CN112649415A - 三光束自同步高速扫频光纤激光拉曼扫描成像系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的三光束自同步高速扫频光纤激光拉曼扫描成像系统，包括使用三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器作为光源，为相干拉曼扫描系统提供信号激发光的光源模块、用于对三种不同波长的脉冲光束进行合束以激发样品的拉曼共振信号的空间光合束器件组，用于将合束后的脉冲光束照射到样品上并对样品进行扫描，使样品在合束脉冲光束的作用下激发拉曼散射光信号的基于xy振镜的扫描模块、用于收集处理样品受激后产生的拉曼散射光信号的信号放大和处理模块和计算与图像处理模块，用于对收集的信号进行成像处理的计算与图像处理模块。本发明可实现三种光束相位同步且可以同时对样品中的多种成分进行高速成像，扫描的生物样品不需要进行特殊标记处理。

Description

三光束自同步高速扫频光纤激光拉曼扫描成像系统及方法

技术领域

本发明属于显微成像的分析技术领域，尤其涉及三光束自同步高速扫频光纤激光拉曼扫描成像系统及方法。

背景技术

光学成像技术长期以来一直是生物医学方面研究的重要工具。在这些技术中，相干拉曼散射(CRS)，包括相干反斯托克斯散射(CARS)和受激拉曼散射(SRS)和其他非线性光学成像方法都已经在解决生物学问题上有成功的应用。这些技术通过其化学特异性，无标记对比度以及高光谱和空间分辨率的优点为解决上述问题提供便利。

一般来说相干拉曼散射显微成像包括相干反斯托克斯散射(CARS)成像和受激拉曼散射(SRS)成像两种形式，这两种成像形式均需要两束频率不同的光作用，一般将能量高频率大的光束定义为泵浦光、频率小的光定义为斯托克斯光。CARS成像过程中，泵浦光与斯托克斯光与物质发生作用，产生CARS信号，当泵浦光与斯托克斯光的频率差与拉曼活性分子振动形成共振，CARS信号将大幅增强。在SRS成像模式中，泵浦光激发SRS信号，当SRS信号与斯托克斯光频率相同，SRS信号会被放大。信号处理系统接受成像信号处理成图像。

需要特别说明的是，CRS显微镜具有对未使用或不能使用荧光分子标记的生物分子样品进行微创和连续的实时成像的能力。有些荧光分子可能会影响样品性能，例如样品分子的大小、重量或因为荧光分子团具有毒性改变样品。荧光分子团的漂白以及激发光的光毒性会干扰生物样品本身的活动以及干扰长时间成像的过程的稳定性。

一般来说CRS显微成像系统需要两束具有特定频率差的脉冲激光作为光源激发成像信号，这些信号用于分析观察可以被该特定频率差脉冲激光激发信号的成分组成的结构，一般用于生物样品的结构和组成分析。因此传统的固定波长双光束的CRS显微成像系统只能同时探测少数几种成分甚至一种成分的信号进行成像。传统的CRS显微镜使用固定波长或使用可调谐的固态激光器作为激光源，光源的稳定性直接影响成像信号及最终成像效果。因此CRS成像技术的临床应用方面转化依然受到传统激光源体积大、成本高的缺点的阻碍。一个标准的固态激光器(通常指掺钛蓝宝石激光器和使用空间光学器件的同步泵浦光参量振荡器(OPO))必须安装在隔离振动的光学平台上，这也为CRS临床转化造成了技术阻碍。针对上述缺点与不足，采用三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器作为激光源解决同时探测的成分数量少、激光源不稳定、系统体积大等缺点，可以扩大CRS成像系统应用范围，满足在科学研究和临床应用方面的需求。

在制造基于三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器的相干拉曼显微成像系统的过程中存在三光束相位同步的技术障碍。要成功激发受激拉曼信号，需要使激发信号的多束光时间空间相位上在亚皮秒级和纳米级尺度上保持一致，这就需要对激光源及系统进行特殊的设计。

在一种受激拉曼差分方法及其装置(公开号：CN109632762A)中，多光束相位同步及调制的过程都使用空间光路进行，使得该方案易受环境因素影响。由于CRS成像技术需要两个相干脉冲光源且在两个不同的波长上都具有足够的功率和低强度噪声。而这两个波长必须紧密同步、覆盖合适的探测范围并且具有匹配的脉冲宽度。这两个脉冲光源在时间和空间上都必须分别在亚皮秒级和纳米级尺度上重叠，且在这两个域中具有高度的稳定性。所以稳定工作的激光源十分重要。同时由于激发不同分子的拉曼信号需要不同的波长的脉冲组合，针对不同分子进行成像的时候往往需要手动调节斯托克斯光以及泵浦光的波长来适应不同的受激拉曼成像要求，这也是限制该系统在临床方面推广的障碍。在一种利用受激拉曼光谱检测血液中肿瘤细胞的方法中(公开号：CN108802008A)，其核心思想为调整光源波长至已知肿瘤细胞特征物质拉曼共振范围进行检测。

综上所述，现有技术存在的问题是：传统的相干拉曼散射成像系统体积大、成本高、系统对于环境稳定性要求高、对不同分子的成像需要手动调节波长不方便获取更多样品信息并且光束间的相位同步难以控制。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器的相干拉曼显微成像系统及方法。

三光束自同步高速扫频光纤激光拉曼扫描成像系统，包括光源模块、空间光合束器件组、基于xy振镜的扫描模块、信号放大和处理模块和计算与图像处理模块，

所述光源模块，使用三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器作为光源，为相干拉曼扫描系统提供信号激发光；

所述空间光合束器件组，用于对三种不同波长的脉冲光束进行合束，以激发样品的拉曼共振信号；

所述基于xy振镜的扫描模块，用于将合束后的脉冲光束照射到样品上并对样品进行扫描，使样品在合束后的脉冲光束的作用下激发拉曼散射光信号；

所述信号放大和处理模块，用于收集处理样品受激后产生的拉曼散射光信号；

所述计算与图像处理模块，用于对收集的信号进行成像处理。

进一步地，所述光源模块包括三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器，所述三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器包括高速扫频斯托克斯脉冲支路、环形腔、倍频泵浦光支路和固定波长斯托克斯光支路，

所述高速扫频斯托克斯脉冲支路包括半导体可饱和吸收镜、第一半导体激光二极管、第一波分复用器、第一增益介质、第一光纤耦合器、光隔离器、声光可调谐滤波器和第二光纤耦合器，半导体可饱和吸收镜、第一波分复用器、第一增益介质和第一光纤耦合器依次连接，第一半导体激光二极管与第一波分复用器连接以接入光路，光隔离器、声光可调谐滤波器和第二光纤耦合器连接成环路；

高速扫频斯托克斯脉冲支路的输出的高速扫频斯托克斯脉冲经第三光纤耦合器分成两路输出，其中一路输出传输至所述空间光合束器件组，另一路输出传输至环形腔，第三光纤耦合器的输入端与第一光纤耦合器的输出端连接；

所述环形腔包括第二半导体激光二极管以及连成环路的第二波分复用器、第二增益光纤和光学集成元件，环形腔的输出从光学集成元件处输出，高速扫频斯托克斯脉冲支路中的另一路输出传输至的第二波分复用器，环形腔的输出光经过啁啾脉冲放大电路放大后，输出为两路，分别为固定波长斯托克斯光支路和倍频泵浦光支路，其中，固定波长斯托克斯光支路通过第四光纤耦合器后经第三光纤准直器传输至空间光合束器件组；倍频泵浦光支路通过第四光纤耦合器输入至倍频模块进行倍频处理后输出到空间光合束器件组。

进一步地，所述倍频模块包括依次设置的第五光纤准直器、第二半波片、第二四分之一波片、第三透镜、倍频晶体、第四透镜、第三半波片。

进一步地，所述啁啾脉冲放大电路包括依次设置的单模无源光纤、第一掺铒光纤放大器、光纤脉冲强度调制器、第二掺铒光纤放大器、第一光纤准直器、第一反射镜、第二光纤准直器和第四光纤耦合器，所述单模无源光纤接入环形腔的输出，并通过所述第四光纤耦合器将的输出分为所述固定波长斯托克斯光支路和所述倍频泵浦光支路；

且在所述第一光纤准直器和所述第一反射镜之间还设置有用于实现脉冲压缩的脉冲压缩空间光器件组。

进一步地，所述脉冲压缩空间光器件组包括第一半波片、第一四分之一波片、偏振分光晶体、第一光栅、第一透镜、第二透镜、第二光栅、可调狭缝、第四半波片和第二反射镜，第一半波片、第一四分之一波片、偏振分光晶体依次设置，所述第一光纤准直器出射的脉冲激光通入所述第一半波片，偏振分光晶体将光出射至所述第一反射镜，第一光栅、第二透镜、可调狭缝、第一透镜、第二光栅、第四半波片和第二反射镜依次设置，且第一光栅靠近偏振分光晶体设置。

进一步地，所述空间光合束器件组包括第三光纤准直器、第四光纤准直器和三光束合束模块，所述三光束合束模块包括第三反射镜、第一二向色镜和第二二向色镜，

高速扫频斯托克斯脉冲经第三光纤耦合器分出的其中一路输出通过所述第三光纤准直器出射到第二二向色镜，

倍频模块倍频处理后输出的倍频泵浦光经第三反射镜反射后出射至第一二向色镜，与第三光纤准直器出射至第一二向色镜的固定波长斯托克斯光在第一二向色镜上进行合束，合束后的光出射至第二二向色镜并在第二二向色镜中与所述高速扫频斯托克斯脉冲进行合束。

进一步地，所述信号收集放大和处理模块包括用于过滤样品激发的瑞利散射及其他信号的滤波片、用于放大光信号的光电倍增管、引入激光器参考脉冲的锁相放大副器以及用于探测光信号并将其转化为电信号的光电探测器。

进一步地，所述计算与图像处理模块包数据采集卡、传输模块和计算与图像处理系统，所述数据采集卡用于接收所述信号收集放大和处理模块输出的电信号，所述传输模块用于连接采集卡和计算机，所述计算与图像处理系统包括计算机及图像处理软件，用于处理数据并转化为图像。

本发明还提供一种基于三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器的相干拉曼扫描成像方法，包括：

S1、由三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光源输出包含较宽频谱范围的三束脉冲，输入空间光合束器件组中；

S2、空间光合束器件组将所述三束脉冲合束；

S3、利用基于xy振镜的扫描模块将调制后的脉冲对样品进行扫描，同时激发多种拉曼共振信号；

S4、利用信号收集放大和处理模块中的滤波片过滤入射脉冲及其他信号，在光电倍增器放大信号后，光电探测器收集拉曼共振信号并转化为电信号；

S5、计算与图像处理模块中的数据采集卡收集所述电信号，并传输至图像处理软件进行处理，将电信号转化为图像。

本发明的另一目的在于提供一种基于三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器的相干拉曼显微成像系统在生物材料无损检测中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种基于三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器的相干拉曼显微成像系统在细胞生物样品无标记检测中的应用。

与现有技术相比，本发明能够实现的有益效果至少如下：

本发明的图像质量高，基于三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器的相干拉曼显微成像系统，可实现在样品成分未知的情况下，对多种分子的拉曼共振信号的同时短时间激发且不需要对系统进行调节，大大提高了成像图像的包含的样品信息，同时由于引入锁相放大技术，减少了激光源噪声对最终成像的干扰。本发明的成像速度快，基于三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器的相干拉曼显微成像系统通过采用高速扫频的技术减少单次扫频扫描时间，同时还可以可通过调谐滤波器减少采集信号量的方法加快成像速度。本发明光源体积小且多为光纤结构，环境对系统的影响极小。

通过将高速扫频脉冲输入特殊的环形腔中，利用非线性效应产生同步脉冲，实现三束脉冲的时间与空间相位同步，产生的成像信号强度及稳定性高，成像效果好；通过使用基于光纤的三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器来代替固态激光源减小系统体积以及对环境稳定性的要求；通过使用基于声光调制器的高速扫频部分实现多种分子信号的同时获取；通过锁相放大技术在信号处理环节减少由于激光源导致的相对强度噪声提高的问题；通过三束不同波长脉冲激光的相互组合增大探测范围，同时获得更多样品信息。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器的相干拉曼显微成像系统的结构示意图。

图2是本发明实施例提供的三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器及空间光器件组的原理示意图。

图3是本发明实施例提供的基于三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器的相干拉曼显微成像方法流程图。

图中：1、第一半导体激光二极管，2、第一波分复用器，3、第一增益介质、4、第一光纤耦合器，5、光隔离器，6、声光可调谐滤波器，7、第二光纤耦合器，8、第三光纤耦合器，9、第二波分复用器、10、第二增益光纤，11、光学集成元件，12、单模无源光纤，13、第一掺铒光纤放大器，14、光纤脉冲强度调制器，15、第二掺铒光纤放大器；16、第一光纤准直器，17、第二光纤准直器，18、第三光纤准直器，19、第四光纤准直器；20、第一半波片，21、第一四分之一波片，22、偏振分光晶体，23、第一反射镜，24、第一光栅，25、第一透镜，26、可调狭缝，27、第二透镜，28、第二光栅，29、第四半波片，30、第四光纤耦合器，31、第五光纤准直器，32、第二半导体激光二极管，33、第二四分之一波片，34、第二半波片，35、第三半波片，36、倍频晶体，37、第三透镜，38、第四透镜，40、第三反射镜，41、第一二向色镜，42、第二二向色镜，43、半导体可饱和吸收镜，44、第二反射镜。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明激光光源部分进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1所示，本实施例提供的一种基于三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器的相干拉曼显微成像系统，包括光源模块、空间光合束器件组、基于xy振镜的扫描模块、信号放大和处理模块和计算与图像处理模块。

光源模块，用于提供高强度、低噪声、稳定的三色相位同步的高速扫频光纤激光器作为光源，为相干拉曼扫描系统提供信号激发光；

空间光合束器件组，用于三种不同波长的脉冲光束合束，以激发样品拉曼共振信号；

基于xy振镜的扫描模块，将合束的脉冲光束照射到样品上以及用于在六个自由度对样品进行扫描，使样品在合束后的脉冲光束的作用下激发拉曼散射光信号；

信号放大和处理模块，用于收集处理样品受激后产生的拉曼散射光信号；

计算与图像处理模块，用于收集信号的图像化处理。

光源模块包括三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器，三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器包括高速扫频斯托克斯脉冲支路、环形腔、倍频泵浦光支路和固定波长斯托克斯光支路，高速扫频斯托克斯光支路包括半导体可饱和吸收镜43、第一半导体激光二极管1、波分复用器2、第一增益介质3、第一光纤耦合器4、光隔离器5、声光可调谐滤波器6和第二光纤耦合器7，半导体可饱和吸收镜43、波分复用器2、第一增益介质3和第一光纤耦合器4依次连接，第一半导体激光二极管1与波分复用器2连接以接入光路，光隔离器5、声光可调谐滤波器6和第二光纤耦合器7连接成环路。这一支路使用半导体可饱和吸收镜43锁模，第一半导体激光二极管1输出的激光通过波分复用器2，波分复用器2的common端连接第一增益介质3，pass端连接半导体可饱和吸收镜43。第一半导体激光二极管1输出泵浦光(本实施例中为波长为980nm的连续光)，通过波分复用器2输入第一增益介质3中转换为特定波长的连续光(本实施例中为1060nm)，之后输入使用2*2耦合比为90：10的第一光纤耦合器4，第一光纤耦合器4将光隔离器5和声光可调谐滤波器6组成环路，光输入环路通过第一光纤耦合器4后返回第一增益介质3并通过波分复用器2的pass端输入半导体可饱和吸收镜43，其锁模机制作用下，将产生特定波长的脉冲光，并再次通过第一光纤耦合器4进入环路，脉冲通过环路中的第二光纤耦合器7，其中90％脉冲继续在环路中循环，10％的脉冲引出作为锁相放大的参考信号，脉冲通过声光可调谐滤波器6被调制产生高速扫频脉冲，之后高速扫频脉冲通过光隔离器5后从第一光纤耦合器4输出90％，剩余10％在环路中继续循环起到稳定脉冲锁模的作用。高速扫频斯托克斯脉冲90％能量通过第三光纤耦合器8输出到空间光合束器件组中，10％的脉冲输入波分复用器9进入产生倍频泵浦光及固定波长斯托克斯光的环形腔中。

通过环形腔内光学集成元件11，高速扫频斯托克斯脉冲与腔内脉冲产生交叉相位调制，达到产生与高速扫频斯托克斯脉冲同步的脉冲的目的。该环形腔由一个具有隔离器、偏振控制器、波分复用器和光纤耦合器作用的光学集成元件11连接一个第二半导体激光二极管32以及第二增益光纤10和第二波分复用器9组成环形腔。第二半导体激光二极管32输出泵浦连续光(本实施例中为980nm波长的连续光)，通过光学集成元件11连续光输入第二增益光纤10中产生特定波长的连续光(本实施例中为1550nm波长)，产生的特定波长连续光在环形腔中通过第二波分复用器9，与高速扫频斯托克斯脉冲在环形腔内产生交叉相位调制，通过光学集成元件11的偏振控制功能利用非线性偏振锁模机制产生与高速扫频斯托克斯脉冲相位同步的脉冲，从光学集成元件11中输出，输出光经过啁啾脉冲放大电路放大后，再经过耦合比为50：50的1*2第四光纤耦合器30分路，其中一路直接输出为固定波长斯托克斯光支路，另一路为倍频泵浦光支路；倍频泵浦光支路在分路后输入倍频模块进行倍频处理再输出激光器。

本实施例中的光学集成元件11可以采用型号TIWDM-1550/980-D-50-B-10-NE，offlink，但该型号不构成对该光学集成元件的的限制。

啁啾脉冲放大电路包括依次设置的单模无源光纤12、第一掺铒光纤放大器13、光纤脉冲强度调制器14、第二掺铒光纤放大器15、第一光纤准直器16、第一反射镜23、第二光纤准直器17和第四光纤耦合器30，单模无源光纤12接入环形腔的输出，并通过第四光纤耦合器30将的输出分为固定波长斯托克斯光支路和倍频泵浦光支路；且在第一光纤准直器16和第一反射镜23之间还设置有用于实现脉冲压缩的脉冲压缩空间光器件组。如图2所示，光源中高速扫频斯托克斯光支路使用半导体可饱和吸收镜(SESAM)43锁模，利用声光可调谐滤波器6进行扫频，在高速扫频斯托克斯光支路中使用宽带光隔离器5保证光在扫频腔中的传输方向，用第二光纤耦合器7引出10％的高速扫频斯托克斯光作为信号放大和处理模块中锁相放大器的参考脉冲。输出的高速扫频斯托克斯光波长范围1000～1120nm，重复频率80MHz通过第三光纤耦合器8进行分束，90％的光输出，10％的光通过第二波分复用器9输入环形腔中(腔中脉冲波长1557nm，重复频率80MHz，脉冲宽度1.21ps)通过交叉相位调制实现输出相位同步。环形腔输出的脉冲激光通过单模无源光纤12实现色散展宽以及第一掺铒光纤放大器13和第二掺铒光纤放大器15的两级放大和光纤脉冲强度调制器14的高频调制后，从第一光纤准直器16中出射通入脉冲压缩空间光器件组中实现脉冲压缩。脉冲压缩空间光器件组包括第一半波片20、第一四分之一波片21、偏振分光晶体22、第一光栅24和第二光栅28组成的光栅对、设置在光栅对之间的由第一透镜25和第二透镜27组成的透镜对、可调狭缝26、第四半波片29和第二反射镜44。光通过第一半波片20及第一四分之一波片21调制偏振状态控制其在偏振分光晶体22中的传播方向使之入射光栅对，从而起到压缩脉冲的作用。光栅对之间的透镜对以及可调狭缝26可以起到滤波的作用。通过光栅对后脉冲通过第四半波片29调整偏振态后被第二反射镜44反射按原光路返回偏振分光晶体22，此时的脉冲经过第二次半波片的偏振调整透射偏振分光晶体完成脉冲压缩过程。压缩后的脉冲通过第一反射镜23改变光束方向至第二光纤准直器17耦合入光纤，然后通过第四光纤耦合器30分束分为50：50的两束激光，其中一束通过倍频模块倍频后输出倍频泵浦光，另一束直接输出固定波长斯托克斯光。三束光的组合使得理论上可探测的受激拉曼共振信号的范围增大。本实施例理论可探测的共振信号的波数范围为2639cm^-1到3812.29cm^-1。

倍频模块包括第五光纤准直器31、第二半波片34、第三半波片35、第二四分之一波片33、倍频晶体36以及第三透镜37和第四透镜38组成的透镜对。光从第五光纤准直器31出射，经过第二半波片34与第二四分之一波片33调整，检测输出的倍频光功率最高时为最佳倍频偏振状态，调至最佳倍频偏振状态后，通过透镜对会聚在倍频晶体36相应波长通道上实现倍频。

空间光合束器件组包括第三光纤准直器18、第四光纤准直器19和三光束合束模块，三光束合束模块包括第三反射镜40、两个不同波段的第一二向色镜41以及第二二向色镜42。第三反射镜40反射倍频后的倍频泵浦光与从第三光纤准直器18出射的固定波长斯托克斯光在第一二向色镜41上合束，合束后的光再与从第四光纤准直器19出射的高速扫频斯托克斯脉冲在第二二向色镜42上合束，三光束合束后通入扫描系统。

基于xy振镜的扫描模块包括xy扫描振镜、样品承载台、样品三维平移台、物镜组以及透镜组。其中光束先进入xy扫描振镜中，xy扫描振镜可以精确地定位及控制光束的扫描速度，经过xy扫描振镜后的光束通过透镜组后经其中一个物镜汇聚在样品承载台的样品上，产生的信号光通过另一物镜进入信号收集放大和处理模块。样品承载台起到承载样品的作用，样品三维平移台起到辅助调制光束扫描位置和更换样品的作用。

信号收集放大和处理模块包括用于过滤样品激发的瑞利散射及其他信号的滤波片以及光阑、用于放大光信号的光电倍增管、用于引入激光器参考脉冲的锁相放大器和用于探测光信号并将其转化为电信号的光电探测器。从物镜收集产生的光信号通过滤波片及光阑过滤信号激发光及环境光，保留的信号光通过光电倍增管放大后由光电探测器收集。锁相放大器接受参考脉冲后，调制光电探测器收集转换后的电子信号，减小系统噪声，提升图像质量。

计算与图像处理模块包数据采集卡、传输模块和计算与图像处理系统，数据采集卡与锁相放大器和光电探测器相连以收集转化后的电信号；传输模块用于连接采集卡和计算机；计算与图像处理系统包括计算机及相关图像处理软件，用于快速处理数据并转化为图像。由于收集到多种分子的拉曼共振信号，因此图像处理软件可以对单一种类分子分布成像也可以对多种分子进行综合成像，从而可以获取更多的样品信息。本实施例中，图像处理软件为开源软件Fiji中的“Cyan Hot”和“Red Hot”子软件。

本系统的扫描成像方法的具体步骤如下：

步骤1：三光束同步高速扫频脉冲光纤激光源输出包含较宽频谱范围的三束脉冲，分别输入空间光合束器件组和环形腔中。

本步骤中：

(1)参考目标样品的拉曼峰波数范围确定三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器的三束脉冲的波长；

(2)由波数范围确定高速扫频斯托克斯脉冲波长范围，由倍频泵浦光束的重复频率确定高速扫频斯托克斯脉的单次扫频时间t，并在声光可调谐滤波器6的控制软件中设置；

(3)通过第二波分复用器9将一部分扫频光引入环形腔内，在环形腔内通过交叉相位调制实现三束脉冲相位时间同步，部分高速扫频斯托克斯脉冲经第三光纤耦合器8出射至空间光合束器件组中的第四光纤准直器19。

步骤2：空间光合束器件组将三光束合束与相位同步，使之满足多种分子拉曼共振激发的需求。

本实施例中，三光束合束的方法：使用两个二向色镜先使倍频泵浦脉冲光与固定波长斯托克斯光合束再使合束后的光与高速扫频斯托克斯脉冲光合束。实施例中选择将波长为1060nm左右的脉冲光束进行高速扫频化处理是考虑到与倍频斯托克斯光(波长为775nm)适合探测生物材料中组成分子的拉曼共振信号的缘故。固定波长斯托克斯光(波长为1550nm)与高速扫频斯托克斯脉冲光束可以组合激发另一波数范围的拉曼共振信号，故系统的探测范围较一般双光束受激拉曼散射显微成像系统更宽，实际应用能力更强。根据不同的应用条件还可选择将多束脉光进行高速扫频化处理。

步骤3：利用扫描系统将将合束后的脉冲光束照射到样品上以及用于在六个自由度对样品进行扫描，由于三种不同波长的脉冲激光同时对样品进行作用，可以实现多种拉曼共振信号的同时激发。扫描过程中使用xy振镜进行高精确度的激光定位与扫描，光束通过xy振镜后由透镜组汇聚，通过物镜到达样品台上样品区域进行扫描，激发信号。

步骤4：信号收集放大和处理模块中滤波片过滤入射脉冲及其他信号，利用探测器收集拉曼共振信号转化为电信号。

(1)滤波片筛选得到所需光信号，可以选择需要的信号进行成像，也可以过滤掉部分非共振信号；

(2)光电倍增管放大较微弱的共振信号；

(3)光电探测器接收放大后共振信号，并转化为电信号；

(4)锁相放大器减少激光源产生的噪声信号；

步骤5：使用数据采集卡储存数据并传输到计算机中进行图像化处理，使用图像处理软件处理收集到的信号；由于收集到多种分子的拉曼共振信号，因此信号处理模块可以对单一种类分子分布成像也可以对多种分子进行综合成像，获取更多的样品信息。

具体包括：

(1)连接光电探测器的数据收集卡，收集和存储转化为电信号的光信号。

(2)传输模块将信号传输至图像处理软件。

(3)使用开源软件Fiji中的“Cyan Hot”和“Red Hot”子软件处理，将信号转化为图像。

针对传统的拉曼成像方法存在成像速度慢，像场弯曲和光子散射，图像质量低的问题；本发明通过在环形腔中利用非线性效应实现同步脉冲的产生，实现三束脉冲的时间与空间同步，产生的成像信号强度及稳定性高；本发明通过使用基于光纤的三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光源来代替固态激光源减小系统体积以及对环境稳定性的要求；通过使用基于声光调制器的高速扫频斯托克斯光实现多种分子信号的同时获取；通过引入锁相放大技术在信号处理环节减少由于更换激光源导致的相对强度噪声提高的问题。最终获得图像质量高、成像速度快，可以获得全面的样品信息的系统。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡利用本发明的脉冲同步实现方法进行多光束合束或将其余光束进行高速扫频化处理的改变探测范围等在本发明精神和原理上的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。

Claims (10)

1.三光束自同步高速扫频光纤激光拉曼扫描成像系统，其特征在于：包括光源模块、空间光合束器件组、基于xy振镜的扫描模块、信号放大和处理模块以及计算与图像处理模块，

所述光源模块，使用三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器作为光源，为相干拉曼扫描系统提供信号激发光；

所述空间光合束器件组，用于对三种不同波长的脉冲光束进行合束，以激发样品的拉曼共振信号；

所述基于xy振镜的扫描模块，用于将合束后的脉冲光束照射到样品上并对样品进行扫描，使样品在合束后的脉冲光束的作用下激发拉曼散射光信号；

所述信号放大和处理模块，用于收集处理样品受激后产生的拉曼散射光信号；

所述计算与图像处理模块，用于对收集的信号进行成像处理。

2.根据权利要求1所述的基于三光束自同步高速扫频光纤激光拉曼扫描成像系统，其特征在于：所述光源模块包括三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器，所述三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器包括高速扫频斯托克斯脉冲支路、环形腔、倍频泵浦光支路和固定波长斯托克斯光支路，

所述高速扫频斯托克斯脉冲支路包括半导体可饱和吸收镜(43)、第一半导体激光二极管(1)、第一波分复用器(2)、第一增益介质(3)、第一光纤耦合器(4)、光隔离器(5)、声光可调谐滤波器(6)和第二光纤耦合器(7)，半导体可饱和吸收镜(43)、第一波分复用器(2)、第一增益介质(3)和第一光纤耦合器(4)依次连接，第一半导体激光二极管(1)与第一波分复用器(2)连接以接入光路，光隔离器(5)、声光可调谐滤波器(6)和第二光纤耦合器(7)连接成环路；

高速扫频斯托克斯脉冲支路的输出的高速扫频斯托克斯脉冲经第三光纤耦合器(8)分成两路输出，其中一路输出传输至所述空间光合束器件组，另一路输出传输至环形腔，第三光纤耦合器(8)的输入端与第一光纤耦合器(4)的输出端连接；

所述环形腔包括第二半导体激光二极管(32)以及连成环路的第二波分复用器(9)、第二增益光纤(10)和光学集成元件(11)，环形腔的输出从光学集成元件(11)处输出，高速扫频斯托克斯脉冲支路中的另一路输出传输至的第二波分复用器(9)，环形腔的输出光经过啁啾脉冲放大电路放大后，输出为两路，分别为固定波长斯托克斯光支路和倍频泵浦光支路，其中，固定波长斯托克斯光支路通过第四光纤耦合器(30)后经第三光纤准直器(18)传输至空间光合束器件组；倍频泵浦光支路通过第四光纤耦合器(30)输入至倍频模块进行倍频处理后输出到空间光合束器件组。

3.根据权利要求2所述的基于三光束自同步高速扫频光纤激光拉曼扫描成像系统，其特征在于：所述倍频模块包括依次设置的第五光纤准直器(31)、第二半波片(34)、第二四分之一波片(33)、第三透镜(37)、倍频晶体(36)、第四透镜(38)和第三半波片(35)。

4.根据权利要求2所述的基于三光束自同步高速扫频光纤激光拉曼扫描成像系统，其特征在于：所述啁啾脉冲放大电路包括依次设置的单模无源光纤(12)、第一掺铒光纤放大器(13)、光纤脉冲强度调制器(14)、第二掺铒光纤放大器(15)、第一光纤准直器(16)、第一反射镜(23)、第二光纤准直器(17)和第四光纤耦合器(30)，所述单模无源光纤(12)接入环形腔的输出，并通过所述第四光纤耦合器(30)将输出分为所述固定波长斯托克斯光支路和所述倍频泵浦光支路；

且在所述第一光纤准直器(16)和所述第一反射镜(23)之间还设置有用于实现脉冲压缩的脉冲压缩空间光器件组。

5.根据权利要求4所述的基于三光束自同步高速扫频光纤激光拉曼扫描成像系统，其特征在于：所述脉冲压缩空间光器件组包括第一半波片(20)、第一四分之一波片(21)、偏振分光晶体(22)、第一光栅(24)、第一透镜(25)、第二透镜(27)、第二光栅(28)、可调狭缝(26)、第四半波片(29)和第二反射镜(44)，第一半波片(20)、第一四分之一波片(21)、偏振分光晶体(22)依次设置，所述第一光纤准直器(16)出射的脉冲激光通入所述第一半波片(20)，偏振分光晶体(22)将光出射至所述第一反射镜(23)，第一光栅(24)、第二透镜(27)、可调狭缝(26)、第一透镜(25)、第二光栅(28)、第四半波片(29)和第二反射镜(44)依次设置，且第一光栅(24)靠近偏振分光晶体(22)设置。

6.根据权利要求2所述的基于三光束自同步高速扫频光纤激光拉曼扫描成像系统，其特征在于：所述空间光合束器件组包括第三光纤准直器(18)、第四光纤准直器(19)和三光束合束模块，所述三光束合束模块包括第三反射镜(40)、第一二向色镜(41)和第二二向色镜(42)，

高速扫频斯托克斯脉冲经第三光纤耦合器(8)分出的其中一路输出通过所述第三光纤准直器(18)出射到第二二向色镜(42)，

倍频模块倍频处理后输出的倍频泵浦光经第三反射镜(40)反射后出射至第一二向色镜(41)，与第三光纤准直器(18)出射至第一二向色镜(41)的固定波长斯托克斯光在第一二向色镜(41)上进行合束，合束后的光出射至第二二向色镜(42)并在第二二向色镜(42)中与所述高速扫频斯托克斯脉冲进行合束。

7.根据权利要求1所述的基于三光束自同步高速扫频光纤激光拉曼扫描成像系统，其特征在于：所述信号收集放大和处理模块包括用于过滤样品激发的瑞利散射及其他信号的滤波片、用于放大光信号的光电倍增管、引入激光器参考脉冲的锁相放大副器以及用于探测光信号并将其转化为电信号的光电探测器。

8.根据权利要求1-7任一所述的基于三光束自同步高速扫频光纤激光拉曼扫描成像系统，其特征在于：所述计算与图像处理模块包数据采集卡、传输模块和计算与图像处理系统，所述数据采集卡用于接收所述信号收集放大和处理模块输出的电信号，所述传输模块用于连接采集卡和计算机，所述计算与图像处理系统包括计算机及图像处理软件，用于处理数据并转化为图像。

9.一种如权利要求1-8任一所述三光束自同步高速扫频光纤激光拉曼扫描成像系统的扫描方法，其特征在于，包括：

S1、由三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光源输出包含较宽频谱范围的三束脉冲，输入空间光合束器件组中；

S2、空间光合束器件组将所述三束脉冲合束；

S3、利用基于xy振镜的扫描模块将调制后的脉冲对样品进行扫描，同时激发多种拉曼共振信号；

S4、利用信号收集放大和处理模块中的滤波片过滤入射脉冲及其他信号，在光电倍增器放大信号后，光电探测器收集拉曼共振信号并转化为电信号；

S5、计算与图像处理模块中的数据采集卡收集所述电信号，并传输至图像处理软件进行处理，将电信号转化为图像。

10.将权利要求1-8任一所述一种基于三光束自同步高速扫频脉冲光纤激光器的相干拉曼显微成像系统应用在生物材料无损检测中或细胞生物样品无标记检测中。

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