CN116300364A - 一种基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置，包括沿光路方向依次设置的部分相干照明模块、显微成像系统、频谱调制模块和图像采集模块，其中，部分相干照明模块用于产生部分相干光以作为照明光；显微成像系统用于利用部分相干光获取样品的散射信号并对散射信号进行放大，获得具有样品信息的光场分布；频谱调制模块用于对来自显微成像系统的入射光频谱分别进行零频分量和高频分量的调制；图像采集模块用于采集经过频谱调制模块调制的零频分量和高频分量干涉所产生的全息图。本发明利用空间光调制器对物光的零频分量引入不同相位值来实现相移，记录物光零频分量和高频分量之间的相移相衬图样，最终可以再现出样品定量的相位分布。
Description
技术领域
本发明属于显微成像技术领域，具体涉及一种基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置，可用于测量微小物体的三维形貌或折射率分布。
背景技术
相位成像在生物医学方面具有非常重要的应用价值。因为生物样品大多是透明或半透明的，在传统显微镜下成像对比度很低，不利于对样品的观测。相位显微成像技术，将相位成像和光学显微镜相结合，可以定量地获得微观物体的三维形貌或透明物体的折射率分布。相对于传统测量方法如扫描探针显微方法，该方法具有全场测量、样品无需预处理(如不需要荧光标记、不需要制作导电电极等)、测量速度快的优点。
数字全息显微技术(Digital Holographic Microscopy，DHM)，是定量相位成像技术中的一种。DHM是将数字全息技术与光学显微技术相结合，通过对全息图进行重建，从得到的强度和相位图像中可以定量获取细胞等样品的三维形貌以及折射率分布等信息。数字全息显微具有相位成像速度快、相位测量精度高等优点，但是仍然存在着一些不足与挑战。目前的DHM装置大多采用物参分离的光路结构，即物光和参考光分别沿不同的路径传播一段距离后发生干涉，因此外界环境的扰动会对物光和参考光造成不同的影响，使全息图极易受到环境扰动的影响。
1942年丹麦科学家泽尼克(Zernike)提出了另一种相位成像技术——相衬干涉显微(Phase contrast interference microscopy)技术。该技术通过将物光的零频分量相位延迟π/2，使被测样品的相位信息变成强度信息。由于干涉图样的强度和被测物体的相位不是线性转换关系，因此传统泽尼克相衬成像只能用于定性的观测。在相衬成像中，当采用焦距为200mm的透镜对物光进行傅里叶变换时，物光的零频分量在频谱面上的直径(半高全宽)约为20～50μm。随着空间光调制器(Spatial light modulator,SLM，像素大小一般为4～8μm)的出现，人们可以很方便地对物光的零频分量进行调制。此时，通过对零频分量引入不同的相位值(相移操作)并记录所产生的强度图像，还可以实现对相位的定量测量。
在相衬成像中，物体的零频分量和高频分量等价于光学干涉中的参考光和物光。然而，对于不同样品，物光的零频和高频分量往往有着不同的强度，两者干涉形成的条纹对比度(相衬图像的衬度)经常得不到保证。2012年提出一种衬度(条纹对比度)可调的相衬干涉显微方法：采用了基于光栅编码的相位掩膜板对物光零频和高频分量进行调制。通过改变零频分量和高频分量上光栅的灰度阶，调节相衬图像中零频分量和高频分量的相对光强，从而调节相衬图样的衬度。同时，通过横向移动光栅可以进行相移操作，实现对相位物体的定量测量和对透明物体厚度或折射率的定量测量。
然而，迄今为止，定量相位成像的相衬显微技术均采用激光作为照明光源，所形成的相衬图像和重构的相位图像中含有散斑噪声，降低了相位成像的信噪比，也降低相位测量的灵敏度。采用LED照明可以有效抑制相衬显微中的散斑噪声，但是LED有效发光点的面积较大(毫米量级)，最终会引起物光频谱中低频分量和高频分量的混叠。这是因为：在相衬成像中，物光实际零频分量分布等于照明光频谱(准直前实际发光点的大小)与平行光照明下样品零频分量的卷积(如图1中插图所示)。因此，LED照明下物光的实际零频分量会出现大幅展宽，和其他高频分量混叠在一起，导致无法单独对零频分量进行相位延迟。和传统的泽尼克相衬成像类似，基于LED照明的相衬显微成像中会出现严重“光晕”现象(物光低频分量被错误地相位调制了)。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置。本发明要解决的技术问题通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置，包括沿光路方向依次设置的部分相干照明模块、显微成像系统、频谱调制模块和图像采集模块，其中，
所述部分相干照明模块用于产生实际发光点与样品零频分量大小相当的部分相干光以作为照明光；
所述显微成像系统用于利用所述部分相干光获取样品的散射信号并对所述散射信号进行放大，获得具有样品信息的光场分布；
所述频谱调制模块用于对来自所述显微成像系统的入射光频谱分别进行零频分量和高频分量的调制；
所述图像采集模块用于采集经过所述频谱调制模块调制的零频分量和高频分量干涉所产生的全息图。
在本发明的一个实施例中，所述部分相干照明模块包括激光器以及沿所述激光器的光路依次设置的第一平面反射镜、第一显微物镜、毛玻璃片、第一薄透镜和第二薄透镜、多模光纤单元和第三薄透镜，所述毛玻璃片垂直于光轴设置且能够绕光轴旋转以产生动态散射的部分相干光，所述多模光纤单元用于收集所述动态散射的部分相干光并控制所述部分相干光的直径；
所述多模光纤单元的出口位于所述第三薄透镜的焦点处。
在本发明的一个实施例中，所述多模光纤单元包括第一光纤头、第二光纤头以及连接在所述第一光纤头与所述第二光纤头之间的多模光纤，其中，所述第一光纤头位于所述第二薄透镜的焦点处，所述第二光纤头位于所述第三薄透镜的焦点处。
在本发明的一个实施例中，所述显微成像系统包括沿光路依次设置的第二显微物镜、第四透镜和第二平面反射镜，其中，样品放置在所述第二显微物镜的前焦面处。
在本发明的一个实施例中，所述频谱调制模块包括第五透镜、偏振片、三棱镜和空间光调制器，其中，
所述偏振片垂直于光路方向并将入射到所述偏振片的光线转换为偏振光，并且能够使得所述空间光调制器的调制效率达到最大值；
所述偏振光入射至所述三棱镜的第一面后被反射至所述空间光调制器上进行频谱调制，调制后的频谱再次入射至所述三棱镜的第二面上；
所述空间光调制器位于所述第五透镜的后焦平面处，用于将来自所述显微成像系统具有样品信息的光的零频分量和高频分量分别进行调制；
通过在所述空间光调制器上加载基于闪耀光栅的相位掩膜板，不仅能够单独测量物光的零频分量和高频分量，还能够获得零频分量和高频分量之间的相移干涉图样。
在本发明的一个实施例中，所述空间光调制器上加载有基于闪耀光栅的相位掩模板，所述相位掩模板由闪耀光栅和位于所述闪耀光栅中心的圆形区域叠加而成，其中，
所述圆形区域用于覆盖并调制物光频谱分量的相位，所述圆形区域之外的掩膜板用于调制物光的高频分量；所述闪耀光栅用于改变被调制光波的传播方向，能够将被调制的物光零频分量或高频分量从其它频谱中分离出来；通过在圆形区域内的闪耀光栅中叠加不同的相位，能够对物光零频分量进行相位延迟以实现相移相衬成像。
在本发明的一个实施例中，所述圆形区域的直径满足：
dFWHM≤2λ/(ML)f15，
其中，λ为照明光的波长，Μ为由所述第二显微物镜和所述第四透镜组成的望远镜系统的放大率，f15为第五透镜的焦距，L为成像视场的直径；
所述多模光纤的输出端面在所述空间光调制器上的成像直径小于所述圆形区域的直径。
在本发明的一个实施例中，所述图像采集模块包括第六透镜、分光棱镜、第一CCD相机、第七透镜和第二CCD相机，其中，
所述第六透镜垂直于光路方向，所述分光棱镜的反射面与所述第六透镜呈一定夹角，所述第七透镜设置在所述分光棱镜的光反射方向，并且所述第二CCD相机位于所述第七透镜的后焦面处；
所述第一CCD相机位于所述分光棱镜的光透射方向。
在本发明的一个实施例中，在所述空间光调制器的中心圆形区域加载灰度光栅图像，以在所述第一CCD相机上得到物光的零频分量强度分布I0；在所述空间光调制器(18)的周围闪耀光栅区域加载灰度光栅图像，以在所述第一CCD相机上得到物光的高频分量强度分布Id；
在所述空间光调制器的中心圆形区域和周围闪耀光栅区域分别加载具有0、2π/3、4π/3的相移量的灰度光栅图样，以在所述第一CCD相机上得到物光的干涉强度图像I1、I2、I3。
在本发明的一个实施例中，所述基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置还包括数据处理模块，用于根据物光的零频分量强度分布I0以及物光的干涉强度图像I1、I2、I3获得物光波的复振幅，
具体地，获得物光的干涉强度图像I1、I2、I3的表达式：
其中，O0、Od分别表示零频分量和高频分量的复振幅，i表示虚部；
进一步得到：
将O0 *Od表示成
其中，/>
表示零频分量和高频分量之间的相位差，则物光波的复振幅表示为：
其中，I0表示样品零频分量的强度分布。
与现有技术相比，本发明的有益效果有：
1、本发明基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置，利用激光作为照明光源，在激光耦合进入多模光纤之前放置一旋转的毛玻璃片，使得激光形成部分相干光，并通过多模光纤将所述部分相干光的发光点大小严格控制为多模光纤的芯径，该芯径尺寸一般位于10～100μm之间。光纤纤芯是照明光的实际发光点，当被成像到空间光调制器上时，其直径dFWHM正好满足由光学衍射理论计算的物光零频分量的直径dFWHM≤2λ/(ML)f15。这样以来，很好地避免样品的高频分量不被相位掩膜板中心圆域所错误调制。一方面不会引起物光的零频分量和高频分量的混叠，另一方面还可以降低相干噪声。
2、为了降低相衬成像的散斑噪声，同时避免相衬成像中的“光晕”现象(最终提高相位测量的精度)，我们本发明提出了小发光面元(直径在10-100μm范围内可选)的部分相干照明的定量相衬显微技术。该技术创新性地利用动态散射和多模光纤，来产生有效发光点为10～100μm(直径)的部分相干光照明。该有效发光点的大小与物光零频分量的大小一致，采用与之匹配的圆形相位掩膜板，不会影响高频分量，最终可以实现低噪声、无畸变的定量相衬成像。在该相衬显微光路中，零频光路和高频光路历经完全相同的光学元件，因此本发明的相衬显微装置对环境扰动具有非常好的免疫性。
3、本发明的定量相衬显微装置中利用空间光调制器，通过加载基于闪耀光栅的掩膜板，不仅可以单独测量物光的零频和高频分量的强度分布，还可以在两者之间引入不同相位值来记录三幅相移干涉图样。单独测量的零频分量和高频分量强度分布简化了相位重建流程，最终可以快速、准确获得样品定量的相位分布。此外，通过在空间光调制器上数字确定零频分量的区域大小，可以调制相衬成像的对比度。
以下将结合附图及实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一种基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置的结构示意图；
图2是本发明实施例提供的一种空间光调制器上加载的灰度图样；
图3是在图2中不同灰度图像下获得的强度图像或干涉图像；
图4是利用本发明实施例的定量相衬显微装置和现有数字全息成像再现出相位台阶的相位分布图；
图5是物光零频分量(不放样品时物光的频谱分布)在空间光调制器平面的强度分布图；
图6是相干光(CI)与部分相干光(PCI)照明下光波导样品再现相位图像中的散斑噪声比较图。
附图标记说明：
1-激光器；2-第一平面反射镜；3-第一显微物镜；4-毛玻璃片；5-第一薄透镜；6-第二薄透镜；7-第一光纤头；8-多模光纤；9-第二光纤头；10-第三薄透镜；11-样品；12-第二显微物镜；13-第四透镜；14-第二平面反射镜；15-第五透镜；16-偏振片；17-三棱镜；18-空间光调制器；19-第六透镜；20-分光棱镜；21-第一CCD相机；22-第七透镜；23-第二CCD相机。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及具体实施方式，对依据本发明提出的一种基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置进行详细说明。
有关本发明的前述及其他技术内容、特点及功效，在以下配合附图的具体实施方式详细说明中即可清楚地呈现。通过具体实施方式的说明，可对本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效进行更加深入且具体地了解，然而所附附图仅是提供参考与说明之用，并非用来对本发明的技术方案加以限制。
应当说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的物品或者设备中还存在另外的相同要素。
请参见图1，图1是本发明实施例提供的一种基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置的结构示意图。该定量相衬显微装置包括沿光路方向依次设置的部分相干照明模块、显微成像系统、频谱调制模块和图像采集模块，其中，所述部分相干照明模块用于产生实际发光点与样品零频分量大小相当的部分相干光以作为照明光；所述显微成像系统用于利用所述部分相干光获取样品的散射信号并对所述散射信号进行放大，获得具有样品信息的光场分布；所述频谱调制模块用于对来自所述显微成像系统的入射光频谱分别进行零频分量和高频分量的调制；所述图像采集模块用于采集经过所述频谱调制模块调制的零频分量和高频分量干涉所产生的全息图。
进一步地，本实施例的部分相干照明模块包括激光器1以及沿激光器的光路依次设置的第一平面反射镜2、第一显微物镜3、毛玻璃片4、第一薄透镜5和第二薄透镜6、多模光纤单元和第三薄透镜10，毛玻璃片4垂直于光轴设置且能够绕光轴旋转以产生动态散射的部分相干光，多模光纤单元用于收集动态散射的部分相干光并控制部分相干光的直径；多模光纤单元的出口位于第三薄透镜10的焦点处。
优选地，所述多模光纤单元包括第一光纤头7、第二光纤头9以及连接在第一光纤头7与第二光纤头9之间的多模光纤8，其中，第一光纤头7位于第二薄透镜6的焦点处，第二光纤头9位于第三薄透镜10的焦点处。来自第二薄透镜6的光线从第一光纤头7射入，并从第二光纤头9射出，光纤直径需与零频区域大小相匹配。
在具体使用过程中，激光器1发出的光波，经过第一平面反射镜2的反射后，经过第一显微物镜3聚焦到毛玻璃片4上，光束经过高速旋转的毛玻璃4产生部分相干光，该部分相干光依次经过第一薄透镜5、第二薄透镜6成像到第一光纤头7，进而导入多模光纤8，经过多模光纤8从第二光纤头9导出，被用作照明光。
进一步地，本实施例的显微成像系统包括沿光路依次设置的第二显微物镜12、第四透镜13和第二平面反射镜14，其中，样品11放置在第二显微物镜12的前焦面处。该模块功能是将样品的频谱信息经第二显微物镜12、第四透镜13和第五透镜15成像到以下将介绍的空间光调制器上。
所述频谱调制模块包括第五透镜15、偏振片16、三棱镜17和空间光调制器18，其中，偏振片16垂直于光路方向并将入射到偏振片16的光线转换为偏振光，并且能够使得空间光调制器18的调制效率达到最大值；偏振光入射至三棱镜17的第一面后被反射至空间光调制器18上进行频谱调制，调制后的频谱再次入射至三棱镜17的第二面上；空间光调制器18位于第五透镜15的后焦平面处，用于将来自所述显微成像系统具有样品信息的光的零频分量和高频分量分别进行调制；通过在空间光调制器18上加载基于闪耀光栅的相位掩膜板，不仅能够单独测量物光的零频分量和高频分量，还能够获得零频分量和高频分量之间的相移干涉图样。
进一步地，本实施例的空间光调制器18上加载有基于闪耀光栅的相位掩模板，所述相位掩模板由闪耀光栅和位于所述闪耀光栅中心的圆形区域叠加而成，其中，所述圆形区域用于覆盖并调制物光频谱分量的相位，所述圆形区域之外的掩膜板用于调制物光的高频分量；所述闪耀光栅用于改变被调制光波的传播方向，能够将被调制的物光零频分量或高频分量从其它频谱中分离出来；通过在圆形区域内的闪耀光栅中叠加不同的相位，能够对物光零频分量进行相位延迟以实现相移相衬成像。
本实施例的图像采集模块包括第六透镜19、分光棱镜20、第一CCD相机21、第七透镜22和第二CCD相机23，其中，第六透镜19垂直于光路方向，分光棱镜20的反射面与第六透镜19呈一定夹角，第七透镜22设置在分光棱镜20的光反射方向，并且第二CCD相机23位于第七透镜22的后焦面处；第一CCD相机21位于分光棱镜20的光透射方向。
具体地，所述频谱调制模块是对来自成像系统的入射光频谱分别进行零频分量和高频分量的调制；入射光经过一个偏振片16形成偏振光，该偏振光入射到三棱镜17后被反射到空间光调制器18上进行频谱调制。调制后的频谱再次入射到三棱镜，经过第六透镜19傅里叶变换，经过分光棱镜20，最终成像到第一CCD相机21上，该第一CCD相机21用于采集由零频分量和高频分量干涉产生的全息图。分光棱镜20分出的另一路光束经过第七透镜22，将空间光调制器上的图像成像到第二CCD相机23上。该路光用于实时监控空间光调制器(SLM)上的调制过程。
本实施例基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置完成样本的泽尼克相衬相位成像工作，同时抑制相干噪声。
由所述部分相干照明模块产生的照明光经过第三薄透镜10扩束准直后，对样品11进行照明。样品11被由第二显微物镜12和第四薄透镜13组成的望远镜系统放大(称作物光)。该物光经扩束放大后经第五薄透镜15的傅里叶变换，依次经过偏振片16、三棱镜17，其频谱出现在第五薄透镜15的后焦平面上。空间光调制器18放置于该第五薄透镜15的后焦平面，用于调节物光频谱以实现相衬成像。具体地，空间光调制器18上加载的相位掩模板由闪耀光栅和位于闪耀光栅中心的一圆形区域叠加而成。闪耀光栅用于改变被调制光波的传播方向，从而将调制的光波与未被调制的物光分离开来。圆形区域用于选择物光零频分量并对物光零频分量进行相位延迟以实现相衬成像。
进一步地，经频谱调制后的光再次反射到三棱镜17上，经过三棱镜17反射后经第六薄透镜19傅里叶变换，沿闪耀光栅+1级衍射光传播的物光被成像到第一CCD相机21上，去除了未被空间光调制器调制的零级光和其它级次衍射光的影响。此外，沿着分光棱镜20反射光方向，由第六透镜19和第七薄透镜22组成的望远镜系统将空间光调制器18上加载图样和物光频谱一起成像到第二CCD相机23上。该路光用于实时监控空间光调制器(SLM)18上的物光频谱和相位掩模板的重合性。
需要说明的是：在相衬成像中，物光的实际零频分量分布等于照明光频谱(准直前实际发光点的大小)与平行光照明下样品零频分量的卷积，如图1中右上角插图所示。为了避免样品的高频分量被相位掩膜板中的中心圆域所错误调制，相位掩膜板中心圆形区域的直径(dFWHM)应满足：dFWHM≤2λ/(ML)f15。其中，λ为照明光的波长，Μ为由第二显微物镜12和第四透镜13组成的望远镜系统的放大率，f15为第五透镜15的焦距，L为成像视场的直径。例如，对于Μ＝10的显微系统，其成像视场直径一般为0.5mm，此时一般要求dFWHM≤2λ/(ML)f15＝53.2μm。
进一步地，多模光纤8的直径需要使得照明光在空间光调制器18平面上的频谱与物光零频分量大小相当；换句话说，多模光纤8的输出端面在空间光调制器18上的成像直径小于所述圆形区域的直径dFWHM。
在本实施例中，在所述空间光调制器的中心圆形区域加载灰度光栅图像，以在所述第一CCD相机上得到物光的零频分量强度分布I0；在所述空间光调制器18的周围闪耀光栅区域加载灰度光栅图像，以在所述第一CCD相机上得到物光的高频分量强度分布Id；
在所述空间光调制器的中心圆形区域和周围闪耀光栅区域分别加载具有0、2π/3、4π/3的相移量的灰度光栅图样，以在所述第一CCD相机上得到物光的干涉强度图像I1、I2、I3。
具体地，采用上述基于部分相干照明的相衬成像装置可以实现对透明物体的定量相位成像。请参见图2，图2是本发明实施例提供的一种空间光调制器上加载的灰度图样，其中，图2(a)为选通物光零频分量的灰度掩模图像；图2(b)为选通物光高频分量的灰度掩模图像；图2(c)-图2(e)为在物光零频分量和高频分量之间产生相移量分别为0、2π/3、4π/3干涉图的灰度掩模图像。在空间光调制器18上依次加载如图2(a)至图2(e)所示的灰度图样，将可以分别在第一CCD相机21的CCD面上得到物光零频分量强度分布、高频分量强度分布，以及不同相移干涉图样。请参见图3，图3是在图2中不同灰度图像下获得的强度图像或干涉图像，其中，图3(a)是物光零频分量的强度图像；图3(b)是物光高频分量强度图像；图3(c)-3(e)是物光零频和高频分量之间相移量分别为0、2π/3、4π/3的干涉图样(相衬图像)。
当中心光栅(图2(a))和周围光栅(图2(b))分别被加载在空间光调制器上，可以分别得到样品零频分量和高频分量的强度分布I0和Id，分别如图3(a)和3(b)所示。当中心光栅和周围光栅之间具有0(图2(c))、2π/3(图2(d))和4π/3(图2(e))的相移量时，可以得到不同的相移干涉图，如图3(c)至图3(e)所示。这里的相移是指光波的零频和高频分量之间有不同的常数相位差。
在空间光调制器上零频区域和高频区域实现相移，当零频区域和高频区域之间具有0、2π/3、4π/3的相移量时(如图2(c)至图2(e)所示)，干涉强度图样分别为I1、I2、I3，如图3(c)至3(e)所示。
在CCD面上，相移干涉强度分布可表示为：
其中，O0、Od分别表示零频分量和高频分量的复振幅，i表示虚部。
从公式(1)可以得到：
如果将O0 *Od表示成
其中，/>
表示零频分量和高频分量之间的相位差，则物光波的复振幅可以表示为：
其中，I0表示样品零频分量的强度分布，这里忽略了O0的相位分布，直接采取了
的近似。
以下通过实验验证本实施例基于部分相干光照明的相衬显微装置的成像性能。
实验一：采用如图1所示的部分相干光照明定量相衬显微对一相位台阶样品进行成像。该相位台阶(70μm×20μm)是在二氧化硅载玻片上蚀刻而成，其深度在532nm波长下对应的相位为2.49rad。在空间光调制器上逐次加载如图2(a)至图2(e)所示的灰度图像，在第一CCD相机21面上便可得到物光零频分量、高频分量，以及不同相移干涉图样I1、I2、I3，分别如图3(a)至图3(e)所示。
请参见图4，图4是利用本发明实施例的定量相衬显微装置和现有数字全息成像再现出相位台阶的相位分布图，其中，图4(a)是相衬成像再现出相位台阶的相位分布(rad)；图4(b)是数字全息成像再现出相位台阶的相位分布(rad)；图4(c)是图4(a)和图4(b)中样品上沿虚线的相位分布(rad)。
采用上述理论方法(公式(1)-(3))可以定量获取出样品的相位分布，如图4(a)所示。同时，本发明实施例利用基于光学干涉的数字全息显微对同一样品进行了成像，再现出的相位图像如图4(b)所示。并且在图4(a)和图4(b)中相位台阶的同一位置各取一条虚线，两条虚线上对应的相位分布如图4(c)中两条曲线所示。对比两条曲线，发现两种不同的方法可以获得相似的相位分布。同时，图4(a)对应的相位曲线表明相位台阶的相位值为(2.49±0.15)rad，图4(b)对应的相位曲线表明相位台阶的相位值为(2.49±0.21)rad，与该相位台阶的实际值2.49rad基本符合，表明本发明实施例的定量相衬显微装置可以进行高精度定量测量。
实验二：本实验比较了相干照明和部分相干照明下的定量相衬显微成像特征。首先，利用第六透镜19和第七透镜22组成的望远镜系统将空间光调制器平面上物光的频谱成像到第二CCD相机23上。在未放样品时，氦氖激光照明和部分相干照明的频谱分布分别如图5(a)和图5(b)所示。为了便于定量比较，我们分别在图5(a)和5(b)中分别取出了经过频谱中心的两条强度曲线，如图5(c)所示。通过对两条曲线进行高斯拟合，发现激光照明和部分相干照明时物光频谱分布的半高全宽dFWHM分别为(24.42±0.24)μm和(48.85±0.58)μm。这里，照明光频谱分布的dFWHM对应于放置样品时物光的零频分量的dFWHM，也即相衬成像中相位掩膜板中心圆形区域的直径大小。在基于旋转毛玻璃片和多模光纤产生的部分相干照明下，照明光的dFWHM满足：dFWHM≤2λ/(ML)f15＝53.2μm，避免样品的高频分量被相位掩膜板中的中心圆域所错误调制。对于Μ＝10的显微系统，其成像视场直径一般为0.5mm，dFWHM≤2λ/(ML)f15＝53.2μm。
实验三：本实验比较了部分相干光(partially coherent illumination，简称PCI)和相干光(coherent illumination，简称CI)照明下定量相衬成像的相干噪声和照明均匀度。在本实验中拍摄了两种情况的图像：第一，使用由氦氖激光出射，耦合进单模光纤(SMF)产生的CI照明。第二，利用旋转毛玻璃与多模光纤结合产生PCI照明。图6(a)和图6(b)展示在CI和PCI照明下在一光波导样本的再现相位图。从图中可以看出PCI图像比CI图像更均匀，具有更高的信噪比。此外，图6(c)展示了图6(a)和图6(b)中沿着白色虚线(位于样品上空白区域)的相位分布，PCI和CI的相位曲线的均方差分别为0.046和0.24。为了进一步量化相干噪声的水平，统计了图6(a)和图6(b)中白色框(200×180像素)内的相位分布，其相位分布直方图如图6(d)和图6(e)所示。对图6(d)和图6(e)中直方图的高斯拟合表明，CI照明下相位分布的半高全宽(FWHM)为0.56±0.021，PCI照明下相位分布的半高全宽(FWHM)为0.20±0.006，这意味着由于散射光对时间的平均作用，PCI比CI图像更均匀，相干噪声更低。
综上，本发明实施例基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置，利用激光作为照明光源，在激光耦合进入多模光纤之前放置一旋转的毛玻璃片，使得激光形成部分相干光，并通过多模光纤将所述部分相干光的发光点大小严格控制为多模光纤的芯径，该芯径尺寸一般位于10～100μm之间。光纤纤芯是照明光的实际发光点，当被成像到空间光调制器上时，其直径dFWHM正好满足由光学衍射理论计算的物光零频分量的直径dFWHM≤2λ/(ML)f15。这样以来，很好地避免样品的高频分量不被相位掩膜板中心圆域所错误调制。一方面不会引起物光的零频分量和高频分量的混叠，另一方面还可以降低相干噪声。
为了降低相衬成像的散斑噪声，同时避免相衬成像中的“光晕”现象(最终提高相位测量的精度)，我们本发明提出了小发光面元(直径在10-100μm范围内可选)的部分相干照明的定量相衬显微技术。该技术创新性地利用动态散射和多模光纤，来产生有效发光点为10～100μm(直径)的部分相干光照明。该有效发光点的大小与物光零频分量的大小一致，采用与之匹配的圆形相位掩膜板，不会影响高频分量，最终可以实现低噪声、无畸变的定量相衬成像。在该相衬显微光路中，零频光路和高频光路历经完全相同的光学元件，因此本发明的相衬显微装置对环境扰动具有非常好的免疫性。
本发明实施例的定量相衬显微装置中利用空间光调制器，通过加载基于闪耀光栅的掩膜板，不仅可以单独测量物光的零频和高频分量的强度分布，还可以在两者之间引入不同相位值来记录三幅相移干涉图样。单独测量的零频分量和高频分量强度分布简化了相位重建流程，最终可以快速、准确获得样品定量的相位分布。此外，通过在空间光调制器上数字确定零频分量的区域大小，可以调制相衬成像的对比度。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置，其特征在于，包括沿光路方向依次设置的部分相干照明模块、显微成像系统、频谱调制模块和图像采集模块，其中，
所述部分相干照明模块用于产生实际发光点与样品零频分量大小相当的部分相干光以作为照明光；
所述显微成像系统用于利用所述部分相干光获取样品的散射信号并对所述散射信号进行放大，获得具有样品信息的光场分布；
所述频谱调制模块用于对来自所述显微成像系统的入射光频谱分别进行零频分量和高频分量的调制；
所述图像采集模块用于采集经过所述频谱调制模块调制的零频分量和高频分量干涉所产生的全息图。
2.根据权利要求1所述的基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置，其特征在于，所述部分相干照明模块包括激光器(1)以及沿所述激光器的光路依次设置的第一平面反射镜(2)、第一显微物镜(3)、毛玻璃片(4)、第一薄透镜(5)和第二薄透镜(6)、多模光纤单元和第三薄透镜(10)，所述毛玻璃片(4)垂直于光轴设置且能够绕光轴旋转以产生动态散射的部分相干光，所述多模光纤单元用于收集所述动态散射的部分相干光并控制所述部分相干光的直径；
所述多模光纤单元的出口位于所述第三薄透镜(10)的焦点处。
3.根据权利要求2所述的基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置，其特征在于，所述多模光纤单元包括第一光纤头(7)、第二光纤头(9)以及连接在所述第一光纤头(7)与所述第二光纤头(9)之间的多模光纤(8)，其中，所述第一光纤头(7)位于所述第二薄透镜(6)的焦点处，所述第二光纤头(9)位于所述第三薄透镜(10)的焦点处。
4.根据权利要求2所述的基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置，其特征在于，所述显微成像系统包括沿光路依次设置的第二显微物镜(12)、第四透镜(13)和第二平面反射镜(14)，其中，样品(11)放置在所述第二显微物镜(12)的前焦面处。
5.根据权利要求4所述的基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置，其特征在于，所述频谱调制模块包括第五透镜(15)、偏振片(16)、三棱镜(17)和空间光调制器(18)，其中，
所述偏振片(16)垂直于光路方向并将入射到所述偏振片(16)的光线转换为偏振光，并且能够使得所述空间光调制器(18)的调制效率达到最大值；
所述偏振光入射至所述三棱镜(17)的第一面后被反射至所述空间光调制器(18)上进行频谱调制，调制后的频谱再次入射至所述三棱镜(17)的第二面上；
所述空间光调制器(18)位于所述第五透镜(15)的后焦平面处，用于将来自所述显微成像系统具有样品信息的光的零频分量和高频分量分别进行调制；通过在所述空间光调制器(18)上加载基于闪耀光栅的相位掩膜板，不仅能够单独测量物光的零频分量和高频分量，还能够获得零频分量和高频分量之间的相移干涉图样。
6.根据权利要求5所述的基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置，其特征在于，所述空间光调制器(18)上加载有基于闪耀光栅的相位掩模板，所述相位掩模板由闪耀光栅和位于所述闪耀光栅中心的圆形区域叠加而成，其中，
所述圆形区域用于覆盖并调制物光频谱分量的相位，所述圆形区域之外的掩膜板用于调制物光的高频分量；所述闪耀光栅用于改变被调制光波的传播方向，能够将被调制的物光零频分量或高频分量从其它频谱中分离出来；
通过在圆形区域内的闪耀光栅中叠加不同的相位，能够对物光零频分量进行相位延迟以实现相移相衬成像。
7.根据权利要求6所述的基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置，其特征在于，所述圆形区域的直径满足：
dFWHM≤2λ/(ML)f15，
其中，λ为照明光的波长，Μ为由所述第二显微物镜(12)和所述第四透镜(13)组成的望远镜系统的放大率，f15为第五透镜(15)的焦距，L为成像视场的直径；
所述多模光纤(8)的输出端面在所述空间光调制器(18)上的成像直径小于所述圆形区域的直径。
8.根据权利要求5所述的基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置，其特征在于，所述图像采集模块包括第六透镜(19)、分光棱镜(20)、第一CCD相机(21)、第七透镜(22)和第二CCD相机(23)，其中，
所述第六透镜(19)垂直于光路方向，所述分光棱镜(20)的反射面与所述第六透镜(19)呈一定夹角，所述第七透镜(22)设置在所述分光棱镜(20)的光反射方向，并且所述第二CCD相机(23)位于所述第七透镜(22)的后焦面处；
所述第一CCD相机(21)位于所述分光棱镜(20)的光透射方向。
9.根据权利要求8所述的基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置，其特征在于，在所述空间光调制器(18)的中心圆形区域加载灰度光栅图像，以在所述第一CCD相机(21)上得到物光的零频分量强度分布I0；在所述空间光调制器(18)的周围闪耀光栅区域加载灰度光栅图像，以在所述第一CCD相机(21)上得到物光的高频分量强度分布Id；
在所述空间光调制器(18)的中心圆形区域和周围闪耀光栅区域分别加载具有0、2π/3、4π/3的相移量的灰度光栅图样，以在所述第一CCD相机(21)上得到物光的干涉强度图像I1、I2、I3。
10.根据权利要求9所述的基于部分相干光照明的定量相衬显微成像装置，其特征在于，还包括数据处理模块，用于根据物光的零频分量强度分布I0以及物光的干涉强度图像I1、I2、I3获得物光波的复振幅，
具体地，获得物光的干涉强度图像I1、I2、I3的表达式：
其中，O0、Od分别表示零频分量和高频分量的复振幅，i表示虚部；
进一步得到：
将O0 *Od表示成
其中，/>
表示零频分量和高频分量之间的相位差，则物光波的复振幅表示为：
其中，I0表示样品零频分量的强度分布。
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