CN103048272B - 基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像方法，包括以下几个步骤：1)入射照明光倾斜照射在基板介质分界面上进行全反射并产生倏逝场；2)使用倏逝场对样品表面进行照明，并通过显微镜接收样品表面的强度图像；3)对强度图像进行傅里叶变换得到相应频谱，对所得到的频谱进行还原，得到相应的频谱还原图像；4)绕样品多次改变入射照明光方向，直至入射照明光方向覆盖0～360°，得到不同方向下的频谱还原图像；5)对不同方向下的频谱还原图像进行叠加，得到完整的高频频谱图像；6)对完整高频频谱图像进行傅里叶反变换，得到观察样品的超分辨显微图像。本发明还公开了一种基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像装置。

Description

基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像方法和装置

技术领域

本发明属于微观观测测量领域，具体涉及一种基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像方法和装置。

背景技术

纳米技术与生物技术是21世纪发展最迅速和热门的科学领域。纳米技术应用广泛，包括1～100nm尺度内的成像、测量、加工、操纵等。许多重要的生物体比如葡萄糖、抗体、病毒等都处于这个尺度范围内，研究这些微小物体的需求推动了高分辨率显微成像技术的发展。反过来，超分辨显微术的发展也推动了整个生命科学的进步。相比其他的显微技术，光学显微技术的一大优势是可以对处于自然状态的活细胞进行研究。自世界上第一台光学显微镜问世以来，提高光学显微成像系统的分辨能力及测量范围一直是众多科学家致力研究的重要科学问题，特别是近年来，随着物理学、生物医学、微电子学和材料学等学科的迅速发展，对这一问题的研究变得尤为迫切，主要体现在：物理学的发展要求人们能观测到微观世界中原子的大小；分子生物学的发展要求人们能观测到活体细胞这种高散射物质内小到纳米尺度的单分子；微电子技术的发展要求人们能检测到超大规模集成电路中窄到数十纳米的线宽尺寸；纳米新材料的出现要求人们能观测到纳米尺度大小的纳米颗粒等，这些现代科学的新进展，更加促使人们不断地去探索高分辨显微成像的新方法和新技术。

由于衍射极限的存在，传统的宽场光学显微镜横向和纵向的分辨率分别仅约为230nm和1000nm。二十世纪三十年代发展起来的电子显微成像技术及八十年代初崛起的各类非光学的探针扫描显微成像技术具有纳米甚至更高的分辨能力，但它们在不同程度上存在着系统结构复杂、成像检测环境要求苛刻及样品处理繁琐等困难，特别是不能获得样品重要的光学信息(如反射率、折射率、偏振态及光谱等信息)，因而无法完全取代光学显微成像的地位。

随着现代激光技术、计算机技术、精密机械及电子技术的迅猛发展，超分辨的光学显微成像技术(Super-resolution Optical Microscopy，SROM)应运而生。根据原理不同，现有技术可以分为两大类：一类是以固体浸没透镜(Solid Immersion Lens，SIL)技术为代表的近场显微技术；另一类则是以激发抵制损耗显微镜(Stimulated Emission Depletion，STED)为代表的荧光显微技术。然后，两种现有技术都存在着一定的缺陷：前者虽然使用宽场照明，但很难将其分辨率压缩在100nm以下；后者则是基于荧光显微技术，无法使用于非荧光样品上，因此使用范围受到限制。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明基于倏逝场照明，提供了一种实现远场超分辨的方法，通过移频算法实现了超分辨显微图像获取。

一种基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像方法，包括以下几个步骤：

1)将准直后的入射照明光倾斜照射在基板介质分界面上产生全反射，在界面另一侧产生倏逝场；

2)使用倏逝场对样品表面进行照明，并通过显微镜从远场接收样品表面的强度图像；

3)对所述的强度图像进行傅里叶变换得到相应频谱，使用移频算法对所得到的频谱进行还原，并得到相应的频谱还原图像；

4)绕样品多次改变入射照明光方向，直至入射照明光方向覆盖0～360°，每次均重复步骤1)～步骤3)，得到不同方向下的频谱还原图像；

5)对不同方向下的频谱还原图像进行叠加，得到完整的高频频谱图像；

6)对所述的完整高频频谱图像进行傅里叶反变换，得到观察样品的超分辨显微图像。

所述的入射照明光为具有相同偏振方向、且波长在380～780nm范围内的可见单色线偏振光。

步骤(2)中所述的照射在基板介质分界面，是指入射照明光由光密介质一侧入射；所述的倾斜照射，是指入射照明光的入射角大于界面全反射角。所述的显微镜为100X放大非浸没光学显微镜，其数值孔径优选为0.8～0.95。

步骤4)中的入射照明光方向改变的次数由下式决定：

NUM＝π/arcsin(k_m/k_e)

式中：k_m为显微镜最大截止频率，k_e为倏逝场横向光波矢。

本发明的工作原理是：

当准直后的单色光通过光密介质后达到介质分界面时，会在介质分界面上发生光路折转。当入射光线的入射角大于全反射角之后，将在界面上发生全反射。此时，在光疏介质一侧，全反射将产生倏逝场。根据光波矢边界连续条件，倏逝场的横向光波矢将由如下公式决定：

k_e＝n₁k₀sinθ≥n₂k₀

其中，k₀为入射单色光在真空中的光波矢大小，n₁和n₂分别为光密介质(棱镜)和光疏介质(空气)的折射率，θ为入射角。

当倏逝场照射在样品表面时，根据移频理论，会发生频谱搬移现象。可以用如下公式表达：

$\stackrel{\→}{{k^{\′}}_{\mathrm{\Λ}}}=\stackrel{\→}{k_e}\±N\stackrel{\→}{k_{\mathrm{\Λ}}}$

其中，为样品表面亚波长细节所对应的傅里叶频谱，k_m为显微镜最大截止频率，N为衍射级次。由于衍射强度随衍射级次的增大而递减，一般而言N≡1，当时，原本不能分辨的样品表面亚波长细节信息，可以被移频至可传导频域内从而可以被显微镜从远场接收。通过对接收的强度图像进行傅里叶变换即可以直接得到再通过上述公式中的反运算即可以将频谱还原。

如果倏逝场仅从单一方向对样品进行照明，其可移频的范围是有限的。对整个频谱面进行二维傅里叶展开，可知可移频通带范围是一个与显微镜通带等大的圆形区域。其相对于频谱原点的张角，可由如下公式确定：

Θ＝2arcsin(k_m/k_e)

其中，为显微镜最大截止频率，NA为显微镜系统数值孔径，λ₀为照明光波长。如果样品表面只具有一维方向的亚波长细节，其对应的频谱图像也将呈一维分布，此时，理论上说只需要单方向倏逝场照明即可将整幅图像的频谱还原。但是，对于不能预知一维亚波长细节分布，或是需要观察具有二维方向亚波长细节的样品时，则需要进行全方向的移频计算。为了覆盖360°的方向角，需要改变入射光方向，进行重复多次的移频计算。所需要的最小移频次数为

NUM＝2π/Θ

次数越多，则频谱信息的还原程度越高，但与此同时，所需要的计算时间则呈线性增加。因此，需要综合考虑系统的图像还原精度与算法消耗时间。

随后，对不同方向下的频谱还原图像进行叠加，即可得到完整高频频谱图像。对得到的完整高频频谱图像进行反傅里叶变换，即可得到观察样品的超分辨显微图像。

一种基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像装置，包括：

用于产生入射照明光的光源组；

用于对所述入射照明光进行全反射且带有基板介质分界面的棱镜，该基板介质分界面的背面放置有样品；

用于收集样品表面的强度图像的显微镜；

以及用于对所述强度图像进行计算和控制的计算机。

所有光学元件，包括光源组、棱镜、显微镜和样品，均位于同轴光路上。

其中，所述的光源组，是指可以发射具有相同偏振方向、波长在380～780nm范围内的可见单色线偏振光的光源组。所述的光源组包括绕棱镜布置的多个子光源，且所有子光源处于同一水平面上。每个子光源包括沿光路依次布置的LED、窄带滤色片、准直模块和偏振片，且在同一时刻，光源组内所有子光源仅有一个处于点亮状态。

所述棱镜为倒置的多棱锥形，所述的基板介质分界面位于棱镜的顶部。且该棱镜为玻璃材质，其折射率为1.52～1.80。入射面倾角由折射率决定，当折射率为1.52时，入射面倾角优选为45°；当折射率为1.80时，入射面倾角优选为60°。

所述的显微镜为100X放大非浸没光学显微镜，其数值孔径优选为0.8～0.95。

本发明还提供了一种基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像装置，包括沿所述光路依次布置的：

用于产生入射照明光的激光光源；

用于改变入射照明光的传播方向的光路转换装置；

用于将入射照明光改变为大角度平行光束的全反射物镜镜头；

用于对所述入射照明光进行全反射且带有基板介质分界面的玻片，该玻片上放置有样品；

用于收集样品表面的强度图像的显微镜；

以及用于对所述强度图像进行计算和控制的计算机。

所述光路转换装置为振镜，且振镜和全反射物镜镜头之间设有，用于将对所述振镜出射的入射照明光进行聚焦的聚焦镜。

所述的光路转换装置还可以为偏心光阑。

本发明具有以下有益的技术效果：

(1)分辨率精细度高，当工作波长为600nm时，理论分辨率极限可达75nm；

(2)结构简单，成本低廉；

(3)采用宽场成像方式，图像获取速度远高于扫描成像方式，可以获取观察样品的即时动态图像，系统图像刷新率高；

(4)适用性强，对样品本身材质无要求。

附图说明

图1为本发明的基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像装置的结构原理图；

图2为本发明光源组中单个子光源的示意图；

图3为本明中棱镜的剖面示意图；

图4为本发明中单方向照明情况下移频通带的示意图；

图5为本发明中光源组的结构示意图；

图6为本发明中棱镜的三维结构示意图；

图7为本发明中经过合成后的完整高频频谱图像的示意图；

图8为本发明的基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像装置改进照明方式后的结构原理图；

图9为本发明的基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像装置另一改进照明方式后的结构原理图；

图10为本发明中偏心光阑的结构示意图。

图中，光源组1，棱镜2，显微镜3，计算机4，样品5，子光源6，LED7，窄带滤色片8，准直模块9，偏振片10，棱镜入射面11，棱镜全反射面12，激光光源13，振镜14，聚焦镜15，反射镜16，全反射物镜镜头17，玻片18，偏心光阑19，入射面倾角

具体实施方式

实施例1

如图1所示，基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像系统的装置，包括：光源组1，棱镜2，显微镜3，计算机4，样品5。

光源组1、棱镜2、显微镜3和样品5位于同轴光路上。由光源组1中单个子光源6发出的入射照明光，在棱镜2中全反射，产生倏逝场照明样品5。所产生的光强分布由显微镜4在远场收集分析。其中，所述的入射照明光，是指具有相同偏振方向、波长在380～780nm范围内的可见单色线偏振准直光。

从根本上说，入射照明光由LED7提供，为达到上述入射照明光的要求，需要设计如图2所示的子光源6结构。子光源6包括LED7、窄带滤色片8、准直模块9和偏振片10等部分。由LED7发出的入射照明光线，将首先经过准直模块9进行准直。所述的准直模块9在现有技术条件下有多种选择，其中优选为光纤准直方式。经过准直的入射照明光线，将依次通过窄带滤色片8进行窄带滤色，并通过偏振片10转换为线偏振光。为达到系统单色性要求，窄带滤色片8的带宽应不大于10nm；为满足系统偏振度要求，偏振片10的偏振纯度应大于99.9％。

从子光源6出射的入射照明光，将进一步水平入射通过棱镜2的棱镜入射面11发生折转，进而在棱镜全反射面12上发生全反射。如图3所示为本明中棱镜的剖面示意图。棱镜入射面11和棱镜全反射面12应保持较高的平整度，因此，棱镜2的材质优选为玻璃。同时，为达到全反射要求，产生倏逝场，在棱镜全反射面12的光线入射角θ应大于全反射临界角。根据光波矢边界连续条件，倏逝场的横向光波矢将由如下公式决定：

k_e＝n₁k₀sinθ≥n₂k₀

其中，k₀为入射单色光在真空中的光波矢大小，n₁和n₂分别为光密介质和光疏介质的折射率，θ为棱镜全反射面上的光线倾角。

当倏逝场照射在样品5表面时，如果样品5表面具有亚波长细节，即当时，会产生移频现象。其中，为亚波长细节对应的傅里叶频谱，Λ为亚波长细节的空间周期；为显微镜3最大截止频率，NA为显微镜3数值孔径，λ₀为照明光波长。根据移频理论，可以用如下公式表达：

$\stackrel{\→}{{k^{\′}}_{\mathrm{\Λ}}}=\stackrel{\→}{k_e}\±N\stackrel{\→}{k_{\mathrm{\Λ}}}$

其中N为衍射级次。由于衍射强度随衍射级次的增大而递减，一般而言N≡1。当时，原本不能分辨的样品表面亚波长细节信息，可以被移频至可传导频域内从而可以被显微镜3从远场接收。通过对接收的强度图像进行傅里叶变换即可以直接得到再通过上述公式的反运算即可以将频谱还原。

如果倏逝场仅从单一方向对样品进行照明，其可移频的范围是有限的。对整个频谱面进行二维傅里叶展开，可知可移频通带范围是一个与显微镜3通带等大的圆形区域，如图4所示。图中的实线区域为显微镜3通带区域范围，虚线区域则为可移频通带范围。因此，本发明系统的截止频率可以写为k_max＝k_e+k_m。为获得尽可能高的系统分辨能力，在系统参数固定的前提下，应使k_e尽可能大。根据k_e的计算公式，应保持较大的棱镜2折射率n₁，并使sinθ→1。根据常规玻璃折射率及其对应折射率，棱镜2折射率范围n₁为1.52～1.80，优选为1.80。同时，光线倾角θ应大于70°，此时对应的sinθ＞0.93。为达到上述要求，需要对入射面倾角进行优化，其大小由棱镜2折射率n₁决定。当折射率为1.52时，入射面倾角优选为45°；当折射率为1.80时，入射面倾角优选为60°。

移频通带范围相对于频谱原点的张角，可由如下公式确定：

Θ＝2arcsin(k_m/k_e)

如果样品表面只具有一维方向的亚波长细节，其对应的频谱图像也将呈一维分布，此时，理论上说只需要单方向倏逝场照明即可将整幅图像的频谱还原。但是，对于不能预知一维亚波长细节分布，或是需要观察具有二维方向亚波长细节的样品时，则需要进行全方向的移频计算。为了覆盖360°的方向角，需要改变入射光方向，进行重复多次的移频计算。为实现多角度的入射光，需要将多个子光源6环绕排列成阵列形式，成为光源组1，如图5所示。为保证互不串扰，在同一时刻，光源组1内所有子光源6仅有一个处于点亮状态。所需要子光源6的个数由所需要的最少移频次数决定，而所需要的最少移频次数可以表示为

NUM＝2π/Θ

相对而言，次数越多，则频谱信息的还原程度越高，但与此同时，所需要的计算时间则呈线性增加。因此，需要综合考虑系统的图像还原精度与算法消耗时间。同时，为了与光源组1配合，每个子光源6应对应于棱镜2的一个棱镜入射面11。因此，整个棱镜2结构为钻石状，其三维结构如图6所示。

光源组1内各个子光源的点亮顺序由计算机4控制。在光源组1内任意子光源6点亮时，通过显微镜3依次在远场收集强度图像，再交由计算机4进行傅里叶变换得到相应频谱并使用移频算法对所得到的频谱进行还原，储存数据后切换到下一子光源6。在所有子光源6顺次点亮一遍后，对得到的频谱还原图像进行叠加，即可以得到完整的高频频谱图像，如图7所示。最终，对得到的完整高频频谱图像进行傅里叶反变换，得到观察样品的超分辨显微图像。

本系统的理论极限分辨能力可以由系统的截止频率进行计算，其计算公式为

$r=\frac{\mathrm{\π}}{k_{\max }}$

将k_max的表达式代入，即可得到系统的理论极限分辨能力。例如：当使用入射照明光中心波长为600nm、棱镜2折射率为1.52、棱镜2中入射面倾角大小为45°时，经过计算可得理论极限分辨率为75nm。

实施例2

除了在本发明具体实施方式图1中提供的结构原理图外，本发明也可以在保证相同原理的前提下，对照明方式加以改进。

如图8所示为实现本发明的基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像装置改进照明方式后的结构原理图。

如图8所示，经过改进照明方式后，基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像系统的装置，包括：激光光源13，振镜14，聚焦镜15，反射镜16，全反射物镜镜头17，玻片18，显微镜3，计算机4，样品5。

激光光源13、振镜14、聚焦镜15、反射镜16、全反射物镜镜头17、玻片18、显微镜3、样品5位于同轴光路上。由激光光源13发出的入射照明光，依次经过振镜14、聚焦镜15、反射镜16、全反射物镜镜头17后，最终在玻片18内发生全反射，倏逝场照明样品5。所产生的光强分布由显微镜4在远场收集分析。

振镜14用于改变入射照明光的传播方向，聚焦镜15的焦平面与全反射物镜镜17的像方焦平面重合，并将由振镜14出射的入射照明光聚焦在全反射物镜镜头17像方焦平面入瞳边缘处。反射镜16的主要作用是折转光路、减小系统轴向尺寸。全反射物镜镜头17在物方通过浸没油与玻片18折射率加以匹配。这样，经过全反射物镜镜头17的入射照明光将由大角度平行出射，并在玻片18上产生全反射，并最终照明放置于玻片18上的样品5，产生与图1所述系统结构相同的效果。

与原有结构相比，经过改进照明方式后，系统结构更为简单，从而使系统搭建难度和搭建成本进一步降低。

实施例3

除了实施例1中所述的方式可以对照明方式加以改进外，还可以使用偏心光阑的方式加以改进。

如图9所示为实现本发明的基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像装置使用偏心光阑改进照明方式后的结构原理图。

如图9所示，经过改进照明方式后，基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像系统的装置，包括：激光光源13，偏心光阑19，全反射物镜镜头17，玻片18，显微镜3，计算机4，样品5。

激光光源13，偏心光阑19，全反射物镜镜头17，玻片18，显微镜3，样品5位于同轴光路上。从激光光源13出射的入射照明光，经过偏心光阑19挡光后(如图10所示)，只有边缘的细光束能够入射到全反射物镜镜头17内。全反射物镜镜头17在物方通过浸没油与玻片18折射率加以匹配。这样，经过全反射物镜镜头17的入射照明光将由大角度平行出射，并在玻片18上产生全反射，并最终照明放置于玻片18上的样品5，产生与图1所述系统结构相同的效果。

当需要改变照明方向时，只需要将偏心光阑19绕光轴旋转一个角度即可加以实现。因此其结构和原理更为简单，但是该照明光路是由挡光实现的，因此降低了激光光源13的能量利用率。

Claims (9)

1.一种基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

1)将准直后的入射照明光倾斜照射在基板介质分界面上产生全反射，在基板介质分界面另一侧产生倏逝场；

2)使用倏逝场对样品表面进行照明，并通过显微镜从远场接收样品表面的强度图像；

3)对所述的强度图像进行傅里叶变换得到相应频谱，使用移频算法对所得到的频谱进行还原，并得到相应的频谱还原图像；

4)绕样品多次改变入射照明光方向，直至入射照明光方向覆盖0～360°，每次均重复步骤1)～步骤3)，得到不同方向下的频谱还原图像；

5)对不同方向下的频谱还原图像进行叠加，得到完整的高频频谱图像；

6)对所述的完整高频频谱图像进行傅里叶反变换，得到观察样品的超分辨显微图像。

2.如权利要求1所述的基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像方法，其特征在于，所述的入射照明光为具有相同偏振方向、且波长在380～780nm范围内的可见单色线偏振光。

3.如权利要求1所述的基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像方法，其特征在于，步骤4)中的入射照明光方向改变的次数由下式决定：

NUM＝π/arcsin(k_m/k_e)

式中：k_m为显微镜最大截止频率，k_e为倏逝场横向光波矢。

4.一种基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像装置，其特征在于，包括：

用于产生入射照明光的光源组；

用于对所述入射照明光进行全反射且带有基板介质分界面的棱镜，该基板介质分界面的背面放置有样品；

用于收集样品表面的强度图像的显微镜；

以及用于对所述强度图像进行计算和控制的计算机；

所述的光源组包括绕棱镜布置且依序点亮的多个子光源，且所有子光源处于同一水平面上，每个子光源包括沿光路依次布置的LED、窄带滤色片、准直模块和偏振片。

5.如权利要求4所述的基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像装置，其特征在于，所述棱镜为倒置的多棱锥形，所述的基板介质分界面位于棱镜的顶部。

6.一种基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像装置，其特征在于，包括沿光路依次布置的：

用于产生入射照明光的激光光源；

用于改变入射照明光的传播方向的光路转换装置；

用于将入射照明光改变为大角度平行光束的全反射物镜镜头；

用于对所述入射照明光进行全反射且带有基板介质分界面的玻片，该玻片上放置有样品；

用于收集样品表面的强度图像的显微镜；

以及用于对所述强度图像进行计算和控制的计算机。

7.如权利要求6所述的基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像装置，其特征在于，所述光路转换装置为振镜。

8.如权利要求7所述的基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像装置，其特征在于，所述振镜和全反射物镜镜头之间设有，用于将对所述振镜出射的入射照明光进行聚焦的聚焦镜。

9.如权利要求6所述的基于倏逝场照明的移频超分辨显微成像装置，其特征在于，所述的光路转换装置为偏心光阑。