CN108931207A - Led照明的干涉显微装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种LED照明的干涉显微成像装置和方法。以克服现有技术存在的结构复杂、光路调整困难，以及时间分辨率低的问题。本发明装置LED照明单元包括沿光轴方向依次设置的LED光源、倒置的第一显微物镜、小孔光阑和第一透镜；干涉显微单元包括沿光轴方向依次设置的第二透镜、第二显微物镜和第二分光棱镜，第二分光棱镜的反射光路上设置有反射镜，所述第二显微物镜工作距离的长度大于第二分光棱镜的长度；成像单元包括设置于第一透镜和第二透镜之间的第一分光棱镜，CCD相机的入射面设置于第一分光棱镜的反射光路上；先将样品设置于第二分光棱镜的出射光路上，且位于第二显微物镜的前焦面，然后按照一定的步骤依次操作。

Description

LED照明的干涉显微装置和方法

技术领域

本发明提出一种LED照明的干涉显微成像装置和方法，适用于反射式样品的定量精确测量。

背景技术

干涉显微技术具有无需荧光标记、可全场测量和测量精度高等优点，在生物细胞成像、微纳检测和表面形貌测量等领域获得了广泛的应用。在干涉显微技术中，通常采用激光器作为光源。由于激光的相干性好，物光和参考光很容易形成干涉条纹。在离轴干涉显微中，激光经过扩束、准直后分为两路，一路光照明样品作为物光波，另一路光作为参考光，物光和参考光相遇产生干涉条纹，当物光波波矢和参考光波波矢的夹角为α时，干涉条纹的周期为d＝λ/2sin(α/2)，其中λ为光波波长。对于离轴干涉图，通常采用傅立叶变换算法进行处理，首先对干涉图做傅立叶变换，变换到频域；然后，在频域设置滤波器，把物光波频谱滤出来；最后对物光波频谱做傅立叶逆变换，得到物光波的复振幅分布，进而得到样品的相位分布。该方法的优点是简单、快捷，但是要求干涉条纹的周期比较小(同时，需要满足尼奎斯特采样频率要求)，以保证频域中物光波频谱、0级频和物光波共轭频谱三者分开。整体而言，激光照明的离轴干涉显微技术具有可实时测量和干涉装置容易调整的优点。但是，激光作为高相干性光源，在干涉测量的时候，由于光路中透镜等元件表面的尘埃、划痕的散射、或者由于透镜表面的多次反射等原因，在干涉图中会引入寄生的杂散光干涉条纹或者散斑，这些相干噪声会降低测量的精度。

为了降低激光的相干噪声对测量精度的影响，可以采用低相干光源。LED作为一种低相干光源，与激光相比，除了具有相干噪声小的优点外，还具有价格低、体积小的优点。目前，LED用于干涉显微的时候有两大缺点：一是干涉装置复杂；二是通常需要用到相移干涉技术。由于LED发出的光波相干长度通常只有几微米到几十微米(取决于光源谱宽)，为了实现干涉，在搭建干涉装置的时候，物光路和参考光路的光程差必须小于相干长度。目前，用到的光路结构有马赫-曾德干涉仪(Optics Letters,volume 37,issue 12,2012，F.Duboiset al.)、迈克尔逊干涉仪(Optics Express,volume 15,issue 15,2007，N.Warnasooriyaet al.)和Linnik干涉仪(Applied Optics,volume 52,issue 34,2013，Rongli Guo etal.)等结构。在这些干涉仪中，为了保证物光和参考光光程相等，在物光臂和参考光臂中需要放置完全相同的光学元器件，导致结构复杂、光路调整困难。另外，由于LED光波的相干长度短，不能直接得到离轴干涉图。为了重建相位分布，通常需要结合相移干涉技术，通过记录多幅相移干涉图(Optics Express,volume 15,issue 15,2007，N.Warnasooriya etal.)，时间分辨率低，不能对动态样品成像。

发明内容

本发明要提供一种LED照明的实时干涉显微装置和方法，以克服现有技术存在的结构复杂、光路调整困难，以及时间分辨率低的问题。

为了解决上述技术问题，本发明的技术解决方案是：

一种LED照明的实时干涉显微装置，其特征在于：沿光轴方向依次设置有LED照明单元、干涉显微单元和成像单元；

所述LED照明单元包括沿光轴方向依次设置的LED光源、倒置的第一显微物镜、小孔光阑和第一透镜；

所述的干涉显微单元包括沿光轴方向依次设置的第二透镜、第二显微物镜和第二分光棱镜，第二分光棱镜的反射光路上设置有反射镜，所述第二显微物镜工作距离的长度大于第二分光棱镜的长度；

所述的成像单元包括设置于第一透镜和第二透镜之间的第一分光棱镜，CCD相机的入射面设置于第一分光棱镜的反射光路上。

上述LED照明的实时干涉显微装置的使用方法，先将样品设置于第二分光棱镜的出射光路上，且位于显微物镜的前焦面，然后按照下述步骤操作：

1)LED光源发出中心波长为λ、光谱峰值半宽为Δλ的光波，经过倒置使用的第一显微物镜后，会聚于第一显微物镜的焦平面附近区域，经过小孔光阑滤波后，通过第一透镜变为平行光；

2)平行光波经过第一分光棱镜、第二透镜、第二显微物镜，然后经过第二分光棱镜分光，透射光照明样品；

3)经过第二分光棱镜反射的光波，照明反射镜；

4)从样品反射的物光波原路经过第二分光棱镜、第二显微物镜、第二透镜，然后经过第一分光棱镜反射，在CCD相机光敏面形成被测样品的放大实像；

5)从反射镜反射回来的光波，经第二分光棱镜反射，经第二显微物镜、第二透镜，然后经过第一分光棱镜反射，作为参考光到达CCD相机光敏面；

6)调整反射镜的轴向位置，使物光波和参考光波的光程相等，两者在CCD相机光敏面发生干涉；干涉形成的轻离轴干涉条纹的疏密、走向通过调整反射镜的俯仰进行调节；

7)CCD相机记录轻离轴干涉图，利用直流分量相减技术，如减去干涉图强度的平均值，从干涉图中去除零频分量，然后采用希尔伯特变换算法，经过重建得到样品的包裹相位；然后利用相位去包裹算法得到去包裹相位分布；最后得到样品的高度分布。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

(1)装置结构简单，方便调整：本发明所提出的装置是基于一个长工作距离物镜的微型迈克尔逊干涉仪，所用元件数目少，因此结构简单。改变参考光波的光程只需要调整分光棱镜后面的反射镜位置，物光波和参考光波的光程匹配容易实现，进而容易实现干涉。

(2)装置的稳定性高：物光和参考光经历几乎完全一样的路径，是典型的物、参光共路的结构，对环境的扰动不敏感。

(3)时间分辨率高：可直接实现轻离轴记录，且只需记录一幅轻离轴干涉图，可以完成样品动态变化过程的定量测量。

附图说明

图1是本发明的结构示意图。

图2是利用CCD相机记录的轻离轴干涉图。

图3是重建样品的高度分布图。

附图标记如下：1-LED光源，2-第一显微物镜，3-小孔光阑，4-第一透镜，5-第一分光棱镜，6-第二透镜，7-第二显微物镜，8-第二分光棱镜，9-显微样品，10-反射镜，11-CCD相机。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明进行详细地说明：

该装置基于长工作距离物镜构建了一个小型的迈克尔逊干涉仪,物光和参考光干涉形成轻离轴干涉图，并被CCD相机记录，对单幅轻离轴干涉图通过希尔伯特变换算法重建得到被测样品的相位分布。

参见图1，

一种LED照明的干涉显微装置，沿光轴方向依次设置有LED照明单元、干涉显微单元和成像单元；

所述LED照明单元包括沿光轴方向依次设置的LED 1、倒置的第一显微物镜2、小孔光阑3和第一透镜4；

所述的干涉显微单元包括沿光轴方向依次设置的第二透镜6、第二显微物镜7和第二分光棱镜8，第二分光棱镜8的反射光路上设置有反射镜10，所述显微物镜7工作距离的长度大于第二分光棱镜8的长度；

所述的成像单元包括设置于第一透镜4和第二透镜6之间的第一分光棱镜5，CCD相机11的入射面设置于第一分光棱镜5的反射光路上。

本发明所提出的LED照明的干涉显微装置，包含的部件结构和功能详细说明如下：

(1)LED光源1，波长在可见光范围内，中心波长为λ、光谱峰值半宽度度为Δλ，输出功率稳定；

(2)第一显微物镜2，作聚光镜使用，把LED发出的光波汇聚于物镜2的焦点附近；

(3)小孔光阑3，用于遮挡杂散光，并提高光波的空间相干性；

(4)第一透镜4，用于把透过小孔光阑的光波准直为平行光；

(5)第一分光棱镜5，改变成像光波的传播方向；

(6)第二透镜6，和物镜7构成望远系统；

(7)第二显微物镜7，用于放大微观物体；

(8)第二分光棱镜8，用于照明光波的非偏振分光及反射的物光波和参考光波的合束；

(9)被测样品9；

(10)反射镜10，反射回去的光作为参考光；

(11)CCD相机11，用于记录干涉图。

其中：第一透镜4、第二透镜6是消色差透镜；第一分光棱镜5、第二分光棱镜8是消偏振分光棱镜；第一显微物镜7为长工作距离物镜；

所述的第一分光棱镜5放置于第二显微物镜7之前，起到改变成像光束方向的作用；

所述的反射镜10，其俯仰可调，用以改变参考光的传播方向，其轴向位置可精确调整，用以改变参考光的光程；

所述的第二透镜6和第二显微物镜7共焦放置；

所述小孔光阑3放置在第一透镜4的前焦面。

本发明装置在使用时，先将样品9设置于第二分光棱镜8的出射光路、第二显微物镜7的工作距离处，与CCD相机11所在位置满足物、像共轭关系。

本发明提出的装置的使用方法如下:

(1)产生沿轴向传播的平行光波。LED光源1发出中心波长为λ、光谱峰值半宽为Δλ的光波经过第一显微物镜2后，会聚于第一显微物镜2的焦平面附近区域，再经过小孔光阑3滤波，然后经第一透镜4准直后变为平面光波。

(2)平面光波经过第一分光棱镜5、第二透镜6、第二显微物镜7后，再经过第二分光棱镜8分光后，透射光波照明样品9。

(3)经过第二分光棱镜8反射的光波，射向反射镜10。

(4)从样品9反射的物光波原路经过第二分光棱镜8、第二显微物镜7、透镜6，然后经过第一分光棱镜5反射后，在CCD相机11的光敏面成样品的放大实像。

(5)经反射镜10反射的光波，经第二分光棱镜8反射，再经第二显微物镜7、第二透镜6，然后经过第一分光棱镜5反射后，到达CCD相机11的光敏面。

(6)沿轴向移动反射镜10，使物光波和参考光波的光程相等，两者在CCD相机光敏面处发生干涉；干涉形成的轻离轴干涉条纹的疏密、走向通过调整反射镜10的俯仰进行调节。

(7)CCD相机11记录轻离轴干涉图，参见图2。利用直流分量相减技术，如减去干涉图强度的平均值，从干涉图中去除零频分量，然后采用希尔伯特变换算法，经过重建得到样品的高度分布，参见图3。

发明原理：本发明依托长工作距离物镜，通过在第二显微物镜7的前端面和被测样品9之间加入分光棱镜，在被测样品9与第二显微物镜7之间构建了一个微型的迈克尔逊干涉仪。干涉仪中反射镜10可前后精密调整，因此前后移动反射镜可以很容易使物光光程和参考光光程相等。当LED光源1照明的时候，在CCD相机11光敏面上直接记录到轻离轴干涉条纹。对于轻离轴干涉图I，利用直流分量相减技术，例如减去干涉图强度的平均值，从干涉图中去除零频分量，得到去除零频后的强度分布k为载频，m为干涉条纹的调制度，为被测样品的相位分布。对I_dc-free做希尔伯特变换，即可得到该实信号对应的虚部，即函数，因此我们可以构造出完整的复信号：

F＝I_dc-free+i·HT(I_dc-free) (1)

上式中，HT表示希尔伯特变换。进一步就可得到包含有载频项的包裹相位分布：

φ_wrap＝arctan Im F/Re F (2)

最后，去除载频项和用解包裹算法消除相位包裹即可得到最终的相位分布由于是反射式测量，根据下式可以求出样品表面的高度分布：

实施案例:

我们用以下参数说明本专利的可行性:LED光源1,中心波长630nm、近高斯型光谱分布、光谱峰值半宽度21nm的LED，光波的相干长度为第一显微物镜2，数值孔径0.4，放大倍数25×；小孔光阑3，通光孔径0.5mm；第一透镜4，工作波段400-700nm，50.8mm，焦距300mm；第一分光棱镜5、边长25.4mm，工作波段450-680nm，透反射比50:50；第二透镜6，工作波段400-700nm，50.8mm，焦距200mm；第二显微物镜7，数值孔径0.28，放大倍数10×，工作距离33.5mm；第二分光棱镜8，边长12.7mm，工作波段450-680nm，透反射比50:50；被测样品9，是一个标称深度为200nm的反射式样品，反射回去的光作为物光波，且和参考光发生干涉产生干涉图；反射镜10，尺寸10mm×10mm，固定在一个三维精密调整架(亚微米精度)上；通过调整反射镜10得到适当间距和条纹走向的干涉图，并用CCD相机记录；CCD相机11，黑白相机，像元尺寸4.5μm×4.5μm，分辨率1600×1200，记录干涉图；记录后的干涉图经过数值重建得到样品的深度信息。

Claims (2)

1.一种LED照明的干涉显微装置，其特征在于：沿光轴方向依次设置有LED照明单元、干涉显微单元和成像单元；

所述LED照明单元包括沿光轴方向依次设置的LED光源(1)、倒置的第一显微物镜(2)、小孔光阑(3)和第一透镜(4)；

所述的干涉显微单元包括沿光轴方向依次设置的第二透镜(6)、第二显微物镜(7)和第二分光棱镜(8)，第二分光棱镜(8)的反射光路上设置有反射镜(10)，所述第二显微物镜(7)工作距离的长度大于第二分光棱镜(8)的长度；

所述的成像单元包括设置于第一透镜(4)和第二透镜(6)之间的第一分光棱镜(5)，CCD相机(11)的入射面设置于第一分光棱镜(5)的反射光路上。

2.根据权利要求1所述的LED照明的干涉显微装置的使用方法，其特征在于：先将样品(9)设置于第二分光棱镜(8)的出射光路上，且位于第二显微物镜(7)的前焦面，然后按照以下步骤操作：

1)LED光源(1)发出中心波长为λ、光谱峰值半宽为Δλ的光波，经过倒置使用的第一显微物镜(2)后，会聚于第一显微物镜(2)的焦平面附近区域，经过小孔光阑(3)滤波后，通过第一透镜(4)变为平行光；

2)平行光波经过第一分光棱镜(5)、第二透镜(6)、第二显微物镜(7)，然后经过第二分光棱镜(8)分光，透射光照明样品(9)；

3)经过第二分光棱镜(8)反射的光波，照明反射镜(10)；

4)从样品反射的物光波原路经过第二分光棱镜(8)、第二显微物镜(7)、第二透镜(6)，然后经过第一分光棱镜(5)反射，在CCD相机光敏面形成被测样品的放大实像；

5)从反射镜(10)反射回来的光波，经第二分光棱镜(8)反射，经第二显微物镜(7)、第二透镜(6)，然后经过第一分光棱镜(5)反射，作为参考光到达CCD相机光敏面；

6)调整反射镜(10)的轴向位置，使物光波和参考光波的光程相等，两者在CCD相机光敏面发生干涉；干涉形成的轻离轴干涉条纹的疏密、走向通过调整反射镜(10)的俯仰进行调节；

7)CCD相机记录轻离轴干涉图，利用直流分量相减技术，如减去干涉图强度的平均值，从干涉图中去除零频分量，然后采用希尔伯特变换算法，经过重建得到样品的包裹相位；然后利用相位去包裹算法得到去包裹相位分布；最后得到样品的高度分布。