CN111678898B - 基于宽带受激辐射的时间分辨光学生物检测设备及其检测成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于宽带受激辐射的时间分辨光学生物检测设备及其检测成像方法，其将泵浦探测技术与光学相干显微技术相结合，实现对被测样本的受激辐射寿命成像；设备包括超连续谱光源、光调制单元、光学相干显微单元，其中光调制单元调制输入激光生成带有时间延迟的泵浦光和探测光，光学相干显微单元用于对生物样本进行相干探测，系统使用相矢量法对信号强度和时间延迟的关系曲线进行分析，获得寿命相关的信息。本发明能够反映原子能级更精细的结构，具有长工作距离、高时空分辨率、快速成像等优势，兼具组织结构信息和分子特异性信息。此外，本发明还可实现对非荧光色团的探测，规避了特定情形下荧光标记可能带来的探测偏差。

Description

基于宽带受激辐射的时间分辨光学生物检测设备及其检测成 像方法

技术领域

本发明属于光学显微成像技术领域，具体涉及一种基于宽带受激辐射的时间分辨光学生物检测设备及其检测成像方法。

背景技术

光学相干层析术(OCT)或较高数值孔径下的光学相干显微术(OCM)可对活体组织实现微米量级分辨率和毫米量级成像深度的在体成像，已在生物医学领域发挥重要作用。但由于其对比度来源于细胞和组织折射率的变化，而在不同生理病理状态下由细胞代谢引起的组织复折射率实部的变化不大，因而散射对比机制下的OCT/OCM技术在分子特异性识别能力上存在不足，亟待发展具有分子特异性的OCT成像新方法。

基于受激辐射效应的非荧光色团成像技术是指当非荧光色团的原子吸收激发光的光子跃迁到激发态之后，利用一束探测光使得原子以受激辐射方式回到基态。理论上，受激辐射方法不仅可以实现对非荧光色团的成像，也可以对常规的荧光样品进行成像，因此这一方法的出现为光学显微技术的发展提供了很好的思路，对于光学显微技术应用范围的进一步扩大起到了推动作用，而且鉴于受激辐射过程明显快于自发辐射过程，这也为提高成像速度提供了潜在可能性。

具有时间分辨特性的荧光寿命成像(FLIM)被认为比荧光强度成像具有更高的灵敏度和特异性；荧光寿命与分子的动力学特性密切相关，例如分子构造和分子微环境的变化等，已被应用于探测细胞和组织的特征，包括离子浓度、周围环境的pH、细胞内辅酶与蛋白质的耦联等等，这些特征均与细胞的新陈代谢水平密不可分。

虽然时间分辨寿命成像具有探测细胞新陈代谢水平的潜在优势和高灵敏特性，但是目前的方法仍然存在着诸多局限性，限制了其对活体细胞、离体组织细胞乃至在体组织细胞成像的能力。提高分子信号的收集效率(高信噪比)和分辨率水平(更清楚)，提高时间分辨寿命成像的速度(更快)，提高成像与探测的深度(更深)，是推进寿命成像对细胞代谢水平检测所面临的难点和挑战，同时也是进一步拓展其在生物医学领域应用范畴所亟需解决的难题。与此同时，当前基于寿命信息实现细胞代谢水平的检测仍然主要基于荧光色团，来自于外源性的荧光标记或是自发荧光物质，这也在一定程度上限制了这些方法的应用：首先，细胞内大量包含新陈代谢信息的物质为非荧光色团，无法用荧光信号对其进行成像；其次，某些应用环境下不适宜用荧光染料对生物样品进行标记，比如对活体组织细胞进行成像时，荧光标记可能会影响样品的活性；最后，在对某些小型代谢产物分子进行观测时，由于这些分子本身的尺寸已经小于荧光染料分子的尺寸，引入荧光标记可能还会影响测量的分辨精度。

发明内容

鉴于上述，本发明提出了一种基于宽带受激辐射的时间分辨光学生物检测设备及其检测成像方法，其将泵浦探测技术与光学相干显微技术相结合，实现对被测样本的荧光寿命成像。

一种基于宽带受激辐射的时间分辨光学生物检测设备，包括超连续谱光源、光调制单元、光学相干显微单元以及计算机，其中：

所述超连续谱光源用于产生超连续谱激光；

所述光调制单元通过对超连续谱激光进行调制生成一路带有强度调制的泵浦光和一路具有时间延迟特性的探测光，进而将这两路光合成后送入光学相干显微单元；

所述光学相干显微单元利用输入的合成光对生物样本进行相干探测，获得能够反映生物样本发光寿命信息的电信号；

所述计算机采用相矢量法对电信号强度与时间延迟的关系曲线进行分析，获得生物样本的发光寿命信息，用以评价生物样本的新陈代谢水平。

进一步地，所述光调制单元包括：

扩束器，用于对超连续谱激光进行扩束，输出具有适配光斑尺寸的激光；

截止滤光片CF1，用于从具有适配光斑尺寸的激光中分离出所需的宽带光谱激光；

二向色镜DM1，用于将宽带光谱激光分成两路不同波长的激光；

光学斩波器，用于对波长较短的一路激光进行强度调制生成泵浦光；

光学延迟线，用于对波长较长的一路激光进行时间延迟生成探测光；

二向色镜DM2，用于将泵浦光和探测光合成后送入光学相干显微单元。

进一步地，所述光学相干显微单元包括分光镜、截止滤光片CF2、透镜GP1～GP5、二维扫描振镜、参考镜、光阑、针孔、衍射光栅以及CMOS线阵传感器，其中：所述分光镜用于将输入的合成光分成两路相同的激光，其中一路依次经光阑和透镜GP1打到参考镜上并原路返回，另一路依次经二维扫描振镜和透镜GP2打到生物样本上并原路返回，进而分光镜将两路返回的激光进行合成并将合成光束依次经截止滤光片CF2、透镜GP3、针孔、透镜GP4、衍射光栅、透镜GP5后送入CMOS线阵传感器；所述CMOS线阵传感器用于将输入光的光谱转换成电信号后送至计算机。

进一步地，所述光学相干显微单元采用的是谱域光学相干显微系统。

进一步地，所述光学延迟线对输入光的时间延迟精确可控。

进一步地，所述超连续谱光源的输出光谱范围为450～1600nm，重复频率为20MHz，脉冲宽度为20ps。

进一步地，所述截止滤光片CF1用以截止800nm波长以上的光谱，从而分离出450～800nm波长的宽带光谱激光，所述截止滤光片CF2用以截止510nm波长以下的光谱。

上述时间分辨光学生物检测设备的检测成像方法，包括如下步骤：

(1)由超连续谱光源发射的激光经过光调制单元和光学相干显微单元，获得被测生物样本某点的强度信息；

(2)调整光学延迟线的时间延迟，获得不同时间延迟下的强度信息；

(3)通过二维扫描振镜对被测生物样本进行二维扫描，从而得到能够反映生物样本发光寿命信息的电信号；

(4)采用相矢量法对电信号强度与时间延迟的关系曲线进行分析，获得生物样本的发光寿命信息，用以评价生物样本的新陈代谢水平。

基于上述技术方案，本发明与现有技术方案相比具有如下优势：

1.本发明通过受激辐射的方式(即泵浦-探测方式)对生物样本进行探测，同时引入谱域相干探测技术实现微弱信号沿轴向分布的同步探测，有望极大地提高成像速度。

2.光谱分光的引入，使得本发明的寿命成像也可具有光谱分辨的能力，能反映原子能级更精细的结构，获取全新维度的分子微环境信息用以评估细胞的代谢水平。

3.本发明还可实现对非荧光色团的探测，显著拓展了检测对象的范围，规避了特定情形下荧光标记可能带来的探测偏差。

附图说明

图1为本发明时间分辨光学生物检测设备的结构示意图。

图2为本发明涉及的调制激发-探测时序图；其中a为光学斩波器方波调制信号，b为调制激发光脉冲信号，c为传统探测光脉冲信号，d为受激辐射探测光脉冲信号。

图3为本发明涉及寿命信息的相矢量分析法的图谱示意图。

具体实施方式

为了更为具体地描述本发明，下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案进行详细说明。

本发明基于宽带受激辐射的时间分辨光学生物检测设备，包括超连续谱光源、光调制单元、光学相干显微单元；光调制单元用于调制输入激光生成带有时间延迟的泵浦光和探测光，输入至光学相干显微单元；光学相干显微单元用于对生物样本进行相干探测。

光调制单元包括扩束器、截止滤光片、二向色镜1、泵浦支路单元、探测支路单元、二向色镜2；扩束器用于对输入激光进行扩束，输出具有合适光斑尺寸的激光；截止滤光片用于分离出所需的宽带光谱激光；二向色镜1用于将输入激光分成两路分别进入泵浦支路单元和探测支路单元；泵浦支路单元包括光学斩波器，用于对输入光进行强度调制；探测支路单元包括光学延迟线，用于对输入光进行时间延迟调制；光学延迟线对输入光的时间延迟精确可控；二向色镜2用于将泵浦支路与探测支路的激光合束，输入到光学相干显微单元；光学相干显微单元为谱域光学相干显微系统。

上述时间分辨光学生物检测设备的检测成像过程如下：

步骤1：超连续谱光源发射的激光经过光调制单元和光学相干显微单元，获得被测生物样本某点的强度信息；

步骤2：调整光学延迟线的时间延迟，获得不同时间延迟下的强度信息；

步骤3：通过二维扫描振镜对被测生物样本进行二维扫描，从而得到三维信息；

步骤4：使用相矢量法(Phasor)对信号强度和时间延迟的关系曲线进行分析，获得寿命相关的信息。

如图1所示，本实施方式中由超连续谱激光器(输出光谱范围为450～1600nm，重复频率为20MHz，脉冲宽度为20ps)发出的光，经扩束器(可实现2～5倍率调谐)后通过截止滤光片(截止800nm以上的光谱)分离出宽带光谱光(450～800nm)，该宽带光谱光抵达一个二向色镜(HR@450～510nm，HT@520～800nm)后，分成反射和透射两路光，反射光路为调制泵浦光支路，该支路中设置了光学斩波器(频率调谐范围200～10kHz)，用于对激发光的强度调制；透射支路为探测光支路，该支路中设置了可调量程为10cm的光学延迟线(对应的最大时间延迟约为300ps)，两支路光经过另一个二向色镜(HR@450～510nm，HT@520～800nm)后汇合，并经分光镜(分光比90/10，其中90％进入样品臂，10％进入参考臂)分为参考光和样品光，参考臂所用透镜L1与样品臂所用透镜L2相同，焦距f＝20mm；在样品臂光路中使用可变光阑(孔径调谐范围为Φ0.8～20mm)衰减激光功率，样品自发辐射光峰值波长在630nm左右。从参考臂和样品臂返回的光在分束镜处汇合并发生干涉，通过另一截止滤光片(截止激发光，即截止510nm以下的光谱)后，经透镜L3、针孔和透镜L4进入光谱仪，透镜L3焦距f＝5mm，针孔直径为50μm，透镜L4焦距f＝10mm。在光谱仪中，干涉光经衍射光栅(1200lines/mm)分光，不同的光谱成分被透镜L5(焦距f＝50mm)聚焦到线阵探测器的不同位置上，并由线阵探测器采集。

为了实现受激辐射信号的高灵敏、快速采集，本实施方式采用CMOS线阵传感器作为信号的收集装置，采样频率200kHz；鉴于激发光与探测光源于同一超连续谱激光器，激发光与探测光的光脉冲间隔及光脉冲宽度均相同。为了实现寿命成像，需要使用光学延迟线在多个不同的时间延迟下分别实现受激辐射成像，从而得到受激辐射强度衰减曲线。

图2进一步展示了调制激发-探测的方案，光学斩波器对探测光脉冲序列进行了强度调制(如图2中的a和b)；相比于传统探测光脉冲信号(如图2中的c)，受激辐射后的探测光脉冲幅度呈现出微小增量(如图2中的d)，而该增量正是对应于非荧光/荧光物质的分子特异性信息。

在得到受激辐射强度衰减曲线后，可基于相矢量Phasor方法开展寿命信息的分析，Phasor方法通过对衰减信号的傅里叶变换，能够完整地提取寿命相关的信息，获取多项代谢相关表征量。典型的Phasor图谱如图3所示，通过Phasor分析方法，不但可以获得寿命的量值，还能基于像素样点在二维空间的群簇特性，得到与寿命直接或间接相关的其他参量，与细胞新陈代谢建立多元联系，比如群簇的面积、群簇的重心、群簇的线性/非线性拟合等等，都与细胞内影响分子寿命的不同因素有关，这些特性与待测物微环境的诸多变量相关联，为受激辐射分子寿命的生物医学解读提供了全面的、多角度的信息，而这正是解决光学信号与细胞代谢水平关联性问题的关键。

综合上述实施案例可见，本发明通过受激辐射的方式(即泵浦-探测方式)对生物样本进行探测，同时引入谱域相干探测技术实现微弱信号沿轴向分布的同步探测，有望极大地提高成像速度；光谱分光的引入，使得本发明的寿命成像也可具有光谱分辨的能力，能反映原子能级更精细的结构，获取全新维度的分子微环境信息用以评估细胞的代谢水平。本发明具有长工作距离、高时空分辨率、快速成像等优势，兼具组织结构信息(散射信号)和分子特异性(寿命成像)信息，能够实现对细胞代谢动态变化和各向异性的高灵敏检测。

上述对实施例的描述是为便于本技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对上述实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于宽带受激辐射的时间分辨光学生物检测设备，其特征在于，包括超连续谱光源、光调制单元、光学相干显微单元以及计算机，其中：

所述超连续谱光源用于产生超连续谱激光；

所述光调制单元通过对超连续谱激光进行调制生成一路带有强度调制的泵浦光和一路具有时间延迟特性的探测光，进而将这两路光合成后送入光学相干显微单元；

所述光学相干显微单元利用输入的合成光对生物样本进行相干探测，获得能够反映生物样本发光寿命信息的电信号；

所述计算机采用相矢量法对电信号强度与时间延迟的关系曲线进行分析，获得生物样本的发光寿命信息，用以评价生物样本的新陈代谢水平；

所述光调制单元包括：

扩束器，用于对超连续谱激光进行扩束，输出具有适配光斑尺寸的激光；

截止滤光片CF1，用于从具有适配光斑尺寸的激光中分离出所需的宽带光谱激光；

二向色镜DM1，用于将宽带光谱激光分成两路不同波长的激光；

光学斩波器，用于对波长较短的一路激光进行强度调制生成泵浦光；

光学延迟线，用于对波长较长的一路激光进行时间延迟生成探测光；

二向色镜DM2，用于将泵浦光和探测光合成后送入光学相干显微单元；

所述光学相干显微单元包括分光镜、截止滤光片CF2、透镜GP1～GP5、二维扫描振镜、参考镜、光阑、针孔、衍射光栅以及CMOS线阵传感器，其中：所述分光镜用于将输入的合成光分成两路相同的激光，其中一路依次经光阑和透镜GP1打到参考镜上并原路返回，另一路依次经二维扫描振镜和透镜GP2打到生物样本上并原路返回，进而分光镜将两路返回的激光进行合成并将合成光束依次经截止滤光片CF2、透镜GP3、针孔、透镜GP4、衍射光栅、透镜GP5后送入CMOS线阵传感器；所述CMOS线阵传感器用于将输入光的光谱转换成电信号后送至计算机。

2.根据权利要求1所述的时间分辨光学生物检测设备，其特征在于：所述光学相干显微单元采用的是谱域光学相干显微系统。

3.根据权利要求1所述的时间分辨光学生物检测设备，其特征在于：所述光学延迟线对输入光的时间延迟可控。

4.根据权利要求1所述的时间分辨光学生物检测设备，其特征在于：所述超连续谱光源的输出光谱范围为450～1600nm，重复频率为20MHz，脉冲宽度为20ps。

5.根据权利要求1所述的时间分辨光学生物检测设备，其特征在于：所述截止滤光片CF1用以截止800nm波长以上的光谱，从而分离出450～800nm波长的宽带光谱激光，所述截止滤光片CF2用以截止510nm波长以下的光谱。

6.如权利要求1所述时间分辨光学生物检测设备的检测成像方法，包括如下步骤：

(1)由超连续谱光源发射的激光经过光调制单元和光学相干显微单元，获得被测生物样本某点的强度信息；

(2)调整光学延迟线的时间延迟，获得不同时间延迟下的强度信息；

(3)通过二维扫描振镜对被测生物样本进行二维扫描，从而得到能够反映生物样本发光寿命信息的电信号；

(4)采用相矢量法对电信号强度与时间延迟的关系曲线进行分析，获得生物样本的发光寿命信息，用以评价生物样本的新陈代谢水平。

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