JP2018538516A - マルチモードの蛍光撮像フローサイトメトリシステム - Google Patents

Abstract

【解決手段】３つの動作モードで動作可能な、サイトメトリを行うためのシステムを提供する。一動作モードでは、細胞／粒子を含むサンプルの蛍光画像が、トップハット形ビームと相互に無線周波数シフトされた複数のビームとの重ね合わせとして形成された励起ビームにより、サンプル内に存在する一又は複数の蛍光色素を励起することによって得られる。別の動作モードでは、サンプルが、ある時間間隔に亘って複数の励起周波数のレーザビームにより走査方式で連続的に照射され得る。サンプルからの蛍光放射を検出して分析することにより、例えばサンプルの蛍光画像を生成できる。また別の動作モードでは、システムは、サンプルの複数の位置を、例えばレーザビームの中心周波数を無線周波数によりシフトさせることによって得られる１つの励起周波数により同時に照射するように動作できる。

Description

本発明は一般に、サンプルの蛍光分析のための装置及び方法に関し、より詳しくは、蛍光利用のフローサイトメトリのための装置及び方法に関する。

蛍光撮像には、例えば生体標本の分子構成に関する情報の取得をはじめとする様々な生物医学的用途がある。生物医学フローサイトメトリでは、外的蛍光色素及び／又は内的細胞内蛍光色素により発せられる蛍光放射が集められて分析され、細胞の化学的特性及び／又は物理的特性に関する情報が得られる。

しかしながら、従来の蛍光利用のフローサイトメトリでは、高速で流れる細胞、又はサブミリ秒の生化学的動態等のその他の高速現象のボヤケのない画像の取得が困難である場合がある。特に、キロヘルツ範囲の撮像フレームレートでのサンプルの短時間の露光では多くの蛍光色素の光放射が弱く、それによって、ボヤケのない画像を取得しにくくなる。更に、従来のシステムの多くは１つの撮像モードでしか動作しないため、サンプル分析のための十分な適応性を有することができない。

そのため、蛍光分析のための改良された方法及びシステムに対するニーズがあり、特に、蛍光利用のフローサイトメトリを行うための改良された方法及びシステムに対するニーズがある。

一態様では、サイトメトリを行うためのシステムが開示されており、このシステムは、少なくとも１つの蛍光色素の励起に適した中心周波数を有するレーザビームを生成するためのレーザと、レーザビームを受けて、前記中心周波数に対して無線周波数（ＲＦ）シフトを夫々有する角度分離した複数のレーザビームを生成するための音響光学偏向素子とを備えている。角度分離したレーザビームは、ローカルオシレータビーム（ＬＯビーム）及び複数のＲＦコムビームを有し、これらのビームの各々が、中心レーザ周波数に対して無線周波数シフトを示す。光学素子が、ＬＯビームをＲＦコムビームの伝搬経路とは異なる伝搬経路に沿って導く。トップハットビーム整形素子がＬＯビームを受けて、例えばＬＯビームの伝搬方向に垂直な面内の１つの方向に沿ったトップハット強度プロファイルをＬＯビームに付与する。システムは、トップハット形のＬＯビーム及びＲＦコムビームを受けて、前記トップハット形のＬＯビーム及びＲＦコムビームの空間重なりによって結合ビームを与えるビームスプリッタと、その少なくとも一部が前記蛍光色素に関連付けられている複数の細胞を含み得るサンプルに結合ビームを導くための少なくとも１つの光学素子（例えばレンズ）とを更に備えており、ＬＯビームはサンプルの複数の空間位置を、例えばサンプルがフローセルを通って流れているときに同時に照射し、前記ＲＦコムビームの各々は前記空間位置の異なる位置を照射して、前記空間位置に前記蛍光色素があれば、前記蛍光色素から蛍光放射を引き出す。前記サンプルの空間位置の各々から発せられる蛍光放射は、前記ＬＯビームの周波数とサンプルのその空間位置を照射しているＲＦコムビームの１つの周波数との差に相当するビート周波数を示す。

ある実施形態では、無線周波数（ＲＦ）シフト間の周波数差は、前記蛍光色素のスペクトル吸収ピークのＦＷＨＭ（半値全幅）より小さい。例として、無線周波数シフトは約１０ＭＨｚ〜約２５０ＭＨｚの範囲、例えば約５０ＭＨｚ〜約１５０ＭＨｚの範囲内である。ある実施形態では、無線周波数シフトは、約０．１ＭＨｚ〜約４ＭＨｚの範囲の周波数だけ相互に分離している。

ある実施形態では、上述のシステムは、ビームスプリッタの下流に配置されたレンズを更に備えており、レンズは、トップハット形のＬＯビームがＲＦコムビームの各々と重なり合うようにトップハット形のＬＯビーム及びＲＦコムビームを中間面に集束させる。各重なり位置におけるトップハット形のＬＯビームの強度プロファイルは、別の重なり位置におけるトップハット形のＬＯビームの強度プロファイルと実質的に同じとすることができる。場合により、ＬＯビームはこの中間面に線形範囲（例えば、この面内の水平次元に沿った範囲）を有し、この範囲は、角度分離したＲＦコムビームの線形範囲（例えば、ＲＦコムビーム間の最大水平距離）と実質的に等しい。トップハット形のＬＯビームは好ましくは、トップハット方向に（ビームの長い方向に沿って）実質的に均一な偏光を有する。

例として、ある実施形態では、ＲＦコムビームはガウシアン強度プロファイルを有し、トップハット形のＬＯビームは、ガウシアン強度プロファイルの最大強度と実質的に等しい強度を有する。更に、ＲＦコムビームの偏光及びトップハット形のＬＯビームの偏光は並べられ得る。

システムは無線周波数発生器を備えることができ、無線周波数発生器は、無線周波数シフトに対応する無線周波数を同時に発生させて、前記ＬＯビーム及びＲＦコムビームを生成するために無線周波数を音響光学偏向素子に与える。ある実施形態では、無線周波数発生器は、ダイレクトデジタルシンセサイザ（ＤＤＳ）ＲＦコム発生器を有している。ある実施形態では、電子電力増幅器が、無線周波数発生器により生成された無線周波数駆動信号を音響光学偏向素子に与えるために増幅することができる。コントローラが、例えば、後で更に説明するようにシステムを異なる動作モードで動作させるため、及び／又は音響光学偏向素子に与える駆動信号の振幅及び／又は周波数を調整するために無線周波数発生器を制御できる。

システムは、サンプルから発せられた蛍光放射があれば、その蛍光放射を検出して時間領域の蛍光信号を生成するための一又は複数の光検出器（例えば、一又は複数の光電子増倍管）を更に備えることができる。場合により、適したフィルタ（例えば、光学バンドパスフィルタ）が光検出器の前に設けられており、対象の蛍光周波数を透過させる一方、不要な放射周波数を遮断する。

ある実施形態では、励起放射（すなわち、ＬＯビーム及びＲＦコムビームの組合せ）は、サンプル内の複数の蛍光色素を同時に励起させることができる。このようなある実施形態では、システムは複数の光検出器を備えることができ、光検出器の各々はこれらの蛍光色素のうちの１つから発せられた蛍光放射を検出するために使用される。ある実施形態では、適したフィルタ、例えばバンドパスフィルタが光検出器の各々の前に設けられており、対象の蛍光周波数の放射を夫々の検出器に透過させる一方、不要な放射を遮断する。

ある実施形態では、対物レンズが、ダイクロイックミラーによる反射を通じて励起放射（すなわち、ＬＯビーム及びＲＦコムビームの組合せ）を受けることができ、励起放射を調査対象のサンプルに集束させることができる。サンプルにより発せられる蛍光放射は、対物レンズ及びダイクロイックミラーを通過し、一又は複数のレンズを通じて光検出器に集束することが可能である。サンプル内の複数の蛍光色素からの蛍光放射に対応する複数の蛍光周波数が複数の光検出器（例えば、光電子増倍管）を通じて検出されるある実施形態では、各光検出器は適したダイクロイックミラーに関連付けられることができ、ダイクロイックミラーから反射を通じて、蛍光色素のうちの１つからの蛍光放射に対応する周波数を有する蛍光放射を受ける。ダイクロイックミラーは、他の蛍光色素に対応する蛍光周波数を通過させて、下流にある他の検出器により検出させることができる。

ある実施形態では、サンプルにより発せられる蛍光放射は、例えば一又は複数のレンズを通じて光ファイバに導かれ得る。光ファイバは、蛍光放射を受ける基端から放射が光ファイバから出る末端まで延びることができる。ある実施形態では、光ファイバの末端に光学的に結合された出射側レンズにより、光ファイバから出る蛍光放射を一又は複数の光検出器に導き易くなる。

システムは分析モジュールを更に備えており、分析モジュールは一又は複数の光検出器と通信して、一又は複数の光検出器から一又は複数の時間領域の蛍光信号を受けて、サンプルの一又は複数の蛍光画像を再構成する。例えば、分析モジュールは、蛍光信号の周波数多重分離を行ってビート周波数を決定でき、ビート周波数を、サンプルの中のこれらのビート周波数で変調された蛍光放射を発する空間位置に相関させることにより、サンプルの蛍光画像を生成できる。例として、ある実施形態では、これらの空間位置はサンプルの水平次元に沿って存在することができる。ある実施形態では、サンプルがフローセル内を流れているとき、サンプルの様々な部分（例えば、サンプルの様々な水平範囲）からの蛍光放射が集められて分析されて、サンプルの２次元蛍光画像が生成される。

ある実施形態では、分析モジュールは、（１）蛍光信号の少なくとも一部のフーリエ変換（例えば、ＦＦＴ）を行って、ビート周波数に対応する信号の周波数成分を取得して、（２）周波数成分（ビート周波数）毎に、例えばその周波数成分の実部及び虚部の平方和の平方根を得ることによってその周波数成分の振幅値を計算して、そのビート周波数に対応する画像の位置に対応するピクセル値を与えることによって、サンプルの蛍光画像を再構成する。

ある実施形態では、分析モジュールは、例えば増幅後に蛍光信号をデジタル化し、デジタル化された蛍光信号の複数のコピーを生成することにより、検出された蛍光信号の周波数多重分離を行うように構成されており、デジタル化されたコピーの数（Ｎ）はＲＦコムビームに関連付けられる周波数の数に相当する。周波数信号のデジタル化されたコピーの各々に、ＲＦコムビームの１つの周波数とＬＯビームの周波数との差に等しいビート周波数に相当する周波数を有する正弦波及び余弦波を乗じ、複数の中間信号を生成する。各中間信号は、ＲＦコムビームの周波数間の周波数間隔の半分と等しいバンド幅を有するローパスフィルタを通過する。ＲＦコムビームの周波数の１つに相当するビート周波数毎に、そのビート周波数に対応するフィルタ処理された２つの中間信号の平方和の平方根が、そのビート周波数での変調を示す蛍光放射を発するＬＯビーム及びＲＦコムビームにより照射されたサンプル位置に対応する画像ピクセルの振幅値として得られる。

ある実施形態では、分析モジュールは、検出された蛍光信号の周波数多重分離を、デジタル化された蛍光信号の一部のコピーを生成することによって実行するように構成されており、デジタル化されたコピーの数（Ｎ）はＲＦコムビームに関連付けられる周波数の数に相当する。デジタル化された蛍光信号の各コピーは、ＲＦコムビームの１つに関連付けられるビート周波数を中心とするバンドパスフィルタにその蛍光信号を通すことによってフィルタ処理される。包絡線検出器が、その周波数に対応する各ピクセルの振幅を推定するために利用される。

ある実施形態では、上述のシステムは、サンプルの明視野画像を生成するための検出アームと、サンプルの暗視野画像を生成するための別の検出アームとを更に備えている。明視野検出アームは、励起放射（すなわち、結合したＬＯビーム及びＲＦコムビーム）を順方向に、すなわちサンプルがフローセルに入るときの励起放射の伝搬方向に実質的に平行な方向に沿って受けるように、例えばサンプルが流れるフローセルに対して位置付けられることができる。更に、暗視野検出アームは、サンプルがフローセルに入るときの励起放射の伝搬方向に実質的に直交する方向に沿って、サンプルにより散乱した励起放射を受けるように、例えばフローセルに対して位置付けられることができる。

ある実施形態では、明視野検出アーム及び暗視野検出アームの各々は一又は複数のレンズを有しており、レンズは、フローセルを透過した放射又は励起放射の伝搬方向とは異なる方向にサンプルにより散乱した放射を光検出器、例えば光電子増倍管に集束させる。場合により、適したフィルタ、例えばバンドパスフィルタが光検出器の前に設けられて、所望の放射周波数（例えば、励起周波数）を通過させる一方、不要な放射周波数を遮断することができる。

場合により、分析モジュールは、明視野画像及び／又は暗視野画像と蛍光画像との重ね合わせを通じて合成画像を生成するように構成されている。

関連する態様では、フローサイトメトリの方法が開示されており、この方法は、相互に無線周波数シフトされた複数のレーザビーム（ＲＦコムビーム）をトップハット形レーザビーム（ＬＯビーム）に重ね合わせることによって励起ビームを生成するステップであって、励起ビームは少なくとも１つの蛍光色素から蛍光を引き出すことができるステップと、励起ビームをサンプルに導いて、サンプル内に前記蛍光色素があれば蛍光色素を励起して、蛍光色素に蛍光放射を発せさせるステップとを有する。ＬＯビームとＲＦコムビームとの重ね合わせの結果、ＲＦコムビームの周波数とＬＯビームの周波数との差に相当する複数のビート周波数が空間的にエンコードされる。蛍光放射が検出されて周波数多重分離され、サンプルの蛍光画像が生成される。

ある実施形態では、サンプルの明視野画像及び暗視野画像が生成され、明視野画像及び暗視野画像は蛍光画像により与えられる情報を補足することができる。ある実施形態では、上記のシステムは、サンプル上の複数の空間位置で蛍光色素の蛍光寿命測定を行い、蛍光寿命画像を形成するためのサブシステムを更に備えている。サブシステムは光検出器を有しており、光検出器は結合励起ビームを検出して、検出結果に応じて励起信号を生成する。分析モジュールは、光検出器と通信して、検出された励起信号を受けて、その励起信号に関連付けられるビート周波数を多重分離することにより、サンプル上の各空間位置におけるビート周波数の各々の位相を決定する。分析モジュールは、検出された蛍光信号に関連付けられるビート周波数の各々の位相を決定して、結合励起ビームに関連付けられる各周波数の位相を蛍光信号に関連付けられる夫々のビート周波数の位相と比較して、サンプル上の複数の空間位置における蛍光寿命測定を行うように更に構成されている。

関連する態様では、フローサイトメトリを実行するシステムが開示されており、このシステムは、少なくとも１つの蛍光色素の励起に適した周波数を有するレーザビームを生成するためのレーザと、前記レーザビームを受けるように構成された音響光学偏向素子（ＡＯＤ）、好ましくは１つの信号音響光学偏向素子と、一又は複数の駆動信号を前記ＡＯＤに与えるための無線周波数発生器と、３つの動作モードを与えるように前記無線周波数発生器を制御するコントローラとを備えている。動作モードは、前記コントローラが周波数発生器に、複数の無線周波数駆動信号を前記ＡＯＤに同時に与えさせて、サンプルの複数の空間位置を同時に照射するための複数の無線周波数シフトビームを生成させる第１の動作モードと、前記コントローラが周波数発生器に複数の無線周波数駆動信号を前記ＡＯＤに連続的に与えさせて、サンプルに複数の無線周波数シフトビームを異なる時点に照射する第２の動作モードと、前記コントローラが周波数発生器に１つの無線周波数駆動信号を前記ＡＯＤに与えさせて、サンプルに１つの周波数のビームを照射する第３の動作モードとを有する。特定の実施形態では、無線周波数シフトビームで照射される空間位置は１つの次元に沿って設けられ、それによって無線周波数シフトビームは１つの面に沿った２以上の位置に照射される。例えば、無線周波数シフトビームは、流れの長さ方向の軸に直交する面に沿った空間位置を照射してもよい。各無線周波数シフトビームは、サンプルで（例えば流れの表面で）相互に０．００１μｍ以上離間していてもよく、例えば０．００５μｍ以上、例えば０．０１μｍ以上、例えば０．０５μｍ以上、例えば０．１μｍ以上、例えば、０．５μｍ以上、例えば１μｍ以上、例えば２μｍ以上、例えば３μｍ以上、例えば５μｍ以上、例えば１０μｍ以上、例えば１５μｍ以上、例えば２５μｍ以上、５０μｍ以上離間していてもよい。

関連する態様では、システムは、無線周波数シフトビームの一方（ここでは、「ローカルオシレータ（ＬＯ）ビーム」）を受けて、前記ＬＯビームを、他方の周波数シフトビーム（ここでは、「ＲＦコムビーム」）の伝搬経路とは異なる伝搬経路に沿って導くための光学素子を備えることができる。システムは、トップハット強度プロファイルをＬＯビームに付与するためのトップハットビーム整形素子と、第１の動作モードでトップハット形ＬＯビームをＲＦコムビームと結合して、サンプルを照射するための複合励起ビームを形成する一又は複数の光学素子とを更に備えることができる。

以下に簡単に説明する添付図面と共に以下の詳細な説明を参照することにより、本発明の各種の態様を更に理解できる。

本発明のある実施形態によるシステムを概略的に示す。 ビームの伝搬方向に垂直な面内のガウシアンビームの概略的な例示的プロファイルを示す。 図２Ａに示されているガウシアンビームをトップハットビーム整形素子に通し、トップハットビーム整形素子の出力ビームを集束させることによって得られる概略的なトップハットビームプロファイルを示す。 例示的なトップハット整形素子の構成要素を概略的に示す。 複数のＲＦコムビームの断面ビームプロファイルを概略的に示す。 図４に示されているＲＦコムビームと、トップハットビームプロファイルを有するＬＯビームとの重ね合わせを概略的に示す。 分析対象のサンプルを照射する、図５に示されている結合ビームを概略的に示す。 仮の蛍光色素の例示的なエネルギーレベルを概略的に示す。 図７の仮の蛍光色素に対応する吸収曲線を概略的に示す。 蛍光放射を透過させる光ファイバを備えた本教示のある実施形態による検出システムを概略的に示す。 蛍光放射が自由空間を通って伝搬して複数の光検出器に到達する、本教示のある実施形態による別の検出システムを概略的に示す。 本教示のある実施形態で使用するための明視野画像生成アーム及び暗視野画像生成アームを概略的に示す。 明視野画像を生成するための検出アームと、サンプルから散乱した励起放射を検出する能力及びサンプルにより発せられた蛍光放射を検出する能力を統合した検出アームとを有している、本教示のある実施形態で使用するための検出システムを概略的に示す。 本発明によるシステムのある実施形態における光検出器により生成される蛍光信号を増幅器により増幅でき、増幅された信号を分析モジュールにより分析して、分析対象のサンプルの蛍光画像を構成できることを概略的に示す。 複数のＲＦコムビーム及びトップハットプロファイルのＬＯビームから構成されている結合ビームでサンプルを照射することによって得られる蛍光信号を分析するための、本発明のある実施形態による方法の各種のステップを示す。 複数のＲＦコムビーム及びトップハットプロファイルのＬＯビームから構成されている結合ビームでサンプルを照射することによって得られる蛍光信号を分析するための、本発明のある実施形態による方法の各種のステップを示す。 本発明のある実施形態による分析モジュールのある例示的なハードウェア実装のうちの選択された構成要素を概略的に示す。 複数のＲＦコムビーム及びトップハットプロファイルのＬＯビームから構成されている結合ビームでサンプルを照射することによって得られる蛍光信号を分析するための、本発明のある実施形態による別の方法の各種のステップを示す。 複数のＲＦコムビーム及びトップハットプロファイルのＬＯビームから構成されている結合ビームでサンプルを照射することによって得られる蛍光信号を分析するための、本発明のある実施形態による別の方法の各種のステップを示す。 複数のＲＦコムビーム及びトップハットプロファイルのＬＯビームから構成されている結合ビームでサンプルを照射することによって得られる蛍光信号を分析するための、本発明のある実施形態によるまた別の方法の各種のステップを示す。 複数のＲＦコムビーム及びトップハットプロファイルのＬＯビームから構成されている結合ビームでサンプルを照射することによって得られる蛍光信号を分析するための、本発明のある実施形態によるまた別の方法の各種のステップを示す。 １つの励起周波数のトップハットプロファイルのビームによるサンプルの照射を概略的に示す。 蛍光寿命測定及び蛍光寿命撮像を可能にする、本教示のある実施形態によるシステムの概略図である。 本教示のある実施形態によるサイトメトリシステムを用いて得られる、８つの異なるレベルの蛍光染料で染色されたポリスチレンビーズの暗視野強度対明視野強度を示す散布図である。 図１６Ａに示されている長方形の部分をゲートとして使用することによりデータを得た、複数のポリスチレンビーズにより発せられる赤色蛍光（ＰＥ）対緑色蛍光（ＦＩＴＣ）の散布図である。 図１６Ｂに示されているデータに対応するヒストグラムである。 図１６Ｂに示されているデータに対応するヒストグラムである。 本教示によるサイトメトリシステムを使って得られて抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムで染色された、固定された末梢血白血球を含むサンプルの明視野画像、暗視野画像及び蛍光画像を示し、サンプルはＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色された生体ＨｅＬａ細胞の分画も含んでいる。 図１７Ａにより画像が与えられているサンプル中の、集合Ａが白血球を表して集合ＢがＨｅＬａ細胞を表す散布図である。 本教示の実施形態によるサイトメトリシステムを使って得られて抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムで染色された、固定された末梢血白血球を含むサンプルの明視野画像、暗視野画像及び蛍光画像を示し、サンプルは、抗ＥｐＣＡＭ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムで染色された、固定されたＭＣＦ−７細胞のわずかな分画でスパイクされている。 図１８Ａにより画像が与えられているサンプル中の、集合Ａが白血球を表して集合ＢがＭＣＦ−７細胞を表す散布図である。

本教示は一般に、サンプルの蛍光分析を行うための方法及びシステムに関する。後述するように、ある実施形態では、本教示によるシステムはサイトメトリを行うために３つの動作モードで動作できる。以下で本教示を説明するために使用される様々な用語は、特にことわりがないかぎり、当業界における通常の意味を有する。例えば、「蛍光色素」という用語は、本明細書では、当業界での通常の意味に従い、励起放射による照射に応じて放射を発することのできる蛍光化合物を指すために使用される。

「サイトメトリ」及び「フローサイトメトリ」という用語も、当業界における通常の意味に従って使用される。特に、「サイトメトリ」という用語は、細胞を同定及び／又は選別し、又は他の手段で分析するための技術を指すことができる。「フローサイトメトリ」という用語は、流体流に存在する細胞を、例えば細胞を蛍光マーカで標識して放射励起を通じて蛍光マーカを検出することによって同定及び／又は選別し、又は他の手段で分析できるサイトメトリ法を指すことができる。「約」及び「実質的に」という用語は、本明細書では、数値を含む特性に関して最大変化率が１０％又は５％であることを意味する。

図１は、３つの動作モードで動作できる、本教示のある実施形態によるサイトメトリを実行するためのシステム１０を概略的に示す。後でより詳しく述べるように、一動作モードでは、調査対象のサンプルを複数の励起周波数で同時に照射でき、励起周波数の各々は、例えばレーザビームの中心周波数をシフトすることによって得られる。より具体的には、基準レーザビーム（本明細書では、ローカルオシレータビームとも呼ぶ）を複数の無線周波数シフトレーザビームと組み合わせることによって生成されるレーザビームにより複数のサンプル位置を同時に照射でき、それによって各サンプル位置が基準ビーム、及び無線周波数シフトビームの１つにより照射されて、そのサンプル位置に対象の蛍光色素があれば蛍光色素を励起する。ある実施形態では、基準ビームはそれ自体、レーザビームの無線周波数シフトを通じて生成できる。それゆえ、サンプルの各空間位置は、基準ビームの周波数と無線周波数シフトビームの１つの周波数との差に対応する異なるビート周波数で「タグ付け」できる。換言すれば、蛍光色素により発せられる蛍光放射はビート周波数を空間的にエンコードする。蛍光放射を検出でき、その周波数成分を分析してサンプルの蛍光画像を構成できる。

別の動作モードでは、サンプルはある時間間隔に亘り複数の励起周波数のレーザビームにより連続的に照射され得る。このようなある実施形態では、励起周波数は、レーザビームを受ける音響光学偏向素子（ＡＯＤ）に、時間的に変化する駆動信号を与えることによって得られる。多くの実施形態では、レーザビームは、数百テラヘルツ（ＴＨｚ）の範囲、例えば約３００ＴＨｚ〜約１０００ＴＨｚの範囲の周波数を有する。ＡＯＤに与える駆動信号は典型的には、無線周波数範囲、例えば約１０ＭＨｚ〜約２５０ＭＨｚの範囲内にある。レーザビームがＡＯＤを通過すると、複数の回折ビームが生成され、回折ビームの各々は異なる回折次数に対応する。ゼロ次回折ビームは入射レーザビームの周波数に対する周波数シフトを示さないが、より高次の回折ビームは、駆動信号の周波数又はその倍数に相当する入射レーザビームの周波数に対する周波数シフトを示す。ある実施形態では、駆動信号によりシフトされた入射レーザビームの周波数に相当する周波数を有する一次回折ビームは、分析対象のサンプルに対象の蛍光色素があれば、その蛍光色素を励起するための励起ビームとして利用される。駆動信号は経時的に変化するため、一次回折ビームの周波数及び角度シフトも変化し、それによって様々な位置における様々な励起周波数でのサンプルの照射が可能になる。照射された各位置からの蛍光放射があると、その蛍光放射を集めて分析し、サンプルの蛍光画像を構成できる。

また別の動作モードでは、システム１０は１つの励起周波数によってサンプルの複数の位置を同時に照射するように動作でき、励起周波数は、例えばレーザビームの中心周波数を無線周波数でシフトすることにより発生し得る。例えば、サンプルの水平範囲は、１つの励起周波数のレーザビームで照射され得る。検出された蛍光放射は、サンプル、例えば細胞／粒子の蛍光含有量を分析するために使用できる。

従って、システム１０の１つの利点は、後述する利点の中でもとりわけ、システム１０が異なるモートで蛍光放射データを取得することで大幅な適応性を有し、異なる動作モード間で切り替える際に別の機器を利用したり、システムに何らかの機械的調整を加えたりする必要がないという点である。

特定の実施形態では、システムは一又は複数の光源を備えている。ある例では、光源は、狭帯域波長ＬＥＤ、レーザが含まれるが、これらに限定されない狭帯域光源、一又は複数の光学バンドパスフィルタ、回折格子、モノクロメータに連結された広帯域光源、又は、組み合わせることによって狭い帯域幅の照射光を生成するこれらのあらゆる組合せである。ある例では、光源は、単波長のダイオードレーザ（例えば４８８ｎｍレーザ）等の単波長レーザである。ある実施形態では、本システムは１つの光源（例えばレーザ）を備えている。他の実施形態では、本システムは２以上の異なる光源を備えており、例えば３以上の異なる光源、４以上の異なる光源、５以上の異なる光源を備えている。例えば、システムは、第１の波長を出力する第１の光源（例えばレーザ）と第２の波長を出力する第２の光源とを備えてもよい。他の実施形態では、システムは、第１の波長を出力する第１の光源、第２の波長を出力する第２の光源、及び第３の波長を出力する第３の光源を備えている。

各光源は、３００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の波長を有してもよく、例えば３５０ｎｍ〜９５０ｎｍ、例えば４００ｎｍ〜９００ｎｍ、４５０ｎｍ〜８５０ｎｍの範囲の波長を有してもよい。特定の実施形態では、光源は、一又は複数の蛍光色素の最大吸収に対応する波長を有する（後述のとおり）。例えば、光源は２８０〜３１０ｎｍ、３０５〜３２５ｎｍ、３２０〜３５０ｎｍ、３４０〜３７５ｎｍ、３７０〜４２５ｎｍ、４００〜４５０ｎｍ、４４０〜５００ｎｍ、４７５〜５５０ｎｍ、５２５〜６２５ｎｍ、６２５〜６７５ｎｍ及び６５０〜７５０ｎｍのうちの一又は複数の範囲内の波長を有する光を出力してもよい。特定の実施形態では、各光源は、３４８ｎｍ、３５５ｎｍ、４０５ｎｍ、４０７ｎｍ、４４５ｎｍ、４８８ｎｍ、６４０ｎｍ及び６５２ｎｍから選択される波長を有する光を出力する。

システム１０は、レーザビーム１４を生成するレーザ放射源１２を備えている。例として、レーザビームは、約３００ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲内の真空波長に相当する約１０００ＴＨｚ〜約３００ＴＨｚの範囲の波長を有することができる。レーザビームのビーム径（例えば、ガウシアンレーザビームが使用される場合はビームウエスト）は、例えば約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲とすることができる。一般性を損なうことなく、この実施形態では、レーザ放射源１２は４８８ｎｍの波長の放射を約１ｍｍのビーム径で発する。

レーザビームの周波数は、そのシステムが意図されている一又は複数の特定の用途に基づいて選択できる。具体的には、後でより詳しく述べるように、レーザ周波数は、例えば放射の吸収を通じて対象の蛍光色素の電子移動を励起するのに適しており、蛍光色素がより低い周波数で蛍光放射を発するような周波数とすることができる。様々なレーザ源を利用できる。このようなレーザ源のある例には、米国カリフォルニア州サンタクララのＣｏｈｅｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．が販売するＳａｐｐｈｉｒｅ ４８８−ＳＦ、Ｇｅｎｅｓｉｓ ＭＸ−４８８−１０００−ＳＴＭ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．）、ＯＢＩＳ ４０５−ＬＸ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州サクラメントのＶｏｒｔｒａｎ Ｌａｓｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．が販売するＳｔａｄｕｓ ４０５−２５０、及び米国カリフォルニア州アーヴィンのＮｅｗｐｏｒｔ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＬＱＣ−６６０−１１０が含まれるが、これらに限定されない。一般性を損なうことなく、この実施形態では、レーザビームはレーザビームの伝搬方向に垂直な面にガウシアン強度プロファイルを有すると仮定される。

ミラー１６がレーザビーム１４を受けて、反射を通じてレーザビームを音響光学偏向素子（ＡＯＤ）１８に導く。この実施形態では、ＡＯＤ １８は、調節可能なポストホルダマウント（Ａ）に取り付けられており、それによってＡＯＤはレーザビーム１４の伝搬方向に垂直な軸を中心として回転できる。コントローラ２１の制御下で動作するダイレクトデジタルシンセサイザ（ＤＤＳ）２０が、１又は複数の駆動信号をＡＯＤ １８に与えることができる。例として、ある実施形態では、これらの駆動信号は、約５０ＭＨｚ〜約２５０ＭＨｚの範囲の周波数に及ぶことができる。例えば、ＡＯＤに与えられる駆動信号は、５５ＭＨｚ〜２２５ＭＨｚであってもよく、例えば６０ＭＨｚ〜２００ＭＨｚ、例えば６５ＭＨｚ〜１７５ＭＨｚ、例えば７０ＭＨｚ〜１５０ＭＨｚ、７５ＭＨｚ〜１２５ＭＨｚであってもよい。ある実施形態では、駆動信号は、約０．１ＭＨｚ〜約４ＭＨｚの範囲の周波数だけ相互に分離していてもよい。例えば、駆動信号は、約０．２ＭＨｚ〜約３．９ＭＨｚの周波数だけ相互に分離していてもよく、例えば約０．３ＭＨｚ〜約３．８ＭＨｚ、例えば約０．４ＭＨｚ〜約３．７ＭＨｚ、例えば約０．５ＭＨｚ〜約３．６ＭＨｚ、約１ＭＨｚ〜約３．５ＭＨｚの周波数だけ相互に分離していてもよい。この実施形態では、電子電力増幅器２０１が、ＤＤＳ ２０により生成された無線周波数信号をＡＯＤ １８に与えるために増幅する。

サンプルが複数の励起周波数で同時に照射される動作モードでは、ＲＦコム発生器２０は、複数のＲＦ駆動信号を同時にＡＯＤ １８に与える。例として、同時に与えられるＲＦ駆動信号の数は約２０〜約２００の範囲とすることができる。レーザビームと駆動信号との相互作用の結果、レーザ放射源１２により生成されるレーザビームの周波数に対して駆動信号の１つに対応する周波数シフトを夫々有する複数の角度分離したレーザビームが生成される。いかなる特定の理論にも限定されることなく、ＡＯＤでは、圧電トランスデューサがクリスタル、例えばクォーツクリスタル内で無線周波数フォノンを生成でき、このような無線周波数フォノンによるレーザビームの光子の散乱によって、周波数シフトレーザビームを生成できる。これらの周波数シフトレーザビームのうちの１つである２２を本明細書では「ローカルオシレータ」（ＬＯ）ビームと呼び、周波数シフトレーザビームの残りである２４を本明細書では、「ＲＦコムビーム」と呼ぶ。周波数シフトレーザビームの角度分離は、例えば約１ミリラジアン〜約１００ミリラジオンの範囲とすることができる。例えば、周波数シフトレーザビームの角度分離は、２ミリラジアン〜約９５ミリラジアンの範囲であってもよく、例えば３ミリラジアン〜約９０ミリラジアン、例えば４ミリラジアン〜約８５ミリラジアン、例えば５ミリラジアン〜約８０ミリラジアン、１０ミリラジアン〜約７５ミリラジアンの範囲であってもよい。

ＬＯビーム及びＲＦコムビームはレンズ２６を通過する。レンズ２６は、この実施形態では焦点距離が約５０ｍｍの収束レンズである。レンズ２６を通過すると、ＬＯレーザビームはミラー２８により遮断され、ミラー２８はＬＯビームを異なる方向（この実施形態ではＬＯビームの当初の伝搬方向に実質的に直交する方向）に変える。ミラー２８は、ＲＦコムビームがミラー２８を通らず、レンズ３０（この実施形態では焦点距離２００ｍｍを有する）に伝搬するようにＲＦコムビームに対して位置付けられている。このようにして、ＬＯビーム及びＲＦコムビームは、異なる伝搬方向に沿って導かれる。上記で開示された方法でピックオフミラー２８を使用することにより、１つのＡＯＤを利用して、ＬＯビーム及びＲＦコムビームの両方を生成し、これらを以下の方法で結合して、サンプルを照射するための励起ビームを生成することができる。複数のＡＯＤ（例えば２つのＡＯＤ、つまり、ＬＯビームを生成するための一方のＡＯＤ及びＲＦコムビームを生成するための他方のＡＯＤ）を使用するのではなく、１つのＡＯＤを使用することにより、システムの構成が単純となり、更に後でより詳しく説明するように、複数の異なる動作モードでシステムを効率的に使用できることになる。

ある実施形態では、ＬＯビームのビームプロファイルは、ＲＦコムビームと再結合する前に変調される。例えば、ＬＯビームのビームプロファイルは、ビームの空間寸法、ビーム形状、強度、空間分布又はこれらのあらゆる組合せで調整（増減）されてもよい。特定の実施形態では、ＬＯビームのビームプロファイルの空間寸法が変調される。例えば、ビームプロファイルは、一又は複数の寸法で、例えば流れの長さ方向の軸に直交する軸に沿ってビームプロファイルを長くするように調整されてもよい。これらの実施形態の一例では、ビームプロファイルの空間寸法（例えば、一又は複数の寸法）は、１％以上増大してもよく、例えば２％以上、例えば３％以上、例えば５％以上、例えば１０％以上、例えば２５％以上、例えば５０％以上、例えば７５％以上、例えば９０％以上、例えば１．５倍以上、例えば２倍以上、例えば３倍以上、５倍以上増大してもよい。これらの実施形態による別の例では、ビームプロファイルの空間寸法（例えば、一又は複数の寸法）は、１％以上減少してもよく、例えば２％以上、例えば３％以上、例えば５％以上、例えば１０％以上、例えば２５％以上、例えば５０％以上、例えば７５％以上、例えば９０％以上、例えば１．５倍以上、例えば２倍以上、例えば３倍以上、５倍以上減少してもよい。

他の実施形態では、ＬＯビームのビーム形状が変調される。例えば、ビーム形状は、ビームプロファイルが一又は複数の寸法で長いように変調されてもよい。特定の例では、ＬＯビームのビーム形状は、ＬＯビームの伝搬方向に垂直な面内で長くされる。特定の実施形態では、ＬＯビームプロファイルの形状は、円形のビームプロファイルから、流れの長さ方向の軸に直交する軸に長い楕円形ビームプロファイルへと変えられる。他の実施形態では、ＬＯビームプロファイルの形状は、円形のビームプロファイルから、流れの長さ方向の軸に直交する軸に長い寸法を有する長方形のビームプロファイルに変えられる。

また別の実施形態では、ＬＯビームの強度が変調される。例えば、ＬＯビームの強度は、例えば１％以上、例えば２％以上、例えば３％以上、例えば５％以上、例えば１０％以上、例えば２５％以上、例えば５０％以上、例えば７５％以上、例えば９０％以上、例えば１．５倍以上、例えば２倍以上、例えば３倍以上、５倍以上増大してもよい。他の実施形態では、ＬＯビームの強度は、例えば１％以上、例えば２％以上、例えば３％以上、例えば５％以上、例えば１０％以上、例えば２５％以上、例えば５０％以上、例えば７５％以上、例えば９０％以上、例えば１．５倍以上、例えば２倍以上、例えば３倍以上、５倍以上減少する。特定の実施形態では、ＬＯビームの強度は、ＲＦコムビームの強度と一致するように変調される。例えば、ＬＯビームは、ＲＦコムビームの強度と１０％以下だけ異なる強度を有してもよく、例えば９％以下、例えば８％以下、例えば７％以下、例えば６％以下、例えば５％以下、例えば４％以下、例えば３％以下、例えば２％以下、例えば１％以下、例えば０．０１％以下だけ異なる強度を有してもよく、ＬＯビームの強度がＲＦコムビームと０．００１％以下だけ異なる場合を含む。特定の例では、ＬＯビーム及びＲＦコムビームの強度は同じである。

また別の実施形態では、ビームプロファイルの空間分布も変調されてよい。例えば、ＬＯビームは、ＬＯビームの強度が一又は複数の寸法でガウシアンではなくなるように変調されてもよい。例えば、ＬＯビームは、流れの長さ方向の軸に平行な第１の軸に沿ってガウシアン分布を有して、流れの長さ方向の軸に直交する第２の軸に沿ってガウシアン分布を有さないように変調されてもよい。

あらゆるビーム整形プロトコルを使用してＬＯビームのビームプロファイルを変調してもよく、ビーム整形プロトコルには、屈折ビーム整形プロトコル及び回折ビーム整形プロトコルが含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、ＬＯビームはトップハットビーム整形素子により変調される。

この実施形態では、ＬＯビームは、他の収束レンズ３２（この実施形態では約２００ｍｍの焦点距離）へと伝搬する。レンズ２６及び収束レンズ３２の組合せにより、ＬＯビームを拡大してコリメートし、それによってトップハットビーム整形素子３４の裏面開口を適切に満たす。より具体的には、ＬＯビーム２２は収束レンズ３２を通過し、ミラー３３及びミラー３５によってトップハットビーム整形素子３４に反射する。

トップハットビーム整形素子３４は、ガウシアンＬＯビームの同位相波面を整形して、トップハット強度プロファイルの形成を可能にする。より具体的には、トップハットビーム整形素子から出たＬＯレーザビーム２２’はビームスプリッタ４４により反射して、レンズ４６（この実施形態では１００ｍｍの焦点距離）により中間像面４８に集束される。中間像面４８上のレーザビームは、ビームの伝搬方向に垂直な面に水平方向に沿ってトップハット強度プロファイルを有する。ＡＯＤ １８と同様に、この実施形態では、ビームスプリッタ４４は調節可能なポストホルダマウント（Ｂ）に取り付けられている。この実施形態では、トップハットビーム整形素子は、放射の偏光がビームのトップハット方向に沿って（この実施形態では水平方向に沿って）実質的に均一であるトップハットビームプロファイルを生成する。

例示として、図２Ａは、ＬＯレーザビームがトップハットビーム整形素子に入るときのＬＯレーザビームのガウシアン強度プロファイルを概略的に示している。図２Ｂに概略的に示されているように、ＬＯレーザビームは、水平方向に（この図ではページに垂直な方向に）延ばされて、プロファイルを通じて延びている各水平ライン、例えば水平ラインＡに沿って実質的に一定であるが、縦方向にはガウシアンプロファイルに従って変化するビームプロファイルを中間像面４８に示す。

様々なトップハットビーム整形素子を利用できる。例として、非球面を有する屈折光学素子又は回折光学素子を使って、適した空間同位相波面を有するビームを生成でき、このビームは、レンズによる集束後にレンズの焦点面にトップハットプロファイルパターンを生成する。このようなトップハットビーム整形素子には複数の形状因子があり、この方法の様々な実施を本教示の各種の実施形態でサンプルでの適したＬＯビーム形状を生成するために利用できる。例えば、“Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｔｈａｔ ｃｏｎｖｅｒｔｓ ａ ｌａｓｅｒ ｂｅａｍ ｔｏ ａ ｃｏｌｌｉｍａｔｅｄ ｆｌａｔ−ｔｏｐ ｂｅａｍ”と題する米国特許第６２９５１６８号明細書、及び“Ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｒ ｆｌａｔ−ｔｏｐ ｂｅａｍ ｓｈａｐｅｒ”と題する米国特許第７４００４５７号明細書は、何れもその全体が参照によって本願に援用され、本教示のある実施形態によるシステムにフラットトップビーム整形素子として使用できるビーム整形システムを開示している。例示として、図３は、米国特許第７４００４５７号明細書の図１を再現したものであり（参照番号は異なる）、方形ビーム又は矩形ビームを与えるためのビーム整形システム３００を概略的に示しており、ビーム整形システム３００は、直交するように配置された２つの非球面シリンドリカルレンズ３０２、３０４を有している。第１の非球面シリンドリカルレンズ３０２はＸ軸に沿って入射ビームＡを整形するためのレンズであり、第２の非球面シリンドリカルレンズ３０４はＹ軸に沿って入射ビームＡを整形するためのレンズである。２つの交差する非球面シリンドリカルレンズは、Ｘ軸に沿ってフラットトッププロファイルを有する矩形レーザビームＢを与えるように構成されている。第１の非球面シリンドリカルレンズ３０２の入射面３０２ａは、表面の中心でより小さくレンズの両端に向かって滑らかに増大する可変曲率半径を有する非球面シリンドリカル凸面である。第２の非球面シリンドリカルレンズ３０４は、第１の非球面シリンドリカルレンズ３０２と同様であるが、第１の非球面シリンドリカルレンズ３０２に対して直交して配置されてＹ軸に沿ってビームを整形する。非球面シリンドリカルレンズ３０２、３０４の入射面３０２ａ／３０４ａ及び出射面３０２ｂ／３０４ｂのプロファイルは、入射ビームＡのＸプロファイル及びＹプロファイルと、結果として得られる矩形レーザビームＢの所望の強度プロファイルとに応じて独立して選択可能である（例えば、同特許の５欄及び６欄参照）。

利用可能な市販のトップハットビーム整形素子の一例は、例えば、カナダ，ラシーヌのＯｓｅｌａ，Ｉｎｃ．が販売するＤＴＨ−１Ｄ−０．４６ｄｅｇ−４ｍｍである。

後でより詳しく述べるように、ビーム整形素子を使ってＬＯビームを水平方向に沿って延ばすことにより、多くの利点が提供される。例えば、ＬＯビーム及びＲＦコムビームの組合せが実質的に同様の照度で複数のサンプル位置を照射して、ＬＯビームの強度及びＲＦコムビームの強度をサンプル位置全体に亘って一致させることにより、高い変調度での蛍光信号の強度振幅変調をもたらすことが保証され得る。このような強度の一致が行われないと、撮像システムは、視野が小さくなるかもしれず、ＡＯＤを駆動する周波数（ピクセル）の全てを使用しないかもしれない。蛍光信号の変調度は、システムがサンプルの蛍光画像を再構成する能力で重要な役割を果たすため、全てのピクセルにおける励起ビート周波数の均一な高い変調度は、システムの動作にとって特に有利である。更に、ＲＦコムビームを生成するためにＡＯＤに与えられる電子信号の振幅は、ダイレクトデジタルシンセサイザの出力を（例えばコントローラ２１を使って）制御し、ＲＦコムビームの強度が、ＲＦコムビーム及びＬＯビームが重なり合う全ての空間位置に亘ってＬＯビームの強度と等しくなるようにＲＦコムビームを均等化することによって調整され得る。この特徴は、蛍光放射の強度振幅変調の高い変調度が確保されるという利点を提供する。

図１を再び参照すると、ＲＦコムビーム２４は、レンズ２６及びレンズ３０の組合せを通じて、中間像面３８に結像される。より具体的には、ＲＦコムビーム２４はレンズ２６を通過し、ミラー２８を避けてレンズ３０に到達し、レンズ３０がＲＦコムビームを、ミラー４０、４２を通じて中間像面３８に導く。

図４は、中間像面３８における例示的な数のＲＦコムビームの分布を概略的に示している（一般性を損なうことなく、ＲＦコムビームの数は、例示を目的として６（ＲＦ１，．．．，ＲＦ６と表示）が選択されているが、他の数も利用できる）。図４に示されているように、ＲＦコムビーム２４は、中間像面３８で水平方向に沿って相互に空間的に分離している。他の実施形態では、ＲＦコムビーム２４のうちの２以上は部分的に重なり合ってもよい。それゆえ、レンズ２６及びレンズ３０の組合せは、角度分離したＲＦコムビームを、水平方向の範囲に亘って空間的に分離した一組のビームに変換する。

図１を再び参照すると、前述のように、ビームスプリッタ４４は、トップハットビーム整形素子３４から出たレーザビーム２２’を受けて、そのレーザビームをレンズ４６に反射し、レンズ４６が今度はそのレーザビームを中間像面４８に集束させ、中間像面４８でＬＯビームはトップハットビームプロファイルを示す。ビームスプリッタ４４はまた、中間像面３８からＲＦコムビーム２４を受けて、ＲＦコムビームがビームスプリッタ４４を通過できる。レンズ４６はＲＦコムビーム２４を中間像面４８に集束させて、ＲＦコムビーム２４がトップハットビームプロファイルを有するＬＯビームと結合して結合ビーム４９が生成される。

例示として、図５は、結合ビーム４９の伝搬軸に垂直な面内における結合ビーム４９の１つの例示的プロファイルを概略的に示す。結合ビームの強度プロファイルは、トップハットＬＯビームの強度プロファイル（四角形で概略的に示されている）及びＲＦコムビーム２４の強度プロファイル（各々が円の１つで概略的に示されている）の重ね合わせとして生成される。後でより詳しく述べるように、ＬＯビームとＲＦコムビームとのこの重ね合わせにより、水平範囲に沿った１つの空間位置に夫々対応する複数のビート周波数がその水平範囲に沿って与える。サンプルの水平範囲を照射すると、サンプルのある位置から発せられた蛍光放射は、振幅変調を通じて、その位置を照射する放射に関連付けられるビート周波数をエンコードする。

再び図１を参照すると、収束レンズ５０（この実施形態では２００ｍｍレンズ）と、この実施形態では調節可能なポストホルダマウントＣに取り付けられている対物レンズ５２とが、中間像面４８の画像をフローセル５４を通って流れるサンプルへと中継するためのテレスコープを形成する。この実施形態では、ミラー５６が結合ビーム４９を収束レンズ５０に反射して、結合ビームが収束レンズ５０を通過した後、ダイクロイックミラー５８が結合ビームを対物レンズ５２に反射する。

図６に概略的に示されているように、結合ビーム４９は、フローセル５４を通って流れるサンプル６２の複数の空間位置６０を同時に照射する。それゆえ、各空間位置６０は、ＲＦコムビームの１つとトップハット形ＬＯレーザビームの一部との重なり合いによって照射される。これらの空間位置で、放射はサンプル内に対象の蛍光色素があれば、その蛍光色素を励起する。より具体的には、この実施形態では、ＬＯビーム及びＲＦコムビームは、例えば蛍光色素を励起させた電子状態に電子遷移することを通じて、蛍光色素をサンプルの複数の空間位置６０で同時に励起する。

ある実施形態では、サンプルは、複数の細胞が取り込まれている流れる流体を含むことができる。場合により、細胞は一又は複数の蛍光マーカ（蛍光色素）で標識することができる。蛍光マーカのある例には、蛍光たんぱく質（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ）、蛍光色素で標識された抗体（例えば、蛍光イソチオシアネート）（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、核酸染料（例えば、４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ））、ＳＹＴＯ１６、ｐｒｏｐｉｅｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）、細胞膜染料（例えば、ＦＭＩ−４３）及び細胞機能染料（例えば、Ｆｌｕｏ−４、Ｉｎｄｏ−１）が含まれるが、これらに限定されない。別の場合では、細胞内に存在する内的蛍光色素を利用して、その細胞からの蛍光放射を引き出すこともできる。後でより詳しく述べるように、このような外的蛍光色素又は内的蛍光色素は、照射する放射に応じて電子励起を生じさせて蛍光放射（典型的には、励起周波数より低い周波数の蛍光放射）を発し、その蛍光放射が集められて分析される。

例示として、いかなる特定の理論にも限定されることなく、図７は、蛍光色素の基底電子状態Ａと２つの励起電子状態Ｂ、Ｃとに対応する仮定のエネルギーレベルを示している。蛍光色素は、基底電子状態（Ａ）から励起電子状態（Ｂ）へと放射エネルギーの吸収を介して励起され得る。蛍光色素はその後、例えば蛍光色素の振動モードによる無放射遷移によって、より低い励起電子状態Ｃへと緩和され得る。蛍光色素は、光遷移によって、より低い励起電子状態Ｃから基底電子状態に更に緩和されることができ、それによって励起周波数より低い周波数の蛍光放射を発する。理解すべき点として、この仮定の例は説明を目的として与えられているにすぎず、蛍光放射を発することのできる唯一の機構を示しているのではない。

多くの場合、蛍光色素は、基底電子状態から励起電子状態に励起する周波数範囲の電磁放射を吸収できる。例示として、図８は、図７に関連して説明した仮の蛍光色素に関する吸収曲線を示す。本教示によるある実施形態の一実施例では、ＬＯ周波数は、対象の蛍光色素の吸収ピークに対応する周波数と一致するように選択できる。無線周波数シフトビームは、夫々のビート周波数だけ、吸収ピークから分離した周波数を有することができる。典型的には、これらの周波数分離は、励起周波数が一切低下しないように蛍光色素の吸収バンド幅と比較して小さい。例として、あくまでも例示として、破線Ａ、ＢはＬＯビームの周波数及びＲＦコムビームの１つの周波数を概略的に示している（説明しやすさのために、図面は正確な縮尺で描かれていない）。サンプルの空間位置をＬＯレーザビーム及び図示のＲＦコムビームの１つの両方で同時に照射することにより、蛍光放射は、ＬＯビームの周波数とＲＦコムビームの周波数との差に相当するビート周波数での振幅変調を示す。

再び例示のために、いかなる特定の理論にも限定されることなく、ＬＯビームとＲＦコムビームの１つとにより同時照射を通じて蛍光色素に生じさせる電界は、数学的に以下のように定義できる。

式（１）中、
Ｅ_com は、結合ビームの電界を指す。
Ｅ_RFは、ＲＦコムビームの１つに関連付けられる電界の振幅を指す。
Ｅ_LOは、ＬＯビームに関連付けられる電界の振幅を指す。
Φ₀ は、レーザ放射源１２により発せられるレーザビームの周波数を指す。
Φ_RFは、ＲＦコムビームに関連付けられる周波数シフトを指す。
Φ_LOは、ＬＯビームに関連付けられる周波数シフトを指す。

ＬＯビームの電界及びＲＦコムビームの電界の重ね合わせに応じて発せられる蛍光放射の強度は、（ω_RF−ω_LO）に相当するビート周波数での変調を示す。従って、ＬＯビームとＲＦコムビームの１つとの重ね合わせにより照射されるサンプルの各空間位置から発せられる蛍光放射は、ＬＯビームに関連付けられる無線周波数シフトとその空間位置を照射しているＲＦコムビームに関連付けられる無線周波数シフトとの差に対応するビート周波数での変調を示す。

蛍光の放射のプロセスには有限の時間量（典型的には、一般的な有機蛍光色素の場合は１〜１０ナノ秒）が必要であるため、発せられる蛍光は、励起ビート周波数が高すぎると、高い変調度を示さない。それゆえ、多くの実施形態では、励起ビート周波数は１／τ_f よりはるかに低くなるように選択され、τ_f は蛍光色素の特徴的な蛍光寿命である。ある例では、励起ビート周波数は１／τ_f より１％以上低くてもよく、例えば２％以上、例えば３％以上、例えば５％以上、例えば１０％以上、例えば２５％以上、例えば５０％以上、例えば７５％以上、例えば９０％以上、例えば１．５倍以上、例えば２倍以上、例えば３倍以上、５倍以上低くてもよい。例えば、励起ビート周波数は、１／τ_f より０．０１ＭＨｚ以上低くてもよく、例えば０．０５ＭＨｚ以上、例えば０．１ＭＨｚ以上、例えば０．５ＭＨｚ以上、例えば１ＭＨｚ以上、例えば５ＭＨｚ以上、例えば１０ＭＨｚ以上、例えば２５ＭＨｚ以上、例えば５０ＭＨｚ以上、例えば１００ＭＨｚ以上、例えば２５０ＭＨｚ以上、例えば５００ＭＨｚ以上、７５０ＭＨｚ以上低くてもよい。

実施形態では、光検出器は、照射されたサンプルからの光（例えば、蛍光等の発光）を検出するように構成されている。実施形態では、光検出器は、一又は複数の検出器を有してもよく、例えば２以上の検出器、例えば３以上の検出器、例えば４以上の検出器、例えば５以上の検出器、例えば６以上の検出器、例えば７以上の検出器、８以上の検出器を有する。あらゆる光検出プロトコルが利用されてもよく、これらには幾つかある光検出器の中でも特に、能動ピクセルセンサ（ＡＰＳ）、４分割フォトダイオード、イメージセンサ、電界結合素子（ＣＣＤ）、増強電荷結合素子（ＩＣＣＤ）、発光ダイオード、フォトンカウンタ、ボロメータ、焦電型検出器、フォトレジスタ、太陽電池、フォトダイオード、光電子増倍管、フォトトランジスタ、量子ドットフォトコンダクタ又はフォトダイオード及びこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、対象の光検出器は３５０ｎｍ〜１２００ｎｍの範囲の光を検出するように構成されており、例えば４５０ｎｍ〜１１５０ｎｍ、例えば５００ｎｍ〜１１００ｎｍ、例えば５５０ｎｍ〜１０５０ｎｍ、例えば５００ｎｍ〜１０００ｎｍ、４００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲の光を検出するように構成されている。特定の実施形態では、光検出器は、最大発光波長の光を検出するように構成されており、例えば３９５ｎｍ、４２１ｎｍ、４４５ｎｍ、４４８ｎｍ、４５２ｎｍ、４７８ｎｍ、４８０ｎｍ、４８５ｎｍ、４９１ｎｍ、４９６ｎｍ、５００ｎｍ、５１０ｎｍ、５１５ｎｍ、５１９ｎｍ、５２０ｎｍ、５６３ｎｍ、５７０ｎｍ、５７８ｎｍ、６０２ｎｍ、６１２ｎｍ、６５０ｎｍ、６６１ｎｍ、６６７ｎｍ、６６８ｎｍ、６７８ｎｍ、６９５ｎｍ、７０２ｎｍ、７１１ｎｍ、７１９ｎｍ、７３７ｎｍ、７８５ｎｍ、７８６ｎｍ、８０５ｎｍの光を検出するように構成されている。

ある実施形態では、サンプルにより発せられる蛍光放射は、例えば励起ビームの伝搬方向に垂直な光路に沿って様々な方法で集められることができる。他の実施形態では、蛍光放射はエピ方向に検出される。

図１を再び参照すると、この実施形態では、照射されたサンプルにある一又は複数の蛍光色素により発せられた蛍光放射は対物レンズ５２を通過し、ダイクロイックミラー５８を透過して光検出器６４に到達する。より具体的には、この実施形態では、レンズ６５がダイクロイックミラー５８を透過した蛍光放射をスリット開口６６に集束させる。スリット開口６６を透過した蛍光放射は蛍光放射フィルタ６８を通り、光検出器６４に到達する。光検出器の前に設けられたスリット開口６６（又は後述する他の実施形態では光学フィルタ）により、サンプルの特定の面から発せられる蛍光放射は通過する一方、その面以外からの蛍光放射は遮断されることができる。更に、蛍光放射フィルタ６８、例えばバンドパスフィルタにより、蛍光放射は光検出器６４に通過する一方、他の周波数の放射の通過は実質的に遮断されることができる。

光検出器６４は、ビート周波数の範囲全体からの信号を検出して透過させるのに十分なＲＦバンド幅を有する。適した光検出器のある例にはとりわけ、光電子増倍管、アバランシェフォトダイオード、ＰＩＮフォトダイオード及びハイブリッド光検出器が含まれるが、これらに限定されない。例として、ある実施形態では、浜松ホトニクスが販売する光電子増倍管（例えば、Ｒ３８９６、Ｒ１０６９９、Ｈ１１４６２）を使用できる。光検出器は、受けた蛍光放射の検出結果に応じて信号、例えばこの実施形態ではアナログ信号を生成する。

他の例として、図９Ａを参照すると、ＬＯビームと空間的に分離したＲＦコムビームとによる同時照射に応じてサンプルにより発せられた蛍光放射は、対物レンズ５２及びダイクロイックミラー５８を通過し、基端１０２ａから末端１０２ｂへと延びているマルチモード光ファイバ１０２にレンズ１００を介して導かれる。より具体的には、マルチモード光ファイバ１０２の基端１０２ａは、レンズ１００の焦点面に近接して位置付けられて蛍光放射を受ける。光取出しレンズ１０４が光ファイバの末端１０２ｂに連結されており、ファイバから出た放射をコリメートする。

多くの場合、サンプルを照射する励起放射は、十分に広い放射吸収スペクトルを有することができる複数の蛍光色素（例えば、有機蛍光色素）を励起し、それによって励起周波数はサンプル内の複数の蛍光色素の吸収スペクトル内に含まれる。すると、各蛍光色素は異なる周波数の蛍光放射を発する。一般性を損なうことなく、また例示を目的として、この実施形態では、検出システムは４つの光電子増倍管１０６、１０８、１１０、１１２を有しており、光電子増倍管の各々がコリメートされた放射のうち、照射されたサンプルの中の励起放射により励起した４つの蛍光色素の中の１つにより発せられる蛍光放射に対応する部分を受ける。より具体的には、ダイクロイックミラー１１４が、蛍光色素の１つにより発せられた第１の周波数の蛍光放射を光電子増倍管１０６に反射する一方、他の周波数の蛍光放射は透過することができる。別のダイクロイックミラー１１６が、異なる蛍光色素により発せられた異なる第２の周波数の蛍光放射を光電子増倍管１０８に反射する一方、また別の蛍光色素により発せられた第３の周波数の蛍光放射を含む、放射の残りの部分が第３のダイクロイックミラー１１８に到達して、第３のダイクロイックミラー１１８がその蛍光放射を光電子増倍管１１０に反射することができる。第３のダイクロイックミラー１１８は、第４の蛍光色素により発せられた第４の放射周波数の蛍光放射を含む放射の残りの部分を透過させて光電子増倍管１１２に到達させることができる。

複数のバンドパスフィルタ１２０、１２２、１２４、１２６は、４つの蛍光周波数のうちの１つに夫々中心を置き、光電子増倍管１０６、１０８、１１０、１１２の前に夫々設けられている。光電子増倍管の各々により検出された信号は、後述するように分析されて、夫々の蛍光周波数で蛍光画像が生成される。ある実施形態では、複数の光検出器を使用するのではなく、１つの光検出器、例えば１つの光電子増倍管を使って、蛍光放射、例えば１つの蛍光色素からの発光に対応する蛍光周波数を検出できる。

ある実施形態では、サンプルがフローセルの中を流れているとき、サンプルの異なる水平行が照射され、各水平行に関連付けられる蛍光放射が一又は複数の光検出器、例えば光電子増倍管１０６、１０８、１１０、１１２により検出される。

図９Ｂは、図９Ａに関連して上述した検出システムと同様の検出システムを概略的に示しているが、この検出システムは、光ファイバを使用するのではなく、ダイクロイックミラー５８を通過する複数の蛍光色素からの蛍光放射を含む蛍光放射が自由空間を伝搬して光電子増倍管１０６、１０８、１１２に到達する点が異なる。より具体的には、レンズ１００は、蛍光放射をレンズ１００及びレンズ１０４間に配置された開口１２６に集束させ、開口１２６は集束しない放射を遮断できる。レンズ１０４は、開口を通過した放射をコリメートし、コリメートされた放射は、図９Ａに関連して上述したように複数の光電子増倍管の間で分配される。

ある実施形態では、システム１０は、励起放射を使ってサンプルの（サンプルがない場合はフローセルの）暗視野画像及び明視野画像を与えるように構成できる。例として、図９Ｃは、サンプルの暗視野画像及び明視野画像を夫々検出するための２つの検出アーム２００、２０２を備えたシステム１０のある実施形態を概略的に示している。

より具体的には、検出アーム２００は、励起放射の伝搬に垂直に位置付けられ、フローセルを流れるサンプルにより散乱した励起放射の一部を受ける。検出アーム２００は２つのレンズ２０４、２０６を有しており、２つのレンズ２０４、２０６は、サンプルにより散乱した励起放射のうちの少なくとも一部をレンズ２０４により画定される立体角内で光電子増倍管２０８に集合的に導く。より具体的には、レンズ２０４は受けた散乱放射をコリメートし、レンズ２０６がコリメートされた散乱放射を光電子増倍管２０８に収束させる。この実施形態では、適したバンドパスフィルタ２１０が光電子増倍管２０８の前に設けられており、所望の周波数を有する放射を光電子増倍管２０８に通過させる一方、不要な周波数の放射を遮断することができる。光電子増倍管２０８の出力は、例えば後述する分析モジュールにより、当業界で知られている方法で処理して、暗視野画像を生成できる。

検出アーム２０２は２つのレンズ２１２、２１４を有しており、レンズ２１２はフローセルから順方向に（実質的にフローセル５４に入る励起放射の伝搬方向に沿って）出た励起放射をコリメートし、レンズ２１４はコリメートされた放射を光検出器２１６に集束させる。光検出器の前に設けられた適したフィルタ２１８、例えばバンドパスフィルタにより、励起周波数の放射を光検出器２１６に透過させる一方、その他の放射周波数の放射を実質的に遮断することができる。光検出器２１６の出力は、既知の方法で処理してフローセルの明視野画像を生成できる。

従って、検出アーム２００は、セルを通って流れる流体により散乱した励起放射を検出し、検出アーム２０２はフローセルを透過する励起放射を検出する。フローセルの中に流体が流れていないときには、光電子増倍管２０８により検出される信号はローであり、光検出器２１６により検出された信号は、フローセルを通る励起放射の散乱がほとんどなく、従って、励起放射の大きなパーセンテージ、時には全部がフローセル内を流れるときにはハイとなる。これに対して、フローセル内の流体サンプルの流れは、光電子増倍管２０８により生成される信号を、サンプルによる励起放射の一部の散乱によって増大させることができ、光検出器２１６により生成される信号はフローセルを透過する励起放射のレベルの低下に伴って減少する。

別の例として、図９Ｄに関して、本開示によるシステムの一実施形態では、フローセル５４に対して励起放射の伝搬方向に実質的に直交して配置された検出アーム２２０ａが、サンプル内の複数の蛍光色素により発せられる蛍光放射及びサンプルにより散乱する励起放射の両方を検出するための光検出器を有している。より具体的には、検出アーム２２０ａはレンズ２２２、２２４を有しており、レンズ２２２、２２４は蛍光放射及び散乱した励起放射を開口２２６に導き、開口２２６は集束していない放射を遮断する。レンズ２２８は、開口を通過した放射をコリメートする。ダイクロイックミラー２３０が、暗視野画像を検出するために、放射のうち励起周波数の部分を光電子増倍管２３２に反射する一方、蛍光放射を通過させる。光電子増倍管２３２の前に設けられた適したフィルタ２３２ａ、例えばバンドパスフィルタにより、励起周波数の放射は光電子増倍管２３２に通過する一方、不要な放射周波数を遮断することができる。別のダイクロイックミラー２３４が、蛍光色素により発せられた第１の周波数の蛍光放射を光電子増倍管２３６に反射する一方、その他の蛍光色素により他の周波数で発せられた蛍光放射を通過させる。別のダイクロイックミラー２３８が、別の蛍光色素により第２の周波数で発せられた蛍光放射を光電子増倍管２４０に反射する一方、また別の蛍光色素により第３の周波数で発せられた蛍光放射を通過させて、この蛍光放射を光電子増倍管２４２により検出する。上述した実施形態と同様に、複数のフィルタ２３６ａ、２４０ａ、２４２ａが光電子増倍管２３６、２４０、２４２の前に夫々設けられており、所望の周波数の放射を透過させる一方、不要な放射周波数の放射を実質的に遮断する。

引き続き図９Ｄを参照すると、本教示によるシステムのこの実施例には、例えば図９Ｃに関連して説明したように、明視野画像を生成するための別の検出アーム２２０ｂが更に設けられている。より詳しくは、検出アーム２０２ｂは、励起放射の明視野画像を生成するために、光を光検出器２１６へと収束させる２つのレンズ２１２、２１４を有している。フィルタ２１８、例えばバンドパスフィルタが、光検出器２１６の前に設けられており、励起放射を光検出器へと通過させる一方、不要な放射周波数を遮断する。

再び図１と更に図１０とに関して、この実施形態では、光検出器により生成された信号を増幅するために、トランスインピーダンス増幅器７０を光検出器６４（又は図９Ａ〜９Ｄに関連して説明した光検出器の各々）の出力に連結することができる。データ分析ユニット７２（本明細書では、分析モジュール又は分析器とも呼ばれる）が、増幅された信号を受けて、この信号を分析しサンプルの蛍光画像を生成する。データ分析ユニット７２は、ハードウェア、ファームウェア及び／又はソフトウェアで実装できる。例えば、検出された蛍光データを分析する方法を、プロセッサの制御下でアクセスされる分析モジュールのリードオンリメモリ（ＲＯＭ）ユニットに記憶して、受けた蛍光信号を分析することができる。

後でより詳しく説明するように、分析方法は、時間的に変化する光検出器の出力の周波数成分を決定し、これらの周波数成分に基づいてサンプルの蛍光画像を構成する。光検出器の出力の周波数成分を決定するために様々な方法を利用できる。このような適した方法のある例には、フーリエ変換、ロックイン検波、フィルタ処理、Ｉ／Ｑ復調、ホモダイン検波及びヘテロダイン検波が含まれるが、これらに限定されない。

例として、図１１Ａ及び図１１Ｂは、サンプルの蛍光画像を生成するために分析モジュール７２によって実行され得る例示的な分析ステップを示す。ステップ（１）で、アナログ増幅信号をデジタル化して、デジタル化された蛍光データを生成する。ステップ（２）で、分析のためにデジタル化された蛍光データの適した部分（長さ）を選択する。例えば、分析のためにサンプルの照射された行（本明細書ではフレームとも呼ぶ）に対応する蛍光データを選択できる。あるいは、分析のためにデータフレームの一部を選択できる。

ステップ（３）で、選択されたデータのフーリエ変換を実行する。例として、ある実施形態では、データの高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を行い、データの周波数成分を決定する。このようなある実施形態では、ＦＦＴのビンがデータ取得のために選択された周波数に対応し得る。例えば、２５６ＭＨｚのサンプリングレートの場合、２５６のサンプルが、１ＭＨｚだけ、例えばＤＣから１２８ＭＨｚまで相互に分離する周波数ビンを生成できる。ＦＦＴ分析により、発せられた蛍光放射が増幅変調を示すビート周波数に相当する周波数が与えられる。

引き続き図１１Ａ及び図１１Ｂに関して、この実施形態では、ステップ（４）で、ＦＦＴデータにある各周波数成分の振幅値が、その周波数成分の実部成分及び虚部成分の平方和の平方根を得ることによって計算される。各周波数成分はサンプルの特定の位置から蛍光放射を引き出すために利用されたビート周波数の１つに対応するため、周波数成分の振幅値は、サンプルの水平行に沿ってその周波数成分に関連付けられる位置に関するピクセル値を与えることができる。このようにして、サンプルの水平行の画像に関するピクセル値を決定できる。サンプルがフローセルの中を垂直に流れているとき、サンプルの水平行毎に得られた蛍光データに関して上記のステップを繰り返すことができる。ピクセル値を使って、蛍光画像を構成できる（ステップ５）。

前述のように、分析モジュール７２は、本教示に従って当業界で知られている技術を使いハードウェア、ファームウェア及び／又はソフトウェアで実装できる。例として、図１２は分析器７２の例示的な実施例を概略的に示しており、分析器７２は、増幅器７０から増幅された蛍光信号を受けて、この蛍光信号をデジタル化してデジタル化された蛍光データを生成するアナログ−デジタル変換器７４を有している。分析モジュールは、計算及び論理演算の実行を含む、分析モジュールの動作を制御するための中央処理ユニット（ＣＰＵ）７６を更に有している。分析モジュールは、ＲＯＭ（リードオンリメモリ）７８、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）８０及び固定メモリ８２も有している。通信バス８４が、分析モジュールの各種の構成要素間の通信、例えばＣＰＵ ７６とその他の構成要素との間の通信を容易にする。メモリモジュールは、蛍光データを分析するための命令と分析結果とを記憶するために使用できる。例として、ある実施形態では、データ分析のための命令、例えば図１１Ａ及び図１１Ｂに関連して述べた上記のステップを実行するための命令をＲＯＭ ７８に記憶できる。ＣＰＵは、ＲＯＭ ７８に記憶された命令を使って、ＲＡＭ ８０に記憶されたデジタル化された蛍光データに対する作業を行い、サンプルの蛍光画像（例えば１次元画像又は２次元画像）を生成できる。ＣＰＵは、固定メモリ８２、例えばデータベースに蛍光画像を記憶させることができる。図１２に概略的に示されているように、分析モジュールは任意に、受けたデータ（例えば、蛍光データ）からピクセル強度及びその他の数量の計算を実行するためのグラフィック処理ユニット（ＧＰＵ）７６’を有することができる。

ある実施形態では、光検出器により生成される出力信号の周波数復調は、ロックイン検波技術を使って実現できる。例として、図１３Ａ及び図１３Ｂに関して、このような一実施形態では、増幅された蛍光信号をデジタル化し（ステップ１）、デジタル化された蛍光信号の一部のコピーを生成する（ステップ２）。その際、デジタル化されたコピーの数（Ｎ）はＲＦコムビームに関連付けられる周波数の数に相当する。信号のデジタル化された各コピーに、ＲＦコムビームの１つの周波数とＬＯビームの周波数との差に等しいビート周波数に相当する周波数を有する正弦波及び余弦波を乗じて複数の中間信号を生成する（ステップ２）。各中間信号を、ＲＦコムの周波数間の周波数間隔の半分に等しい帯域幅を有するローパスフィルタに通す（ステップ３）。

ＲＦコムビームの周波数の１つに相当するビート周波数毎に（換言すれば、照射されたサンプルの空間位置に対応する周波数毎に）、その周波数に対応するフィルタ処理された２つの中間信号の平方和の平方根を、その周波数を有するＬＯビーム及びＲＦコムビームにより照射されたサンプル位置に対応する画像ピクセルの振幅値として得る（ステップ４）。ある実施形態では、同じビート周波数に対応する（すなわち、同じサンプル位置に対応する）複数の蛍光データ信号を上述の方法で処理でき、ピクセル値を平均して平均ピクセル値を得ることができる。

サンプルがフローセルの中を垂直に流れているとき、サンプルの水平行毎に得られた蛍光データに関して上記のステップを繰り返すことができる。ピクセル値を使って蛍光画像を構成できる（ステップ５）。

上述のロックイン検波方法は、ソフトウェア、ファームウェア及び／又はハードウェアで実装できる。例として、一実施形態では、上述したロックイン検波方法は、特に７以上の周波数が使用される場合、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）を使って実装できる。ある実施形態では、スイスのチューリッヒのＺｕｒｉｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓが販売するＨＦ２Ｌ−ＭＦ多周波数増幅器等の多周波数ロックイン増幅器を使用できる。

更なる例として、ある実施形態では、検出された蛍光信号の周波数復調は、バンドパスフィルタに基づく画像復調技術を利用して実現できる。図１４Ａ及び図１４Ｂに関して、このような周波数復調方法の一実施形態では、光検出器６４及び増幅器７０により与えられる蛍光信号をデジタル化し（ステップ１）、デジタル化された信号の複数のコピーを生成する（ステップ２）。その際、デジタル化されたコピーの数（Ｎ）はＲＦコムビームに関連付けられる周波数の数に相当する。デジタル化された蛍光信号の各コピーは、ＲＦコムビームの１つに関連付けられるビート周波数（すなわち、サンプルの特定の位置に関連付けられるビート周波数）に中心を置くバンドパスフィルタに信号を通すことによってフィルタ処理する（ステップ３）。より具体的には、各バンドパスフィルタは、Ｎ個のビート周波数のうちの１つに中心を置き、隣り合うビート周波数間の周波数間隔の半分と等しいバンド幅を有する。

各ビート周波数で包絡線検出器を使用して、水平ライン毎にそのビート周波数に対応する各ピクセルの振幅を推定する（ステップ４）。場合により、ピクセルに対応する複数のピクセル値を、そのピクセルに関連付けられるサンプル位置に対応する複数の蛍光信号を処理することによって得て平均化して平均ピクセル値を得る。サンプルがフローセルの中を垂直に流れているとき、サンプルの水平行毎に得られた蛍光データに関して上記のステップを繰り返すことができる。ピクセル値を使って、サンプルの１次元蛍光画像又は２次元蛍光画像を構成できる（ステップ５）。

分析モジュールは、明視野画像データ及び暗視野画像データを受けて処理するように更に構成できる。例えば、図９Ｃ及び図１０に関して、分析モジュール７２は、光検出器２０８、２１６から暗視野画像データ及び明視野画像データを受けて、暗視野画像及び明視野画像を生成するように更に構成できる。例えば、図１２に関して、例えば既知の方法で暗視野画像及び明視野画像を生成するための命令を固定メモリ８２に記憶できる。プロセッサ７６はこれらの命令を使って、受けた暗視野画像データ及び明視野画像データを処理して画像を生成できる。分析モジュールは、例えば蛍光画像と明視野画像及び暗視野画像の一方又は両方とを重ね合わせることによって複合画像を生成するように更に構成できる。

上述したシステム１０のような本教示によるシステムによって生成される蛍光画像、明視野画像及び暗視野画像を様々な方法で使用できる。例えば、蛍光画像は、従来のフローサイトメータにより生成されるデータと比較できる値を生成するように統合され得る。蛍光画像は、その画像を生成させた蛍光プローブの位置を決定するために分析することもできる（例えば、蛍光プローブが核であるか、細胞質であるか、細胞小器官に局所化されているか、又は細胞膜の外側にあるかを決定できる）。更に、ある用途では、全てが同じ細胞から得られた異なる蛍光バンドを検出することにより得られた複数の蛍光画像を使って、ある細胞内の複数の蛍光プローブの共局在化の度合いを決定できる。加えて、とりわけ細胞の形態、細胞内情報伝達、インターナリゼーション、細胞間相互作用、細胞死、細胞周期及びスポット計数（例えばＦＩＳＨ）の分析が、マルチカラー蛍光画像、明視野画像及び暗視野画像を使って可能となる。

前述したように、システム１０は、少なくとも３種類のモードで動作できる。上述した一モードでは、ＬＯビーム及び複数のＲＦコムビームがサンプルの一部（例えば、水平範囲に沿って配置された位置）を同時に照射し、照射された位置から発せられた蛍光放射を検出して分析することにより、サンプルの蛍光画像を構成する。別の動作モードでは、複数のＲＦ駆動信号をＡＯＤに同時に与えるのではなく、駆動信号を含む周波数ランプがＡＯＤに与えられ、それによってレーザビームの周波数は時間と共に開始周波数（ｆ₁ ）から最終周波数（ｆ₂ ）へと変化する。周波数ランプ内の駆動周波数毎に、レーザビームの周波数はその駆動周波数だけシフトされ、サンプルは周波数シフトレーザビームにより照射されて、サンプルから周波数放射が引き出される。換言すれば、この動作モードでは、システムは、ある時間間隔に亘って中心レーザ周波数からシフトされた複数の周波数でサンプルを連続的に照射することにより、サンプルからの蛍光放射を得るように動作する。ＡＯＤにより生じる周波数シフトは角偏向を伴い、それによって、同じ光路を使ってビームはサンプル全体に亘って高速で走査される。

より具体的には、この動作モードでは、ＲＦ周波数シンセサイザ１０を使用して、ＡＯＤ １８に与えられる駆動信号を開始周波数（ｆ₁ ）から最終周波数（ｆ₂ ）へとランプする。例として、駆動信号をランプする周波数範囲は、約５０ＭＨｚ〜約２５０ＭＨｚとすることができる。ある実施形態では、駆動信号を約１００ＭＨｚ〜約１５０ＭＨｚへとランプする。この実施形態では、駆動周波数はある期間に亘り連続的に変化し、それによって例えば高速が実現される。他の実施形態では、駆動周波数は別々の段階で開始周波数（ｆ₁ ）から最終周波数（ｆ₂ ）へと変化することができる。

周波数シフトビームがミラー２８を通らず、レンズ２６、レンズ３０、ミラー４０／４２、ビームスプリッタ４４、レンズ４６、ミラー５６、レンズ５０、ミラー５８及び対物レンズ５２により画定される光路に沿って伝搬し、サンプルホルダの中を流れるサンプルの一部を照射するように、駆動周波数は選択される。ランプ速度は好ましくは、サンプルがビームを通って流れる際に、発せられる蛍光放射に基づいて生成される蛍光画像の垂直方向へのあらゆるボヤケを改善し、好ましくは防止するように十分高速である。これは、例えばランプ速度をサンプルの流動速度と一致させることによって実現できる。サンプルにおけるレーザスポットサイズは、適した速度を推定するために使用できる。例として、１マイクロメートルのレーザスポットサイズの場合、１本のラインに亘る走査時間は、サンプルの流れる速度が毎秒０．１メートルであるとき、画像のボヤケを防止するためには１０μ秒以下とすべきである。

励起放射による照射に応じてサンプルから発せられる蛍光放射は、上述した方法で集められて検出される。具体的には、図１０に関して、蛍光放射は光検出器６４により検出される。検出された蛍光は増幅器７０により増幅され、増幅信号は分析モジュール７２によって分析されて、サンプルの蛍光画像が再構成される。画像の再構成は、水平ピクセル位置を、開始周波数（ｆ₁ ）から最終数（ｆ₂ ）まで走査期間内の特定の時間に割り当てることによって実行される。上述した動作モードのように周波数成分の振幅を分析することよってピクセル値を得るのとは異なり、この動作モードで使用される復調方式は、検出された蛍光信号の時間領域値を使用して値を画像のピクセルに割り当てる。サンプルが垂直方向に流れているときにこのプロセスを繰り返すことにより、サンプルの２次元蛍光画像を得ることができる。

サンプルにより発せられる蛍光放射があれば、その蛍光放射を光検出器６４により集める。図１０に関して、検出された蛍光放射は増幅器７０により増幅される。分析モジュール７２は増幅信号を受ける。この動作モードでは、分析モジュールは蛍光信号を分析して、サンプル、例えば細胞／粒子の蛍光含有量を決定する。この動作モードでサンプルを励起するビームは１つだけであるため、サンプルの励起に応じてビート周波数は発生しない。従って、蛍光信号の周波数領域には画像情報がない。その代わりに、検出された蛍光信号は時間領域でエンコードされた画像情報を有する。この動作モードでは、検出された蛍光信号の時間値を水平画素座標として使用して蛍光信号のデジタル化された電圧値をピクセル値（輝度）として使用することにより、画像をデジタルで再構成できる。ＡＯＤに与えられる駆動周波数の各走査により、画像の１つの水平ライン（行）が生成される。画像の再構成は、サンプルが照射領域（地点）を通って流れているときに連続走査により実現される。

また別の動作モードでは、システム１０はサンプルの複数の位置を１つの励起周波数で同時に照射することより動作でき、この励起周波数は、例えばレーザビームの中心周波数を無線周波数でシフトすることによって発生し得る。より具体的には、再び図１に関して、このような動作モードでは、１つの駆動無線周波数をＡＯＤ １８に与えることにより、ＡＯＤ １８に入射するレーザビームに対してシフトされた周波数を有するレーザビームが生成される。更に、周波数シフトレーザビームは、ＡＯＤに入射するレーザビームに対して角度シフトを示し、それによって、無線周波数レーザビームはミラー２８によって遮断されて、レンズ３２及びミラー３３、３５を通じてトップハットビーム整形素子３４に向かって反射する。トップハットビーム整形素子３４を出たビームは、ビームスプリッタ４４により反射して、レンズ４６によって中間像面４８に集束される。この中間像面４８では、図１５Ａに概略的に示されているように、レーザビーム１０００が水平方向に沿って延ばされたプロファイルを示す。

水平方向に延ばされたレーザビームは、ミラー５６により収束レンズ５０に反射する。収束レンズ５０を通過したレーザビームはミラー５８によって対物レンズ５２に反射する。前述したように、収束レンズ５０及び対物レンズ５２は、トップハットプロファイルのレーザビームを中間像面４８からフローセル５４の中を流れるサンプルへと中継するためのテレスコープを形成する。

水平方向に延ばされたレーザビームはサンプルの水平範囲を照射して、サンプル内に対象の蛍光色素があれば、その蛍光色素をその水平範囲に沿って励起する。それゆえ、この動作モードでは、サンプルの複数の水平位置が異なる励起周波数で照射される第１の動作モードとは異なり、サンプルの複数の水平位置が同じ励起周波数で照射される。この動作モードでは、使用者が流れる細胞又は粒子の画像を得ることができない。しかしながら、この動作モードでは典型的には、他の２つの動作モードの場合より高い光学パワーをサンプルに与えることができ、これは、画像が不要な場合に、より高い信号対ノイズ比のデータの取得に有益となり得る。この動作モードには、音響光学偏向素子を駆動する電子信号を変化させるだけでアクセスでき、システムにあらゆる機械的変更を加える必要がない。

従って、システム１０は３つの異なる動作モードで動作してサンプルから蛍光放射を引き出すことができる。

ある実施形態では、蛍光寿命測定は、例えば無線周波数シフトビーム及びローカルオシレータビームの各々のビートの位相を検出された蛍光信号の夫々の無線周波数成分の位相と比較することによって、サンプル上の各サンプル位置で実行できる。例として、図１５Ｂは、このような蛍光寿命測定を可能にする上述したシステム１０の改良型であるシステム１０’を示している（簡潔さを期し、図１に示されている特定の構成要素はこの図では示されていない）。具体的には、ＲＦコムビームのうち、ビームスプリッタ４４に入射した部分は、ビームスプリッタによって収束レンズ４００（例示として、この実施形態では収束レンズ４００の焦点距離は２００ｍｍであるが、その他の焦点距離も使用できる）に反射する。収束レンズ４００は、ＲＦコムビームのその部分をフォトダイオード４０２で集束させ、フォトダイオード４０２は励起ビームを検出する。フォトダイオード４０２の出力は、分析モジュール７２によって受けることができる（図１０参照）。分析モジュールは、例えば上述した復調方法の１つを使って励起ビームの周波数多重分離を行って、励起ビームの中の各無線周波数成分の位相を決定できる。このため、検出された蛍光信号の無線周波数成分毎に、その無線周波数成分の位相が比較され得る基準位相が与えられ得る。例えば、励起信号のＦＦＴの実部成分及び虚部成分又はロックイン型復調のＩ成分及びＱ成分を利用できる。あるいは、サンプル／フローセルの明視野画像を検出する検出器の出力を使って、蛍光ビート周波数の位相が比較され得る基準位相を得ることができる。

より具体的には、分析モジュール７２は、例えば上述した方法で、検出された蛍光信号の周波数多重分離を行うことができる。当業者であればわかるように、蛍光信号のビート周波数毎に無線周波数成分の位相を励起ビームの夫々の基準位相と比較して、空間的に分解された蛍光寿命測定値及び蛍光寿命画像を得ることができる。

特定の実施形態では、本システムは、流れ内のサンプルにより発せられる光を検出するために上述の光学構成を利用するフローサイトメータシステムを備えている。特定の実施形態では、本システムは、米国特許第３９６０４４９号明細書、米国特許第４３４７９３５号明細書、米国特許第４６６７８３０号明細書、米国特許第４７０４８９１号明細書、米国特許第４７７０９９２号明細書、米国特許第５０３０００２号明細書、米国特許第５０４０８９０号明細書、米国特許第５０４７３２１号明細書、米国特許第５２４５３１８号明細書、米国特許第５３１７１６２号明細書、米国特許第５４６４５８１号明細書、米国特許第５４８３４６９号明細書、米国特許第５６０２０３９号明細書、米国特許第５６２０８４２号明細書、米国特許第５６２７０４０号明細書、米国特許第５６４３７９６号明細書、米国特許第５７００６９２号明細書、米国特許第６３７２５０６号明細書、米国特許第６８０９８０４号明細書、米国特許第６８１３０１７号明細書、米国特許第６８２１７４０号明細書、米国特許第７１２９５０５号明細書、米国特許第７２０１８７５号明細書、米国特許第７５４４３２６号明細書、米国特許第８１４０３００号明細書、米国特許第８２３３１４６号明細書、米国特許第８７５３５７３号明細書、米国特許第８９７５５９５号明細書、米国特許第９０９２０３４号明細書、米国特許第９０９５４９４号明細書及び米国特許第９０９７６４０号明細書に記載されているフローサイトメータの一又は複数の構成要素を備えているフローサイトメータシステムであり、これらの開示を参照によって本願に援用する。

前述したように、ある実施形態では、本システムは、フローサイトメータの流れ等の流れ内を流れるサンプル中の粒子（例えば、細胞）を撮像するために構成されている。流れ内の粒子の流速は、０．００００１ｍ／ｓ以上であってもよく、例えば０．００００５ｍ／ｓ以上、例えば０．０００１ｍ／ｓ以上、例えば０．０００５ｍ／ｓ以上、例えば０．００１ｍ／ｓ以上、例えば０．００５ｍ／ｓ以上、例えば０．０１ｍ／ｓ以上、例えば０．０５ｍ／ｓ以上、例えば０．１ｍ／ｓ以上、例えば０．５ｍ／ｓ以上、例えば１ｍ／ｓ以上、例えば２ｍ／ｓ以上、例えば３ｍ／ｓ以上、例えば４ｍ／ｓ以上、例えば５ｍ／ｓ以上、例えば６ｍ／ｓ以上、例えば７ｍ／ｓ以上、例えば８ｍ／ｓ以上、例えば９ｍ／ｓ以上、例えば１０ｍ／ｓ以上、例えば１５ｍ／ｓ以上、２５ｍ／ｓ以上であってもよい。例えば、流れのサイズ（例えば、フローノズルオリフィス）に応じて、本システムにおける流れの流速は０．００１μＬ／分以上であってもよく、例えば０．００５μＬ／分以上、例えば０．０１μＬ／分以上、例えば０．０５μＬ／分以上、例えば０．１μＬ／分以上、例えば０．５μＬ／分以上、例えば１μＬ／分以上、例えば５μＬ／分以上、例えば１０μＬ／分以上、例えば２５μＬ／分以上、例えば５０μＬ／分以上、例えば１００μＬ／分以上、例えば２５０μＬ／分以上、５００μＬ／分以上であってもよい。

以下の例は、本教示の各種の態様を更に説明するためにのみ与えられており、必ずしも本発明の教示を実施する最適な方法又は得られる最適な結果を示そうとしているわけではない。

実施例１
図９Ａに関連して上述した検出システムと同様の検出システムを備える図１に関連して説明したシステムと同様のシステムを使って、イリノイ州レイクフォレストのＳｐｈｅｒｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．がＲＣＰ−３０−５Ａの商品名で販売する８つの異なるレベルの蛍光染料で染色したポリスチレンビーズからの蛍光放射を測定した。また、このシステムを使って上述の方法で明視野画像及び暗視野画像も生成した。

図１６Ａは、暗視野強度対明視野強度の散布図である。図１６Ａの長方形の部分をゲートとして使い、図１６Ｂ、図１６Ｃ及び図１６Ｄに示されているデータを生成した。このデータには測定した全ての事象（合計５０，０００の事象を検出した）の約３２％が含まれている。図１６Ｂは、各粒子により発せられた赤色蛍光（ＰＩ）対緑色蛍光（ＦＩＴＣ）の散布図を示す。この図１６Ｂは、異なる輝度レベルの８つの集合を明確に示している。図１６Ｃ及び図１６Ｄは同じデータのヒストグラムである。

実施例２
図９Ａに関連して上述した検出システムと同様の検出システムを備える図１に関連して上記に説明したシステムと同様のシステムを使って、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムで染色した、固定された末梢血白血球のＦＩＲＥ画像、明視野画像及び暗視野画像を得た。サンプルには、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色した生体ＨｅＬａ細胞の分画も含めた。細胞は、データ取得中にフローセルを０．５メートル／秒の速度で流れた。

図１７Ａに示されている画像は、上から下に、明視野、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウム蛍光チャネルの重ね合わせ、明視野、暗視野、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、及びＰＩチャネル蛍光である。補償は適用せず、全ての画像をオートスケールで観察した。２番、３番、５番、８番、９番、１２番、１７番、２０番及び２１番の細胞はＨｅＬａ細胞（集合Ｂ）であり、それ以外は白血球（集合Ａ）である。

図１７Ｂは、集合Ａが白血球を示して集合ＢがＨｅＬａ細胞を示す散布図である。

実施例３
図９Ａに関連して上述した検出システムと同様の検出システムを備える図１に関連して上記に説明したシステムと同様のシステムを使って、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムで染色した、固定された末梢血白血球のＦＩＲＥ画像、明視野画像及び暗視野画像を得た。サンプルは、抗ＥｐＣＡＭ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した、固定されたＭＣＦ−７細胞のわずかな分画でスパイクした。細胞は、データ取得中にフローセルを０．５メートル／秒の速度で流れた。

図１８Ａに示されている画像は、上から下に、明視野、ＦＩＴＣ及びＰＩチャネル蛍光の重ね合わせ、明視野、暗視野、ＦＩＴＣ、及びＰＩ蛍光である。白血球の集合では、緑色蛍光はＰＩ染料から漏れた蛍光のアーチファクトである。画像は全て、輝度のオートスケールで観察し、それゆえ、白血球はＦＩＴＣ蛍光を示すが、これはＰＩからのわずかな蛍光漏出信号である。１番、２番、４番、５番、１０番、１３番、１５番及び１６番の細胞はＭＣＦ−７細胞である。

図１８Ｂは、集合Ａが白血球を示して集合ＢがＭＣＦ−７細胞を示す散布図である。

当業者であればわかるように、本教示の範囲から逸脱することなく、様々な変更を加えることができる。特に、上述の様々な特徴、構造又は特性は、適した方法で組み合わせられ得る。例えば、一実施形態に関連して述べた検出システムを別の実施形態で使用してもよい。

Claims (34)

1. サイトメトリを行うためのシステムであって、
   少なくとも１つの蛍光色素の励起に適した中心周波数を有するレーザビームを生成するためのレーザと、
   前記レーザビームを受けて、１つのローカルオシレータビーム（ＬＯビーム）及び複数のＲＦコムビームを含む複数の角度分離したレーザビームを生成するための音響光学偏向素子であって、前記ＬＯビーム及びＲＦコムビームの各々が前記中心周波数に対して無線周波数（ＲＦ）シフトを有する前記音響光学偏向素子と、
   前記ＬＯビームを前記ＲＦコムビームの伝搬経路とは異なる伝搬経路に沿って導く光学素子と、
   前記ＬＯビームを受けて、前記ＬＯビームにトップハット強度プロファイルを付与するトップハットビーム整形素子と、
   トップハット形の前記ＬＯビーム及び前記ＲＦコムビームを受けて、前記トップハット形のＬＯビーム及び前記ＲＦコムビームの空間的な重なりによって結合励起ビームを与えるビームスプリッタと、
   その少なくとも一部が前記蛍光色素に関連付けられている複数の細胞を含むサンプルに前記結合励起ビームを導く少なくとも１つの光学素子であって、前記ＬＯビームが前記サンプルの複数の空間位置を同時に照射して、前記ＲＦコムビームの各々が前記空間位置の異なる空間位置を照射し、前記空間位置に前記蛍光色素があれば、前記蛍光色素から蛍光放射を引き出す前記光学素子と
   を備えており、
   前記サンプルの空間位置の各々から発せられる前記蛍光放射は、前記ＬＯビームの周波数と前記サンプルの空間位置を照射している前記ＲＦコムビームの１つの周波数との差に相当するビート周波数を示すことを特徴とするシステム。
2. 前記無線周波数シフトは前記蛍光色素のスペクトル吸収ピークのＦＷＨＭ（半値全幅）より小さいことを特徴とする請求項１に記載のシステム。
3. 前記無線周波数シフトは約１０ＭＨｚ〜約２５０ＭＨｚの範囲内であることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
4. 前記無線周波数シフトは、約０．１ＭＨｚ〜約４ＭＨｚの範囲の周波数だけ相互に分離していることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
5. 前記トップハット形のＬＯビームは、角度分離した前記ＲＦコムビームの線形範囲と実質的に等しい線形範囲を有することを特徴とする請求項１に記載のシステム。
6. 前記ＲＦコムビームはガウシアン強度プロファイルを有することを特徴とする請求項５に記載のシステム。
7. 前記トップハット形のＬＯビームは、前記ガウシアン強度プロファイルの最大値と実質的に等しい強度を有することを特徴とする請求項６に記載のシステム。
8. 無線周波数を同時に発生させて、前記ＬＯビーム及び前記ＲＦコムビームを生成すべく前記無線周波数を前記音響光学偏向素子に与える無線周波数発生器を更に備えていることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
9. 前記無線周波数発生器は、ダイレクトデジタルシンセサイザ（ＤＤＳ）ＲＦコム発生器を有していることを特徴とする請求項８に記載のシステム。
10. 前記無線周波数発生器を制御するコントローラを更に備えていることを特徴とする請求項９に記載のシステム。
11. 前記音響光学偏向素子に与えるために前記無線周波数を増幅する電子電力増幅器を更に備えていることを特徴とする請求項１０に記載のシステム。
12. 発せられた前記蛍光放射を検出して、時間領域の蛍光信号を生成する光検出器を更に備えていることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
13. 前記光検出器と通信して、前記蛍光信号を受けて、前記蛍光信号に基づいて前記サンプルの少なくとも１つの蛍光画像を再構成する分析モジュールを更に備えていることを特徴とする請求項１１に記載のシステム。
14. 前記分析モジュールは、前記蛍光信号の周波数多重分離を行って前記ビート周波数を決定し、前記ビート周波数で変調された蛍光放射を発する前記サンプルの空間位置と前記ビート周波数を相関させることにより、前記蛍光画像を生成するように構成されていることを特徴とする請求項１３に記載のシステム。
15. 前記分析モジュールは、前記蛍光信号の少なくとも一部のフーリエ変換を行うことにより、前記蛍光信号の周波数多重分離を行って前記ビート周波数を決定することを特徴とする請求項１３に記載のシステム。
16. 前記分析モジュールは、ビート周波数毎にビート周波数の振幅値を計算してビート周波数に対応する画像の位置に対応するピクセル値を与えることによって、前記蛍光画像を再構成することを特徴とする請求項１４に記載のシステム。
17. 前記分析モジュールは、前記蛍光信号の複数のデジタルコピーを生成することによって前記蛍光画像を再構成するように構成されており、コピーの数は前記ＲＦコムビームに関連付けられる周波数の数に相当することを特徴とする請求項１３に記載のシステム。
18. 前記分析モジュールは、前記ＲＦコムビームの１つの周波数と前記ＬＯビームの周波数との差に等しいビート周波数に相当する周波数を有する正弦波及び余弦波を前記デジタルコピーの各々に乗じることによって複数の中間信号を生成するように更に構成されていることを特徴とする請求項１７に記載のシステム。
19. 前記分析モジュールは、前記ＲＦコムビームの周波数間の周波数間隔の半分に等しいバンド幅を有するローパスフィルタに各中間信号を通し、ビート周波数毎にビート周波数に対応する２つの中間信号の平方和の平方根を、ビート周波数で変調された蛍光放射を発する前記ＬＯビーム及び前記ＲＦコムビームにより照射されたサンプル位置に対応する画像ピクセルの振幅値として得るように更に構成されていることを特徴とする請求項１８に記載のシステム。
20. 前記分析モジュールは、前記蛍光信号の複数のデジタルコピーの各々を、前記ビート周波数の１つに中心を置くバンドパスフィルタに通し、包絡線検出器を使用してビート周波数に対応する各ピクセルの振幅を推定することによって、前記蛍光信号の周波数多重分離を行うように構成されていることを特徴とする請求項１３に記載のシステム。
21. 前記サンプルの暗視野画像を生成するための第１の検出アームと、前記サンプルの明視野画像を生成するための第２の検出アームとを更に備えていることを特徴とする請求項１２に記載のシステム。
22. 前記分析モジュールは、前記蛍光画像と前記暗視野画像及び前記明視野画像の一方又は両方との複合画像を生成するように構成されていることを特徴とする請求項２１に記載のシステム。
23. 前記サンプルの前記空間位置は、前記サンプルの水平次元に沿って存在することを特徴とする請求項１に記載のシステム。
24. 共焦点構成では蛍光放射を検出するように前記光検出器の前に設けられた開口を更に備えていることを特徴とする請求項１２に記載のシステム。
25. 前記光検出器の前に設けられた蛍光フィルタを更に備えていることを特徴とする請求項１２に記載のシステム。
26. 前記蛍光フィルタはバントパスフィルタであることを特徴とする請求項２５に記載のシステム。
27. 前記蛍光色素の蛍光寿命測定を行うためのサブシステムを更に備えていることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
28. 前記サブシステムは、複数の空間位置で蛍光寿命測定を行い、蛍光寿命画像を形成するように構成されていることを特徴とする請求項２７に記載のシステム。
29. 前記サブシステムは、前記結合励起ビームを検出して、検出結果に応じて励起信号を生成する光検出器を有していることを特徴とする請求項２７に記載のシステム。
30. 前記サブシステムは分析モジュールを更に有しており、前記分析モジュールは、前記光検出器と通信し、検出された前記励起信号を受けて、前記励起信号に関連付けられた前記ビート周波数を多重分離して前記ビート周波数の各々の位相を決定することを特徴とする請求項２９に記載のシステム。
31. 前記分析モジュールは、検出された前記蛍光信号に関連付けられる前記ビート周波数の各々の位相を決定し、前記結合励起ビームに関連付けられる各ビート周波数の前記位相を前記蛍光信号に関連付けられる夫々のビート周波数の前記位相と比較して、蛍光寿命測定を行うように更に構成されていることを特徴とする請求項３０に記載のシステム。
32. 前記分析モジュールは、前記ビート周波数の各々を空間位置に相関させ、蛍光寿命画像を生成することを特徴とする請求項３１に記載のシステム。
33. フローサイトメトリを行うためのシステムであって、
    少なくとも１つの蛍光色素の励起に適した周波数を有するレーザビームを生成するためのレーザと、
    前記レーザビームを受けるように構成された１つの音響光学偏向素子（ＡＯＤ）と、
    一又は複数の駆動信号を前記ＡＯＤに与える無線周波数発生器と、
    ３つの動作モードを与えるように、前記無線周波数発生器を制御するコントローラと
    を備えており、
    前記動作モードは、
    （ａ）前記コントローラが前記無線周波数発生器に、複数の無線周波数駆動信号を前記ＡＯＤに同時に与えさせて、サンプルの複数の空間位置を同時に照射するための複数の無線周波数シフトビームを生成させる第１の動作モードと、
    （ｂ）前記コントローラが前記無線周波数発生器に複数の無線周波数駆動信号を前記ＡＯＤに連続的に与えさせて、前記サンプルに複数の無線周波数シフトビームを異なる時点に照射する第２の動作モードと、
    （ｃ）前記コントローラが前記無線周波数発生器に１つの無線周波数駆動信号を前記ＡＯＤに与えさせて、前記サンプルに１つの周波数のビームを照射する第３の動作モードと
    を有することを特徴とするシステム。
34. 前記無線周波数シフトビームの１つ（ここでは、「ローカルオシレータ（ＬＯ）ビーム」）を受けて、前記ＬＯビームを、他の周波数シフトビーム（ここでは、「ＲＦコムビーム」）の伝搬経路とは異なる伝搬経路に沿って導く光学素子を更に備えていることを特徴とする請求項３３に記載のシステム。