CN111122508A - 基于f-p干涉仪的双波长共路相位显微成像测量系统 - Google Patents

基于f-p干涉仪的双波长共路相位显微成像测量系统 Download PDF

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Abstract

本发明提供的是一种基于F‑P干涉仪的腔内增强型双波长共路相位显微成像测量系统。其特征是：它由激光光源1、光衰减片2、光纤耦合器(LFC)3、单模光纤4、光纤准直器(FCL)5、扩束镜6、F‑P干涉仪7、待测物体8、显微物镜9、CCD探测相机10以及计算机11组成。本发明可用于微小物体的数字全息和折射率测量，可广泛用于各种微小物体的折射率三维显微成像领域。

Description

基于F-P干涉仪的双波长共路相位显微成像测量系统
(一)技术领域
本发明涉及的是一种基于F-P干涉仪的双波长共路相位显微成像测量系统，可用于细胞和各种微小物体内部的折射率三维显微成像，属于光学成像技术领域。
(二)背景技术
显微光学成像，通常也称“光学显微成像”(Optical Microscopy或“光学显微术”(Light Microscopy)，是指透过样品或从样品反射回来的可见光，通过一个或多个透镜后，能够得到微小样品的放大图像的技术。所得图像可以通过目镜直接用眼睛观察，也可以用感光板或数字化图像探测器如电荷耦合器件(CCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)进行记录，还可以在计算机上进行显示和分析处理。
采用明场照明方式的普通光学显微术通常存在三个方面的局限性：一是只能对深色样品(透射型)或强反光样品(反射型)进行成像；二是光学衍射极限限制了该技术的最高分辨率约为200nm；三是离焦信息会降低图像对比度。基于样品中(外源或内源)荧光分子的激发和荧光发射的荧光显微术(Fluorescence Microscopy)，可以突破无法对透明样品成像的局限，但分辨率受限和离焦干扰的问题仍需要采取其他措施才能加以解决。
20世纪30年代，荷兰物理学家泽尼克(Zernike)首次提出了相衬技术，其原理是通过将直射光(即零频光)的相位改变±90°并适当衰减，从而使直射光和衍射光发生干涉而使像平面上的复振幅分布近似正比于物体的相位分布，将“看不见”的相位变化转化为“可见”的强度分布。采用该技术，可以方便地实现对无染色的活细胞样品的直接观察和成像，但其缺点是不适合厚样品和极微小样品。
近年来的数字全息技术由于其能够记录并显示所记录物体的全部信息而被应用于显微成像中，其中专利CN109062018A中公开了一种三波长反射式数字全息显微镜，该数字全息显微镜由三束波长有差别的线偏振光源以及分光棱镜、透镜等组成。其实现的功能是相对于以往的显微成像装置有了较好的图像分辨率，但其系统只使用了反射光作为形成干涉光，无法得到更精确的图像。
专利CN109615651A中公开了一种基于光场显微系统的三维显微成像方法及系统，通过预设算法对光场强度图像和其中所述的第一前向投影矩阵、高分辨率强度图像和第二前向投影矩阵进行三维重建，生成三维样本的三维重建结果。通过增加一路采集光路，实现在同等迭代次数下，增强焦面重建信噪比，光场显微成像的重建效果有很大的提升，但该方法及系统是使用更加优化的算法重建而得到的，依靠的光路结构依然没有变化，并且迭代复杂，难以实现。
专利CN109520988A中公开了一种显微成像系统，隔震平台，可移动的载玻片，成像组件构成。可对不同类型的细胞样本进行高精度检测，但是该系统是依据细胞荧光的原理成像，无法对于其他非细胞微粒及物体成像，适用范围小。
专利CN201710904860.1公开了一种光学相干断层扫描成像系统，该成像系统采用了马赫曾德尔干涉光路，其特点是采用了光纤来简化系统，降低成本，但是相比F-P腔的光路结构，仍然较为复杂。
专利CN201810145657.5公开了一种高分辨率数字全息衍射层析成像，其特点是采用马赫曾德尔干涉光路结构，利用合成孔径方法得到N幅合成高分辨率全息图，进而获得被测样品的高分辨率三维折射率再现。相对来说，结构更为复杂，与本发明专利有着本质区别。
专利CN201910136421.X公开了一种超分辨率数字全息成像系统和成像方法，其成像系统的特点是在传统的马赫曾德尔干涉光路前加入一块透射式空间光调制器，对光源进行调制。与采用F-P腔的光路结构的本发明相比，有着本质区别。
对此，本发明所设计的基于F-P干涉仪的双波长共路相位显微成像测量系统，F-P干涉仪的精细度在20以上，由此可以利用光束在F-P干涉仪的多次反射，其在反射透射之后产生的相干条纹会成倍放大，从干涉结构部分直接提高了成像的分辨率。
另外，本发明设计的基于F-P干涉仪的双波长共路相位显微成像测量系统，能够利用双波长来提高相位测量的稳定性和精确度，两个光源发出的不同波长的光，形成复合全息图，再计算得到合成波长，从而在数值重建中降低散斑噪声，提高精度和稳定性。本发明结构简单，操作调节容易，是更加优化的微小物体显微成像和测量系统。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种结构简单紧凑、操作调节容易的基于F-P干涉仪的双波长共路相位显微成像测量系统。
本发明的目的是这样实现的，方法如下：
该双波长共路相位显微成像测量系统是由激光光源1、光衰减片2、LFC光纤耦合器3、单模光纤4、FCL光纤准直器5、扩束镜6、F-P干涉仪7、待测物体8、显微物镜9、CCD探测相机10以及计算机11组成。
其中,激光光源1分为两个不同波长的光源1-1和1-2，光源1-1发出的光λ1经由光衰减片2-1后，再通过LFC光纤耦合器3-1将光耦合进单模光纤4-1，光λ1在光纤中传输至光纤准直器5准直以及扩束镜6扩束后，传输至F-P干涉仪。光束λ1在F-P腔内多次反射后，将置于F-P腔内的待测微粒的光程差成倍放大，从而将其相位信息成倍放大后，携带待测微粒信息的透射光传至下方显微物镜9，经过显微物镜传至下方探测相机10，再将得到的待测微粒信号传输至计算机11；随后，再将光源1-2发出的光λ2经由光衰减片2-2后，再通过LFC光纤耦合器3-2将光耦合进单模光纤4-2，光λ2在光纤中传输至光纤准直器5准直以及扩束镜6扩束后，传输至F-P干涉仪。光束λ2在F-P腔内多次反射后，再将置于F-P腔内的待测微粒的光程差成倍放大，从而将其相位信息成倍放大后，携带待测微粒信息的透射光传至下方显微物镜9，经过显微物镜传至下方探测相机10，再将得到的待测微粒信号传输至计算机11。计算机11通过两波长计算得到合成波长，从而在数值重建中降低散斑噪声，提高精度。
本发明还有以下技术特征：
使用的光路系统的F-P干涉仪作为干涉器件，通过光在F-P腔中的多次反射，从而使得光束在光路中产生自干涉，由于其反射次数较多，可以显著增大干涉条纹的宽度，达到了增大空间分辨率的目的。
所述的可调F-P干涉仪，其腔长固定，腔体两平板高度平行，能够产生较为理想的干涉条纹。
所述的显微物镜9使用复消色差物镜，其具有优良的修正性和极其高的数值孔径，所以在观察和显微照相术方面具有最大的分辨率、色彩纯度、对比度以及图象平直度。
所述的单模光纤可以将两个波长不同的光源传输至光纤准直器，避免了光路的复杂性和各种反射透射器件的不稳定性，达到了简化光路的目的。
本发明基于两束波长不同的光记录信息，在计算机内分别记录两幅干涉图，并对根据
Figure BDA0002266507100000051
得出合成波长，合成波长明显短于两段波的波长，从而在双波长数值重建中降低相位散斑噪声，提高精度稳定性。
F-P腔中，光束在F-P腔中多次反射、透射，相位增强，最终透过F-P腔的光束的复振幅为：
Figure BDA0002266507100000052
其中，为透射光的复振幅，是F-P腔中入射光的复振幅，为F-P腔的两平行的平面玻璃板内侧的表面反射率，δ为待测细胞的相位分布。
则F-P腔多光束干涉时，通过数字全息获得的相位分布为：
Figure BDA0002266507100000061
其中，n是腔内介质的折射率，d是F-P腔的厚度，λ为光源的合成波长。
光束沿着传播方向，经过待测物体内部的每一点的折射率的累积，就是通过数字全息图获得的相位分布，当待测物体内部及与待测物体周围的环境介质之间的折射率差较小时，光程差是沿光束路径方向折射率的累积，则相位分布与待测物体的折射率分布的关系为：
Figure BDA0002266507100000062
其中，n(x,y,z)为待测细胞2内部的折射率分布，z轴是光束传播的方向，n0为待测细胞2周围的环境介质的折射率。
相应的合成波长为：
Figure BDA0002266507100000063
通过合成波长的全息叠加效应来减少散斑噪声，得到了更精确的条纹。
由此得到的相位分布图和一般以M-Z干涉得到的相位分布图对比图如图4所示，相较于传统的M-Z法，可以得到变化率更加明显的图像，表明了干涉条纹的锐利度会有明显加强，利用计算机由此重建的微粒全息图像，会比传统方式有更高的分辨率，更适用于精细测量。
本发明中的装置由于其光学元件较少，便于后期在F-P干涉仪上添加各种有效控制F-P干涉仪平行度和提高F-P干涉仪反射率的可调谐装置，可改装空间大。另外，如果使用波长数大于二的方法求得合成波长，只是增加了相应的波长数量，与本发明的合成波长显微成像方法属于同一种方法，也应在本发明的保护范围内。
本发明的方法能够显著提高再现图像的分辨率。
(四)附图说明
图1是基于F-P干涉仪的腔内增强双波长共路相位显微成像测量系统的实施例。其特征是：它由激光光源1、光衰减片2、LFC光纤耦合器3、单模光纤4、FCL光纤准直器5、扩束镜6、F-P干涉仪7、待测物体8、显微物镜9、CCD探测相机10以及计算机11组成。
图2是基于F-P干涉仪的双波长共路相位显微成像测量系统中的F-P腔的实施例。
图3是基于F-P干涉仪的双波长共路相位显微成像测量系统中合成波长得到的干涉条纹。
图4是基于F-P干涉仪的双波长共路相位显微成像测量系统和一般M-Z干涉仪得到的强度变化对比图。
(五)具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。但不应以此限制本发明的保护范围。
请先参阅图1，图1是本发明基于F-P干涉仪的双波长共路相位显微成像测量系统。其特征是：它由激光光源1、光衰减片2、LFC光纤耦合器3、单模光纤4、FCL光纤准直器5、扩束镜6、F-P干涉仪7、待测物体8、显微物镜9、CCD探测相机10以及计算机11组成。
上述原件的位置关系如下：
先参阅光源1-1，沿所述的激光光源1-1的输出光的光轴方向，依次是所述的衰减片2-1、LFC光纤耦合器3-1，随后用单模光纤4-1连接光纤耦合器3-1和下方的FCL光纤准直器5、再沿光束由准直器出射后的光轴方向为扩束镜6、F-P干涉仪7，其中待测物体8在F-P干涉仪中；接着请再参阅光源1-2，沿所述的激光光源1-2的输出光的光轴方向，依次是所述的衰减片2-2、LFC光纤耦合器3-2，随后用单模光纤4-2连接光纤耦合器3-2和下方的FCL光纤准直器5、再沿光束由准直器出射后的光轴方向为扩束镜6、F-P干涉仪7，F-P干涉仪下方是MO显微物镜以及CCD探测相机10，探测相机再与侧方的计算机11相连。
利用本发明对待测物体实现双波长三维相位成像增强的方法，请参阅图2，该方法包括下列步骤：
将待测物体8置于所述的F-P干涉仪7中，该操作分为两各部分，第一部分：调节光路中各器件的位置，使所述的激光光源1-1输出相干光经过衰减片2-1衰减后，在LFC光纤耦合器3-1处耦合进入单模光纤4-1，光经单模光纤传输后，在光纤准直器5处准直，再由扩束镜6扩束后进入F-P干涉仪中，此时调节F-P干涉仪的位置，使光束在所述的待测物体所在的F-P腔进行多次反射，调节所述显微物镜9，使干涉仪的透射光能够完全进入所述显微物镜9，缓慢移动所述探测相机10，使其位于通过所述显微物镜9的光的后焦面处。
接着再进行第二部分：调节光路中各器件的位置，使所述的另一波长的激光光源1-2输出相干光经过衰减片2-2衰减后，在LFC光纤耦合器3-2处耦合进入单模光纤4-2，光经单模光纤传输后，也在光纤准直器5处准直，再由扩束镜6扩束后进入F-P干涉仪中，此时调节F-P干涉仪的位置，使光束在所述的待测物体所在的F-P腔进行多次反射，调节所述显微物镜9，使干涉仪的透射光能够完全进入所述显微物镜9，缓慢移动所述探测相机10，使其位于通过所述显微物镜9的光的后焦面处。再通过
Figure BDA0002266507100000091
得到合成波长，根据上述公式计算，从而得到所需的复合记录图，减少重建时所需的相位包裹。
基于F-P干涉仪的双波长共路相位显微成像测量系统中的F-P腔工作实施例如下：
请先参阅图3，图3为基于F-P干涉仪的双波长共路相位显微成像测量系统中的F-P腔的工作步骤。光以一定角度进入F-P腔后，在腔内经过多次反射，每次反射都会通过待测物体，反射光每通过一次待测物体，光程差都会成倍放大，最后光透射出F-P腔后，经过MO显微物镜会聚到CCD探测相机，得到放大的干涉条纹。
本发明基于F-P干涉仪的双波长共路相位显微成像测量系统，使用一个腔长固定的F-P干涉仪来多次反射增强携带待测物体相位信息的相干光，同时双波长光束依次对待测物体进行测量，产生由两个波长不同的光源得到的干涉图，再计算两个重建图像的反正切以及乘积的振幅，同时根据合成波长来得到重建图像。
优选的，本实施例使用的单模光纤为康宁公司的corningSMF-28单模光纤，其具有良好的传输效率。
优选的，本实施例的待测物体为聚苯乙烯小球。能够得到较好的均匀的条纹。
优选的，本实施例所使用的两个光源的波长分别为632.8nm和532nm，这两束光在横向剪切形成复合全息图时能得到较好的全息图。
优选的，F-P腔的自由光谱范围FSR＞100GHz，精细度F＞20，损耗≤3dB。
以上所述实施例仅是为充分说明分发明而所举的较佳的实施例，本发明保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所做的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (5)

1.一种基于F-P干涉仪的腔内增强型双波长共路相位显微成像测量系统。其特征是：它由激光光源1、光衰减片2、光纤耦合器(LFC)3、单模光纤4、光纤准直器(FCL)5、扩束镜6、F-P干涉仪7、待测物体8、显微物镜9、CCD探测相机10以及计算机11组成。所述系统中，激光光源1分为两个不同波长的光源1-1和1-2，光源1-1发出的光(波长为λ1)经由光衰减片2-1后，再通过LFC光纤耦合器3-1将光耦合进单模光纤4-1，光λ1在光纤中传输至光纤准直器5准直以及扩束镜6扩束后，传输至F-P干涉仪。波长为λ1的光束在F-P腔内多次反射后，将置于F-P腔内的待测微粒的光程差成倍放大，从而将其相位信息成倍放大后，携带待测微粒信息的透射光传至下方显微物镜9，经过显微物镜传至下方探测相机10，再将得到的待测微粒信号传输至计算机11；随后，再将光源1-2发出的光λ2经由光衰减片2-2后，再通过LFC光纤耦合器3-2将光耦合进单模光纤4-2，波长为λ2的光束光纤中传输至光纤准直器5准直以及扩束镜6扩束后，传输至F-P干涉仪。波长为λ2的光束在F-P腔内多次反射后，再将置于F-P腔内的待测微粒的光程差成倍放大，携带待测微粒信息的透射光传至下方显微物镜9，经过显微物镜传至下方探测相机10，再将得到的待测微粒信号传输至计算机11。计算机11依据通过两波长计算得到合成波长，从而在数值重建中降低散斑噪声，提高精度。
2.根据权利要求1所述的显微成像测量系统，其特征是：所使用的光路系统中的F-P干涉仪作为产生成倍光程差的器件，通过光在F-P腔中的多次反射，每次经过待测微粒多可以成倍增加光程差，从而显著增大干涉条纹的宽度，达到了提高分辨率的目的。
3.根据权利要求1所述的显微成像测量系统，其特征是：系统使用两个波长不同的光源，得到两张波长不同的干涉条纹分布。再通过两个不同波长得到合成波长，合成波长明显短于两个波长，再得到复合全息图。
4.根据权利要求1所述的显微成像测量系统，其特征是：所用波长数量大于等于2。
5.根据权利要求1所述的显微成像测量系统。其特征是：所述的F-P干涉仪，腔体长度不变，待测物体置于腔体中，通过多次反射得到成倍放大的干涉条纹。
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