JP7066740B2 - 刺激された放出に基づく蛍光顕微鏡法システムおよび方法 - Google Patents
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Description
本出願は、35 U.S.C.§119(e)およびPCT条約8の下で、2017年4月11日に出願された「FLUORESCENCE MICROSCOPY SYSTEM AND METHODS BASED ON STIMULATED EMISSION」という題名の同時係属の米国仮出願第62/484,171号の利益を主張する。上記文献は、全ての目的のためにその全体として参照することによって本明細書において援用される。
蛍光顕微鏡は、有機または無機物質の性質を研究するために、反射および吸収の代わりに、またはそれに加えて、蛍光(または燐光)を使用する光学顕微鏡である。例えば、蛍光顕微鏡法は、生細胞、組織、および動物における高分解能、高速、タンパク質特有結像を提供する、生物学者にとって非常に貴重なツールである。蛍光顕微鏡法は、光を吸収し、異なる波長においてその光を自発的に再放出するマーカ(フルオロフォアとも称される)を使用する。特に、結像される試料は、フルオロフォアによって吸収される具体的波長(または複数の波長)の光を用いて照射され、それらを励起電子状態に入らせる。自発放出は、それによって励起状態におけるフルオロフォアが、吸収光よりも長い波長の(すなわち、異なる色の)蛍光の放射(放出)を通して基底状態に緩和されるプロセスである。照明光は、スペクトルフィルタの使用を通して、はるかに弱い放出された蛍光から分離される。吸収と自発放出との間のナノ秒スケールの遅れは、蛍光マーカが1秒あたり放出する光の量を限定し、これは、信号レベル(「輝度」)および測定速度を基本的に限定する。例えば、これがDNA鎖に沿って移動する際のRNAポリメラーゼの個々のステップを見ることは、典型的な蛍光タンパク質が自発放出を通して生産し得るものよりもはるかに多い、1ミリ秒あたり数千の光子を放出するマーカを要求する。
側面および実施形態は、概して、蛍光顕微鏡法/結像に関し、特に、フルオロフォアからの信号を増加させるための機構としての刺激された放出を区別するシステムおよび方法に関する。検出および結像のためにサンプル中の蛍光マーカの信号強度を強化するように刺激された放出を区別するための技法を採用する、蛍光顕微鏡法システムの種々の実施形態が、開示される。したがって、蛍光マーカの輝度および光安定性を大幅に増加させることは、下記にさらに議論されるように、高速、高精度結像および測定を可能にし得る。用語「蛍光顕微鏡法」、「フルオロフォア」、「蛍光マーカ」、および「蛍光分子」が、解説の便宜および明確化のために本開示全体を通して使用されるが、本明細書に開示される方法およびシステムの側面ならびに実施形態は、蛍光のみの使用に限定されず、燐光および他の発光マーカならびにプロセスに等しく適用されることが理解されるものである。本明細書に使用されるように、蛍光という用語および関連付けられる用語は、1つの波長における電磁放射の吸収および別のより低いエネルギー波長におけるその再放出を指すことを意図している。
本願明細書は、例えば、以下の項目も提供する。
(項目1)
蛍光結像システムであって、
第1の軸に沿って励起ビームを生成するように構成された励起源と、
前記第1の軸に対して垂直配向にある第2の軸に沿って刺激ビームを生成するように構成された刺激源であって、前記励起ビームおよび前記刺激ビームは、異なる波長を有する、刺激源と、
複数の蛍光マーカを有するサンプルであって、前記複数の蛍光マーカは、前記複数の蛍光マーカが励起状態をとるように前記励起光ビームによって照射され、次いで、前記最初に励起されたサンプルによる刺激された放出を生成するように前記刺激光ビームによって再び照射される、サンプルと、
前記第2の軸に沿って配向され、前記刺激ビームおよび前記複数の蛍光マーカによって放出された前記刺激された放出を捕捉し、集束させるように構成されている、対物レンズと、
前記対物レンズの後焦点面に位置付けられ、前記刺激された放出が通過することを可能にしながら前記刺激ビームを減衰させるように構成されている、刺激ビーム減衰器と、
前記刺激された放出と基準ビームとの間の相対位相偏移を誘発し、前記基準ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産するように構成されている、位相調節構成要素と、
前記刺激された放出を結像するように構成された検出器と
を備える、蛍光結像システム。
(項目2)
前記基準ビームは、前記減衰させられた刺激ビームである、項目1に記載の蛍光結像システム。
(項目3)
前記刺激ビーム減衰器は、中心ピンホール開口を有する、ビームブロックを含み、前記ビームブロックは、前記刺激ビームに対して光学的に不透過性であり、前記刺激ビーム減衰器は、前記刺激ビームの一部が前記中心ピンホール開口を通過し、前記減衰させられた刺激ビームを提供するように位置付けられている、項目2に記載の蛍光結像システム。
(項目4)
前記刺激ビーム減衰器は、グレーフィルタを含む、項目2に記載の蛍光結像システム。
(項目5)
前記第1の軸に沿った前記励起ビームは、前記対物レンズによって捕捉されない、項目1に記載の蛍光結像システム。
(項目6)
前記刺激ビームは、コリメートされる、項目1に記載の蛍光結像システム。
(項目7)
前記対物レンズと前記検出器との間に位置付けられ、前記検出器上に前記刺激された放出を集束させるように構成されている、少なくとも1つのレンズをさらに備える、項目1に記載の蛍光結像システム。
(項目8)
前記少なくとも1つのレンズは、第1のレンズと、第2のレンズと、第3のレンズとを含み、前記第1および第2のレンズは、光学リレーとして構成され、前記第3のレンズは、前記光学リレーから前記刺激された放出を受光し、前記検出器上に前記刺激された放出を集束させるように位置付けられ、構成されている、項目6に記載の蛍光結像システム。
(項目9)
前記刺激源および前記励起源は、それぞれ、レーザを含む、項目1に記載の蛍光結像システム。
(項目10)
前記位相偏移構成要素は、所定の度数の固定位相偏移を前記刺激された放出および前記基準ビームのうちの1つに付与するように構成されている、項目1に記載の蛍光結像システム。
(項目11)
前記位相偏移構成要素は、回転可能である、項目1に記載の蛍光結像システム。
(項目12)
刺激された放出に基づく蛍光結像の方法であって、
サンプル中の複数の蛍光マーカが励起状態をとるように、第1の軸に沿って配向された励起源からの励起ビームを用いて、前記複数の蛍光マーカを照射することと、
前記第1の軸に垂直関係にある第2の軸に沿って配向された刺激源からの刺激ビームを用いて、前記励起状態における前記複数の蛍光マーカを照射することであって、刺激された放出は、前記刺激ビームによって照射されると、前記1つ以上の蛍光マーカによって生成され、前記刺激ビームおよび前記励起ビームは、異なる波長を有する、ことと、
対物レンズを通して前記刺激ビームおよび前記刺激された放出を集束させることと、
前記対物レンズ後、前記第2の軸に沿って位置付けられた刺激ビーム減衰器を用いて前記刺激ビームを減衰させ、減衰させられた刺激ビームを生産することと、
前記減衰させられた刺激ビームに対して前記刺激された放出を位相偏移させることによって、前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産することと、
検出器を用いて前記刺激された放出を結像することと
を含む、方法。
(項目13)
レンズを使用して前記検出器上に前記刺激された放出を集束させることをさらに含む、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記刺激された放出を前記対物レンズから付加的レンズに中継することと、
前記付加的レンズを使用して、前記検出器上に前記刺激された放出を集束させることと
をさらに含む、項目12に記載の方法。
(項目15)
刺激された放出に基づく蛍光結像の方法であって、
サンプル中の複数の蛍光マーカが励起状態をとるように、第1の軸に沿って配向された励起源からの励起ビームを用いて、前記複数の蛍光マーカを照射することと、
前記第1の軸に垂直関係にある第2の軸に沿って配向された刺激源からの刺激ビームを用いて、前記励起状態における前記複数の蛍光マーカを照射することであって、刺激された放出は、前記刺激ビームによって照射されると、前記1つ以上の蛍光マーカによって生成され、前記刺激ビームおよび前記励起ビームは、異なる波長を有する、ことと、
対物レンズを通して前記刺激ビームおよび前記刺激された放出を集束させることと、
前記対物レンズ後、前記第2の軸に沿って位置付けられた刺激ビーム減衰器を用いて前記刺激ビームを減衰させることと、
基準ビームと前記刺激された放出との間の相対位相偏移を誘発することによって、前記基準ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産することと、
検出器を用いて前記刺激された放出を結像することと
を含む、方法。
(項目16)
前記刺激ビームを減衰させることは、減衰させられた刺激ビームを生産することを含み、前記基準ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産することは、前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産することを含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記刺激ビームを減衰させることは、グレーフィルタを通して前記減衰ビームの一部を通過させることを含む、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記刺激ビームを減衰させることは、中心ピンホール開口を有するビームブロック上に前記刺激ビームを集束させることであって、前記ビームブロックは、前記刺激ビームに対して光学的に不透過性である、ことと、前記中心ピンホール開口を通して前記刺激ビームの一部を通過させ、前記減衰させられた刺激ビームを提供することとを含む、項目16に記載の方法。
(項目19)
前記基準ビームと前記刺激された放出との間の前記相対位相偏移を誘発することは、位相調節板を通して前記基準ビームおよび前記刺激された放出のうちの少なくとも1つを通過させることを含む、項目15に記載の方法。
(項目20)
蛍光結像システムであって、
励起ビームを生成し、複数の蛍光マーカを含有するサンプルを照射するように構成されている、励起源であって、前記励起ビームは、前記複数の蛍光マーカの吸収帯内の第1の波長を有し、前記複数の蛍光マーカを励起状態に励起するように構成されている、励起源と、
コリメートされた刺激ビームを生成し、前記サンプルをさらに照射するように構成されている、刺激源であって、前記刺激ビームは、前記複数の蛍光マーカの放出帯内の第2の波長を有し、前記励起状態における前記複数の蛍光マーカを刺激し、刺激された放出を生産するように構成されている、刺激源と、
前記刺激ビームおよび前記刺激された放出を受光するように構築および配列された対物レンズと、
前記対物レンズから前記刺激ビームおよび前記刺激された放出を受光し、前記刺激ビームを減衰させ、基準ビームと前記刺激された放出との間の相対位相偏移を誘発し、それによって、前記基準ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を引き起こすように構成されている、位相偏移および減衰装置と、
前記刺激された放出を受光および結像するように構成された検出器と、
前記対物レンズと前記検出器との間に位置付けられ、前記検出器における結像面上に前記刺激された放出を集束させるように構成されている、光学装置と
を備える、蛍光結像システム。
(項目21)
前記位相偏移および減衰装置は、前記対物レンズの後焦点面に位置付けられた減衰領域を有する位相調節板を含み、前記減衰領域は、前記刺激ビームを減衰させるように構成されている、項目20に記載の蛍光結像システム。
(項目22)
前記位相調節板はさらに、前記刺激された放出を位相偏移させ、それによって、前記基準ビームと前記刺激された放出との間の前記相対位相偏移を誘発するように構成されている、項目21に記載の蛍光結像システム。
(項目23)
前記減衰領域は、グレーフィルタを含む、項目21に記載の蛍光結像システム。
(項目24)
前記基準ビームは、前記減衰させられた刺激ビームである、項目20に記載の蛍光結像システム。
(項目25)
前記位相偏移および減衰装置は、
前記対物レンズの後焦点面に位置付けられ、前記刺激ビームを減衰させ、減衰させられた刺激ビームを生産するように構成されている、刺激ビーム減衰器と、
前記刺激ビーム減衰器と前記検出器との間に位置付けられた位相調節板と
を含む、項目24に記載の蛍光結像システム。
(項目26)
前記位相調節板はさらに、前記刺激された放出を位相偏移させるように構成され、前記減衰させられた刺激ビームを通過させる中心開口を含む、項目25に記載の蛍光結像システム。
(項目27)
前記刺激ビーム減衰器は、中心ピンホール開口を有する刺激ビームブロックを含み、前記刺激ビームブロックは、前記中心ピンホールを通して前記刺激ビームの一部を通過させ、前記減衰させられた刺激ビームを生産するように配列されている、項目25に記載の蛍光結像システム。
(項目28)
前記光学装置は、前記刺激ビーム減衰器と前記位相調節板との間に位置付けられた光学リレーと、前記位相調節板と前記検出器との間に位置付けられ、前記結像面上に前記刺激された放出を集束させるように構成されている、レンズとを含む、項目20に記載の蛍光結像システム。
(項目29)
前記刺激源および前記対物レンズは、第1の軸に沿って配列され、前記刺激源は、前記第1の軸に沿って前記刺激ビームを指向するように構成され、前記励起源は、前記第1の軸に直交する第2の軸に沿って前記励起ビームを指向するように配列および構成されている、項目20に記載の蛍光結像システム。
(項目30)
刺激された放出に基づく蛍光結像の方法であって、
サンプルと関連付けられる複数の蛍光マーカを励起状態に励起することと、
刺激ビームを用いて前記サンプルを照射し、前記励起状態における前記複数の蛍光マーカを刺激し、刺激された放出を生産することと、
前記サンプルを通して透過される前記刺激ビームを減衰させ、減衰させられた刺激ビームを生産することと、
前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間の相対位相偏移を誘発し、前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を提供することと、
結像面上に前記刺激された放出を集束させることと、
前記結像面に位置する結像検出器を用いて前記刺激された放出を検出することと
を含む、方法。
(項目31)
前記複数の蛍光マーカを励起することは、前記複数の蛍光マーカの吸収帯内の波長を有する励起ビームを用いて前記サンプルを照射することを含む、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記対物レンズを用いて前記サンプルを通して透過される前記刺激された放出および前記刺激ビームを収集し、集束させることをさらに含む、項目30に記載の方法。
(項目33)
前記刺激ビームを減衰させることは、前記対物レンズの後焦点面に位置する刺激ビーム減衰器を用いて、前記対物レンズからの前記刺激ビームを遮断することを含む、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間の前記相対位相偏移を誘発することは、前記刺激された放出および前記減衰させられた刺激ビームのうちの少なくとも1つを位相偏移させるように構成された位相調節板を通して前記刺激された放出および前記減衰させられた刺激ビームを透過させることを含む、項目33に記載の方法。
(項目35)
粒子移動を追跡する方法であって、
項目30に記載の方法を使用して、前記粒子と関連付けられる蛍光マーカから生産される刺激された放出を結像することと、
前記画像を分析し、前記粒子の移動を追跡することと
を含む、方法。
(項目36)
前記粒子は、タンパク質である、項目35に記載の方法。
(項目37)
結像モードフローサイトメトリを実施する方法であって、
項目30に記載の方法を使用して、着目粒子と関連付けられる蛍光マーカから生産される刺激された放出を結像することと、
前記画像を分析し、前記粒子の移動を追跡することと
を含む、方法。
側面および実施形態は、刺激された放出結像のための蛍光顕微鏡法システムおよび方法、ならびにその用途を対象とする。特に、実施形態は、背景刺激光から刺激された放出を区別し、それによって、蛍光マーカの信号強度を増加させるために、刺激された放出結像の文脈における位相コントラスト顕微鏡法の原理を適用する。
Claims (37)
- 蛍光結像システムであって、
第1の軸に沿って励起ビームを生成するように構成された励起源と、
第2の軸に沿って刺激ビームを生成するように構成された刺激源であって、前記励起ビームおよび前記刺激ビームは、異なる波長を有する、刺激源と、
複数の蛍光マーカを有するサンプルであって、前記複数の蛍光マーカは、前記複数の蛍光マーカが励起状態をとるように前記励起光ビームによって照射され、次いで、前記最初に励起されたサンプルによる刺激された放出を生成するように前記刺激光ビームによって再び照射される、サンプルと、
前記第2の軸に沿って配向され、前記刺激ビームおよび前記複数の蛍光マーカによって放出された前記刺激された放出を捕捉し、集束させるように構成されている、対物レンズと、
前記対物レンズの後焦点面に位置付けられ、前記刺激された放出が通過することを可能にしながら前記刺激ビームを減衰させるように構成されている、刺激ビーム減衰器と、
前記刺激された放出と基準ビームとの間の相対位相偏移を誘発し、前記基準ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産するように構成されている、位相調節構成要素と、
前記刺激された放出を結像するように構成された検出器と
を備える、蛍光結像システム。 - 前記基準ビームは、前記減衰させられた刺激ビームである、請求項1に記載の蛍光結像システム。
- 前記刺激ビーム減衰器は、中心ピンホール開口を有する、ビームブロックを含み、前記ビームブロックは、前記刺激ビームに対して光学的に不透過性であり、前記刺激ビーム減衰器は、前記刺激ビームの一部が前記中心ピンホール開口を通過し、前記減衰させられた刺激ビームを提供するように位置付けられている、請求項2に記載の蛍光結像システム。
- 前記刺激ビーム減衰器は、グレーフィルタを含む、請求項2に記載の蛍光結像システム。
- 前記第1の軸に沿った前記励起ビームは、前記対物レンズによって捕捉されない、請求項1に記載の蛍光結像システム。
- 前記刺激ビームは、コリメートされる、請求項1に記載の蛍光結像システム。
- 前記対物レンズと前記検出器との間に位置付けられ、前記検出器上に前記刺激された放出を集束させるように構成されている、少なくとも1つのレンズをさらに備える、請求項1に記載の蛍光結像システム。
- 前記少なくとも1つのレンズは、第1のレンズと、第2のレンズと、第3のレンズとを含み、前記第1および第2のレンズは、光学リレーとして構成され、前記第3のレンズは、前記光学リレーから前記刺激された放出を受光し、前記検出器上に前記刺激された放出を集束させるように位置付けられ、構成されている、請求項6に記載の蛍光結像システム。
- 前記刺激源および前記励起源は、それぞれ、レーザを含む、請求項1に記載の蛍光結像システム。
- 前記位相偏移構成要素は、所定の度数の固定位相偏移を前記刺激された放出および前記基準ビームのうちの1つに付与するように構成されている、請求項1に記載の蛍光結像システム。
- 前記位相偏移構成要素は、回転可能である、請求項1に記載の蛍光結像システム。
- 刺激された放出に基づく蛍光結像の方法であって、
サンプル中の複数の蛍光マーカが励起状態をとるように、第1の軸に沿って配向された励起源からの励起ビームを用いて、前記複数の蛍光マーカを照射することと、
第2の軸に沿って配向された刺激源からの刺激ビームを用いて、前記励起状態における前記複数の蛍光マーカを照射することであって、刺激された放出は、前記刺激ビームによって照射されると、前記1つ以上の蛍光マーカによって生成され、前記刺激ビームおよび前記励起ビームは、異なる波長を有する、ことと、
対物レンズを通して前記刺激ビームおよび前記刺激された放出を集束させることと、
前記対物レンズ後、前記第2の軸に沿って位置付けられた刺激ビーム減衰器を用いて前記刺激ビームを減衰させ、減衰させられた刺激ビームを生産することと、
前記減衰させられた刺激ビームに対して前記刺激された放出を位相偏移させることによって、前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産することと、
検出器を用いて前記刺激された放出を結像することと
を含む、方法。 - レンズを使用して前記検出器上に前記刺激された放出を集束させることをさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 前記刺激された放出を前記対物レンズから付加的レンズに中継することと、
前記付加的レンズを使用して、前記検出器上に前記刺激された放出を集束させることと
をさらに含む、請求項12に記載の方法。 - 刺激された放出に基づく蛍光結像の方法であって、
サンプル中の複数の蛍光マーカが励起状態をとるように、第1の軸に沿って配向された励起源からの励起ビームを用いて、前記複数の蛍光マーカを照射することと、
第2の軸に沿って配向された刺激源からの刺激ビームを用いて、前記励起状態における前記複数の蛍光マーカを照射することであって、刺激された放出は、前記刺激ビームによって照射されると、前記1つ以上の蛍光マーカによって生成され、前記刺激ビームおよび前記励起ビームは、異なる波長を有する、ことと、
対物レンズを通して前記刺激ビームおよび前記刺激された放出を集束させることと、
前記対物レンズ後、前記第2の軸に沿って位置付けられた刺激ビーム減衰器を用いて前記刺激ビームを減衰させることと、
基準ビームと前記刺激された放出との間の相対位相偏移を誘発することによって、前記基準ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産することと、
検出器を用いて前記刺激された放出を結像することと
を含む、方法。 - 前記刺激ビームを減衰させることは、減衰させられた刺激ビームを生産することを含み、前記基準ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産することは、前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産することを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記刺激ビームを減衰させることは、グレーフィルタを通して前記減衰ビームの一部を通過させることを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記刺激ビームを減衰させることは、中心ピンホール開口を有するビームブロック上に前記刺激ビームを集束させることであって、前記ビームブロックは、前記刺激ビームに対して光学的に不透過性である、ことと、前記中心ピンホール開口を通して前記刺激ビームの一部を通過させ、前記減衰させられた刺激ビームを提供することとを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記基準ビームと前記刺激された放出との間の前記相対位相偏移を誘発することは、位相調節板を通して前記基準ビームおよび前記刺激された放出のうちの少なくとも1つを通過させることを含む、請求項15に記載の方法。
- 蛍光結像システムであって、
励起ビームを生成し、複数の蛍光マーカを含有するサンプルを照射するように構成されている、励起源であって、前記励起ビームは、前記複数の蛍光マーカの吸収帯内の第1の波長を有し、前記複数の蛍光マーカを励起状態に励起するように構成されている、励起源と、
コリメートされた刺激ビームを生成し、前記サンプルをさらに照射するように構成されている、刺激源であって、前記刺激ビームは、前記複数の蛍光マーカの放出帯内の第2の波長を有し、前記励起状態における前記複数の蛍光マーカを刺激し、刺激された放出を生産するように構成されている、刺激源と、
前記刺激ビームおよび前記刺激された放出を受光するように構築および配列された対物レンズと、
前記対物レンズから前記刺激ビームおよび前記刺激された放出を受光し、前記刺激ビームを減衰させ、基準ビームと前記刺激された放出との間の相対位相偏移を誘発し、それによって、前記基準ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を引き起こすように構成されている、位相偏移および減衰装置と、
前記刺激された放出を受光および結像するように構成された検出器と、
前記対物レンズと前記検出器との間に位置付けられ、前記検出器における結像面上に前記刺激された放出を集束させるように構成されている、光学装置と
を備える、蛍光結像システム。 - 前記位相偏移および減衰装置は、前記対物レンズの後焦点面に位置付けられた減衰領域を有する位相調節板を含み、前記減衰領域は、前記刺激ビームを減衰させるように構成されている、請求項20に記載の蛍光結像システム。
- 前記位相調節板はさらに、前記刺激された放出を位相偏移させ、それによって、前記基準ビームと前記刺激された放出との間の前記相対位相偏移を誘発するように構成されている、請求項21に記載の蛍光結像システム。
- 前記減衰領域は、グレーフィルタを含む、請求項21に記載の蛍光結像システム。
- 前記基準ビームは、前記減衰させられた刺激ビームである、請求項20に記載の蛍光結像システム。
- 前記位相偏移および減衰装置は、
前記対物レンズの後焦点面に位置付けられ、前記刺激ビームを減衰させ、減衰させられた刺激ビームを生産するように構成されている、刺激ビーム減衰器と、
前記刺激ビーム減衰器と前記検出器との間に位置付けられた位相調節板と
を含む、請求項24に記載の蛍光結像システム。 - 前記位相調節板はさらに、前記刺激された放出を位相偏移させるように構成され、前記減衰させられた刺激ビームを通過させる中心開口を含む、請求項25に記載の蛍光結像システム。
- 前記刺激ビーム減衰器は、中心ピンホール開口を有する刺激ビームブロックを含み、前記刺激ビームブロックは、前記中心ピンホールを通して前記刺激ビームの一部を通過させ、前記減衰させられた刺激ビームを生産するように配列されている、請求項25に記載の蛍光結像システム。
- 前記光学装置は、前記刺激ビーム減衰器と前記位相調節板との間に位置付けられた光学リレーと、前記位相調節板と前記検出器との間に位置付けられ、前記結像面上に前記刺激された放出を集束させるように構成されている、レンズとを含む、請求項20に記載の蛍光結像システム。
- 前記刺激源および前記対物レンズは、第1の軸に沿って配列され、前記刺激源は、前記第1の軸に沿って前記刺激ビームを指向するように構成され、前記励起源は、前記第1の軸に直交する第2の軸に沿って前記励起ビームを指向するように配列および構成されている、請求項20に記載の蛍光結像システム。
- 刺激された放出に基づく蛍光結像の方法であって、
サンプルと関連付けられる複数の蛍光マーカを励起状態に励起することと、
刺激ビームを用いて前記サンプルを照射し、前記励起状態における前記複数の蛍光マーカを刺激し、刺激された放出を生産することと、
前記サンプルを通して透過される前記刺激ビームを減衰させ、減衰させられた刺激ビームを生産することと、
前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間の相対位相偏移を誘発し、前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を提供することと、
結像面上に前記刺激された放出を集束させることと、
前記結像面に位置する結像検出器を用いて前記刺激された放出を検出することと
を含む、方法。 - 前記複数の蛍光マーカを励起することは、前記複数の蛍光マーカの吸収帯内の波長を有する励起ビームを用いて前記サンプルを照射することを含む、請求項30に記載の方法。
- 前記対物レンズを用いて前記サンプルを通して透過される前記刺激された放出および前記刺激ビームを収集し、集束させることをさらに含む、請求項30に記載の方法。
- 前記刺激ビームを減衰させることは、前記対物レンズの後焦点面に位置する刺激ビーム減衰器を用いて、前記対物レンズからの前記刺激ビームを遮断することを含む、請求項32に記載の方法。
- 前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間の前記相対位相偏移を誘発することは、前記刺激された放出および前記減衰させられた刺激ビームのうちの少なくとも1つを位相偏移させるように構成された位相調節板を通して前記刺激された放出および前記減衰させられた刺激ビームを透過させることを含む、請求項33に記載の方法。
- 粒子移動を追跡する方法であって、
請求項30に記載の方法を使用して、前記粒子と関連付けられる蛍光マーカから生産される刺激された放出を結像することと、
前記画像を分析し、前記粒子の移動を追跡することと
を含む、方法。 - 前記粒子は、タンパク質である、請求項35に記載の方法。
- 結像モードフローサイトメトリを実施する方法であって、
請求項30に記載の方法を使用して、着目粒子と関連付けられる蛍光マーカから生産される刺激された放出を結像することと、
前記画像を分析し、前記粒子の移動を追跡することと
を含む、方法。
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