CN111122509B - 基于f-p干涉仪反射透射式相位显微成像测量系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供的是一种基于F‑P干涉仪的腔内增强型透射反射式相位显微成像测量系统。其特征是：它由激光光源1、光衰减系统2、激光扩束系统3、BS分光棱镜4、F‑P干涉仪5、显微物镜6和8、探测相机7和9、计算机10组成。本发明通过光在F‑P腔中的多次反射，每次经过腔内待测物体可以成倍增加光程差，从而显著增大干涉条纹的宽度，达到了提高分辨率的目的。本发明可用于微小物体的数字全息和折射率测量，可广泛用于各种微小物体内部的折射率三维显微成像测量领域。

Description

基于F-P干涉仪反射透射式相位显微成像测量系统

(一)技术领域

本发明涉及的是一种基于F-P干涉仪的透射反射式增强型相位显微成像测量系统，可用于细胞和各种微小物体内部的折射率三维显微成像测量，属于光学测量技术领域。

(二)背景技术

显微光学成像，通常也称“光学显微成像”(Optical Microscopy)或“光学显微术”(Light Microscopy)，是指透过样品或从样品反射回来的可见光，通过一个或多个透镜后，能够得到微小样品的放大图像的技术。所得图像可以通过目镜直接用眼睛观察，也可以用感光板或数字化图像探测器如电荷耦合器件(CCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)进行记录，还可以在计算机上进行显示和分析处理。

采用明场照明方式的普通光学显微术通常存在三个方面的局限性：一是只能对深色样品(透射型)或强反光样品(反射型)进行成像；二是光学衍射极限限制了该技术的最高分辨率约为200nm；三是离焦信息会降低图像对比度。基于样品中(外源或内源)荧光分子的激发和荧光发射的荧光显微术(Fluorescence Microscopy)，可以突破无法对透明样品成像的局限，但分辨率受限和离焦干扰的问题仍需要采取其他措施才能加以解决。

20世纪30年代，荷兰物理学家泽尼克(Zernike)首次提出了相衬技术，其原理是通过将直射光(即零频光)的相位改变±90°并适当衰减，从而使直射光和衍射光发生干涉而使像平面上的复振幅分布近似正比于物体的相位分布，将“看不见”的相位变化转化为“可见”的强度分布。采用该技术，可以方便地实现对无染色的活细胞样品的直接观察和成像，但其缺点是不适合厚样品和极微小样品。

近年来的数字全息技术由于其能够记录并显示所记录物体的全部信息而被应用于显微成像中，其中专利CN109062018A中公开了一种三波长反射式数字全息显微镜，该数字全息显微镜由三束波长有差别的线偏振光源以及分光棱镜、透镜等组成。其实现的功能是相对于以往的显微成像装置有了较好的图像分辨率，但其系统只使用了反射光作为形成干涉光，无法通过对比消除误差，并且三光源系统结构复杂，不易操作。

专利CN109615651A中公开了一种基于光场显微系统的三维显微成像方法及系统，通过预设算法对光场强度图像和其中所述的第一前向投影矩阵、高分辨率强度图像和第二前向投影矩阵进行三维重建，生成三维样本的三维重建结果。通过增加一路采集光路，实现在同等迭代次数下，增强焦面重建信噪比，光场显微成像的重建效果有很大的提升，但该方法及系统是使用更加优化的算法重建而得到的，依靠的光路结构依然没有变化，并且迭代复杂，难以实现。

专利CN109520988A中公开了一种显微成像系统，隔震平台，可移动的载玻片，成像组件构成。可对不同类型的细胞样本进行高精度检测，但是该系统是依据细胞荧光的原理成像，无法对于其他非细胞微粒及物体成像，适用范围小。

专利CN201710904860.1公开了一种光学相干断层扫描成像系统，该成像系统采用了马赫曾德尔干涉光路，其特点是采用了光纤来简化系统，降低成本，但是相比F-P腔的光路结构，仍然较为复杂。

专利CN201810145657.5公开了一种高分辨率数字全息衍射层析成像，其特点是采用马赫曾德尔干涉光路结构，利用合成孔径方法得到N幅合成高分辨率全息图，进而获得被测样品的高分辨率三维折射率再现。相对来说，结构更为复杂，与本发明专利有着本质区别。

专利CN201910136421.X公开了一种超分辨率数字全息成像系统和成像方法，其成像系统的特点是在传统的马赫曾德尔干涉光路前加入一块透射式空间光调制器，对光源进行调制。与采用F-P腔的光路结构的本发明相比，有着本质区别。

对此，本发明所设计的基于F-P干涉仪的增强型相位显微成像测量系统，其F-P干涉仪的精细度在20以上，由此可以利用光束在F-P干涉仪的多次反射，其在反射透射之后产生的相干条纹会成倍放大，从干涉结构部分直接提高了成像的分辨率。

另外，本发明设计的基于F-P干涉仪的腔内增强型相位显微成像测量系统，能够同时利用通过F-P干涉仪的反射光和折射光，由同一光源产生两次不同的干涉，从而生成两幅干涉图像，对比两幅图像来消除相干噪声。其结构简单，易于操作，分辨率高，精确度高，成像性能好。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种结构简单紧凑、操作调节容易的基于F-P干涉仪的透射反射式增强型相位显微成像测量系统。

本发明的目的是这样实现的，方法如下：

该反射式增强型相位显微成像测量系统是由激光光源1、光衰减系统2、激光扩束系统3、BS分光棱镜4、F-P干涉仪5、显微物镜6和8、探测相机7和9、计算机10组成。

其中,光源1发出的光经由光衰减系统2，再通过激光扩束系统3扩束后进入到BS分光棱镜4，该分光棱镜产生两束传播方向垂直的强度相等的激光，分别传至F-P干涉仪5和上方显微物镜8，传至F-P干涉仪5的光束，在F-P腔内多次反射后，将置于F-P腔内的待测物体的光程差成倍放大，从而将其相位信息成倍放大后，携带待测物体信息的透射光传至右方显微物镜6，经过显微物镜后传至右方探测相机7，再将得到的待测物体信号传输至计算机8；与此同时，F-P干涉仪中的反射光同步反射回BS分光棱镜，再通过分光棱镜反射至上方显微物镜8，反射光通过显微物镜后由上方探测相机9接收，将得到的待测物体的信号传输至计算机10；最后，在计算机10中将得到的两幅图像做出对比，弥补单张图像存在的细节丢失，减少误差。

本发明还有以下技术特征：

所使用的光路系统中的F-P干涉仪作为产生成倍光程差的器件，通过光在F-P腔中的多次反射，每次经过待测微粒都可以成倍增加光程差，从而显著增大干涉条纹的宽度，达到了提高分辨率的目的。

F-P腔中，光束在F-P腔中多次反射、透射，相位增强，最终透过F-P腔的光束的复振幅为：

其中，为透射光的复振幅，是F-P腔中入射光的复振幅，为F-P腔的两平行的平面玻璃板内侧的表面反射率，δ为待测细胞的相位分布。

则F-P腔多光束干涉时，通过数字全息获得的相位分布为：

其中，n是腔内介质的折射率，d是F-P腔的厚度，λ为光源的合成波长。

光束沿着传播方向，经过待测物体内部的每一点的折射率的累积，就是通过数字全息图获得的相位分布，当待测物体内部及与待测物体周围的环境介质之间的折射率差较小时，光程差是沿光束路径方向折射率的累积，则相位分布与待测物体的折射率分布的关系为：

其中，n(x,y,z)为待测细胞2内部的折射率分布，z轴是光束传播的方向，n₀为待测细胞2周围的环境介质的折射率。

由此得到的相位分布图和一般以M-Z干涉得到的相位分布图如图3所示，相较于传统的M-Z法，可以得到变化率更加明显的图像，表明了干涉条纹的锐利度会有明显加强，利用计算机由此重建的微粒全息图像，会比传统方式有更高的分辨率，更适用于精细测量。

使用的光路系统的F-P干涉仪作为干涉器件，通过光在F-P腔中的多次反射，从而使得光束在光路中产生自干涉，由于其反射次数较多，可以显著增大干涉条纹的宽度，且其产生的透射光和反射光分别自干涉，产生两幅同光源的方式不同的干涉图，达到了消除误差的目的。

所述的可调F-P干涉仪，其自由光谱范围FSR＞100GHz，精细度F＞20，损耗≤3dB。

所述的的显微物镜6和8使用复消色差物镜，其具有优良的修正性和极其高的数值孔径，所以在观察和显微照相术方面具有最大的分辨率、色彩纯度、对比度以及图象平直度。

本发明基于反射和透射的记录信息，在计算机内同时记录两幅干涉图，并对两幅干涉图进行观察对比，减小相应误差。此外，本发明的反射透射式结构可以精简为单独的反射式增强型相位显微成像测量系统和单独的透射式相位显微成像测量系统。在不要求最大分辨率的情况下可以使用单独的透射式或者反射式增强系统来测量待测物体。

本发明中的装置由于其光学元件较少，便于后期在F-P干涉仪上添加各种有效控制F-P干涉仪平行度和提高F-P干涉仪反射率的可调谐装置，可改装空间大。

本发明的方法能够显著提高再现图像的分辨率。

(四)附图说明

图1是基于F-P干涉仪的透射反射式增强型相位显微成像测量系统。其特征是：它由激光光源1、光衰减系统2、激光扩束系统3、BS分光棱镜4、F-P干涉仪5、显微物镜6和8、探测相机7和9、计算机10组成。

图2是基于F-P干涉仪的透射反射式增强型相位显微成像测量系统的实施例。

图3是基于F-P干涉仪的反射式增强型相位显微成像测量系统的实施例。

图4是基于F-P干涉仪的透射式增强型相位显微成像测量系统的实施例。

图5是基于F-P干涉仪的透射式增强型相位显微成像测量系统中F-P腔的三维结构图，其中1-1和1-2是楔形镜组成的F-P腔，2是保证F-P腔平行度和腔距的平行镜。

图6是将F-P腔置于其中的外装置壳，其中1为固定孔，可以用螺丝调整F-P腔的腔长及平行度，2为放置匹配液的区域，3为放置光纤等微小物的微孔，4为装置外壳。

图7是M-Z干涉法成像和本发明基于F-P标准具的透射反射式增强型相位显微成像的相位强度对比图

(五)具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。但不应以此限制本发明的保护范围。

请先参阅图1，图1是本发明基于F-P干涉仪的透射反射式增强型相位显微成像测量系统图。由图可见本发明基于F-P干涉仪的透射反射式增强型相位显微成像测量系统包括激光光源1、光衰减系统2、激光扩束系统3、BS分光棱镜4、F-P干涉仪5、显微物镜6和8、探测相机7和9、计算机10。上述原件的位置关系如下：

沿所述的激光光源1的输出光的光轴方向，依次是所述的衰减系统2、扩束系统3、BS分光棱镜4、F-P干涉仪5、显微物镜6和探测相机7，在BS上方依次为显微物镜8和探测相机9，计算机在探测相机7上方。所述的BS分光棱镜，其分光面与光路严格成45°，所述的F-P干涉仪，其两端腔体严格平行，所述的显微物镜6和8通过使用油浸物镜来增加数值孔径的值。所属计算机10与所属的探测相机7和9相连。

利用本发明对待测物体实现三维相位成像增强的方法，请参阅图2，该方法包括下列步骤：

将待测物体11置于所述的F-P干涉仪5中，调节光路中元件的位置，使所述的激光光源1输出相干光经过衰减系统2和扩束系统3后，在BS分光棱镜4处分光，此时的两束光的光强比为1:1，此时调节F-P干涉仪的位置，使光束在所述的待测物体所在的F-P腔进行多次反射，调节所述显微物镜6，使干涉仪的透射光能够完全进入所述显微物镜6，缓慢移动所述探测相机7，使其位于通过所述显微物镜6的光的后焦面处。再调节所述显微物镜8，使干涉仪的反射光能够再通过所述BS分光棱镜后，反射至上方显微物镜8，并完全进入所述显微物镜8，缓慢移动所述探测相机9，使其位于通过所述显微物镜8的光的后焦面处。待探测相机接收信号完毕后，在所述计算机10上显示两幅干涉图。

此外，本发明的反射透射式结构可以精简为单独的反射式增强型相位显微成像测量系统和透射式相位显微成像测量系统。在不追求最大成像分辨率的情况下可以使用单独的透射式或者反射式增强系统来测量待测物体。其具体实施例如下。

请先参阅图3，图3为单独的反射式增强型相位显微成像测量系统。调节光路中元件的位置使所述的激光光源1输出相干光经过衰减系统2和扩束系统3后，在BS分光棱镜4处分光，此时的两束光的光强比为1:1，此时调节F-P干涉仪5的位置，使光束在所述的待测物体所在的F-P腔进行多次反射，调节所述显微物镜6，使干涉仪的反射光能够完全进入所述显微物镜6，缓慢移动所述探测相机7，使其位于通过所述显微物镜6的光的后焦面处。待探测相机接收信号完毕后，在所述计算机8上显示反射光的干涉图。

再参阅图4，图4为单独的透射式增强型相位显微成像测量系统。由于整个光路在一条直线上，所以不需要分光棱镜分光，调节光路中元件的位置使所述的激光光源1输出相干光经过衰减系统2和扩束系统3后，调节F-P干涉仪4的位置，使光束在所述的待测物体所在的F-P腔进行多次反射，调节所述显微物镜5，使干涉仪的反射光能够完全进入所述显微物镜5，缓慢移动所述探测相机6，使其位于通过所述显微物镜5的光的后焦面处。待探测相机接收信号完毕后，在所述计算机7上显示透射光的干涉图。

请再参阅图7，图7是M-Z干涉法成像和本发明发明基于F-P标准具的透射反射式增强型相位显微成像的相位强度对比图，可以很明显看出，本发明所得到的相位强度图，相较于传统的M-Z法，可以得到变化率更加明显地图像，表明了干涉条纹的锐利度会有明显加强，利用计算机由此重建的微粒全息图像，会比传统方式有更高的分辨率，更适用于精细测量。

本发明基于F-P干涉仪的透射反射式增强型相位显微成像测量系统，使用一个腔长固定的F-P干涉仪来多次反射增强携带待测样品相位信息的相干光，同时采用BS分光棱镜所产生的反射光以及透射光，产生两幅由同一光源得到但形成方式不同的干涉图，本发明是当前各种相位显微成像系统中相较于其他系统，结构较为简单并且也不需要多个限制条件的成像测量系统。

以上所述实施例仅是为充分说明分发明而所举的较佳的实施例，本发明保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所做的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (6)

1.一种基于F-P干涉仪透射反射式增强型相位显微成像测量系统,其特征是：它由激光光源(1)、光衰减系统(2)、激光扩束系统(3)、BS分光棱镜(4)、F-P干涉仪(5)、显微物镜一(6)和显微镜二(8)、探测相机一(7)和探测相机二(9)、计算机(10)组成,所述系统中，激光光源(1)发出的光经由光衰减系统(2)，再通过激光扩束系统(3)扩束后进入到BS分光棱镜(4)，该分光棱镜产生两束传播方向垂直的强度相等的激光，分别传至F-P干涉仪(5)和上方显微镜二(8)，传至F-P干涉仪(5)的光束，在F-P腔内多次反射后，将置于F-P腔内的待测物体的光程差成倍放大，从而将其相位信息成倍放大后，携带待测物体信息的透射光传至右方显微物镜一(6)，经过显微物镜后传至右方探测相机一(7)，再将得到的待测物体信号传输至计算机(10)，与此同时，F-P干涉仪中的反射光同步反射回BS分光棱镜，再通过分光棱镜反射至上方显微镜二(8)，反射光通过显微物镜后由上方探测相机二(9)接收，将得到的待测物体的信号传输至计算机(10),最后，在计算机(10)中将得到的两幅图像做出对比，弥补单张图像存在的细节丢失，减少误差。

2.根据权利要求1所述的显微成像测量系统，其特征是：所使用的光路系统中的F-P干涉仪作为产生成倍光程差的器件，通过光在F-P腔中的多次反射，每次经过待测物体可以成倍增加光程差，从而显著增大干涉条纹的宽度，达到了提高分辨率的目的。

3.根据权利要求1所述的显微成像测量系统，其特征是：由激光光源(1)、光衰减系统(2)、激光扩束系统(3)、F-P干涉仪(5)、显微物镜(6)、探测相机(7)、计算机(10)，组合为独立的透射式增强型相位显微成像测量系统。

4.根据权利要求1所述的显微成像测量系统，其特征是：由激光光源(1)、光衰减系统(2)、激光扩束系统(3)、BS分光棱镜(4)、F-P干涉仪(5)、显微镜二(8)、探测相机二(9)、计算机(10)，组合为独立的反射式增强型相位显微成像测量系统。

5.根据权利要求2所述的显微成像测量系统，其特征是：所述的F-P干涉仪，腔体长度不变，待测物体置于腔体中，通过多次反射得到成倍放大的干涉条纹。

6.根据权利要求2所述的显微成像测量系统，其特征是：其产生的透射光和反射光传至不同的显微物镜，产生两幅由同一光源得到的干涉图。