JP2015534134A - 標識を伴わない高コントラスト細胞撮像のための定量位相顕微鏡検査 - Google Patents

Abstract

本明細書に記述されるシステム及び方法は、試料により回折される光と、試料により回折されない光との間の各種の相対位相シフトによる複数の位相コントラスト画像を利用して定量位相画像を生成する。生成された定量位相画像は、細胞体及び核の、標識を伴わない自動セグメンテーションのための十分なコントラストを有し得る。【選択図】図２４

Description

実施形態は、概して位相コントラスト顕微鏡検査に関する。より具体的に、一部の実施形態は、高コントラスト細胞撮像のための定量位相顕微鏡検査に関する。本発明の他の態様は、定量位相顕微鏡検査における空間変化のリアルタイム画像取得を可能にするための新規の時分割多重化法を含む。

試料の顕微鏡検査画像中の細胞体及び／又は細胞核の境界の識別は、画像中の細胞体及び／又は核のセグメンテーションと称され得る。試料中の細胞の構造を撮像する（例えばセグメンテーションのために）ために、様々な種類の細胞構造間のコントラストを強調するための染色又は標識技術がしばしば使用される。例えば、試験片は、ＤＮＡもしくはＲＮＡと反応する染料（例えば臭化エチジウム）、又は細胞の細胞核及び細胞質と異なるように相互作用する染料（例えばヘマトキシリンエオシン）により染色され得る。別の例として、１つ以上の着色剤（発色体）及び／又は１つ以上の蛍光剤（蛍光体）であり得る標識は、固有タグの存在に基づいて細胞構造内の所望の物質を識別するのに有用である。そのような染色及び標識技術は、細胞構造の識別を助けるが、外部造影剤を用いる染色又は標識は、撮像される試料の構造又は他の関心のある特性に影響を及ぼし得る。さらに、一般に、そのような染色又は標識を生細胞に関して実施することができない。

従来の位相コントラスト撮像技術（例えば、Ｚｅｒｎｉｋｅ、微分干渉（ＤＩＣ））は、明視野撮像と比べてコントラストが改良された細胞単層の撮像を可能にする。染色又は標識を必要としないこれらの位相コントラスト技術は、一般に、追加の光部品、光源及び位置決め手法の出費を伴ってではあるが、十分な画像コントラストを提供することができる。

国際公開第２０１３／１８７８３３号パンフレット

従来の位相撮像を従前の一連の透過光画像の処理により（例えば、焦点画像の出し入れの控除により）近似することができる。エッジ特徴が強調された画像を提供する一方で、コントラストは、細胞及び／又は核の自動セグメンテーションの信頼性を確保するにはしばしば不十分である。

さらに、標識及び染色を伴う従来の光学撮像も従来の位相コントラスト撮像も、細胞単層に関する定量的な厚さ情報を提供しない。

例示的な実施形態は、試料の定量位相画像を生成するための方法及びシステムに関する。一部の実施形態は、生体試料の高コントラスト定量位相画像を生成するために利用され得る。生体試料の生成された高コントラスト定量位相画像は、画像中の細胞体及び／又は核の、標識を伴わない自動セグメンテンーションのための十分なコントラストを有し得る。定量位相画像は、各種の位置での試料厚さに関する情報も提供し得る。空間分解された厚さ情報は、画像セグメンテーションを不要にするのに十分である細胞状態に関する情報を提供し得る。

例示的な実施形態は、調整可能なコントラスト撮像システムである。システムは、主光ビームにより試料を照明するための光源を含む。一部の実施形態において、光源は、低コヒーレンスの光ビームを生成する。光は、１０μｍ未満のコヒーレンス長を有し得る。

システムは、試料により回折される光を集光し、試料により回折されない光を集光するように構成される少なくとも１つの主ビーム光素子を、主ビームの経路において試料の後方にさらに含む。一部の実施形態において、少なくとも１つの主ビーム光素子は、顕微鏡の対物レンズ及び／又はチューブレンズを含む。

システムは、少なくとも１つの主ビーム光素子により集光された光を第１のビームと第２のビームに分割するように構成されたビームスプリッタも含む。第１のビームは、第１の回折ビーム及び第１の非回折ビームを含み、第２のビームは、第２の回折ビーム及び第２の非回折ビームを含む。

第１のビームの経路に沿って、システムは、第１の非回折光を焦点面で合焦させるように構成された第１の光素子（例えばレンズ）を含む。システムは、第１の回折ビームの少なくとも一部を遮断し、合焦された第１の非回折ビームの少なくとも一部を透過させるように構成されたマスクも、焦点面又はその付近に含む。一部の実施形態において、マスクは、合焦された第１の非回折ビームの少なくとも一部を透過させるように構成された開口を画定する。マスクは、第１の回折ビームの大半を遮断し、合焦された第１の非回折ビームの大半を透過させるように構成され得る。一般に、マスクは、変調成分を非回折ビームからフィルタリングし、クリーンな位相基準を提供する。

第２の光素子（例えばレンズ）も、第１のビームの経路においてマスクの後方にある。一部の実施形態において、第２の光素子は、第１の非回折ビームをコリメートするように構成される。第２の光素子は、第１の光素子の焦点距離と同じ焦点距離を有し得る。システムは、第１のレンズ、マスク及び第２のレンズを含む空間フィルタを含み得る。

システムは、第１のビームの経路において第２の光素子の後方に可動ミラーを含む。一部の実施形態において、システムは、可動ミラーを配置するための圧電素子も含む。可動ミラーは、選択された複数の位相シフトのそれぞれを第２のビームに対して第１のビームに生成すべく位置決めされるように構成される。一部の実施形態において、選択された複数の相対位相シフトは、０、π、π／２及びπを含む。選択された複数の相対位相シフトは、３π／２をさらに含み得る。

システムは、第１のビームの経路及び第２のビームの経路に第２のビームスプリッタも含む。第２のビームスプリッタは、２次元（２−Ｄ）撮像システムによる撮像のために、可動ミラーからの第１のビームを第２のビームと合成するように構成される。一部の実施形態において、第２のビームスプリッタは、可動ミラーからの第１の非回折ビームの透過部分と第２の回折ビームとを合成するように構成される。

一部の実施形態において、第１のビームスプリッタから２−Ｄ撮像システムまでの第１の非回折ビームの光路長は、第１のビームスプリッタから２−Ｄ撮像システムまでの第２の回折ビームの光路長に略等しい。

一部の実施形態において、システムは、第２のビームの経路に第３の光素子（例えばレンズ）及び第４の光素子（例えばレンズ）を含む。第３の光素子は、第４の光素子の焦点距離に略等しい焦点距離を有し得る。第４の光素子は、第２の回折ビームを２−Ｄ撮像システムで合焦させるように構成され得る。

一部の実施形態において、システムは、定量位相画像を決定するようにプログラミングされた計算装置をさらに含む。定量位相画像の決定は、少なくとも部分的に、０の相対位相シフトに位置決めされ、π／２の相対位相シフトに位置決めされ、πの相対位相シフトに位置決めされた可動ミラーにより得られて測定された２−Ｄ位相コントラスト画像に基づき得る。一部の実施形態において、定量位相画像は、少なくとも部分的に、３π／２の相対位相シフトに位置決めされた可動ミラーにより得られて測定された２−Ｄ位相コントラスト画像にさらに基づく。定量位相画像は、定量位相画像中の各位置での相対位相遅れに関する定量情報を含み得る。

一部の実施形態において、システムは、１つ以上の細胞を含む試料の、標識を伴わない高コントラスト撮像のために構成される。計算装置は、定量位相画像に基づいて、細胞及び／又は核を含む試料の、標識を伴わないセグメンテーションを実施するようにさらにプログラミングされ得る。計算装置は、定量位相画像の少なくとも一部に基づいて細胞単層試料の定量的な厚さ情報を生成するようにさらにプログラミングされ得る。

別の実施形態は、定量位相撮像のための方法である。方法は、試料を通る主光ビームを導き、試料により回折される光及び試料により回折されない光を集光することを含む。

方法は、集光された回折光及び非回折光を、第１の回折ビーム及び第１の非回折ビームを含む第１のビームと、第２の回折ビーム及び第２の非回折ビームを含む第２のビームとに分割することも含む。一部の実施形態において、ビームスプリッタは、集光された回折光及び非回折光を分割するために使用され得る。

方法は、第１の非回折ビームを焦点面で合焦させることも含む。第１の回折ビームの少なくとも一部は、焦点面又はその付近で遮断され、合焦された第１の非回折ビームの少なくとも一部は、焦点面又はその付近で透過される。一部の実施形態において、第１の回折ビームの少なくとも一部を遮断し、合焦された第１の非回折ビームの少なくとも一部を透過させることは、第１の回折ビームの大部分を遮断することを含む。一部の実施形態において、焦点面又はその付近に配置された空間フィルタは、合焦された第１の非回折ビームの少なくとも一部を透過させ、第１の回折ビームの少なくとも一部を遮断する。

方法は、第１の非回折ビームの透過部分を相対位相シフト素子に導くことをさらに含む。一部の実施形態において、相対位相シフト素子は、可動ミラーである。相対位相は、可動ミラーに結合された圧電素子を用いて調節され得る。

方法は、相対位相シフト素子からの第１のビームを第２のビームと合成して合成ビームを得て、合成ビームを２次元撮像装置に導いて位相コントラスト画像を生成することも含む。

方法は、相対位相シフト素子を調節して、第１のビームと第２のビームの間の相対位相シフト約０に対応する位相コントラスト画像を得ることをさらに含む。方法は、相対位相シフト素子を調節して、位相シフトされた第１のビームと第２のビームの間の約π／２の相対位相シフトに対応する位相コントラスト画像を得ることもさらに含む。方法は、相対位相シフト素子を調節して、位相シフトされた第１のビームと第２のビームの間の約πの相対位相シフトに対応する位相コントラスト画像を得ることを含む。

方法は、少なくとも部分的に、相対シフト約０に対応する少なくとも１つの位相コントラスト画像、相対シフト約π／２に対応する少なくとも１つの位相コントラスト画像、相対シフト約πに対応する少なくとも１つの位相コントラスト画像に基づいて、計算装置を用いて定量位相画像を生成することを含む。定量位相画像は、定量位相画像中の各位置の相対位相遅れに関する定量情報を含み得る。一部の実施形態において、方法は、定量位相画像を表示することをさらに含む。

一部の実施形態において、方法は、相対位相シフト素子を調節して、位相シフトされた第１のビームと第２のビームの間の約３π／２の相対位相シフトに対応する位相コントラスト画像を得ることをさらに含む。定量位相コントラスト画像は、少なくとも部分的に、約３π／２の相対シフトに対応する少なくとも１つの位相コントラスト画像にも基づき得る。

一部の実施形態において、方法は、定量位相画像を表示することをさらに含む。方法は、定量位相画像の少なくとも一部に基づいて、定量位相画像の少なくとも一部における各位置の定量的な厚さ情報を生成することも含み得る。

一部の実施形態において、試料は、１つ以上の細胞を含み、定量位相画像は、標識を伴わない試料の高コントラスト画像である。一部の実施形態において、試料は、細胞単層を含み、方法は、試料の定量位相画像の少なくとも一部に基づいて、細胞単層に関する定量的な厚さ情報を生成することをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、定量位相画像に基づいて、標識を伴わずに細胞及び／又は核の自動セグメンテーションを実施することも含む。

本明細書の以下でより詳しく記述される幾つかの実施形態において、新規の時分割多重化法の使用を通して複数（例えば４つ）の位相遅れで画像を連続的に取り込むように構成される定量位相顕微鏡検査システムが提供される。そのようなシステムは、定量位相顕微鏡検査システムにおける空間変化のリアルタイム画像取得を可能にする。

以下で概説されるような一部に実施形態において、時分割多重化法は、定量位相顕微鏡検査システムにおける空間変化のリアルタイム画像取得を可能にする定量位相顕微鏡検査システムに使用される。

時分割多重化法を介したＱＰＭのリアルタイム取得は、心臓細胞収縮及び神経系モデル伸張等の動的な生体プロセスの監視を可能にする。

本発明のさらなる実施形態において、位相コントラスト撮像システムが提供され、システムは、新規アルゴリズムを画像データに適用し、それにより背景「ノイズ」を抑制し、したがって、「スペックルを伴わない」背景を実現することにより画像品質を改良するように構成される。アルゴリズム及び得られた改良画像の具体的な詳細は、以下に記述され、図２５及び図２６にも提示される。

実施形態の特徴及び態様は、要素が必ずしも縮尺通りに描写されていない添付図面を参照して、以下に記述される。

位相コントラスト撮像のための、一部の実施形態による例示的なシステムを概略的に描写している。 相対位相シフト０、π／２及びπの位相コントラスト画像を得ることを含む定量位相撮像のための、一部の実施形態による例示的な方法を描写するフローチャートである。 図２に描写される方法の「位相コントラスト画像を得る」部分を描写するフローチャートである。 相対位相シフト０、π／２、π及び３π／２の位相コントラスト画像を得ることを含む定量撮像のための、一部の実施形態による別の例示的な方法を描写するフローチャートである。 本明細書に教示される例示的な実施形態を実践するのに適した例示的な計算環境を図示している。 システム及び方法の例を用いて得られた、エッチングされた段を有するガラスの定量位相顕微鏡検査データの２次元画像である。 図５の破線内に属するデータの平均位相プロファイルのプロットである。 システム及び方法の例を用いて得られた、ヒト上皮頬細胞の定量位相顕微鏡検査データの第１の組の２次元画像である。 ｚ方向に表示された相対位相を有する、ヒト上皮頬細胞の定量位相顕微鏡検査データの第１の組の３次元画像の斜視図である。 システム及び方法の例を用いて得られた、ヒト上皮頬細胞の定量位相顕微鏡検査データの第２の組の２次元画像である。 ｚ方向に表示された相対位相を有する、ヒト上皮頬細胞の定量位相顕微鏡検査データの第２の組の３次元画像の斜視図である。 システム及び方法の例を用いて得られた、撮像チャンバ内のＢ３５生細胞の定量位相顕微鏡検査データの第１の組の２次元画像である。 ｚ方向に表示された相対位相を有する、撮像チャンバ内のＢ３５生細胞の定量位相顕微鏡検査データの第１の組の３次元画像の斜視図である。 システム及び方法の例を用いて得られた、撮像チャンバ内のＢ３５生細胞の定量位相顕微鏡検査データの第２の組の２次元画像である。 ｚ方向に表示された相対位相を有する、撮像チャンバ内のＢ３５生細胞の定量位相顕微鏡検査データの第２の組の３次元画像の斜視図である。 腸薄組織切片試料の２次元光強度画像である。 システム及び方法の例を用いて得られた位相コントラスト画像から生成された、腸薄組織切片試料の定量位相顕微鏡検査データの第１の組の２次元画像である。 倍率４ｘに構成された顕微鏡を有するシステム及び方法の例を用いて得られた、腸薄組織切片試料の定量位相顕微鏡検査データの第２の組の２次元画像である。 倍率２０ｘに構成された顕微鏡により得られた位相コントラスト画像から生成された、腸薄組織切片試料の定量位相顕微鏡検査データの第３の組の２次元画像である。 倍率４０ｘに構成された顕微鏡対物レンズにより得られた、腸薄組織切片試料の定量位相顕微鏡検査データの第４の組の２次元画像である。 倍率４ｘに構成された顕微鏡を有するシステム及び方法の例を用いて得られた、ラット間葉系幹細胞試料の定量位相顕微鏡検査データの第１の組の２次元画像である。 倍率２０ｘに構成された顕微鏡により得られた、ラット間葉系幹細胞試料の定量位相顕微鏡検査データの第２の組の２次元画像である。 倍率４０ｘに構成された顕微鏡により得られた、ラット間葉系幹細胞試料の定量位相顕微鏡検査データの第３の組のグレースケール２次元画像である。 時分割多重化のために構成された位相コントラスト撮像のための、本発明の幾つかの態様による例示的な定量位相顕微鏡検査システムを概略的に描写している。 位相回復のための従来アルゴリズム及び得られた取得画像、並びに、本明細書に開示される位相回復のための新規アルゴリズム及び本明細書に記述される新規アルゴリズムの適用により実現された、抑制された背景ノイズ及び「スペックルを伴わない」背景を表示する得られた画像を提供する。 元の画像、図２５に論述される従来アルゴリズムを利用して得られた画像、及び、本明細書に記述される新規アルゴリズムを用いて得られた画像を提供する。新規アルゴリズムが画像データに適用されると、より良好な画像品質及び細胞コントラストが得られる。

定量位相撮像システム及び方法に関する一部の実施形態が本明細書に記述される。実施形態の例は、アーチファクトが少ない定量位相画像を得るために、試料により回折される光と、試料により回折されない光との間の各種の相対位相シフトを有する複数の位相コントラスト画像を生成する。一部の実施形態は、生体薄試料（例えば細胞単層）に関する定量的な光学的厚さ情報を提供する位相コントラスト顕微鏡検査システム及び方法を提供する。一部の実施形態は、標識を伴わずに細胞体及び／又は核の自動セグメンテーションを実施するのに十分な画像コントラストを提供し得る。

図１は、定量位相コントラスト（ＰＣ）撮像を実施するための、一部の実施形態による例示的なシステム１０を概略的に描写している。システム１０は、主光ビーム１６により試料１４を照明するための光源１２を含む。一部の実施形態において、レンズ及びフィルタ等の各種の光素子が、光源１２に含まれ得又は光源１２と試料１４の間に配置され得る。光源１２は、時間的コヒーレンスが低い光源であり得る。例えば、一部の実施形態において、光源は、約２．５μｍ未満のコヒーレンス長を有する主ビームを生成し得る。

試料１４は、半透明又は透明の試料であり得る。一部の実施形態において、試料は、乾いた試料（例えばカバーガラス上の）又は湿った試料（例えば、チャンバ内の生細胞）であり得る。一部の実施形態において、試料は、マイクロタイタープレート内又はｔ２２５フラスコ内にあり得る。一部の実施形態において、試料は、使用される光の波長に応じて２μｍ〜１０μｍの厚さであり得る。

主光ビーム１６は、試料１４と相互作用し、試料により回折される光（回折光）１８と、試料により回折されない光（非回折光）１７とをもたらす。回折光１８及び非回折光１７は、主ビーム１６の経路において試料１４の後方にある少なくとも１つの主ビーム光素子２０により集光される。凡例１１で表示されるように、本ブロック図において、試料により回折される光は、実線で表示され、試料により回折されない光は、破線で表示されている。一部の実施形態において、少なくとも１つの主ビーム光素子２０は、示されるように、対物レンズ２２、チューブレンズ２４又は両方を含み得る。図示されるように、１つ以上の透明又は半透明の光素子１５（例えば、ガラススライド、カバーガラス、チャンバ窓等）は、少なくとも１つの主ビーム光素子２０を試料１４から離し得る。

一部の実施形態において、光を集光するための少なくとも１つの主ビーム光素子２０は、顕微鏡２８の一部（例えば、顕微鏡の対物レンズ２２及びチューブレンズ２４）であり得る。一部の実施形態において、光源１２は、顕微鏡２８の部分であってもよく、顕微鏡２８とは別個であってもよく、顕微鏡２８内に部分的に組み込まれてもよい。顕微鏡２８は、回折光１８及び非回折光１７を導くための１つ以上のミラー（例えばミラー２６）をさらに含み得る。顕微鏡は、計算装置１００に接続され得及び／又は計算装置１００と通信状態にあり得る。計算装置１００は、図５に関して以下でより詳しく記述される。

システム１０において、集光された光（回折光１８及び非回折光１７）は、２つの別経路に分割され、第１の光ビーム３２が第１の経路に沿って導かれ、第２の光ビーム３８が第２の経路に沿って導かれる。光ビーム３２、３８は、合成されて撮像装置６２に導かれる前に経路の一方又は両方に沿って光学的に操作され、撮像装置６２では、合成ビーム３９の第１のビーム部分と合成ビーム３９の第２のビーム部分との間の干渉が位相コントラスト画像を生成する。

回折光１８及び非回折光１７を含む集光された光２５は、第１のビームスプリッタ３０によって、第１の回折ビーム３４及び第１の非回折ビーム３６を含む第１のビーム３２と、第２の回折ビーム４０及び第２の非回折ビーム４２を含む第２のビーム３８とに分割される。示されるように、集光された光２５は、キューブ状ビームスプリッタ３０により分割され得る。他の実施形態において、光を分割するための他の光素子（例えばプレート状ビームスプリッタ）が使用され得る。

第１の経路に沿って、第１の回折ビーム３４の少なくとも一部が遮断され、第１の非回折ビーム３６の少なくとも一部が透過される。システム１０は、第１のビーム３２を焦点面４６で合焦させる第１の光素子（例えばレンズ４４）を第１のビーム３２の経路に含む。システム１０は、焦点面４６又はその付近に配置されたマスク４８も含む。マスク４８は、第１の回折ビーム３４の少なくとも一部を遮断し、第１の非回折ビーム３６の少なくとも一部を透過させるように構成される。例えば、マスク４８は、光を遮断する材料を含み得、マスク４８は、合焦された第１の非回折ビーム３６の位置又はその付近に配置された開口４９を画定し得る。第１の回折ビーム３４が焦点面４６で合焦されないため、第１の回折ビーム３４の大半は、開口４９を通過せず、マスクにより遮断される。第１の非回折ビーム３６が焦点面４６で合焦されるため、第１の非回折ビームの大半又は全ては、開口４９を通過する。一部の実施形態において、マスク４８は、空間フィルタとして記述され得る。

マスク４８の後方で、第１の非回折ビームの透過部分３７は、可動ミラー５４に遭遇し、第２のビーム３８に対してシフトされ得る。システムは、マスク４８の後方かつ可動ミラー５４の前方に第２の光素子（例えばレンズ５０）を含み得る。一部の実施形態において、第２の光素子（例えばレンズ５０）は、非回折ビームの透過部分３７をコリメートするように構成され得る。一部の実施形態において、第２の光素子（例えばレンズ５０）は、第１の光素子（例えばレンズ４４）の焦点距離と略等しい焦点距離を有し得る。

上記されたように、システム１０は、非回折ビームの透過部分３７を含む第１のビーム３２の経路において第２の光素子（例えばレンズ５０）の後方に可動ミラー５４をさらに含む。可動ミラー５４は、選択された複数の位相シフトのそれぞれを第２のビーム３８に対して第１のビーム３２に生成すべく位置決めされるように構成される。選択された相対位相シフトは、０、π／２、π及び３π／２のいずれかを含み得る。要求される位相シフトを生成するために可動ミラー５４が移動されるべき量は、試料を照明する光の主波長に依存する。例えば、初期位置の可動ミラー５４に相対位相シフトが無く、照明光１６の主ビームの主波長がλである場合、初期位置からのミラーの変位（ΔＰ）と相対位相シフト（Δθ）の間の関係は、以下に与えられる。

８４０ｎｍの波長を有する光の場合、相対位相シフトπ／２は、可動ミラー５４の変位１０５ｎｍに相当する。可動ミラー５４は、可動ミラー５４を正確に変位させるための追加部分又は部品を含む可動ミラーユニット５２の部分であり得る。例えば、システム１０において、可動ミラーユニット５２は、矢印５８で表されるようにビーム経路に沿ってミラーを並進させる圧電変換器５６も含む。圧電変換器５６への入力電圧は、可動ミラー５４が、相対位相シフトに比例して、どの程度遠くに変位されるかを決定する。一部の実施形態において、圧電変換器５６は、計算装置１００を用いて制御され得る（以下の図５の記述を参照）。

他の実施形態において、可動ミラー５４を変位させるために他の装置、システム又は機構が使用され得る。例えば、可動ミラーは、以下の任意の１つ又は任意の組合せにより並進される：圧電アクチュエータ、線形可変差動変圧器（ＬＶＤＴ）駆動ステージ、精密スクリュー駆動ステージ、ボイスコイルアクチュエータ等。

潜在的に位相シフトされた第１の非回折ビームの透過部分３７を含む第１のビーム３２が可動ミラーから反射した後、それは、第２のビームスプリッタ６０により２次元撮像装置（例えばカメラ６２）内に導かれる。

第２のビーム３８の経路に移ると、第２のビーム３８は、第２の回折ビーム４０及び第２の非回折ビーム４２を含む。第１のビームスプリッタ３０からカメラ６２までで測定される第１の非回折ビーム３６の経路長は、第１のビームスプリッタ３０からカメラ６２までで測定される第２の回折ビーム４０の経路長と略等しくあり得る。第２のビーム３８は、第２の非回折ビーム４２を合焦させる第３の光素子（例えばレンズ６４）に遭遇し得る。一部の実施形態において、第３の光素子（例えばレンズ６４）の焦点距離は、第１の光素子（例えばレンズ４４）の焦点距離と略等しくあり得る。第２のビーム３８は、その経路に沿って１つ以上のミラー（例えばミラー６６、６８）により導かれ得る。第２のビーム３８は、第２のビームスプリッタ６０で第１のビーム３２と合成される前に第４の光素子（例えばレンズ６９）にも遭遇し得る。一部の実施形態において、第４の光素子（例えばレンズ６９）は、第３の光素子（例えばレンズ５０）の焦点距離と略等しい焦点距離を有し得る。一部の実施形態において、第４の光素子（例えばレンズ６９）は、第２の回折ビームを２−Ｄ撮像装置（例えばカメラ６２）で合焦させ得る。

一部の実施形態において、第２のビームの経路は、第２の非回折ビーム４２の少なくとも一部を遮断するように構成され、第２の回折ビーム４０の少なくとも一部を透過させるように構成される、第２のマスク（不図示）を含み得る。そのような実施形態において、第２のマスクは、大半の入射光を透過させるが、第２の非回折ビーム４２の焦点である領域で大半の光を遮断する素子の形態をとり得る。第２の非回折ビーム４２の少なくとも一部を遮断することにより位相コントラスト画像のコントラストが高まるが、第２の非回折ビーム４２の焦点で第２のマスクに入射する回折ビーム４０の部分を遮断することにより位相画像の中央の画像品質が低下し得る。

第２のビームスプリッタ６０は、潜在的に位相シフトされた第１の非回折ビームの透過部分３７を含む第１のビーム３２を、第２の回折ビーム４０を含み、第２の非回折ビーム４２を含み得る第２のビーム３８と合成する。第１の非回折ビームの透過部分３７と第２の回折ビーム４０との間の干渉は、位相コントラスト（ＰＣ）画像を２−Ｄ撮像装置（例えばカメラ６２）に生成する。

２−Ｄ撮像装置は、適した分解能を有する任意の２−Ｄ撮像装置（例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、光電子増倍管（ＰＭＴ）カメラ、高分解能ビデオカメラ、又は適当な分解能を有する他の撮像装置）であり得る。一部の実施形態において、２−Ｄ撮像装置（例えばカメラ６２）は、画像又は画像データを解析のための計算装置１００に提供するように構成され得る。本明細書において、用語「画像」は、表示画像及び画像に対応するデータもしくは情報の一方又は両方を意味し得る。よって、画像の獲得は、アナログ画像の獲得又はデジタル画像に対応するデータの獲得を意味し得る。さらに、画像に対応するデータは、生の画像データ、処理された画像データ（例えば、フィルタリングされた、スムージングされた、クロッピングされた）、圧縮された画像データ等であり得る。さらに、画像データは、当業者により理解されるであろう各種のフォーマット（例えば、ＪＰＧ、ビットマップ、ポストスクリプト等）で記憶又は送信され得る。

図２〜図４は、試料の定量位相画像を生成するための例示的な方法を概略的に図示するフローチャートである。図示のために、方法７０、８０及び９０は、図１に描写されるシステム１０に関して記述される。しかし、当業者により理解されるであろうように、方法７０、８０及び９０を実施するために、他の構成を有する他のシステムが使用され得る。

図２は、第１のビームと第２のビームの間の３つの異なる相対位相シフトに基づいて定量位相画像を生成するための例示的な方法７０を図示している。一部の実施形態において、定量位相撮像のための方法は、図２のフローチャートに概略的に描写されるように、０、π／２及びπの位相シフトで位置決めされる位相シフト素子により位相コントラスト画像を得ることを含み得る。方法７０の第１のステップであるステップ７２は、第１のビーム３２と第２のビーム３８の間の相対位相シフト０の位置に位相シフト素子を調節することである。一般に、ステップ７２は、試料の位相コントラストビューを得るための方法８０を実施し、第１のビーム３２と第２のビーム３８の間の相対位相シフト０の位置を表示するビューに到達するまで、位相シフト素子を調節しながら、得られる試料ビューを観察することにより実現され得る。

図３は、試料の位相コントラストビューを得るための方法８０をフローダイヤグラムで概略的に描写している。主光ビーム１６は、試料１４を通じて導かれる（ステップ８１）。主光ビーム１６は、光源１２からであり得る。主光ビームは、低い時間的コヒーレンスを有し得る。例えば、一部の実施形態において、主光ビームは、約１０μｍ未満のコヒーレンス長を有し得る。

試料による回折光１８及び非回折光１７は、集光される（ステップ８２）。図１に図示されるように、回折光１８及び非回折光１７は、顕微鏡２８の部品であり得る１つ以上の主ビーム光素子（例えば、対物レンズ２２及びチューブレンズ２４）を用いて集光され得る。

集光された光２５は、第１の回折ビーム３４及び第１の非回折ビーム３６を含む第１のビーム３２と、第２の回折ビーム４０及び第２の非回折ビーム４２を含む第２のビームとに分割される（ステップ８４）。示されるように、集光された光２５は、キューブ状ビームスプリッタ３０により分割され得る。

第１の非回折ビーム３６は、焦点面４６に合焦される（ステップ８４）。示されるように、第１の非回折ビーム３６は、第１の光素子（例えば第１のレンズ４４）により合焦され得る。他の実施形態において、第１の非回折ビーム３６を合焦させるために、複数のレンズ又は１つ以上の他の種類の光素子（例えば湾曲ミラー）が使用され得る。

焦点面４６又はその付近で、第１の回折ビーム３４の少なくとも一部が遮断され、第１の非回折ビーム３６の少なくとも一部が透過される（ステップ８５）。第１の回折ビーム３４の少なくとも一部を遮断し、第１の非回折ビーム３６の少なくとも一部を透過させるために、焦点面４６又はその付近でマスク４８又は空間フィルタが使用され得る。例えば、マスクは、合焦された第１の非回折ビーム３６の少なくとも一部、大半又は実質的に全てがマスクを通過できるように配置された透過部分又は開口４９を含み得る。透過部分又は開口４９から離れて、マスク４８は、焦点面４６で合焦されない第１の回折ビーム３４の少なくとも一部、大半又は実質的に全てを遮断するように構成される。

一部の実施形態において、第１の非回折ビームの透過部分３７は、第２の光素子（例えばレンズ５０）を通過し得る。第２の光素子は、第１の非回折ビームの透過部分３７をコリメートするように構成され得る。第１の非回折ビームの透過部分３７は、相対位相シフト素子に導かれる（ステップ８６）。相対位相シフト素子は、第２のビーム３８に対して第１のビーム３２の経路を延ばす素子であり得る。示されるように、相対位相シフト素子は、可動ミラーを並進させるための機構（例えば圧電変換器５６）を含む可動ミラーユニット５２の部分であり得る可動ミラー５４であり得る。他の実施形態において、相対位相シフト素子は、物理的な経路長を変化させずに第２のビームに対して第１のビームの光路長を変化させ得る。例えば、一部の実施形態において、位相シフトを得るために、空気の屈折率とは異なる屈折率及び各種の長さを有する各種の光素子が第１のビームの経路内に挿入され得る。別の例として、一部の実施形態において、位相シフトを得るために、異なる屈折率を有する同じ長さの各種の光素子が第１のビームの経路内に挿入され得る。第１のビーム３２が相対位相シフト素子に遭遇した後、第１の非回折ビームの透過部分３７を含む第１のビーム３２は、第２の回折ビーム４０の部分を含む第２のビーム３８と合成される（ステップ８７）。図１に図示されるように、第１のビーム３２及び第２のビーム３８は、第２のビームスプリッタ６０により合成され得る。一部の実施形態において、第２のビーム３８は、第１のビーム３２と合成される前に１つ以上の追加の光素子（例えばレンズ６４及びレンズ６９）に遭遇し得る。

合成ビーム３９は、２−Ｄ撮像装置（例えばカメラ６２）に導かれる（ステップ８８）。例えば、システム１０において、第２のビームスプリッタ６０は、合成ビーム３９の第１のビーム部分をカメラ６２に導くために使用され、ミラー６８は、合成ビーム３９の第２のビーム部分をカメラ６２に導くために使用される。図１に示されるように、合成ビーム３９の第２の回折ビーム部分をカメラ６２上に合焦させるために、レンズ６９等の光素子が使用され得る。

図２のステップ７２により、位相シフト素子を相対位相シフト０の位置に調節することは、位相シフト素子（例えば可動ミラー５４）の位置が調節されるときに、現在の位相コントラストビューをカメラ６２から能動的に観察することを伴い得る。位相シフト素子が第１のビーム３２と第２のビーム３８の間の相対位相シフト０の位置にあるとき、位相コントラストビューは、位相シフト素子が相対位相シフト０の位置から離れるときと比べて、比較的高いコントラスト（例えば最大コントラスト）を有する。

位相シフト素子が相対位相シフト０に位置決めされた（ステップ７２）後、位相シフト０の位相コントラスト画像が得られる（ステップ７３）。図３のステップ８９で、ビューを観察するために使用されるのと同じ２−Ｄ撮像装置を用いて位相コントラスト画像が取り込まれ得る。カメラ６２は、位相コントラスト画像を取り込み、それを内部メモリもしくはカメラ６２のストレージに保存し得、及び／又は、画像を解析及び／又は記憶のための計算装置１００に送信し得る。よって、位相シフト０での位相コントラスト画像は、撮像装置、又は撮像装置から画像を受信した装置のメモリから得られ得る。

ステップ７３で第１の画像が得られた後、位相シフト素子は、π／２の位相シフトに対応する位置に調節される（ステップ７４）。上で説明されたように、ビームが主波長λを有するとすれば、上記数式１は、所望の相対位相シフト（Δθ）を得るべく、可動ミラーが相対位相シフト０の位置からどの程度遠くに変位（ΔＰ）されるべきかを決定するために使用され得る。例えば、上記されたように、８４０ｎｍの波長を有する光の場合、相対位相シフトπ／２は、可動ミラー５４の変位（ΔＰ）１０５ｎｍに相当する。よって、可動ミラー５４は、π／２の位相シフトに位置決めするために１０５ｎｍだけ変位され得る。位相コントラスト画像は、相対位相シフトπ／２に位置決めされた位相シフト素子により得られ得る（ステップ７５）。位相コントラスト画像は、図２に図示される方法８０を用いて得られ得る（ステップ７５）。

位相シフト素子は、次いで、第１のビーム３２と第２のビーム３８の間のπ／２の位相シフトを達成するための位置に調節される（ステップ７６）。例えば、８４０ｎｍの波長を有する光の場合、相対位相シフトπは、相対位相シフト０の位置からの可動ミラー５４の変位２１０ｎｍに相当する。位相コントラスト画像は、相対位相シフトπに位置決めされた位相シフト素子により得られる（ステップ７７）。ジョウキされたように、位相コントラストビューは、図２に図示される方法８０を用いて獲得され取り込まれ得る（ステップ７７）。相対位相シフト０、π／２及びπに位置決めされた位相シフト素子に対応する位相コントラスト画像が得られた後、位相コントラスト画像から定量位相画像が生成される（ステップ７８）。方法８０は、相対位相シフト０、相対位相シフトπ／２及び相対位相シフトπの順序で位相コントラストビューを得るように記述されているが、実際には、相対位相シフト０の位置が決定された後、位相コントラスト画像が任意の順序で得られ得る。さらに、方法７０は、相対位相シフト０、π／２及びπのそれぞれで位相コントラスト画像を得るように記述されているが、所定の位置での位相シフト素子、及び定量位相画像を生成するために使用される前の複数の合成画像（例えば平均された）により、複数の位相コントラスト画像を得ることができる。

位相コントラスト画像は、試料からの回折光と非回折光の間の干渉として、以下の数式により表現され得る。

ここで、Ｉ₀（ｘ，ｙ）は、各位置での位相コントラスト画像強度であり、Ｉ_Uは、非回折光による画像強度であり、Ｉ_Dは、回折光による画像強度であり、Δφ（ｘ，ｙ）は、２次元位相シフトである。Ｉ_U（ｘ，ｙ）及びＩ_D（ｘ，ｙ）の両方は、位置（ｘ，ｙ）の関数であるが、数式では単純化のために、それらが単にＩ_U及びＩ_Dにより表現されている。

システムにおける第１のビームと第２のビームの間の相対位相シフトが、制御された方法で変化し、位相コントラスト画像が０、π／２、π及び３π／２の相対位相シフトで得られる場合、以下の数式が当てはまる。

相対位相シフト０での位相コントラストの数式Ｉ₀（２）、相対位相シフトπ／２での位相コントラストの数式Ｉ₁（３）、及び相対位相シフトπでの位相コントラストの数式Ｉ₂（４）は、Ｉ₀、Ｉ₁及びＩ₂に依存する、画像全体の定量位相の数式を生じさせるように以下の通り組み合わされ得る。

数式６は、相対位相シフト０、π／２及びπをそれぞれに有する位相コントラスト画像Ｉ₀、Ｉ₁及びＩ₂から各位置の定量位相情報を含む定量位相画像を作成するべく、各位置（ｘ，ｙ）での相対位相Δφ（ｘ，ｙ）を決定するために使用され得る。得られた定量位相画像は、３ステップ画像と称され得る。

図４は、４つの位相シフトに基づいて定量位相画像を生成するための例示的な方法９０を図示している。一部の実施形態において、定量位相撮像のための方法は、図４のフローチャートに概略的に描写されるように、０、π／２、π及び３π／２の位相シフトに位置決めされた位相シフト素子により位相コントラスト画像を得ることを含み得る。方法９０は、相対位相シフト０、π／２及びπに位相シフト素子を調節し、各相対位相シフトでの位相コントラストビューを得るための、方法７０の対応するステップ７２〜７７と並行するステップ９１〜９６を含む。方法９０において、位相シフト素子は、相対位相シフト３π／２の位置にも調節され（ステップ９７）、その位相シフトでの位相コントラスト画像が得られる（ステップ９８）。上記されたように、図３の方法８０は、画像として取り込まれ得る所望の位相コントラストビューを得るために使用され得る。相対位相シフト０、π／２、π及び３π／２での位相コントラスト画像から定量位相画像が生成される。

Ｉ₀（ｘ，ｙ）が相対位相シフト０での位相コントラスト画像強度であり、Ｉ₁（ｘ，ｙ）が相対位相シフトπ／２での位相コントラスト画像強度であり、Ｉ₂（ｘ，ｙ）が相対位相シフトπでの位相コントラスト画像強度であり、Ｉ₃（ｘ，ｙ）が相対位相シフト３π／２での位相コントラスト画像強度である場合、上記数式２〜５から導かれる以下の数式７を用いて、画像Δφ（ｘ，ｙ）中の各位置での定量位相Δφ（ｘ，ｙ）を得ることができる。

得られる定量位相画像は、４ステップ画像と称され得る。４ステップ定量位相画像の例は、図６、図８〜図１５、図１７及び図１８〜図２３に表れている。

方法７０のための定量位相画像値Δφ（ｘ，ｙ）は、数式６又は等価式もしくは近似式を評価するために、計算装置（以下の図５に関する議論を参照）を用いて位相コントラスト画像Ｉ₀、Ｉ₁及びＩ₂から計算され得る。Ｉ₂がＩ₁に等しい位置の場合、差（Ｉ₂−Ｉ₁）は、数式６の分母０に関する問題を避けるために、０以外の小さな値として定義され得る。同様に、方法９０のための定量位相データ値Δφ（ｘ，ｙ）は、数式７又は等価式もしくは近似式を評価するために、計算装置を用いて位相コントラスト画像Ｉ₀、Ｉ₁、Ｉ₂及びＩ₃から計算され得る。Ｉ₂がＩ₀に等しい位置の場合、差（Ｉ₂−Ｉ₀）は、数式７の分母０に関する問題を避けるために、０以外の小さな値として定義され得る。

一部の実施形態において、定量位相値の計算は、各位置について（例えば、各画素について、又は各データ点（ｘ₀，ｙ₀）について）実施される。他の実施形態において、位相コントラスト画像データは、定量位相データが計算される前に処理され得る（例えば、ノイズの効果を低減させるために多くの画素にわたって平均化される）。当業者は、位相コントラスト画像データから定量位相データを生成するために多くの様々なコンピュータプログラム及びアルゴリズムが使用され得ることを理解するであろう。

一部の実施形態において、方法（例えば、方法７０、方法９０）は、定量位相画像を視覚表示装置１２２（以下の図５の記述を参照）に表示することをさらに含み得る。４ステップ定量位相画像の例は、図６、図８〜図１５、図１７及び図１８〜図２３に表れている。

一部の実施形態において、方法（例えば、方法７０、方法９０）は、定量位相画像データの少なくとも一部に基づいて、試料の少なくとも一部の厚さを計算することをさらに含み得る。計算値は、定量位相画像中の各位置での厚さ、定量位相画像中の位置の少なくとも一部の各位置での厚さであり得、又は、プロファイルを得るために複数の画素ラインを平均化し得る、定量位相画像に沿うプロファイルであり得る。以下の図７に関する記述を参照されたい。

図５は、本明細書に教示される例示的な方法及びシステムを含む実施形態を実践するのに適した例示的な計算環境を図示している。環境は、関連周辺装置を有する計算装置１００を含む。計算装置１００は、本明細書に教示される各種の方法又は方法の部分を実施するための実行可能コード１５０を実装するようにプログラミング可能である。計算装置１００は、ハードドライブ、ＣＤ−ＲＯＭ又は他の非一時的なコンピュータ読取可能媒体等の記憶装置１１６を含む。記憶装置１１６は、オペレーティングシステム１１８及び他の関連ソフトウェアを記憶し得る。計算装置１００は、メモリ１０６をさらに含み得る。メモリ１０６は、コンピュータのシステムメモリ、又は、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＥＤＯ ＲＡＭ等のランダムアクセスメモリを含み得る。メモリ１０６は、他の種類のメモリ又はそれらの組合せも含み得る。計算装置１００は、実行可能コード１５０の各部分を実装及び処理するための命令を記憶装置１１６及び／又はメモリ１０６に記憶し得る。

実行可能コード１５０は、位相コントラスト画像を解析して、３ステップ及び／又は４ステップ定量位相画像を生成するためのコードを含み得る。一部の実施形態において、実行可能コード１５０は、位相コントラスト画像及び／又は定量位相画像を処理するための画像処理機能（例えば、関心領域のクロッピング、スムージング、定義付け）を含み得る。実行可能コード１５０は、位相コントラストの位相画像及び／又は定量位相画像を表示するためのコードを含み得る。一部の実施形態において、実行可能コード１５０は、定量位相画像中の１つ以上の位置に対応する厚さ情報を決定するためのコードを含み得る。

一部の実施形態において、実行可能コード１５０は、定量位相画像に基づいて細胞体及び／又は細胞核の自動セグメンテーションを実施するためのコードをさらに含み得る。当業者は、ｗａｔｅｒｓｈｅｄ特徴検出、統計的閾値処理（例えば、Ｏｔｓｕ、平均、最小誤差、Ｈｕａｎｇ、三角、及び最小最大閾値処理）及び／又はエッジ強調フィルタ（例えば、アンシャープマスキング、Ｓｏｂｅｌフィルタリング、Ｇａｕｓｓｉａｎフィルタ、Ｋａｌｍａｎフィルタ）を含み得る多くの既知の自動セグメンテーション法及び技術を自動セグメンテーションに利用できることを理解するであろう。一部の実施形態において、実行可能コード１５０は、細胞及び／又は核のユーザ支援型セグメンテーションのための機能（例えば、定量位相画像中の細胞境界又は核境界を表示することをユーザに可能にさせるツール）を含み得る。他の実施形態において、セグメンテーションは、ユーザにより完全に手動で実施され得る。

計算装置１００は、システムハードウェア、周辺装置及び／又は周辺ハードウェアを制御するために、メモリ１０６に記憶されたソフトウェア及び他のプログラムを実行するように、プロセッサ１０２も含み、１つ以上の追加のプロセッサ１０２’を含み得る。プロセッサ１０２及びプロセッサ１０２’をそれぞれ単一コアプロセッサ又は複数コア（１０４及び１０４’）プロセッサとすることができる。計算装置のインフラストラクチャ及びリソースを動的に共有できるように、計算装置１００内で仮想化が利用され得る。仮想化プロセッサは、実行可能コード１５０及び記憶装置１１６内の他のソフトウェアによっても使用され得る。プロセスが複数よりもむしろ１つの計算リソースのみを使用していると見えるように、複数のプロセッサ上で実行するプロセスを取り扱うために、仮想マシン１１４が提供され得る。１つのプロセッサにより複数の仮想マシンを使用することもできる。

ユーザは、ユーザインタフェース１２４又は任意の他のインタフェースを表示し得る、コンピュータモニタ等の視覚表示装置１２２を通して、計算装置１００と相互作用し得る。表示装置１２２のユーザインタフェース１２４は、位相コントラスト画像、定量位相画像、及び／又は各種の周辺装置を制御するためのユーザコントローラを表示するために使用され得る。視覚表示装置１２２は、例示的な実施形態の他の態様又は要素（例えば、記憶装置１１６のためのアイコン）も表示し得る。計算装置１００は、ユーザからの入力を受けるための、キーボード又はマルチポイントタッチインタフェース（例えばタッチスクリーン）１０８及びポインティング装置１１０（例えば、マウス、トラックボール及び／又はトラックパッド）のような他のＩ／Ｏ装置を含み得る。キーボード１０８及びポインティング装置１１０は、有線及び／又は無線接続を介して、視覚表示装置１２２に接続され得及び／又は計算装置１００に接続され得る。計算装置１００は、他の適した従来のＩ／Ｏ周辺機器を含み得る。

一部の実施形態において、計算装置１００は、有線接続を介して、無線接続を介して、及び／又は記憶装置（例えばフラッシュドライブ）の物理的移送を介して、撮像装置１７０（例えば、図１のカメラ６２）から情報（例えば、データ又は画像）を受信し、及び／又は当該装置に情報を送信する。一部の実施形態において、計算装置１００は、撮像装置１７０の１つ以上の態様（例えば、取得レート、画像分解能等）を制御するための実行可能コードを含む。一部の実施形態において、撮像装置１７０自体は、撮像パラメータ（例えば、取得レート、画像分解能等）を制御するためのユーザインタフェースを含み得る。

一部の実施形態において、計算装置１００は、ミラー位置コントローラ１８０から情報を受信し得及び／又は当該コントローラに情報を送信し得る。例えば、計算装置１００は、可動ミラー５４の位置に関する情報を受信し得及び／又は可動ミラー５４の位置の変化をミラー位置コントローラ１８０に指示し得る。一部の実施形態において、ミラー位置コントローラ１８０は、計算装置１００内に組み込まれ得る。

一部の実施形態において、計算装置１００は、顕微鏡／光源１６０から情報を受信し得及び／又は当該装置に情報を送信し得る。例えば、輝度等の光源のパラメータは、計算装置１００を用いて観察及び／又は制御され得る。別の例として、デジタル制御される顕微鏡の場合、顕微鏡のパラメータ（例えば、フォーカス又はフィルタリング）は、計算装置１００を用いて観察又は制御され得る。

計算装置１００は、非限定的に、標準電話線、ＬＡＮもしくはＷＡＮリンク（例えば、８０２．１１、Ｔ１、Ｔ３、５６ｋｂ、Ｘ．２５）、ブロードバンド接続（例えば、ＩＳＤＮ、フレームリレー、ＡＴＭ）、無線接続、コントローラエリアネットワーク（ＣＡＮ）、又は上記のいずれかの組合せもしくは上記の全ての組合せを含む各種の接続を通して、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）又はインターネットを介してネットワーク装置１２６とインタフェースするためのネットワークインタフェース１１２を含み得る。ネットワークインタフェース１１２は、内蔵型ネットワークアダプタ、ネットワークインタフェースカード、ＰＣＭＣＩＡネットワークカード、カードバスネットワークアダプタ、無線ネットワークアダプタ、ＵＳＢネットワークアダプタ、モデム、本明細書に記述される動作を実施可能であり通信可能な任意の種類のネットワークとのインタフェースを計算装置１００に可能にするのに適した他の任意の装置を備え得る。

また、計算装置１００は、ワークステーション、デスクトップコンピュータ、サーバ、ラップトップ、ハンドヘルドコンピュータ等の任意のコンピュータシステム、又は、通信可能であり、本明細書に記述される動作を実施するのに十分なプロセッサ能力及びメモリ容量を有する他の形態の計算もしくは電気通信装置であり得る。

計算装置１００は、ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）オペレーティングシステムの任意のバージョン、Ｕｎｉｘ（登録商標）及びＬｉｎｕｘ（登録商標）オペレーティングシステムの様々なリリース、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータ用のＭＡＣＯＳの任意のバージョン、任意の組み込み型オペレーティングシステム、任意のリアルタイムオペレーティングシステム、任意のオープンソースオペレーティングシステム、著作権のある任意のオペレーティングシステム、モバイル計算装置用の任意のオペレーティングシステム、又は、計算装置上で実行可能であり、本明細書に記述される動作を実施可能な他の任意のオペレーティングシステム等の、任意のオペレーティングシステム１１８を実行することができる。オペレーティングシステムは、ネイティブモード又はエミュレートモードで実行し得る。

この開示の幾つかの態様において、非限定的に４位相表示（例えば、０、π／２、π及び３π／２）を含む複数の位相遅れで画像を連続的に取り込むように構成される定量顕微鏡検査システムが提供され、システムは、複数（例えば４つ）の位相表示からの高速で同時又は略同時の画像表示のために新規の時分割多重化法を利用する。例示的な定量顕微鏡検査システムは、図２４に提示されており、時分割多重化法を実現できる１つのシステムを提供する。そのような構成及び方法は、ヒトの目による知覚に適した定量位相顕微鏡検査画像の表示を可能にし、それにより、数十ミリ秒内の露出時間等の短時間の動的な細胞プロセスを当業者が監視することを可能にする。当業者は、時分割多重化法が多数の定量位相顕微鏡検査システムで使用され得るが、図２４が新規の時分割多重化法が利用され得る１つの定量顕微鏡検査システムを単に提供していることを認識するであろう。

定量位相顕微鏡検査システムの特定の作用機構又は具体的な設計に限定されることを意図せずに、一実施形態において、定量位相顕微鏡検査システムは、特に０、π／２、π及び３π／２の、４つの位相遅れで画像を連続的に取り込むように構成される。画像取得は、例えば、適当な横分解能での画像取得を可能にするＤａｌｓａ ＣＭＯＳのようなモノクロＣＣＤカメラにより実現され得る。システムは、連続位相表示を生成するように設計された複数の装置を備える。この実施形態の一態様において、所望の連続位相遅れを生成するために、合計ウィンドウ時間１．５ミリ秒を有する複数の超高速シャッタが使用される。連続位相表示を生成するための装置として、電気光学変調器が代替的に機能し得る。超高速シャッタ及び電気光学変調器（ＥＯＭ）は、連続位相表示を生成するための単なる例示的な装置であり、本発明を限定することは意図されていない。当業者は、所望の連続位相表示を生成することが可能である任意の装置が本発明の実践に使用され得ることを理解するであろう。

定量位相顕微鏡検査を用いる空間変化のリアルタイム画像取得は、ヒトの目がフリッカーを知覚しないことを確実にし、例えば細胞の位置を連続的に監視するために、少なくとも１５フレーム／秒のスピードで基準ビームの複数（例えば４つ）の光路長から略同時に画像を取得することを要求する。所望のリアルタイム取得を実現するために、連続位相遅れを生成するために使用される複数の装置は、非限定的にカメラ又はセンサを含む検出器と電子的に同期されるように構成され、前者は、画像を生成し、後者は、強度信号を提供する。特定の態様において、この同期は、非限定的に、カメラ又はセンサの同期出力パルスによりデジタルパルス発生器をトリガすることを含めて、同期装置を利用することにより実現される。

センサ取得は、ＰＣにより停止及び開始され、よって、シャッタ／ＥＯＭと自動的に同期される。各シャッタの停止及び開始時間は、反対のフレームへの裏抜けが無いことを確実にするために正確に揃えられる。シャッタ／ＥＯＭは、ＴＴＬ入力に適応し、オープン／クローズ制御を提供する。専用の画像取得ソフトウェアを有するＰＣを用いて生のカメラ画像が取得される。

定量位相顕微鏡検査により得られた画像の品質は、背景ノイズ又は「スペックル」の低減に導く新規の伸張アルゴリズムの適用によっても改良され得る。位相回復用の従来アルゴリズム及びこのアルゴリズムの適用により得られた画像は、図２５に提示されている。本明細書において開発された位相回復用の新規アルゴリズムを用いて得られた改良画像は、両方とも図２６に明らかにされている。定量位相顕微鏡と蛍光顕微鏡の両方で取得された画像に対して、開発されたアルゴリズムをＱＰＭと組み合わせて適用することができる。

数式（６及び／又は７）の数学的な形（すなわち、複素平面内に各種の極を有する周期関数）は、位相計算の発散に寄与し得、事実上、「スペックル」を画像に形成する（例えば、数式（６及び／又は７）の分母が０に近付くとき）。それ自体、スペックルを伴わない画像を実現するために、分数の分子及び分母の特別な数値的評価が必要である。位相画像の均一な背景を保証するアルゴリズムは、以下のステップを伴う。１）画像をフロートフォーマットに変換すること。２）補助複素変数Ｚ＝Ｒｅ＋ｉ＊Ｉｍを計算することであり、ここで、Ｒｅが分数の分子であり、Ｉｍがその分母である。「スペックルを伴う」位相は、単純にＡｒｇ（Ｚ）（補助変数の引数）に等しい。３）「スペックルを伴う」位相２Ｄ画素アレイ内の最小画素値に基づいて分母シフトΔを計算すること。４）「伸張された」補助変数Ｚｓを、
Ｚｓ＝［Ｒｅ＋Δ・ｔｇΔφ］＋ｉ・［Ｉｍ＋Δ］ （８）
として導くこと。

このように実施された伸張は、初期画像の位相が伸張画像の位相と等しい（Ａｒｇ（Ｚ）＝Ａｒｇ（Ｚｓ）であるので、）ことを確実にするが、０に近い分母の値を有する任意の画素は、Δだけシフトされ、事実上、スペックルを排除する。５）伸張変数Ｚｓの引数として最終位相画像を計算すること。６）フロート画像を元のフォーマット（ｊｐｇ、ｔｉｆｆ、ＲＧＢ等）に変換し、ユーザに表示すること。全体アルゴリズムは、ほぼ瞬間的であり（コンピュータの計算スペックのみにより限定される）、スペックルを伴う位相背景のリアルタイム排除を可能にする。

図２６は、センサからの生のＲＧＢ画像（ａ）、数式（６）による位相アルゴリズム（ｂ）、及び数式８による新規アルゴリズム（ｃ）を表示するための自動リアルタイム取得を提供する。

システム及び方法の例
発明者等は、図１に描写されたシステム１０に類似するシステム例を設計及び製作した。システム例は、試料を照明するために、６μｍのコヒーレンス長を有する、波長８４０ｎｍの超ルミネサンスレーザダイオードを使用する。試料により回折される光及び試料により回折されない光を集光するために、対物レンズ及びチューブレンズを含む透過型顕微鏡が使用された。システムは、２つのキューブ状ビームスプリッタを使用した。第１の経路に沿って、システムは、６０ｍｍの焦点距離を有する第１のレンズと、６０ｍｍの焦点距離を有する第２のレンズとを含んでいた。第１のレンズの焦点面に、システムは、合焦された第１の非回折ビームの大半を透過させる一方、第１の回折ビームの大半を遮断する、１５μｍの直径を有する開口を有するマスクを含んでいた。第２の経路に沿って、システムは、１５０μｍの焦点距離を有する第３のレンズと、１５０μｍの焦点距離を有する第４のレンズとを含んでいた。可動ミラーは、０．６４ラジアンに相当する位置分解能及び０から２πに相当する全体レンジを有する圧電変換器の上に配置された。システムは、２−Ｄ画像を得るための高分解能ＣＣＤカメラを含んでいた。以下の記述において、定量位相画像は、回折光及び非回折光の集光、及び撮像領域のスケールのために顕微鏡が使用されるため、定量位相顕微鏡検査（ＱＰＭ）画像と呼ばれる。以下の記述において、図６、図８〜図１５、図１７及び図１８〜図２３に対応して、全てのＱＰＭ画像は、相対位相シフト０、π／２、π及び３π／２での位相コントラスト画像の測定を伴う４ステップ技術を用いて生成される。
ガラス試料にエッチングされた段の結果例
エッチングされた段を有するガラス試料がシステム例により測定された。段は、約２１８ｎｍの高さとなるように、Ｄｅｋｔｅｋ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｆｉｌｏｍｅｔｅｒを用いて個々に測定された。図６のＱＰＭ画像２００は、ガラス試料の４つの測定された位相コントラスト画像から生成された。矩形により表示される領域２０２において、強度値は、グラフ２０４の軌跡２０６として表示される平均位相（ラジアン単位）をｘ（μｍ単位）の関数として提供するために、各行について平均化された。段の位相差Δφ_stepは、０．７６ラジアンに略等しい。Δｈ（ｘ，ｙ）が或る位置での相対高さであり、λ₀が光源の中心波長であり、ｎ（ｘ，ｙ）が当該位置での試料材料の屈折率である、以下の公式を用いて、位相差を高さ差に関連付けることができる。

ガラス試料の場合、ｎは、０．５２の一定値であり、Ｄｅｋｔａｋ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｆｉｌｏｍｅｔｅｒにより測定される値の７％以内である、段の２０３ｎｍの厚さ値を生じさせる。この調和は、試料に関する定量的な厚さ情報をナノメートルスケールで得るために、システム及び方法の例を使用できることを証明している。

生体試料の場合、屈折率は、様々な位置にわたって略一定であり得、又は、様々な種類の細胞又は細胞構造（例えば、核、細胞小器官、細胞壁）によって各位置で変化し得る。例えば、様々な生体試料の屈折率は、少なくとも１．３３〜１．４７の範囲にわたって変化し得る。屈折率が大きく変化する試料において、厚さの決定は、位置（ｘ，ｙ）により変化する屈折率の使用を要求し得る。当業者は、定量位相値から厚さ値を計算するために、様々な細胞及び細胞構造の屈折率の既知の値が使用され得ることを理解するであろう。
ヒト上皮頬細胞の結果例
図８〜図１１は、上述されたシステム例を用いて得られたヒト上皮頬細胞のＱＰＭ画像を示している。ヒト上皮頬細胞は、カバーガラス上で撮像された。定量位相情報が各位置での画像強度により表示される図８により図示されるように、ＱＰＭ画像は、上皮頬細胞２１０、２１２、２１４及び２１６をセグメンテーションのために区別するのに十分なコントラストを提供する。さらに、ＱＰＭ画像は、核２１１、２１３、２１５及び２１７等の細胞内構造を識別するのに十分なコントラストを提供する。図９は、強度とｚ方向高さの両方により位相が識別される、図８に表れる定量位相情報の３次元表現の斜視図を含む。図１０は、ヒト上皮頬細胞の別の２次元ＱＰＭ画像を含む。図１１は、図１０に示されるＱＰＭ情報の３次元表現の斜視図である。図８〜図１１はグレースケールであるが、一部の実施形態において、異なる位相値を表示するために、異なる色が使用され得る。

Ｂ３５細胞の結果例
図１２〜図１５は、上述されたシステム例を用いて得られたＢ３５生細胞のＱＰＭ画像を示している。Ｂ３５細胞株は、新生仔ラットの中枢神経系の腫瘍に由来する神経細胞株である。Ｂ３５生細胞は、撮像チャンバ内で撮像された。定量位相情報が各位置での画像強度により表示される図１２の２次元画像により示されるように、ＱＰＭ画像は、Ｂ３５細胞２３０〜２３９をセグメンテーションのために区別するのに十分なコントラストを提供する。図１３は、強度とｚ方向高さの両方により位相が識別される、図１２に表れる定量位相情報の３次元表現の斜視図を含む。図１４は、Ｂ３５生細胞の別の２次元ＱＰＭ画像を含み、図１５は、ＱＰＭ画像の３次元表現の対応する斜視図である。
腸組織切片の結果例
図１６〜図２０は、腸薄組織切片試料の画像である。図１７は、組織切片試料の２次元ＱＰＭ画像である。図１６は、比較目的での組織切片試料の同じスポットの光強度画像である。図１６及び図１７に図示されるように、図１７の腸組織切片のＱＰＭ画像は、図１６の光学画像と比べて優れた画像分解能及び優れた画像コントラストを提供する。さらに、ＱＰＭ画像は、定量位相情報も提供する。

図１８〜図２０は、様々な倍率に構成されたシステム例により取られた位相コントラスト画像から生成された、腸組織切片試料のＱＰＭ画像を含む。図１８は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＹＰｌａｎＦＬ ４ｘ／０．１３対物レンズ（平面、フルオライト、倍率４ｘ、開口数０．１３）を有する顕微鏡を用いて得られた位相コントラスト画像から生成された、腸薄組織切片のＱＰＭ画像を含む。図１９は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＹＰｌａｎＦＬ ２０ｘ／０．５対物レンズ（平面、フルオライト、倍率２０ｘ、開口数０．５）を有する顕微鏡を用いて得られた位相コントラスト画像から生成された、腸薄組織切片のＱＰＭ画像を含む。図２０は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＵＰｌａｎＳＡｐｏ ４０ｘ／０．９５対物レンズ（平面、アクロマート、倍率４０ｘ、開口数０．９５）を有する顕微鏡を用いて得られた位相コントラスト画像から生成された、腸薄組織切片のＱＰＭ画像を含む。図１９及び図２０により示されるように、それぞれに比較的高い倍率２０ｘ及び４０ｘの下でも、ＱＰＭ画像は、良好な分解能及び良好な画像コントラストを示している。
ラット間葉系幹細胞の結果例
図２１〜図２３は、様々な倍率に構成されたシステム例により取られた位相コントラスト画像から生成された、ラット間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の試料のＱＰＭ画像を含む。ラットＭＳＣは、カバーガラス上で撮像された。ＭＳＣは、ラットの骨髄に由来する多能幹細胞であり、各種の細胞種類に区別することができる。図２１は、顕微鏡内にＯｌｙｍｐｕｓ ＹＰｌａｎＦＬ ４ｘ／０．１３対物レンズ（平面、フルオライト、倍率４ｘ、開口数０．１３）を有するシステム例を用いて得られた位相コントラスト画像から生成された、ＭＳＣのＱＰＭ画像を含む。図２２は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＹＰｌａｎＦＬ ２０ｘ／０．５対物レンズ（平面、フルオライト、倍率２０ｘ、開口数０．５）により得られた位相コントラスト画像から生成された、ＭＳＣのＱＰＭ画像を含む。図２３は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＵＰｌａｎＳＡｐｏ ４０ｘ／０．９５対物レンズ（平面、アクロマート、倍率４０ｘ、開口数０．９５）により得られた位相コントラスト画像から生成された、ＭＳＣのＱＰＭ画像を含む。図２２及び図２３により示されるように、それぞれに比較的高い倍率２０ｘ及び４０ｘの下でも、ＭＳＣのＱＰＭ画像は、良好な分解能及び高い画像コントラストを示している。

本発明の実施形態の一部の特徴が本明細書に図示及び記述されているが、この出願に基づく多くの修正及び変更が当業者にとって明らかであろう。したがって、添付の請求項は、本発明の本来の主旨に属するような修正及び変更の全てをカバーすることが意図されていることを理解されたい。

請求項は、限定事項の具体的な組合せを記載しているが、本発明は、それ自体及び関連する従属請求項に表現される限定事項の任意の可能な組合せであり、明らかに相容れないものを除く組合せと併せて、各独立請求項を明示的に包含している。

Claims (20)

1. 試料の位相コントラスト撮像システムであって、
   ａ）試料を照明するための光源であって、第１のビームスプリッタが光源から少なくとも第１の光ビーム及び第２の光ビームを生成し、第１の光素子が、試料により回折されない第１の光ビームからの光を集光するように構成され、第２の光素子が、試料により回折される第２の光ビームからの光と、試料により回折されない第２の光ビームからの光とを集光するように構成される、光源と、
   ｂ）連続位相遅れを生成するために使用される少なくとも４つの装置であって、第１の光ビームが、連続位相遅れを生成するために使用される少なくとも４つの装置を通過することにより少なくとも４つの位相遅れに分割され、連続位相遅れを生成するための少なくとも４つの装置が、検出器と電子的に同期される、少なくとも４つの装置と、
   ｃ）連続位相表示を生成するために使用される少なくとも４つの装置を通過した後の第１の光ビームからの光を集光し、試料を通過した後の第２の光ビームからの光を後からさらに集光する検出器と、
   ｄ）同期装置であって、パルス発生器である同期装置と、
   ｅ）試料からの光及び非回折基準ビームを集光する第２のビームスプリッタと、
   を備える、システム。
2. 少なくとも４つの位相遅れが０、π／２、π及び３π／２である、請求項１記載のシステム。
3. システムが、１つ以上の細胞を含む試料の、標識を伴わない高コントラスト撮像のために構成される、請求項１又は請求項２記載のシステム。
4. システムが、数十ミリ秒の動的な生体プロセスの、標識を伴わない高コントラスト撮像のために構成される、請求項１又は請求項２記載のシステム。
5. 動的な生体プロセスが、心臓細胞収縮又は神経系モデル伸張である、請求項４記載のシステム。
6. 試料を照明するための光源が、低コヒーレンスの光ビームを生成し、コヒーレンス長が１０μｍ未満である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のシステム。
7. 少なくとも１つの主ビーム光素子が顕微鏡の対物レンズを備える、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のシステム。
8. 少なくとも１つの主ビーム光素子がチューブレンズを備える、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載のシステム。
9. 連続位相遅れを生成するために使用される少なくとも４つの装置が、超高速シャッタ又は電気光学変調器である、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のシステム。
10. 検出器がカメラ又はセンサである、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載のシステム。
11. 定量位相撮像のための方法であって、
    ａ）試料を照明するための光源であって、第１のビームスプリッタが光源から少なくとも第１の光ビーム及び第２の光ビームを生成し、第１の光素子が、試料により回折されない第１の光ビームからの光を集光するように構成され、第２の光素子が、試料により回折される第２の光ビームからの光と、試料により回折されない第２の光ビームからの光とを集光するように構成される、光源を用意するステップと、
    ｂ）第１の光ビームを、連続位相遅れを生成するために使用される少なくとも４つの装置に通過させることにより少なくとも４つの位相遅れに分割するステップであって、連続位相遅れを生成するための少なくとも４つの装置が、検出器と電子的に同期される、ステップと、
    ｃ）連続位相表示を生成するために使用される少なくとも４つの装置を通過した後の第１の光ビームからの光と、試料を通過した後の第２の光ビームからの後からの光とを検出器により集光するステップであって、第１及び第２の光ビーム（３２、３８）からの光が、検出器により電気的に同期される、ステップと、
    ｄ）超高速シャッタ又はＥＯＭを利用することにより、４つの経路長からの交互位相画像を取り込むセンサを電子的に同期するステップと、
    を含む、方法。
12. 少なくとも４つの位相遅れが０、π／２、π及び３π／２である、請求項１１記載の方法。
13. 試料が１つ以上の細胞を含み、定量位相画像が、標識を伴わない、試料の高コントラスト画像である、請求項１１又は請求項１２記載の方法。
14. 連続位相遅れを生成するために使用される少なくとも４つの装置が、超高速シャッタ又は電気光学変調器である、請求項１１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
15. 検出器がカメラ又はセンサである、請求項１１乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法。
16. 方法が、定量位相画像に基づいて、標識を伴わずに細胞及び／又は核の自動セグメンテーションを実施することをさらに含む、請求項１１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
17. 方法が、ヒトの目によるフリッカーの知覚を伴わないＱＰＭ画像の略同時表示を可能にすることをさらに含む、請求項１１乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
18. 方法が、心臓細胞収縮又は神経系モデル伸張等、数十ミリ秒の動的な生体プロセスの、標識を伴わない高コントラスト撮像をさらに含む、請求項１１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
19. 試料が細胞単層を含み、方法が、試料の定量位相画像の少なくとも一部に基づいて、試料に関する定量的な厚さ情報を生成することをさらに含む、請求項１８記載の方法。
20. 定量位相画像の少なくとも一部に基づいて、定量位相画像の少なくとも一部における各位置の定量的な厚さ情報を生成することをさらに含む、請求項１１乃至請求項１９のいずれか１項記載の方法。