CN105301753B - 一种微纳照明下的多重散射超分辨显微方法与装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微纳照明下的多重散射超分辨显微方法，包括以下步骤：1)利用微纳光源作用于具有单一空间频率的微纳结构样品，使微纳结构样品内部发生多重散射；2)通过显微镜对单一空间频率样品进行光场成像，并对像进行频谱分析，得到所述微纳光源的频移量；3)更换具有不同单一空间频率的结构样品，建立所述的微纳光源与各空间频率对应的频移数据库；4)利用所述的微纳光源观察待测样品，并对待测样品进行360度的照射，在照射过程中应用显微镜进行成像，得到相应的频移图像；5)根据所述的频移数据库，对频移图像进行频谱还原和重构，得到待测样品的超分辨显微图像。本发明还公开了一种微纳照明下的多重散射超分辨显微装置。

Description

一种微纳照明下的多重散射超分辨显微方法与装置

技术领域

本发明涉及超分辨显微领域，尤其涉及一种微纳照明下的多重散射超分辨显微方法与装置。

背景技术

由阿贝衍射极限理论可知，常规远场光学显微镜的极限分辨率可表示为其中λ为所用照明光的波长，NA为所用显微物镜的数值孔径。因此，在可见光波段，光学显微镜的分辨率被限制在200纳米左右。然而，随着生物医学等技术的发展，研究人员们已经开始对生物组织和细胞在纳米尺度上进行分析，所观察的样品性质也多种多样，因此需要一种对样品的普适性强的可以突破常规衍射极限的新技术，来实现超分辨显微。

衍射极限限制分辨率也可以从傅利叶频谱的角度进行分析，即二维物体都是由一系列角谱按照相应的权重叠加而成的。其中高频分量对应的是物体的细节信息，但由于光波的波矢有限，无法承载这些高频信息到达远场，而只能以倏逝波的形式在近场存在。所谓的超分辨即将这些高频信息从近场提取出来。比如SNOM技术，是通过近场探针与样品表面相互作用来提取近场信息。再比如SIL技术，是通过大折射率固体浸没使光波波矢增加，使近场更多的高频信息可以从倏逝波的形式变为行波传到远场。但以上技术或者需要昂贵的设备和复杂的后续处理，或者对应的分辨率相对有限。

发明内容

本发明从一种全新的角度出发，提出利用微纳照明下的多重散射效应来提取近场信息。该方法简易、快捷、可靠，通过微纳光源与样品结构相互作用，使样品的频谱发生缩放，高频变为低频传到远场，在样品表面以下形成一放大的虚像，并得到λ/10以上的分辨率。在本发明的多重散射超分辨显微方法中，包括如何使微纳光源与待分辨结构相互作用、如何得到所有方向的高频分量、如何对输出结果进行处理。

一种微纳照明下的多重散射超分辨显微方法，包括以下步骤：

1)利用微纳光源作用于具有单一空间频率的微纳结构样品(如光栅)，使微纳结构样品内部发生多重散射；

2)通过显微镜对微纳结构样品进行光场成像，并对像进行频谱分析，得到所述微纳光源的频移量；

3)更换不同的具有单一空间频率的微纳结构样品，重复步骤1)和步骤2)中的操作，利用微纳光源在各空间频率下的频移量建立频移数据库；

4)利用所述的微纳光源观察待测样品，并对出射光的方向进行360度的扫描或对待测样品进行360度的照射，在扫描或照射过程中应用与步骤2)中相同的显微镜进行成像，得到相应的频移图像；

5)根据所述的频移数据库，对频移图像进行频谱还原和重构，得到待测样品的超分辨显微图像。

多重散射是指样品中的每一散射点都可以作为发射球面波的子波源，发射的子球面波相互叠加后重新分布于物体中，之后每一点再作为子波源对新的光场产生散射，如此循环下去，最终得到稳定存在的散射场。多重散射场会将物体高频信息传达到远场。然而，一般的光学显微照明方式会引入相当多的噪声，使由多重散射所加载的高频信息完全被淹没，难以提取。微纳结构由于尺度上与光波长可比拟，它所提供的照明则可以有效地压制噪声，使多重散射对高频信息的加载和提取变得简单易操作，且具有分辨率高、实时成像、装置简单、处理方便、信噪比好等特点，可以很好地应用于荧光及非荧光样品的检测之中。

在本发明中，微纳光源有多种实施方式，在这里我们提供几种优选的实施方式：

优选的，所述的微纳光源为内部定向传输有耦合光的平板波导，其厚度小于1微米，所述的微纳结构样品和待测样品置于或嵌入所述的平板波导表面。

优选的，所述的微纳光源为内部通有耦合光的微纳光纤，其直径小于1微米，所述微纳光纤的出射光用于照亮所述的微纳结构样品和待测样品。

并列优选的，所述的微纳光源为受外界激发产生自发辐射的纳米线，微纳结构样品和待测样品被纳米线的出射光照亮，或者所述的纳米线环绕样品并沿样品轮廓进行弯曲。

其中，微纳光纤和平板波导为被动发光的微纳装置，需要将外界光耦合到其中并保证传播，半导体纳米线可主动发光，需要搭建激发光路使其自发辐射。采用平板波导，微纳光源与待观察结构相互作用，需使微纳波导表面与待观察结构紧密贴合；若采用微纳光纤或纳米线，需调整微纳光源的出射方向及其与样品之间的距离，才能使样品内部发生有效散射。

纳米线作为微纳光源进行观察时，要求纳米线表面形貌良好，直径在1微米以下，可根据样品对纳米线直径的选择进行适当调整。纳米线的材料可以是单一半导体材料比如CdS、CdSe、GaN、ZnO，也可以是掺杂、引入缺陷或多元半导体材料。

同时，本发明还提供了一种微纳照明下的多重散射超分辨显微装置，包括：

微纳光源，用于使样品内部发生多重散射，抑制噪声；

显微镜，用于对发生多重散射后的样品进行光场成像，得到频移图像；

CCD：用于能显微镜成像进行拍照；

计算机，用于对频移图像进行频谱分析，建立频移数据库；以及后续样品图的还原和重构，得到超分辨显微图像。

优选的，所述的微纳光源为内部定向传输有耦合光的平板波导，所述样品置于或嵌入所述的平板波导表面，该平板波导的底部依次设有反射层和波导衬底，也可以选择合适材料既充当反射层也充当衬底；衬底及其上微纳波导、样品结构放在显微镜的载物台上。耦合光在可见或近紫外波段，平板波导厚度要在1微米以下，可从几百纳米到几十纳米不等。厚度变小，分辨率会变高，但同时波导的传导能力会变差，可能会限制到观察的空间范围。

衬底的选择可以透明也可以不透明，它的作用主要是支撑微纳装置。但在需要为波导提供反射面且反射层就由衬底本身来充当的情况下，最好选择与波导层折射率差大的材料作为衬底。

并列优选的，所述的微纳光源为内部通有耦合光的微纳光纤，直径小于1微米，显微镜的载物台上设有衬底，所述的样品置于或嵌入衬底表面。

微纳光纤作为一种一维微纳结构，方便转移和操纵。微纳光纤通光后，使其端头与待观察结构靠近，并调整端头和结构之间的距离及光注入的方向，使得光场以尽可能大的横向分量，尽可能小的场变形注入到结构上，同样在结构内部发生多重散射，叠加后的总光场传到远场被显微物镜、目镜成像，构成一个位于二维物体表面下方的放大的虚像。由于通过这种方法引入的倏逝波方向比较纯粹，因此有效地避免了不同空间高频分量之间的串扰。

当通在光纤里的光频较为单一时，比如激光，那么光场在样品结构上发生多重散射的过程中会有较为明显的干涉效应，在得到最终的超分辨图像过程中，需要通过图像处理消除产生的干涉条纹，如果选择通宽波段的光进行照明，则可得到更为清晰干净的图像。

并列优选的，所述的微纳光源为受外界激发产生自发辐射的纳米线，所述显微镜的显微物镜和显微目镜之间设有半透半反镜，用于照明光与激发光之间的光路切换。

将纳米线通过分子间作用力或更为稳固的粘合工艺使其与可三维移动的精密装置连接，将显微镜的照明光换成激发波段的光以激发纳米线发生自发辐射，从纳米线端头出射的宽范围荧光在样品结构上多重散射。这样省去了需要将照明微纳光纤与外界激光耦合相连的麻烦，使微纳光纤操纵起来更加自由。

以上两种优选方法无需对观察样品进行处理，而只需要灵活地操纵通光或自身发光的微纳光纤，调整其位置与方向对样品进行扫描，最终便可得到包含各个方向高频信息的超分辨图像。

进一步优选的，所述的纳米线和样品放置在衬底波导层上，且该纳米线环绕样品沿样品轮廓弯曲布置，该衬底波导层的底部为反射层或反射层和衬底层。

在这种情况中，纳米线与多层衬底结合引入双重光路。将纳米线置于硅基亚波长二氧化硅层衬底上，并引入激发光使纳米线发生自发辐射，此时衬底上分布于纳米线周围的结构由于受到纳米线微纳光源的照明，沿照明光方向的高频信息便可实现超分辨。同时衬底表面仍会有一层倏逝波的存在，方向与纳米线荧光方向一致。由于纳米线材料的折射率高，表面倏逝波的横向分量往往也较大，横向分量的增大可以有效地对分辨率进行提高。

沿着纳米线荧光方向的倏逝波分量处于绝对优势，如果通过调整纳米线的方位来调控倏逝波方向，使其方向与超过衍射极限的高频分量的方向一致，就可以实现相应高频分量的超分辨。

本方案中的核心元件纳米线的直径设置为200nm-400nm，具有非常大的表面积与体积比，非常柔软，而其长度则可高达几十微米甚至几百微米，因此可以根据所要观察的物体的轮廓而随意弯曲成最适宜观察的形状，从而实现精细物体的高分辨全貌观察。

本方案中的多层衬底要求放置样品的波导层厚度在1微米以下。

利用微纳光纤与纳米线之间的相互作用力，可以方便地实现纳米线的空间转移和弯曲，而且由于纳米线与衬底之间较强的相互吸引力，使得纳米线被弯曲后无需再借助任何其它的外力使其保持相应的形状，从而使得超分辨观察变得非常方便、简易、可靠性高、稳定性强。

另外，本发明也可以采用纳米线粘合工艺，将纳米线围成一个圆以提供所有二维方向上的照明，并与一三维精密移动装置连接，以对样品进行大范围扫描全貌成像。

本发明具有以下有益的技术效果：

1、实现了二维超分辨，分辨能力在λ/10以上；

2、对样品的类型没有特殊要求，既可以是荧光样品也可以是非荧光样品；

3、装置简易，操作方便，实时性强，且无需复杂的数据处理。

附图说明

图1为本发明中显微镜的结构示意图；

图2为实施例1中的微纳光源与结构耦合示意图；

图3为实施例2中的微纳光源与结构耦合示意图；

图4为实施例3中的微纳光源与结构耦合示意图；

图5为实施例2中观察的多道结构的结果图；

图5中的a图、b图和c图为采用微纳光纤观察多道槽结构所拍照片；

图5中的d图、e图和f图为采用纳米线观察多道槽结构所拍照片；

图6为实施例3中观察的Y形结构的结果图；

图7为操纵纳米线的微纳光纤图，插入图为标尺。

具体实施方式

一种微纳照明下的多重散射超分辨显微装置，包括微纳光源、光学显微镜和计算机。微纳光源用于使样品内部发生多重散射；显微镜用于对发生多重散射后的样品进行光场成像，得到频移图像；CCD用于对显微成的移频像进行拍照；计算机用于对频谱进行分析，得到频移数据库，以及对后续样品频移图像进行频谱还原和重构，得到超分辨显微图像。

光学显微镜的结构如图1所示，包括放置样品的载物台1、显微物镜2、显微目镜7、半透半反镜3或半透半反镜4、以及成像用CCD。半透半反镜3和半透半反镜4用于光路5或光路6的选择切换，两个光路分别是普通照明光路和激发照明光路。

本次实施选用的衬底是硅材料，一是因为硅上非常容易镀二氧化硅波导层，二是因为硅的折射率3.5与二氧化硅折射率1.5相差很大。

上述装置的具体实施步骤如下：

(1)利用微纳光源作用于具有单一空间频率的微纳结构样品(如光栅)，使微纳结构样品内部发生多重散射；

(2)通过显微镜对微纳结构样品进行光场成像，并对像进行频谱分析，得到微纳光源在此空间频率下的频移量；

(3)更换一系列具有不同单一空间频率的微纳结构样品，重复步骤(1)和步骤(2)中的操作，利用得到的频移函数建立频移数据库；

(4)针对具体的复杂样品，利用微纳光源作用于该样品，并对待测样品进行360度的扫描或照射，在此过程中应用步骤(2)中相同的光学显微镜进行成像，得到相应的频移图像；

(5)计算机根据步骤(3)中的频移数据库，对步骤(4)中的频移图像进行频谱还原和重构，得到复杂样品的超分辨显微图像。

实施例1

如图2所示，选用平板波导作为本实施例中的微纳光源，将所要观察的样品22置于厚度为300纳米的平板波导上，样品位于波导层23表面，衬底位于波导层23底部，衬底为反射层24，将500nm波长的光21通过自由光路或光纤束耦合到波导中形成微纳光源，耦合光可选用可见或近紫外波段。

波导表面场散射的过程中，会构成一个位于二维物体表面下方的放大的虚像，将整个装置置于高倍光学显微镜下观察，调焦使成像清晰。用500万像素CCD对成像进行拍照，根据相应的频移数据库，在频域对图像进行处理，还原。还原后得到无变形、包含样品绝大多数高频分量的照片。

实施例2

如图3所示，采用波导型微纳光纤作为本实施例中的微纳光源，将样品33置于高倍光学显微镜载物台上的衬底32上，使其位于物镜焦面附近。将微纳光纤31固定于精密三维位移台上，以与水平面成7度角(根据显微镜载物台的高度及固定微纳光纤的三维位移台的高度确定，具有均匀的照明效果)的方向靠近样品。将外界光源发出的激光或宽带光耦合到微纳光纤31中。调节微纳光纤31与样品33之间的距离，使目标被微纳光纤出射光照亮，轻微调焦，使成像清晰。转动载物台或调节微纳光纤，进行360度的扫描。根据频移函数，在频域对图像进行处理，还原。本实施例中观察多道槽结构所拍照片如图5中的图a、图b和图c所示。

本实施例中，还可以采用自发光型半导体纳米线替换波导型微纳光纤为作为微纳光源，将激发光耦合到显微镜照明光路中。将样品置于高倍光学显微镜下，使其位于物镜焦面附近。将纳米线固定与精密三维位移台上，以与水平面成7度角的方向靠近样品。打开激发光，激发半导体纳米线使其自发辐射。调节纳米线与样品之间的距离，使目标被纳米线端头出射光照亮。轻微调焦，使成像清晰。转动载物台或调节微纳光纤，进行360度的扫描。根据频移数据库，在频域对图像进行处理，还原。本实施例中观察多道槽结构所拍照片如图5中的图d、图e和图f所示。

在a图、b图和c图中，所用激光波长为630纳米，衍射极限为λ/2＝315纳米。在d图、e图和f图中，所用照明光是510nm，衍射极限为λ/2＝255纳米。多道结构的槽宽槽距都为175nm，小于衍射极限。

实施例3

如图4所示，采用纳米线与双层衬底结合引入双重光路作为本实施中的微纳光源，将激发光耦合到显微镜照明光路中，把样品43置于硅基二氧化硅衬底42上或嵌入到衬底表面，衬底底部为反射层44，二氧化硅层的厚度是300纳米，将衬底42置于高倍光学显微镜下，使样品43位于物镜焦面上。使用与三维精密位移台连接的微纳光纤(如图7所示)，对纳米线41进行三维微纳操作，将直径300纳米的CdS掺杂纳米线置于样品43附近的衬底上，根据样品43的轮廓对纳米线41进行弯曲。使纳米线41与衬底42紧密贴合。打开激发光，激发半导体纳米线使其自发辐射，微调焦，使成像清晰。根据频移数据库，在频域对图像进行处理，还原。本实施例中Y形结构实验结果见图6。

Claims (8)

1.一种微纳照明下的多重散射超分辨显微方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)利用微纳光源作用于具有单一空间频率的微纳结构样品，使微纳结构样品内部发生多重散射；

所述的微纳光源为受外界激发产生自发辐射的纳米线，所述纳米线的直径设置为200nm-400nm，纳米线的辐射光通过接触耦合进入衬底平板波导，微纳结构样品和待测样品被纳米线的辐射光照亮，所述的纳米线环绕样品并沿样品轮廓进行弯曲；

2)通过显微镜对微纳结构样品进行光场成像，并对像进行频谱分析，得到所述微纳光源在该空间频率下的频移量；

3)更换具有不同单一空间频率的微纳结构样品，重复步骤1)和步骤2)中的操作，利用微纳光源在各空间频率下的频移量建立频移数据库；

4)利用所述的微纳光源观察待测样品，并对待测样品进行360度的照射或扫描，在此过程中应用显微镜进行成像，得到相应的频移图像；

5)根据所述的频移数据库，对频移图像进行频谱还原和重构，得到待测样品的超分辨显微图像。

2.如权利要求1所述的微纳照明下的多重散射超分辨显微方法，其特征在于，所述的微纳光源为内部定向传输有耦合光的平板波导，其厚度小于1微米，耦合光来自于与自发辐射纳米线之间的接触耦合，所述的微纳结构样品和待测样品置于或嵌入所述的平板波导表面。

3.如权利要求1所述的微纳照明下的多重散射超分辨显微方法，其特征在于，所述的微纳光源为内部通有耦合光的微纳光纤，其直径小于1微米，所述微纳光纤的出射光用于照亮所述的微纳结构样品和待测样品。

4.一种微纳照明下的多重散射超分辨显微装置，其特征在于，包括：

微纳光源，用于使样品内部发生多重散射；所述的微纳光源为受外界激发产生自发辐射的纳米线，所述纳米线的直径设置为200nm-400nm，纳米线的辐射光通过接触耦合进入衬底平板波导，照亮置于平板波导表面的样品，该纳米线环绕样品且沿样品轮廓弯曲布置；

显微镜，用于对发生多重散射后的样品进行光场成像，得到频移图像；

光路切换装置：用于显微镜照明光路与纳米线激发光路之间的切换；

CCD，用于对显微镜成像进行拍照；

计算机，用于对频移图像进行频谱还原和重构，得到超分辨显微图像。

5.如权利要求4所述的微纳照明下的多重散射超分辨显微装置，其特征在于，所述的微纳光源为内部定向传输有耦合光的平板波导，其厚度小于1微米，耦合光来自于与自发辐射纳米线之间的接触耦合，所述样品置于或嵌入所述的平板波导表面，该平板波导的底部依次设有反射层和波导衬底。

6.如权利要求4所述的微纳照明下的多重散射超分辨显微装置，其特征在于，所述的微纳光源为内部通有耦合光的微纳光纤，其直径小于1微米，显微镜的载物台上设有衬底，所述的样品置于或嵌入衬底表面。

7.如权利要求4所述的微纳照明下的多重散射超分辨显微装置，其特征在于，所述的微纳光源为受外界激发产生自发辐射的纳米线，其直径小于1微米，显微镜的载物台上设有衬底，所述的样品置于或嵌入衬底表面。

8.如权利要求4所述的微纳照明下的多重散射超分辨显微装置，其特征在于，所述的纳米线和样品放置在衬底波导层上，该衬底波导层的底部为反射层。