CN112816410A - 一种tirf照明的深度成像方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种TIRF照明的深度成像方法和系统，该方法包括：TIRF照明时入射光在待成像样品前发生全反射，并产生倏逝波，产生的倏逝波透射到待成像样品上；改变入射光的入射角度，倏逝波的透射深度改变；不同透射深度的倏逝波分别照射到待成像样品时，STORM成像单元对待成像样品成像，将所有的待成像样品图像通过预设的图像重构算法进行计算，得到不同深度的待成像样品成像图像，实现深度成像。本发明基于STORM+TIRF的方式，通过不同的TIRF照明，实现一定深度方向的成像。

Description

一种TIRF照明的深度成像方法和系统
技术领域
本发明涉及显微成像技术领域，具体涉及一种TIRF照明的深度成像方法和系统。
背景技术
STORM属于显微镜成像领域，其原理是当光入射到带有荧光染色的细胞后，细胞会发出随机的荧光闪烁点。通过多次的成像，最终可以得到每个位置的荧光闪烁点，而闪烁点的位置即是细胞的位置点。当光照射到细胞时，因为荧光的随机闪烁，一次一次闪烁后，最终可以得到每个闪烁点的位置，就可以得到细胞的不同位置的图像。即对荧光细胞成像时候，通过荧光分子的随机闪烁过一段时间的图片来将闪烁点重构出来，以实现超分辨的成像。
TIRF照明属于全反射并产生倏逝波，也就是在全反射时光会在光密介质中内反射，根据物理光学部分，光会在光疏介质中产生薄薄的一层倏逝波。典型的有效照明下渗透度只有50nm到100nm，只有临近盖玻片表面(进场)的荧光分子才能被激发，远场分子不受激发。
STORM显微镜成像采用TIRF照明产生的倏逝波照射带有荧光染色的细胞，TIRF照明时候可以让照明区域更加薄，使得成像时候的杂散光降低，提高成像的信噪比。但是因为倏逝波仅仅只是薄薄的一层，而且只能贴着靠近光密介质的光疏介质中传播，因此STORM+TIRF的组合无法完成深度的成像。
发明内容
本发明的目的是为了克服以上现有技术存在的不足，提供了一种能实现深度成像的TIRF照明的深度成像方法和系统。
本发明的目的通过以下的技术方案实现：
一种TIRF照明的深度成像方法，包括：TIRF照明时入射光在待成像样品前发生全反射，并产生倏逝波，产生的倏逝波透射到待成像样品上；改变入射光的入射角度，倏逝波的透射深度改变；不同透射深度的倏逝波分别照射到待成像样品时，STORM成像单元对待成像样品成像，将所有的待成像样品图像通过预设的图像重构算法进行计算，得到不同深度的待成像样品成像图像，实现深度成像。
优选地，一种TIRF照明的深度成像方法包括：
S1，TIRF照明时入射光的入射角度为θ1，透射深度为H1，通过STORM的荧光成像为S1；
S2，改变入射角度为θ2，此时透射深度为H2，通过STORM的荧光成像为S2；其中H2>H1；
S3，计算透射深度H1-H2对应的待成像样品图像为S2-S1；
S4，重复改变不同的入射角度，直到得到透射深度Hn-Hn-1对应的待成像样品图像Sn-Sn-1，实现不同深度的待成像样品成像。
优选地，入射光的入射角度与倏逝波的透射深度的关系表达式为：
Figure BDA0002878807050000021
其中，θ为入射光的入射角度，d为倏逝波的透射深度，n1为TIRF照明中待成像样品前的物镜的折射率，n2为待成像样品的折射率。
优选地，一种TIRF照明的深度成像方法还包括：对不同深度的倏逝波照明进行亮度补偿，校正因为倏逝波深度导致的成像亮度变化。
一种TIRF照明的深度成像系统，包括：STORM成像单元和TIRF照明单元；TIRF照明单元分别产生不同透射深度的倏逝波照射到待成像样品上，STORM成像单元均对待成像样品成像；待成像样品夹持在上玻片和下玻片之间，下玻片和物镜之间填充浸没油，下玻片、浸没油和物镜的折射率相同，且均大于待成像样品的折射率。
优选地，TIRF照明单元包括：照明光源、中间折返镜和物镜；照明光源发出的激光经中间折返镜反射，再经物镜透射后照射到下玻片上发生全反射，并产生倏逝波照射到待成像样品上。
优选地，照明光源包括：光纤光源和准直透镜组；光纤光源发出的激光经过准直透镜组后照射到中间折返镜。
优选地，TIRF照明单元分别产生不同透射深度的倏逝波包括：通过改变TIRF照明单元的动件，来改变入射到待成像样品的入射角，并通过测量动件的移动位置和此时入射到待成像样品上的入射角关系，获得移动位置和入射角的关系曲线。
优选地，TIRF照明单元分别产生不同透射深度的倏逝波照射到待成像样品上，STORM成像单元均对待成像样品成像包括：
步骤一：移动动件到位置L0，倏逝波的深度为d0，此时STORM成像相机聚焦到d0处清晰成像，此时待成像样品成像为S0；
步骤二：移动动件到L1，对应的倏逝波深度为d0+△d，此时倏逝波深度为d1＝d0+△d，此时待成像样品成像为S1；其中，△d为倏逝波的透射深度进行N等分之后的等分间隔；
步骤三：移动动件到L2，对应的倏逝波深度为d0+2△d，此时待成像样品成像为S3；
步骤四：继续移动动件，直到动件位置为Lm，对应的倏逝波深度为d0+m△d，移动待成像样品前的物镜，移动距离为m△d/n1,此时物镜聚焦在Lm,，此时倏逝波深度为dm＝d0+m△d，待成像样品成像为Sm；
步骤五：重复步骤二至步骤四，移动动件，直到动件的位置为LN时，此时待成像样品成像为SN；
步骤六：将相邻的两幅待成像样品成像依次相减，分别得到△S1，△S2，…△SN，这些相减得到的图形，就是不同深度下的待成像样品图像。
优选地，动件包括：准直透镜组、光纤光源和照明光源中的任意一种。
本发明相对于现有技术具有如下优点：
本发明在TIRF照明时通过改变入射光的入射角度，倏逝波的透射深度改变；不同透射深度的倏逝波分别照射到待成像样品时，STORM成像单元对待成像样品成像，将所有的待成像样品图像通过预设的图像重构算法进行计算，得到不同深度的待成像样品成像图像，实现深度成像。因此，本发明基于STORM+TIRF的方式，通过不同的TIRF照明，实现一定深度方向的成像。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明的TIRF照明的深度成像方法的流程示意图。
图2为本发明的入射光的入射角度与倏逝波的透射深度的关系图。
图3为本发明的深度光强和照明深度的关系图。
图4为本发明的物镜全反射角度、最大孔径角与浸没油、待成像样品的关系图。
图5为本发明的TIRF照明的深度成像系统移动准直透镜组的示意图。
图6为本发明的TIRF照明的深度成像系统光纤光源的示意图。
图7为本发明的TIRF照明的深度成像系统移动照明光源的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
一种TIRF照明的深度成像方法，包括：TIRF照明时入射光在待成像样品前发生全反射，并产生倏逝波，产生的倏逝波透射到待成像样品1013上；改变入射光的入射角度，倏逝波的透射深度改变；不同透射深度的倏逝波分别透射到待成像样品1013时，STORM成像单元对待成像样品1013成像，将所有的待成像样品1013图像通过预设的图像重构算法进行计算，得到不同深度的待成像样品1013成像图像，实现深度成像。
需要说明的是，预设的图像重构算法是现有技术，不是本发明的改进点。且STORM原理也是现有技术。待成像样品1013为细胞。
参见图1，一种TIRF照明的深度成像方法具体为，包括：
S1，TIRF照明时入射光的入射角度为θ1，透射深度为H1，通过STORM的荧光成像为S1；
S2，改变入射角度为θ2，此时透射深度为H2，通过STORM的荧光成像为S2；其中H2>H1；
S3，计算透射深度H1-H2对应的待成像样品1013图像为S2-S1；
S4，重复改变不同的入射角度，直到得到透射深度Hn-Hn-1对应的待成像样品1013图像Sn-Sn-1，实现不同深度的待成像样品1013成像。
参见图2，入射光的入射角度与倏逝波的透射深度的关系表达式为：
Figure BDA0002878807050000051
其中，θ为入射光的入射角度，d为倏逝波的透射深度，n1为TIRF照明中待成像样品1013前的物镜102的折射率，n2为待成像样品1013的折射率。根据上述公式，入射角度越大，倏逝波的透射深度越小，也就是按照倏逝波照明深度和亮度的关系进行光强。
一种TIRF照明的深度成像方法还包括：对不同深度的倏逝波照明进行亮度补偿，校正因为倏逝波深度导致的成像亮度变化。如图3所示，不同深度光强和照明深度成反指数关系。
上述一种TIRF照明的深度成像方法适用的一种TIRF照明的深度成像系统，包括：STORM成像单元和TIRF照明单元；TIRF照明单元分别产生不同透射深度的倏逝波照射到待成像样品1013上，STORM成像单元均对待成像样品1013成像；待成像样品1013夹持在上玻片1011和下玻片1012之间，下玻片1012和物镜102之间填充浸没油，下玻片1012、浸没油和物镜102的折射率相同，且均大于待成像样品1013的折射率。
在本实施例，浸没油的折射率n1，待成像样品1013的折射率为n2＝1.38；全内发射角度和最大孔径角举例如图4所示。
TIRF照明单元包括：照明光源104、中间折返镜103和物镜102；照明光源104发出的激光经中间折返镜103反射，再经物镜102透射后照射到下玻片1012上发生全反射，并产生倏逝波照射到待成像样品1013上。更进一步地，照明光源104包括：光纤光源10421和准直透镜组10411；光纤光源10421发出的激光经过准直透镜组10411后照射到中间折返镜103。
TIRF照明单元分别产生不同透射深度的倏逝波包括：通过改变TIRF照明单元的动件，来改变入射到待成像样品1013的入射角，并通过测量动件的移动位置和此时入射到待成像样品1013上的入射角关系，获得移动位置和入射角的关系曲线。
TIRF照明单元分别产生不同透射深度的倏逝波照射到待成像样品1013上，STORM成像单元均对待成像样品1013成像包括：
步骤一：移动动件到位置L0，倏逝波的深度为d0，此时STORM成像相机聚焦到d0处清晰成像，此时待成像样品1013成像为S0；
步骤二：移动动件到L1，对应的倏逝波深度为d0+△d，此时倏逝波深度为d1＝d0+△d，此时待成像样品1013成像为S1；其中，△d为倏逝波的透射深度进行N等分之后的等分间隔；
步骤三：移动动件到L2，对应的倏逝波深度为d0+2△d，移动待成像样品1013前的物镜102，移动距离为2△d/n1,此时物镜102聚焦在L2,，此时倏逝波深度为d2＝d0+2△d，待成像样品1013成像为S2；
步骤四：重复上述步骤二和步骤三，移动动件，直到动件的位置为LN时，此时待成像样品1013成像为SN；在上述步骤中，每次同样位置的物镜102会对两个不同倏逝波深度进行成像；
步骤五：将相邻的两幅待成像样品1013成像依次相减，分别得到△S1，△S2，…△SN，这些相减得到的图形，就是不同深度下的待成像样品1013图像。
当△d比较小时，可以适当选择同样位置的物镜102对m个不同倏逝波深度进行成像，也就是只有到m个动件移动位置后，再次调整物镜102位置再对接下来m个动件移动位置进行成像。如上步骤为特例，m＝2；
移动动件包括：移动准直透镜组10411、移动光纤光源10421和移动照明光源104中的任意一种。如图5为移动准直透镜组10411改变TIRF的入射角。如图6为移动光纤光源10421改变TIRF的入射角。如图7为移动照明光源104，改变准直透镜组10411和光纤的整体的相对角度改变TIRF的入射角。
上述具体实施方式为本发明的优选实施例，并不能对本发明进行限定，其他的任何未背离本发明的技术方案而所做的改变或其它等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种TIRF照明的深度成像方法，其特征在于，包括：
TIRF照明时入射光在待成像样品前发生全反射，并产生倏逝波，产生的倏逝波透射到待成像样品上；改变入射光的入射角度，倏逝波的透射深度改变；不同透射深度的倏逝波分别照射到待成像样品时，STORM成像单元对待成像样品成像，将所有的待成像样品图像通过预设的图像重构算法进行计算，得到不同深度的待成像样品成像图像，实现深度成像。
2.根据权利要求1所述的TIRF照明的深度成像方法，其特征在于，包括：
S1，TIRF照明时入射光的入射角度为θ1，透射深度为H1，通过STORM的荧光成像为S1；
S2，改变入射角度为θ2，此时透射深度为H2，通过STORM的荧光成像为S2；其中H2>H1；
S3，计算透射深度H1-H2对应的待成像样品图像为S2-S1；
S4，重复改变不同的入射角度，直到得到透射深度Hn-Hn-1对应的待成像样品图像Sn-Sn-1，实现不同深度的待成像样品成像。
3.根据权利要求1所述的TIRF照明的深度成像方法，其特征在于，入射光的入射角度与倏逝波的透射深度的关系表达式为：
Figure FDA0002878807040000011
其中，θ为入射光的入射角度，d为倏逝波的透射深度，n1为TIRF照明中待成像样品前的物镜的折射率，n2为待成像样品的折射率。
4.根据权利要求1所述的TIRF照明的深度成像方法，其特征在于，还包括：对不同深度的倏逝波照明进行亮度补偿，校正因为倏逝波深度导致的成像亮度变化。
5.一种TIRF照明的深度成像系统，其特征在于，包括：STORM成像单元和TIRF照明单元；TIRF照明单元分别产生不同透射深度的倏逝波照射到待成像样品上，STORM成像单元均对待成像样品成像；待成像样品夹持在上玻片和下玻片之间，下玻片和物镜之间填充浸没油，下玻片、浸没油和物镜的折射率相同，且均大于待成像样品的折射率。
6.根据权利要求5所述的TIRF照明的深度成像系统，其特征在于，TIRF照明单元包括：照明光源、中间折返镜和物镜；照明光源发出的激光经中间折返镜反射，再经物镜透射后照射到下玻片上发生全反射，并产生倏逝波照射到待成像样品上。
7.根据权利要求6所述的TIRF照明的深度成像系统，其特征在于，照明光源包括：光纤光源和准直透镜组；光纤光源发出的激光经过准直透镜组后照射到中间折返镜。
8.根据权利要求7所述的TIRF照明的深度成像系统，其特征在于，TIRF照明单元分别产生不同透射深度的倏逝波包括：
通过改变TIRF照明单元的动件，来改变入射到待成像样品的入射角，并通过测量动件的移动位置和此时入射到待成像样品上的入射角关系，获得移动位置和入射角的关系曲线。
9.根据权利要求8所述的TIRF照明的深度成像系统，其特征在于，TIRF照明单元分别产生不同透射深度的倏逝波照射到待成像样品上，STORM成像单元均对待成像样品成像包括：
步骤一：移动动件到位置L0，倏逝波的深度为d0，此时STORM成像相机聚焦到d0处清晰成像，此时待成像样品成像为S0；
步骤二：移动动件到L1，对应的倏逝波深度为d0+△d，此时倏逝波深度为d1＝d0+△d，此时待成像样品成像为S1；其中，△d为倏逝波的透射深度进行N等分之后的等分间隔；
步骤三：移动动件到L2，对应的倏逝波深度为d0+2△d，此时待成像样品成像为S3；
步骤四：继续移动动件，直到动件位置为Lm，对应的倏逝波深度为d0+m△d，移动待成像样品前的物镜，移动距离为m△d/n1,此时物镜聚焦在Lm,，此时倏逝波深度为dm＝d0+m△d，待成像样品成像为Sm；
步骤五：重复步骤二至步骤四，移动动件，直到动件的位置为LN时，此时待成像样品成像为SN；
步骤六：将相邻的两幅待成像样品成像依次相减，分别得到△S1，△S2，…△SN，这些相减得到的图形，就是不同深度下的待成像样品图像。
10.根据权利要求9所述的TIRF照明的深度成像系统，其特征在于，动件包括：准直透镜组、光纤光源和照明光源中的任意一种。
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