CN113946044A - 基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统及方法，包括：激光光源；根据导入的双层点阵相位图对激光光束进行相位调制，产生三维多焦点阵列的空间光调制器；将三维多焦点阵列投射至样品面上，激发样品产生双光子荧光信号的物镜；对双光子荧光信号进行相位调制的相位调制单元；采集相位调制后的双光子荧光信号，得到若干图像数据的探测器；对若干图像数据进行图像重构，得到样品的深度分布图的控制终端。本发明通过空间光调制器产生的三维多焦点阵列激发样品产生双光子荧光信号，并将每个激发焦点的双光子荧光信号的光强分布调制为双螺旋点扩散函数形状，大幅提高了现有多焦点多光子显微技术的成像深度、分辨率和成像速度。
Description
技术领域
本发明属于光学成像技术领域，尤其涉及的是基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统及方法。
背景技术
与传统共聚焦显微技术相比，双光子荧光显微术具有三维空间分辨率、对活体样品损伤小、成像深度深、信噪比高等优点，广泛应用于生物医学领域，成为研究组织和细胞内特定分子和特定结构动态变化的有力工具。
现有的双光子荧光显微技术的成像分辨率和成像速度较低，为了提高成像速度，人们提出了多焦点多光子显微技术，但现有多焦点多光子显微技术成像分辨率和成像深度较低，而且三维成像时需要在深度方向逐层扫描，速度仍然很慢。
因此，现有技术有待于进一步的改进。
发明内容
鉴于上述现有技术中的不足之处，本发明的目的在于提供一种基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统及方法，克服现有多焦点多光子显微技术成像分辨率、成像深度低和三维成像速度慢的缺陷。
本发明所公开的第一实施例为一种基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统，其中，包括：激光光源；
空间光调制器，用于接收所述激光光源产生的激光光束，并根据导入的等间隔切换的双层点阵相位图对所述激光光束进行相位调制，产生随时间移动的三维多焦点阵列；其中，所述双层点阵相位图由三维点阵分布相位图和线性相位光栅相位图合成；
物镜，用于接收所述三维多焦点阵列，并将所述三维多焦点阵列投射至样品面上，激发样品产生双光子荧光信号；
相位调制单元，用于接收所述双光子荧光信号，并对所述双光子荧光信号进行相位调制，将每个激发焦点的双光子荧光信号的光强分布由高斯点扩散函数形状调制为双螺旋点扩散函数形状；
探测器，用于采集相位调制后的双光子荧光信号，得到若干原始图像数据；
控制终端，用于接收所述若干原始图像数据，并对所述若干原始图像数据进行图像重构，得到样品的深度分布图。
所述的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统，其中，所述激光光源与所述空间光调制器之间设置有第一半波片、偏振分光棱镜、第二半波片以及扩束准直模块；
所述第一半波片和所述偏振分光棱镜用于接收所述激光光源产生的激光光束，并对所述激光光束的激光功率进行调节；
所述第二半波片用于接收调节激光功率后的激光光束，并改变所述激光光束的偏振方向；
所述扩束准直模块用于接收改变偏振方向后的激光光束，并将所述激光光束以预设角度扩束准直至所述空间光调制器。
所述的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统，其中，所述空间光调制器与所述物镜之间设置有4f系统、第一反射镜、第二反射镜以及双色片；
所述4f系统用于接收所述三维多焦点阵列，并对所述三维多焦点阵列中的杂散光进行过滤；
所述第一反射镜和所述第二反射镜用于接收滤除杂散光后的三维多焦点阵列，并将所述三维多焦点阵列投射至所述双色片；
所述双色片和所述物镜用于接收所述第一反射镜和所述第二反射镜反射的三维多焦点阵列，并将所述三维多焦点阵列以平行光的形式投射至样品面上，激发样品产生双光子荧光信号。
所述的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统，其中，所述控制终端同时与所述探测器和所述空间光调制器连接，所述控制终端用于生成双层点阵相位图并将所述双层点阵相位图导入所述空间光调制器，以及控制所述探测器采集相位调制后的双光子荧光信号。
所述的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统，其中，所述4f系统包括沿光路依次设置的第一透镜、光阑以及第二透镜，所述空间光调制器设置于所述第一透镜的前焦面，所述光阑设置于所述第一透镜的后焦面，所述第一透镜的后焦面与所述第二透镜的前焦面重合。
所述的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统，其中，所述物镜与所述相位调制单元之间设置有沿光路依次设置的管镜和第三透镜，所述第三透镜的前焦面与所述管镜的后焦面重合，所述相位调制单元设置于所述第三透镜的后焦面。
所述的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统，其中，所述相位调制单元与所述探测器之间设置有第四透镜，所述第三透镜的后焦面与所述第四透镜的前焦面重合。
本发明所公开的第二实施例为一种基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像方法，其中，包括：
根据导入的等间隔切换的双层点阵相位图对激光光源产生的激光光束进行相位调制，产生随时间移动的三维多焦点阵列；其中，所述双层点阵相位图由三维点阵分布相位图和线性相位光栅相位图合成；
接收所述三维多焦点阵列，并将所述三维多焦点阵列投射至样品面上，激发样品产生双光子荧光信号；
接收所述双光子荧光信号，并对所述双光子荧光信号进行相位调制，将每个激发焦点的双光子荧光信号的光强分布由高斯点扩散函数形状调制为双螺旋点扩散函数形状；
采集相位调制后的双光子荧光信号，得到若干原始图像数据；
对所述若干原始图像数据进行图像重构，得到样品的深度分布图。
所述的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像方法，其中，所述对所述若干原始图像数据进行图像重构，得到样品的深度分布图的步骤包括：
对所述若干原始图像数据中的双螺旋点进行定位并截取，获得各个原始图像数据对应的若干亚区域图像数据；
根据各个原始图像数据对应的若干亚区域图像数据以及预先确定的旋转角度与轴向深度的关系曲线，确定样品不同轴向深度对应的重构图；
对样品不同轴向深度对应的重构图进行叠加，得到样品的深度分布图。
所述的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像方法，其中，所述根据各个原始图像数据对应的若干亚区域图像数据以及预先确定的旋转角度与轴向深度的关系曲线，确定样品不同轴向深度对应的重构图的步骤包括：
根据预先确定的旋转角度与轴向深度的关系曲线，确定样品不同轴向深度对应的二值数字针孔；
根据各个原始图像数据对应的若干亚区域图像数据以及样品不同轴向深度对应的二值数字针孔，确定样品不同轴向深度对应的重构图。
有益效果，本发明通过空间光调制器产生的三维多焦点阵列激发样品产生双光子荧光信号，并利用相位调制单元将双光子荧光信号的光强分布调制为双螺旋点扩散函数形状，通过单次扫描就能获得较大轴向深度的样品信息，在无需轴向扫描的前提下实现更大范围的三维双光子成像，大幅提高了现有多焦点多光子显微技术的成像深度、分辨率和成像速度。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统的结构示意图；
图2是本发明实施例提供的双层点阵相位图；
图3是本发明实施例提供的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统在均匀染料样品上产生的双光子荧光信号的光强分布图；
图4是图3中的双光子荧光信号经过相位调制单元进行相位调制后的光强分布图；
图5是本发明实施例提供的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像方法的实施例流程图；
图6是本发明实施例提供的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统得到的老鼠肾细胞样品不同轴向深度的重构图。
附图中各标记：1、激光光源；2、空间光调制器；3、物镜；4、样品面；5、相位调制单元；6、探测器；7、控制终端；8、第一半波片；9、偏振分光棱镜；10、第二半波片；11、扩束准直模块；12、4f系统；13、第一反射镜；14、第二反射镜；15、双色片；16、管镜；17、第三透镜；18、第四透镜；111、第五透镜；112、第六透镜；121、第一透镜；122、光阑；123、第二透镜。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在实施方式和申请专利范围中，除非文中对于冠词有特别限定，否则“一”与“所述”可泛指单一个或复数个。
另外，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
与传统共聚焦显微技术相比，双光子荧光显微术具有三维空间分辨率、对活体样品损伤小、成像深度深、信噪比高等优点，广泛应用于生物医学领域，成为研究组织和细胞内特定分子和特定结构动态变化的有力工具，但双光子荧光显微技术的成像分辨率和成像速度较低。
多焦点多光子显微技术通过增加激光光束的数量大大提高了双光子显微的采集速度，但受限于面阵探测器的帧频，成像分辨率和成像速度仍然较低。近年来，有人提出一种图像扫描显微镜，用面探测器替代传统共聚焦显微镜中的光电倍增管，随后对采集到的图像进行处理，能够提升√2倍的分辨率。后续，为提高图像扫描显微镜的成像速度，有学者提出其并行版本，即多焦点结构光照明显微技术。为进一步提高图像扫描显微技术的三维成像速度，一种基于双螺旋点扩散函数工程的多焦点结构光照明技术应运而生，虽然将双螺旋点扩散函数和多焦点结构光照明技术结合可以有效提高三维成像速度，但受到激发点阵焦深的影响，单层点阵对样品照明的轴向范围仅约为2μm，而且现有图像扫描显微技术是采用的单光子技术，成像深度有限。
为了解决上述问题，本发明提供了一种基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统，如图1所示，所述系统包括：激光光源1；用于接收所述激光光源1产生的激光光束，并根据导入的等间隔切换的双层点阵相位图对所述激光光束进行相位调制，产生随时间移动的三维多焦点阵列的空间光调制器；其中，所述双层点阵相位图由三维点阵分布相位图和线性相位光栅相位图合成；用于接收所述三维多焦点阵列，并将所述三维多焦点阵列投射至样品面4上，激发样品产生双光子荧光信号的物镜3；用于接收所述双光子荧光信号，并对所述双光子荧光信号进行相位调制，将每个激发焦点的双光子荧光信号的光强分布由高斯点扩散函数形状调制为双螺旋点扩散函数形状的相位调制单元5；用于采集相位调制后的双光子荧光信号，得到若干原始图像数据的探测器6；用于接收所述若干原始图像数据，并对所述若干原始图像数据进行图像重构，得到样品的深度分布图的控制终端7。具体成像过程中，空间光调制器2接收激光光源1产生的激光光束，并根据预先导入的双层点阵相位图对激光光束进行相位调制，通过不断切换空间光调制器2上的双层点阵相位图产生随时间移动的三维多焦点阵列，三维多焦点阵列经物镜3接收后，由物镜3投射至样品面4上，在样品面4上进行高精度随机寻址扫描，直至样品面4上被选择的区域全部被激发产生双光子荧光信号为止，所述双光子荧光信号经相位调制单元5进行相位调制后，由探测器6采集，得到若干原始图像数据，并由控制终端7对若干原始图像数据进行图像重构，得到样品的深度分布图。本实施例通过高速的空间光调制器2产生随时间移动的三维多焦点阵列，利用三维多焦点阵列激发样品产生双光子荧光信号，并通过相位调制单元5将每个激发焦点的双光子荧光信号的光强分布由高斯点扩散函数形状调制为双螺旋点扩散函数形状，通过单次二维扫描就能获得至少3μm轴向范围的样品信息，在无需轴向扫描的前提下实现更大范围的三维双光子成像，大幅提高了现有多焦点多光子显微技术的成像深度、分辨率和成像速度。
在一具体实施方式中，所述激光光源1与所述空间光调制器2之间设置有第一半波片8、偏振分光棱镜9、第二半波片10以及扩束准直模块11。所述第一半波片8和所述偏振分光棱镜9用于接收所述激光光源1产生的激光光束，并对所述激光光束的激光功率进行调节；所述第二半波片10用于接收调节激光功率后的激光光束，并改变所述激光光束的偏振方向；所述扩束准直模块11用于接收改变偏振方向后的激光光束，并将所述激光光束以预设角度扩束准直至所述空间光调制器2。所述扩束准直模块11包括第五透镜111和第六透镜112，所述第五透镜111的后焦面与所述第六透镜112的前焦面重合，所述第五透镜111用于接收改变偏振方向后的激光光束，并对所述激光光束进行扩束；所述第六透镜112用于接收扩束后的激光光束，并将所述激光光束以预设角度准直至所述空间光调制器2。具体成像过程中，激光光源1产生特定波长的脉冲激光，例如，1036nm的脉冲激光，经第一半波片8和偏振分光棱镜9进行激光功率的调节后，从偏振分光棱镜9出射的激光光束再次经过第二半波片10进行偏振方向的调节，通过转动第二半波片10使空间光调制器2对激光光束的调制效果达到最佳，由第二半波片10出射的激光光束被扩束准直模块11以预设角度扩束准直至空间光调制器2进行相位调制。
在一具体实施例中，所述空间光调制器2与所述物镜3之间设置有4f系统12、第一反射镜13、第二反射镜14以及双色片15；所述4f系统12用于接收所述三维多焦点阵列，并对所述三维多焦点阵列中的杂散光进行过滤；所述第一反射镜13和所述第二反射镜14用于接收滤除杂散光后的三维多焦点阵列，并将所述三维多焦点阵列投射至所述双色片15；所述双色片15和所述物镜3用于接收所述第一反射镜13和所述第二反射镜14反射的三维多焦点阵列，并将所述三维多焦点阵列以平行光的形式投射至样品面4上，产生双光子荧光信号。其中，激光光束在空间光调制器2上的波前相位与在物镜3后孔径面上的波前相位具有一致性。具体成像过程中，空间光调制器2产生的三维多焦点阵列经过4f系统12滤除杂散光后，由第一反射镜13和第二反射镜14投射至双色片15，并由双色片15和物镜3以平行光的形式投射至样品面4上，激发样品产生双光子荧光信号。
进一步地，所述4f系统12包括沿光路依次设置的第一透镜121、光阑122以及第二透镜123，所述空间光调制器2设置于所述第一透镜121的前焦面，所述光阑122设置于所述第一透镜121的后焦面，所述光阑122用于滤除除1级衍射光外的其它衍射级光，所述第一透镜121的后焦面与所述第二透镜123的前焦面重合。
在一具体实施方式中，所述控制终端7同时与所述探测器6和所述空间光调制器2连接，所述控制终端7用于生成双层点阵相位图并将所述双层点阵相位图导入所述空间光调制器2，以及控制所述探测器6采集相位调制后的双光子荧光信号。具体成像过程中，控制终端7通过LABVIEW软件同时生成两个同步触发信号，其中一个触发信号用于控制空间光调制器2等间隔切换双层点阵相位图，即从一张双层点阵相位图切换到下一张双层点阵相位图，使得生成的三维多焦点阵列整体性的移动到下一个扫描位置。在空间光调制器2切换双层点阵相位图的同时，另一个触发信号用于控制探测器6采集相位调制后的双光子荧光信号，即空间光调制器2每切换一张双层点阵相位图，探测器6就采集一次相位调制后的双光子荧光信号，最终获得与每个扫描位置一一对应的若干原始图像数据I1,I2…In。
如图2所示，为本发明实施例提供的双层点阵相位图，控制终端7在生成双层点阵相位图时，首先分别生成三维点阵分布相位图和线性相位光栅相位图，其中，所述三维点阵分布相位图采用改进的加权相位恢复(weighted GS，WGS)算法生成，然后将三维点阵分布相位图和线性相位光栅相位图合成双层点阵相位图。
在一具体实施方式中，所述相位调制单元5为双螺旋相位片，所述物镜3与所述相位调制单元5之间设置有沿光路依次设置的管镜16和第三透镜17，所述第三透镜17的前焦面与所述管镜16的后焦面重合，所述相位调制单元5设置于所述第三透镜17的后焦面。在双光子荧光信号采集过程中，所述物镜3和所述管镜16构成4f系统12，样品面4产生的双光子荧光信号经物镜3和管镜16构成的4f系统后，由第三透镜17投射至相位调制单元5上进行相位调制。如图3所示，本发明实施例提供的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统在均匀染料样品上产生的双光子荧光信号的光强分布图，图4为相位调制单元5对图3中的双光子荧光信号进行相位调制后的光强分布图。
在一具体实施方式中，所述相位调制单元5与所述探测器6之间设置有第四透镜18，所述第三透镜17的后焦面与所述第四透镜18的前焦面重合，具体成像过程中，经过相位调制单元5调制后的双光子荧光信号，由第四透镜18成像到探测器6上，生成若干原始图像数据。
此外，基于上述基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统，本发明还提供了一种基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像方法，如图5所示，其包括以下步骤：
S1、根据导入的等间隔切换的双层点阵相位图对激光光源产生的激光光束进行相位调制，产生随时间移动的三维多焦点阵列；其中，所述双层点阵相位图由三维点阵分布相位图和线性相位光栅相位图合成；
S2、接收所述三维多焦点阵列，并将所述三维多焦点阵列投射至样品面上，激发样品产生双光子荧光信号；
S3、接收所述双光子荧光信号，并对所述双光子荧光信号进行相位调制，将每个激发焦点的双光子荧光信号的光强分布由高斯点扩散函数形状调制为双螺旋点扩散函数形状；
S4、采集相位调制后的双光子荧光信号，得到若干原始图像数据；
S5、对所述若干原始图像数据进行图像重构，得到样品的深度分布图。
具体实施时，空间光调制器根据导入的双层点阵相位图对激光光源产生的激光光束进行相位调制，通过不断切换空间光调制器上的双层点阵相位图产生随时间移动的三维多焦点阵列，三维多焦点阵列经物镜接收后，由物镜投射至样品面上，在样品面上高精度随机寻址扫描，直至样品面上被选择的区域全部被激发产生双光子荧光信号为止，所述双光子荧光信号经相位调制单元进行相位调制后，由探测器采集，得到若干原始图像数据，控制终端对若干原始图像数据进行图像重构，得到样品的深度分布图。本实施例通过高速的空间光调制器产生随时间移动的三维多焦点阵列，利用三维多焦点阵列激发样品产生双光子荧光信号，并通过相位调制单元将每个激发焦点的双光子荧光信号的光强分布由高斯点扩散函数形状调制为双螺旋点扩散函数形状，通过单次二维扫描就能获得至少3μm轴向范围的样品信息，在无需轴向扫描的前提下实现更大范围的三维双光子成像，大幅提高了现有多焦点多光子显微技术的成像深度、分辨率和成像速度。
在一具体实施方式中，步骤S5包括：
S51、对所述若干原始图像数据中的双螺旋点进行定位并截取，获得各个原始图像数据对应的若干亚区域图像数据；
S52、根据各个原始图像数据对应的若干亚区域图像数据以及预先确定的旋转角度与轴向深度的关系曲线，确定样品不同轴向深度对应的重构图；
S53、对样品不同轴向深度对应的重构图进行叠加，得到样品的深度分布图。
本实施例中控制终端对获得的若干原始图像数据进行图像重构时，首先对若干原始图像数据进行降噪，然后利用预先标定的基准点位置对降噪后的若干原始图像数据中的双螺旋点进行定位并截取，获得各个原始图像数据对应的若干亚区域图像数据。例如，对于若干原始图像数据中的第j幅图像数据Ij，利用基准点位置定位单张图像数据Ij(n≥j≥1)中所有的双螺旋点并截取，从图像数据Ij中获得一系列亚区域图像数据S1,S2…Sl。
获得各个原始图像数据对应的若干亚区域图像数据后，根据各个原始图像数据对应的若干亚区域图像数据以及预先确定的旋转角度与轴向深度的关系曲线，确定样品不同轴向深度对应的重构图，然后对样品不同轴向深度对应的重构图进行叠加，即可得到样品的深度分布图。如图6所示为本发明实施例提供的基于点扩散函数的多焦点多光子显微成像系统得到的老鼠肾细胞样品轴向深度分别为-2μm、-1.5μm、-1.0μm、-0.5μm、-0μm、0.5μm、1.0μm、1.5μm和2μm时的重构图。
在一具体实施方式中，所述旋转角度与轴向深度的关系曲线的确定方法为：将荧光珠放置于三维电动纳米位移台，移动三维电动纳米位移台，并从-2μm到2μm轴向深度每间隔100nm记录一次双螺旋点扩散函数的强度分布图，对某个特定的轴向深度z,定位其双螺旋点扩散函数两个旁瓣的中心，两个中心的连线与水平线的夹角即为该轴向深度z对应的旋转角度θ，根据多组轴向深度z和旋转角度θ的数据拟合即可确定旋转角度与轴向深度的关系曲线θ＝kz。
在一具体实施方式中，步骤S52具体包括:
S521、根据预先确定的旋转角度与轴向深度的关系曲线，确定样品不同轴向深度对应的二值数字针孔；
S522、根据各个原始图像数据对应的若干亚区域图像数据以及样品不同轴向深度对应的二值数字针孔，确定样品不同轴向深度对应的重构图。
具体地，在确定样品不同轴向深度对应的重构图时，首先根据预先确定的旋转角度与轴向深度的关系曲线，确定所需重构的样品层轴向深度z对应的旋转角度θ的二值数字针孔，其中，二值数字针孔可表示为G
其中，(xi,1,yi,1)和(xi,2,yi,2)分别为二值数字针孔的中心坐标，c为高斯点扩散函数的标准差，c可通过扫描100nm的荧光珠样品获得。
确定样品不同轴向深度对应的二值数字针孔后，根据各个原始图像数据对应的若干亚区域图像数据以及样品不同轴向深度对应的二值数字针孔，确定样品不同轴向深度对应的重构图。其中，针对每个原始图像数据Ij和特定轴向深度z，将各原始图像数据Ij对应的若干亚区域图像数据中每个亚区域图像数据Si分别与特定轴向深度z对应的二值数字针孔G相乘，并将相乘后得到的图像所有像素强度值进行求和，得到每个原始图像数据Ij对应的像素点的灰度值，然后将每个原始图像数据Ij对应的像素点的灰度值按扫描顺序进行排列，即得到样品在轴向深度z对应的重构图。
综上所述，本发明提供了一种基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统及方法，所述系统包括：激光光源；根据导入的等间隔切换的双层点阵相位图对激光光束进行相位调制，产生随时间移动的的三维多焦点阵列的空间光调制器；其中，双层点阵相位图由三维点阵分布相位图和线性相位光栅相位图合成；将三维多焦点阵列投射至样品面上，激发样品产生双光子荧光信号的物镜；对双光子荧光信号进行相位调制的相位调制单元；采集相位调制后的双光子荧光信号，得到若干原始图像数据的探测器；对若干原始图像数据进行图像重构，得到样品的深度分布图的控制终端。本发明通过高速的空间光调制器产生随时间移动的三维多焦点阵列，利用三维多焦点阵列激发样品产生双光子荧光信号，并通过相位调制单元将每个激发焦点的双光子荧光信号的光强分布由高斯点扩散函数形状调制为双螺旋点扩散函数形状，系统简单，通过单次扫描就能获得较大轴向深度的样品信息，在无需轴向扫描的前提下实现更大范围的三维双光子成像，大幅提高了现有多焦点多光子显微技术的成像深度、分辨率和成像速度。
应当理解的是，本发明的系统应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统，其特征在于，包括：激光光源；
空间光调制器，用于接收所述激光光源产生的激光光束，并根据导入的等间隔切换的双层点阵相位图对所述激光光束进行相位调制，产生随时间移动的三维多焦点阵列；其中，所述双层点阵相位图由三维点阵分布相位图和线性相位光栅相位图合成；
物镜，用于接收所述三维多焦点阵列，并将所述三维多焦点阵列投射至样品面上，激发样品产生双光子荧光信号；
相位调制单元，用于接收所述双光子荧光信号，并对所述双光子荧光信号进行相位调制，将每个激发焦点的双光子荧光信号的光强分布由高斯点扩散函数形状调制为双螺旋点扩散函数形状；
探测器，用于采集相位调制后的双光子荧光信号，得到若干原始图像数据；
控制终端，用于接收所述若干原始图像数据，并对所述若干原始图像数据进行图像重构，得到样品的深度分布图。
2.根据权利要求1所述的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统，其特征在于，所述激光光源与所述空间光调制器之间设置有第一半波片、偏振分光棱镜、第二半波片以及扩束准直模块；
所述第一半波片和所述偏振分光棱镜用于接收所述激光光源产生的激光光束，并对所述激光光束的激光功率进行调节；
所述第二半波片用于接收调节激光功率后的激光光束，并改变所述激光光束的偏振方向；
所述扩束准直模块用于接收改变偏振方向后的激光光束，并将所述激光光束以预设角度扩束准直至所述空间光调制器。
3.根据权利要求1所述的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统，其特征在于，所述空间光调制器与所述物镜之间设置有4f系统、第一反射镜、第二反射镜以及双色片；
所述4f系统用于接收所述三维多焦点阵列，并对所述三维多焦点阵列中的杂散光进行过滤；
所述第一反射镜和所述第二反射镜用于接收滤除杂散光后的三维多焦点阵列，并将所述三维多焦点阵列投射至所述双色片；
所述双色片和所述物镜用于接收所述第一反射镜和所述第二反射镜反射的三维多焦点阵列，并将所述三维多焦点阵列以平行光的形式投射至样品面上，激发样品产生双光子荧光信号。
4.根据权利要求1所述的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统，其特征在于，所述控制终端同时与所述探测器和所述空间光调制器连接，所述控制终端用于生成双层点阵相位图并将所述双层点阵相位图导入所述空间光调制器，以及控制所述探测器采集相位调制后的双光子荧光信号。
5.根据权利要求3所述的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统，其特征在于，所述4f系统包括沿光路依次设置的第一透镜、光阑以及第二透镜，所述空间光调制器设置于所述第一透镜的前焦面，所述光阑设置于所述第一透镜的后焦面，所述第一透镜的后焦面与所述第二透镜的前焦面重合。
6.根据权利要求1所述的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统，其特征在于，所述物镜与所述相位调制单元之间设置有沿光路依次设置的管镜和第三透镜，所述第三透镜的前焦面与所述管镜的后焦面重合，所述相位调制单元设置于所述第三透镜的后焦面。
7.根据权利要求6所述的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像系统，其特征在于，所述相位调制单元与所述探测器之间设置有第四透镜，所述第三透镜的后焦面与所述第四透镜的前焦面重合。
8.一种基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像方法，其特征在于，包括：
根据导入的等间隔切换的双层点阵相位图对激光光源产生的激光光束进行相位调制，产生随时间移动的三维多焦点阵列；其中，所述双层点阵相位图由三维点阵分布相位图和线性相位光栅相位图合成；
接收所述三维多焦点阵列，并将所述三维多焦点阵列投射至样品面上，激发样品产生双光子荧光信号；
接收所述双光子荧光信号，并对所述双光子荧光信号进行相位调制，将每个激发焦点的双光子荧光信号的光强分布由高斯点扩散函数形状调制为双螺旋点扩散函数形状；
采集相位调制后的双光子荧光信号，得到若干原始图像数据；
对所述若干原始图像数据进行图像重构，得到样品的深度分布图。
9.根据权利要求8所述的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像方法，其特征在于，所述对所述若干原始图像数据进行图像重构，得到样品的深度分布图的步骤包括：
对所述若干原始图像数据中的双螺旋点进行定位并截取，获得各个原始图像数据对应的若干亚区域图像数据；
根据各个原始图像数据对应的若干亚区域图像数据以及预先确定的旋转角度与轴向深度的关系曲线，确定样品不同轴向深度对应的重构图；
对样品不同轴向深度对应的重构图进行叠加，得到样品的深度分布图。
10.根据权利要求9所述的基于点扩散函数工程的多焦点多光子显微成像方法，其特征在于，所述根据各个原始图像数据对应的若干亚区域图像数据以及预先确定的旋转角度与轴向深度的关系曲线，确定样品不同轴向深度对应的重构图的步骤包括：
根据预先确定的旋转角度与轴向深度的关系曲线，确定样品不同轴向深度对应的二值数字针孔；
根据各个原始图像数据对应的若干亚区域图像数据以及样品不同轴向深度对应的二值数字针孔，确定样品不同轴向深度对应的重构图。
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