CN106770288A - 一种共光路干涉相位显微一次成像系统及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种共光路干涉相位显微一次成像系统及方法,包括激光器、中性可调衰减器、扩束准直器、半透半反镜、视场光阑、非偏振分光棱镜、反射载物台、样品、显微物镜、第三透镜、CCD和计算机;本发明基于差分干涉光路,采用非偏振分光镜把激光分为物光与参考光两束平行光,再利用反射载物台全反射物光与参考光,物光和参考光经非偏振分光棱镜合束后以共光路的方式传播,后经显微物镜放大,最终被CCD相机采集并传输到计算机里并显示;本发明可通过调整反射载物台的角度实现现有的光路干涉成像系统,其中包括离轴干涉、同轴干涉和轻微离轴干涉。本发明在相位显微方面具有广泛的实用价值与应用前景,特别是在生物细胞形态识别应用领域。
Description
技术领域
本发明属于生物细胞成像技术研究领域,具体涉及一种共光路干涉相位显微一次成像系统及方法。
背景技术
在观测的生物样品中,如活细胞,可以当成是透明的来处理,并且这些细胞通常表现为相位物体。为了能够清楚的观测到这些相位物体,通常的做法是将相位信息转换为强度分布,这也就导致了相位显微成像的出现。在最近的十几年中,由于各种应用定量相位显微成像的技术被不断提出,这就为研究类似于生物细胞的相位物体的组织结构和动力学行为提供了极为重要的研究手段,而相位显微成像技术基本上是应用光的干涉原理来工作,所以也可以称此类技术为干涉相位显微成像技术。这些技术包括离轴干涉、同轴干涉和轻微离轴干涉。
对相位物体的光学检测技术主要基于干涉原理。干涉显微从结构上可划分为:物光与参考光分离的干涉显微和物光与参考光共路的干涉显微。物、参分离的干涉显微方法主要有:Michelson干涉显微;Linnik干涉显微和Mach-Zehnder干涉显微等。Michelson干涉显微的基本原理是,入射光透过显微物镜到分光镜被分成两束光,一束为投射到参考镜的参考光,另一束为透射到样本表面的物光,两束光经过反射,并在显微物镜的视场上发生干涉。该结构的特点是,物光与参考光经过同一个显微物镜,两束光不会由于物镜的差异而产生光程差。但是,显微物镜与样本之间加入了分光镜,这样就使显微物镜的工作距离比另两种装置更长,进而限制了物镜的放大倍数,同样也限制了数值孔径的大小,这就直接导致了仪器的横向分辨率降低。Linnik干涉显微的基本结构是它的物光和参考光分别有一个显微物镜,光线透过显微物镜就直接到样品表面,因为其与样品表面之间没有其它光学元件,所以该装置的放大倍数可以很大,工作距离可以很短,并且能够达到0.5μm的横向分辨率。但是该装置物光和参考光的显微物镜的差异会产生额外的光程差,这将影响真实的观测结果。Mach-Zehnder干涉显微的基本结构是该装置只使用了一个显微物镜,参考镜则放置在主光路中,这样就使得物光光路和参考光路的工作条件非常接近,结构设计上也更加紧凑,同时可以排除许多干扰因素。基于这些主要显微成像原理,国内外科学家进行了拓展研究,如:专利技术CN 102914258 A基于正交双光栅的同步移相干涉显微检测装置及检测方法,该技术利用平行双光栅将正交偏振的物光和参考光分束,结合偏振调制通过一次曝光获得两幅相移干涉图。虽然该方法可以实现实时测量,但由于采用离轴光路不能充分利用CCD的功能,且物参光间若存在夹角将会使数据处理的工作变得复杂;又如专利CN 103115582 A基于受激辐射的迈克尔逊荧光干涉显微测量装置,该发明通过镀膜改变被测面的表面特性,保证测量光经被测面反射后能够返回探测系统,解决了高NA和高斜率表面检测的难题,但是该光路本身具有横向分辨率较低的缺陷,且仪器的成本较高。并且在物光与参考光分离的干涉显微中,环境的扰动会对物光与参考光造成不同的影响,从而影响两者之间的光程差的稳定性,最终对测量精度产生影响。
在共光路实验装置中,可以通过调节分光镜的分光层与光轴之间的夹角大小实现物光和参考光之间的同轴干涉或离轴干涉。物、参共路干涉显微主要有:Fizeau干涉显微、泽尼克相衬干涉显微、剪切干涉显微和点衍射相位显微技术等。斐索干涉显微Fizeauinterferometer是利用准直的平行光在样品表面反射后与入射光发生干涉,通过记录的等厚干涉条纹的形状分布反映被检样品表面的形貌分布。泽尼克相衬干涉显微原理是采用环状光来照明样品,同时采用环状相位掩模板来延迟零频分量的相位,从而使被测样品的相位信息变成强度信息。在相衬显微方法中所用的部分相干的环状光束照明大大降低了成像中的相干噪声,且提高了显微镜的横向分辨率。剪切干涉法是通过某种元件,将一个空间相干的波面分成两个完全相同或相似的波面,二者彼此间产生小的空间位移。因为两个波面上各点相干,在重叠区域会形成一组干涉条纹,通过处理该干涉条纹就可以获得原始波面的信息。点衍射干涉术的基本原理是当包含样品信息的入射光波经过聚焦透镜后,根据透镜的傅立叶变换特性,该光束的频谱出现在聚焦透镜的后焦平面且零频分量位于频谱面的中央,而高频分量分布于零频分量的周围。如在专利CN 104034257 A一种菲索型准共光路结构的同步相移干涉测量装置及方法,该技术解决了同步相移干涉用于共光路干涉系统的难题,使系统中光学元件所存在的应力双折射效应所造成的相位测量误差大大降低;又如专利CN 102221327 A基于泽尼克相衬成像的相移干涉显微装置及方法,该发明解决了现有泽尼克相衬成像只能用于定性观察的局限性,同时克服了现有干涉显微方法对环境振动较敏感稳定性差、相干噪声高、横向分辨率低等技术问题。但是这些干涉显微装置在使用过程中需要较多的光学元器件,特别是显微镜系统,实验成本较高,且对使用人员的专业素养要求高,所以应用门槛较高。
本发明是基于共光路的干涉显微,所以其优点在于它的抗干扰能力强,不会产生额外的光程差,而与其他共光路装置相比,本发明的装置结构简单,成本低廉,且操作方便,可以实现同轴干涉、离轴干涉和轻微离轴干涉。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题提供一种共光路干涉相位显微一次成像系统及方法,使该装置能同时适用于同轴与离轴干涉,也包括轻微离轴干涉,在单次曝光下采集到干涉图,经计算机处理后可以实现相位物体快速相位显微成像。
本发明的技术方案是:一种共光路干涉相位显微一次成像系统,包括激光器、中性可调衰减器、扩束准直器、半透半反镜、视场光阑、非偏振分光棱镜、反射载物台、样品、显微物镜、第三透镜、CCD和计算机;
所述激光器、中性可调衰减器、扩束准直器、半透半反镜依次放置在同一光路上;所述视场光阑非偏振分光棱镜、反射载物台依次放置在半透半反镜的垂直下方,所述样品放置在反射载物台上的一侧;所述半透半反镜的镜面与水平方向成45°;用于分光的非偏振分光棱镜的分光层与水平方向垂直;可调反射载物台的平面与水平面平行;所述显微物镜、第三透镜和CCD依次放置在半透半反镜的垂直上方,计算机与CCD电连接;
所述激光器发出的水平方向的光束,向前传输经过中性可调衰减器调节到合适的光强,再经过扩束准直器扩束准直后,向半透半反镜传输,激光经过半透半反镜的反射面改向为竖直向下的光束,激光通过视场光阑把激光束调节到合适的大小后传输向非偏振分光棱镜,非偏振分光棱镜把激光束平均分为两束竖直向下的平行光,这两束光照射向反射载物台和载物台上的样品;样品光与参考光通过反射载物台全反射向非偏振分光棱镜,又经过非偏振分光棱镜的合束并产生干涉,通过半透半反镜,由其后的的显微物镜放大,再由第三透镜准直为平行光,最终在CCD上形成相移干涉图,并传输、显示在计算机上。
上述方案中,所述半透半反镜用石英玻璃制成,分光面为镀膜半反射、半透射的迎光束面,各为入射光强度的50%。
上述方案中,所述载物台为一个角度可调的全反镜,光轴与非偏振分光棱镜的分光层之间的夹角可通过载物台调节。
上述方案中,所述视场光阑可调节光束的大小,使干涉图像的大小不超过CCD的记录靶面。
上述方案中,所述扩束准直器包括第一透镜和第二透镜。
一种利用所述的共光路干涉相位显微一次成像系统进行成像的方法,包括以下步骤:
步骤S1、所述激光束发出的水平方向的光束,向前传输经过中性可调衰减器调节至合适光强后,利用扩束准直器将照明光束扩束准直为大小合适的平行光;
步骤S2、光束经半透半反镜反射为竖直向下并向非偏振分光棱镜传输,在这两个装置中间放置一个大小合适的视场光阑使得成像区域的大小不超过CCD记录靶面的面积,又经非偏振分光棱镜分光为物光和参考光两束竖直向下的光束,照射到反射载物台上;前面所述的物光照射到样品上作为样品光,而参考光则被反射载物台全反射后直接原路返回;
步骤S3、物参反射光束经过非偏振分光棱镜合束后,物光和参考光之间发生干涉,并原路返回经过视场光阑和半透半反镜,再经过显微物镜放大后,由第三透镜准直为平行光,最终在CCD上形成相移干涉图,并传输到计算机里,经计算机处理后显示。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
1、本发明通过采用非偏振分光棱镜对激光束进行分光,该分光装置结构简单,易于操作;
2、本发明采用差分干涉光路保证了本发明系统的可靠性与稳定性;
3、本发明系统结构简单,成本低廉、实验操作方便;
4、本发明中外界环境的扰动对干涉仪中的物光和参考光造成相同的影响,因而在最终记录时这些外界因素的影响将被相互抵消,从而使得该类干涉仪的抗干扰能力增强;
5、本发明中显微物镜位于干涉系统之后,可减少相位噪声。因此,本发明系统应用面广,具有很好的实用价值。
附图说明
图1是本发明一实施方式的共光路干涉相位显微一次成像系统及方法对应的光路示意图。
图中:1:激光器;2:中性可调衰减器;3:扩束准直器;4:半透半反镜;5:视场光阑;6:非偏振分光棱镜;7:反射载物台;8:样品;9:显微物镜;10:第三透镜;11:CCD;12:计算机;R:参考光束;O:样品光束。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明,但本发明的保护范围并不限于此。
本发明是一种基于物、参共光路的干涉显微成像装置及一次成像的方法,基于差分干涉光路,采用非偏振分光镜把激光分为物光与参考光两束平行光,再利用反射载物台全反射物光与参考光,物光和参考光经非偏振分光棱镜合束后以共光路的方式传播,后经显微物镜放大,最终被CCD相机采集并传输到计算机里,通过相应的软件进行样品图像的后处理。本发明可以通过调整反射载物台的角度实现现有的光路干涉成像系统,其中包括离轴干涉、同轴干涉和轻微离轴干涉。本发明在相位显微方面具有广泛的实用价值与应用前景,特别是在生物细胞形态识别应用领域。
图1所示为本发明所述共光路干涉相位显微一次成像系统及方法的一种实施方式,所述一种共光路干涉相位显微一次成像系统,包括激光器1、中性可调衰减器2、扩束准直器3、半透半反镜4、视场光阑5、非偏振分光棱镜6、反射载物台7、样品8、显微物镜9、第三透镜10、CCD11和计算机12。
所述激光器1、中性可调衰减器2、扩束准直器3、半透半反镜4依次放置在同一光路上;所述视场光阑5非偏振分光棱镜6、反射载物台7依次放置在半透半反镜4的垂直下方,所述样品8放置在反射载物台7上的一侧;所述半透半反镜4的镜面与水平方向成45°;用于分光的非偏振分光棱镜6的分光层与水平方向垂直;可调反射载物台7的平面与水平面平行;所述显微物镜9、第三透镜10和CCD11依次放置在半透半反镜4的垂直上方,计算机12与CCD11电连接。
所述激光器1发出的水平方向的光束,向前传输经过中性可调衰减器2调节到合适的光强,再经过由第一透镜和第二透镜组成的扩束准直器3扩束准直后,向半透半反镜4传输,激光经过半透半反镜4的反射面改向为竖直向下的光束,激光通过视场光阑5把激光束调节到合适的大小后传输向非偏振分光棱镜6,非偏振分光棱镜6把激光束平均分为两束竖直向下的平行光,这两束光照射向反射载物台7和载物台上的样品8;样品光与参考光通过反射载物台7全反射向非偏振分光棱镜6,又经过非偏振分光棱镜6的合束并产生干涉,通过半透半反镜4,由其后的的显微物镜9放大,再由第三透镜10准直为平行光,最终在CCD11上形成相移干涉图,并传输、显示在计算机12上。
所述半透半反镜4用石英玻璃制成,分光面为镀膜半反射、半透射的迎光束面,各为入射光强度的50%,并与水平方向成45°角,实现把光束由水平反射为竖直向下。
所述载物台7为一个角度可调的全反镜,使光轴与非偏振分光棱镜6的分光层之间的夹角可调,可实现同轴、离轴和轻微离轴干涉的光路调节。
所述视场光阑5是用于调节光束的大小,使最终形成的干涉图像的大小不超过CCD11的记录靶面。
本发明还提供一种利用所述的共光路干涉相位显微一次成像系统进行成像的方法,包括以下步骤:
步骤S1、所述激光束1发出的水平方向的光束,向前传输经过中性可调衰减器2调节至合适光强后,利用扩束准直器3将照明光束扩束准直为大小合适的平行光后照明样品;
步骤S2、光束经半透半反镜4反射为竖直向下并向非偏振分光棱镜6传输,在这两个装置中间放置一个大小合适的视场光阑5使得成像区域的大小不超过CCD记录靶面的面积,又经非偏振分光棱镜6分光为物光和参考光两束竖直向下的光束,照射到反射载物台7上;前面所述的物光照射到样品8上作为样品光,而参考光则被反射载物台7全反射后直接原路返回;
步骤S3、物参反射光束经过非偏振分光棱镜6合束后,物光和参考光之间发生干涉,并原路返回经过视场光阑5和半透半反镜4,再经过显微物镜9放大后,由第三透镜10准直为平行光,最终照射到CCD 11的记录靶面上,并将数据传输到计算机12里,经由相应的软件处理后在计算机12上显示。
本发明的工作原理如下:
激光束1沿水平方向传输,经过中性可调衰减器2调节至合适光强后,利用扩束准直器3将照明光束扩束准直为大小合适的平行光后照明样品,光束经半透半反镜4反射为竖直向下传输向非偏振分光棱镜6,在这中间放置一个大小合适的视场光阑使得成像区域的大小不超过CCD记录靶面的面积,经非偏振分光棱镜6分光为物光和参考光两束竖直向下的光束,照射到反射载物台7上;物光照射到样品8上作为样品光,而参考光则被反射载物台7全反射后直接原路返回;物参反射光束经过非偏振分光棱镜6合束后,物光和参考光之间发生干涉,并原路返回经过视场光阑5和半透半反镜4,再经过显微物镜9放大后,由第三透镜10准直为平行光,最终照射到CCD 11的记录靶面上,CCD 11将数据传输到计算机12里,最后通过对应的软件就可在计算机12上实现定量相位成像。在整个装置中反射载物台7通过旋转可改变光束光轴的方向,由此可根据需要,观察采集到的干涉图像来调整反射载物台7的角度,实现自由切换同轴干涉、离轴干渉和轻微离轴干涉。
应当理解,虽然本说明书是按照各个实施例描述的,但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明,它们并非用以限制本发明的保护范围,凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种共光路干涉相位显微一次成像系统,其特征在于,包括激光器(1)、中性可调衰减器(2)、扩束准直器(3)、半透半反镜(4)、视场光阑(5)、非偏振分光棱镜(6)、反射载物台(7)、样品(8)、显微物镜(9)、第三透镜(10)、CCD(11)和计算机(12);
所述激光器(1)、中性可调衰减器(2)、扩束准直器(3)、半透半反镜(4)依次放置在同一光路上;所述视场光阑(5)非偏振分光棱镜(6)、反射载物台(7)依次放置在半透半反镜(4)的垂直下方,所述样品(8)放置在反射载物台(7)上的一侧;所述半透半反镜(4)的镜面与水平方向成45°;用于分光的非偏振分光棱镜(6)的分光层与水平方向垂直;可调反射载物台(7)的平面与水平面平行;所述显微物镜(9)、第三透镜(10)和CCD(11)依次放置在半透半反镜(4)的垂直上方,计算机(12)与CCD(11)电连接;
所述激光器(1)发出的水平方向的光束,向前传输经过中性可调衰减器(2)调节到合适的光强,再经过扩束准直器(3)扩束准直后,向半透半反镜(4)传输,激光经过半透半反镜(4)的反射面改向为竖直向下的光束,激光通过视场光阑(5)把激光束调节到合适的大小后传输向非偏振分光棱镜(6),非偏振分光棱镜(6)把激光束平均分为两束竖直向下的平行光,这两束光照射向反射载物台(7)和载物台上的样品(8);样品光与参考光通过反射载物台(7)全反射向非偏振分光棱镜(6),又经过非偏振分光棱镜(6)的合束并产生干涉,通过半透半反镜(4),由其后的的显微物镜(9)放大,再由第三透镜(10)准直为平行光,最终在CCD(11)上形成相移干涉图,并传输、显示在计算机(12)上。
2.根据权利要求1所述的共光路干涉相位显微一次成像系统,其特征在于,所述半透半反镜(4)用石英玻璃制成,分光面为镀膜半反射、半透射的迎光束面,各为入射光强度的50%。
3.根据权利要求1所述的共光路干涉相位显微一次成像系统,其特征在于,所述载物台(7)为一个角度可调的全反镜,光轴与非偏振分光棱镜(6)的分光层之间的夹角可通过载物台(7)调节。
4.根据权利要求1所述的共光路干涉相位显微一次成像系统,其特征在于,所述视场光阑(5)可调节光束的大小,使干涉图像的大小不超过CCD(11)的记录靶面。
5.根据权利要求1所述的共光路干涉相位显微一次成像系统,其特征在于,所述扩束准直器(3)包括第一透镜和第二透镜。
6.一种利用权利要求1所述的共光路干涉相位显微一次成像系统进行成像的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤S1、所述激光束(1)发出的水平方向的光束,向前传输经过中性可调衰减器(2)调节至合适光强后,利用扩束准直器(3)将照明光束扩束准直为大小合适的平行光;
步骤S2、光束经半透半反镜(4)反射为竖直向下并向非偏振分光棱镜(6)传输,在这两个装置中间放置一个大小合适的视场光阑(5)使得成像区域的大小不超过CCD记录靶面的面积,又经非偏振分光棱镜(6)分光为物光和参考光两束竖直向下的光束,照射到反射载物台(7)上;前面所述的物光照射到样品(8)上作为样品光,而参考光则被反射载物台(7)全反射后直接原路返回;
步骤S3、物参反射光束经过非偏振分光棱镜(6)合束后,物光和参考光之间发生干涉,并原路返回经过视场光阑(5)和半透半反镜(4),再经过显微物镜(9)放大后,由第三透镜(10)准直为平行光,最终在CCD(11)上形成相移干涉图,并传输到计算机(12)里,经计算机(12)处理后显示。
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