JP2006195240A - 断層画像化装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】生体組織や生体細胞等の試料の光断層画像と蛍光断層画像とを同時に取得する。
【解決手段】光源ユニット2が蛍光色素を励起する低コヒーレンス光からなるレーザ光を射出し、このレーザ光Lを光分割手段3が測定光L1と参照光L2とに分割する。周波数変調手段6が参照光L2と反射光L3との間に僅かな周波数差を与えた後、合波手段5が反射光L3と参照光L2とを合波する。干渉光検出手段7が反射光L3と参照光L2とが合波されたときの干渉光L5を検出するとともに、蛍光検出手段8が試料Sの蛍光色素が励起されることにより射出された蛍光L4を検出する。そして、画像生成手段9が干渉光検出手段7により検出された干渉光L5から試料の光断層画像を生成するとともに、蛍光検出手段8により検出された蛍光L4から試料Sの蛍光断層画像を生成する。
【選択図】図1
【解決手段】光源ユニット2が蛍光色素を励起する低コヒーレンス光からなるレーザ光を射出し、このレーザ光Lを光分割手段3が測定光L1と参照光L2とに分割する。周波数変調手段6が参照光L2と反射光L3との間に僅かな周波数差を与えた後、合波手段5が反射光L3と参照光L2とを合波する。干渉光検出手段7が反射光L3と参照光L2とが合波されたときの干渉光L5を検出するとともに、蛍光検出手段8が試料Sの蛍光色素が励起されることにより射出された蛍光L4を検出する。そして、画像生成手段9が干渉光検出手段7により検出された干渉光L5から試料の光断層画像を生成するとともに、蛍光検出手段8により検出された蛍光L4から試料Sの蛍光断層画像を生成する。
【選択図】図1
Description
本発明は、たとえば生体組織や細胞等からなる試料の断層画像を取得する断層画像化装置に関するものである。
生体組織の観察においては生体組織の細胞の形態を観察する形態観察と、生体組織の細胞を構成する物質を観察する物質観察とが行われる。生体組織、特に生体細胞の形態観察および物質観察を行う方法として、生体組織の細胞を蛍光色素等により染色してコントラストを確保した後に光学顕微鏡で観察する方法が知られている。(たとえば特許文献1参照。)蛍光色素等により染色を行うのは、生物の細胞や生体組織の多くは無色透明であり細胞内外の屈折率が僅かであるためコントラストがつかず観察が難しいからである。ここで、形態観察を行うための蛍光色素と物質観察を行うための蛍光色素とは異なる種類のものが使用されており、異なる蛍光波長からなる複数の蛍光を検出することにより形態観察と物質観察とが行われる。
また、生体組織の形態観察を行うときには、上述した光学顕微鏡を用いる方法の他に位相差顕微鏡を用いる場合がある。(たとえば特許文献2参照。)この位相差顕微鏡は、光の回折、干渉という2つの性質を利用し、明暗のコントラストにより無色透明な標本を可視化する観察方法であって、標本への染色が不要であるという特徴を有している。
特開2004−70371号公報
特開2001−311875号公報
しかし、特許文献1のように複数の蛍光色素を用いて光学顕微鏡により観察を行った場合、形態観察のための蛍光色素と物質観察のための蛍光色素の双方から検出される蛍光もしくは反射像が混在することになるため、形態観察を行うための蛍光と物質の観察を行うための蛍光とが識別しづらいという問題がある。また、光学顕微鏡を用いるときには観察時に観察試料の薄片標本を作成して観察が行われるが、多細胞系や組織系の試料は光散乱が大きいため、光学顕微鏡では鮮明な画像の取得は困難であるという問題がある。
また、特許文献2のように、位相差顕微鏡を用いた場合、形態観察は行うことができるが、物質観察は試料を蛍光色素等により染色し光学顕微鏡を用いて行う必要がある。つまり、無染色の生体組織を位相差顕微鏡により形態観察した後、生体組織を蛍光色素等を用いて染色し、位相差顕微鏡により観察した部位と同一の部位を光学顕微鏡により観察しなければならない。したがって、形態観察と物質観察とを行うのに手間が掛かってしまうとともに、位相差顕微鏡により観察したときの生体組織の空間的座標と光学顕微鏡により観察したときの生体組織の空間的座標とを一致させるのが困難であるという問題がある。
そこで、本発明は、試料の鮮明な光断層画像と蛍光断層画像とを同時に取得することができる断層画像化装置を提供することを目的とするものである。
本発明の断層画像化装置は、蛍光色素を有する試料の断層画像を取得する断層画像化装置であって、蛍光色素を励起する低コヒーレンス光からなるレーザ光を射出する光源ユニットと、光源ユニットから射出されたレーザ光を測定光と参照光とに分光する光分割手段と、光分割手段により分光された参照光と、測定光が試料に照射されたときの試料からの反射光との間に僅かな周波数差を与える周波数変調手段と、周波数変調手段により僅かな周波数差が与えられた反射光と参照光とを合波する合波手段と、合波手段において反射光と参照光とが合波されたときの干渉光を検出する干渉光検出手段と、測定光が試料に照射されたときに、試料の蛍光色素が励起されることにより射出された蛍光を検出する蛍光検出手段と、干渉光検出手段により検出された干渉光から試料の光断層画像を生成するとともに、蛍光検出手段により検出された蛍光から試料の蛍光断層画像を生成する画像生成手段とを有することを特徴とするものである。
ここで、周波数変調手段は、参照光と反射光との間に僅かな周波数差を与えるものであれば、参照光に対し周波数シフトを行ってもよいし、反射光に対し周波数シフトを行うものであってもよい。ここで、「僅かに周波数シフトさせる」とは、参照光と反射光とが合波されたときに、参照光と反射光との差周波数で強弱を繰り返すビート信号が生じるような周波数のシフトを意味する。
また、試料は蛍光色素を有するものであればよく、蛍光色素により染色されているものであってもよいし、自己蛍光特性を有する細胞等を有する試料であってもよい。試料が蛍光色素により染色されている場合、蛍光色素は1光子励起蛍光色素であってもよいし、2光子励起蛍光色素であってもよい。
さらに、光源ユニットは、試料の蛍光色素を励起する低コヒーレンス光からなるレーザ光を射出するものであればよく、このレーザ光が超短パルスレーザ光であってもよい。
ここで、「超短パルスレーザ光」とは、ピコ秒の単位が用いられる時間領域以下のパルス光を意味し、好ましくはフェムト秒(fs)のパルス光をいう。
この超短パルスレーザ光を射出する光源ユニットは、超短パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、レーザ光源から射出された超短パルスレーザ光が入射される、負分散特性を有する光ファイバとを備えたものであってもよいし、超短パルスレーザ光を射出する固体レーザからなるものであってもよい。
ここで、「負分散特性」とは、波長が長くなると波長分散(ps/nm/km)の値が小さくなることを意味し、この負分散特性を有する光ファイバにパルス光が入射されたとき、光ファイバ内においてパルス幅が圧縮され、このパルス幅が圧縮されたパルスレーザ光は、低コヒーレンス光として射出されるようになっている。上記負分散特性を有するファイバとして零分散ファイバあるいはフォトニッククリスタルファイバを用いることができる。
なお、光源ユニットから射出されるレーザ光の波長は、試料に含まれる蛍光色素の励起波長に合わせて適宜選択されるものであるが、近赤外域の波長からなるレーザ光であることが好ましい。ここで、「近赤外域」とは、750nm〜2500nmまでの波長帯域をいう。
さらに、断層画像化装置は、試料中に測定光の複数の集束部分を形成するマイクロレンズアレイを備えたものであってもよい。このとき、合波手段は、複数の集束部分から反射した複数の反射光と参照光とをそれぞれ合波するようになっている。また、蛍光検出手段は、複数の集束部分おいて発生した蛍光をそれぞれ検出するものであり、干渉光検出手段は、複数の反射光と複数の参照光とが干渉したときの干渉光をそれぞれ検出するようになっている。
本発明の画像取得装置によれば、蛍光色素を有する試料の断層画像を取得する際に、画像生成手段が干渉光検出手段により検出された干渉光から試料の光断層画像を生成するとともに、蛍光検出手段により検出された蛍光から試料の蛍光断層画像を生成することにより、試料の形態観察を行うための光断層画像と試料の物質観察を行うための蛍光断層画像とを同時に取得することができるため、試料の効率的な形態観察および物質観察を行うことができる。
また、従来のように光学顕微鏡を用いずに形態観察を行うことができるため、光散乱が大きい多細胞系や組織系の試料であっても、形態観察のための鮮明な光断層画像を取得することができ、試料のin vivo観察を行うことができる。
さらに、光断層画像と蛍光断層画像とを同時に取得することにより、光断層画像と蛍光断層画像との空間的座標関係は常に一致させることができるため、高精度な生体組織の分析を行うことができる。
なお、蛍光色素が、2光子励起蛍光色素からなるものであれば、試料深部の測定を行うときに、試料の深部のみについての蛍光の励起が可能となり、試料深部の鮮明な蛍光断層画像を取得することができる。
また、光源ユニットが、超短パルスレーザ光を射出するモード同期ファイバレーザもしくはモード同期半導体レーザからなるレーザ光源と、レーザ光源が射出した超短パルスレーザ光を伝搬させる、超短パルスレーザ光の波長帯域において負分散特性を有する光ファイバとを有し、光ファイバから低コヒーレンス光からなるレーザ光が射出される構成であれば、高分解能な光断層画像を取得することができるようになる。特に、蛍光色素が2光子励起蛍光色素の場合、光源ユニットから射出されるレーザ光のパルス幅が狭くなっているため、蛍光色素を励起するレーザ強度を確保することができ、鮮明な蛍光断層画像を取得することができる。
さらに、光源ユニットが、近赤外域の波長からなるレーザ光を射出するものであれば、試料に対するレーザ光の透過性を向上させることができるため、たとえば多細胞系や組織系の試料に対しても試料内における散乱の影響を受けずに細胞レベルの高分解能な光断層画像を取得することができる。また、蛍光検出においても、試料に対するレーザ光の透過性を向上させることにより、試料の深部のみについての蛍光の励起が可能となり、試料深部の鮮明な蛍光断層画像を取得することができる。
さらに、試料中に測定光の複数の集束部分を形成するマイクロレンズアレイを備え、合波手段が、複数の集束部分から反射した複数の反射光と参照光とをそれぞれ合波するものであり、蛍光検出手段が、複数の集束部分おいて発生した複数の蛍光を検出するものであり、干渉光検出手段が、複数の反射光と複数の参照光とがそれぞれ干渉したときの複数の干渉光を検出する構成であれば、試料の複数の部位に測定光を同時に走査しながら照射することが可能となるため、試料がたとえば短時間に状態が変化するような生体細胞の観察を精度よく行うことができる。
以下、図面を参照して本発明の断層画像化装置の実施の形態を詳細に説明する。図1は本発明の断層画像化装置の第1の実施の形態を示す構成図である。断層画像化装置1は、OCT(Optical Coherence Tomography)計測による光断層画像と、蛍光検出による蛍光断層画像とを同時に取得する断層画像化装置であって、レーザ光を射出する光源ユニット2と、光源ユニット2から射出されたレーザ光Lを試料Sに照射する測定光L1と参照光L2とに分光する光分割手段3と、参照光L2と反射光L3との間に僅かな周波数差を与える周波数変調手段6と、反射光L3と参照光L2とを合波する合波手段5と、合波手段5において反射光L3と参照光L2とが合波されたときの干渉光L5を検出する干渉光検出手段7と、測定光L1が試料Sに照射されたときに、試料Sの蛍光色素が励起されることにより射出された蛍光を検出する蛍光検出手段8と、干渉光検出手段7により検出された干渉光L5から試料Sの光断層画像を生成するとともに、蛍光検出手段8により検出された蛍光L4から試料Sの蛍光断層画像を生成する画像生成手段9とを有する。
ここで、光源ユニット2は、たとえばスーパーコンティニウム(Supercontinuum)光源からなっており、図2に示すように、超短パルスレーザ光L0を射出するレーザ光源2aと、レーザ光源2aから射出された超短パルスレーザ光L0がレンズ2bを介して入射される、負分散特性を有する光ファイバ2cとを有し、光ファイバ2cから射出された超短パルスレーザ光がコリメートレンズ2dを介して光分割手段3に射出されるようになっている。
レーザ光源2aは、たとえばエルビウム(Er)ドープファイバーレーザーとEr光増幅器とを有するモード同期ファイバレーザからなっており、たとえばパルス幅145fs、中心波長1.555μm、スペクトル幅約18nmの低コヒーレント光を射出するものである。なお、このモード同期ファイバリングレーザーの構成および動作原理の詳細は、「レーザ研究第27巻11号 p756−761、モード同期ファイバリングレーザー、中沢 正隆他著、1999年11月」に記載されている。
光ファイバ2cは、たとえば図3(a)に示すような波長1.56μm前後において負分散特性を有している。ここで、超短パルスレーザ光L0が光ファイバ2c内を伝搬するときパルス幅が圧縮するとともにスペクトル幅が広がる。具体的には、図3(b)に示すように、パルス幅がfsオーダーとなる超短パルスレーザ光L0では自己位相変調効果により、パルス時間波形中の長波長成分が先に進み短波長成分が後になる。このような超短パルスレーザ光を負分散特性を有する光ファイバ2c内において伝搬させたとき、パルス幅が圧縮される。たとえば超短パルスレーザ光L0が、上述のように、パルス幅145fs、中心波長1.555μm、スペクトル幅約18nmの低コヒーレント光である場合、図3(c)に示すように、パルス幅約10fs、スペクトル幅約800nmの広スペクトル帯域で近赤外域のレーザ光Lとして出力されるようになっている。
このように、負分散特性を有する光ファイバ2c内にレーザ光源2aから射出したパルス光を伝搬させることにより、パルス幅を圧縮してコヒーレント長を短くすることができるため、高い分解能により光断層画像を取得することができる。
なお、光源ユニット2として上述した構成の他に、レーザ光源2aが中心波長795nm、スペクトル帯域700nm〜1000nmのTi:Al2O3レーザからなり、光ファイバ2cが、図4(a)に示すような波長800nm前後において負分散特性を有するPCF(Photonic crystal fiber)からなるものであってもよい。このとき、光ファイバ2cから射出されるレーザ光Lは、図4(b)に示すような広スペクトル帯域な近赤外域のレーザ光Lとして光分割手段3に射出されるようになる。
さらに、負分散特性を有する光ファイバ2cとの組み合わせにおいて使用されるレーザ光源2aとして、たとえば800nm〜1300nmの近赤外域の波長からなるピコ秒〜サブピコ秒の短パルスレーザを射出するものであって、図5に示すようなCr:LiSrAlF6レーザ、Cr:LiCaAlF6レーザ、Cr:Mg6SO4レーザ、Cr:YAGレーザ、Yb:YAGレーザ等を用いることができる。
なお、上述のようにレーザ光源2aと光ファイバ2cとを組み合わせた光源ユニット2について例示しているが、レーザ光源2aから射出されたレーザ光を直接光分割手段3に入射するものであってもよい。具体的には、図5に示される固体レーザのうち、Cr:LiSrAlF6レーザ、Cr:LiSrAlF6レーザ、Cr:LiCaAlF6レーザ、Yb:YAGレーザから直接レーザ光Lを光分割手段3に射出するようにしてもよい。さらに、光源ユニット2として「レーザ研究第27巻11号 p735−743、モード同期技術の基礎、張 吉男著、1999年11月」、「レーザ研究第27巻11号 p744−749、極短パルスモード同期固体レーザ、鳥塚 健二著、1999年11月」に開示されているものを用いるようにしてもよい。
図1の光分割手段3はたとえばビームスプリッタからなっており、光源ユニット2から射出されたレーザ光Lの一部を透過させ、測定光L1として試料Sに照射させるようになっている。同時に、光源ユニット2から射出されたレーザ光Lの一部を反射させ、参照光L2として周波数変調手段6に入射させるようになっている。なお、このビームスプリッタは合波手段5としても機能するものであって、後述する反射光L3と参照光L2とを合波するようになっている。
周波数変調手段6は、参照光L2に対し周波数シフトを行うことにより参照光L2と反射光L3との間に僅かな周波数差を与えるものであって、光分割手段3により分光された参照光L2を合波手段5に反射する参照ミラー6aと、参照ミラー6aを参照光L2の光軸に直交する方向(矢印Y方向)に移動させるミラー駆動手段6bとを備えている。そして、ミラー駆動手段6bが参照ミラー6aの移動させたときに参照光L2に時間的な遅延が生じ、参照光L2の周波数がドップラーシフトにより僅かに変動する。よって、この周波数シフトした参照光L2が合波手段5に入射されるようになっている。なお、このミラー駆動手段6bの動作は駆動制御手段20により制御されている。
光分割手段3と試料Sの間には集光レンズ4が配置されており、光分割手段3により分光された測定光L1は、集光レンズ4により集束して試料Sに照射されるようになっている。ここで、試料Sは、図6に示すように、たとえば走査ステージ10上に載置されているものであって、ステージ駆動手段11により矢印X方向、Y方向およびZ方向に移動可能に保持されている。図1のステージ駆動手段11は駆動制御手段20により制御されており、駆動制御手段20は、光分割手段3から参照ミラー6aまでの距離と光分割手段3から集光レンズ4の焦点位置までの距離とが等しくなるように、ミラー駆動手段6bおよびステージ駆動手段11を制御するようになっている。これにより、合波手段5において参照光L2と反射光L3とが干渉し干渉光検出手段7において、参照光L2と反射光L3の差周波数で強弱を繰り返すビート信号が検出されるようになる。
なお、図6において、走査ステージ10が矢印Z方向に移動することにより、試料S中の焦点位置を移動させるようにしているが、集光レンズ4を矢印Z方向に移動させることにより、試料S中の焦点位置を移動させるようにしてもよい。
合波手段5は、光分割手段3としても機能するビームスプリッタからなり、周波数変調手段6により周波数シフトされた参照光L2と試料Sからの反射光L3とを合波しミラー12b側に射出するようになっている。同時に、合波手段5は、試料Sから射出された蛍光をダイクロイックミラー12a側に反射させるようになっている。
干渉光検出手段7は、たとえばヘテロダイン干渉計等からなっており、干渉光L5の光強度を検出するようになっている。具体的には、光分割手段3から参照ミラー6aまでの光路長と、光分割手段3から集光レンズ4の焦点位置までの光路長が等しいときに、参照光L2と反射光L3との周波数差で強弱を繰り返すビート信号が発生する。干渉光検出手段7は発生したビート信号の強度を検出するようになっている。
蛍光検出手段8は、たとえばCCDカメラ等の撮影手段からなっており、合波手段5からダイクロイックミラー12aおよび反射光カットフィルター8aを介して入射される蛍光の光強度を検出するものである。なお、蛍光検出手段8は特定の波長帯域の蛍光のみ検出するものであってもよいし、複数の波長帯域の蛍光を波長帯域毎に検出するものであってもよい。
画像生成手段9は、干渉光検出手段7により検出された干渉光L5から光断層画像を取得するとともに、蛍光検出手段8により検出された蛍光L4から蛍光断層画像を取得するものである。さらに、画像生成手段9は、取得した断層光断層画像と断層蛍光断層画像と表示部50に表示させる機能を有している。
ここで、試料Sが有する蛍光色素について詳しく説明する。試料Sが蛍光色素により染色されたものであってもよいし、自己蛍光特性を有する細胞等を有するものであってもよいが、試料が蛍光色素により染色されている場合、蛍光色素は2光子励起蛍光色素であることが好ましい。2光子励起蛍光色素を用いたときには集光レンズ4により集光された測定光L1の集束部分のみから蛍光を発光するようになる。なお、2光子励起過程についての詳細な原理については、「レーザ研究第27巻11号 p744−749、多光子顕微鏡による半導体材料内部欠陥の3次元観察、河田 善正著、2003年6月」に記載されている。
すなわち、図7(a)に示すように、2光子励起蛍光色素は、波長λ2の2つのフォトンを同時に吸収し基底状態の電子が励起される。2光子励起過程の発生効率は光強度分布の2乗に比例するため、図7(b)に示すように、光強度の大きな測定光L1の集束部分(ビームウエスト)BW近傍のみで蛍光L4が発生し、集束部分BW以外ではほとんど2光子励起過程が生じない。このため、試料Sの深部に測定光L1を集束させたときであっても測定光L1が吸収されることがなく、試料Sの深い(矢印Z方向)部分における蛍光をも検出することができる。
一方、1光子励起蛍光色素は、図8(a)に示すように、基底状態にある電子が励起エネルギーに対応する波長λ1のフォトンを1つ吸収し励起状態になる。なお、上述した1光子励起蛍光色素と2光子励起蛍光色素との電子の励起準位が同じ場合、2光子過程の励起光の波長λ2は1光子過程の励起光の波長λ1の倍になる(λ2=2λ1)。したがって、図8(b)に示すように、光強度の大きなレーザ光の集束部分BWのみならず、その集束部分BWの近傍においても発光してしまう。
生体試料では各種内在色素などは可視光を吸収し蛍光等を発するものが多いため、1光子励起過程に用いられる励起光(可視光)自体が生体組織で強く散乱されること、および図8(b)のように1光子過程の蛍光発光のためにレーザ光伝搬領域全体から蛍光が発生すること等により、1光子励起蛍光色素を用いたときには試料深部の観察は困難である。一方、2光子励起蛍光色素の場合、1光子励起過程で用いられる励起光(可視光)の波長λ1に対して2倍の波長λ2となるような、たとえば800nm〜1300nmの近赤外域の励起光が用いられるため、生体組織に対する透過性がよくなり、試料深部への限局した光励起が可能となる。
さらに、図2から図5に示すような近赤外域の広帯域な超短パルスレーザ光を射出する光源ユニット2を用いることにより、高分解能な光断層画像の取得と鮮明な蛍光断層画像の取得を同時に行うことができる。
まず、光源ユニット2と光断層画像との関係について説明する。試料Sの光断層画像を取得する際に、光軸方向の分解能は光源のコヒーレンス長が規律となる。このため、より高い分解能を得るためには、広いスペクトル帯域の光源が有効である。一方、横方向の分解能は光スポットの大きさで決まるため、空間コヒーレンスの高い光源が必要となる。すなわち、面内分解能と光軸方向分解能とを両立させるためには、空間コヒーレンスが高く、時間コヒーレンスの低い(スペクトル帯域の広い)光源が必要となる。このとき、上述した光源ユニット2から射出される超短パルスレーザ光はこの相反する要求を満たすことができる。よって、広いスペクトル帯域であって近赤外域の超短パルスレーザ光を射出する光源ユニット2を用いることにより、高分解能な光断層画像を取得することができる。
次に、光源ユニット2と蛍光断層画像との関係について説明する。蛍光断層画像を取得する際に、2光子過程を効率的に発生させるためには、光強度を強くすることが求められ、空間軸(光の集光)と時間軸の集中化(短パルス化)とは有効である。よって、蛍光色素が2光子励起蛍光色素であるときに、光源ユニット2が超短パルス・広スペクトル帯域のレーザ光Lを射出するものであれば、鮮明な蛍光断層画像を取得することができる。
このように、近赤外域の広帯域な超短パルスレーザ光を射出する光源ユニット2を用いることにより、高分解能な光断層画像の取得と鮮明な蛍光断層画像の取得を同時に行うことができる。
なお、2光子励起蛍光色素の種類は、試料Sにおける観察したい物質に予め蛍光試薬を結合させ、あるいは環境(たとえばpHなどのイオン濃度)変化に対し蛍光特性が変化するように選択される。特に、2光子励起蛍光色素として2光子励起効率の高いものを用いることが好ましい。具体的には、2光子励起蛍光色素の2光子吸収断面積が102GM(1GM=1×10-50cm4 s molecule−1 photon−1)以上であることが好ましく、たとえば文献He,G.S.et al.,Appl. Phys. Lett.1995,67,3703、文献He,G.S.et al.,Appl. Phys.Lett.1995,67,2433、文献He,G.S.et al.,Appl.Phys.Lett.1996,68,3549、文献He,G.S.et al.,Appl. Phys.Lett.1997,81,2529等に記載されているスチルバゾリウム誘電体、特開2003−20469号公報の3−9頁に記載された化合物、特開2003−183213号公報の5−17頁に記載された化合物、特開2004−123668号公報の8−11頁に記載された化合物等が用いられる。特に、特開2003−20469号公報、特開2003−183213号公報、特開2004−123668号公報に記載された2光子吸収化合物を用いることが好ましい。
上述した化合物には生体分子と共有結合、イオン結合または配位結合しうる反応性置換基を導入することが望ましい。反応性置換基としては、たとえばサクシンイミジルエステル基、ハロゲン置換トリアジニル基、ハロゲン置換ピリミジニル基、スルホニルハライド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル基、アジリジニル基などが挙げられる。またスルホン酸基およびその塩、カルボキシル基およびその塩、水酸基、ポリエーテル基等の推算性基を導入しておくことが望ましい。このとき、反応性基および水溶性基の導入は公知の方法により行われる。
このような外因性材料に2光子励起効率の高いものを用いることにより、従来観察が困難であった散乱の大きい多細胞系や組織系での細胞機能の画像化を実現することができる。つまり、試料Sの蛍光検出は、観察したい物質に予め蛍光試料を結合させ、あるいは環境変化(たとえばpHなどのイオン濃度等)に対し蛍光特性が変化する試薬を用いることにより、生体細胞、組織の機能情報をとらえることにより行われる。よって、このような外因性材料に2光子励起効率の高いものを用いることにより、従来観察が困難であった散乱の大きい多細胞系や組織系での細胞機能の画像化を実現することができる。
次に、図1から図8を参照して本発明の断層画像化装置1の動作例ついて説明する。まず、光源ユニット2において、レーザ光源2aから射出された超短パルスレーザ光L0が光ファイバ2cにおいてパルス圧縮され、このパルス圧縮されたレーザ光Lがコリメートレンズ2dを介して光分割手段3に射出される(図2参照)。その後、レーザ光Lは光分割手段3により、試料Sに照射される測定光L1と周波数変調手段6に入射される参照光L2とに分光される。
分光された測定光L1が集光レンズ4を介して試料Sに照射されたとき、測定光L1が試料において反射したときの反射光L3と、測定光L1により試料Sの蛍光色素が励起されたことによる蛍光L4とが試料から射出し、集光レンズ4を介して合波手段5に入射される。一方、参照光L2は周波数変調手段6において周波数シフトが施された後、合波手段5に入射される。
合波手段5において参照光L2と反射光L3とが合波し、参照光L2と反射光L3との干渉光L5がダイクロイックミラー12a、ミラー12bを介して干渉光検出手段7に入射される。一方、蛍光L4はダイクロイックミラー12aにおいて反射し蛍光検出手段8に入射される。そして、画像生成手段9において、干渉光検出手段7により検出された干渉光L5から光断層画像が生成するとともに、蛍光検出手段8により検出された蛍光から蛍光断層画像が生成される。
ここで、試料Sへの測定光L1の照射は試料Sを移動させながら行われるものであり、測定光L1が照射された試料Sの各部位における干渉光L5および蛍光L4が、それぞれ干渉光検出手段7および蛍光検出手段8により検出される。そして、試料Sの各部位における干渉光L5および蛍光L4から光断層画像および蛍光断層画像が生成される。
図9は多細胞系もしくは生体組織系からなる試料Sの1細胞のXZ断層画像を取得する際に測定光L1を照射したときの様子を示す模式図、図10は図9の測定光L1の走査により検出されるビート信号の一例を示すグラフ図、図11は図9の測定光L1の走査により検出される蛍光を示すグラフ図であり、図9から図11を参照して画像生成手段9について具体的に説明する。なお、図9において試料Sの細胞膜S1が2光子励起蛍光色素により染色されているものとする。
試料Sの細胞膜S1上(X=XL、Z=Za)に測定光L1の集束部分が位置したとき、細胞膜S1は屈折率の境界部分であるため反射光L3が発生する。すると、干渉光検出手段7において図10(a)に示すような強度のビート信号が検出される。なお、図10(a)において、核S2(Z=Zb、Zc)および細胞膜S1(Z=Zd)においても反射光L3が発生するが、参照ミラー6aの位置による光路長の違いにより細胞膜S1(Z=Za)からの反射光L3が一番強いものとなっている。
また、細胞膜S1は2光子励起蛍光色素により染色されているため、測定光L1の集束部分が位置したとき蛍光が射出する。そして、図11に示すように、蛍光検出手段8においてZ=Zaにおける蛍光の光強度が検出される。
次に、測定光L1の集束部分が矢印Z1方向に移動していき、試料Sの核S2の部分(Z=Zb)に位置したとき、核S2の外周は屈折率の境界部分であるため反射光L3が発生し、干渉光検出手段7において図10(b)に示すような強度のビート信号が取得される。一方、核S2は2光子励起蛍光色素により染色されていないため、蛍光L4は検出されない(図11参照)。
さらに、測定光L1の集束部分BWが矢印Z1方向に移動していき、試料Sの核S2の外周部分(Z=Zc)に位置したとき、干渉光検出手段7において、図10(c)に示すようなビート信号が検出される。一方、核S2は2光子励起蛍光色素により染色されていないため、蛍光L4は検出されない(図11参照)。
測定光L1の集束部分BWが矢印Z1方向に移動していき、試料Sの細胞膜S1の部分(Z=Zd)に位置したとき、干渉光検出手段7において、図10(d)に示すようなビート信号が検出される。また、細胞膜S1は2光子励起蛍光色素により染色されているため蛍光L4が射出し、蛍光検出手段8において蛍光L4が検出される(図11参照)。
そして、画像生成手段9において、図10(E)に示すように、干渉光検出手段7において検出されたビート信号強度を加算平均し、X=XL上を矢印Z方向に集束部分BWを走査させたときのビート信号の強度が算出される。
上述のような測定光L1の集束部分を矢印Z方向に移動させたときの蛍光L4および干渉光L5の検出が試料Sを矢印X方向に移動させながら行われる。すると、画像生成手段9において、測定光L1の集束部分BWのX座標およびZ座標と、干渉光検出手段7において検出された干渉光L5の光強度とが取得され、図12(a)に示すようなXZ平面における光断層画像が生成される。同時に、画像生成手段9において、測定光L1の集束部分BWのX座標およびZ座標と、蛍光検出手段8において検出された蛍光L4の光強度とから図12(b)に示すようなXZ平面における蛍光断層画像が生成される。
そして、画像生成手段9により、図12(a)、(b)のように断層光断層画像と断層蛍光断層画像とが並べて表示部50に表示され、もしくは図12(c)に示すように、断層光断層画像と断層蛍光断層画像とを重ねて表示される。
このように、試料Sの形態観察を行うための光断層画像と試料の物質観察を行うための蛍光断層画像とを同時に取得することができるため、試料Sの効率的な形態観察および物質観察を行うことができる。また、従来のように光学顕微鏡を用いずに形態観察を行うことができるため、光散乱が大きい多細胞系や組織系の試料であっても、形態観察のための鮮明な光断層画像を取得することができ、試料のin vivo観察を行うことができる。さらに、光断層画像と蛍光断層画像とを同時に取得することにより、光断層画像と蛍光断層画像との空間的座標関係は常に一致させることができるため、高精度な生体組織の分析を行うことができる。
図13は本発明の断層画像化装置の別の実施の形態を示す模式図であり、図13を参照して断層画像化装置100について説明する。なお、図13の断層画像化装置100において、図1の断層画像化装置1と同一の構成を有する部位には同一の符号を付してその説明を省略する。図13の断層画像化装置100が、図1の断層画像化装置1と異なる点は、試料Sに測定光L1を照射する際にいわゆるマルチビーム走査を行う点である。なお、マルチビーム走査方式については「レーザ研究第31巻6号 p371−374、リアルタイム非線形光学顕微鏡の開発と生物細胞の動的観察、中村 收 他著、2003年6月」および特開2000−193889号公報に開示されている。
具体的には、試料S上への測定光L1の集光がマイクロレンズアレイディスク140により行われるものであって、マイクロレンズアレイディスク140は、複数の集光レンズ140a、140b、140cがアレイ状に配列された構造を有している。また、マイクロレンズアレイディスク140は、回転制御部141により回転可能に設けられており、マイクロレンズアレイディスク140が回転することにより、測定光L1の集束部分が試料S内を走査するようになっている。なお、複数の集光レンズ140a〜140cに対し測定光L1を入射するため、光分割手段3により分光された測定光L1は、ミラー101により反射され、測定光L1のビーム径を広げる拡大レンズ群110に入射され拡大された後、マイクロレンズアレイディスク140に入射されるようになっている。よって、試料S上には複数の集光レンズ140a〜140cにより測定光L1の複数の集束部分が形成されることになる。
マイクロレンズアレイ140を透過した複数の測定光L1は、リレーレンズ144、対物レンズ145を介して試料Sに照射される。すると、試料S中の測定光L1の複数の集束部分からそれぞれ反射光L3および蛍光L4が射出され、反射光L3は対物レンズ145、リレーレンズ144、ビームスプリッタ143およびコリメートレンズ146を介して合波手段(ビームスプリッタ)6に入射される。蛍光L4は、対物レンズ145、リレーレンズ144、ビームスプリッタ142および結像レンズ147を介して蛍光検出手段108に入射される。なお、蛍光検出手段108は、試料Sの複数の部位から射出された複数の蛍光L4を同時に検出する機能を有している。
一方、参照光L2はミラー102を介して周波数変調手段160に入射される。この周波数変調手段160は、回折格子161、フーリエ変換レンズ162、参照ミラー163等を備えており、参照ミラー163はミラー駆動手段164により揺動可能に設けられている。そして、参照光L2は回折格子161、フーリエ変換レンズ162を介して参照ミラー163に入射され、再びフーリエ変換レンズ162を介して回折格子161に入射された後、ミラー103側に射出される。このとき、参照ミラー163の角度によって回折格子161への参照光L2の入射位置が変わることにより、参照光L2の時間的な遅延が生じ、時間的な遅延によるドップラーシフトによる参照光L2の周波数シフトが行われるようになっている。
周波数変調手段160により周波数シフトされた参照光L2はビーム拡大機能およびダイナミックフォーカス機能を有するレンズ群120により拡大された後、合波手段5に入射される。そして、合波手段5において参照光L2と複数の反射光L3とがそれぞれ合波される。合波された参照光L2と複数の反射光L3との干渉光L5がビームスプリッタ155により光分割されて、レンズ150a、シャッター151aを介して干渉光検出手段107aに入射されるとともに、レンズ150b、シャッター151bを介して干渉光検出手段107bに入射される。
そして、干渉光検出手段107a、107aがこの干渉光L5の光強度を検出するようになっている。このとき、シャッター151a、151bを交互に開閉を行うことにより、干渉光検出手段107a、107bが交互に干渉光L5の検出を行うようにすることにより、測定光L2の走査速度に合わせた干渉光L5の検出を行うことができる。なお、干渉光検出手段107a、107bは、試料Sの複数の部位から射出された複数の蛍光L4を同時に検出するようになっている。
そして、画像生成手段9は、干渉光検出手段107a、107bおよび蛍光検出手段108において検出された干渉光L5および蛍光L4からそれぞれ光断層画像および蛍光断層画像を生成するようになっている。なお、上述した回転制御部141、ミラー駆動手段164は図13において図示しない駆動制御手段により制御されており、画像取得手段9この駆動制御手段から測定光L2が照射された試料Sの位置情報を取得するようになっている。
このようなマルチビーム走査方式の断層画像化装置100を用いることにより、試料Sに対し測定光L1を高速に走査することが可能となるため、試料Sがたとえば短時間に状態が変化するような生体細胞の観察を精度よく行うことができる。また、上述のような断層画像化装置100であっても、試料の形態観察を行うための光断層画像と試料の物質観察を行うための蛍光断層画像とを同時に取得することができるため、試料の効率的な形態観察および物質観察を行うことができる。
なお、本発明の実施の形態は上記実施の形態に限定されない。たとえば上記各実施の形態において、周波数変調手段は参照光に対し参照ミラーもしくは回折格子等を用いてドップラーシフトによる周波数変調を行うようにしているが、たとえば光学変調器等を用いて周波数シフトを行うようにしてもよい。さらに、周波数変調手段は参照光L2に対し周波数シフトを行うようにしているが、反射光L3に対し周波数シフトをするものであってもよい。具体的には、たとえば周波数変調手段が試料Sに振動を加えるものであって、試料Sの振動によりドップラーシフトによる周波数変調を行うようにしてもよい。
1、100 断層画像化装置
2 光源ユニット
2a レーザ光源
2c 光ファイバ
3 光分割手段
4 集光手段
5 合波手段
6 周波数変調手段
6a 参照ミラー
6b ミラー駆動手段
7 干渉光検出手段
8 蛍光検出手段
9 マイクロレンズアレイディスク
9 画像生成手段
10 走査ステージ
11 ステージ駆動手段
12a ダイクロイックミラー
12a ビームスプリッタ
12b ミラー
BW 集束部分
L0 超短パルスレーザ光
L レーザ光
L1 測定光
L2 参照光
L3 反射光
L4 蛍光
L5 干渉光
S 試料
2 光源ユニット
2a レーザ光源
2c 光ファイバ
3 光分割手段
4 集光手段
5 合波手段
6 周波数変調手段
6a 参照ミラー
6b ミラー駆動手段
7 干渉光検出手段
8 蛍光検出手段
9 マイクロレンズアレイディスク
9 画像生成手段
10 走査ステージ
11 ステージ駆動手段
12a ダイクロイックミラー
12a ビームスプリッタ
12b ミラー
BW 集束部分
L0 超短パルスレーザ光
L レーザ光
L1 測定光
L2 参照光
L3 反射光
L4 蛍光
L5 干渉光
S 試料
Claims (6)
- 蛍光色素を有する試料の断層画像を取得する断層画像化装置であって、
前記蛍光色素を励起する低コヒーレンス光からなるレーザ光を射出する光源ユニットと、
該光源ユニットから射出されたレーザ光を測定光と参照光とに分光する光分割手段と、
該光分割手段により分光された前記参照光と、前記測定光が前記試料に照射されたときの該試料からの反射光との間に僅かな周波数差を与える周波数変調手段と、
該周波数変調手段により僅かな周波数差が与えられた前記反射光と前記参照光とを合波する合波手段と、
該合波手段において前記反射光と前記参照光とが合波されたときの干渉光を検出する干渉光検出手段と、
前記測定光が前記試料に照射されたときに、該試料の前記蛍光色素が励起されることにより射出された蛍光を検出する蛍光検出手段と、
前記干渉光検出手段により検出された前記干渉光から前記試料の光断層画像を生成するとともに、前記蛍光検出手段により検出された蛍光から前記試料の蛍光断層画像を生成する画像生成手段と
を有することを特徴とする断層画像化装置。 - 前記蛍光色素が、2光子励起蛍光色素からなることを特徴とする請求項1に記載の断層画像化装置。
- 前記光源ユニットが、超短パルスレーザ光を射出するモード同期ファイバレーザもしくはモード同期半導体レーザからなるレーザ光源と、該レーザ光源が射出した前記超短パルスレーザ光を伝搬させる、該超短パルスレーザ光の波長帯域において負分散特性を有する光ファイバとを有し、該光ファイバから前記低コヒーレンス光からなるレーザ光が射出されるものであることを特徴とする請求項1または2に記載の断層画像化装置。
- 前記光源ユニットが、超短パルスレーザ光を射出する固体レーザからなるものであることを特徴とする請求項1から3のいずれか1項に記載の断層画像化装置。
- 前記光源ユニットが、近赤外域の波長からなる前記レーザ光を射出するものであることを特徴とする請求項1から4のいずれか1項に記載の断層画像化装置。
- 前記試料中に複数の集束部分を形成するように前記測定光を集光するマイクロレンズアレイを備え、前記合波手段が、前記測定光の前記複数の集束部分からそれぞれ反射した反射光と前記参照光とを合波するものであり、前記蛍光検出手段が、前記複数の集束部分おいて発生した複数の前記蛍光を検出するものであり、前記干渉光検出手段が、前記複数の反射光と前記複数の参照光とがそれぞれ干渉した複数の干渉光を検出するものであることを特徴とする請求項1から5のいずれか1項に記載の断層画像化装置。
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