JP2020516953A - 刺激された放出に基づく蛍光顕微鏡法システムおよび方法 - Google Patents

Abstract

刺激された放出に基づく蛍光結像。一実施例では、システムは、励起ビームを用いてサンプル中の蛍光マーカを励起する、励起源と、刺激された放出を生産するために励起された蛍光マーカを刺激する、刺激源と、刺激ビームおよび刺激された放出を受光する、対物レンズとを含む。本システムはさらに、対物レンズから刺激ビームおよび刺激された放出を受光し、刺激ビームを減衰させ、基準ビーム（随意に、刺激ビームの少なくとも一部である）と刺激された放出との間の相対位相偏移を誘発し、それによって、基準ビームと刺激された放出との間に強め合う干渉を引き起こすように構成される、位相偏移および減衰装置を含む。本システムはさらに、結像面上に刺激された放出を集束させるように構成される、光学装置と、結像面に位置付けられ、刺激された放出を結像するように構成される、検出器とを含む。

Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）およびＰＣＴ条約８の下で、２０１７年４月１１日に出願された「ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＹ ＳＹＳＴＥＭ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＢＡＳＥＤ ＯＮ ＳＴＩＭＵＬＡＴＥＤ ＥＭＩＳＳＩＯＮ」という題名の同時係属の米国仮出願第６２／４８４，１７１号の利益を主張する。上記文献は、全ての目的のためにその全体として参照することによって本明細書において援用される。

（背景）
蛍光顕微鏡は、有機または無機物質の性質を研究するために、反射および吸収の代わりに、またはそれに加えて、蛍光（または燐光）を使用する光学顕微鏡である。例えば、蛍光顕微鏡法は、生細胞、組織、および動物における高分解能、高速、タンパク質特有結像を提供する、生物学者にとって非常に貴重なツールである。蛍光顕微鏡法は、光を吸収し、異なる波長においてその光を自発的に再放出するマーカ（フルオロフォアとも称される）を使用する。特に、結像される試料は、フルオロフォアによって吸収される具体的波長（または複数の波長）の光を用いて照射され、それらを励起電子状態に入らせる。自発放出は、それによって励起状態におけるフルオロフォアが、吸収光よりも長い波長の（すなわち、異なる色の）蛍光の放射（放出）を通して基底状態に緩和されるプロセスである。照明光は、スペクトルフィルタの使用を通して、はるかに弱い放出された蛍光から分離される。吸収と自発放出との間のナノ秒スケールの遅れは、蛍光マーカが１秒あたり放出する光の量を限定し、これは、信号レベル（「輝度」）および測定速度を基本的に限定する。例えば、これがＤＮＡ鎖に沿って移動する際のＲＮＡポリメラーゼの個々のステップを見ることは、典型的な蛍光タンパク質が自発放出を通して生産し得るものよりもはるかに多い、１ミリ秒あたり数千の光子を放出するマーカを要求する。

自発放出は、励起された蛍光マーカが吸収後に光を放出するための唯一の方法ではない。励起されたマーカが適切な波長範囲（色）を有する光を用いて照射される場合、これはまた、放出するように「刺激」されることができる。刺激された放出の速度は、自発放出よりもはるかに速くなり得るため、刺激された放出は、自発放出よりも数桁明るくなり得る。これは、蛍光マーカ輝度を改良するための刺激的な可能性を提供する。しかしながら、刺激された放出は、刺激光から区別することが困難である。これが放出光と異なる色であるため、容易にフィルタ処理され得る自発放出を誘発する照明光と異なり、刺激光は、刺激された放出と同一の色、同一の位相、同一の偏光であり、バルク物質において、同一の方向に伝搬する。刺激ビームからの雑音および背景は、したがって、排除することが困難であり、これは、マーカ輝度を増加させるための刺激された放出の利点を無効にする。

（発明の要約）
側面および実施形態は、概して、蛍光顕微鏡法／結像に関し、特に、フルオロフォアからの信号を増加させるための機構としての刺激された放出を区別するシステムおよび方法に関する。検出および結像のためにサンプル中の蛍光マーカの信号強度を強化するように刺激された放出を区別するための技法を採用する、蛍光顕微鏡法システムの種々の実施形態が、開示される。したがって、蛍光マーカの輝度および光安定性を大幅に増加させることは、下記にさらに議論されるように、高速、高精度結像および測定を可能にし得る。用語「蛍光顕微鏡法」、「フルオロフォア」、「蛍光マーカ」、および「蛍光分子」が、解説の便宜および明確化のために本開示全体を通して使用されるが、本明細書に開示される方法およびシステムの側面ならびに実施形態は、蛍光のみの使用に限定されず、燐光および他の発光マーカならびにプロセスに等しく適用されることが理解されるものである。本明細書に使用されるように、蛍光という用語および関連付けられる用語は、１つの波長における電磁放射の吸収および別のより低いエネルギー波長におけるその再放出を指すことを意図している。

刺激された放出結像システムのある実施形態は、蛍光マーカを含有するサンプルを照射および励起するための励起源と、サンプル中に刺激された放出を引き起こすために刺激ビームを生成する、刺激源と、刺激ビームを減衰させるために刺激ビーム減衰器上に刺激ビームを集束させる、対物レンズとを含む。いくつかの実施例では、刺激ビーム減衰器は、ピンホール開口を含有するビームブロックを含む。他の実施例では、刺激ビーム減衰器は、グレーフィルタを含む。本システムはさらに、随意に、刺激ビーム減衰器と組み合わせられ得、基準ビームまたは刺激された放出のいずれかの位相を改変することによって、刺激された放出および基準ビーム（刺激ビームの一部であり得る）をコヒーレントに干渉させ、それによって、結像のために強化された信号を提供するように構成される、位相調節要素を含む。さらに、本システムは、結像検出器と、検出器がサンプルの画像を生産し得るように、結像検出器上に強化された信号を集束させるように構成される、光学系とを含む。光学系は、所望の倍率レベルを提供するように構成されることができる。

ある実施形態によると、蛍光ベースの結像システムは、第１の軸に沿って励起ビームを生成するように構成される、励起源と、第１の軸に対して垂直配向にある第２の軸に沿って刺激ビームを生成するように構成される、刺激源であって、励起ビームおよび刺激ビームは、異なる波長を有する、刺激源と、複数の蛍光マーカを有するサンプルであって、複数の蛍光マーカは、複数の蛍光マーカが励起状態をとるように励起光ビームによって照射され、次いで、最初に励起されたサンプルによる刺激された放出を生成するように刺激光ビームによって再び照射される、サンプルと、第２の軸に沿って配向され、刺激ビームおよび複数の蛍光マーカによって放出された刺激された放出を捕捉し、集束させるように構成される、対物レンズとを含む。本システムはさらに、対物レンズの後焦点面に位置付けられ、刺激された放出が通過することを可能にしながら刺激ビームを減衰させるように構成される、刺激ビーム減衰器と、基準ビーム（随意に、減衰させられた刺激ビームである）に対して刺激された放出を位相偏移させ、基準ビームと刺激された放出との間に強め合う干渉を生産するように構成される、位相調節構成要素と、刺激された放出を結像するように構成される、検出器とを含む。

一実施例では、第１の軸に沿った励起ビームは、対物レンズによって捕捉されない。別の実施例では、刺激ビームは、コリメートされる。ある実施例では、蛍光顕微鏡法システムはさらに、対物レンズと検出器との間に位置付けられ、検出器上に刺激された放出を集束させるように構成される、少なくとも１つのレンズを含む。一実施例では、少なくとも１つのレンズは、第１のレンズと、第２のレンズと、第３のレンズとを含み、第１および第２のレンズは、光学リレーとして構成され、第３のレンズは、光学リレーから刺激された放出を受光し、検出器上に刺激された放出を集束させるように位置付けられ、構成される。いくつかの実施例では、刺激源および励起源は、それぞれ、レーザを含む。一実施例では、刺激ビーム減衰器は、グレーフィルタを含む。別の実施例では、刺激ビーム減衰器は、中心ピンホール開口を有する、ビームブロックを含み、ビームブロックは、刺激ビーム中の光の大部分を遮断しながら、少量が中心ピンホール開口を通過することを可能にし、それによって、減衰させられた刺激ビームを生産するように構成される。一実施例では、位相偏移構成要素は、固定位相偏移（または特定の度数、例えば、９０°）を刺激された放出および基準ビームのうちの少なくとも１つに付与するように構成される。別の実施例では、位相偏移構成要素は、刺激された放出の種々の波長に適応するために回転可能である、または別様に調節可能である。

さらなる実施形態は、刺激された放出に基づく蛍光結像の方法を対象とし、本方法は、サンプル中の複数の蛍光マーカが励起状態をとるように、第１の軸に沿って配向される励起源からの励起ビームを用いて、複数の蛍光マーカを照射する行為と、第１の軸に垂直関係にある第２の軸に沿って配向される刺激源からの刺激ビームを用いて、励起状態における複数の蛍光マーカを照射する行為であって、刺激された放出は、刺激ビームによって照射されると、１つ以上の蛍光マーカによって生成され、刺激ビームおよび励起ビームは、異なる波長を有する、行為と、対物レンズを通して刺激ビームおよび刺激された放出を集束させる行為と、対物レンズ後、第２の軸に沿って位置付けられる刺激ビーム減衰器を用いて刺激ビームを減衰させ、減衰させられた刺激ビームを生産する行為と、刺激された放出と基準ビームとの間の相対位相偏移を誘発することによって、基準ビーム（随意に、減衰させられた刺激ビームである）と刺激された放出との間の強め合う干渉を生産する行為と、検出器を用いて刺激された放出を結像する行為とを含む。

ある実施例では、本方法はさらに、レンズを使用して検出器上に刺激された放出を集束させることを含む。いくつかの実施例では、本方法はさらに、刺激された放出を対物レンズから付加的レンズに中継することと、付加的レンズを使用して、検出器上に刺激された放出を集束させることとを含む。

ある実施形態によると、蛍光ベースの結像システムは、励起ビームを生成し、複数の蛍光マーカを含有するサンプルを照射するように構成される、励起源であって、励起ビームは、複数の蛍光マーカの吸収帯内の第１の波長を有し、複数の蛍光マーカを励起状態に励起するように構成される、励起源と、コリメートされた刺激ビームを生成し、サンプルをさらに照射するように構成される、刺激源であって、刺激ビームは、複数の蛍光マーカの放出帯内の第２の波長を有し、励起状態における複数の蛍光マーカを刺激し、刺激された放出を生産するように構成される、刺激源とを備える。本システムはさらに、刺激ビームおよび刺激された放出を受光するように構築および配列される、対物レンズと、対物レンズから刺激ビームおよび刺激された放出を受光し、刺激ビームを減衰させ、基準ビーム（刺激ビームまたはその一部であり得る）と刺激された放出との間の相対位相偏移を誘発し、それによって、基準ビームと刺激された放出との間に強め合う干渉を引き起こすように構成される、位相偏移および減衰装置と、刺激された放出を受光および結像するように構成される、検出器と、対物レンズと検出器との間に位置付けられ、検出器における結像面上に刺激された放出を集束させるように構成される、光学装置とを備える。

ある実施例では、位相偏移および減衰装置は、対物レンズの後焦点面に位置付けられる減衰領域を有する、位相調節板を含み、減衰領域は、刺激ビームを減衰させるように構成される。位相調節板はさらに、刺激された放出を位相偏移させ、それによって、基準ビームと刺激された放出との間の相対位相偏移を誘発するように構成されてもよい。一実施例では、減衰領域は、刺激ビームブロックと、中心ピンホール開口とを含む。別の実施例では、減衰領域は、グレーフィルタを含む。

いくつかの実施例では、位相偏移および減衰装置は、対物レンズの後焦点面に位置付けられ、刺激ビームを減衰させ、減衰させられた刺激ビームを生産するように構成される、刺激ビーム減衰器と、刺激ビーム減衰器と検出器との間に位置付けられる、位相調節板とを含む。一実施例では、位相調節板はさらに、刺激された放出を位相偏移させるように構成され、基準ビーム（例えば、減衰させられた刺激ビーム）を通過させる中心開口を含む。位相調節板は、回転可能であってもよい。一実施例では、刺激ビーム減衰器は、中心ピンホール開口を有する刺激ビームブロックを含む。別の実施例では、刺激ビーム減衰器は、グレーフィルタを含む。一実施例では、位相調節および減衰装置は、刺激された放出または基準ビームを９０°もしくは別の固定度数だけ位相偏移させるように構成される。

一実施例では、光学装置は、刺激ビーム減衰器と位相調節板との間に位置付けられる、光学リレーを含む。光学リレーは、例えば、レンズの対を含んでもよい。一実施例では、光学装置はさらに、位相調節板と検出器との間に位置付けられ、結像面上に刺激された放出を集束させるように構成される、レンズを含む。別の実施例では、光学装置は、少なくとも１つのレンズを含む。

一実施例では、刺激源および対物レンズは、第１の軸に沿って配列され、刺激源は、第１の軸に沿って刺激ビームを指向するように構成され、励起源は、第１の軸に直交する第２の軸に沿って励起ビームを指向するように配列および構成される。

ある実施形態によると、刺激された放出に基づく蛍光結像の方法は、サンプルと関連付けられる複数の蛍光マーカを励起状態に励起することと、刺激ビームを用いてサンプルを照射し、励起状態における複数の蛍光マーカを刺激し、刺激された放出を生産することと、サンプルを通して透過される刺激ビームを減衰させ、減衰させられた刺激ビームを生産することと、減衰させられた刺激ビーム（または別の基準ビーム）と刺激された放出との間の相対位相偏移を誘発し、減衰させられた刺激ビーム（または他の基準ビーム）と刺激された放出との間に強め合う干渉を提供することと、結像面上に刺激された放出を集束させることと、結像面に位置する結像検出器を用いて刺激された放出を検出することとを含む。

一実施例では、複数の蛍光マーカを励起することは、複数の蛍光マーカの吸収帯内の波長を有する励起ビームを用いてサンプルを照射することを含む。本方法はさらに、対物レンズを用いてサンプルを通して透過される刺激された放出および刺激ビームを収集し、集束させることを含んでもよい。いくつかの実施例では、本方法はさらに、対物レンズの後焦点面に位置する刺激ビーム減衰器を用いて、対物レンズからの刺激ビームを遮断することを含む。一実施例では、減衰させられた刺激ビーム（または基準ビーム）と刺激された放出との間の相対位相偏移を誘発することは、刺激された放出を位相偏移させるように構成される位相調節板を通して刺激された放出を透過させることを含む。

いくつかの実施形態では、粒子移動を追跡する方法は、刺激された放出に基づく蛍光顕微鏡法の方法の実施例を使用して、着目粒子と関連付けられる蛍光マーカから生産される刺激された放出を結像することと、画像を分析し、粒子の移動を追跡することとを含む。一実施例では、本方法は、蛍光マーカと関連付けられるタンパク質の移動を追跡するために使用されることができる。別の実施例では、本方法は、電圧感受性フルオロフォアを介する試験下でサンプルまたは物体／対象における電気動態を追跡するために使用されることができる。別の実施例では、本方法は、結像モードフローサイトメトリを実施するために使用されることができる。

これらの例示的側面および実施形態のさらなる他の側面、実施形態、ならびに利点が、下記に詳細に議論される。本明細書に開示される実施形態は、本明細書に開示される原理のうちの少なくとも１つと一貫する任意の様式で他の実施形態と組み合わせられてもよく、「ある実施形態」、「いくつかの実施形態」、「代替実施形態」、「種々の実施形態」、「一実施形態」、または同等物の言及は、必ずしも相互に排他的ではなく、説明される特定の特徴、構造、または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれ得ることを示すことを意図している。本明細書におけるそのような用語の出現は、必ずしも全てが同一の実施形態を指すわけではない。

少なくとも１つの実施形態の種々の側面が、縮尺通りに描かれることを意図していない、付随の図を参照して下記に議論される。図は、種々の側面および実施形態の例証ならびにさらなる理解を提供するために含まれ、本明細書に組み込まれ、その一部を構成するが、本発明の限界の定義として意図されない。図では、種々の図に図示される各同じまたはほぼ同じ構成要素は、同様の番号によって表される。明確化の目的のために、全ての構成要素が、全ての図において標識化され得るわけではない。

図１は、蛍光顕微鏡法システムの一実施例の簡略化されたブロック図である。 図２は、図１の蛍光顕微鏡法システムの一実施例のブロック図である。 図３は、図２の蛍光顕微鏡法システムのある実施例のブロック図である。 図４は、図１の蛍光顕微鏡法システムの別の実施例のブロック図である。 図５Ａは、図１の蛍光顕微鏡法システムの別の実施例のブロック図である。 図５Ｂは、図５Ａの蛍光顕微鏡法システムの別の実施例のブロック図である。 図６は、図１の蛍光顕微鏡法システムの別の実施例のブロック図である。

（詳細な説明）
側面および実施形態は、刺激された放出結像のための蛍光顕微鏡法システムおよび方法、ならびにその用途を対象とする。特に、実施形態は、背景刺激光から刺激された放出を区別し、それによって、蛍光マーカの信号強度を増加させるために、刺激された放出結像の文脈における位相コントラスト顕微鏡法の原理を適用する。

上記に議論されるように、蛍光マーカからの自発放出光の強度は、弱く、励起状態におけるフルオロフォアのナノ秒スケールの寿命によって限定される。言い換えると、励起されたフルオロフォアが、単一のパケットの蛍光（光子）を自発的に放出するために、数ナノ秒かかり、その光子が放出された後のみ、フルオロフォアが、励起され、再び放出することが可能である。励起された蛍光マーカは、適切な波長の刺激ビームを用いて励起されたマーカを照射することによって、光子を放出するように「刺激」されることができる。刺激された放出は、励起状態の放射崩壊を促進し、したがって、フルオロフォアからの光の放出を増幅することができる。刺激された放出は、刺激された放出の速度が自発放出よりもはるかに速いことに起因して、結像のための有意に改良された蛍光マーカ輝度を含む、自発放出に優る多くの利点を提供する。しかしながら、上記に議論されるように、刺激ビームから刺激された放出光を区別することは、それらが同一の波長、同一の位相、同一の偏光を有し、バルク物質において、同一の方向に伝搬するため、困難である。波長ベースのフィルタ処理等の従来の雑音軽減技法は、したがって、非効果的である。側面および実施形態は、それによって刺激された放出光が背景刺激ビームから区別され得、それによって、増加された蛍光マーカ輝度を利用し、より高い性能の結像を達成する技法を提供する。特に、下記に詳細に議論されるように、位相コントラスト顕微鏡法の原理を活用することによって、刺激された放出結像システムが、実装されることができ、刺激された放出光は、基準ビーム（ある実施例では、刺激ビームであり得る）にコヒーレントに干渉し、信号を強化する。

本明細書に議論される方法および装置の実施形態は、用途において、以下の説明に記載される、または付随の図面に図示される構造の詳細および構成要素の配列に限定されないことを理解されたい。本方法および装置は、他の実施形態における実装が可能であり、種々の方法で実践または実行されることが可能である。具体的実装の実施例は、例証目的のみのために本明細書に提供され、限定であることを意図していない。また、本明細書に使用される語句および専門用語は、説明の目的のためであり、限定として見なされるべきではない。「〜を含む」、「〜を備える」、「〜を有する」」、「〜を含有する」、「〜を伴う」、およびそれらの変形例等の用語の本明細書における使用は、その後に列挙されるアイテムおよびそれらの均等物ならびに付加的アイテムを包含することを意味する。「または」の言及は、「または」を使用して説明されるいかなる用語も、単一の説明される用語、１つを上回る説明される用語、および説明される用語の全てのうちのいずれかを示し得るように、包括として解釈され得る。前および後、左および右、上部および底部、上側および下側、上方および下方、ならびに垂直および水平の任意の言及は、説明の便宜のためのものであることを意図し、本システムおよび方法またはそれらの構成要素をいずれか１つの位置または空間的配向に限定することを意図していない。

図１を参照すると、蛍光マーカの信号強度を強化するために、刺激された放出を区別するための技法を採用する蛍光顕微鏡法システム１００の一実施例が、図示される。システム１００は、サンプル１２０を照射し、サンプル１２０と関連付けられる蛍光分子１２２（例えば、蛍光マーカ）を励起するために使用される励起ビーム１１２を生産するように構成される、励起源１１０を含む。例えば、励起源１１０は、規定された波長を有する単一光ビームを放出するレーザであってもよい。励起ビーム１１２の波長は、サンプル１２０と関連付けられる蛍光分子１２２のタイプに基づいて選択されてもよい。蛍光分子は、あるスペクトル範囲（すなわち、光の波長の範囲）に及ぶ励起帯を有する。所与の蛍光分子の励起帯内の波長を有する光は、蛍光分子を励起するであろう。故に、励起源１１０は、所与のサンプル１２０と関連付けられる蛍光分子１２２の励起帯内の波長を有する励起ビーム１１２を生産するように構成されることができる。一実施例では、励起ビーム１１２は、約４８８ｎｍの波長を有してもよい。システム１００はさらに、サンプル１２０をさらに照射するために使用される刺激ビーム１３２を生産するように構成される、刺激源１３０を含む。ある実施例では、刺激源１３０は、レーザである。蛍光分子１２２はさらに、それにわたって蛍光分子が、それらが励起状態から基底状態に緩和されると放出されるスペクトル範囲を定義する、放出スペクトルを有する。放出スペクトルは、典型的には、励起帯と異なるが、励起帯と部分的に重複し得る。コリメート光を含む刺激ビーム１３２は、放出するように励起された蛍光分子１２２を刺激するために使用され、したがって、刺激源１３０は、蛍光分子１２２の放出スペクトル内の波長を有する刺激ビーム１３２を生産するように構成されてもよい。ある実施例では、刺激ビーム１３２の波長は、励起ビーム１１２の波長と異なるように選択され、好ましくは、励起ビーム１１２の波長から比較的に遠くにスペクトル的に離間されてもよい。そのような構成は、励起ビーム１１２が、結像される光から容易にスペクトル的にフィルタ処理され、取り除かれることを可能にする。一実施例では、刺激ビーム１３２の波長は、約５５０ｎｍである。したがって、一実施例では、励起ビームの波長は、約４８８ｎｍであってもよく、刺激ビームの波長は、約５５０ｎｍであってもよいが、しかしながら、励起および刺激波長の多数の他の実施例も、使用されてもよい。

励起ビーム１１２は、第１の軸１１４に沿って励起源１１０からサンプル１２０に伝搬し、刺激ビーム１３２は、第２の軸１３４に沿って刺激源１３０からサンプル１２０に伝搬する。図１に示される実施例では、第１の軸１１４は、第２の軸１３４に直交する、または垂直である（すなわち、それに対して約９０度にある）。本配列は、励起ビーム１１２が、サンプル１２０からの放出を結像するために使用される検出器１４０の方向に伝搬せず、したがって、励起ビーム１１２からの検出器１４０における「雑音」が低減され得る点において有利であり得る。しかしながら、第１および第２の軸１１４、１３４が直交することは、必要ではなく、第１の軸１１４は、第２の軸１３４と同一線上にある、または第２の軸１３４に対して任意の角度に配列されてもよい。

上記のように、いったん蛍光分子１２２が励起ビーム１１２による照射後に励起状態をとると、刺激ビーム１３２による照射は、励起された蛍光分子に光子（刺激された放出）を放出させ、励起された蛍光分子を基底状態に緩和させ、それらは、励起ビーム１１２によって再び励起されることができる。故に、ある実施例では、励起源１１０および／または刺激源１３０は、時間において相互に続くパルス化ビームとして、それぞれ、励起ビーム１１２および／または刺激ビーム１３２を生産するように構成されることができる。例えば、下記にさらに議論されるように、励起源１１０は、蛍光分子１２２を励起する励起ビーム１１２のパルスを放出してもよく、その後、刺激源１３０は、刺激ビーム１３２のパルスを放出し、励起された蛍光分子を刺激し、検出器１４０によって検出され得る刺激された放出を放出してもよい。いくつかの実施例では、刺激ビーム１３２は、光学系配列（図示せず）を使用して、サンプル１２０上に集束され、励起光ビーム１１２の印加によって最初の励起がサンプル１２０中で起こった直後に励起された蛍光分子１２２を照射してもよい。いくつかの実施例では、励起ビーム１１２は、連続的ビームであってもよく、刺激ビーム１３２は、パルス化されてもよい。他の実施例では、励起ビーム１１２および刺激ビーム１３２の両方が、連続的であってもよいが、しかしながら、本配列は、パルス化ビーム配列よりも電力集約的であり得る。

上記に議論されるように、蛍光マーカからの刺激された放出は、これが同一の波長、位相、および偏光を有し、図１に示される軸１３４に沿ってサンプル１２０から同一の方向に伝搬するため、刺激ビーム１３４から区別することが困難であり得る。したがって、サンプルからの光１３６は、蛍光分子１２２からの刺激ビーム１３２および刺激された放出の両方を含む。刺激された放出は、概して、刺激ビーム１３２と比較して弱いため、従来のシステムでは、これは、全く結像されることができないか、または非常に低いコントラストもしくは信号対雑音比を伴う不良品質の画像を生産するかのいずれかである。故に、刺激された放出から刺激ビーム１３２を区別および分離するために、蛍光顕微鏡法システム１００は、刺激ビーム１３２を減衰させ、基準ビーム（ある実施例では、減衰させられた刺激ビームであり得る）の位相および刺激された放出の位相が、コントラストを生成し、検出器１４０による結像のために信号を強化するように異なるように操作される、位相コントラスト顕微鏡法からの技法を活用するように構成される。

依然として図１を参照すると、システム１００は、検出器１４０に向かって光１３６を集束させる対物鏡１５０を含む。対物鏡１５０は、典型的には、対物レンズであってもよいが、反射光学系（例えば、ミラー）を使用して実装されてもよい。システム１００はさらに、光１３６を受光する位相偏移および減衰装置２００を含む。位相偏移および減衰装置２００は、刺激された放出を含有する検出器１４０の視野の領域内で刺激された放出と基準ビームとの間に強め合う干渉を生成し、刺激ビーム１３２を減衰させ、それによって、結像面に到達する「背景光」の量を低減させることによって、結像のために刺激された放出信号を強化するように作用する。位相偏移および減衰装置２００の種々の実施例が、図２−６を参照して下記に議論される。光学系３００は、検出器１４０上に刺激された放出を集束させるように構成される。光学系３００の実施例もまた、図２−６を参照して下記に議論される。図１に示されるブロック図では、光学系３００は、位相偏移および減衰装置２００と検出器１４０との間に位置付けられるように示されるが、しかしながら、実践的実装では、これらの構成要素を構成する要素は、相互に混在してもよい（例えば、図３、５Ａ、および５Ｂに示されるように）、または位相偏移および減衰装置２００は、光学系３００と検出器１４０との間に位置付けられてもよい。故に、図１は、単純に、特定の物理的配列ではなく、システム１００の実施例の機能的構成要素を示すことを意図している。

図１に示される実施例では、検出器１４０は、光１３６が第２の軸１３４に沿ってサンプル１２０から検出器１４０に進行するように、それに沿って刺激ビーム１３２がサンプルに指向される、第２の軸１３４上に位置付けられるように示される。しかしながら、他の実施例では、検出器１４０は、第２の軸１３４上に位置付けられる必要はない。例えば、光学系３００は、第２の軸１３４に対してある角度に配列される光路に沿って光１３６を再指向する１つ以上の折り返しミラー（図示せず）を含んでもよい。さらに、上記に議論されるように、ある実施例では、励起源は、励起ビームもまた第２の軸１３４に沿って検出器に向かって進行し得るように配列されてもよい。この場合、光学系３００は、これが検出器１４０に到達する前に励起ビーム１３２をフィルタ処理して取り除くように構成される、スペクトルフィルタを含んでもよい。

上記に議論されるように、位相偏移および減衰装置２００は、検出器１４０における刺激された放出の結像を強化するように、刺激ビーム１３２を減衰させることおよびサンプルからの刺激された放出と基準ビームとの間の相対位相偏移を付与することの両方を行うように作用する。図２を参照すると、図１の蛍光顕微鏡法システム１００の一実施例のブロック図が、図示される。本実施例では、システム１００は、基準ビーム１６２を生産する基準源１６０を含む。光学系３００は、基準ビーム１６２を位相偏移および減衰装置２００ならびに検出器１４０の光路に結合するように構成されてもよい。刺激された放出１２４、刺激ビーム１３２、および基準ビーム１６２は、位相偏移および減衰装置２００に指向され、これは、刺激ビーム１３２を減衰させ、刺激された放出１２４と基準ビーム１６２との間の相対位相偏移を誘発する。本相対位相偏移は、基準ビーム１６２およびサンプル１２０からの刺激された放出１２４の強め合う干渉を引き起こし、サンプルを含有しない領域と比較して、サンプル１２０に対応する検出器視野の領域内の画像コントラストの増加をもたらす。このように、刺激された放出１２４の結像が、強化されることができる。

図３は、位相偏移および減衰装置２００ならびに光学系３００の配列のある実施例を示す、図２の蛍光顕微鏡法システム１００の一実施例のブロック図である。本実施例では、光学系３００は、基準ビーム１６２を光路に結合するように構成される、ビーム結合構成要素３１０を含む。光学系３００はさらに、１つ以上のレンズ、１つ以上のミラー、またはそれらの組み合わせを含み得、刺激された放出１２４および基準ビーム１６２を検出器１４０上に指向し、集束させるように構成される、付加的光学配列３２０を含む。ビーム結合構成要素は、基準ビーム１６２を刺激された放出１２４の光路に注入するように構成される、ビームスプリッタおよび／または１つ以上のミラーならびに／もしくはレンズを含んでもよい。図示される実施例では、位相偏移および減衰装置２００は、刺激ビーム減衰器２１０と、位相調節板２２０とを含む。刺激ビーム減衰器２１０は、刺激された放出１２４を有意に減衰させることなく、刺激ビーム１３２を有意に減衰させるように構成および配列される。例えば、刺激ビーム減衰器２１０は、刺激ビーム１３２が刺激ビーム減衰器２１０上に集束され、それによって遮断される一方、刺激された放出１２４が刺激ビーム減衰器２１０の周囲で結像されるように位置付けられる、ビーム遮断構成要素（例えば、刺激ビーム１３２の波長において光学的に不透過性である要素）を含んでもよい。

位相調節板２２０は、刺激された放出１２４または基準ビーム１６２のいずれかを位相偏移させるように作用する。図３に図示される実施例では、位相調節板２２０は、それを通して基準ビーム１６２が通過する領域２２２を有するように示される。本領域２２２は、刺激された放出１２４が基準ビーム１６２に対して位相偏移され、逆もまた同様であるように、位相調節板２２０の残りと比較して異なる厚さまたは異なる光学性質を有することができる。一実施例では、位相調節板２２０は、相補的位相偏移（例えば、選択された度数だけの相互からのオフセット）を刺激された放出１２４および基準ビーム１６２に付与するように構成されることができる。いずれかの光ビームの絶対位相ではなく、基準ビーム１６２と刺激された放出１２４との間の相対位相が、所望の強め合う干渉が起こることを可能にする。位相調節板２２０は、刺激された放出１２４の波長におけるある位相偏移（例えば、−９０°、＋９０°、またはある他の度数）を提供するように較正される、ある厚さまたは他の光学性質（例えば、屈折率）を伴って構成されてもよい。ある実施例では、位相調節板２２０は、異なる周波数の光のための所望の位相偏移を提供するために回転可能である、または別様に調節可能であってもよい。

基準源１６０は、基準ビーム１６２を提供するように構成される光源である。ある実施例では、基準源１６０は、レーザであり得る。図２および３に示される実施例では、基準源１６０は、刺激源１３０と別個の構成要素として示される。しかしながら、他の実施例では、刺激源１３０もまた、基準源１６０であり得る。例えば、刺激ビーム１３２の一部または位相偏移および減衰装置２００によって生産される減衰させられた刺激ビームが、基準ビーム１６２として使用され、したがって、専用基準源１６０の必要性を除去することができる。図４は、光学構成要素３３０が、刺激ビーム１３２の一部を抽出し、基準ビーム１６２を提供するために使用される、蛍光顕微鏡法システム１００のある実施例を示す。光学構成要素３３０は、ビームスプリッタ、折り返しミラー、または基準ビーム１６２として使用されるように刺激ビーム１３２の一部を再指向するように構成される他の構成要素であり得る。光学系３００は、上記に議論されるように、位相偏移および減衰装置２００が基準ビーム１６２と刺激された放出１２４との間の相対位相偏移を引き起こすように作用し得るように、基準ビーム１６２を光路に結合するように構成されることができる。

図５Ａを参照すると、減衰させられた刺激ビームが基準ビーム１６２として使用され、位相偏移および減衰装置２００ならびに光学系３００の配列のさらなる実施例を示す、図１の蛍光顕微鏡法システム１００の別の実施例が、図示される。上記に議論されるように、光１３６は、示されるように、刺激された放出１２４と、刺激ビーム１３２とを含んでもよい。図３の実施例と同様に、図５Ａの実施例では、位相偏移および減衰装置２００は、刺激ビーム減衰器２１０と、位相調節板２２０とを含む。本実施例における光学系３００は、第１のレンズ３４２と、第２のレンズ３４４と、第３のレンズ３４６とを含む。第１のレンズ３４２および第２のレンズ３４４は、光学リレーとして作用し、第３のレンズ３４６は、検出器１４０における結像面上に刺激された放出１２４を集束させる。当業者は、本開示の利益を前提として、第１、第２、および第３のレンズ３４２、３４４、３４６が、それぞれ、単一のレンズ要素または複数のレンズ要素を含み得、さらに、第１、第２、または第３のレンズのうちのいずれかが、ミラー等の１つ以上の反射光学要素と置換される、またはそれを用いて補完され得ることを理解するであろう。故に、３つのレンズ３４２、３４４、３４６の例証は、光学系３００によって実施される機能を表すことを意図し、光学系３００の物理的実装を示される構成に限定することを意図していない。上記に議論されるように、ある実施例では、システム１００は、図５Ｂに示されるように、レンズ３４６と検出器１４０との間に位置付けられるスペクトル放出フィルタ３５０を含んでもよい。

一実施例によると、刺激ビーム減衰器２１０は、刺激された放出１２４を有意に減衰させることなく、刺激ビーム１３２を有意に減衰させるように構成および配列される。図５Ａおよび５Ｂに図示される実施例では、刺激ビーム減衰器２１０は、「ピンホール」とも称される、小さい中心開口２１４を有するビーム遮断構成要素２１２を含む。ビーム遮断構成要素２１２は、刺激ビーム１３２が、刺激ビーム遮断構成要素上に集束され、検出器１４０による検出から実質的に遮断される一方、刺激された放出１２４が、刺激光遮断構成要素の周囲に結像され、光学系３００によって検出器１４０上に集束されることを可能にするように、対物鏡１５０の後焦点面に位置付けられてもよい。ある実施例では、減衰させられた刺激ビーム１３２ａが、示されるように、検出器１４０に向かって第２の軸１３４に沿って継続するように、比較的に少量の刺激ビーム１３２が、刺激ビーム遮断構成要素２１２の中心開口２１４を通過する。本配列は、検出器１４０における結像面に到達する、刺激された放出１２４の量を最大限にする一方、刺激ビーム（すなわち、背景光）の量を最小限にする。

依然として図５Ａおよび５Ｂを参照すると、一実施例では、減衰させられた刺激ビーム１３２ａおよび刺激された放出１２４は、第１および第２のレンズ３４２、３４４によって形成された光学リレーを介して、位相調節板２２０に通過される。位相調節板２２０は、刺激された放出１２４、減衰させられた刺激ビーム１３２ａ、または両方を位相偏移させるように作用する。上記に議論されるように、本位相偏移は、減衰させられた刺激ビーム１３２ａおよびサンプル１２０からの刺激された放出１２４の強め合う干渉を引き起こし、サンプルを含有しない領域と比較して、サンプル１２０に対応する検出器視野の領域内の画像コントラストの増加をもたらす。図示される実施例では、位相調節板２２０は、それを通して減衰させられた刺激ビーム１３２ａが通過する小さい中心開口２２４を有するように示される。したがって、本実施例では、位相調節板は、減衰させられた刺激ビーム１３２ａではなく、刺激された放出１２４を位相偏移させるように作用する。しかしながら、当業者は、本開示の利益を前提として、位相調節板２２０が、代わりに、刺激された放出１２４ではなく、減衰させられた刺激ビーム１３２ａを位相偏移させるように構成され得ることを容易に理解するであろう。代替として、位相調節板２２０は、相補的位相偏移（例えば、選択された度数だけの相互からのオフセット）を刺激された放出１２４および減衰させられた刺激ビーム１３２ａに付与するように構成されることができる。上記に議論されるように、いずれかの光ビームの絶対位相ではなく、減衰させられた刺激ビーム１３２ａと刺激された放出１２４との間の相対位相が、所望の強め合う干渉が起こることを可能にする。位相調節板２２０は、刺激された放出１２４の波長におけるある位相偏移（例えば、−９０°、＋９０°、またはある他の度数）を提供するように較正される、ある厚さを伴って構成されてもよい。ある実施例では、位相調節板２２０は、異なる周波数の光のための所望の位相偏移を提供するために回転可能である、または別様に調節可能であってもよい。

図５Ａおよび５Ｂの実施例では、位相調節板２２０は、刺激ビーム減衰器２１０よりも光学縦列に沿って遠くに（すなわち、検出器１４０により近接して）位置付けられる。しかしながら、蛍光顕微鏡法システム１００の実施形態は、本配列に限定されない。他の実施例では、刺激ビーム減衰器２１０は、位相調節板２２０に続く（またはその「下流」の）光学縦列内に位置付けられることができる。この場合、位相調節板２２０は、刺激ビーム１３２または刺激された放出１２４のいずれかを位相偏移させるように作用してもよく、刺激ビーム減衰器２１０は、これが検出器１４０に到達する前に（随意に、位相偏移された）刺激ビーム１３２を減衰させるように作用する。さらに、図３、５Ａ、および５Ｂの実施例では、刺激ビーム減衰器２１０および位相調節板２２０は、別個の構成要素として示される。しかしながら、他の実施形態では、これらの２つの構成要素は、１つの複合構成要素に組み合わせられることができる。例えば、図６は、システム１００が組み合わせられた位相調節および減衰構成要素２３０を含む実施形態を図示する。

図６を参照すると、本実施例では、システム１００は、対物鏡１５０から光１３６を受光するように位置付けられる、組み合わせられた位相調節および減衰構成要素２３０を含む。上記に議論されるように、光１３６は、結像される刺激された放出１２４および刺激ビーム１３２の両方を含む。組み合わせられた位相調節および減衰構成要素２３０は、刺激ビーム１３２を減衰させる一方、また、刺激された放出１２４と減衰させられた刺激ビーム１３２ａとの間に相対位相偏移を生産するように構成されることができる。上記に議論されるように、これは、２つの間の位相偏移がある量だけ増加されるかまたは減少されるかのいずれかであるように、刺激ビーム１３２および刺激された放出１２４の一方または両方を位相偏移させることによって達成されることができる。図６に示される実施例では、組み合わせられた位相調節および減衰構成要素２３０は、刺激ビーム１３２を減衰させる一方、刺激された放出１２４が構成要素２３０の残りの部分を通して（またはその周囲を）通過することを可能にし、それによって、刺激された放出のいかなる減衰も回避または最小限にするように、対物鏡１５０の後焦点面またはその近傍に位置付けられる減衰領域２３２を含む。一実施例では、減衰領域２３２は、図５Ａおよび５Ｂに示される刺激ビーム減衰器２１０と類似してもよい。言い換えると、これは、刺激ビーム１３２の大部分が遮断される一方、少量が開口を通して通過することを可能にされるように、小さいピンホール開口を伴うビームブロック（すなわち、実質的に完全に不透過性の領域）を含んでもよい。この場合、開口が物理的孔である場合、組み合わせられた位相偏移および減衰構成要素２３０は、刺激された放出１２４を位相偏移させるように構成されてもよい。他の実施例では、減衰領域２３２は、刺激ビーム１３２を実質的に減衰させる、いわゆる「グレーフィルタ」等の減衰フィルタであってもよい。

組み合わせられた位相調節および減衰構成要素２３０は、基準ビーム１６２が減衰させられた刺激ビーム１３２ａであるシステム１００の実施例において図６に示されるが、本開示の利益を前提として、当業者は、組み合わせられた位相調節および減衰構成要素２３０が、別の基準ビーム１６２が使用されるシステム１００の実施例において同様に使用され得ることを理解するであろう。そのような実施例では、組み合わせられた位相調節および減衰構成要素２３０は、刺激ビーム１３２を減衰させる領域ならびに刺激された放出１２４および／または基準ビーム１６２を位相偏移させる１つ以上の領域の両方を含んでもよい。

ある実施例では、刺激ビーム減衰器２１０内の中心開口のサイズ、またはグレーフィルタの「暗さ」、したがって、刺激ビーム１３２の減衰のレベルは、刺激された放出１２４の輝度に基づいて選択されることができる。いくつかの事例では、これは、刺激された放出の既知または推定される予期される輝度に基づいて事前選択されることができる。他の実施例では、刺激ビーム１３２の減衰のレベルは、結像プロセスの間に取得される刺激された放出の輝度についての情報に応答して、動的に調節されることができる。刺激ビーム１３２の一部が基準ビーム１６２として使用されるある実施例では、上記に議論されるように、刺激ビーム１３２の少なくとも一部が、刺激された放出１２４との強め合う干渉のために利用可能であることが必要であるが、しかしながら、一般に、刺激ビーム１３２の減衰のある程度のレベルが、検出器１４０が、刺激ビームで飽和されず、刺激された放出を検出することが不可能ではないように防止するように望ましい。いくつかの実施例では、刺激ビームの減衰のレベルは、刺激ビーム減衰器２１０の中心開口のサイズを調節することによって、動的に制御されることができる。他の実施例では、刺激ビームの減衰のレベルは、（例えば、漸進的に「より暗い」または「より明るい」フィルタが、刺激ビーム１３２の減衰の所望のレベルに基づいて、光路の内外に移動され得るように）液晶ベースのフィルタまたは機械的に移動可能なフィルタのセット等の調節可能グレーフィルタを使用することによって、動的に制御されることができる。当業者は、調節可能減衰を提供する種々の機構が、公知であり、システム１００の実施形態において使用され得ることを理解するであろう。

図６に示される実施例では、図１の光学系３００は、検出器１４０が位置する結像面上に刺激された放出１２４を集束させるレンズ３６０によって表される。しかしながら、他の実施例では、組み合わせられた位相調節および減衰構成要素２３０は、図５Ａおよび５Ｂに示されるレンズ３４２および３４４等のリレー光学系と併用されることができる。ある実施例では、対物レンズ１５０の後焦点面は、対物レンズ自体の中にあってもよい。この場合、図５Ａおよび５Ｂに示されるもの等の光学リレーを含む光学系３００の構成が、好ましくあり得る。光学系３００の具体的設計にかかわらず、いったん刺激された放出１２４が対物鏡１５０によって捕捉されると、刺激された放出１２４は、サンプル１２０によって放出される刺激された放出１２４の画像を捕捉するために、検出器１４０上に集束される。光学系３００はさらに、システム１００にある所望のレベルの光学倍率を提供するように設計されることができる。当業者は、本開示の利益を前提として、光学系３００ならびに位相調節および減衰装置２００の多数の構成が、実装され得、システム１００の実施形態が、付随の図面に示される実施例に限定されないことを理解するであろう。例えば、ある事例では、位相調節機能は、特別に設計された対物鏡１５０内に組み込まれ、それによって、別個の位相調節板２２０の必要性を排除することができる。

したがって、上記に説明されるように、システム１００の種々の実施形態および実装は、検出器１４０に到達する背景光の量を低減させるように刺激ビーム１３２を減衰させ、検出器における画像コントラストを強化するように一方または両方のビームを位相偏移させることによって刺激ビームの残りの部分または別の基準ビームと刺激された放出との間に強め合う干渉を生産するように動作する。刺激された放出１２４の一部は、（光学縦列の設計によって刺激ビーム減衰器または減衰領域のみを照射する）刺激ビーム１３２よりもはるかに少ない程度であるが、刺激ビーム減衰器２１０または組み合わせられた位相調節および減衰構成要素２３０の減衰領域２３２によって減衰（薄暗く）され得る。その結果、刺激された放出１２４は、背景刺激ビーム１３２から区別され、広い範囲の用途において有用な結像能力を提供するために十分な分解能を用いて結像されることができる。

蛍光顕微鏡法システム１００の実施形態および刺激ビーム１３２から刺激された放出１２４を区別し、それによって、刺激された放出を有用に結像する関連付けられる能力は、例えば、従来の蛍光顕微鏡法と比較して、より速いタンパク質移動を追跡する能力を提供すること、結像モードフローサイトメトリ速度および信頼性を改良すること、遺伝子配列速度および信頼性を改良すること、改良された散乱顕微鏡法を提供すること、電圧感受性フルオロフォアの結像を提供すること、ならびにより小さいおよび／またはより微かな標的の結像を可能にすることを含む、多種多様な用途における有用性を有し得る。

上記に議論されるように、蛍光マーカ１２２が励起ビーム１１２によって励起されると、それらは、それらがある程度の時間後に励起状態から基底状態に緩和される際、光を自発的に放出するであろう。確率密度関数が、概して、約１ナノ秒である、自発放出の速度を説明する。励起された蛍光マーカは、放出が起こるまで再励起されることができない。故に、いったん励起ビーム１１２がサンプル１２０中の実質的に全ての蛍光分子１２２を励起するために十分な強度になると、励起ビーム１１２の強度をさらに増加させることは、蛍光分子からの自発放出によって生産される光の量（すなわち、放出の強度または輝度）を増加させることができない。これは、飽和限界として公知である。しかしながら、刺激ビーム１３２を印加することは、蛍光分子１２２をより迅速に放出させ、それによって、それらが、より早く励起ビーム１１２によって再励起され、したがって、再び放出されることを可能にする。言い換えると、刺激された放出の速度は、自発放出のものよりもはるかに速く、刺激ビームの強度を制御することによって制御されることができる。例えば、刺激ビーム１３２は、全ての蛍光分子がある時間周期内に放出されるであろう確率が確実なものに近づくような強度を有するように構成されることができる。本時間周期は、刺激ビーム１３２の強度を制御することによって設定されることができ、自発放出の約１ナノ秒時間フレームよりも数桁短くあり得る。故に、例えば、１秒等の所与の時間スパンにおける蛍光分子１２２からの放出光の量、したがって、放出の輝度は、大いに増加される。これは、例えば、非常に小さいまたは微かな標的の改良された結像を可能にする。

加えて、刺激された放出の速度は、非常に速くあり得るため、システム１００の実施形態を使用して刺激された放出を結像することは、例えば、タンパク質移動等の非常に短い時間フレームにわたって起こる事象を視認または追跡する改良された能力、ならびに、例えば、フローサイトメトリ、散乱顕微鏡法、または遺伝子配列等の関連付けられる用途における改良された速度および精度を提供する。別の実施例では、システム１００の実施形態は、電圧感受性フルオロフォアを結像するために使用されることができる。これらのフルオロフォアは、例えば、ニューロン中等の電位に暴露されると活性状態になる。電気的過渡現象が、ほんの一瞬だけニューロンを横断して進行し、したがって、従来の技法を使用して監視することが非常に困難である、またはさらには不可能であり得る。刺激された放出の速度は、自発放出の速度よりも速くあり得るため、刺激された放出を使用することは、より短い時間量内により多くの光を供給することが可能であり、電圧感受性蛍光マーカを介する電気信号のより良好な分解能の時間分解画像の捕捉を可能にし得る。

蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）は、２つの感光性分子（発色団）の間のエネルギー伝達を説明する距離依存機構である。最初に、その電子励起状態にあるドナー発色団が、非放射性双極子−双極子結合を通してアクセプタ発色団にエネルギーを伝達し得る。アクセプタ発色団の吸収スペクトルは、ドナー発色団の蛍光放出スペクトルと重複しなければならない。両方の発色団が蛍光分子であるとき、本現象は、蛍光共鳴エネルギー伝達と称される。ＦＲＥＴの効率は、ドナーとアクセプタとの間の距離の６乗に反比例し、これを生体高分子の寸法に匹敵する距離（例えば、１０〜１００Å）にわたって有用にする。したがって、ＦＲＥＴは、２つの蛍光マーカが相互にある距離内にあるかどうかを判定するために使用されることができ、これは、例えば、タンパク質移動を追跡するために有用であり得る。しかしながら、ＦＲＥＴ効率を測定する従来の方法は、緩慢である。例えば、アクセプタからの放出を従来通りに測定することは、アクセプタの自発放出の速度によって限定される。ＦＲＥＴ効率はまた、アクセプタの存在および不在下でドナーの光退色速度から推測されることができるが、時間スケールは、光退色のものであり、これは、数秒〜数分である。上記に議論されるように、本明細書に開示されるシステム１００の実施形態は、蛍光マーカまたは他の発色団から刺激された放出を区別し、それによって、刺激された放出の結像を可能にする能力を提供する。故に、本能力を用いて、刺激された放出は、アクセプタによる放出を刺激するために、アクセプタの放出帯内の波長を有する刺激ビームを使用して、ＦＲＥＴを適用されることができる。上記に議論されるように、刺激された放出の速度は、自発放出のものよりも数桁速くあり得、したがって、刺激された放出を結像する能力は、ＦＲＥＴ測定速度が大いに増加されることを可能にし、それによって、より精密なタンパク質移動追跡を可能にし、より速いタンパク質移動を追跡する能力を提供する。

光退色は、励起されたフルオロフォアの恒久的不活性化をもたらす現象である。光退色は、より集中的な入射光とともに、すなわち、励起ビームがより高い強度を有するとき、顕著に増加する。光退色は、上記に議論されるように、ＦＲＥＴ効率を推測するために使用される等、いくつかの用途を有することができるが、これは、概して、これがサンプル中の蛍光マーカの有用寿命を限定するため、望ましくない現象である。光退色は、励起されたフルオロフォアとサンプル中の別の分子との間の衝突の結果として起こると仮定されている。したがって、より長くフルオロフォアが励起状態にあるほど、その損傷衝突の可能性が高くなる。従来の蛍光顕微鏡法では、概して、可能な限り多くのサンプル中の蛍光マーカを励起するために、比較的に高い強度の励起ビームを有することが、有利であり、自発放出の速度は、自然定数であるため、光退色は、不可避のリスクである。しかしながら、システム１００の実施形態は、（従来の蛍光顕微鏡法システムでは可能ではない）刺激された放出ベースの結像を実施する能力を提供し、上記に議論されるように、刺激ビームの強度を制御することによって、刺激された放出の速度は、制御され、自発放出のものよりもはるかに速くあり得る。その結果、励起されたフルオロフォアは、フルオロフォアが励起状態において費やす時間が大幅に低減され、ひいては、励起状態にある間に損傷衝突を有するそのフルオロフォアのリスクを大幅に低減させ得るように、非常に短い時間フレーム（例えば、自発放出のナノ秒時間スケールではなくピコ秒）において、放出するように刺激され、基底状態に緩和されることができる。その結果、刺激された放出を結像するためにシステム１００の実施形態によって提供される能力は、光退色を低減させ、サンプル中の蛍光分子の有用寿命を延長する追加の利益を有し得る。

別の実施形態によると、本明細書に開示される位相コントラスト技法によって可能にされる刺激された放出結像の別の用途は、高速、高読取雑音カメラ上に蛍光分子の画像を記録する能力である。自発蛍光信号は弱いため、蛍光画像は、従来、緩慢に画像を取得するが、非常に暗い環境内で良好に機能する低読取雑音カメラを使用して捕捉される。蛍光よりも明るいことに加えて、刺激された放出は、コヒーレントであり、明るい背景光との干渉を通して検出されることができる。その結果、高読取雑音を伴うカメラが、代わりに使用されてもよい。これらのタイプのカメラは、低読取雑音カメラよりも数桁速く動作することができる。したがって、本明細書に開示される実施形態に従って刺激された放出結像を使用することは、例えば、結像モードフローサイトメトリ等の高速結像を要求し得る用途を可能にすることができる。フローサイトメトリは、これが検出器を過ぎて進行する際に蛍光サンプルを照会するために利用可能な小さい時間ウィンドウのため、小さい蛍光信号に悩まされる。その結果、フローサイトメトリにおける蛍光は、従来、高感度単一ピクセル光検出器によって結像されなければならない。対照的に、本明細書に開示される実施形態に従って蛍光から刺激された放出を結像することは、それらの単一ピクセル検出器が高フレームレートカメラと置換されることを可能にし、サンプルの２次元画像を捕捉する能力を提供してもよい。

したがって、側面および実施形態は、サンプル中の蛍光マーカの信号強度を強化するための機構として刺激された放出を区別するための技法を採用するシステムおよび方法を提供し、それによって、改良された結像能力および拡大された用途における蛍光顕微鏡法の使用を可能にする。本明細書に開示される刺激された放出ベースの蛍光顕微鏡法システムの実施形態は、独立型結像システムとして実装および使用されてもよい、またはフローサイトメトリ、遺伝子配列、および同等物等の用途と関連付けられる機器ならびに／もしくはプロセスフローに統合されてもよい。

少なくとも１つの実施形態のいくつかの側面を上記に説明しているが、種々の改変、修正、および改良が、当業者に容易に想起されるであろうことが理解されるものである。そのような改変、修正、および改良は、本開示の一部であることを意図し、本発明の範囲内であることを意図している。故に、前述の説明および図面は、実施例にすぎず、本発明の範囲は、添付される請求項およびそれらの均等物の適切な構築から判定されるべきである。

これらの例示的側面および実施形態のさらなる他の側面、実施形態、ならびに利点が、下記に詳細に議論される。本明細書に開示される実施形態は、本明細書に開示される原理のうちの少なくとも１つと一貫する任意の様式で他の実施形態と組み合わせられてもよく、「ある実施形態」、「いくつかの実施形態」、「代替実施形態」、「種々の実施形態」、「一実施形態」、または同等物の言及は、必ずしも相互に排他的ではなく、説明される特定の特徴、構造、または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれ得ることを示すことを意図している。本明細書におけるそのような用語の出現は、必ずしも全てが同一の実施形態を指すわけではない。
本願明細書は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
蛍光結像システムであって、
第１の軸に沿って励起ビームを生成するように構成された励起源と、
前記第１の軸に対して垂直配向にある第２の軸に沿って刺激ビームを生成するように構成された刺激源であって、前記励起ビームおよび前記刺激ビームは、異なる波長を有する、刺激源と、
複数の蛍光マーカを有するサンプルであって、前記複数の蛍光マーカは、前記複数の蛍光マーカが励起状態をとるように前記励起光ビームによって照射され、次いで、前記最初に励起されたサンプルによる刺激された放出を生成するように前記刺激光ビームによって再び照射される、サンプルと、
前記第２の軸に沿って配向され、前記刺激ビームおよび前記複数の蛍光マーカによって放出された前記刺激された放出を捕捉し、集束させるように構成されている、対物レンズと、
前記対物レンズの後焦点面に位置付けられ、前記刺激された放出が通過することを可能にしながら前記刺激ビームを減衰させるように構成されている、刺激ビーム減衰器と、
前記刺激された放出と基準ビームとの間の相対位相偏移を誘発し、前記基準ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産するように構成されている、位相調節構成要素と、
前記刺激された放出を結像するように構成された検出器と
を備える、蛍光結像システム。
（項目２）
前記基準ビームは、前記減衰させられた刺激ビームである、項目１に記載の蛍光結像システム。
（項目３）
前記刺激ビーム減衰器は、中心ピンホール開口を有する、ビームブロックを含み、前記ビームブロックは、前記刺激ビームに対して光学的に不透過性であり、前記刺激ビーム減衰器は、前記刺激ビームの一部が前記中心ピンホール開口を通過し、前記減衰させられた刺激ビームを提供するように位置付けられている、項目２に記載の蛍光結像システム。
（項目４）
前記刺激ビーム減衰器は、グレーフィルタを含む、項目２に記載の蛍光結像システム。
（項目５）
前記第１の軸に沿った前記励起ビームは、前記対物レンズによって捕捉されない、項目１に記載の蛍光結像システム。
（項目６）
前記刺激ビームは、コリメートされる、項目１に記載の蛍光結像システム。
（項目７）
前記対物レンズと前記検出器との間に位置付けられ、前記検出器上に前記刺激された放出を集束させるように構成されている、少なくとも１つのレンズをさらに備える、項目１に記載の蛍光結像システム。
（項目８）
前記少なくとも１つのレンズは、第１のレンズと、第２のレンズと、第３のレンズとを含み、前記第１および第２のレンズは、光学リレーとして構成され、前記第３のレンズは、前記光学リレーから前記刺激された放出を受光し、前記検出器上に前記刺激された放出を集束させるように位置付けられ、構成されている、項目６に記載の蛍光結像システム。
（項目９）
前記刺激源および前記励起源は、それぞれ、レーザを含む、項目１に記載の蛍光結像システム。
（項目１０）
前記位相偏移構成要素は、所定の度数の固定位相偏移を前記刺激された放出および前記基準ビームのうちの１つに付与するように構成されている、項目１に記載の蛍光結像システム。
（項目１１）
前記位相偏移構成要素は、回転可能である、項目１に記載の蛍光結像システム。
（項目１２）
刺激された放出に基づく蛍光結像の方法であって、
サンプル中の複数の蛍光マーカが励起状態をとるように、第１の軸に沿って配向された励起源からの励起ビームを用いて、前記複数の蛍光マーカを照射することと、
前記第１の軸に垂直関係にある第２の軸に沿って配向された刺激源からの刺激ビームを用いて、前記励起状態における前記複数の蛍光マーカを照射することであって、刺激された放出は、前記刺激ビームによって照射されると、前記１つ以上の蛍光マーカによって生成され、前記刺激ビームおよび前記励起ビームは、異なる波長を有する、ことと、
対物レンズを通して前記刺激ビームおよび前記刺激された放出を集束させることと、
前記対物レンズ後、前記第２の軸に沿って位置付けられた刺激ビーム減衰器を用いて前記刺激ビームを減衰させ、減衰させられた刺激ビームを生産することと、
前記減衰させられた刺激ビームに対して前記刺激された放出を位相偏移させることによって、前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産することと、
検出器を用いて前記刺激された放出を結像することと
を含む、方法。
（項目１３）
レンズを使用して前記検出器上に前記刺激された放出を集束させることをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記刺激された放出を前記対物レンズから付加的レンズに中継することと、
前記付加的レンズを使用して、前記検出器上に前記刺激された放出を集束させることと
をさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
刺激された放出に基づく蛍光結像の方法であって、
サンプル中の複数の蛍光マーカが励起状態をとるように、第１の軸に沿って配向された励起源からの励起ビームを用いて、前記複数の蛍光マーカを照射することと、
前記第１の軸に垂直関係にある第２の軸に沿って配向された刺激源からの刺激ビームを用いて、前記励起状態における前記複数の蛍光マーカを照射することであって、刺激された放出は、前記刺激ビームによって照射されると、前記１つ以上の蛍光マーカによって生成され、前記刺激ビームおよび前記励起ビームは、異なる波長を有する、ことと、
対物レンズを通して前記刺激ビームおよび前記刺激された放出を集束させることと、
前記対物レンズ後、前記第２の軸に沿って位置付けられた刺激ビーム減衰器を用いて前記刺激ビームを減衰させることと、
基準ビームと前記刺激された放出との間の相対位相偏移を誘発することによって、前記基準ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産することと、
検出器を用いて前記刺激された放出を結像することと
を含む、方法。
（項目１６）
前記刺激ビームを減衰させることは、減衰させられた刺激ビームを生産することを含み、前記基準ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産することは、前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産することを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記刺激ビームを減衰させることは、グレーフィルタを通して前記減衰ビームの一部を通過させることを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記刺激ビームを減衰させることは、中心ピンホール開口を有するビームブロック上に前記刺激ビームを集束させることであって、前記ビームブロックは、前記刺激ビームに対して光学的に不透過性である、ことと、前記中心ピンホール開口を通して前記刺激ビームの一部を通過させ、前記減衰させられた刺激ビームを提供することとを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記基準ビームと前記刺激された放出との間の前記相対位相偏移を誘発することは、位相調節板を通して前記基準ビームおよび前記刺激された放出のうちの少なくとも１つを通過させることを含む、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
蛍光結像システムであって、
励起ビームを生成し、複数の蛍光マーカを含有するサンプルを照射するように構成されている、励起源であって、前記励起ビームは、前記複数の蛍光マーカの吸収帯内の第１の波長を有し、前記複数の蛍光マーカを励起状態に励起するように構成されている、励起源と、
コリメートされた刺激ビームを生成し、前記サンプルをさらに照射するように構成されている、刺激源であって、前記刺激ビームは、前記複数の蛍光マーカの放出帯内の第２の波長を有し、前記励起状態における前記複数の蛍光マーカを刺激し、刺激された放出を生産するように構成されている、刺激源と、
前記刺激ビームおよび前記刺激された放出を受光するように構築および配列された対物レンズと、
前記対物レンズから前記刺激ビームおよび前記刺激された放出を受光し、前記刺激ビームを減衰させ、基準ビームと前記刺激された放出との間の相対位相偏移を誘発し、それによって、前記基準ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を引き起こすように構成されている、位相偏移および減衰装置と、
前記刺激された放出を受光および結像するように構成された検出器と、
前記対物レンズと前記検出器との間に位置付けられ、前記検出器における結像面上に前記刺激された放出を集束させるように構成されている、光学装置と
を備える、蛍光結像システム。
（項目２１）
前記位相偏移および減衰装置は、前記対物レンズの後焦点面に位置付けられた減衰領域を有する位相調節板を含み、前記減衰領域は、前記刺激ビームを減衰させるように構成されている、項目２０に記載の蛍光結像システム。
（項目２２）
前記位相調節板はさらに、前記刺激された放出を位相偏移させ、それによって、前記基準ビームと前記刺激された放出との間の前記相対位相偏移を誘発するように構成されている、項目２１に記載の蛍光結像システム。
（項目２３）
前記減衰領域は、グレーフィルタを含む、項目２１に記載の蛍光結像システム。
（項目２４）
前記基準ビームは、前記減衰させられた刺激ビームである、項目２０に記載の蛍光結像システム。
（項目２５）
前記位相偏移および減衰装置は、
前記対物レンズの後焦点面に位置付けられ、前記刺激ビームを減衰させ、減衰させられた刺激ビームを生産するように構成されている、刺激ビーム減衰器と、
前記刺激ビーム減衰器と前記検出器との間に位置付けられた位相調節板と
を含む、項目２４に記載の蛍光結像システム。
（項目２６）
前記位相調節板はさらに、前記刺激された放出を位相偏移させるように構成され、前記減衰させられた刺激ビームを通過させる中心開口を含む、項目２５に記載の蛍光結像システム。
（項目２７）
前記刺激ビーム減衰器は、中心ピンホール開口を有する刺激ビームブロックを含み、前記刺激ビームブロックは、前記中心ピンホールを通して前記刺激ビームの一部を通過させ、前記減衰させられた刺激ビームを生産するように配列されている、項目２５に記載の蛍光結像システム。
（項目２８）
前記光学装置は、前記刺激ビーム減衰器と前記位相調節板との間に位置付けられた光学リレーと、前記位相調節板と前記検出器との間に位置付けられ、前記結像面上に前記刺激された放出を集束させるように構成されている、レンズとを含む、項目２０に記載の蛍光結像システム。
（項目２９）
前記刺激源および前記対物レンズは、第１の軸に沿って配列され、前記刺激源は、前記第１の軸に沿って前記刺激ビームを指向するように構成され、前記励起源は、前記第１の軸に直交する第２の軸に沿って前記励起ビームを指向するように配列および構成されている、項目２０に記載の蛍光結像システム。
（項目３０）
刺激された放出に基づく蛍光結像の方法であって、
サンプルと関連付けられる複数の蛍光マーカを励起状態に励起することと、
刺激ビームを用いて前記サンプルを照射し、前記励起状態における前記複数の蛍光マーカを刺激し、刺激された放出を生産することと、
前記サンプルを通して透過される前記刺激ビームを減衰させ、減衰させられた刺激ビームを生産することと、
前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間の相対位相偏移を誘発し、前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を提供することと、
結像面上に前記刺激された放出を集束させることと、
前記結像面に位置する結像検出器を用いて前記刺激された放出を検出することと
を含む、方法。
（項目３１）
前記複数の蛍光マーカを励起することは、前記複数の蛍光マーカの吸収帯内の波長を有する励起ビームを用いて前記サンプルを照射することを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記対物レンズを用いて前記サンプルを通して透過される前記刺激された放出および前記刺激ビームを収集し、集束させることをさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記刺激ビームを減衰させることは、前記対物レンズの後焦点面に位置する刺激ビーム減衰器を用いて、前記対物レンズからの前記刺激ビームを遮断することを含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間の前記相対位相偏移を誘発することは、前記刺激された放出および前記減衰させられた刺激ビームのうちの少なくとも１つを位相偏移させるように構成された位相調節板を通して前記刺激された放出および前記減衰させられた刺激ビームを透過させることを含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
粒子移動を追跡する方法であって、
項目３０に記載の方法を使用して、前記粒子と関連付けられる蛍光マーカから生産される刺激された放出を結像することと、
前記画像を分析し、前記粒子の移動を追跡することと
を含む、方法。
（項目３６）
前記粒子は、タンパク質である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
結像モードフローサイトメトリを実施する方法であって、
項目３０に記載の方法を使用して、着目粒子と関連付けられる蛍光マーカから生産される刺激された放出を結像することと、
前記画像を分析し、前記粒子の移動を追跡することと
を含む、方法。

Claims (37)

1. 蛍光結像システムであって、
   第１の軸に沿って励起ビームを生成するように構成された励起源と、
   前記第１の軸に対して垂直配向にある第２の軸に沿って刺激ビームを生成するように構成された刺激源であって、前記励起ビームおよび前記刺激ビームは、異なる波長を有する、刺激源と、
   複数の蛍光マーカを有するサンプルであって、前記複数の蛍光マーカは、前記複数の蛍光マーカが励起状態をとるように前記励起光ビームによって照射され、次いで、前記最初に励起されたサンプルによる刺激された放出を生成するように前記刺激光ビームによって再び照射される、サンプルと、
   前記第２の軸に沿って配向され、前記刺激ビームおよび前記複数の蛍光マーカによって放出された前記刺激された放出を捕捉し、集束させるように構成されている、対物レンズと、
   前記対物レンズの後焦点面に位置付けられ、前記刺激された放出が通過することを可能にしながら前記刺激ビームを減衰させるように構成されている、刺激ビーム減衰器と、
   前記刺激された放出と基準ビームとの間の相対位相偏移を誘発し、前記基準ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産するように構成されている、位相調節構成要素と、
   前記刺激された放出を結像するように構成された検出器と
   を備える、蛍光結像システム。
2. 前記基準ビームは、前記減衰させられた刺激ビームである、請求項１に記載の蛍光結像システム。
3. 前記刺激ビーム減衰器は、中心ピンホール開口を有する、ビームブロックを含み、前記ビームブロックは、前記刺激ビームに対して光学的に不透過性であり、前記刺激ビーム減衰器は、前記刺激ビームの一部が前記中心ピンホール開口を通過し、前記減衰させられた刺激ビームを提供するように位置付けられている、請求項２に記載の蛍光結像システム。
4. 前記刺激ビーム減衰器は、グレーフィルタを含む、請求項２に記載の蛍光結像システム。
5. 前記第１の軸に沿った前記励起ビームは、前記対物レンズによって捕捉されない、請求項１に記載の蛍光結像システム。
6. 前記刺激ビームは、コリメートされる、請求項１に記載の蛍光結像システム。
7. 前記対物レンズと前記検出器との間に位置付けられ、前記検出器上に前記刺激された放出を集束させるように構成されている、少なくとも１つのレンズをさらに備える、請求項１に記載の蛍光結像システム。
8. 前記少なくとも１つのレンズは、第１のレンズと、第２のレンズと、第３のレンズとを含み、前記第１および第２のレンズは、光学リレーとして構成され、前記第３のレンズは、前記光学リレーから前記刺激された放出を受光し、前記検出器上に前記刺激された放出を集束させるように位置付けられ、構成されている、請求項６に記載の蛍光結像システム。
9. 前記刺激源および前記励起源は、それぞれ、レーザを含む、請求項１に記載の蛍光結像システム。
10. 前記位相偏移構成要素は、所定の度数の固定位相偏移を前記刺激された放出および前記基準ビームのうちの１つに付与するように構成されている、請求項１に記載の蛍光結像システム。
11. 前記位相偏移構成要素は、回転可能である、請求項１に記載の蛍光結像システム。
12. 刺激された放出に基づく蛍光結像の方法であって、
    サンプル中の複数の蛍光マーカが励起状態をとるように、第１の軸に沿って配向された励起源からの励起ビームを用いて、前記複数の蛍光マーカを照射することと、
    前記第１の軸に垂直関係にある第２の軸に沿って配向された刺激源からの刺激ビームを用いて、前記励起状態における前記複数の蛍光マーカを照射することであって、刺激された放出は、前記刺激ビームによって照射されると、前記１つ以上の蛍光マーカによって生成され、前記刺激ビームおよび前記励起ビームは、異なる波長を有する、ことと、
    対物レンズを通して前記刺激ビームおよび前記刺激された放出を集束させることと、
    前記対物レンズ後、前記第２の軸に沿って位置付けられた刺激ビーム減衰器を用いて前記刺激ビームを減衰させ、減衰させられた刺激ビームを生産することと、
    前記減衰させられた刺激ビームに対して前記刺激された放出を位相偏移させることによって、前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産することと、
    検出器を用いて前記刺激された放出を結像することと
    を含む、方法。
13. レンズを使用して前記検出器上に前記刺激された放出を集束させることをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記刺激された放出を前記対物レンズから付加的レンズに中継することと、
    前記付加的レンズを使用して、前記検出器上に前記刺激された放出を集束させることと
    をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
15. 刺激された放出に基づく蛍光結像の方法であって、
    サンプル中の複数の蛍光マーカが励起状態をとるように、第１の軸に沿って配向された励起源からの励起ビームを用いて、前記複数の蛍光マーカを照射することと、
    前記第１の軸に垂直関係にある第２の軸に沿って配向された刺激源からの刺激ビームを用いて、前記励起状態における前記複数の蛍光マーカを照射することであって、刺激された放出は、前記刺激ビームによって照射されると、前記１つ以上の蛍光マーカによって生成され、前記刺激ビームおよび前記励起ビームは、異なる波長を有する、ことと、
    対物レンズを通して前記刺激ビームおよび前記刺激された放出を集束させることと、
    前記対物レンズ後、前記第２の軸に沿って位置付けられた刺激ビーム減衰器を用いて前記刺激ビームを減衰させることと、
    基準ビームと前記刺激された放出との間の相対位相偏移を誘発することによって、前記基準ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産することと、
    検出器を用いて前記刺激された放出を結像することと
    を含む、方法。
16. 前記刺激ビームを減衰させることは、減衰させられた刺激ビームを生産することを含み、前記基準ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産することは、前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を生産することを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記刺激ビームを減衰させることは、グレーフィルタを通して前記減衰ビームの一部を通過させることを含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記刺激ビームを減衰させることは、中心ピンホール開口を有するビームブロック上に前記刺激ビームを集束させることであって、前記ビームブロックは、前記刺激ビームに対して光学的に不透過性である、ことと、前記中心ピンホール開口を通して前記刺激ビームの一部を通過させ、前記減衰させられた刺激ビームを提供することとを含む、請求項１６に記載の方法。
19. 前記基準ビームと前記刺激された放出との間の前記相対位相偏移を誘発することは、位相調節板を通して前記基準ビームおよび前記刺激された放出のうちの少なくとも１つを通過させることを含む、請求項１５に記載の方法。
20. 蛍光結像システムであって、
    励起ビームを生成し、複数の蛍光マーカを含有するサンプルを照射するように構成されている、励起源であって、前記励起ビームは、前記複数の蛍光マーカの吸収帯内の第１の波長を有し、前記複数の蛍光マーカを励起状態に励起するように構成されている、励起源と、
    コリメートされた刺激ビームを生成し、前記サンプルをさらに照射するように構成されている、刺激源であって、前記刺激ビームは、前記複数の蛍光マーカの放出帯内の第２の波長を有し、前記励起状態における前記複数の蛍光マーカを刺激し、刺激された放出を生産するように構成されている、刺激源と、
    前記刺激ビームおよび前記刺激された放出を受光するように構築および配列された対物レンズと、
    前記対物レンズから前記刺激ビームおよび前記刺激された放出を受光し、前記刺激ビームを減衰させ、基準ビームと前記刺激された放出との間の相対位相偏移を誘発し、それによって、前記基準ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を引き起こすように構成されている、位相偏移および減衰装置と、
    前記刺激された放出を受光および結像するように構成された検出器と、
    前記対物レンズと前記検出器との間に位置付けられ、前記検出器における結像面上に前記刺激された放出を集束させるように構成されている、光学装置と
    を備える、蛍光結像システム。
21. 前記位相偏移および減衰装置は、前記対物レンズの後焦点面に位置付けられた減衰領域を有する位相調節板を含み、前記減衰領域は、前記刺激ビームを減衰させるように構成されている、請求項２０に記載の蛍光結像システム。
22. 前記位相調節板はさらに、前記刺激された放出を位相偏移させ、それによって、前記基準ビームと前記刺激された放出との間の前記相対位相偏移を誘発するように構成されている、請求項２１に記載の蛍光結像システム。
23. 前記減衰領域は、グレーフィルタを含む、請求項２１に記載の蛍光結像システム。
24. 前記基準ビームは、前記減衰させられた刺激ビームである、請求項２０に記載の蛍光結像システム。
25. 前記位相偏移および減衰装置は、
    前記対物レンズの後焦点面に位置付けられ、前記刺激ビームを減衰させ、減衰させられた刺激ビームを生産するように構成されている、刺激ビーム減衰器と、
    前記刺激ビーム減衰器と前記検出器との間に位置付けられた位相調節板と
    を含む、請求項２４に記載の蛍光結像システム。
26. 前記位相調節板はさらに、前記刺激された放出を位相偏移させるように構成され、前記減衰させられた刺激ビームを通過させる中心開口を含む、請求項２５に記載の蛍光結像システム。
27. 前記刺激ビーム減衰器は、中心ピンホール開口を有する刺激ビームブロックを含み、前記刺激ビームブロックは、前記中心ピンホールを通して前記刺激ビームの一部を通過させ、前記減衰させられた刺激ビームを生産するように配列されている、請求項２５に記載の蛍光結像システム。
28. 前記光学装置は、前記刺激ビーム減衰器と前記位相調節板との間に位置付けられた光学リレーと、前記位相調節板と前記検出器との間に位置付けられ、前記結像面上に前記刺激された放出を集束させるように構成されている、レンズとを含む、請求項２０に記載の蛍光結像システム。
29. 前記刺激源および前記対物レンズは、第１の軸に沿って配列され、前記刺激源は、前記第１の軸に沿って前記刺激ビームを指向するように構成され、前記励起源は、前記第１の軸に直交する第２の軸に沿って前記励起ビームを指向するように配列および構成されている、請求項２０に記載の蛍光結像システム。
30. 刺激された放出に基づく蛍光結像の方法であって、
    サンプルと関連付けられる複数の蛍光マーカを励起状態に励起することと、
    刺激ビームを用いて前記サンプルを照射し、前記励起状態における前記複数の蛍光マーカを刺激し、刺激された放出を生産することと、
    前記サンプルを通して透過される前記刺激ビームを減衰させ、減衰させられた刺激ビームを生産することと、
    前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間の相対位相偏移を誘発し、前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間に強め合う干渉を提供することと、
    結像面上に前記刺激された放出を集束させることと、
    前記結像面に位置する結像検出器を用いて前記刺激された放出を検出することと
    を含む、方法。
31. 前記複数の蛍光マーカを励起することは、前記複数の蛍光マーカの吸収帯内の波長を有する励起ビームを用いて前記サンプルを照射することを含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記対物レンズを用いて前記サンプルを通して透過される前記刺激された放出および前記刺激ビームを収集し、集束させることをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
33. 前記刺激ビームを減衰させることは、前記対物レンズの後焦点面に位置する刺激ビーム減衰器を用いて、前記対物レンズからの前記刺激ビームを遮断することを含む、請求項３２に記載の方法。
34. 前記減衰させられた刺激ビームと前記刺激された放出との間の前記相対位相偏移を誘発することは、前記刺激された放出および前記減衰させられた刺激ビームのうちの少なくとも１つを位相偏移させるように構成された位相調節板を通して前記刺激された放出および前記減衰させられた刺激ビームを透過させることを含む、請求項３３に記載の方法。
35. 粒子移動を追跡する方法であって、
    請求項３０に記載の方法を使用して、前記粒子と関連付けられる蛍光マーカから生産される刺激された放出を結像することと、
    前記画像を分析し、前記粒子の移動を追跡することと
    を含む、方法。
36. 前記粒子は、タンパク質である、請求項３５に記載の方法。
37. 結像モードフローサイトメトリを実施する方法であって、
    請求項３０に記載の方法を使用して、着目粒子と関連付けられる蛍光マーカから生産される刺激された放出を結像することと、
    前記画像を分析し、前記粒子の移動を追跡することと
    を含む、方法。