CN103998969A - 用于无标记高对比度细胞成像的定量相位显微镜 - Google Patents

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Abstract

本文所述的系统和方法采用具有由样本所衍射的光与没有由样本所衍射的光之间的各种相对相移的多个相衬图像来产生定量相位图像。所产生的定量相位图像可具有用于细胞体和细胞核的无标记自动分割的充分对比度。

Description

用于无标记高对比度细胞成像的定量相位显微镜
技术领域
一般来说，实施例涉及相衬（phase contrast）显微镜。更具体来说，一些实施例涉及用于高对比度细胞成像的定量相位（quantitative phase）显微镜。
背景技术
样本的显微镜图像中的细胞体和/或细胞核的边界的识别称作图像中的细胞体和/或细胞核的分割。为了对样本中的细胞结构进行成像(例如用于分割)，染色或加标记技术常常用来增强不同类型的细胞结构之间的对比度。例如，标本可采用与DNA或RNA起反应的染料(例如溴乙锭)或者以不同方式与细胞核和细胞质相互作用的染料(例如苏木精-伊红)来染色。作为另一个示例，可以是一个或多个着色剂(发色团)和/或一个或多个荧光剂(荧光团)的标记在基于特定标签的存在来识别细胞结构中的预期物质方面是有用的。这类染色和加标记技术帮助识别细胞结构；但是，使用外部造影剂的染色或加标记可影响被成像样本的感兴趣结构或其它性质。此外，一般来说，这种染色或加标记无法对活细胞执行。
与采用明场成像相比，常规相衬成像技术(例如，泽尔尼克，微分干涉差(DIC))实现以改进对比度来对细胞单层的成像。不要求染色或加标记的这些相衬技术一般能够提供充分的图像对比度，但是以附加光学组件、光源和对齐过程为代价。
常规相位成像能够近似为处理一系列传统透射光图像(例如通过聚焦和离焦图像的减法)。虽然为图像提供增强边缘特征，但是对比度常常不足以确保细胞和/或细胞核的可靠自动分割。
此外，具有标记和染色的常规光学成像和常规相衬成像均没有提供与细胞单层有关的定量厚度信息。
发明内容
示范实施例涉及用于产生样本的定量相位图像的方法和系统。一些实施例可用于产生生物样本的高对比度定量相位图像。生物样本的所产生的高对比度定量相位图像可具有用于图像中的细胞体和/或细胞核的无标记自动分割的充分对比度。定量相位图像还可提供与各个位置的样本厚度有关的信息。空间解析厚度信息可提供与细胞条件有关的充分信息，以便使图像分割是不必要的。
一个示范实施例是一种用于可调谐相衬成像的系统。该系统包括用于采用光的主束来照射样本的光源。在一些实施例中，光源产生具有低相干性的光的束。光可具有小于10微米的相干长度。
该系统还包括样本之后的主束通路中的至少一个主束光学元件，其配置成收集由样本所衍射的光，并且收集没有由样本所衍射的光。在一些实施例中，至少一个主束光学元件包括显微镜物镜和/或镜筒透镜。
该系统还包括分束器，其配置成将至少一个主束光学元件所收集的光分成第一束和第二束。第一束包括第一衍射束和第一未衍射束，以及第二束包括第二衍射束和第二未衍射束。
沿第一束的通路，该系统包括第一光学元件(例如透镜)，其配置成将第一未衍射束聚焦在焦平面。该系统还包括在焦平面处或附近的遮光罩，其配置阻挡第一衍射束的至少一部分，而透射聚焦的第一未衍射束的至少一部分。在一些实施例中，遮光罩限定孔径，其配置成透射聚焦的第一未衍射束的至少一部分。遮光罩可配置成阻挡第一衍射束的大部分，而透射聚焦的第一未衍射束的大部分。一般来说，遮光罩从未衍射束中过滤调制分量，这提供清洁的相位参考。
第二光学元件(例如透镜)也在遮光罩之后的第一束的通路中。在一些实施例中，第二光学元件配置成准直第一未衍射束。第二光学元件可具有与第一光学元件的焦距相同的焦距。该系统可包括空间滤波器，其中包括第一透镜、遮光罩和第二透镜。
该系统包括第二光学元件之后的第一束通路中的可动反射镜。在一些实施例中，该系统还包括定位可动反射镜的压电元件。可动反射镜配置为定位成产生第一束中相对于第二束的多个所选相移的每个。在一些实施例中，多个所选相对相移包括零、π/2和π。多个所选相对相移还可包括3π/2。
该系统还包括第一束通路和第二束通路中的第二分束器。第二分束器配置成把来自可动反射镜的第一束与第二束相结合，供二维(2-D)成像系统进行成像。在一些实施例中，第二分束器配置成组合来自可动反射镜的第一未衍射束的透射部分和第二衍射束。
在一些实施例中，从第一分束器到2-D成像系统的第一未衍射束的光程长度与从第一分束器到2-D成像系统的第二衍射束的光程长度大致相等。
在一些实施例中，该系统包括第二束通路中的第三光学元件(例如透镜)和第四光学元件(例如透镜)。第三光学元件可具有与第四光学元件的焦距大致相等的焦距。第四光学元件可配置成将第二衍射束聚焦在2-D成像系统。
在一些实施例中，该系统还包括计算装置，其编程为确定定量相位图像。定量相位图像的确定可至少部分基于采用对相对零相移所定位、对π/2的相对相移所定位以及对π的相对相移所定位的可动反射镜所得到的所测量2-D相衬图像。在一些实施例中，定量相位图像还至少部分基于采用对3π/2的相对相移所定位的可动反射镜所得到的所测量2-D相衬图像。定量相位图像可包括与定量相位图像中的各位置的相对相位延迟有关的定量信息。
在一些实施例中，该系统配置用于包括一个或多个细胞的样本的无标记高对比度成像。计算装置还可编程为基于定时相位图像来执行包括细胞和/或细胞核的样本的无标记分割。计算装置还可编程为基于定量相位图像的至少一部分来生成细胞单层样本的定量厚度信息。
另一个实施例是一种用于定量相位成像的方法。该方法包括引导光的主束经过样本，并且收集由样本所衍射的光以及没有由样本所衍射的光。
该方法还包括将所收集的衍射和未衍射光分成第一束(包括第一衍射束和第一未衍射束)以及第二束(包括第二衍射束和第二未衍射束)。在一些实施例中，分束器可用来分离所收集的衍射和未衍射光。
该方法还包括将第一未衍射束聚焦在焦平面。在焦平面处或附近阻挡第一衍射束的至少一部分，并且在焦平面处或附近透射聚焦的第一未衍射束的至少一部分。在一些实施例中，阻挡第一衍射束的至少一部分而透射聚焦的第一未衍射束的至少一部分包括阻挡第一衍射束的大部分。在一些实施例中，定位在焦平面处或附近的空间滤波器透射聚焦的第一未衍射束的至少一部分而阻挡第一衍射束的至少一部分。
该方法还包括将透射的第一未衍射束部分引导至相对相移元件。在一些实施例中，相对相移元件是可动反射镜。相对相位可使用与可动反射镜所耦合的压电元件来调整。
该方法还包括把来自相对相移元件的第一束与第二束相结合以得到组合束，并且将组合束引导至二维成像装置以产生相衬图像。
该方法还包括调整相对相移元件，以得到对应于第一束与第二束之间的大约零相对相移的相衬图像。该方法还包括调整相对相移元件，以得到对应于经相移的第一束与第二束之间的大约π/2的相对相移的相衬图像。该方法包括调整相对相移元件，以得到对应于经相移的第一束与第二束之间的大约π的相对相移的相衬图像。
该方法包括使用计算装置、至少部分基于与大约零相对相移对应的至少一个相衬图像、基于与大约π/2相对相移对应的至少一个相衬图像以及基于与大约π相对相移对应的至少一个相衬图像来产生定量相位图像。定量相位图像可包括与定量相位图像中的各位置的相对相位延迟有关的定量信息。在一些实施例中，该方法还包括显示定量相位图像。
在一些实施例中，该方法还包括调整相对相移元件，以得到对应于经相移的第一束与第二束之间的大约3π/2的相对相移的相衬图像。定量相衬图像还可至少部分基于与大约3π/2的相对相移对应的至少一个相衬图像。
在一些实施例中，该方法还包括显示定量相位图像。该方法还可包括基于定量相位图像的至少一部分来生成定量相位图像的至少一部分中的各位置的定量厚度信息。
在一些实施例中，样本包括一个或多个细胞，以及定量相位图像是样本的无标记高对比度图像。在一些实施例中，样本包括细胞单层，以及该方法还包括基于样本的定时相位图像的至少一部分来生成与细胞单层有关的定量厚度信息。在一些实施例中，该方法还包括基于定量相位图像来执行细胞和/或细胞核的无标记自动分割。
附图说明
下面参照附图来描述实施例的特征和方面，附图中，元件不一定按比例示出。
图1示意示出按照一些实施例、用于相衬成像的示范系统。
图2是示出按照一些实施例、用于包括得到零、π/2和π相对相移的相衬图像的定量相位成像的示范方法的流程图。
图3是示出图2所示方法的“得到相衬图像”部分的流程图。
图4是示出按照一些实施例、用于包括得到零、π/2、π和3π/2相对相移的相衬图像的定量成像的另一种示范方法的流程图。
图5示出适合于实施本文所述的示范实施例的示范计算环境。
图6是采用使用示例系统和方法所得到的蚀刻阶跃（etched step）的玻璃的定量相位显微镜数据的二维图像。
图7是落入图5的虚线之内的数据的平均相位分布的图表。
图8是使用示例系统和方法所得到的人脸颊上皮细胞的第一组定量相位显微镜数据的二维图像。
图9是具有沿z方向所显示的相对相位的人脸颊上皮细胞的第一组定量相位显微镜数据的三维图像的透视图。
图10是使用示例系统和方法所得到的人脸颊上皮细胞的第二组定量相位显微镜数据的二维图像
图11是具有沿z方向所显示的相对相位的人脸颊上皮细胞的第二组定量相位显微镜数据的三维图像的透视图。
图12是使用示例系统和方法所得到的、成像室中的B35活细胞的第一组定量相位显微镜数据的二维图像。
图13是具有沿z方向所显示的相对相位、成像室中的B35活细胞的第一组定量相位显微镜数据的三维图像的透视图。
图14是使用示例系统和方法所得到的、成像室中的B35活细胞的第二组定量相位显微镜数据的二维图像。
图15是具有沿z方向所显示的相对相位、成像室中的B35活细胞的第二组定量相位显微镜数据的三维图像的透视图。
图16是细肠组织切片样本的二维光强图像。
图17是从使用示例系统和方法所得到的相衬图像所产生的细肠组织切片样本的第一组定量相位显微镜数据的二维图像。
图18是采用对4×放大率所配置的显微镜、使用示例系统和方法所得到的细肠组织切片样本的第二组定量相位显微镜数据的二维图像。
图19是从采用对20×放大率所配置的显微镜所得到的相衬图像所产生的细肠组织切片样本的第三组定量相位显微镜数据的二维图像。
图20是采用对40×放大率所配置的显微镜物镜所得到的细肠组织切片样本的第四组定量相位显微镜数据的二维图像。
图21是采用对4×放大率所配置的显微镜、使用示例系统和方法所得到的大鼠骨髓充间质干细胞样本的第一组定量相位显微镜数据的二维图像。
图22是采用对20×放大率所配置的显微镜所得到的大鼠骨髓充间质干细胞样本的第二组定量相位显微镜数据的二维图像。
图23是采用对40×放大率所配置的显微镜所得到的大鼠骨髓充间质干细胞样本的第三组定量相位显微镜数据的灰度二维图像。
具体实施方式
本文中相对于用于定量相位成像的系统和方法来描述一些实施例。示例实施例生成具有由样本所衍射的光与没有由样本所衍射的光之间的各种相对位移的多个相衬图像，以得到相对没有伪影的定量相位图像。一些实施例提供相衬显微镜系统和方法，其提供与薄生物样本(例如细胞单层)有关的定量光学厚度信息。一些实施例可提供充分图像对比度，以执行细胞体和/或细胞核的无标记自动分割。
图1示意示出按照一些实施例、用于执行定量相衬(PC)成像的示范系统10。系统10包括用于采用光的主束16来照射样本14的光源12。在一些实施例中，各种光学零件、例如透镜和滤波器可包含在光源12中或者定位在光源12与样本14之间。光源12可以是低时间相干光源。例如，在一些实施例中，光源可产生相干长度小于大约2.5微米的主束。
样本14可以是半透明或透明样本。在一些实施例中，样本可以是干样本(例如在盖玻片上)或者湿样本(例如室中的活细胞)。在一些实施例中，样本可处于微量滴定板中或者t225长颈瓶中。在一些实施例中，样本可以在2微米与10微米厚之间，这取决于所使用光的波长。
光的主束16与样本14相互作用，从而产生由样本衍射的光(衍射光)18以及没有由样本衍射的光(未衍射光)17。衍射光18和未衍射光17由样本14之后的主束16通路中的至少一个主束光学元件20来收集。如图例11所示，在当前图中，由样本所衍射的光以实线示出，而没有由样本衍射的光以虚线示出。在一些实施例中，至少一个主束光学元件20可包括物镜22、镜筒透镜24或者它们两者，如所示。如所示，一个或多个透明或半透明光学元件15(例如载玻片、盖玻片、室窗等)可分隔至少一个主束光学元件20与样本14。
在一些实施例中，用于收集光的至少一个主束光学元件20可以是显微镜28的一部分(例如显微镜物镜22和镜筒透镜24)。在一些实施例中，光源12可以是显微镜28的一部分，可以与显微镜28分离，或者可部分结合到显微镜28中。显微镜28还可包括用于引导衍射光18和未衍射光17的一个或多个反射镜(例如反射镜26)。显微镜可连接到计算装置100和/或与其通信。下面针对图5更详细描述计算装置100。
在系统10中，所收集的光(衍射光18和未衍射光17)分成两个独立通路，即，沿第一通路所引导的第一光束32以及沿第二通路所引导的第二光束38。光束32、28在相结合并且引导至成像装置62之前沿通路之一或两者以光学方式来操作，其中组合束39的第一束部分与组合束39的第二束部分之间的干涉产生相衬图像。
包括衍射光18和未衍射光17的所收集的光25由第一分束器30分成第一束32(包括第一衍射束34和第一未衍射束36)以及第二束38(包括第二衍射束40和第二未衍射束42)。如所示，所收集的光25可由立方分束器30来分离。在其它实施例中，可使用用于分离光的其它光学元件(例如片式分束器)。
沿第一通路，阻挡第一衍射束34的至少一部分，而透射第一未衍射束36的至少一部分。第一系统10包括第一束32的通路中的第一光学元件(例如透镜44)，其将第一束32聚焦在焦平面46。系统10还包括在焦平面46处或附近的遮光罩48。遮光罩46配置成阻挡第一衍射束34的至少一部分，而透射第一未衍射束36的至少一部分。例如，遮光罩46可包括阻挡光的材料，并且遮光罩46可限定定位在聚焦的第一未衍射束26的位置处或附近的孔径49。因为第一衍射束34没有聚焦在焦平面46，所以第一未衍射束的大部分将不会通过孔径49，而是将被遮光罩阻挡。因为第一未衍射束36聚焦在焦平面46，所以第一衍射束的大部分或全部将通过孔径49。在一些实施例中，遮光罩46可描述为空间滤波器。
在遮光罩48之后，第一未衍射束37的透射部分遇到可动反射镜54，并且可相对于第二束38来偏移。该系统可包括遮光罩48之后和可动反射镜54之前的第二光学元件(例如透镜50)。在一些实施例中，第一光学元件(例如透镜50)可配置成准直透射的未衍射束部分37。在一些实施例中，第二光学元件(例如透镜50)可具有与第一光学元件(例如透镜44)的焦距大致相等的焦距。
如上所述，系统10还包括第一束32(其包括透射的未衍射束部分37)的通路中、在第二光学元件(例如透镜50)之后的可动反射镜54。可动反射镜54配置为定位成产生第一束32中相对于第二束38的多个所选相移的每个。所选相对相移可包括零、π/2、π和3π/2中的任一个。可动反射镜54必须移动以产生所需相移的量取决于照射样本的光的主波长。例如，如果在初始位置不存在相对可动反射镜54的相对相移，并且照射光的主束16的主波长为λ，则反射镜从初始位置的位移(ΔP)与相对相移(Δθ)之间的关系如下所示。
                                                       (1)
对于波长为840 nm的光，π/2相对相移对应于可动反射镜54的105 nm位移。可动反射镜54可以是可动反射镜单元52的一部分，其中可动反射镜单元52包括用于准确地使可动反射镜54位移的附加部分或组件。例如，在系统10中，可动反射镜单元52还包括压电换能器56，其如箭头58所示使反射镜沿束通路平移。对压电换能器56的输入电压确定使可动反射镜54位移的程度，其与相对相移成比例。在一些实施例中，压电换能器56可使用计算装置100来控制(参见以下图5的描述)。
在其它实施例中，其它装置、系统或机构可用来使可动反射镜54位移。例如，可动反射镜可通过下列任一个或者任何组合来平移：压电致动器、线性可变差动变压器(LVDT)驱动级、准确螺杆驱动级、语音线圈致动器等。
在第一束32(其包括第一未衍射束37的潜在相移的透射部分)从可动反射镜所反射之后，它由第二分束器60引导至二维成像装置(例如照相装置62)中。
转到第二束38的通路，第二束38包括第二衍射束40和第二未衍射束42。如从第一分束器30到照相装置62所测量的第一未衍射束36的通路长度可与如从第一分束器30到照相装置62所测量的第二衍射束40的通路长度大致相等。第二束38可遇到第三光学元件(例如透镜64)，其聚焦第二未衍射束42。在一个实施例中，第三光学元件(例如透镜64)的焦距可与第一光学元件(例如透镜44)的焦距大致相等。第二束38可沿其通路由一个或多个反射镜(例如反射镜66、68)来引导。第二束38在第二分束器60与第一束32相结合之前，还可遇到第四光学元件(例如透镜70)。在一些实施例中，第四光学元件(例如透镜70)可具有与第三光学元件(例如透镜50)的焦距大致相等的焦距。在一些实施例中，第四光学元件(例如透镜70)可将第二衍射束聚焦在2-D成像装置(例如照相装置62)。
在一些实施例中，第二束的通路可包括第二遮光罩(未示出)，其配置成阻抗第二未衍射束42的至少一部分，并且配置成透射第二衍射束40的至少一部分。在这种实施例中，第二遮光罩可采取透射大部分入射光、但阻抗作为第二未衍射束42的焦点的区域中的大部分光的元件的形式。虽然阻挡第二未衍射束42的至少一部分可增加相衬图像中的对比度，但是相位图像中心的图像质量可因阻挡在第二未衍射束42的焦点处入射到第二遮光罩上的衍射束40的部分而降低。
第二分束器60第一束32(其包括可能相移、透射的第一未衍射束部分37)与第二束38(其包括第二衍射束40，并且可包括第二未衍射束42)相结合。透射的第一未衍射束部分37与第二衍射束40之间的干涉在2-D成像装置(例如照相装置62)产生相衬(PC)图像。
2-D成像装置可以是具有适当分辨率的任何2-D成像装置(例如电荷耦合器件(CCD)照相装置、光电倍增器管(PMT)照相装置、高分辨率摄像机或者适当分辨率的其它成像装置)。在一些实施例中，2-D成像装置(例如照相装置62)可配置成向计算装置100提供图像或图像数据供分析。如本文所使用的术语“图像”可表示所显示图像以及与图像对应的数据或信息其中之一或两者。因此，得到图像可表示得到模拟图像或者得到与数字图像对应的数据。此外，与图像对应的数据可以是原始图像数据、经处理的图像数据(例如经过滤、平滑、剪裁)、压缩图像数据等。此外，图像数据可按照多种格式(例如JPG、位图、postscript等)来存储或传送，这是本领域的技术人员会理解的。
图2-4是示意示出用于生成样本的定量相位图像的示范方法的流程图。为了便于说明，针对图1所示的系统10来描述方法70、80和90。但是，具有其它配置的其它系统可用来执行方法70、80和90，这是本领域的技术人员会理解的。
图2示出用于基于第一束与第二束之间的三个不同相对相移来产生定量相位图像的示范方法70。在一些实施例中，用于定量相位成像的方法可包括采用在零、π/2和π的相移所定位的相移元件来得到相衬图像，如图2的流程图示意所示。方法70的第一步骤、即步骤72将相移元件调整到第一束32与第二束34之间的零相对相移的位置。一般来说，可通过执行用于得到样本的相衬视图的方法80，并且观测所产生的样本视图，同时调整相移元件，直到该视图指示达到第一束32与第二束34之间的零相对相移的位置，来实现步骤72。
图3示意示出流程图中用于得到样本的相衬视图的方法80。主光束14被引导经过样本14(步骤81)。主光束14可来自光源12。主光束可具有低时间相干性。例如，在一些实施例中，主光束可具有小于大约10微米的相干长度。
收集由样本18所衍射的光和未衍射光17(步骤82)。如图1所示，衍射光18和未衍射光17可使用一个或多个主束光学元件(例如物镜22和镜筒透镜24)－其又可以是显微镜28的组件－来收集。
所收集的光25分成第一束32(包括第一衍射束34和第一未衍射束36)以及第二束(包括第二衍射束40和第二未衍射束42)(步骤84)。如所示，所收集的光25可由立方分束器30来分离。
第一未衍射束36聚焦到焦平面46(步骤84)。如所示，第一未衍射束36可由第一光学元件(例如第一透镜44)来聚焦。在其它实施例中，多个透镜或者一个或多个其它类型的光学元件(例如曲面镜)可用来聚焦第一未衍射束36。
在焦平面46处或附近，阻挡第一衍射束34的至少一部分，而透射第一未衍射束36的至少一部分(步骤85)。在焦平面46处或附近的遮光罩48或空间滤波器可用来阻挡第一衍射束34的至少一部分，而透射第一未衍射束36的至少一部分。例如，遮光罩可包括透射部分或孔径49，其定位成允许聚焦的第一未衍射束36的至少一部分、大部分或者基本上全部通过遮光罩。除了透射部分或孔径49之外，遮光罩48可配置成阻挡没有聚焦在焦平面46的第一衍射束34的至少一部分、大部分或者基本上全部。
在一些实施例中，透射的第一未衍射束部分37可通过第二光学元件(例如透镜50)。第二光学元件可配置成准直透射的第一未衍射束部分37。透射的第一未衍射束部分37引导至相对相移元件(步骤86)。相对相移元件可以是延长第一束32相对于第二束38的通路的元件。如所示，相对相移元件可以是可动反射镜54，其可以是可动反射镜单元52的一部分，其中反射镜单元52包括用于使可动反射镜平移的机构(例如压电换能器56)。在其它实施例中，相对相移元件可改变第一束相对第二束的光程长度，而没有改变物理通路长度。例如，在一些实施例中，具有与空气不同的衍射率和各种长度的各种光学元件可插入第一束的通路中，以得到相移。作为另一个示例，在一些实施例中，具有不同衍射率的相同长度的各种光学元件可插入第一束的通路中，以得到相移。在第一束32遇到相对相移元件之后，第一束32(其包括透射的第一未衍射部分37)与第二束38(其包括第二衍射束部分40)相结合(步骤87)。如图1所示，第一束32和第二束38可与第二分束器相结合。在一些实施例中，第二束38在与第一束32相结合之前，可遇到一个或多个附加光学元件(例如透镜64和透镜69)。
组合束39引导至2-D成像装置(例如照相装置62)(步骤88)。例如，在系统100中，第二分束器60用来将组合束62的第一束部分引导至照相装置62，以及反射镜68用来将组合束39的第二束部分引导至照相装置62。如图1所示，光学元件、例如透镜69可用来将组合束39的第二衍射束部分聚焦到照相装置62上。
按照图2的步骤72将相移元件调整到零相对相移可涉及在相移元件(例如可动反射镜54)的位置被调整时主动观测来自照相装置62的当前相衬视图。当相移元件处于第一束32与第二束38之间的零相对相移的位置时，与相移元件离开零相对相移的位置时相比，相衬视图将具有较高对比度(例如最大对比度)。
在相移元件对零相对相移来定位(步骤72)之后，版在零的相移的相衬图像(步骤73)。相衬图像可使用在图3的步骤89用来观测视图的相同2-D成像装置来捕获。照相装置32可捕获相衬图像，并且将其保存到照相装置32的内部存储器或存储装置，和/或将图像发送给计算装置100供分析和/或存储。因此，在零的相移的相衬图像可从成像装置或者接收来自图像装置的图像的装置的存储器来得到。
在步骤73得到第一图像之后，将相移元件调整到与π/2的相移对应的位置(步骤74)。如上所述，给定具有主波长λ的束，上式1可用来确定可动反射镜应当从零相对相移位置位移的程度(ΔP)，以得到预期相对相移(Δθ)。例如，如上所述，对于波长为840 nm的光，π/2相对相移对应于可动反射镜54的105 nm位移(ΔP)。因此，可动反射镜54可位移105 nm到达π/2相移的位置。相衬图像采用对π/2的相对相移所定位的相移元件来得到(步骤75)。相衬图像可使用图2所示的方法80来得到(步骤75)。
然后将相移元件调整到达到第一束32与第二束38之间的π/2的相移的位置(步骤76)。例如，对于波长为840 nm的光，π相对相移对应于可动反射镜54从零相对相移位置的210 nm位移。相衬图像采用对π相对相移所定位的相移元件来得到(步骤77)。如上所述，相衬视图可使用图2所示的方法80来得到和捕获(步骤77)。在已经得到与相移元件对零、π/2和π相对相移所定位的相衬图像之后，定量相位图像从相衬图像来产生(步骤78)。虽然方法80描述为按照零相对相移、π/2相对相移和π相对相移的顺序来得到相衬视图，但是实际上，在确定零相对相移的位置之后，相衬图像可按照任何顺序来得到。此外，虽然方法70描述为在零、π/2和π相对相移的每个来得到相衬图像，但是多个相衬图像可能采用处于给定位置的相移元件来得到，并且多个图像在用来产生定量相位图像之前相结合(例如求平均)。
相衬图像可按照下式表示为来自样本的衍射与未衍射光之间的干涉：
                                (2)
其中，I0(x,y)是在各位置的相衬图像强度，IU是来自未衍射光的图像强度，ID是来自衍射光的图像强度，以及Δφ(x,y)是二维相移。虽然IU(x,y)和ID(x,y)是位置(x,y)的函数，但是为了简洁起见，它们在等式中只通过IU和ID来表示。
如果第一束与第二束之间的系统中的相对相移按照可控方式来改变并且相衬图像在零、π/2、π和3π/2的相对相移来得到，则下式适用：
                           (3)
                           (4)
                        (5)
在零相对相移的相衬的等式I0(2)、在π/2相对相移的相衬的等式I1(3)以及在π相对相移的相衬的等式I2可以相结合，以产生跨图像的定量相位的等式，其取决于I0、I1和I2，如下所示：
                                      (6)
等式6可用来从分别具有相对相移零、π/2和π的相衬图像I0、I1和I2来确定在各位置(x,y)的Δφ(x,y)，以创建定量相位图像，其包括在各位置的定量相位信息。所产生的定量相位图像可称作3步图像。
图4示出用于基于四个相移来产生定量相位图像的示范方法90。在一些实施例中，用于定量相位成像的方法可包括采用在零、π/2、π和3π/2的相移所定位的相移元件来得到相衬图像，如图4的流程图示意所示。方法90包括步骤91-96，其用于调整零、π/2和π相对相移的相移元件，并且得到在各相对相移的相衬视图，其与方法70的对应步骤72-77并行。在方法90中，相移元件还调整到3π/2相对相移的位置(步骤97)，以及在那个相移得到相衬图像(步骤98)。如上所述，图3的方法80可用来得到预期相衬视图，其可作为图像来捕获。定量相位图像从在零、π/2、π和3π/2相对相移的相衬图像来产生。
如果I0(x,y)是在零相对相移的相衬图像强度，I1(x,y)是在π/2相对相移的相衬图像，I2(x,y)是在π相对相移的相衬图像，以及I3(x,y)是在3π/2相对相移的相衬图像，则在图像Δφ(x,y)中的各位置的定量相位Δφ(x,y)能够使用下式7(其可从上式2-5来得出)来得到。
                                             (7)
所产生的定量相位图像可称作4步图像。4步定量相位图像的示例出现在图6、图8-15、图17和图18-23中。
可通过使用计算装置(参见以下与图5有关的论述)以评估等式6或者等效表达或近似，从相衬图像I0、I1和I2来计算方法70的定量相位图像值Δφ(x,y)。对于I2等于I1的位置，差(I2-I1)可定义为小的非零值，以避免与等式6中的零分母有关的问题。类似地，可通过使用计算装置以评估等式7或者等效表达或近似，从相衬图像I0、I1、I2和I3来计算方法90的定量相位数据值Δφ(x,y)。对于I2等于I0的位置，差(I2-I0)可定义为小的非零值，以避免与等式7中的零分母有关的问题。
在一些实施例中，对各位置(例如对各像素或者对各数据点(xo,yo))来执行定量相位值的计算。在其它实施例中，可在计算定量相位数据之前处理(例如对多个像素求平均，以降低噪声影响)相衬图像数据。本领域的技术人员将会理解，许多不同的计算机程序和算法可用来从相衬图像数据来产生定量相位数据。
在一些实施例中，方法(例如方法70、方法90)还可包括在可视显示装置122(参见以下图5的描述)上显示定量相位图像。4步定量相位图像的示例出现在图6、图8-15、图17和图18-23中。
在一些实施例中，方法(例如方法70、方法90)还可包括基于定量相位图像数据的至少一部分来计算样本的至少一部分的厚度。计算可以是在定量相位图像中的各位置的厚度、在定量相位图像中的位置的至少一部分的各位置的厚度或者可以是沿定量相位图像的分布，其可对多行像素求平均，以得到该分布。参见以下与图7有关的描述。
图5示出适合于实施包括本文所述的示范方法和系统的实施例的示范计算环境。该环境包括具有关联外围装置的计算装置100。计算装置100可编程为实现用于执行本文所述的各种方法或者方法的部分的可执行代码150。计算装置100包括存储装置116，例如硬盘驱动器、CD-ROM或者其它非暂时计算机可读介质。存储装置116可存储操作系统118和其它相关软件。计算装置100还可包括存储器106。存储器106可包括计算机系统存储器或随机存取存储器，例如DRAM、SRAM、EDO RAM等。存储器106也可包括其它类型的存储器或者其组合。计算装置100可在存储装置116和/或存储器106中存储用于实现和处理可执行代码150的各部分的指令。
可执行代码150可包括用于分析相衬图像以产生三步和/或四步定量相位图像的代码。在一些实施例中，可执行代码150可包括用于处理相衬图像和/或定量相位图像的图像处理功能性(例如修剪、平滑、过滤、定义感兴趣区域等)。可执行代码150可包括用于显示相衬相位图像和/或定量相位图像的代码。在一些实施例中，可执行代码150可包括用于确定与定量相位图像中的一个或多个位置对应的厚度信息的代码。
在一些实施例中，可执行代码150还可包括用于基于定量相位图像来执行细胞体和/或细胞核的自动分割的代码。本领域的技术人员会理解，许多已知自动分割方法和技术可用于自动分割，这可包括流域特征检测、统计驱动阈值(例如Otsu、平均、MinError、Huang、三角和MinMax阈值)和/或边缘增强滤波器(例如非锐化屏蔽、Sobel过滤、高斯滤波器、卡尔曼滤波器)。在一些实施例中，可执行代码150可包括用于细胞和/或细胞核的用户辅助分割的功能性(例如，允许用户指示定量相位图像中的细胞边界或细胞核边界的工具)。在其它实施例中，分割可完全由用户手动执行。
计算装置100还包括处理器102，并且可包括用于运行存储器106中存储的软件的一个或多个附加处理器102’以及用于控制系统硬件、外围装置和/或外围硬件的其它程序。处理器102和(一个或多个)处理器102’各能够是单核处理器或多核(104和104’)处理器。虚拟化可用于计算装置100中，使得能够动态共享计算装置中的基础设施和资源。虚拟化处理器还可与可执行代码150以及存储装置116中的其它软件配合使用。可提供虚拟机114以操控运行于多个处理器的进程，使得进程看来像是仅使用一个计算资源而不是多个。多个虚拟机还能够与一个处理器配合使用。
用户可经过可视显示装置122、例如计算机监视器(其可显示用户界面124或任何其它界面)来与计算装置100进行交互。显示装置122的用户界面124可用来显示相衬图像、定量相位图像和/或用于控制各种外围装置的用户控件。可视显示装置122还可显示示范实施例的其它方面或元素(例如存储装置116的图标)。计算装置100可包括其它I/O装置，例如键盘或多点触摸界面(例如触摸屏)108以及用于接收来自用户的输入的指点装置110(例如鼠标、轨迹球和/或轨迹垫)。键盘108和指点装置110可经由有线和/或无线连接来连接到可视显示装置122和/或计算装置100。计算装置100可包括其它适当常规I/O外设。
在一些实施例中，计算装置100经由有线连接、经由无线连接和/或经由存储装置(例如flash驱动器)的物理传递从成像装置170(例如图1的照相装置62)接收信息(例如数据或图像)和/或向其发送信息。在一些实施例中，计算机装置100包括用于控制成像装置170的一个或多个方面(例如获取速率、图像分辨率等)的可执行代码。在一些实施例中，成像装置170本身可包括用于控制成像参数(例如获取速率、图像分辨率等)的用户界面。
在一些实施例中，计算装置100可从反射镜位置控制器180接收信息和/或向其发送信息。例如，计算装置100可接收与可动反射镜54的位置有关的信息，和/或可指导反射镜位置控制器180改变可动反射镜54的位置。在一些实施例中，反射镜位置控制器180可集成到计算装置100中。
在一些实施例中，计算装置100可从显微镜/光源160接收信息和/或向其发送信息。例如，光源的参数、例如亮度可使用计算装置100来观测和/或控制。作为另一个示例，对于数字控制的显微镜，显微镜的参数(例如焦点或过滤)可使用计算装置100来观测和/或控制。
计算装置100可包括网络接口112，以便经由局域网(LAN)、广域网(WAN)或因特网、经过多种连接(包括但不限于标准电话线、LAN或WAN链路(例如802.11、T1、T3、56kb、X.25)、宽带连接(例如ISDN、帧中继、ATM)、无线连接、控制器区域网络(CAN)或者上述任一个或全部的某种组合)，来与网络装置126进行接口。网络接口112可包括内置网络适配器、网络接口卡、PCMCIA网络卡、卡总线网络适配器、无线网络适配器、USB网络适配器、调制解调器或者适合于使计算装置100能够与能够进行通信的任何类型的网络进行接口并且执行本文所述操作的任何其它装置。
此外，计算装置100可以是任何计算机系统，例如工作站、台式计算机、服务器、膝上型、手持计算机或者其它形式的计算或电信装置，其能够进行通信并且具有充分处理器能力和存储器容量以执行本文所述操作。
计算装置100能够运行任何操作系统118，例如MICROSOFT WINDOWS操作系统的版本、Unix和Linux操作系统的不同版本、Macintosh计算机的MACOS的任何版本、任何开放源操作系统、任何专有操作系统、用于移动计算装置的任何操作系统或者能够运行于计算装置并且执行本文所述操作的任何其它操作系统中的任一个。操作系统可运行于本机模式或仿真模式。
示范系统和方法
本发明的发明人设计和构成与图1所示系统10相似的示例系统。示例系统使用相干长度为6 μm的840 nm波长超级发光激光二极管，以照射样本。包括物镜和镜筒透镜的透射显微镜用来收集由样本所衍射的光以及没有由样本所衍射的光。系统使用两个立方分束器。沿第一通路，该系统包括焦距为60 mm的第一透镜以及焦距为60 mm的第二透镜。在第一透镜的焦平面，该系统包括具有直径为15 μm的孔径的遮光罩，其中孔径透射聚焦的第一未衍射束的大部分，同时阻挡第一衍射束的大部分。沿第二通路，该系统包括焦距为150 μm的第三透镜以及焦距为150 μm的第四透镜。可动反射镜定位在具有与0.64弧度对应的位置分辨率以及与0至2π对应的总范围的压电换能器上。该系统包括用于得到2-D图像的高分辨率CCD照相装置。在以下描述中，定量相位图像称作定量相位显微镜(QPM)图像，因为显微镜用于衍射和未衍射光的收集以及被成像区域的缩放。在以下描述和对应图6、图8-15、图17和图18-23中，所有QPM图像使用4步技术来产生，其中4步技术涉及在零、π/2、π和3π/2相对相移的相衬图像的测量。
玻璃样本中的蚀刻阶跃的示例结果
具有蚀刻到其中的阶跃的玻璃样本采用示例系统来测量。阶跃使用Dektek表面轮廓仪来单独测量为大约218 nm高。图6中的QPM图像200从玻璃样本的四个所测量相衬图像来生成。在由矩形202所示的区域中，强度值对到达行来求平均，以提供作为x(单位为微米)的函数的平均相位(单位为弧度)，其在图表204中显示为轨迹206。阶跃的相位差Δφstep大约等于0.76弧度。相位差能够使用下式来与高度差相关，其中Δh(x,y)是在某个位置的相对高度，λ0是光源的中心波长，以及(x,y)是在该位置的样本材料的衍射率。
                                     (8)
对于玻璃样本，n为0.52的常数值，从而对该阶跃产生203 nm的厚度值，其在采用Dektak表面轮廓仪所测量的值的7%之内。这个一致证明，示例系统和方法能够用来在纳米级得到与样本有关的定量厚度信息。
对于生物样本，衍射率可跨不同位置是大致恒定的，或者它在各位置对不同类型的细胞或细胞结构(例如细胞核、细胞器官、细胞壁)可改变。例如，不同生物样本的衍射率至少对1.33至1.47的范围可改变。在具有衍射率的大变化的样本中，厚度的确定可要求使用根据位置(x,y)而改变的衍射率。本领域的技术人员将会理解，各种细胞和细胞结构的衍射率的已知值可用来从定量相位值来计算厚度值。
人脸颊上皮细胞的示例结果
图8-11示出使用上述示例系统所得到的人脸颊上皮细胞的QPM图像。人脸颊上皮细胞在处于盖玻片上的同时被成像。如图8所示，图8中定量相位信息通过在各位置的图像强度来指示，QPM图像提供区分脸颊上皮细胞210、212、214和216供分割的充分对比度。此外，QPM图像提供识别子细胞结构，例如细胞核211、213、215和217的充分对比度。图9包括图8中出现的定量相位信息的三维表示的透视图，其中相位根据沿z方向的强度和高度来识别。图10包括人脸颊上皮细胞的另一个二维QPM图像。图11是图10所示QPM信息的三维表示的透视图。虽然图8至图11按照灰度级，但是在一些实施例中，不同颜色可用来表示不同的相位值。
B35细胞的示例结果
图12-15示出使用上述示例系统所得到的B36活细胞的QPM图像。B35细胞系是从乳鼠中枢神经系统的肿瘤所得出的神经元细胞系。B35活细胞在处于成像室中的同时被成像。如图12中的二维图像所示，图12中定量相位信息通过在各位置的图像强度来表示，QPM图像提供区分B35细胞230-239供分割的充分对比度。图13包括图12中出现的定量相位信息的三维表示的透视图，其中相位根据沿z方向的强度和高度来识别。图14包括B35活细胞的另一个二维QPM图像，以及图15是QPM图像的三维表示的对应透视图。
肠组织切片的示例结果
图16-20是细肠组织切片样本的图像。图17是组织切片样本的二维QPM图像。图16是用于比较的组织切片样本中的同一点的光强图像。如图16和图17所示，与图16中的光学图像相比，图17中的肠组织切片的QPM图像提供优良图像分辨率和优良图像对比度。此外，QPM图像还提供定量相位信息。
图18-20包括从采用对不同放大率所配置的示例系统所拍摄的相衬图像所产生的肠组织切片样本的QPM图像。图18包括从使用具有Olympus YplanFL 4×/0.13物镜(平场（plan）、萤石、放大率4×、数值孔径0.13)的显微镜所得到的相衬图像所产生的细肠组织切片的QPM图像。图19包括从使用具有Olympus YplanFL 20×/0.5物镜(平场、萤石、放大率20×、数值孔径0.5)的显微镜所得到的相衬图像所产生的细肠组织切片的QPM图像。图20包括从使用具有Olympus UplanSApo 40×/0.95物镜(平场、消色差、放大率40×、数值孔径0.95)的显微镜所得到的相衬图像所产生的细肠组织切片的QPM图像。如图19和图20所示，甚至在分别为20×和40×的较高放大率下，QPM图像示出良好分辨率和良好图像对比度。
大鼠骨髓充间质干细胞的示例结果
图21-23包括从采用对不同放大率所配置的示例系统所拍摄的相衬图像所产生的大鼠骨髓充间质干细胞(MSC)的样本的QPM图像。大鼠MSC在处于盖玻片上的同时被成像。MSC是多蛋白干细胞，其从大鼠的骨髓来得出，并且能够区分为多种细胞类型。图21包括从使用具有显微镜中的Olympus YPlanFL 4×/0.13物镜(平场、萤石、放大率4×、数值孔径0.13)的示例系统所得到的相衬图像所产生的MSC的QPM图像。图21包括从采用Olympus YPlanFL 20×/0.5物镜(平场、萤石、放大率20×、数值孔径0.5)所得到的相衬图像所产生的MSC的QPM图像。图22包括从采用Olympus UplanSApo 40×/0.95物镜(平场、消色差、放大率40×、数值孔径0.95)所得到的相衬图像所产生的MSC的QPM图像。如图22和图23所示，甚至在分别为20×和40×的较高放大率下，MSC的QPM图像示出良好分辨率和高图像对比度。
虽然本文中示出和描述了本发明的实施例的一些特征，但是许多修改和变更将是本领域的技术人员基于本申请是显而易见的。因此要理解，所附权利要求书预计涵盖落入本发明的真实精神之内的所有这类修改和变更。
虽然权利要求叙述限制的特定组合，但是本发明明确包含各独立权利要求本身，并且还与相关从属权利要求中明确表达的限制的任何可能组合相结合，除了无疑是不兼容的之外。

Claims (34)

1. 一种用于相衬成像的系统，所述系统包括：
光源，用于采用光的主束来照射样本；
在所述样本之后的所述主束的通路中的至少一个主束光学元件，并配置成收集由所述样本所衍射的光，并且收集没有由所述样本所衍射的光；
分束器，配置成将所述至少一个主束光学元件所收集的所述光分成包括第一衍射束和第一未衍射束的第一束和包括第二衍射束和第二未衍射束的第二束；
所述第一束的通路中的第一光学元件，配置成将所述第一未衍射束聚焦在焦平面；
在所述焦平面处或附近的遮光罩，配置成阻挡所述第一衍射束的至少一部分，而透射所述聚焦的第一未衍射束的至少一部分；
所述遮光罩之后的所述第一束的所述通路中的第二光学元件；
所述第二光学元件之后的、所述第一束的所述通路中的可动反射镜，配置成定位成产生所述第一束中的多个所选相对相移的每个；以及
所述第一束的所述通路中和所述第二束的通路中的第二分束器，并配置成将来自所述可动反射镜的所述第一束与所述第二束相结合，供由二维成像系统进行成像。
2. 如权利要求1所述的系统，其中，所述多个所选相对相移包括零、π/2和π。
3. 如权利要求2所述的系统，其中，所述多个所选相对相移还包括3π/2。
4. 如以上权利要求中的任一项所述的光学系统，其中，所述系统配置用于对包括一个或多个细胞的样本的无标记、高对比度成像。
5. 如以上权利要求中的任一项所述的系统，其中，所述光源产生具有低相干性的光的束。
6. 如权利要求5所述的系统，其中，所述光源产生相干长度小于10微米的光的束。
7. 如以上权利要求中的任一项所述的系统，其中，所述遮光罩限定配置成透射所述聚焦的第一未衍射束的至少一部分的孔径。
8. 如以上权利要求中的任一项所述的系统，其中，所述遮光罩配置成阻挡所述第一衍射束的大部分，并且配置成透射所述聚焦的第一未衍射束的大部分。
9. 如以上权利要求中的任一项所述的系统，其中，所述第二光学元件配置成准直所述第一束。
10. 如以上权利要求中的任一项所述的系统，其中，所述第二光学元件具有与所述第一光学元件的焦距相同的焦距。
11. 如以上权利要求中的任一项所述的系统，还包括所述第二束的所述通路中的第三光学元件和所述第二束的所述通路中的第四光学元件，所述第三光学元件具有与所述第四光学元件的焦距大致相等的焦距。
12. 如权利要求11所述的系统，其中，所述第四光学元件配置成将所述第二衍射束聚焦在所述成像系统。
13. 如以上权利要求中的任一项所述的系统，其中，从所述第一分束器到所述2-D成像装置的所述第一未衍射束的光程长度与从所述第一分束器到所述2-D成像装置的所述第二衍射束的光程长度大致相等。
14. 如以上权利要求中的任一项所述的系统，还包括定位所述可动反射镜的压电元件。
15. 如以上权利要求中的任一项所述的系统，其中，所述第二分束器配置成组合来自所述可动反射镜的所述第一未衍射束的所述透射的部分和所述第二衍射束。
16. 如以上权利要求中的任一项所述的系统，其中，所述至少一个主束光学元件包括显微镜物镜。
17. 如以上权利要求中的任一项所述的系统，其中，所述至少一个主束光学元件包括镜筒透镜。
18. 如以上权利要求中的任一项所述的系统，还包括计算装置，其配置成至少部分基于采用对零的相对相移所定位的、对π/2的相对相移所定义的以及对π的相对相移所定位的所述可动反射镜而得到的所测量二维相衬图像，来确定定量相位图像。
19. 如权利要求18所述的系统，其中，所述定量相位图像还至少部分基于采用对3π/2的相对相移所定位的所述可动反射镜而得到的所测量二维相衬图像。
20. 如权利要求18或19所述的系统，其中，所述定量相位图像包括与所述定量相位图像中的各位置的相对相位延迟有关的定量信息。
21. 如权利要求18至20中的任一项所述的系统，其中，所述计算装置还编程为基于所述定量相位图像来执行包括细胞和/或细胞核的样本的无标记分割。
22. 如权利要求18至21中的任一项所述的系统，其中，所述计算装置还编程为基于所述定量相位图像的至少一部分来生成细胞单层样本的定量厚度信息。
23. 一种用于定量相位成像的方法，所述方法包括：
引导光的主束经过样本；
收集由所述样本所衍射的光和没有由所述样本所衍射的光；
将所述收集的衍射和未衍射光分成包括第一衍射束和第一未衍射束的第一束以及包括第二衍射束和第二未衍射束的第二束；
将所述第一未衍射束聚焦在焦平面；
阻挡所述第一衍射束的至少一部分，而透射在所述焦平面处或附近的所述聚焦的第一未衍射束的至少一部分；
将所述透射的第一未衍射束部分引导至相对相移元件；
把来自所述相对相移元件的所述第一束与所述第二束相结合，以得到组合束；
将所述组合束引导至二维成像装置，以产生相衬图像；
调整所述相对相移元件，以得到对应于所述第一束与所述第二束之间的大约零相对相移的相衬图像；
调整所述相对相移元件，以得到对应于所述经相移的第一束与所述第二束之间的大约π/2的相对相移的相衬图像；
调整所述相对相移元件，以得到对应于所述经相移的第一束与所述第二束之间的大约π的相对相移的相衬图像；以及
使用计算装置，至少部分基于与大约零相对相移对应的所述至少一个相衬图像、与大约π/2相对相移对应的所述至少一个相衬图像以及与大约π相对相移对应的所述至少一个相衬图像来产生定量相位图像。
24. 如权利要求23所述的方法，还包括：
调整所述相对相移元件，以得到对应于所述经相移的第一束与所述第二束之间的大约3π/2的相对相移的相衬图像；其中所述定量相衬图像还基于与大约3π/2的相对相移对应的至少一个相衬图像。
25. 如权利要求23或24所述的方法，其中，所述定量相位图像包括与所述定量相位图像中的各位置的相对相位延迟有关的定量信息。
26. 如权利要求23至25中的任一项所述的方法，其中，所述样本包括一个或多个细胞，以及所述定量相位图像是所述样本的无标记、高对比度图像。
27. 如权利要求26所述的方法，其中，所述方法还包括基于所述定量相位图像来执行细胞和/或细胞核的无标记自动分割。
28. 如权利要求26或27所述的方法，其中，所述样本包括细胞单层；以及其中所述方法还包括基于所述样本的所述定量相位图像的至少一部分来生成与所述样本有关的定量厚度信息。
29. 如权利要求23至28中的任一项所述的方法，还包括基于所述定量相位图像的至少一部分来生成所述定量相位图像的至少一部分中的各位置的定量厚度信息。
30. 如权利要求23至29中的任一项所述的方法，其中，所述相对相移元件是可动反射镜。
31. 如权利要求30所述的方法，其中，相对相位使用与所述可动反射镜耦合的压电元件来调整。
32. 如权利要求23至31中的任一项所述的方法，其中，阻挡所述第一衍射束的至少一部分而透射所述聚焦的第一未衍射束的至少一部分包括阻挡所述第一衍射束的大部分。
33. 如权利要求23至32中的任一项所述的方法，还包括显示所述定量相位图像。
34. 如权利要求23至33中的任一项所述的方法，其中，定位在所述焦平面处或附近的空间滤波器透射所述聚焦的第一未衍射束的至少一部分而阻挡所述第一衍射束的至少一部分。
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