旋转样品或是多波长扫描等方式，得到一系列的图像，经过合适的重建方法计算出折射率的层析。例如F.Charriere于2006年基于数字全息显微提出标准衍射层析技术，并测量了被放置在玻璃微量吸液管中花粉分子的折射率分布。其精度优于0.01，三维空间分辨率优于1μm。此外，美国W.Choi在生物细胞折射率三维重建方面也做出了许多的研究，于2007年基于相移干涉显微提出了层析相位显微技术，此技术已成功获得了海拉细胞和人类结肠癌细胞的三维折射率分布。2014年意大利的P.Memmolo等人将光镊技术引入到数字全息技术中观察到了红细胞3D形态分布。但无论是不同照明角度还是旋转样品都对实验精度要求很高，操控难度也会加大。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题提供一种双光束非正交相位显微一次成像系统及方法，使同时适用于所有的离轴干涉，包括轻微离轴干涉，在单次曝光下可同时采集到不同角度下的两幅干涉图，节约采集时间，增强相位成像的稳定性、精确度和效率。可实现相位物体双角度快速相位显微成像。为相位体最终的三维成像奠定了基础。
为了实现上述目的，本发明基于衍射相位显微成像技术，运用后放大干涉的原理并结合离轴干涉技术，提出了一种双光束非正交相位显微一次成像技术，构造独立双光束非正交干涉系统，具体技术方案如下：
一种双光束非正交相位显微一次成像系统，其特征在于，包括依次排列的激光器、第一透镜、针孔滤波器、第二透镜、衍射光栅、样品、空间光调制器、光束扩束器、特殊镜片、波片组、显微镜和CCD，所述CCD与计算机连接；所述衍射光栅和样品之间设有轴向对称分布的第一全反镜和第二全反镜；所述光束扩束器和特殊镜片之间设有轴向对称分布的用于调节+1级衍射光角度的第三全反镜和用于调节-1级衍射光角度的第四全反镜；所述特殊镜片用于调节+1级衍射光、-1级衍射光与0级衍射光干涉角度；所述波片组用于调节双角度干涉光束偏振态；
沿着激光器的输出方向依次连接由第一透镜、针孔空间滤波器、第二透镜组成的透镜扩束准直系统以及衍射光栅，所述衍射光栅将激光分成包含0级级衍射光以及+1级衍射光、-1级衍射光在内的许多级衍射光；所述衍射光中的+1级衍射光、-1级衍射光分别通过第一全反镜和第二全反镜的调节从两个不同角度透过样品并携带样品信息，0级衍射光向前透过样品也携带了样品信息；空间光调制器允许+1级衍射光、-1级衍射光全部通过，0级衍射光低通滤波，+1级衍射光、-1级衍射光作为样品光，0级衍射光作为参考光；0级衍射光通过光束扩束器光束整形，+1级衍射光、-1级衍射光由第三全反镜、第四全反镜及特殊镜片调节分别与0级衍射光发生干涉；双角度干涉光束继续向前经过波片组调节不同偏振态以保证单次曝光两幅图的干涉效果；干涉光束在经过偏振片时可调节两幅干涉图样的对比度；并在显微镜处进行后放大处理，在CCD上形成两干涉图，并存储在计算机上。
上述方案中，所述第三全反镜和第四全反镜为可旋转全反镜。通过旋转可改变物光场的传输方向，那么经特殊镜片出射的两干涉光束也会发生相应的改变，由此可根据需要，观察采集到的干涉图像来调整第三全反镜、第四全反镜的角度自由切换离轴干涉与轻微离轴干涉。
上述方案中，所述的特殊镜片两平面由两片半透半反镜组成，且两半透半反镜片夹角呈90°，保证了0级衍射光的水平透射以及+1级衍射光和-1级衍射光的反射效果。
上述方案中，所述波片组由上半部分的四分之一波片和下半部分的半波片组成，这样具有不同的偏振状态两干涉光束不会发生二次干涉，保证了两幅图样的干涉效果。
上述方案中，还包括用于调节两幅干涉图样的对比度偏振片；所述偏振片位于波片组和显微镜之间。
上述方案中，显微镜位于干涉系统之后。
一种利用所述的双光束非正交相位显微一次成像系统进行成像的方法，其特征在于包括以下步骤：
第一步，激光束沿着激光器的输出方向经过透镜扩束准直系统由激光束经衍射光栅分成+1级衍射光、-1级衍射光与0级衍射光；所述衍射光束透过样品，并通过空间光调制器允许+1级衍射光、-1级衍射光全部通过，0级衍射光低通滤波，+1级衍射光、-1级衍射光与0级衍射光分别作为样品光O1、O2与参考光R；
第二步，所述的+1级衍射光、-1级衍射光束经过第三全反镜、第四全反镜及特殊镜片调节使其分别与0级衍射光发生干涉，且在干涉发生后两干涉光束经过波片组调节不同偏振态；
第三步，样品光束O1、O2与参考光束R对应相遇形成了干涉系统，仅需单次曝光，可在CCD上采集到两幅干涉图样；然后由相应的相位恢复运算可实现定量相位成像。
与现有技术相比本发明的有益效果是：
1、采用衍射相位显微成像技术原理的共几何光路结构保证了本发明系统的可靠性与稳定性；
2、本发明采用合适的空间光调制器允许+1、-1级衍射光全部通过，0级衍射光低通滤波，并分别作为样品光与参考光。无需相移，从而避免了相移精确调控的困难；
3、本发明相位成像系统单次曝光可同时采集到两幅干涉图，耗时少，利于样品实时相位信息的提取以及快现象的研究；
4、通过旋转第三全反镜、第四全反镜，可实现任意离轴干涉，还包括能够有效利用CCD空间带宽的轻微离轴干涉；
5、显微物镜位于干涉系统之后，可减少相位噪声，相差弱；
6、双角度非正交相位成像可解构相位体的空间形态结构以至于实现三维成像。
因此，本发明系统应用面广，具有很好的实用价值。
附图说明
图1是本发明一实施方式是的系统及方法对应的光路示意图。
图中，1：激光器；2：第一透镜；3：针孔空间滤波器；4：第二透镜；5：衍射光栅；6：第一全反镜；7：第二全反镜；8：样品；9：空间光调制器；10：光束扩束器；11：第三全反镜；12：第四全反镜；13：特殊镜片；14：波片组；15:偏振片；16：显微镜；17：CCD；18：计算机。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于此。
图1所示为本发明所述双光束非正交相位显微一次成像系统及方法的一种实施方式，所述双光束非正交相位显微一次成像系统包括依次排列的激光器1、第一透镜2、针孔滤波器3、第二透镜4、衍射光栅5、样品8、空间光调制器9、光束扩束器10、特殊镜片13、波片组14、显微镜16、偏振片15和CCD17，所述CCD17与计算机18连接；所述衍射光栅5和样品8之间设有轴向对称分布的第一全反镜6和第二全反镜7；所述光束扩束器10和特殊镜片13之间设有轴向对称分布的用于调节+1级衍射光角度的第三全反镜11和用于调节-1级衍射光角度的第四全反镜12；所述特殊镜片13用于调节+1级衍射光、-1级衍射光与0级衍射光干涉角度；所述波片组14用于调节双角度干涉光束偏振态。
激光器1发出的激光沿着激光器1的输出方向依次连接由第一透镜2、针孔空间滤波器3、第二透镜4组成的透镜扩束准直系统以及衍射光栅5，所述衍射光栅5将激光分成包含0级级衍射光以及+1级衍射光、-1级衍射光在内的许多级衍射光；所述衍射光中的+1级衍射光、-1级衍射光分别通过第一全反镜6和第二全反镜7的调节从两个不同角度透过样品8并携带样品信息，0级衍射光向前透过样品8也携带了样品信息；空间光调制器9允许+1级衍射光、-1级衍射光全部通过，0级衍射光低通滤波，+1级衍射光、-1级衍射光分别作为样品光O1和O2，0级衍射光作为参考光R；0级衍射光通过光束扩束器10光束整形，+1级衍射光O1、-1级衍射光O2由第三全反镜11、第四全反镜12及特殊镜片13调节分别与0级衍射光R发生干涉；双角度干涉光束继续向前经过波片组14调节不同偏振态以保证单次曝光两幅图的干涉效果；干涉光束在经过偏振片15时可调节两幅干涉图样的对比度；样品光束与参考光束相干涉后的图样经干涉系统后的显微镜16处进行后放大处理，并记录在后面的CCD17上形成两干涉图，并存储在计算机18上，经相应的相位恢复运算，就可获得样品的定量相位图样，由相位与光程差的关系可解构出相位体的形态结构。
所述第三全反镜11和第四全反镜12为可旋转全反镜，调整所述第三全反镜11和第四全反镜12的转向，也可改变两参考光的传播方向，与样品光可发生离轴或是轻微离轴干涉。若旋转偏振片15也可同时调节两幅干涉图样的对比度来达到最佳效果。
所述的特殊镜片13两平面由两片半透半反镜组成，且两半透半反镜片夹角呈90°。保证了0级衍射光的水平透射以及+1、-1级衍射光的反射效果。
所述波片组14由上下两部分构成。上半部分为四分之一波片，下半部分为半波片，两干涉光透过后会具有不同的偏振状态，防止两干涉光束发生二次干涉，消除误差的同时保证了干涉图样的效果。
显微镜16位于干涉系统之后，可减少相位噪声，相差弱。
一种利用所述的双光束非正交相位显微一次成像系统进行成像的方法，其特征在于包括以下步骤：
第一步，激光器1发出的激光束沿着激光器1的输出方向经过透镜扩束准直系统由激光束经衍射光栅5分成+1级衍射光、-1级衍射光与0级衍射光在内的许多级衍射光；所述衍射光束透过样品8，并通过空间光调制器9允许+1级衍射光、-1级衍射光全部通过，0级衍射光低通滤波，+1级衍射光、-1级衍射光与0级衍射光分别作为样品光O1、O2与参考光R；
第二步，所述的+1级衍射光、-1级衍射光束经过第三全反镜11、第四全反镜12及特殊镜片13调节使其分别与0级衍射光发生干涉，且在干涉发生后两干涉光束经过波片组14调节不同偏振态，以防止二次干涉对干涉图样效果的影响；
第三步，样品光束O1、O2与参考光束R对应相遇形成了干涉系统，仅需单次曝光，可在CCD17上采集到两幅干涉图样；然后由相应的相位恢复运算可实现定量相位成像。
本发明基于衍射相位显微成像技术，采用光栅衍射分光原理将光束分为作为参考光的0级衍射光以及作为物光的+1级衍射光和-1级衍射光，继而空间光调制器对0级衍射光进行滤波整形，再经由光束调节最终分别形成干涉图样，具有高度的稳定性。且由于波片调节后的双角度干涉光束具有不同的偏振态，故CCD17只需单次曝光即可采集到两幅干涉图，充分利用CCD17带宽。经相应的相位恢复运算可快速实现双角度相位成像，进而解构相位体的空间形态结构。而且该成像方法能适用于所有的离轴干涉，包括轻微离轴干涉。为相位体的三维成像奠定了基础。在相位显微方面具有广泛的实用价值与应用前景，特别是在透明样品，如生物细胞相位成像以及相位测量等应用领域。
应当理解，虽然本说明书是按照各个实施例描述的，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种双光束非正交相位显微一次成像系统，其特征在于，包括依次排列的激光器(1)、第一透镜(2)、针孔滤波器(3)、第二透镜(4)、衍射光栅(5)、样品(8)、空间光调制器(9)、光束扩束器(10)、特殊镜片(13)、波片组(14)、显微镜(16)和CCD(17)，所述CCD(17)与计算机(18)连接；所述衍射光栅(5)和样品(8)之间设有轴向对称分布的第一全反镜(6)和第二全反镜(7)；所述光束扩束器(10)和特殊镜片(13)之间设有轴向对称分布的用于调节+1级衍射光角度的第三全反镜(11)和用于调节-1级衍射光角度的第四全反镜(12)；所述特殊镜片(13)用于调节+1级衍射光、-1级衍射光与0级衍射光干涉角度；所述波片组(14)用于调节双角度干涉光束偏振态；
沿着激光器(1)的输出方向依次连接由第一透镜(2)、针孔空间滤波器(3)、第二透镜(4)组成的透镜扩束准直系统以及衍射光栅(5)，所述衍射光栅(5)将激光分成包含0级衍射光以及+1级衍射光、-1级衍射光在内的许多级衍射光；所述衍射光中的+1级衍射光、-1级衍射光分别通过第一全反镜(6)和第二全反镜(7)的调节从两个不同角度透过样品(8)并携带样品信息，0级衍射光向前透过样品(8)也携带了样品信息；空间光调制器(9)允许+1级衍射光、-1级衍射光全部通过，0级衍射光低通滤波，+1级衍射光、-1级衍射光作为样品光，0级衍射光作为参考光；0级衍射光通过光束扩束器(10)光束整形，+1级衍射光、-1级衍射光由第三全反镜(11)、第四全反镜(12)及特殊镜片(13)调节分别与0级衍射光发生干涉；双角度干涉光束继续向前经过波片组(14)调节干涉光束不同的偏振态，并在显微镜(16)处进行后放大处理，在CCD(17)上形成两干涉图，并存储在计算机(18)上。
2.根据权利要求1所述的一种双光束非正交相位显微一次成像系统，其特征在于，所述第三全反镜(11)和第四全反镜(12)为可旋转全反镜。
3.根据权利要求1所述的一种双光束非正交相位显微一次成像系统，其特征在于，所述的特殊镜片(13)两平面由两片半透半反镜组成，且两半透半反镜片夹角呈90°。
4.根据权利要求1所述的一种双光束非正交相位显微一次成像系统，其特征在于，所述波片组(14)由上半部分的四分之一波片和下半部分的半波片组成。
5.根据权利要求1所述的一种双光束非正交相位显微一次成像系统，其特征在于，还包括用于调节两幅干涉图样的对比度偏振片(15)；所述偏振片(15)位于波片组(14)和显微镜(16)之间。
6.根据权利要求1所述的一种双光束非正交相位显微一次成像系统，其特征在于，显微镜(16)位于干涉系统之后。
7.一种利用权利要求1所述的双光束非正交相位显微一次成像系统进行成像的方法，其特征在于包括以下步骤：
第一步，激光束沿着激光器(1)的输出方向经过透镜扩束准直系统由激光束经衍射光栅(5)分成+1级衍射光、-1级衍射光与0级衍射光；衍射光束透过样品(8)，并通过空间光调制器(9)允许+1级衍射光、-1级衍射光全部通过，0级衍射光低通滤波，+1级衍射光、-1级衍射光与0级衍射光分别作为样品光O1、O2与参考光R；
第二步，所述的+1级衍射光、-1级衍射光束经过第三全反镜(11)、第四全反镜(12)及特殊镜片(13)调节使其分别与0级衍射光发生干涉，且在干涉发生后两干涉光束经过波片组(14)调节不同偏振态；
第三步，样品光束O1、O2与参考光束R对应相遇形成了干涉系统，仅需单次曝光，即可在CCD(17)上采集到两幅干涉图样；然后由相应的相位恢复运算可实现定量相位成像。
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