CN105044066B - 一种基于宽带受激辐射的纳米oct成像方法及系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于宽带受激辐射的纳米OCT成像方法及系统。本发明利用受激辐射而非自发辐射使处于激发态的色团快速回到基态，并采用宽带探测光源实现受激辐射荧光信号的相干探测。轴向与横向分辨率的提高则分别通过宽带光源技术和受激辐射损耗技术来实现。采用超宽带光源作为探测光源，可实现亚微米至百纳米级的轴向分辨率。采用基于受激辐射损耗的点扩散函数调控技术，可以实现纳米级的横向分辨率。鉴于受激辐射过程大大短于自发辐射过程，本发明的成像方法较之于传统的荧光成像，成像速度可以极大提高。本发明不仅实现了OCT成像的纳米分辨率，而且拓展了OCT的荧光成像功能，并为非荧光色团的光学成像提供了方法。

Description

一种基于宽带受激辐射的纳米OCT成像方法及系统

技术领域

本发明涉及OCT技术、受激辐射探测技术以及受激辐射损耗(StimulatedEmission Depletion，STED)显微术，具体涉及一种基于宽带受激辐射的纳米OCT成像方法及系统。

技术背景

随着生物医学领域的飞速发展，纳米分辨技术越来越受到研究人员的重视。一方面，为了更好地理解人体生命的作用过程与疾病的形成机理，人们需要观察细胞内器官、病毒、寄生虫等在三维细胞空间的精确定位和分布。另一方面，后基因组时代蛋白质科学的研究也要求阐明蛋白质结构、定位与功能的关系以及蛋白质-蛋白质之间发生相互作用的时空顺序；生物大分子，主要是结构蛋白与RNA及其复合物，如何组成细胞的基本结构体系；重要的活性因子如何调节细胞的主要生命活动，如细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡与细胞信号传递等。反映这些体系性质的特征尺度都在纳米量级，由此对相应的观测手段提出了更高的要求。

目前，基于荧光的超分辨显微方法主要有以下几类：第一类光学超分辨技术利用荧光分子的光开光效应，采用极低光强的激活光使得同一时间只有极少数、稀疏的荧光分子被激活，具备发射荧光的能力。此时，这些荧光分子所发出的荧光将不会由于衍射效应而发生空间上的串扰，相应的荧光分子也将可以被一一区分并通过点扩散函数数字化的方法计算出中心位置。反复这一过程逐个获取数微米尺度范围内所有荧光分子的中心位置，最后叠加重构成一幅完整的图像，即可实现超分辨显微。第二类光学超分辨技术称为光学波动成像法(SOFI)，由Dertinger等人于2009年提出。SOFI利用荧光分子连续发光时发光强度存在波动性这一现象，通过对一段时间内探测得到的荧光强度进行高阶时间相关运算，从而提高系统的分辨率。第三类光学超分辨方法称为结构光照明显微术(SIM)。这种方法通过对照明光源进行调制，将原本不可分辨的高空间频率信息编码入荧光图像中，结合计算解码获取高分辨率信息，可将横向分辨率提高至约100nm。在荧光饱和情况下，这种技术的空间分辨能力可以进一步地提高至50nm左右。第四类光学超分辨方法则是基于光学非线性效应来抑制荧光的发射，减小有效荧光点扩散函数的横向尺寸，从而提高系统的分辨率。由Stefan Hell于1994年提出的STED正是这一类显微术中的代表。在STED显微术中，有效荧光发光面积的减小是通过受激辐射效应来实现的。当激发光的照射使得其衍射斑范围内的荧光分子被激发，其中的电子跃迁到激发态后，损耗光使得部分处于激发光斑外围的电子以受激辐射的方式回到基态，其余位于激发光斑中心的被激发电子则不受损耗光的影响，继续以自发荧光的方式回到基态。由此，有效荧光的发光面积得以减小，系统的分辨率得以提高。

在生物医学的研究之中，涉及到的样品除了常见的荧光样品(本身发荧光或荧光染料标记)之外，还有一类特殊的非荧光色团，如血红蛋白和细胞色素。这类物质中的电子在吸收激发光光子后仍然会跃迁到激发态，但是之后绝大部分将以非辐射的方式回到基态，从而导致自发荧光极其微弱，无法被探测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于宽带受激辐射的纳米OCT成像方法和系统。本发明：1)利用受激辐射而非自发辐射使处于激发态的色团快速回到基态，并采用宽带探测光源实现受激辐射荧光信号的相干探测。2)轴向与横向分辨率的提高则分别通过宽带光源技术和受激辐射损耗技术来实现。采用超宽带光源作为探测光源，可实现亚微米至百纳米级的轴向分辨率。采用基于受激辐射损耗的点扩散函数调控技术，可以实现纳米级的横向分辨率。3)受激辐射过程十分迅速，这为生物体的实时成像提供了可能。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种基于宽带受激辐射的纳米OCT成像方法：

1)开启激发光对样品进行照射，使样品处于激发状态；

2)开启激发光的同时开启损耗光；损耗光经过光束调制后形成横向中空型长焦光斑；损耗光照射到样品上，此时位于激发光斑外围位置上的激发态电子将通过受激辐射的方式回到基态，而处于激发光斑中心附近位置上的激发态电子将仍然留在激发态上；

3)关闭激发光和损耗光，开启探测光，将留在激发态上的电子通过受激辐射的方式送回基态；

4)受激辐射荧光与样品发生相互作用，形成后向散射信号；这些信号光再次入射到分光棱镜上，与从参考光路返回的参考光汇合并形成干涉，干涉光由快速光谱仪探测；通过分析干涉光谱在傅里叶域上的强度，便可以得到之前处于激发态电子的数量，继而表征出样品中荧光色团或非荧光色团的分布。

一种基于宽带受激辐射的纳米OCT成像系统，包括时序控制器、激发光源、损耗光源、光束调制模块、探测光源、平面反射镜、信号采集和处理模块和样品臂；样品臂包括二维扫描振镜和显微物镜；

激发光源出射的激发光束首先被导入第一单模光纤，之后依次通过第一准直透镜，以及平面镜反射进入样品臂；由损耗光源发出的损耗光束首先被导入第二单模光纤，由第二单模光纤出射的光束经第二准直透镜后进入光束调制模块；之后通过二向色镜及平面镜的反射进入样品臂；由探测光源出射的光束被导入第三单模光纤，然后经第三准直透镜准直，再通过分光棱镜后被分成两部分，其中透射光作为探测光，而反射光作为参考光；参考光被平面反射镜反射后再次入射到分光棱镜上；探测光依次被二向色镜和反射镜反射，进入样品臂；进入样品臂的激发光束、损耗光束和探测光束通过二维扫描振镜后，再经显微物镜聚焦，投射到样品上；来自样品的信号光被显微物镜收集，再次通过二维扫描振镜，之后被二向色镜反射，从而与激发光束和损耗光束分离；被二向色镜反射的后向散射信号光入射到分光棱镜上被反射，之后与透过分光棱镜的参考光形成干涉，并由信号采集和处理模块采集并处理；探测光源、损耗光源和激发光源均与时序控制器连接。

与背景技术相比，本发明具有的有益效果是：

1、较之于传统的荧光超分辨显微方法，本发明同时融合了OCT技术、受激辐射损耗技术以及受激辐射探测技术。不仅拓展了OCT的荧光成像功能，并为非荧光色团的光学成像提供了方法。

2、由于OCT的轴向分辨率和横向分辨率是相互独立的。利用超宽带光源作为探测光源，可以实现百纳米级的轴向分辨率。结合受激辐射损耗点扩散函数调控技术，减小有效荧光点扩散函数的横向尺寸，可以实现纳米级超高横向分辨率。

3、受激辐射过程大大快于自发辐射过程，这为提高成像速度、实现生物体的实时观测提供了可能。

附图说明

图1是本发明的成像系统示意图。

图2是本发明中的三个光源的时序控制图。

图3是本发明中与三束光源相关的电子跃迁能级图。

图4是系统的横向分辨率和轴向分辨率的示意图。

图1中：1时序控制器，2激发光源，3损耗光源，4光束调制模块，5探测光源，6二维扫描振镜，7样品，8平面反射镜，9信号采集和处理模块。虚线框内是典型的谱域OCT系统。

图3中：①代表受激激发，②代表振动弛豫过程，③代表受激辐射损耗，④代表受激辐射探测。

图4中：束腰处代表系统的横向分辨率，虚线框内代表的是系统的轴向分辨率。

具体实施方式

下面结合附图和实施例子对本发明作进一步的说明。

一种基于宽带受激辐射的纳米OCT成像方法：

1)开启激发光对样品进行照射，使样品处于激发状态；

2)开启激发光的同时开启损耗光；损耗光经过光束调制后形成横向中空型长焦光斑；损耗光照射到样品上，此时位于激发光斑外围位置上的激发态电子将通过受激辐射的方式回到基态，而处于激发光斑中心附近位置上的激发态电子将仍然留在激发态上；

3)关闭激发光和损耗光，开启探测光，将留在激发态上的电子通过受激辐射的方式送回基态；

4)受激辐射荧光与样品发生相互作用，形成后向散射信号；这些信号光再次入射到分光棱镜上，与从参考光路返回的参考光汇合并形成干涉，干涉光由快速光谱仪探测；通过分析干涉光谱在傅里叶域上的强度，便可以得到之前处于激发态电子的数量，继而表征出样品中荧光色团或非荧光色团的分布。

如图1所示，本发明一种基于宽带受激辐射的纳米OCT成像系统，包括时序控制器1、激发光源2、损耗光源3、光束调制模块4、探测光源5、平面反射镜8、信号采集和处理模块9和样品臂；样品臂包括二维扫描振镜6和显微物镜；

激发光源2出射的激发光束首先被导入第一单模光纤，之后依次通过第一准直透镜，以及平面镜反射进入样品臂；由损耗光源3发出的损耗光束首先被导入第二单模光纤，由第二单模光纤出射的光束经第二准直透镜后进入光束调制模块4，目的是对损耗光束进行调制使其形成横向中空型光斑；之后通过二向色镜及平面镜的反射进入样品臂；由探测光源5出射的光束被导入第三单模光纤，然后经第三准直透镜准直，再通过分光棱镜后被分成两部分，其中透射光作为探测光，而反射光作为参考光；参考光通过聚焦透镜到平面反射镜8，再被平面反射镜反射后再次入射到分光棱镜上；探测光依次被二向色镜和反射镜反射，进入样品臂；进入样品臂的激发光束、损耗光束和探测光束通过二维扫描振镜6后，再经显微物镜聚焦，投射到样品7上；来自样品的信号光被显微物镜收集，再次通过二维扫描振镜6，之后被二向色镜反射，从而与激发光束和损耗光束分离。被二向色镜反射的后向散射信号光入射到分光棱镜上被反射，之后与透过分光棱镜的参考光形成干涉，并由信号采集和处理模块9采集并处理；探测光源5、损耗光源3和激发光源2均与时序控制器1连接。

如图2所示为本发明中的三个光源的时序控制图。利用优化的时序控制电路，使激发光源和损耗光源同时开启，此时进行的是A受激辐射损耗。激发光和损耗光照射到样品上，位于激发光斑外围位置上的激发态电子将通过受激辐射的方式回到基态，而处于激发光斑中心附近位置上的激发态电子将仍然留在激发态上。随后关闭激发光和损耗光，开启探测光，此时进行B受激辐射探测，将留在激发态上的电子通过受激辐射的方式送回基态。

如图3所示为本发明中与三束光源相关的电子跃迁能级图。①处于基态的电子吸收了一个激发光子而跃迁到激发态，通过②振动弛豫回到激发态的最低振动能级。由于上述过程在极短的时间内完成，与激发光同时开启的损耗光使激发光斑外围的激发态电子发生③受激辐射损耗。此时，在激发光斑中心的电子仍然处于激发状态。开启探测光发生④受激辐射探测，处在中心的激发态电子回到基态。

如图4所示为系统的横向分辨率和轴向分辨率的示意图。OCT系统的轴向分辨率和横向分辨率相互分离的，利用上述的受激辐射损耗技术可以实现纳米级的横向分辨率。而系统的轴向分辨率由光源决定，本发明采用宽带光源技术可实现亚微米至百纳米级的轴向分辨率。同时本发明采用长焦光斑设计，在焦深范围内可以实现无需轴向扫描的大纵深高分辨率并行成像。

Claims (2)

1.一种基于宽带受激辐射的纳米OCT成像方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

1)开启激发光对样品进行照射，使样品处于激发状态；

2)开启激发光的同时开启损耗光；损耗光经过光束调制后形成横向中空型长焦光斑；损耗光照射到样品上，此时位于激发光斑外围位置上的激发态电子将通过受激辐射的方式回到基态，而处于激发光斑中心附近位置上的激发态电子将仍然留在激发态上；

3)关闭激发光和损耗光，开启探测光，将留在激发态上的电子通过受激辐射的方式送回基态；

4)受激辐射荧光与样品发生相互作用，形成后向散射信号；这些信号光再次入射到分光棱镜上，与从参考光路返回的参考光汇合并形成干涉，干涉光由快速光谱仪探测；通过分析干涉光谱在傅里叶域上的强度，便可以得到之前处于激发态电子的数量，继而表征出样品中荧光色团或非荧光色团的分布。

2.一种基于宽带受激辐射的纳米OCT成像系统，包括时序控制器、激发光源、损耗光源、光束调制模块、探测光源、平面反射镜、信号采集和处理模块和样品臂；样品臂包括二维扫描振镜和显微物镜；

其特征在于：激发光源出射的激发光束首先被导入第一单模光纤，之后依次通过第一准直透镜，以及平面镜反射进入样品臂；由损耗光源发出的损耗光束首先被导入第二单模光纤，由第二单模光纤出射的光束经第二准直透镜后进入光束调制模块；之后通过二向色镜及平面镜的反射进入样品臂；由探测光源出射的光束被导入第三单模光纤，然后经第三准直透镜准直，再通过分光棱镜后被分成两部分，其中透射光作为探测光，而反射光作为参考光；参考光通过聚焦透镜到平面反射镜，再被平面反射镜反射后再次入射到分光棱镜上；探测光依次被二向色镜和反射镜反射，进入样品臂；进入样品臂的激发光束、损耗光束和探测光束通过二维扫描振镜后，再经显微物镜聚焦，投射到样品上；来自样品的信号光被显微物镜收集，再次通过二维扫描振镜，之后被二向色镜反射，从而与激发光束和损耗光束分离；被二向色镜反射的后向散射信号光入射到分光棱镜上被反射，之后与透过分光棱镜的参考光形成干涉，并由信号采集和处理模块采集并处理；探测光源、损耗光源和激发光源均与时序控制器连接。