JP2014126491A - 情報取得システム、情報取得装置、および情報取得方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 測定対象の物体から生じる光の光量を十分確保し、高感度な情報取得システムを提供することを目的とする。
【解決手段】 互いに異なる中心波長を有する複数のパルス光が合波された光を出射する光源部と、前記光源部から出射され、物体に照射されることによって生じた光を検出する光検出部と、前記光検出部で検出された光の強度の時間波形に基づいて前記物体の情報を取得する情報取得部とを有する情報取得システムであって、前記複数のパルス光のパルス繰り返し周波数が互いに異なり、前記情報取得部は、前記光の強度の時間波形から、前記互いに異なるパルス繰り返し周波数ごとの光の強度を算出することで、前記物体の情報を取得することを特徴とする情報取得システム。
【選択図】 図１

Description

本発明は、互いに異なる中心波長を有する複数のパルス光を用いた情報取得システム、情報取得装置、および情報取得方法に関する。

広帯域の波長成分を有する光を対象物に照射し、測定対象の物体から反射、散乱する光、または測定対象の物体を透過する光、あるいは測定対象の物体において発光する光を検出して分光することで、測定対象の物体についての様々な情報を得ることができる。この方法はスペクトル分光法として一般的によく知られており、対象物に照射する前の光のスペクトル成分と、測定対象の物体から反射、散乱または透過する光のスペクトル成分との比較から、測定対象の物体の光特性を知ることができる。蛍光を観察するバイオ分野では、観察したい生体物質に蛍光色素を標識し、特定波長の光を当てることで発光させ、測定対象の物体に含まれる生体物質の分布状態を観察するなどの利用法がある。

現在、一般的に用いられているスペクトル分光を行うための計測装置としては、広帯域の波長成分を有する光を出射する光源と、測定対象の物体から生じる光を波長ごとに分光する分光器、分光された光を異なる波長ごとに受光する複数の受光器から構成される。しかしこのような構成では、測定対象の物体から生じた光が受光器で検出される前に、回折格子や波長フィルタ等の分光器を経由するため、分光器で光の損失が生じ、測定装置の感度が低いという問題があった。

特許文献１では、高帯域パルスプローブビームを用いた装置であって、測定対象の物体から生じた光を、波長分散デバイスにより波長分散を与えることで波長ごとに時間遅延を与え、時間的に分離して測定することでスペクトル情報を得る方法が開示されている。

特表２０１１−５２９２３０号公報

しかし特許文献１に開示の方法では、測定対象の物体から生じた光が分光器を経由しないものの、波長分散デバイスを経由することによる光の損失が避けられず、測定装置の感度が低いという問題があった。

本発明は上記課題に着目し、測定対象の物体から生じる光を損失させず、高感度な情報取得システムを提供することを目的とする。

本発明に係る情報取得システムは、互いに異なる中心波長を有する複数のパルス光が合波された光を出射する光源部と、
前記光源部から出射され、物体に照射されることによって生じた光を検出する光検出部と、
前記光検出部で検出された光の強度の時間波形に基づいて前記物体の情報を取得する情報取得部とを有する情報取得システムであって、
前記複数のパルス光のパルス繰り返し周波数が互いに異なり、前記情報取得部は、前記光の強度の時間波形から、前記互いに異なるパルス繰り返し周波数ごとの光の強度を算出することで、前記物体の情報を取得することを特徴とする。

本発明に係る情報取得装置は、互いに異なる中心波長を有する複数のパルス光が合波された光が物体に照射されることによって生じた光を検出する光検出部と、
前記光検出部で検出された光の強度の時間波形に基づいて前記物体の情報を取得する情報取得部とを有する情報取得装置であって、
前記複数のパルス光のパルス繰り返し周波数が互いに異なり、前記情報取得部は、前記光の強度の時間波形から、前記互いに異なるパルス繰り返し周波数ごとの光の強度を算出することで、前記物体の情報を取得することを特徴とする。

本発明に係る情報取得システムは、波長ごとに繰り返し周波数の異なる多波長パルス光源を用いることで、測定対象が生じた光を損失させず、高感度である。

本発明の実施形態に係る情報取得システムを示す模式図（ａ）及び光源部から出射される光の波長の時間変化の一例を示すグラフ（ｂ）である。 本発明の実施例１に係る情報取得システムを示す模式図である。 本発明の実施例２に係る情報取得システムを示す模式図である。 本発明の実施例３に係る情報取得システムを示す模式図である。

本発明の実施形態に係る情報取得システムについて図１（ａ）および（ｂ）を用いて説明するが、本発明はこれらに限られない。図１（ａ）は本実施形態に係る情報取得システムを示す模式図であり、図１（ｂ）は本実施形態における光源部から出射される光の波長の時間変化の一例を示すグラフである。

本実施形態に係る情報取得システムは、互いに異なる中心波長（λ_１、λ_２、λ_３・・・λ_Ｎ）を有する複数のパルス光が合波された光を出射する光源部１０１と、光源部１０１から出射され、測定対象の物体１０３に照射されることによって生じた光を検出する光検出部１０４と、光検出部１０４で検出された光の強度の時間波形に基づいて物体１０３の情報を取得する情報取得部１０５とを有する。

ここで、光源部１０１から出射されて物体１０３に照射されることによって生じた光とは、物体１０３に照射された光のうち物体１０３に吸収されず、物体１０３によって反射された光、散乱された光、または物体１０３を透過した光を含む概念である。さらに、物体１０３に照射されることによって生じた光は、物体１０３が蛍光物質などを含む場合、物体１０３に照射された光を吸収して発せられた蛍光、燐光なども含む。光源部１０１から出射されて物体１０３に照射されることによって生じる光は、多光子励起蛍光、非線形効果による高次高調波発生、コヒーレントストークスラマン散乱、コヒーレントアンチストークスラマン散乱などの現象に基づくものを含む。上記吸収には、通常の散乱角度の違いに基づく吸収、電子励起による吸収、分子振動による吸収、それらの倍波吸収などがある。

なお、物体１０３によって反射された光、散乱された光を検出しやすくするために、図１（ａ）で示すように、光源部１０１から物体１０３へ照射される光の光路上にハーフミラー１０２を設けてもよい。

ここで、物体１０３を構成する材料、材料組成などによって、物体１０３の光特性が異なるため、物体１０３によって生じた光（反射光、散乱光、透過光、蛍光、燐光など）を光検出部１０４で検出し、物体１０３に照射した光の強度に対する変化量を算出することで、物体１０３の光特性に関する情報を取得できる。また光特性に関する情報から物体を構成する材料、材料組成などに関する情報を得ることができる場合もある。なお、光検出部１０４では反射光、散乱光、透過光、蛍光、燐光のうち少なくともいずれか１種を検出すればよい。

光源部１０１から互いに異なる中心波長を有する複数のパルス光が合波された光が出射されるため、物体１０３について、異なる波長に対する光特性に関する情報を同時に取得することができる。

また、複数のパルス光は、互いに異なる中心波長（λ_１、λ_２、λ_３・・・λ_Ｎ）、および、互いに異なるパルス繰り返し周波数（ｆ_１、ｆ_２、ｆ_３・・・ｆ_Ｎ）を有する。ここで、パルス繰り返し周波数（ｐｕｌｓｅ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）とは、パルス光のピークトップの間隔（周期）の逆数であり、以下では単に、繰り返し周波数と呼ぶことがある。すなわち、パルス光のピークトップが、周波数１／ｆ_Ｎの周期で表れる（Ｎ＝１，２，３・・）。

例えば、波長λ_１のパルス光は繰り返し周波数がｆ_１であるため、情報取得部１０５で算出される周波数ｆ_１の成分の光の強度は、光源部１０１から出射される光のうち、波長λ_１の光が物体１０３に照射されて生じた光の強度を反映していることになる。同様に、情報取得部１０５で算出される周波数ｆ_２、ｆ_３・・・ｆ_Ｎの成分の光の強度は、それぞれ波長λ_２、λ_３・・・λ_Ｎの光が物体１０３に照射されて生じた光の強度を反映していることになる。したがって、光検出部１０４により検出された光の強度から、情報取得部１０５を用いて各周波数ｆ_１、ｆ_２、ｆ_３・・・ｆ_Ｎごとの光の強度を求めることにより、波長λ_１、λ_２、λ_３・・・λ_Ｎの光が物体１０３に照射されて生じた光の強度を同時に検出することができる。例えば、光源部１０１から出射された光が物体１０３に照射される前後における、波長λ_１、λ_２、λ_３・・・λ_Ｎの光の強度の変化を算出することにより、測定対象の物体１０３の光特性に関する情報を取得できる。

物体１０３が互いに異なる励起波長および蛍光波長を有する複数の蛍光物質を有する場合、光源部１０１からの光を物体１０３に照射し、物体１０３から出る複数波長の蛍光の強度を測定することにより、物体１０３に含まれる複数の蛍光物質の同定が可能となる。光源部１０１から出射される複数のパルス光の波長λ_１、λ_２、λ_３・・・λ_Ｎを各蛍光物質の励起波長に一致させることで、物体１０３に含まれる複数の蛍光物質が同時に励起され、各蛍光物質が持つ固有の蛍光波長で蛍光が発生する。このとき、波長λ_１、λ_２、λ_３・・・λ_Ｎの光により励起された複数の蛍光物質から出る蛍光の波長をそれぞれλ_１’、λ_２’、λ_３’・・・λ_Ｎ’とする。ここで、蛍光波長λ_１’の蛍光は光源部１０１から出射される光のうち波長λ_１で励起されて発生するが、このパルス光は繰り返し周波数がｆ_１であるため、発生する蛍光も周波数ｆ_１で光の強度が変化する。同様に、波長λ_２’、λ_３’・・・λ_Ｎ’の蛍光は、それぞれ周波数ｆ_２、ｆ_３・・・ｆ_Ｎで光の強度が変化する。よって、光検出部１０４により検出された光の強度から、情報取得部１０５を用いて各周波数ｆ_１、ｆ_２、ｆ_３・・・ｆ_Ｎごとの光の強度を求めることにより、蛍光波長がそれぞれλ_１’、λ_２’、λ_３’・・・λ_Ｎ’の蛍光強度を同時に取得することができる。

以上のように、本実施形態では、回折格子などの分光器を必要とせず、従来構成のような光損失が生じないため、高感度な情報取得システムを提供できる。

なお、本実施形態に係る情報取得システムは、流体内の粒子の運動および形態的特徴を検出または測定することによって、フローサイトメトリを実行するよう構成されていてもよい。なお、本実施形態に係る情報取得システムは、光源部１０１を除く構成要素を情報取得装置とみることもできる。すなわち、本実施形態に係る情報取得装置は、互いに異なる中心波長を有する複数のパルス光が合波された光が物体に照射されることによって生じた光を検出する光検出部と、前記光検出部で検出された光の強度の時間波形に基づいて前記物体の情報を取得する情報取得部とを有する。そして、前記複数のパルス光のパルス繰り返し周波数が互いに異なり、前記情報取得部は、前記光の強度の時間波形から、前記互いに異なるパルス繰り返し周波数ごとの光の強度を算出することで、前記物体の情報を取得することを特徴とする。

（光源部）
本実施形態における光源部は、中心波長およびパルス繰り返し周波数が互いに異なる複数のパルス光が合波された光を出射するものであれば特に限定されない。

例えば、中心波長およびパルス繰り返し周波数が互いに異なるパルス光を出射する複数の光源を合波させて出射する光源が挙げられる。このとき用いるパルス光の光源は出射される光の波長を変化させることができる波長可変光源であってもよい。

また、波長幅を有する光を出射する光源と、この光源から出射された光を、互いに異なる中心波長を有する複数の光に分波する分波器と、分波して得られた複数の光の強度を変調する複数の変調器とを有する光源も例として挙げられる。このとき用いる波長幅を有する光を出射する光源として、広帯域の波長成分を有するスーパーコンティニューム（Ｓｕｐｅｒｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）光（以下、ＳＣ光と略すことがある）の光源を用いることができる。

本実施形態における光源部から出射されるパルス光のパルス幅は、１００ｐｓ以下であることが好ましく、１０ｐｓ以下であることがさらに好ましい。また、０．０１ｐｓ（１０ｆｓ）以上であることが好ましい。これは、パルス光のパルス幅が狭いほどパルス光のピーク強度が大きく、測定対象の物体の非線形効果の有無がわかりやすくなるからである。ここでいうパルス幅はパルス光の半値幅である。

本実施形態における光源部から出射される各パルス光の中心波長は、３００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下であることが好ましく、７００ｎｍ以上１３００ｎｍ以下であることが特に好ましい。

なお、互いに異なる中心波長を有する複数のパルス光を合波する合波器として、光カップラ、回折格子、プリズムなどを用いることができる。

ここで、一般的に、繰り返し周波数ｆの光パルスは、その高調波である周波数Ｎ・ｆ（Ｎは整数）の成分を含んでいるため、複数のパルス光のパルス繰り返し周波数のうち最も低い周波数をｆ_０としたときに、ｆ_０以外の繰り返し周波数を有するパルス光の繰り返し周波数ｆは、ｆ_０＜ｆ＜２ｆ_０で表される式を満たすことが好ましい。

測定対象の物体が蛍光色素で標識されており、測定対象の物体から生じる蛍光を検出する場合について説明する。蛍光色素の蛍光寿命は一般的に１０ｎｓ程度であり、その逆数の１００ＭＨｚ以上の周波数を有する蛍光の変化は測定できないため、複数のパルス光のパルス繰り返し周波数がいずれも１００ＭＨｚ以下であることが好ましい。

また、蛍光色素を二光子励起させるためには、蛍光色素の励起波長（一光子励起により励起する波長）の２倍の波長を中心波長とする光を出射する光源を用いることが好ましい。例えば、励起波長３９０ｎｍの蛍光色素を二光子励起させるためには、その２倍の波長である７８０ｎｍの中心波長を有する光を出射する光源を用いることが好ましい。

（情報取得部）
情報取得部１０５は、光検出部１０４で検出された光の強度の時間波形に基づいて、互いに異なるパルス繰り返し周波数ごとの光の強度を算出することで、物体１０３の情報を取得する。互いに異なるパルス繰り返し周波数ごとの光の強度を同時に算出するために、情報取得部は、フーリエ変換を含む演算を行うことが好ましい。

情報取得部として、ＣＰＵを有するコンピュータであり、このコンピュータがフーリエ変換機能を有するアプリケーションを内蔵する例が挙げられる。他の例は、情報取得部がＦＦＴアナライザなどのフーリエ変換機能を有する装置を有する場合である。

なお、ＦＦＴアナライザの代わりにロックインアンプなどを用いることができる。ロックインアンプを用いる場合、光源部から出射される光の繰り返し周波数を制御する信号を取り出し、参照信号として用いることができる。このとき、光源部から出射される光を、別途設けた光検出素子で受光し、得られた各周波数の信号を参照信号とすればよい。ロックインアンプを用いることで、ＦＦＴアナライザに比べより微弱な蛍光を検出することが可能である。

（情報取得方法）
本発明の実施形態に係る情報取得方法は、互いに異なる中心波長を有する複数のパルス光が合波された光を物体に照射する工程と、物体に照射されることによって生じた光を検出する工程と、検出された光の強度の時間波形に基づいて前記物体の情報を取得する情報取得工程と、を有する。そして、前記複数のパルス光のパルス繰り返し周波数が互いに異なり、前記情報取得工程は、前記光の強度の時間波形から、前記互いに異なるパルス繰り返し周波数ごとの光の強度を算出することで、前記物体の情報を取得する工程であることを特徴とする。

本実施形態に係る情報取得方法は、上記以外の工程を含んでいてもよい。

本発明の実施例に係る情報取得システムについて説明するが、本発明はこれらに限られない。

（実施例１）
本発明の実施例１に係る情報取得システムについて、図２を用いて説明する。本実施例に係る情報取得システムは、互いに異なる中心波長および繰り返し周波数のパルス光を発光する２つのパルスレーザ光源を用いた二光子励起蛍光顕微鏡の例である。

本実施例に係る情報取得システムにおいて、光源部として、パルスレーザ光源２０１、パルスレーザ光源２０２、および２つのパルスレーザ光源２０１，２０２から出る光を合波する光カップラ２０３を用いる。パルスレーザ光源２０１として、非線形結晶が内蔵されたモード同期Ｅｂ（エルビウム）ドープファイバレーザ光源を使用する。励起波長が３９０ｎｍの蛍光色素Ａを二光子励起させるため、パルスレーザ光源２０１の中心波長を７８０ｎｍ、繰り返し周波数を４０ＭＨｚとする。パルスレーザ光源２０２として、モード同期Ｙｂ（イットリビウム）ドープファイバレーザ光源を使用する。励起波長が５１５ｎｍの蛍光色素Ｂを二光子励起させるため、パルスレーザ光源２０２の中心波長を１０３０ｎｍ、繰り返し周波数を５０ＭＨｚとする。また、パルスレーザ光源２０１、２０２から出る光のパルス幅は、ともに１ｐｓとする。

測定対象の物体２１５としては、２種類の蛍光色素により標識された生体細胞試料を用いる。これらの蛍光色素は、励起波長（一光子励起により励起する波長）が３９０ｎｍで蛍光波長が４５０ｎｍの蛍光色素Ａと、励起波長が５１５ｎｍで蛍光波長が５５０ｎｍの蛍光色素Ｂの２種類を使用する。

光合波器２０３で合波された、互いに異なる中心波長を有する２つのパルス光は、ビームエキスパンダ２０４により径の太い光束に変換される。ビームエキスパンダ２０４で変換された光がダイクロイックミラー２０５で反射された後、Ｘスキャンミラー２０６、Ｙスキャンミラー２０７で反射され、対物レンズ２０８によりステージ２０９上の測定対象の物体２１５に向けて集光されるように、各部品を配置する。なお、ダイクロイックミラー２０５は、検出すべき光でない励起波長７８０〜１０３０ｎｍの光を反射し、検出すべき光である蛍光波長４５０〜５５０ｎｍの光を透過する性質をもつミラーを用いる。Ｘスキャンミラー２０６、Ｙスキャンミラー２０７として１対のガルバノミラーを用いる。Ｘスキャンミラー２０６は測定対象の物体２１５を主走査するために用いるミラーで、Ｙスキャンミラー２０７は副走査用である。Ｘスキャンミラー２０６とＹスキャンミラー２０７とは互いの回転軸が直交するように配置し、各ミラーの回転角の制御は制御ユニット２１４によって行う。

測定対象の物体２１５において、対物レンズ２０８の集光点中央の微小領域では、蛍光色素が二光子励起され、波長が４５０、５５０ｎｍである蛍光が発生する。集光点中央の微小領域から外れると二光子励起が生じないので、蛍光は発生しない。なお、レーザスポットのサイズは、対物レンズ２０８のＮＡ（ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ａｐｅｒｔｕｒｅ、開口数）が大きいほど小さくなり、それに伴い、蛍光が発生する微小領域のサイズも小さくなる。

集光点中央の微小領域で発生した二光子励起蛍光は、対物レンズ２０８を経由し、ダイクロイックミラー２０５を透過し、バンドパスフィルタ２１０、集光レンズ２１１を透過後、光検出部としての受光素子２１２へ入射する。バンドパスフィルタ２１０は、受光素子２１２に、測定に不要な光が入射するのを防ぐために、本実施例で測定対象としている蛍光波長４５０〜５５０ｎｍの領域以外の光を透過させない性質をもつフィルタを用いる。

Ｘスキャンミラー２０６が回転させると、集光点が測定対象の物体２１５のＸ方向に移動する。また、Ｙスキャンミラー２０７が回転させると、集光点が測定対象の物体２１５におけるＸ方向と垂直なＹ方向へスキャンされる。なお、Ｘ方向、Ｙ方向は共に対物レンズ２０８の光軸方向に垂直な方向に設定する。よって、Ｘスキャンミラー２０６を所定の角度まで回転させて戻す操作を１回行う毎にＹスキャンミラー２０７の角度を１ピッチ分ずつ変化させれば、測定対象の物体２１５を二次元的にスキャンすることができるため、測定対象の物体２１５の二次元情報を取得することができる。

さらに、一回の二次元スキャン終了後、ステージ２０９を移動させて集光点を光軸方向に所定距離だけ移動させ、上記の説明と同様の２次元スキャンを繰り返すことで、測定対象の物体２１５の三次元情報を取得することが可能となる。

受光素子２１２で検出された光の強度に関する情報は、周波数解析器２１３に入力される。周波数解析器２１３としてＦＦＴアナライザを用い、４０ＭＨｚ、５０ＭＨｚの信号成分を同時に測定する。このとき、周波数の最大値は５０ＭＨｚであるため、ＦＦＴアナライザのサンプリングレートを、繰り返し周波数の最大値の２倍以上である２００ＭＨｚとした。測定された各周波数成分の光の強度は、パルスレーザ２０１、２０２から出た光により励起された蛍光色素の蛍光強度に相当する。すなわち、４０ＭＨｚの周波数成分の光の強度は蛍光波長が４５０ｎｍである蛍光色素Ａの蛍光強度に相当し、５０ＭＨｚの周波数成分の光の強度は蛍光波長が５５０ｎｍである蛍光色素Ｂの蛍光強度に相当する。これより、蛍光色素Ａと蛍光色素Ｂの蛍光強度を同時に測定することが可能となる。

以上のように、複数の蛍光色素により標識された測定対象の物体から、分光器を用いずに複数の蛍光強度を同時に測定することができる。したがって、蛍光のような微弱な光を、分光器で光損失させることなく測定できるため、高感度な測定が可能となり、複数の蛍光色素による高精細な三次元蛍光画像を同時に取得することができる。

（実施例２）
本発明の実施例２に係る情報取得システムについて、図３を用いて説明する。本実施例に係る情報取得システムは、実施例１におけるパルスレーザ光源を波長可変の光源とした二光子励起蛍光顕微鏡の例である。以下、実施例１と異なる点について説明する。特に説明がない場合は、実施例１と同じである。

光源部として、３つの波長可変パルスレーザ光源３０１、３０２、３０３および、光合波器３０４を用いた。その他の構成部品は、ビームエキスパンダ３０５、ダイクロイックミラー３０６、Ｘスキャンミラー３０７、Ｙスキャンミラー３０８、対物レンズ３０９、ステージ３１０、バンドパスフィルタ３１１、集光レンズ３１２、受光素子３１３、周波数解析器３１４、制御ユニット３１５である。

ステージ３１０上には測定対象の物体３１６を配置する。測定対象の物体３１６は、９種類の蛍光色素（蛍光色素Ａ〜Ｉ）により標識された生体細胞試料である。蛍光色素Ａは、励起波長（一光子励起により励起する波長）が３４０ｎｍで蛍光波長が３９０ｎｍである。蛍光色素Ｂは、励起波長が３６０ｎｍで蛍光波長が４１０ｎｍである。蛍光色素Ｃは、励起波長が３８０ｎｍで蛍光波長が４３０ｎｍである。蛍光色素Ｄは、励起波長が４００ｎｍで蛍光波長が４５０ｎｍである。蛍光色素Ｅは、励起波長が４２０ｎｍで蛍光波長が４７０ｎｍである。蛍光色素Ｆは、励起波長が４４０ｎｍで蛍光波長が４９０ｎｍである。蛍光色素Ｇは、励起波長が４６０ｎｍで蛍光波長が５１０ｎｍである。蛍光色素Ｈは、励起波長が４８０ｎｍで蛍光波長が５３０ｎｍである。蛍光色素Ｉは、励起波長が５００ｎｍで蛍光波長が５５０ｎｍである。

波長可変パルスレーザ光源３０１、３０２、３０３として、中心波長を６８０〜１０００ｎｍの範囲で可変できる３つのチタンサファイアレーザ光源を使用する。波長可変パルスレーザ光源３０１は、励起波長が３４０ｎｍの蛍光色素Ａ、励起波長が３６０ｎｍの蛍光色素Ｂ、励起波長が３８０ｎｍの蛍光色素Ｃの３種類の蛍光色素を二光子励起させるために、中心波長を６８０、７２０、７６０ｎｍと変化させ、繰り返し周波数を３０ＭＨｚとする。

波長可変パルスレーザ光源３０２は、励起波長が４００ｎｍの蛍光色素Ｄ、励起波長が４２０ｎｍの蛍光色素Ｅ、励起波長が４４０ｎｍの蛍光色素Ｆの３種類の蛍光色素を二光子励起させるために、中心波長を８００、８４０、８８０ｎｍと変化させ、繰り返し周波数を４０ＭＨｚとする。

波長可変パルスレーザ光源３０３は、励起波長が４６０ｎｍの蛍光色素Ｇ、励起波長が４８０ｎｍの蛍光色素Ｈ、励起波長が５００ｎｍの蛍光色素Ｉの３種類の蛍光色素を二光子励起させるために、中心波長を９２０、９６０、１０００ｎｍと変化させ、繰り返し周波数を５０ＭＨｚとした。また、波長可変パルスレーザ光源３０１、３０２、３０３の各レーザのパルス幅を１ｐｓとする。

３つの波長可変パルスレーザ光源３０１、３０２、３０３からの光を測定対象の物体３１６へ照射し、集光点中央の微小領域で二光子励起蛍光が発生する。測定対象の物体３１６から発生した複数波長の蛍光は対物レンズ３０９を経由し、ダイクロイックミラー３０６を透過し、バンドパスフィルタ３１１、集光レンズ３１２を透過後、受光素子３１３へ入射する。ダイクロイックミラー３０６は、励起波長である６８０〜１０００ｎｍの光を反射し、蛍光波長である３９０〜５５０ｎｍの光を透過するよう設定されている。バンドパスフィルタ３１１は、観察対象とする蛍光波長である３９０〜５５０ｎｍの光を透過し、他の波長領域の光は透過しないよう設定されている。

受光素子３１３で検出された光の強度に関する情報は、周波数解析器３１４に入力される。周波数解析器３１４としてＦＦＴアナライザを用い、３０ＭＨｚ、４０ＭＨｚ、５０ＭＨｚの信号成分を同時に測定した。このとき、繰り返し周波数の最大値は５０ＭＨｚであるため、ＦＦＴアナライザのサンプリングレートを、繰り返し周波数の最大値の２倍以上である２００ＭＨｚとした。測定された各周波数成分の光強度は、波長可変パルスレーザ光源３０１、３０２、３０３により励起された蛍光色素の蛍光強度に相当する。

ここで、例えば波長可変パルスレーザ光源３０１の中心波長を６８０ｎｍ、波長可変パルスレーザ光源３０２の中心波長を８００ｎｍ、波長可変パルスレーザ光源３０３の中心波長を９２０ｎｍに設定する。このとき、３０ＭＨｚの信号成分は蛍光波長が３９０ｎｍである蛍光色素Ａの蛍光強度に相当し、４０ＭＨｚの信号成分は蛍光波長が４５０ｎｍである蛍光色素Ｄの蛍光強度に相当し、５０ＭＨｚの信号成分は蛍光波長が５１０ｎｍである蛍光色素Ｇの蛍光強度に相当する。

同様に、例えば波長可変パルスレーザ光源３０１の中心波長を７２０ｎｍ、波長可変パルスレーザ光源３０２の中心波長を８４０ｎｍ、波長可変パルスレーザ光源３０３の中心波長を９６０ｎｍに設定する。このとき、３０ＭＨｚの信号成分は蛍光波長が４１０ｎｍである蛍光色素Ｂの蛍光強度に相当し、４０ＭＨｚの信号成分は蛍光波長が４７０ｎｍである蛍光色素Ｅの蛍光強度に相当し、５０ＭＨｚの信号成分は蛍光波長が５３０ｎｍである蛍光色素Ｈの蛍光強度に相当する。

同様に、例えば波長可変パルスレーザ光源３０１の中心波長を７６０ｎｍ、波長可変パルスレーザ光源３０２の中心波長を８８０ｎｍ、波長可変パルスレーザ光源３０３の中心波長を１０００ｎｍに設定する。このとき、３０ＭＨｚの信号成分は蛍光波長が４３０ｎｍである蛍光色素Ｃの蛍光強度に相当し、４０ＭＨｚの信号成分は蛍光波長が４９０ｎｍである蛍光色素Ｆの蛍光強度に相当し、５０ＭＨｚの信号成分は蛍光波長が５５０ｎｍである蛍光色素Ｉの蛍光強度に相当する。これより、３種類の蛍光色素の蛍光強度を同時に測定することができ、合計９種類の蛍光色素の蛍光強度を測定することが可能となる。

本実施例のように波長可変パルスレーザ光源を用いることにより、任意の蛍光色素の蛍光強度を測定できることできる。

（実施例３）
本発明の実施例３に係る情報取得システムについて、図４を用いて説明する。本実施例に係る情報取得システムは、実施例１の光源部において、ＳＣ光の光源を用いた二光子励起蛍光顕微鏡の例である。以下、実施例１と異なる点について説明する。特に説明がない場合は、実施例１と同じである。光源部として、パルスレーザ光源４０１、フォトニック結晶ファイバ４０２、光分波器４０３、４つの光変調器４０４〜４０７、光合波器４０８を用いた。

その他の構成部品は、ビームエキスパンダ４０９、ダイクロイックミラー４１０、Ｘスキャンミラー４１１、Ｙスキャンミラー４１２、対物レンズ４１３、ステージ４１４、バンドパスフィルタ４１５、集光レンズ４１６、受光素子４１７、周波数解析器４１８、制御ユニット４１９である。

ステージ４１４上には測定対象の物体４２０を配置する。測定対象の物体４２０は、４種類の蛍光色素（蛍光色素Ａ〜Ｄ）により標識された生体細胞試料である。蛍光色素Ａは、励起波長（一光子励起により励起する波長）が４００ｎｍで蛍光波長が４５０ｎｍである。蛍光色素Ｂは、励起波長が５００ｎｍで蛍光波長が５５０ｎｍである。蛍光色素Ｃは、励起波長が６００ｎｍで蛍光波長が６５０ｎｍである。蛍光色素Ｄは、励起波長が７００ｎｍで蛍光波長が７５０ｎｍである。

パルスレーザ光源４０１として、モード同期Ｙｂ（イットリビウム）ドープファイバレーザ光源を使用し、中心波長を１０３０ｎｍ、繰り返し周波数を１ＧＨｚ、パルス幅を１ｐｓとした。パルスレーザ光源４０１からの出る光を、零分散波長が１０３０ｎｍ近傍に存在するフォトニック結晶ファイバ４０２へ入射させることで、広帯域の波長成分を有するＳＣ光が発生する。本実施例の場合、波長が８００〜１４００ｎｍの範囲の波長成分を有するＳＣ光が得られる。このＳＣ光を光分波器４０３へ入射させ、波長ごとに伝搬経路を分岐させる。本実施例では光分波器４０３として回折格子を用い、ＳＣ光の中から、中心波長が８００、１０００、１２００、１４００ｎｍの光を取り出す構成とする。中心波長が８００ｎｍの光は励起波長が４００ｎｍの蛍光色素Ａを二光子励起させるため、中心波長が１０００ｎｍの光は励起波長が５００ｎｍの蛍光色素Ｂを二光子励起させるためにそれぞれ用いる。同様に、中心波長が１２００ｎｍの光は励起波長が６００ｎｍの蛍光色素Ｃを二光子励起させるため、中心波長が１４００ｎｍの光は励起波長が７００ｎｍの蛍光色素Ｄを二光子励起させるためにそれぞれ用いる。

中心波長の異なる４つの光を、それぞれ光変調器４０４〜４０７へ入射させ、異なる周波数で強度変調する。このとき、中心波長が８００ｎｍの光を３５ＭＨｚ、中心波長が１０００ｎｍの光を４０ＭＨｚ、中心波長が１２００ｎｍの光を４５ＭＨｚ、中心波長が１４００ｎｍの光を５０ＭＨｚの繰り返しとなるように強度変調する。

４つの光変調器４０４〜４０７から出て、光合波器４０８で合波された光は、対象物４２０へ照射され、集光点中央の微小領域で二光子励起蛍光が発生する。対象物４２０から発生する複数波長の蛍光は対物レンズ４１３、ダイクロイックミラー４１０を透過し、バンドパスフィルタ４１５、集光レンズ４１６を透過した後、受光素子４１７へ入射する。ダイクロイックミラー４１０は、励起波長である８００〜１４００ｎｍの光を反射し、蛍光波長である４５０〜７５０ｎｍの光を透過するよう設定されている。バンドパスフィルタ４１５は、測定対象とする蛍光波長である４５０〜７５０ｎｍの光を透過し、他の波長領域の光は透過しないよう設定されている。

受光素子４１７で検出された信号は、周波数解析器４１８に入力される。周波数解析器４１８としてＦＦＴアナライザを用い、３５ＭＨｚ、４０ＭＨｚ、４５ＭＨｚ、５０ＭＨｚの周波数成分を同時に測定する。このとき、繰り返し周波数の最大値は５０ＭＨｚであるため、ＦＦＴアナライザのサンプリングレートを、繰り返し周波数の最大値の２倍以上である２００ＭＨｚとする。測定された各周波数成分の光の強度は、光変調器４０４〜４０７から出た互いに異なる中心波長を有する光により励起された蛍光色素の蛍光強度に相当する。すなわち、３５ＭＨｚの周波数成分の光の強度は蛍光波長が４５０ｎｍである蛍光色素Ａの蛍光強度に相当し、４０ＭＨｚの周波数成分の光の強度は蛍光波長が５５０ｎｍである蛍光色素Ｂの蛍光強度に相当する。同様に、４５ＭＨｚの周波数成分の光の強度は蛍光波長が６５０ｎｍである蛍光色素Ｃの蛍光強度に相当し、５０ＭＨｚの周波数成分の光の強度は蛍光波長が７５０ｎｍである蛍光色素Ｄの蛍光強度に相当する。これより、４種類の蛍光色素の蛍光強度を同時に測定することが可能となる。

本実施例では、広帯域の波長成分を有するパルス光源であるスーパーコンティニューム光を用いているため、光分波器で分波する光の数を増やし、増やした分だけ光変調器を設けることで、数多くの蛍光色素の蛍光強度を同時に測定できることができる。

１０１ 光源部
１０２ ハーフミラー
１０３ 物体
１０４ 光検出部
１０５ 情報取得部

Claims (15)

1. 互いに異なる中心波長を有する複数のパルス光が合波された光を出射する光源部と、
   前記光源部から出射され、物体に照射されることによって生じた光を検出する光検出部と、
   前記光検出部で検出された光の強度の時間波形に基づいて前記物体の情報を取得する情報取得部とを有する情報取得システムであって、
   前記複数のパルス光のパルス繰り返し周波数が互いに異なり、前記情報取得部は、前記光の強度の時間波形から、前記互いに異なるパルス繰り返し周波数ごとの光の強度を算出することで、前記物体の情報を取得することを特徴とする情報取得システム。
2. 前記複数のパルス光のパルス繰り返し周波数のうち最も低い周波数をｆ_０としたときに、前記ｆ_０以外の繰り返し周波数を有するパルス光の繰り返し周波数ｆが、ｆ_０＜ｆ＜２ｆ_０で表される式を満たすことを特徴とする請求項１に記載の情報取得システム。
3. 前記複数のパルス光のパルス繰り返し周波数がいずれも１００ＭＨｚ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の情報取得システム。
4. 前記情報取得部は、前記互いに異なるパルス繰り返し周波数ごとの光の強度を算出する際にフーリエ変換を含む演算を行うことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の情報取得システム。
5. 前記光源部は中心波長およびパルス繰り返し周波数が互いに異なるパルス光を出射する複数の光源を有することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の情報取得システム。
6. 前記複数の光源の少なくとも１つは、出射される光の波長を変化させることができる波長可変光源であることを特徴とする請求項５に記載の情報取得システム。
7. 前記光源部は、波長幅を有する光を出射する光源と、前記波長幅を有する光を出射する光源から出射された光を互いに異なる中心波長を有する複数の光に分波する分波器と、前記分波して得られた複数の光の強度を変調する複数の変調器とを有することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の情報取得システム。
8. 互いに異なる中心波長を有する複数のパルス光が合波された光が物体に照射されることによって生じた光を検出する光検出部と、
   前記光検出部で検出された光の強度の時間波形に基づいて前記物体の情報を取得する情報取得部とを有する情報取得装置であって、
   前記複数のパルス光のパルス繰り返し周波数が互いに異なり、前記情報取得部は、前記光の強度の時間波形から、前記互いに異なるパルス繰り返し周波数ごとの光の強度を算出することで、前記物体の情報を取得することを特徴とする情報取得装置。
9. 前記複数のパルス光のパルス繰り返し周波数のうち最も低い周波数をｆ_０としたときに、前記ｆ_０以外の繰り返し周波数を有するパルス光の繰り返し周波数ｆが、ｆ_０＜ｆ＜２ｆ_０で表される式を満たすことを特徴とする請求項８に記載の情報取得装置。
10. 前記複数のパルス光のパルス繰り返し周波数がいずれも１００ＭＨｚ以下であることを特徴とする請求項８または９に記載の情報取得装置。
11. 前記情報取得部は、前記互いに異なるパルス繰り返し周波数ごとの光の強度を算出する際にフーリエ変換を含む演算を行うことを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の情報取得装置。
12. 前記光源部は中心波長およびパルス繰り返し周波数が互いに異なるパルス光を出射する複数の光源を有することを特徴とする請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の情報取得装置。
13. 前記複数の光源の少なくとも１つは、出射される光の波長を変化させることができる波長可変光源であることを特徴とする請求項１２に記載の情報取得装置。
14. 前記光源部は、波長幅を有する光を出射する光源と、前記波長幅を有する光を出射する光源から出射された光を互いに異なる中心波長を有する複数の光に分波する分波器と、前記分波して得られた複数の光の強度を変調する複数の変調器とを有することを特徴とする請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の情報取得装置。
15. 互いに異なる中心波長を有する複数のパルス光が合波された光を物体に照射する工程と、
    物体に照射されることによって生じた光を検出する工程と、
    検出された光の強度の時間波形に基づいて前記物体の情報を取得する情報取得工程と、を有する情報取得方法であって、
    前記複数のパルス光のパルス繰り返し周波数が互いに異なり、前記情報取得工程は、前記光の強度の時間波形から、前記互いに異なるパルス繰り返し周波数ごとの光の強度を算出することで、前記物体の情報を取得する工程であることを特徴とする情報取得方法。
    

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