CN111024664B - 一种结构光照明超分辨显微芯片的成像方法 - Google Patents

一种结构光照明超分辨显微芯片的成像方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种结构光照明超分辨显微芯片的成像方法，该方法包括如下步骤：步骤一：将两束相干光束分别打到成对的光栅上；发生干涉之后产生的结构光照明样品产生调制的荧光分布图并采集其照片。步骤二：调整两束相干光的光程差，使干涉之后产生的结构光发生两次平移并分别采集调制的荧光分布图照片。步骤三：两束相干光束切换到不同方向不同周期的成对光栅，重复步骤一和二。步骤四：对步骤三中得到的所有调制的荧光分布图照片对应的空间频谱信息在频域空间进行迭代拼接，得到扩大后的频谱，最后进行反傅里叶变换重构出超分辨的样品图像。本发明器件衍射结构所在的平面与样品放置的平面能够有效分离，有利于芯片的重复利用。

Description

一种结构光照明超分辨显微芯片的成像方法
技术领域
本发明涉及超分辨显微领域，尤其涉及一种结构光照明超分辨显微芯片的成像方法。
背景技术
传统光学系统受到阿贝衍射极限的限制，导致显微镜分辨率只能达到照明波长的一半。为了突破传统显微镜的衍射极限，人们发明了一系列的荧光标记和非荧光标记方法。其中移频技术可以突破传统成像与探测器件的带宽限制，在视场大、速度快上具有显著优势。结构光照明超分辨显微术属于移频技术，凭借其成像速度快、较低的激发光强(W/cm2)、对荧光染料的非特异性需求等优点，已经成为目前主流的超分辨成像技术之一，广泛应用于生物成像。
传统的显微光学系统可以看作为一个低通滤波器，其空间频率带宽由光学传递函数决定，空间频率高于这一带宽的信息都不可以通过。结构光照明超分辨显微术通过空间频率混合的方式将物体的高频空间结构信息混合编码至显微系统的带宽范围内，从而可以实现突破衍射极限的分辨率。其实现方式是利用调制光场作为样品激发光，能够实现的最大分辨率取决于这个调制光场的周期。照明光场的周期越小，则可以实现的分辨率越高。普通的结构光照明显微技术利用物镜耦合双光束产生干涉条纹，其条纹周期取决于物镜的有效数值孔径。为了增加物镜的有效数值孔径，往往需要匹配高折射率的溶液，然而自然界中液体的折射率有限，因而限制了这种超分辨方法的分辨率。此外，增大有效数值孔径还会带来成像视场面积的减小和显微镜工作距离的缩短。因而基于物镜耦合双光束方式实现的结构光照明显微术的应用受到了限制。
解决此矛盾的思路是将照明系统和接收系统分离，其中照明系统可以采用高折射率的芯片提供更小周期的结构光照明，接收系统用数值孔径较小的物镜，因此可以同时获得较大的成像视场和较高的分辨率。
公开号CN201811455370提出的基于光波导薄膜的结构光照明超分辨显微芯片，但该方法中样品与波导薄膜在芯片的同一面，不利于芯片的重复利用，此外，该方法中的光波导薄膜厚度只有一两百纳米，部分高折射率材料在薄膜制备上存在困难，但可以很容易制备成块状单晶材料。本发明提出采用块状单晶光波导材料制备结构光照明超分辨显微芯片的方案，在光波导的一面制备衍射单元，另一面抛光面作为样品成像面，可以实现芯片功能面与成像面的有效分离。
发明内容
本发明目的在于针对现有结构光照明显微技术的不足，提出一种结构光照明超分辨显微芯片的成像方法。本发明基于块状高折射光波导材料，在波导表面制备衍射结构，利用衍射效应将两束自由空间光耦合进波导材料，利用高有效折射率倏逝场产生的干涉结构光对样品进行照明，将物体高频空间频谱信息进而调制移频到低频被显微物镜接收，再恢复出样品的超分辨显微图。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种结构光照明超分辨显微芯片的成像方法，该方法基于结构光照明超分辨显微芯片实现，所述超分辨显微芯片包括：两面平行的衬底材料，衬底材料在所选照明波段是透明的，其中一个表面是功能表面，上面刻有m圈成对分布的光栅结构，另一个表面是成像平面，用来放置样品，对芯片的成像平面进行抛光处理，提高全反射的效率和倏逝场的均匀度；成像平面的成像区域正对于功能表面的光栅圈的中心；第m圈光栅圈的直径为：
Figure GDA0002640427470000021
其中T是衬底材料的厚度，λ是使用的照明光波长，n是衬底材料的折射率，Pm是第m圈光栅的周期,
Figure GDA0002640427470000022
是入射光与波导法线的夹角。
该方法的具体步骤如下：
步骤一：将两束相干光束分别打到成对的光栅上；光场经过成对的光栅发生一级衍射，以一定的角度θm耦合到衬底光波导中；
Figure GDA0002640427470000023
其中λ是使用的光波长，n是材料的折射率，Pm是光栅的周期,
Figure GDA0002640427470000024
是入射光与波导法线的夹角。最内一圈的光栅周期最大，由内而外，光栅周期逐渐变小。
两束耦合进光波导的光场在成像平面发生全反射，产生的倏逝场在成像区域的中心相遇并发生干涉，干涉之后产生的结构光照明样品产生调制的荧光分布图并采集其照片。结构光的周期与光栅的周期有关。
步骤二：调整两束相干光的光程差，使干涉之后产生的结构光发生两次平移并分别采集调制的荧光分布图照片。
步骤三：两束相干光束切换到不同方向不同周期的成对光栅，重复步骤一和二，得到样品在不同方向以及不同周期结构光照明下的调制的荧光分布图的照片。
步骤四：对步骤三中得到的所有调制的荧光分布图照片，进行傅里叶变换，得到每张照片对应的空间频谱信息，然后将这些空间频谱信息在频域空间进行迭代拼接，得到扩大后的频谱，最后进行反傅里叶变换重构出超分辨的样品图像。
进一步地，如果超分辨显微芯片的照明光是可见光，可选衬底材料包括Si3N4、SiO2、Al2O3、TiO2或者Polymer等。成像分辨率取决于材料折射率以及照明波长，衬底材料和照明波长具体根据对成像分辨率的需求、成本、加工条件等选用。
进一步地，所述超分辨显微芯片的光栅采用微纳加工方法制备，包括EBL、FIB、光刻或纳米压印等。
一种利用超分辨显微芯片进行成像的光学系统结构，该光学系统结构包括：耦合到芯片中产生倏逝场的平行光光源、两束平行光的光程差调节装置、支撑芯片的样品台、收集样品发射荧光的显微物镜、光学接收系统和镜架等机械固定装置。其中平行光光源位于芯片的功能表面的外侧，照射到光栅表面，用于在衬底光波导中激发所需的倏逝场，平行光光源为相干光。显微物镜位于芯片的成像平面的外侧，用于收集成像信号。光学接收系统包括了透镜、光学相机和计算机，用于记录成像信号。
进一步地，光源后可以增加光束扫描装置，将光斑准确反射到光栅上，提高成像速度。光束扫描装置可以是振镜或者空间光调制器。
进一步地，可以在平行光光源后加缩束扩束装置，产生适合光栅大小的入射光斑。本发明的有益效果：本发明直接在整块的光波导材料表面采用集成光学加工方法制备衍射结构单元，特点是可以实现集成化大规模生产，有利于降低芯片的成本；其次是器件衍射结构所在的平面与样品放置的平面能够有效分离，可以在不破坏器件衍射结构单元的情况下清洗成像区域，有利于芯片的重复利用。
附图说明
图1是芯片的截面及激发光的示意图；
图2是光学系统结构的示意图；其中201是光源，202是光束的缩束扩束系统，203是双光束产生和光程差调制系统，204是反射镜，205是样品台，206是芯片，207是显微物镜，208是滤光片，209是透镜，210是光学相机，211是用于图像的存储、重构和显示的计算机系统；
图3是光栅的平面分布图；
图4是重构频谱示意图；
图5是样品普通光场成像和结构光超分辨成像图的对比，其中(a)是荧光分子的分布原图，(b)是普通宽场成像图，(c)是结构光照明超分辨显微芯片的成像图。
具体实施方式
为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例和附图来详细说明本发明。
如图1所示，本发明提供的一种结构光照明超分辨显微芯片，包括：两面平行的衬底材料，衬底材料在所选照明光波段是透明的，如果照明光是可见光，可选衬底材料包括Si3N4、SiO2、Al2O3、TiO2或者Polymer等，成像分辨率取决于材料折射率以及选用照明波长，衬底材料和照明波长具体根据成像分辨率需求、成本和加工条件等选用。衬底材料其中一个表面是功能表面，采用EBL、FIB、光刻或纳米压印等微纳加工方法在上面刻m圈成对分布的光栅结构，另一个表面是成像平面，用来放置样品，对芯片的成像平面进行抛光处理，提高全反射的效率和倏逝场的均匀度；成像平面的成像区域位于功能表面的光栅圈的中心；一组同对光栅之间的间距满足：
Figure GDA0002640427470000041
其中T是衬底材料的厚度，λ是使用的照明光波长，n是衬底材料的折射率，Pm是该圈光栅的周期,
Figure GDA0002640427470000042
是入射光与波导法线的夹角。
如图2所示，一种利用超分辨显微芯片进行成像的光学系统结构，该光学系统结构包括：耦合到芯片中产生倏逝场的平行光光源201、支撑芯片206的样品台205、收集样品散射光的显微物镜207、光学接收系统和镜架等机械固定装置。其中平行光光源是相干光源，位于如图1所示的芯片206的功能表面的外侧，照射到光栅表面，用于在衬底光波导中激发所需的倏逝场。可以在平行光光源后加缩束扩束装置202，产生适合光栅大小的入射光斑。双光束产生和相位差调制系统203核心是空间光调制器，用来产生两束具有相干特性的光束并能调节两束光的相位差，两束相干光束经过反射镜204照到芯片206，显微物镜207位于芯片206的成像平面的外侧，用于收集成像信号。光学接收系统包括了滤光片208、透镜209、光学相机210和计算机211，用于记录、存储和处理成像信号。
一种利用超分辨显微芯片进行成像的光学系统结构的成像方法，该方法包括：
步骤一：将两束相干光束分别打到成对的光栅上；光场经过成对的光栅发生一级衍射，以一定的角度θm耦合到衬底光波导中；
Figure GDA0002640427470000043
其中λ是使用的光波长，n是材料的折射率，Pm是光栅的周期,
Figure GDA0002640427470000044
是入射光与波导法线的夹角。最内一圈的光栅周期最大，由内而外，光栅周期逐渐变小。
两束耦合进光波导的光场在成像平面发生全反射，产生的倏逝场在成像区域的中心相遇并发生干涉，干涉之后产生的结构光照明样品产生调制的荧光分布图并用普通显微镜采集其照片。结构光的周期与光栅的周期有关。
步骤二：调整两束相干光的光程差，使干涉之后产生的结构光发生两次平移并分别采集调制的荧光分布图照片。使用步骤一和二得到的三张调制的荧光分布图照片可在进行重构时解调出样品对应方向和周期的结构光照明下的空间频谱的相位。
步骤三：两束相干光束切换到不同方向不同周期的成对光栅，重复步骤一和二，得到样品在不同方向以及不同周期结构光照明下的调制的荧光分布图照片。
步骤四：对步骤三中得到的所有调制的荧光分布图照片，进行傅里叶变换，得到每张照片对应的空间频谱信息，然后将这些空间频谱信息在频域空间进行迭代拼接，得到扩大后的频谱，最后进行反傅里叶变换重构出超分辨的样品图像。
实施例
图1、图3分别是芯片侧视和俯视的光栅分布示意图。芯片的功能表面有m圈成对分布的光栅，每圈的光栅周期一致，为Pm，成对光栅的间距Dm。另一个表面是成像平面，放置有需要成像的样品。成像区域对应于另一面光栅圈的中心。
假设两束平行光照明到芯片其中一组光栅，则产生的一级衍射光在光波导内的传输角度是：
Figure GDA0002640427470000051
λ是使用的光波长，n是材料的折射率，P是光栅的周期,
Figure GDA0002640427470000052
是入射光与波导法线的夹角。若平行光垂直照明，
Figure GDA0002640427470000053
则衍射角公式θ简化为：
Figure GDA0002640427470000054
该一级衍射光在成像区域发生全反射，所能提供的倏逝场的波矢是：K＝K0*n*sinθ，其中K0是入射光在真空中的波矢，可以表述为
Figure GDA0002640427470000055
因而产生的倏逝波干涉条纹周期为
Figure GDA0002640427470000056
一组同对光栅之间的间距是：D＝2*T*tanθ，其中T是波导的厚度。
其重构的频谱空间如图4所示，频谱空间相比普通显微镜的频谱空间扩大，分辨率得到了提高。
以SiN材料为例，在532nm的激光照明下，其折射率n为2.06。荧光发光波长为575nm，物镜的数值孔径为0.85。
第一圈光栅的周期P1＝516nm,θ1＝30°，倏逝波的有效折射率为1.03；
第二圈光栅的周期P2＝298nm，θ2＝60°，倏逝波的有效折射率为1.784；
第三圈光栅的周期P3＝270nm，θ3＝80°，倏逝波的有效折射率为1.97；
分别用两束平行光垂直照射每圈不同方向的成对光栅，来自光栅的一级衍射光将以θm的角度射到上表面成像区域，并干涉产生结构光照明样品，激发荧光。样品的荧光图将被光学系统接收到并被存储记录。对两束光的光程差进行两次调节，以平移照明结构光并采集相应的结构光调制的荧光照片。将样品不同空间频谱范围的信息采集后，在频域空间进行迭代拼接得到扩大后的频谱，如图4，最后进行反傅里叶变换得到突破衍射极限的样品图像。利用所列参数，普通宽场成像可以实现的分辨率为338nm，结构光照明超分辨显微芯片实现的分辨率为102nm，如图5所示(标尺对应500nm)。相比普通宽场成像，该方法的有效分辨率可以提高到3.3倍。而普通结构光照明显微仅仅能提高两倍分辨率，该发明可以有效突破普通结构光照明显微方法的分辨率极限。
以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内。

Claims (6)

1.一种结构光照明超分辨显微芯片的成像方法，其特征在于，该方法基于结构光照明超分辨显微芯片实现，所述超分辨显微芯片包括：两面平行的衬底材料，衬底材料在所选照明波段是透明的，其中一个表面是功能表面，上面刻有m圈成对分布的光栅结构，另一个表面是成像平面，用来放置样品，对芯片的成像平面进行抛光处理，提高全反射的效率和倏逝场的均匀度；成像平面的成像区域正对于功能表面的光栅圈的中心；第m圈光栅圈的直径为：
Figure FDA0002640427460000011
其中T是衬底材料的厚度，λ是使用的照明光波长，n是衬底材料的折射率，Pm是第m圈光栅的周期,
Figure FDA0002640427460000012
是入射光与波导法线的夹角；
该方法的具体步骤如下：
步骤一：将两束相干光束分别打到成对的光栅上；光场经过成对的光栅发生一级衍射，以一定的角度θm耦合到衬底光波导中；
Figure FDA0002640427460000013
其中λ是使用的光波长，n是材料的折射率，Pm是光栅的周期,
Figure FDA0002640427460000014
是入射光与波导法线的夹角；最内一圈的光栅周期最大，由内而外，光栅周期逐渐变小；
两束耦合进光波导的光场在成像平面发生全反射，产生的倏逝场在成像区域的中心相遇并发生干涉，干涉之后产生的结构光照明样品产生调制的荧光分布图并采集其照片；结构光的周期与光栅的周期有关；
步骤二：调整两束相干光的光程差，使干涉之后产生的结构光发生两次平移并分别采集调制的荧光分布图照片；
步骤三：两束相干光束切换到不同方向不同周期的成对光栅，重复步骤一和二，得到样品在不同方向以及不同周期结构光照明下的调制的荧光分布图的照片；
步骤四：对步骤三中得到的所有调制的荧光分布图照片，进行傅里叶变换，得到每张照片对应的空间频谱信息，然后将这些空间频谱信息在频域空间进行迭代拼接，得到扩大后的频谱，最后进行反傅里叶变换重构出超分辨的样品图像。
2.根据权利要求1所述的一种结构光照明超分辨显微芯片的成像方法，其特征在于，如果超分辨显微芯片的照明光是可见光，可选衬底材料包括Si3N4、SiO2、Al2O3、TiO2或者Polymer；成像分辨率取决于材料折射率以及照明波长，衬底材料和照明波长具体根据对成像分辨率的需求、成本、加工条件选用。
3.根据权利要求1所述的一种结构光照明超分辨显微芯片的成像方法，其特征在于，所述超分辨显微芯片的光栅采用微纳加工方法制备，包括EBL、FIB、光刻或纳米压印。
4.一种利用超分辨显微芯片进行成像的光学系统结构，其特征在于，所述超分辨显微芯片包括：两面平行的衬底材料，衬底材料在所选照明波段是透明的，其中一个表面是功能表面，上面刻有m圈成对分布的光栅结构，另一个表面是成像平面，用来放置样品，对芯片的成像平面进行抛光处理，提高全反射的效率和倏逝场的均匀度；成像平面的成像区域正对于功能表面的光栅圈的中心；第m圈光栅圈的直径为：
Figure FDA0002640427460000021
其中T是衬底材料的厚度，λ是使用的照明光波长，n是衬底材料的折射率，Pm是第m圈光栅的周期,
Figure FDA0002640427460000022
是入射光与波导法线的夹角；
所述光学系统结构包括：耦合到芯片中产生倏逝场的平行光光源、两束平行光的光程差调节装置、支撑芯片的样品台、收集样品发射荧光的显微物镜、光学接收系统和镜架机械固定装置；其中平行光光源位于芯片的功能表面的外侧，照射到光栅表面，用于在衬底光波导中激发所需的倏逝场，平行光光源为相干光；显微物镜位于芯片的成像平面的外侧，用于收集成像信号；光学接收系统包括了透镜、光学相机和计算机，用于记录成像信号。
5.根据权利要求4所述的利用超分辨显微芯片进行成像的光学系统结构，其特征在于，光源后增加光束扫描装置，将光斑准确反射到光栅上，提高成像速度；光束扫描装置是振镜或者空间光调制器。
6.根据权利要求4所述的利用超分辨显微芯片进行成像的光学系统结构，其特征在于，在平行光光源后加缩束扩束装置，产生适合光栅大小的入射光斑。
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