KR20230157532A - 다중모드 형광 이미징 유동 세포 계측 시스템 - Google Patents

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KR20230157532A
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에릭 다이볼드
키건 오슬리
조나단 린
Original Assignee
벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니
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Abstract

3개의 작동 모드로 작동될 수 있는 세포 계측을 수행하기 위한 시스템이 제공되어 있다. 하나의 작동 모드에서, 세포/입자를 포함하는 샘플의 형광 이미지는 서로에 대해 고주파 편이된 복수의 빔과 톱햇형 빔의 중첩으로 형성된 여기 빔에 의해 샘플에 존재하는 하나 이상의 형광단(들)을 여기시킴으로써 얻어진다. 다른 작동 모드에서, 샘플은 복수의 여기 주파수의 레이저 빔에 의해 스캔 방식으로 시간 간격에 걸쳐 연속적으로 조명될 수 있다. 샘플로부터의 형광 방출은 예를 들어 샘플의 형광 이미지를 생성하도록 검출 및 분석될 수 있다. 또 다른 작동 모드에서, 상기 시스템은, 예를 들어 고주파에 의해 레이저 빔의 중심 주파수를 편이시킴으로써 생성될 수 있는 단일 여기 주파수에 의해 동시에 샘플의 복수의 위치를 조명하도록 작동될 수 있다.

Description

다중모드 형광 이미징 유동 세포 계측 시스템{MULTI-MODAL FLUORESCENCE IMAGING FLOW CYTOMETRY SYSTEM}
본 발명은 일반적으로 샘플의 형광 분석을 위한 장치 및 방법에 관한 것으로, 보다 특별하게는 형광-기반 유동 세포 계측(fluorescence-based flow cytometry)을 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.
형광 이미징은 예를 들어 생물학적 표본의 분자 조성에 관한 정보를 얻는 것에 있어서 다양한 생의학적 응용을 갖는다. 생의학적 유동 세포 계측에서, 외인성 및/또는 내인성 세포 형광단(fluorophore)에 의해 방출된 형광 방사선이 수집 및 분석되어 세포의 화학적 및/또는 물리적 특성에 대한 정보를 얻는다.
그러나, 종래의 형광-기반 유동 세포 계측에서는, 고속으로 유동하는 세포의 흐림 없는 이미지(blur-free image) 또는 서브밀리초 생화학 역학과 같은 다른 빠른 현상의 획득이 어려울 수 있다. 특히, 킬로헤르츠 범위의 이미징 프레임 속도에서 샘플의 짧은 노출과 결합된 많은 형광단의 약한 광 방출은 흐림 없는 이미지의 획득을 어렵게 만든다. 또한, 많은 종래의 시스템은 하나의 이미징 모드로만 작동하고, 따라서 샘플 분석을 위한 충분한 유연성을 제공하지 못한다.
따라서, 형광 분석을 위한 향상된 방법 및 시스템에 대한 필요성, 및 특히 형광-기반 유동 세포 계측을 수행하기 위한 향상된 방법 및 시스템에 대한 필요성이 존재한다.
일 양태에 있어서, 세포 계측을 수행하기 위한 시스템이 개시되어 있으며, 상기 시스템은 적어도 하나의 형광단을 여기시키기에 적합한 중심 주파수를 갖는 레이저 빔을 생성하기 위한 레이저, 및 레이저 빔을 수용하고, 상기 중심 주파수에 대한 고주파(radio frequency; RF) 편이(shift)를 각각 갖는 복수의 각도적으로 분리된 레이저 빔을 생성하기 위한 음향-광학 디플렉터(acousto-optic deflector)를 포함한다. 각도적으로 분리된 레이저 빔은 국부 발진기 빔(LO 빔) 및 복수의 RF 콤 빔(RF comb beam)을 포함하며, 여기서 각각의 빔은 중심 레이저 주파수에 대한 고주파 편이를 나타낸다. 광학 요소는 RF 콤 빔의 전파 경로와는 상이한 전파 경로를 따라 LO 빔을 지향시킨다. 톱햇 빔 셰이퍼(top-hat beam shaper)는 LO 빔을 수용하고, 예를 들어 그 전파 방향에 수직한 평면에서 하나의 방향을 따라 LO 빔에 톱햇 강도 프로파일을 부여한다. 상기 시스템은 톱햇형 LO 빔 및 RF 콤 빔을 수용하고 상기 빔들의 공간적 중첩에 의해 조합 빔을 제공하는 빔 스플리터(beam splitter), 및 적어도 일부가 상기 형광단과 연관되는 복수의 세포를 포함할 수 있는 샘플 상에 조합 빔을 지향시켜서, 예를 들어 샘플이 유동 세포를 통해 유동할 때, LO 빔이 샘플의 복수의 공간 위치를 동시에 조명하고, 상기 RF 콤 빔 각각이 상기 공간 위치 중 상이한 하나의 위치를 조명하여, 상기 공간 위치에서, 존재한다면, 상기 형광단으로부터 형광 방사선을 유도하게 하기 위한 적어도 하나의 광학 요소(예를 들면, 렌즈)를 추가로 포함한다. 상기 샘플 위치 각각으로부터 방출된 형광 방사선은 그와 같은 샘플 위치를 조명하는 RF 콤 빔 중 하나와 상기 LO 빔 사이의 주파수 차이에 대응하는 비트 주파수(beat frequency)를 나타낸다.
일부의 구현예에 있어서, 고주파(RF) 편이들 사이의 주파수 차이는 상기 형광단의 스펙트럼 흡수 피크의 FWHM(full width at half maximum; 반치전폭)보다 작다. 예로서, 고주파 편이는 약 10 MHz 내지 약 250 MHz의 범위, 예를 들어 약 50 MHz 내지 약 150 MHz의 범위이다. 일부의 구현예에서, 고주파 편이는 약 0.1 MHz 내지 약 4 MHz의 범위의 주파수만큼 서로 분리된다.
일부의 구현예에 있어서, 상기 시스템은 톱햇 LO 빔이 각각의 RF 콤 빔과 중첩하도록 톱햇형 LO 빔 및 RF 콤 빔을 중간 평면상에 포커싱시키기 위해 빔 스플리터의 하류에 배치된 렌즈를 추가로 포함한다. 각각의 중첩 위치에서의 톱햇형 LO 빔의 강도 프로파일은 다른 중첩 위치에서의 그 프로파일과 실질적으로 동일할 수 있다. 일부의 경우에, LO 빔은 각도적으로 분리된 RF 콤 빔의 선형 범위(예를 들면, RF 콤 빔들 사이의 최대 수평 거리)와 실질적으로 동일한 이와 같은 중간 평면에서의 선형 범위(예를 들면, 이와 같은 평면에서의 수평 치수를 따른 범위)를 갖는다. 톱햇형 LO 빔은 바람직하게는 톱햇 방향으로(빔의 기다란 방향을 따라) 실질적으로 균일한 편광을 갖는다.
예로서, 일부의 구현예에서, RF 콤 빔은 가우시안(Gaussian) 강도 프로파일을 갖고, 톱햇형 LO 빔은 가우시안 강도 프로파일의 최대 강도와 실질적으로 동일한 강도를 갖는다. 또한, RF 콤 빔 및 톱햇형 LO 빔의 편광은 정렬될 수 있다.
상기 시스템은 고주파 편이에 대응하는 고주파를 동시에 발생시키고 상기 LO 및 RF 콤 빔을 생성하기 위해 고주파를 음향-광학 디플렉터에 인가하기 위한 고주파 발생기를 포함할 수 있다. 일부의 구현예에서, 고주파 발생기는 직접 디지털 합성기(DDS) RF 콤 발생기를 포함한다. 일부의 구현예에서, 전자 전력 증폭기(electronic power amplifier)는 음향-광학 디플렉터에 인가하기 위해 고주파 발생기에 의해 발생된 고주파 구동 신호를 증폭할 수 있다. 컨트롤러는, 예를 들어, 추가로 후술하는 바와 같이, 상이한 작동 모드로 시스템을 작동시키도록, 및/또는 음향-광학 디플렉터에 인가된 구동 신호의 진폭 및/또는 주파수를 조정하도록 고주파 발생기를 제어할 수 있다.
상기 시스템은, 만약 있다면, 샘플로부터 방출된 형광 방사선을 검출하고 시간-영역(time-domain) 형광 신호를 생성하기 위한 하나 이상의 광검출기(예를 들면, 하나 이상의 광전자 증배관)를 추가로 포함할 수 있다. 일부의 경우에, 관심 있는 형광 주파수를 투과시키면서 원치 않는 방사선 주파수를 차단하기 위해 적절한 필터(예를 들면, 광학 대역 통과 필터)가 광검출기의 전방에 배치된다.
일부의 구현예에 있어서, 여기 방사선(즉, LO 빔과 RF 콤 빔의 조합)은 샘플 내의 다수의 형광단을 동시에 여기시킬 수 있다. 일부의 이와 같은 구현예에서, 상기 시스템은 다수의 광검출기를 포함할 수 있고, 광검출기 각각은 이와 같은 형광단 중 하나로부터 방출된 형광 방사선을 검출하는 데 사용된다. 일부의 구현예에서, 각각의 검출기에서 관심 있는 형광 주파수의 방사선을 투과시키면서 원치 않는 방사선을 차단하는 적절한 필터, 예를 들어 대역 통과 필터가 각각의 광검출기의 전방에 배치된다.
일부의 구현예에 있어서, 대물 렌즈는 다이크로익 미러(dichroic mirror)에 의한 반사를 통해 여기 방사선(즉, LO 빔과 RF 콤 빔의 조합)을 수용할 수 있고, 연구중인 샘플 상에 여기 방사선을 포커싱시킬 수 있다. 샘플에 의해 방출된 형광 방사선은 대물 렌즈 및 다이크로익 미러를 통과하여 하나 이상의 렌즈를 통해 광검출기 상에 포커싱될 수 있다. 샘플 내의 다수의 형광단으로부터의 형광 방출에 대응하는 다수의 형광 주파수가 복수의 광검출기(예를 들면, 광전자 증배관)를 통해 검출되는 일부 구현예에서, 각각의 광검출기는 적절한 다이크로익 미러와 연관될 수 있고, 이 다이크로익 미러로부터 광검출기는 형광단 중 하나로부터의 형광 방출에 대응하는 주파수를 갖는 형광 방사선을 반사를 통해 수용한다. 다이크로익 미러는 다른 형광단에 대응하는 형광 주파수를 통과시켜서 다른 하류 검출기에 의해 검출되게 할 수 있다.
일부의 구현예에 있어서, 샘플에 의해 방출된 형광 방사선은, 예를 들어 하나 이상의 렌즈를 통해 광섬유에 결합될 수 있다. 광섬유는 형광 방사선을 수용하는 근위 단부로부터 방사선이 광섬유를 빠져나가는 원위 단부까지 연장될 수 있다. 일부의 구현예에서, 광섬유의 원위 단부에 광학적으로 결합된 출력 렌즈는 광섬유를 빠져나가는 형광 방사선을 하나 이상의 광검출기 상으로 지향시키는 것을 용이하게 한다.
상기 시스템은 하나 이상의 광검출기와 통신하여 광검출기(들)로부터 하나 이상의 시간-영역 형광 신호를 수신하고 샘플의 하나 이상의 형광 이미지를 재구성하는 분석 모듈을 추가로 포함한다. 예를 들면, 분석 모듈은 비트 주파수를 결정하기 위해 형광 신호의 주파수 역다중화(de-multiplexing)를 제공할 수 있고, 그와 같은 비트 주파수로 변조된 형광 방사선을 방출하는 샘플의 공간 위치와 비트 주파수를 상관시킴으로써 샘플의 형광 이미지를 생성할 수 있다. 예로서, 일부의 구현예에서, 그와 같은 공간 위치는 샘플의 수평 치수를 따를 수 있다. 일부의 구현예에서, 샘플이 유동 세포를 통해 유동할 때, 샘플의 상이한 부분(예를 들면, 샘플의 상이한 수평 범위)으로부터의 형광 방사선이 수집 및 분석되어 샘플의 2차원 형광 이미지를 생성한다.
일부의 구현예에 있어서, 분석 모듈은, (1) 형광 신호의 적어도 일부분의 푸리에 변환(예를 들면, FFT)을 얻어서 비트 주파수에 대응하는 신호의 주파수 성분을 얻음으로써, (2) 각각의 주파수 성분(비트 주파수)에 대하여, 예를 들어 그와 같은 주파수 성분의 실수 및 허수 부분의 제곱의 합의 제곱근을 얻음으로써, 그와 같은 주파수 성분의 진폭의 크기를 산출하여, 그와 같은 비트 주파수에 대응하는 이미지의 위치에 대응하는 픽셀 값을 제공함으로써, 샘플의 형광 이미지를 재구성한다.
일부의 구현예에 있어서, 분석 모듈은, 예를 들어, 증폭 후에 형광 신호를 디지털화하고 디지털화된 형광 신호의 몇 개의 사본을 생성함으로써 검출된 형광 신호의 주파수 역다중화를 실행하도록 구성되며, 여기서 디지털화된 사본의 수(N)는 RF 콤 빔과 연관된 주파수의 수에 대응한다. 형광 신호의 각각의 디지털화된 사본은 RF 콤 빔 중 하나와 LO 빔의 주파수들 사이의 차이와 동일한 비트 주파수에 대응하는 주파수를 갖는 사인파 및 코사인파와 곱해져서 복수의 중간 신호를 생성한다. 각각의 중간 신호는 RF 콤 주파수들 사이의 주파수 간격의 절반과 동일한 대역폭을 갖는 저역 통과 필터를 통과한다. RF 콤 주파수 중 하나에 대응하는 각각의 비트 주파수에 대하여, 그와 같은 주파수에 대응하는 2개의 필터링된 중간 신호의 제곱의 합의 제곱근은 그와 같은 비트 주파수로의 변조를 나타내는 형광 방사선을 방출하는 RF 콤 빔 및 LO 빔에 의해 조명된 샘플 위치에 대응하는 이미지 픽셀의 진폭의 크기로서 얻어진다.
일부의 구현예에 있어서, 분석 모듈은, 디지털화된 형광 신호의 몇 개의 사본을 생성함으로써 검출된 형광 신호의 주파수 역다중화를 실행하도록 구성되며, 여기서 디지털화된 사본의 수(N)가 RF 콤 빔과 연관된 주파수의 수에 대응한다. 디지털화된 형광 신호의 각 사본은 RF 콤 빔 중 하나와 연관된 비트 주파수에 중심설정된 대역 통과 필터를 통해 그와 같은 신호를 통과시킴으로써 필터링된다. 포락선 검출기(envelope detector)는 그와 같은 주파수에 대응하는 각 픽셀의 진폭을 추정하는 데 이용된다.
일부의 구현예에서, 상기 시스템은 샘플의 명시야 이미지(brightfield image)를 생성하기 위한 검출 아암 및 샘플의 암시야 이미지(darkfield image)를 생성하기 위한 다른 검출 아암을 추가로 포함한다. 명시야 검출 아암은, 예를 들어 샘플이 관통 유동하는 유동 세포에 대해, 전방 방향으로, 즉 유동 세포에 진입할 때 여기 방사선의 전파 방향에 실질적으로 평행한 방향을 따라 여기 방사선(즉, 조합된 LO 및 RF 콤 빔)을 수용하도록 위치될 수 있다. 또한, 암시야 검출 아암은, 예를 들어 유동 세포에 대해, 유동 세포에 진입할 때 여기 방사선의 전파 방향에 실질적으로 직교하는 방향을 따라 샘플에 의해 산란된 여기 방사선을 수용하도록 위치될 수 있다.
일부의 구현예에 있어서, 명시야 및 암시야 검출 아암 각각은 유동 세포를 통해 투과된 방사선, 또는 여기 방사선의 전파 방향과는 상이한 방향으로 샘플에 의해 산란된 방사선을 각각 광검출기, 예를 들어 광전자 증배관 상에 포커싱시키기 위한 하나 이상의 렌즈를 포함한다. 일부의 경우에, 원하는 방사선 주파수(예를 들면, 여기 주파수)를 통과시키면서 원치 않는 방사선 주파수를 차단하기 위해 적절한 필터, 예를 들어 대역 통과 필터가 광검출기의 전방에 배치될 수 있다.
일부의 경우에, 분석 모듈은 명시야 및/또는 암시야 및 형광 이미지의 오버레이(overlay)를 통해 합성 이미지를 생성하도록 구성된다.
관련 양태에 있어서, 유동 세포 계측 방법이 개시되어 있으며, 상기 방법은 톱햇형 레이저 빔(LO 빔)을 서로 고주파 편이된 복수의 레이저 빔(RF 콤 빔)과 중첩시킴으로써 여기 빔을 생성하는 단계를 포함하며, 여기 빔은 적어도 하나의 형광단으로부터 형광을 유도하고, 샘플에 존재한다면, 형광단을 여기시키도록 여기 빔을 샘플 상으로 지향시켜서 형광 방사선을 방출하게 할 수 있다. LO 빔과 RF 콤 빔의 중첩은 RF 콤 빔과 LO 빔 사이의 주파수 차이에 대응하는 복수의 비트 주파수의 공간 인코딩을 초래한다. 형광 방사선이 검출되고 주파수 역다중화되어 샘플의 형광 이미지를 생성한다.
일부의 구현예에 있어서, 형광 이미지에 의해 제공된 정보를 보충할 수 있는 샘플의 명시야 이미지 및 암시야 이미지가 생성된다. 일부의 구현예에서, 상기 시스템은 형광 수명 이미지를 형성하기 위해 샘플 상의 다수의 공간 위치에서 형광단의 형광 수명 측정을 수행하기 위한 서브시스템을 추가로 포함한다. 서브시스템은 조합 여기 빔을 검출하고 상기 검출에 반응하여 여기 신호를 생성하기 위한 광검출기를 포함한다. 분석 모듈은 광검출기와 통신하여 검출된 여기 신호를 수신하고 여기 신호와 연관된 비트 주파수를 역다중화하여 샘플 상의 각각의 공간 위치에서 비트 주파수 각각의 위상을 결정한다. 분석 모듈은 검출된 형광 신호와 연관된 각각의 비트 주파수의 위상을 결정하고, 조합 여기 빔과 연관된 각각의 주파수의 위상을 형광 신호와 연관된 각각의 비트 주파수의 위상과 비교하여 샘플 상의 다수의 공간 위치에서 형광 수명 측정을 수행하도록 추가로 구성된다.
관련 양태에 있어서, 유동 세포 계측을 수행하기 위한 시스템이 개시되어 있으며, 상기 시스템은 적어도 하나의 형광단을 여기시키기에 적합한 주파수를 갖는 레이저 빔을 생성하기 위한 레이저, 상기 레이저 빔을 수용하도록 구성된 음향-광학 디플렉터(AOD), 바람직하게는 단일 음향-광학 디플렉터(AOD), 상기 AOD에 하나 이상의 구동 신호를 인가하기 위한 고주파 발생기, 및 3개의 작동 모드를 제공하도록 상기 고주파 발생기를 제어하기 위한 컨트롤러를 포함한다. 작동 모드는, 상기 컨트롤러가 샘플의 복수의 공간 위치를 동시에 조명하도록 복수의 고주파 편이된 빔을 생성시키기 위해 상기 AOD에 복수의 고주파 구동 신호를 동시에 인가하도록 고주파 발생기를 실행시키는 제1 작동 모드, 상기 컨트롤러가 상이한 시간에 복수의 고주파 편이된 빔으로 샘플을 조명하기 위해 상기 AOD에 복수의 고주파 구동 신호를 연속적으로 인가하도록 고주파 발생기를 실행시키는 제2 작동 모드, 및 상기 컨트롤러가 단일 주파수의 빔으로 샘플을 조명하기 위해 상기 AOD에 단일의 고주파 구동 신호를 인가하도록 고주파 발생기를 실행시키는 제3 작동 모드를 포함한다. 특정 구현예에서, 고주파 편이된 빔에 의해 조명된 공간 위치는 단일 치수를 따라 위치되어, 고주파 편이된 빔이 단일 평면을 따라 2개 이상의 위치를 조사하게 한다. 예를 들면, 고주파 편이된 빔은 유동 스트림의 종축에 직교하는 평면을 따라 공간 위치를 조명할 수 있다. 각각의 고주파 편이된 빔은, 50 ㎛ 이상을 포함하여, 0.001 ㎛ 이상, 예컨대 0.005 ㎛ 이상, 예컨대 0.01 ㎛ 이상, 예컨대 0.05 ㎛ 이상, 예컨대 0.01 ㎛ 이상, 예컨대 0.05 ㎛ 이상, 예컨대 0.1 ㎛ 이상, 예컨대 0.5 ㎛ 이상, 예컨대 1 ㎛ 이상, 예컨대 2 ㎛ 이상, 예컨대 3 ㎛ 이상, 예컨대 5 ㎛ 이상, 예컨대 10 ㎛ 이상, 예컨대 15 ㎛ 이상, 예컨대 25 ㎛ 이상만큼 샘플(예를 들면, 유동 스트림의 표면)에서 서로 이격될 수 있다.
관련 양태에 있어서, 상기 시스템은 고주파 편이된 빔 중 하나(본 명세서에서는, "국부 발진기(LO) 빔")를 수용하고 다른 주파수 편이된 빔(본 명세서에서는, "RF 콤 빔")의 전파 경로와는 상이한 전파 경로를 따라 상기 LO 빔을 지향시키기 위한 광학 요소를 포함할 수 있다. 상기 시스템은 톱햇형 강도 프로파일을 LO 빔에 부여하기 위한 톱햇 빔 셰이퍼, 및 샘플을 조명하기 위한 합성 여기 빔을 형성하기 위해 제1 작동 모드에서 톱햇형 LO 빔을 RF 콤 빔과 조합하기 위한 하나 이상의 광학 요소를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 양태의 추가적인 이해는 하기에서 간략하게 설명되는 관련 도면과 함께 하기의 상세한 설명을 참조함으로써 얻어질 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 시스템을 개략적으로 도시하고,
도 2a는 빔의 전파 방향에 수직한 평면에서의 가우시안 빔의 예시적인 개략 프로파일이고,
도 2b는 톱햇 빔 셰이퍼를 통해 도 2a에 도시된 가우시안 빔을 통과시키고 빔 셰이퍼의 출력 빔을 포커싱시킴으로써 얻어진 개략적인 톱햇 빔 프로파일이고,
도 3은 예시적인 톱햇 빔 셰이퍼의 구성요소를 개략적으로 도시하고,
도 4는 복수의 RF 콤 빔의 단면 빔 프로파일을 개략적으로 도시하고,
도 5는 톱햇 빔 프로파일을 갖는 LO 빔과 도 4에 도시된 RF 콤 빔의 중첩을 개략적으로 도시하고,
도 6은 분석중인 샘플을 조명하는 도 5에 도시된 조합 빔을 개략적으로 도시하고,
도 7은 가상 형광단의 예시적인 에너지 레벨을 개략적으로 도시하고,
도 8은 도 7의 가상 형광단에 대응하는 흡수 곡선을 개략적으로 도시하고,
도 9a는 형광 방사선의 전송을 위한 광섬유를 포함하는, 본 교시의 일 구현예에 따른 검출 시스템을 개략적으로 도시하고,
도 9b는 본 교시의 일 구현예에 따른 다른 검출 시스템을 개략적으로 도시한 것으로서, 형광 방사선이 자유 공간을 통해 전파하여 복수의 광검출기에 도달하는 것을 도시하고,
도 9c는 본 교시의 일부의 구현예에서 사용하기 위한 명시야 및 암시야 이미지 생성 아암을 개략적으로 도시하고,
도 9d는 본 교시의 일부의 구현예에서 사용하기 위한 검출 시스템을 개략적으로 도시한 것으로, 이 검출 시스템이 명시야 이미지를 생성하기 위한 검출 아암, 및 샘플로부터 산란된 여기 방사선뿐만 아니라, 샘플에 의해 방출된 형광 방사선의 검출 능력을 통합하는 검출 아암을 포함하는 것을 도시하고,
도 10은 본 발명에 따른 시스템의 일 구현예에서 광검출기에 의해 생성된 형광 신호가 증폭기에 의해 증폭될 수 있고, 증폭된 신호가 분석 모듈에 의해 분석되어 분석중인 샘플의 형광 이미지를 구성할 수 있는 것을 개략적으로 도시하고,
도 11a 및 도 11b는 복수의 RF 콤 빔 및 톱햇 프로파일형 LO 빔으로 구성된 조합 빔으로 샘플을 조명함으로써 얻어진 형광 신호의 분석을 위한, 본 발명의 일 구현예에 따른 방법에 있어서의 다양한 단계를 도시하고,
도 12는 본 발명의 일 구현예에 따른 분석 모듈의 예시적인 하드웨어 실행예의 선택된 구성요소를 개략적으로 도시하고,
도 13a 및 도 13b는 복수의 RF 콤 빔 및 톱햇 프로파일형 LO 빔으로 구성된 조합 빔으로 샘플을 조명함으로써 얻어진 형광 신호의 분석을 위한, 본 발명의 일 구현예에 따른 다른 방법에 있어서의 다양한 단계를 도시하고,
도 14a 및 도 14b는 복수의 RF 콤 빔 및 톱햇 프로파일형 LO 빔으로 구성된 조합 빔으로 샘플을 조명함으로써 얻어진 형광 신호의 분석을 위한, 본 발명의 일 구현예에 따른 또 다른 방법에 있어서의 다양한 단계를 도시하고,
도 15a는 단일 여기 주파수의 톱햇 프로파일형 빔에 의한 샘플의 조명을 개략적으로 도시하고,
도 15b는 형광 수명 측정 및 형광 수명 이미징을 허용하는, 본 교시의 일 구현예에 따른 시스템의 개략도이고,
도 16a는 본 교시의 일 구현예에 따른 세포 계측 시스템을 사용함으로써 얻어진 8개의 이산 레벨의 형광 염료로 착색된 폴리스티렌 비드의 암시야 강도 대 명시야 강도의 산포도이고,
도 16b는 복수의 폴리스티렌 비드에 의해 방출된 적색 형광(PE) 대 녹색 형광(FITC)의 산포도를 나타내며, 여기서 데이터는 게이트로서 도 16a에 도시된 산포도의 직사각형 섹션을 사용함으로 얻어졌으며,
도 16c 및 도 16d는 도 16b에 나타낸 데이터에 대응하는 히스토그램이고,
도 17a는 본 교시에 따른 세포 계측 시스템을 사용하여 얻어진 항-CD45-FITC 및 프로피디움 요오드화물로 착색된 고정 말초 혈액 백혈구를 포함하는 샘플의 명시야, 암시야 및 형광 이미지를 도시하며, 여기서 샘플은 또한 Calcein-AM으로 착색된 살아있는 HeLa 세포의 일부를 포함하며,
도 17b는 도 17a가 이미지를 제공하는 샘플에서 집단 A가 백혈구를 나타내고, 집단 B가 HeLa 세포를 나타내는 산포도이고,
도 18a는 본 교시의 일 구현예에 따른 세포 계측 시스템을 사용하여 얻어진 항-CD45-FITC 및 프로피디움 요오드화물로 착색된 고정 말초 혈액 백혈구를 포함하는 샘플의 명시야, 암시야 및 형광 이미지를 도시하며, 여기서 샘플에는 항-EpCAM-FITC 및 프로피디움 요오드화물로 착색된 소량의 고정 MCF-7 세포가 섞여 있으며,
도 18b는 도 18a가 이미지를 제공하는 샘플에서 집단 A가 백혈구를 나타내고, 집단 B가 MCF-7 세포를 나타내는 산포도이다.
본 교시는 일반적으로 샘플의 형광 분석을 수행하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 후술하는 바와 같이, 일부의 구현예에서, 본 교시에 따른 시스템은 세포 계측을 수행하기 위한 3개의 작동 모드로 작동할 수 있다. 본 교시를 설명하기 위해 하기에서 사용되는 다양한 용어는, 달리 언급되지 않으면, 당업계에서의 일반적인 의미를 갖는다. 예를 들면, "형광단(fluorophore)"이라는 용어는, 당업계에서의 통상적인 의미와 일치하게, 본 명세서에서 여기 방사선에 의한 조사에 반응하여 방사선을 방출할 수 있는 형광성 화학적 화합물을 지칭하는 데 사용된다.
"세포 계측(cytometry)" 및 "유동 세포 계측(flow cytometry)"이라는 용어는 또한 당업계의 통상적인 의미와 일치하게 사용된다. 특히, "세포 계측"이라는 용어는 세포를 식별 및/또는 분류하거나 다른 방식으로 분석하기 위한 기술을 지칭할 수 있다. "유동 세포 계측"이라는 용어는 유체 유동에 존재하는 세포가, 예를 들어 형광성 마커로 세포를 표지하고 방사성 여기를 통해 형광성 마커를 검출함으로써, 식별 및/또는 분류되거나 다른 방식으로 분석될 수 있는 세포 계측 기술을 지칭할 수 있다. "약" 및 "실질적으로"라는 용어는 본 명세서에서 수치 값을 포함하는 특성에 대하여 10% 또는 5%의 최대 변화를 나타내는 데 사용된다.
도 1은 본 교시의 구현예에 따른 세포 계측을 수행하기 위한 시스템(10)을 개략적으로 도시하며, 이 시스템은 3개의 작동 모드로 작동될 수 있다. 보다 상세하게 후술하는 바와 같이, 하나의 작동 모드에서, 연구중인 샘플은 복수의 여기 주파수로 동시에 조명될 수 있으며, 각각의 여기 주파수는 예를 들어 레이저 빔의 중심 주파수를 편이시킴으로써 얻어질 수 있다. 보다 상세하게는, 복수의 샘플 위치는 기준 레이저 빔(본 명세서에서는 국부 발진기 빔이라고도 지칭됨)을 복수의 고주파 편이된 레이저 빔과 혼합함으로써 생성된 레이저 빔에 의해 동시에 조명될 수 있고, 그에 따라 각각의 샘플 위치는, 존재한다면, 그와 같은 위치에서 관심 있는 형광단을 여기시키기 위해 고주파 편이된 빔 중 하나 및 기준 빔에 의해 조명된다. 일부의 구현예에서, 기준 빔 자체는 레이저 빔의 고주파 편이를 통해 생성될 수 있다. 따라서, 샘플의 각각의 공간 위치는 기준 빔의 주파수와 고주파 편이된 빔 중 하나의 주파수 사이의 차이에 대응하는 상이한 비트 주파수로 "태깅(tagging)"될 수 있다. 다시 말해서, 형광단에 의해 방출된 형광 방사선은 비트 주파수를 공간적으로 인코딩할 것이다. 형광 방출이 검출될 수 있고, 그 주파수 성분이 분석되어 샘플의 형광 이미지를 구성할 수 있다.
다른 작동 모드에서, 샘플은 복수의 여기 주파수의 레이저 빔에 의해 시간 간격에 걸쳐 연속적으로 조명될 수 있다. 일부의 이와 같은 구현예에서, 여기 주파수는 시변 구동 신호(time-varying drive signal)를 레이저 빔을 수용하는 음향-광학 디플렉터(AOD)에 인가함으로써 얻어질 수 있다. 많은 구현예에서, 레이저 빔은 수백 테라헤르츠(THz) 범위, 예를 들어 약 300 THz 내지 약 1000 THz 범위의 주파수를 갖는다. AOD에 인가된 구동 신호는 전형적으로, 고주파 범위, 예를 들어 약 10 MHz 내지 약 250 MHz 범위에 있다. AOD를 통한 레이저 빔의 통과는 상이한 회절 차수에 각각 대응하는 복수의 회절 빔을 생성한다. 0차 회절 빔이 입력 레이저 빔의 주파수에 대한 주파수 편이가 없음을 나타내는 반면, 보다 높은 고차 회절 빔은 구동 신호의 주파수 또는 그 배수에 대응하는 입력 레이저 빔의 주파수에 대한 주파수 편이를 나타낸다. 일부의 구현예에서, 구동 신호에 의해 편이된 입력 레이저 빔의 주파수에 대응하는 주파수를 갖는 1차 회절 빔은, 분석중인 샘플에 존재한다면, 관심 있는 형광단을 여기시키기 위한 여기 빔으로서 이용된다. 구동 신호가 시간에 따라 변함에 따라, 1차 회절 빔의 주파수 및 각도 편이도 변하여, 상이한 위치에서 상이한 여기 주파수로의 샘플의 조명을 허용한다. 각각의 조명된 위치로부터의 형광 방출은, 존재한다면, 수집 및 분석되어 샘플의 형광 이미지를 구성할 수 있다.
또 다른 작동 모드에서, 상기 시스템(10)은, 예를 들어 고주파에 의해 레이저 빔의 중심 주파수를 편이시킴으로써 생성될 수 있는 단일 여기 주파수에 의해 동시에 샘플의 복수의 위치를 조명하도록 작동될 수 있다. 예를 들면, 샘플의 수평 범위는 단일 여기 주파수의 레이저 빔에 의해 조명될 수 있다. 검출된 형광 방사선은 샘플, 예를 들어 세포/입자의 형광 성분(fluorescence content)을 분석하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 후술하는 것 중에서, 상기 시스템(10)의 하나의 이점은 상이한 작동 모드들 사이를 전환할 때 상이한 기구를 이용할 필요가 없거나 시스템에 어떠한 기계적 변형도 가할 필요가 없이 상이한 모드에서 형광 방출 데이터를 얻는 데 상당한 유연성을 제공한다는 것이다.
특정 구현예에 있어서, 시스템은 하나 이상의 광원을 포함한다. 일부의 예에서, 광원은, 조합하여 조명광의 협대역을 생성하는 하나 이상의 광학 대역 통과 필터, 회절 격자, 모노크로메이터(monochromator), 또는 이들의 임의의 조합에 결합된 광대역 광원, 좁은 파장 LED 또는 레이저를 포함하지만 이에 한정되지 않는 협대역 광원이다. 특정 예에서, 광원은 단일 파장 다이오드 레이저(예를 들면, 488 ㎚ 레이저)와 같은 단일 파장 레이저이다. 일부의 구현예에서, 본 시스템은 단일 광원(예를 들면, 레이저)을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 시스템은, 5개 이상의 상이한 광원을 포함하여, 2개 이상의 상이한 광원, 예컨대 3개 이상의 상이한 광원, 예컨대 4개 이상의 상이한 광원을 포함한다. 예를 들면, 시스템은 제1 파장을 출력하는 제1 광원(예를 들면, 레이저) 및 제2 파장을 출력하는 제2 광원을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 시스템은 제1 파장을 출력하는 제1 광원, 제2 파장을 출력하는 제2 광원 및 제3 파장을 출력하는 제3 광원을 포함한다.
각각의 광원은, 450 ㎚ 내지 850 ㎚를 포함하여, 300 ㎚ 내지 1000 ㎚, 예컨대 350 ㎚ 내지 950 ㎚, 예컨대 400 ㎚ 내지 900 ㎚의 범위인 파장을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 광원은 하나 이상의 형광단의 흡수 최대값에 대응하는 파장을 갖는다(후술함). 예를 들면, 광원은 280 ㎚ 내지 310 ㎚, 305 ㎚ 내지 325 ㎚, 320 ㎚ 내지 350 ㎚, 340 ㎚ 내지 375 ㎚, 370 ㎚ 내지 425 ㎚, 400 ㎚ 내지 450 ㎚, 440 ㎚ 내지 500㎚, 475 ㎚ 내지 550 ㎚, 525 ㎚ 내지 625 ㎚, 625 ㎚ 내지 675㎚ 및 650 ㎚ 내지 750㎚ 중 하나 이상의 범위인 파장을 갖는 광을 출력할 수 있다. 특정 구현예에서, 각각의 광원은 348 ㎚, 355 ㎚, 405 ㎚, 407 ㎚, 445 ㎚, 488 ㎚, 640 ㎚ 및 652 ㎚로부터 선택된 파장을 갖는 광을 출력한다.
상기 시스템(10)은 레이저 빔(14)을 생성하는 레이저 방사선원(12)을 포함한다. 예로서, 레이저 빔은 약 300 ㎚ 내지 약 1000 ㎚ 범위의 진공 파장에 대응하는 약 1000 T㎐ 내지 약 300 T㎐의 범위의 주파수를 가질 수 있다. 레이저 빔의 빔 직경(예를 들면, 가우시안 레이저 빔이 이용될 때 빔 웨이스트(beam waist))은 예를 들어 약 0.1 ㎜ 내지 약 10 ㎜의 범위일 수 있다. 일반성의 어떠한 손실도 없이, 본 구현예에서, 레이저(12)는 약 1 ㎜의 빔 직경을 갖는 488 ㎚의 파장으로 방사선을 방출한다.
레이저 빔의 주파수는 시스템이 의도되는 특정 응용(들)에 기초하여 선택될 수 있다. 구체적으로는, 보다 상세하게 후술하는 바와 같이, 레이저 주파수는, 형광단이 보다 낮은 주파수의 형광 방사선을 방출하게 하도록, 예를 들어 방사선의 흡수를 통해 관심 있는 형광단의 전자 전이를 여기시키기에 적합할 수 있다. 다양한 레이저원이 이용될 수 있다. 이와 같은 레이저원의 일부 예는, 코히런트 인코퍼레이티드(Coherent, Inc.)(Santa Clara, CA U.S.A.)에 의해 시판되는 Sapphire 488-SF, Genesis MX-488-1000-STM(코히런트 인코퍼레이티드), OBIS 405-LX(코히런트 인코퍼레이티드), 보트란 레이저 테크놀로지 인코퍼레이티드(Vortran Laser Technology, Inc.)(Sacramento, CA U.S.A.)에 의해 시판되는 Stadus 405-250, 및 뉴포트 코퍼레이션(Newport Corporation)(Irvine, CA U.S.A.)의 LQC-660-110을, 제한 없이, 포함한다. 일반성의 어떠한 손실도 없이, 본 구현예에서, 레이저 빔은 그 전파 방향에 수직한 평면에서 가우시안 강도 프로파일을 갖는 것으로 간주된다.
미러(16)는 레이저 방사선 빔(14)을 수용하고 반사를 통해 음향-광학 디플렉터(AOD)(18)로 레이저 빔을 지향시킨다. 본 구현예에서, AOD(18)는 빔(14)의 전파 방향에 수직한 축을 중심으로 한 AOD의 회전을 허용하는 조정 가능한 포스트 홀더 마운트(adjustable post holder mount)(A) 상에 장착된다. 컨트롤러(21)의 제어하에서 작동하는 직접 디지털 합성기(DDS)(20)는 하나 이상의 구동 신호를 AOD(18)에 인가할 수 있다. 예로서, 일부의 구현예에서, 이와 같은 구동 신호는 약 50 MHz 내지 약 250 MHz의 주파수 범위에 걸쳐 있을 수 있다. 예를 들면, AOD에 인가된 구동 신호는, 75MHz 내지 125 MHz를 포함하여, 55 MHz 내지 225 MHz, 예컨대 60 MHz 내지 200 MHz, 예컨대 65 MHz 내지 175 MHz, 예컨대 70 MHz 내지 150 MHz일 수 있다. 일부의 구현예에서, 구동 신호는 약 0.1 MHz 내지 약 4 MHz 범위의 주파수만큼 서로 분리될 수 있다. 예를 들면, 구동 신호는, 약 1 MHz 내지 약 3.5 MHz를 포함하여, 약 0.2 MHz 내지 약 3.9 MHz, 예컨대 약 0.3 MHz 내지 약 3.8 MHz, 예컨대 약 0.4 MHz 내지 약 3.7 MHz, 약 0.5 MHz 내지 약 3.6 MHz의 주파수만큼 서로 분리될 수 있다. 본 구현예에서, 전자 전력 증폭기(21')는 AOD(18)에 인가하기 위해 DDS(20)에 의해 생성된 고주파 신호를 증폭한다.
샘플이 복수의 여기 주파수와 동시에 조명되는 작동 모드에서, RF 콤 발전기(20)는 복수의 RF 구동 신호를 AOD(18)에 동시에 인가한다. 예로서, 동시에 인가되는 RF 구동 신호의 수는 약 20개 내지 약 200개의 범위일 수 있다. 레이저 빔과 구동 신호의 상호작용은 레이저(12)에 의해 생성된 레이저 빔의 주파수에 대한 구동 신호 중 하나에 대응하는 주파수 편이를 각각 갖는 복수의 각도적으로 분리된 레이저 빔을 발생시킨다. 어떠한 특정 이론에도 제한되지 않고, AOD에서, 압전 변환기는 결정, 예를 들어 수정 내에 고주파 광자를 생성할 수 있으며, 이와 같은 고주파 광자에 의한 레이저 빔의 광학 광자의 산란은 주파수 편이된 레이저 빔을 생성시킬 수 있다. 이와 같은 주파수 편이된 빔 중 하나의 빔(22)은 본 명세서에서 "국부 발진기(LO)" 빔이라고 지칭되고, 주파수 편이된 빔 중 나머지 빔(24)은 본 명세서에서 "RF 콤 빔"이라고 지칭된다. 주파수 편이된 빔의 각도적 분리는 예를 들어 약 1 밀리라디안 내지 약 100 밀리라디안의 범위일 수 있다. 예를 들면, 주파수 편이된 빔들의 각도적 분리는, 10 밀리라디안 내지 약 75 밀리라디안을 포함하여, 2 밀리라디안 내지 약 95 밀리라디안, 예컨대 3 밀리라디안 내지 약 90 밀리라디안, 예컨대 4 밀리라디안 내지 약 85 밀리라디안, 예컨대 5 밀리라디안 내지 약 80 밀리라디안의 범위일 수 있다.
LO 및 RF 콤 빔은 본 구현예에서는 약 50 ㎜의 초점 거리를 갖는 포지티브 렌즈(positive lens)인 렌즈(26)를 통과한다. 렌즈(26)를 통과한 후에, LO 레이저 빔은 미러(28)에 의해 차단되고, 이 미러(28)는 LO 빔을 상이한 방향(본 구현예에서는 LO 빔의 원래 전파 방향에 실질적으로 직교하는 방향)으로 재지향시킨다. 미러(28)는 RF 콤 빔이 미러(28)를 지나치고 렌즈(30)(본 구현예에서는 200 ㎜의 초점 거리를 가짐)로 전파하도록 이와 같은 RF 콤 빔에 대해 위치된다. 이와 같은 방식으로, LO 빔 및 RF 콤 빔은 상이한 전파 방향을 따라 지향된다. 전술한 방식으로 픽오프 미러(pickoff mirror)(28)의 사용은 단일 AOD를 이용하여 LO 빔 및 RF 콤 빔 둘 모두를 생성하고 후술하는 방식으로 이들을 조합하여 샘플을 조명하기 위한 여기 빔을 생성할 수 있게 한다. 다수의 AOD(예를 들면, 2개의 AOD, 즉 LO 빔 생성을 위한 AOD와 RF 콤 빔 생성을 위한 AOD)보다는 단일 AOD의 사용은, 보다 상세하게 후술하는 바와 같이, 시스템의 설계를 단순화시키고, 또한 다수의 개별 작동 모드에서의 시스템의 효율적인 사용을 허용한다.
일부의 구현예에 있어서, LO 빔의 빔 프로파일은 RF 콤 빔과 재조합되기 전에 변경된다. 예를 들면, LO 빔의 빔 프로파일은 빔의 공간 치수, 빔 형상, 강도, 공간 분포 또는 이들의 임의의 조합으로 조정(증가 또는 감소)될 수 있다. 특정 구현예에서, LO 빔의 빔 프로파일의 공간 치수가 변경된다. 예를 들면, 빔 프로파일은 하나 이상의 치수에서, 예컨대 유동 스트림의 종축에 직교하는 축을 따라 빔 프로파일을 신장시키도록 조정될 수 있다. 이와 같은 구현예에 따른 일 예에서, 빔 프로파일의 공간 치수(예를 들면, 하나 이상의 치수)는, 5배 이상을 포함하여, 1% 이상, 예컨대 2% 이상, 예컨대 3% 이상, 예컨대 5% 이상, 예컨대 10% 이상, 예컨대 25% 이상, 예컨대 50% 이상, 예컨대 75% 이상, 예컨대 90% 이상, 예컨대 1.5배 이상, 예컨대 2배 이상, 예컨대 3배 이상만큼 증가될 수 있다. 이와 같은 구현예에 따른 다른 예에서, 빔 프로파일의 공간 치수(예를 들면, 하나 이상의 치수)는, 5배 이상을 포함하여, 1% 이상, 예컨대 2% 이상, 예컨대 3% 이상, 예컨대 5% 이상, 예컨대 10% 이상, 예컨대 25% 이상, 예컨대 50% 이상, 예컨대 75% 이상, 예컨대 90% 이상, 예컨대 1.5배 이상, 예컨대 2배 이상, 예컨대 3배 이상만큼 감소될 수 있다.
다른 구현예에 있어서, LO 빔의 빔 형상은 변경된다. 예를 들면, 빔 형상은 하나 이상의 치수에서 빔 프로파일을 신장시키도록 변경될 수 있다. 특정 예에서, LO 빔의 빔 형상은 LO 빔의 전파 방향에 수직한 평면에서 신장된다. 특정 구현예에서, LO 빔 프로파일의 형상은 원형 빔 프로파일로부터, 유동 스트림의 종축에 직교하는 축에서 신장되는 타원형 빔 프로파일로 변화된다. 다른 구현예에서, LO 빔 프로파일의 형상은 원형 빔 프로파일로부터, 유동 스트림의 종축에 직교하는 축에 긴 치수를 갖는 직사각형 빔 프로파일로 변화된다.
또 다른 구현예에 있어서, LO 빔의 강도가 변경된다. 예를 들면, LO 빔의 강도는, 5배 이상을 포함하여, 예컨대 1% 이상, 예컨대 2% 이상, 예컨대 3% 이상, 예컨대 5% 이상, 예컨대 10% 이상, 예컨대 25% 이상, 예컨대 50% 이상, 예컨대 75% 이상, 예컨대 90% 이상, 예컨대 1.5배 이상, 예컨대 2배 이상, 예컨대 3배 이상만큼 증가될 수 있다. 다른 구현예에서, LO 빔의 강도는, 5배 이상을 포함하여, 예컨대 1% 이상, 예컨대 2% 이상, 예컨대 3% 이상, 예컨대 5% 이상, 예컨대 10% 이상, 예컨대 25% 이상, 예컨대 50% 이상, 예컨대 75% 이상, 예컨대 90% 이상, 예컨대 1.5배 이상, 예컨대 2배 이상, 예컨대 3배 이상만큼 감소된다. 특정 구현예에서, LO 빔의 강도는 RF 콤 빔의 강도와 정합하도록 변경된다. 예를 들면, LO 빔의 강도가 0.001% 이하만큼 RF 콤 빔의 강도와 상이한 것을 포함하여, LO 빔은 10% 이하, 예컨대 9% 이하, 예컨대 8% 이하, 예컨대 7% 이하, 예컨대 6% 이하, 예컨대 5% 이하, 예컨대 4% 이하, 예컨대 3% 이하, 예컨대 2% 이하, 예컨대 1% 이하, 예컨대 0.01% 이하만큼 RF 콤 빔의 강도와 상이한 강도를 가질 수 있다. 특정 경우에, LO 빔 및 RF 콤 빔의 강도는 동일하다.
또 다른 구현예에 있어서, 빔 프로파일의 공간 분포가 또한 변경될 수 있다. 예를 들면, LO 빔은 LO 빔의 강도가 하나 이상의 치수에서 더 이상 가우시안이 아니도록 변경될 수 있다. 예를 들면, LO 빔은 유동 스트림의 종축에 평행한 제1 축을 따른 가우시안 분포 및 유동 스트림의 종축에 직교하는 제2 축을 따른 비가우시안 분포를 갖도록 변경될 수 있다.
임의의 빔 셰이핑 프로토콜이 굴절 및 회절 빔 셰이핑 프로토콜을 포함하지만 이에 한정되지 않는 LO 빔의 빔 프로파일을 변경하는 데 이용될 수 있다. 일부의 구현예에서, LO 빔은 톱햇 빔 셰이퍼에 의해 변경된다.
본 구현예에 있어서, LO 빔은 다른 포지티브 렌즈(32)(본 구현예에서는 약 200 ㎜의 초점 거리를 가짐)로 전파된다. 렌즈(26)와 렌즈(32)의 조합은 톱햇 빔 셰이퍼(34)의 후면 개구(back aperture)를 적절히 충전하도록 LO 빔을 확대 및 시준한다. 보다 구체적으로는, LO 빔(22)은 렌즈(32)를 통과하고 미러(33 및 35)에 의해 톱햇 빔 셰이퍼(34)로 반사된다.
톱햇 빔 셰이퍼(34)는 가우시안 LO 빔의 위상면(phase front)을 셰이핑하여 톱햇 강도 프로파일의 형성을 가능하게 한다. 보다 구체적으로는, 톱햇 빔 셰이퍼를 빠져나오는 LO 레이저 빔(22')은 빔 스플리터(44)에 의해 반사되고, 렌즈(46)(본 구현예에서는 100 ㎜의 초점 거리를 가짐)에 의해 중간 이미지 평면(48) 상에 포커싱된다. 중간 이미지 평면(48) 상의 레이저 빔은 빔의 전파 방향에 수직한 평면에서 수평 방향을 따라 톱햇 강도 프로파일을 갖는다. AOD(18)와 유사하게, 본 구현예에서, 빔 스플리터(44)는 조정 가능한 포스트 홀더 마운트(B) 상에 장착된다. 본 구현예에서, 톱햇 빔 셰이퍼는 방사선의 편광이 빔의 톱햇 방향(본 구현예에서 수평 방향)을 따라 실질적으로 균일한 톱햇 빔 프로파일을 생성한다.
예시로서, 도 2a는 톱햇 빔 셰이퍼에 진입할 때의 LO 레이저 빔의 가우시안 강도 프로파일을 개략적으로 도시한다. 도 2b에 개략적으로 도시된 바와 같이, 중간 이미지 평면(48)에서, LO 레이저 빔은 수평 방향(이와 같은 도면에서 페이지에 수직한 방향)으로 신장되는 빔 프로파일을 나타내고, 이 빔 프로파일은 프로파일을 통해 연장되는 각각의 수평 라인, 예를 들어 수평 라인(A)을 따라 실질적으로 일정하지만, 가우시안 프로파일에 따라 수직으로 변한다.
다양한 톱햇 빔 셰이퍼가 이용될 수 있다. 예로서, 비구면 또는 회절 광학 요소를 갖는 굴절 광학 요소는 적절한 공간 위상면을 갖는 빔을 생성하는 데 사용될 수 있으며, 이 빔은 렌즈에 의해 포커싱된 후에, 렌즈의 초점면에서 톱햇 프로파일 패턴을 생성할 것이다. 다수의 폼 팩터(form factor)가 이와 같은 톱햇 빔 셰이퍼에 대해 존재하며, 이와 같은 접근법의 다양한 실행예가 본 교시의 다양한 구현예에 있어서 샘플에서 적절한 LO 빔 형상을 생성하는 데 이용 가능하다. 예를 들면, "레이저 빔을 시준된 플랫톱 빔으로 변환시키는 굴절 광학 시스템(Refractive optical system that converts a laser beam to a collimated flat-top beam)"이라는 명칭의 미국 특허 제6,295,168호 및 "직사각형 플랫톱 빔 셰이퍼(Rectangular flat-top beam shaper)"라는 명칭의 미국 특허 제7,400,457호는 본 교시의 일부 구현예에 따른 시스템에서 플랫톱 빔 셰이퍼로 이용될 수 있는 빔 셰이핑 시스템을 개시하고 있으며, 이들 특허 문헌 둘 모두는 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 예시로서, 도 3은 2개의 직교로 배치된 비원통형 렌즈(302 및 304)를 포함하는 정사각형 또는 직사각형 빔을 제공하기 위한 빔 셰이핑 시스템(300)을 개략적으로 도시하는 미국 특허 제7,400,457호(다른 참조 번호를 가짐)의 도 1의 복제도이다. 제1 비원통형 렌즈(302)는 X-축을 따라 입사 빔(A)을 셰이핑하기 위한 것이고, 제2 비원통형 렌즈(304)는 Y-축을 따라 입사 빔(A)을 셰이핑하기 위한 것이다. 2개의 교차된 비원통형 렌즈는 X-축을 따라 플랫톱 프로파일을 갖는 결과적인 직사각형 레이저 빔(B)을 제공하도록 구성된다. 비원통형 렌즈(302)의 입력 표면(302a)은 표면의 중심에서 보다 작고 렌즈의 양 말단부를 향해 매끄럽게 증가하는 가변 곡률 반경을 갖는 볼록한 비원통형 표면이다. 제2 비원통형 렌즈(304)는 제1 비원통형 렌즈와 유사하지만, Y-축을 따라 비임을 셰이핑하기 위해 렌즈(302)에 대해 직교로 배치된다. 렌즈(302 및 304)의 입력 표면(302a/304a) 및 출력 표면(302b/304b)의 프로파일은 입사 빔(A)의 X-프로파일 및 Y-프로파일 및 결과적인 직사각형 빔(B)의 원하는 강도 프로파일의 함수로서 독립적으로 선택될 수 있다(예를 들면, 상기 특허의 칼럼 5 및 6 참조).
이용될 수 있는 상업적으로 입수 가능한 톱햇 빔 셰이퍼의 예는 예를 들어 오셀라 인코퍼레이티드(Osela, Inc.)((Lachine, Canada)에 의해 시판되는 DTH-1D-0.46deg-4㎜를 포함한다.
보다 상세하게 후술하는 바와 같이, 수평 방향을 따라 LO 빔을 신장시키기 위한 빔 셰이퍼의 사용은 다수의 이점을 제공한다. 예를 들면, LO 빔과 RF 콤 빔의 조합이 실질적으로 유사한 조명 강도를 갖는 복수의 샘플 위치를 조명하여 샘플 위치 전체에 걸쳐 LO 및 RF 콤 빔의 강도를 정합시키고, 이에 의해 높은 변조 깊이를 갖는 형광 신호의 강도 진폭 변조를 생성하는 것을 보장할 수 있다. 이와 같은 강도 정합의 부재시에, 이미징 시스템은 작은 시야를 가질 수 있고, AOD를 구동하는 모든 주파수(픽셀)를 이용할 수 없다. 형광 신호의 변조 깊이가 샘플의 형광 이미지를 재구성하는 시스템의 능력에 중요한 역할을 하므로, 모든 픽셀에서의 여기 비트 주파수의 균일하게 높은 변조 깊이가 시스템의 작동에 특히 유리하다. 또한, RF 콤 빔을 생성하기 위해 AOD에 인가된 전자 신호의 진폭은, RF 콤 빔을 동등하게 하도록 (예를 들면, 컨트롤러(21)를 이용함으로써) 직접 디지털 합성기의 출력을 제어함으로써, 이들의 강도가 RF 콤 빔 및 LO 빔이 중첩되는 모든 공간 위치에 걸쳐 LO 빔의 강도와 동일하도록 조정될 수 있다. 이와 같은 특징은 형광 방사선의 강도 진폭 변조의 높은 변조 깊이를 보장한다는 점에서 이점을 제공한다.
도 1을 다시 참조하면, RF 콤 빔(24)은 렌즈(26 및 30)의 조합을 통해 중간 이미지 평면(38) 상에 이미징된다. 보다 구체적으로는, RF 콤 빔(24)은 렌즈(26)를 통과하고, 미러(28)를 지나쳐서 렌즈(30)에 도달하고, 이 렌즈(30)는 RF 콤 빔을 미러(40 및 42)를 통해 중간 이미지 평면(38)으로 지향시킨다.
도 4는 중간 이미지 평면(38)에서의 예시적인 수의 RF 콤 빔의 분포를 개략적으로 도시한다(일반성의 손실 없이, RF 콤 빔의 수는 예시의 목적으로 6개인 것으로 선택되지만(RF1, ..., RF6으로 표시됨), 다른 수가 또한 이용될 수 있음). 도 4에 도시된 바와 같이, 중간 이미지 평면(38)에서, RF 콤 빔(24)은 수평 방향을 따라 서로 공간적으로 분리되어 있다. 다른 구현예에서, 2개 이상의 RF 콤 빔(24)은 부분적으로 중첩될 수 있다. 따라서, 렌즈(26 및 30)의 조합은 각도적으로 분리된 RF 콤 빔을 수평 범위에 걸쳐 있는 공간적으로 분리된 빔의 세트로 변환한다.
도 1을 다시 참조하면, 전술한 바와 같이, 빔 스플리터(44)는 톱햇 빔 셰이퍼(34)를 빠져나가는 레이저 빔(22')을 수용하고 그와 같은 빔을 렌즈(46)로 반사시키고, 이 렌즈(46)는 결국 LO 빔이 톱햇 빔 프로파일을 나타내는 중간 이미지 평면(48) 상에 빔을 포커싱시킨다. 빔 스플리터는 또한 중간 이미지 평면(38)으로부터 RF 콤 빔(24)을 수용하고 RF 콤 빔의 통과를 허용한다. 렌즈(46)는 RF 콤 빔(24)을 중간 이미지 평면(48) 상에 포커싱시켜 톱햇 빔 프로파일을 갖는 LO 빔과 조합시켜서 조합 빔(49)을 생성한다.
예시로서, 도 5는 그 전파 축에 수직한 평면에서 조합 빔(49)의 하나의 예시적인 프로파일을 개략적으로 도시한다. 조합 빔의 강도 프로파일은 톱햇 LO 빔(정사각형으로 개략적으로 도시됨)의 강도 프로파일과 RF 콤 빔(24)(각각이 원 중 하나에 의해 개략적으로 도시됨)의 강도 프로파일의 중첩으로서 생성된다. 보다 상세하게 후술하는 바와 같이, LO 빔 및 RF 콤 빔의 이와 같은 중첩은, 수평 범위를 따라서, 그와 같은 수평 범위를 따른 하나의 공간 위치에 각각 대응하는 복수의 비트 주파수를 제공한다. 샘플의 수평 범위를 조명할 때, 샘플의 위치로부터 방출된 형광 방사선은, 진폭 변조를 통해, 그와 같은 위치를 조명하는 방사선과 연관된 비트 주파수를 인코딩한다.
도 1을 다시 참조하면, 본 구현예에서 조정 가능한 포스트 홀더 마운트(C) 상에 장착된 포지티브 렌즈(50)(본 구현예에서 200㎜ 렌즈) 및 대물 렌즈(52)는 중간 평면(48)에서의 이미지를 유동 세포(54)를 통해 유동하는 샘플 상에 중계하기 위한 망원경(telescope)을 형성한다. 본 구현예에서, 미러(56)는 조합 빔(49)을 렌즈(50)로 반사시키고, 다이크로익 미러(58)는 렌즈(50)를 통과한 후의 조합 광 빔을 대물 렌즈(52)를 향해 반사시킨다.
도 6에 개략적으로 도시된 바와 같이, 조합 빔(49)은 유동 세포(54)를 통해 유동하는 샘플(62)의 복수의 공간 위치(60)를 동시에 조명한다. 따라서, 각각의 위치(60)는 RF 콤 빔 중 하나와 톱햇형 LO 레이저 빔의 일부분의 중첩에 의해 조명된다. 이와 같은 공간 위치에서, 방사선은, 존재한다면, 샘플 내의 관심 있는 형광단을 여기시킬 것이다. 보다 구체적으로는, 본 구현예에서, LO 빔 및 RF 콤 빔은 복수의 샘플 위치(60)에서, 예를 들어 여기된 전자 상태로의 형광단의 전자 전이를 일으킴으로써 형광단을 동시에 여기한다.
일부의 구현예에 있어서, 샘플은 복수의 세포가 동반되는 유동 유체를 포함할 수 있다. 일부의 경우에, 세포는 하나 이상의 형광성 마커(형광단)로 표지될 수 있다. 형광성 마커의 일부 예는, 형광성 단백질(예를 들면, GFP, YFP, RFP), 형광단으로 표지된 항체(예를 들면, 플루오레세인 이소티오시안산염(fluorescein isothiocyanate))(FITC), 피코에리트린(phycoerythrin)(PE), 알로피코시아닌(allophycocyanin)(APC)), 핵산 착색제(예를 들면, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI), SYT016, 프로피디움 요오드화물(PI)), 세포막 착색제(예를 들면, FMI-43), 및 세포 기능 염료(예를 들면, Fluo-4, Indo-1)를, 제한 없이, 포함한다. 다른 경우에, 세포 내에 존재하는 내인성 형광단은 세포로부터 형광 방사선을 유도하는 데 이용될 수 있다. 보다 상세하게 후술하는 바와 같이, 이와 같은 외인성 또는 내인성 형광단은 조명 방사선에 반응하여 전자 여기를 겪고, (전형적으로 여기 주파수보다 낮은 주파수의) 형광 방사선을 방출하며, 이 형광 방사선이 수집 및 분석된다.
예시로서, 그리고 어떠한 특정 이론에도 제한되지 않고, 도 7은 기저 전자 상태(A)뿐만 아니라, 형광단의 2개의 전자 여기된 전자 상태(B 및 C)에 대응하는 가상 에너지 레벨을 도시하고 있다. 형광단은 방사선 에너지의 흡수를 통해 기저 전자 상태(A)로부터 여기 전자 상태(B)로 여기될 수 있다. 다음에, 형광단은 예를 들어 형광단의 진동 모드에 의해 조정되는 비방사 전이를 통해 보다 낮은 여기 상태(B)로 이완될 수 있다. 형광단은 광학 전이를 통해 보다 낮은 전자 상태(C)로부터 기저 상태로 추가로 이완될 수 있으며, 이에 의해 여기 주파수보다 낮은 주파수의 형광 방사선을 방출한다. 이와 같은 가상의 예는 설명의 목적으로만 제공되고, 형광 방사선이 방출될 수 있는 유일한 메커니즘을 나타내는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다.
많은 경우에, 형광단은 기저 상태로부터 여기 전자 상태로 여기되는 주파수 범위에 걸쳐 전자기 방사선을 흡수할 수 있다. 예시로서, 도 8은 도 7과 관련하여 논의된 가상 형광단에 대한 흡수 곡선을 도시하고 있다. 본 교시에 따른 일 구현예의 하나의 실행예에 있어서, LO 주파수는 관심 있는 형광단의 피크 흡수에 대응하는 주파수와 일치하도록 선택될 수 있다. 고주파 편이된 빔은 각각의 비트 주파수에 의해 피크 흡수로부터 분리된 주파수를 가질 수 있다. 전형적으로, 이와 같은 주파수 분리는 여기 주파수의 임의의 저하를 회피하기 위해 형광단의 흡수 대역폭에 비하여 작다. 예로서, 그리고 예시로서만, 파선(A 및 B)은 RF 콤 빔 중 하나 및 LO 빔의 주파수를 개략적으로 도시하고 있다(설명의 용이성을 위해 도면은 일정한 축척으로 도시되어 있지 않음). 도시된 RF 콤 빔 중 하나 및 LO 레이저 빔 둘 모두에 의한 샘플의 공간 위치의 동시 조명은 LO 및 RF 콤 빔 주파수들 사이의 차이에 대응하는 비트 주파수로의 진폭 변조를 나타내는 형광 방사선을 초래한다.
또, 예시로서, 그리고 어떠한 특정 이론에도 제한되지 않고, RF 콤 빔 중 하나 및 LO 빔에 의한 동시 조명을 통해 형광단에 인가되는 전기장은 하기와 같이 수학적으로 정의될 수 있다:
식(1)
여기서,
Ecom은 조합 빔의 전기장을 나타내고,
ERF는 RF 콤 빔 중 하나와 연관된 전기장의 진폭을 나타내고,
ELO는 LO 빔과 연관된 전기장의 진폭을 나타내고,
ω0은 레이저(12)에 의해 생성된 레이저 빔의 주파수를 나타내고,
ωRF는 RF 콤 빔과 연관된 주파수 편이를 나타내며,
ωLO는 LO 빔과 연관된 주파수 편이를 나타낸다.
LO 및 RF 콤 빔의 전기장의 중첩에 반응하여 방출된 형광 방사선의 강도는(ωRF-ωLO)에 대응하는 비트 주파수로의 변조를 나타낼 것이다. 따라서, RF 콤 빔 중 하나와 LO 빔의 중첩에 의해 조명된 샘플의 각각의 공간 위치로부터 방사되는 형광 방사선은 그와 같은 공간 위치를 조명하는 RF 콤 빔과 연관된 고주파 편이와 LO 빔과 연관된 고주파 편이 사이의 차이에 대응하는 비트 주파수로의 변조를 나타낸다.
형광 방출의 프로세스가 한정된 시간(전형적으로 일반 유기 형광단에 대해 1 내지 10 나노초)을 필요로 하기 때문에, 방출된 형광은 여기 진동 주파수가 너무 높으면 높은 변조 깊이를 나타내지 않는다. 따라서, 많은 구현예에서, 여기 비트 주파수는 1/τf보다 상당히 작도록 선택되며, 여기서, τf는 형광단의 특성 형광 수명이다. 일부 예에서, 여기 비트 주파수는, 5배 이상을 포함하며, 1% 이상만큼, 예컨대 1% 이상, 예컨대 2% 이상, 예컨대 3% 이상, 예컨대 5% 이상, 예컨대 10% 이상, 예컨대 25% 이상, 예컨대 50% 이상, 예컨대 75% 이상, 예컨대 90% 이상, 예컨대 1.5배 이상, 예컨대 2배 이상, 예컨대 3배 이상만큼 1/τf보다 작을 수 있다. 예를 들면, 여기 비트 주파수는, 750 MHz 이상을 포함하여, 0.01 MHz 이상, 예컨대 0.05 MHz 이상, 예컨대 0.1 MHz 이상, 예컨대 0.5 MHz 이상, 예컨대 1 MHz 이상, 예컨대 5 MHz 이상, 예컨대 10 MHz 이상, 예컨대 25 MHz 이상, 예컨대 50 MHz 이상, 예컨대 100 MHz 이상, 예컨대 250 MHz 이상, 예컨대 500 MHz 이상만큼 1/τf보다 작을 수 있다.
구현예에 있어서, 광검출기는 조사된 샘플로부터의 광(예를 들면, 형광과 같은 발광)을 검출하도록 구성된다. 구현예에서, 광검출기는, 8개 이상의 검출기를 포함하여, 1개 이상의 검출기, 예컨대 2개 이상의 검출기, 예컨대 3개 이상의 검출기, 예컨대 4개 이상의 검출기, 예컨대 5개 이상의 검출기, 예컨대 6개 이상의 검출기, 예컨대 7개 이상의 검출기를 포함할 수 있다. 다른 광검출기 중에서도, 능동 픽셀 센서(APS), 4분할 포토다이오드(quadrant photodiode), 이미지 센서, 전하 결합 소자(CCD), 강화된 전하 결합 소자(ICCD), 발광 다이오드, 광자 카운터, 볼로미터(bolometer), 초전 검출기(pyroelectric detector), 포토레지스터(photoresistor), 광전지(photovoltaic cell), 포토다이오드, 광전자 증배관, 포토트랜지스터(phototransistor), 양자점 광전도체(quantum dot photoconductor) 또는 포토다이오드, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 광 검출 프로토콜이 이용될 수 있다. 일부의 구현예에서, 관심 있는 광검출기는, 400 ㎚ 내지 800 ㎚를 포함하여, 350 ㎚ 내지 1200 ㎚, 예컨대 450 ㎚ 내지 1150 ㎚, 예컨대 500 ㎚ 내지 1100 ㎚, 예컨대 550 ㎚ 내지 1050 ㎚, 예컨대 500 ㎚ 내지 1000 ㎚의 범위인 광을 검출하도록 구성된다. 특정 구현예에서, 광검출기는 395 ㎚, 421 ㎚, 445 ㎚, 448 ㎚, 452 ㎚, 478 ㎚, 480 ㎚, 485 ㎚, 491 ㎚, 496 ㎚, 500 ㎚, 510 ㎚, 515 ㎚, 519 ㎚, 520 ㎚, 563 ㎚, 570 ㎚, 578 ㎚, 602 ㎚, 612 ㎚, 650 ㎚, 661 ㎚, 667 ㎚, 668 ㎚, 678 ㎚, 695 ㎚, 702 ㎚, 711 ㎚, 719 ㎚, 737 ㎚, 785 ㎚, 786 ㎚, 805 ㎚와 같은 발광의 방출 최대에서 광을 검출하도록 구성된다.
일부의 구현예에 있어서, 샘플에 의해 방출된 형광 방사선은 다양한 상이한 방식으로, 예를 들어 여기 빔의 전파 방향에 수직한 광학 경로를 따라 수집될 수 있다. 다른 구현예에서, 형광 방사선은 에피-방향(epi-direction)에서 검출된다.
도 1을 다시 참조하면, 본 구현예에서, 조명된 샘플 내에 존재하는 하나 이상의 형광단에 의해 방출된 형광 방사선은 대물 렌즈(52)를 통과하고, 다이크로익 미러(58)를 통해 투과되어 광검출기(64)에 도달한다. 보다 구체적으로는, 본 구현예에서, 렌즈(65)는 다이크로익 미러(58)를 통해 투과된 형광 방사선을 슬릿 개구(slit aperture)(66) 상에 포커싱시킨다. 슬릿을 통해 투과된 형광 방사선은 형광 방출 필터(68)를 통과하여 광검출기(64)에 도달한다. 광검출기의 전방에 배치된 슬릿 개구(66)(또는 후술하는 다른 구현예에서의 광학 필터)는 샘플의 특정 평면으로부터 방출된 형광 방사선을 실질적으로 통과시키면서 면외(out-of-plane) 형광 방출을 배제한다. 또한, 형광 방출 필터(68), 예를 들어 통과 대역 필터는 형광 방사선을 광검출기(64)로 통과시키면서 다른 주파수의 방사선의 통과를 실질적으로 차단한다.
광검출기(64)는 비트 주파수의 전체 범위로부터 신호를 검출하고 전송하기에 충분한 RF 대역폭을 갖는다. 적합한 광검출기의 일부 예는, 그 중에서도, 광전자 증배관, 애벌란시 포토다이오드(avalanche photodiode), PIN 포토다이오드 및 하이브리드 광검출기를, 제한 없이, 포함한다. 예로서, 일부의 구현예에서, 하마마츠 코퍼레이션(Hamamatsu Corporation)에 의해 시판되는 광전자 증배관(예를 들면, R3896, R10699, H11462)이 이용될 수 있다. 광검출기는 수용된 형광 방사선의 검출에 반응하여 신호, 예를 들어 본 구현예에서는 아날로그 신호를 생성한다.
다른 예로서, 그리고 도 9a를 참조하면, LO 빔 및 공간적으로 분리된 RF 콤 빔에 의한 동시 조명에 반응하여 샘플에 의해 방출된 형광 방사선은 대물 렌즈(52) 및 다이크로익 미러(58)를 통과하여 렌즈(100)를 통해 다중모드 광섬유(102) 상에 결합되고, 이 다중모드 광섬유는 근위 단부(102a)로부터 원위 단부(102b)까지 연장된다. 보다 구체적으로는, 광섬유(102)의 근위 단부(102a)는 형광 방사선을 수용하도록 렌즈(100)의 초점면에 근접하게 위치된다. 광섬유의 원위 단부(102b)에 결합된 광추출 렌즈(outcoupling lens)(104)는 광섬유를 빠져나가는 방사선을 시준한다.
많은 경우에, 샘플을 조명하는 여기 방사선은 여기 주파수가 샘플 내의 다수의 형광단의 흡수 스펙트럼 내에 있도록 충분히 넓은 방사선 흡수 스펙트럼을 가질 수 있는 다수의 형광단(예를 들면, 유기 형광단)을 여기한다. 다음에, 각각의 형광단은 상이한 주파수의 형광 방사선을 방출한다. 일반성의 손실 없이, 그리고 예시의 목적으로, 본 구현예에서, 검출 시스템은 4개의 광전자 증배관(106, 108, 110 및 112)을 포함하며, 각각 광전자 증배관은 조명된 샘플에서 여기 방사선에 의해 여기된 4개의 형광단 중 하나에 의해 방출된 형광 방사선에 대응하는 시준된 방사선의 일부분을 수용한다. 보다 구체적으로는, 다이크로익 미러(114)는 제1 주파수로 형광단 중 하나에 의해 방출된 형광 방사선을 광전자 증배관(106)으로 반사시키면서 다른 주파수의 형광 방사선을 통과시킨다. 다른 다이크로익 미러(116)는 상이한 제2 주파수로 상이한 형광단에 의해 방출된 형광 방사선을 광전자 증배관(108)으로 반사시키면서, 제3 주파수로 또 다른 형광단에 의해 방출된 형광 방사선을 포함하는 나머지 방사선이 제3 다이크로익 미러(118)에 도달하게 하며, 이 제3 다이크로익 미러는 그와 같은 형광 방사선을 광전자 증배관(110)으로 반사시킨다. 다이크로익 미러(118)는 제4 방사선 주파수로 제4 형광단에 의해 방출된 형광 방사선을 포함하는 나머지 방사선을 통과시켜서 광전자 증배관(112)에 도달하게 한다.
4개의 형광 주파수 중 하나에 각각 중심설정된 복수의 대역 통과 필터(120, 122, 124 및 126)는 각각 광전자 증배관(106, 108, 110 및 112)의 전방에 배치된다. 각각의 광전자 증배관에 의해 검출된 신호는 후술하는 방식으로 분석되어 각각의 형광 주파수로 형광 이미지를 생성한다. 일부의 구현예에서, 다수의 광검출기를 사용하기보다는, 단일 광검출기, 예를 들어 단일 광전자 증배관이 형광 방사선, 예를 들어 단일 형광단으로부터의 방출에 대응하는 형광 주파수를 검출하는 데 사용될 수 있다.
일부의 구현예에서, 샘플이 유동 세포를 통해 유동할 때, 샘플의 상이한 수평 열이 조명되고, 각각의 수평 열과 연관된 형광 방사선이 광전자 증배관(106, 108, 110 및 112)과 같은 하나 이상의 광검출기에 의해 검출된다.
도 9b는 도 9a와 관련하여 전술한 것과 유사한 검출 시스템을 개략적으로 도시하고 있으며, 이와 같은 검출 시스템은, 광섬유를 사용하기보다는, 다이크로익 미러(58)를 통과한 복수의 형광단으로부터의 형광 방출을 포함하는 형광 방사선이 자유 공간에서 전파하여 광전자 증배관(106, 108 및 112)에 도달한다는 것을 제외하고는, 도 9a의 것과 유사하다. 보다 구체적으로는, 렌즈(100)는 렌즈들(100 및 104) 사이에 배치된 개구(126) 상에 형광 방사선을 포커싱시키고, 여기서 개구는 초점을 벗어난 방사선을 배제할 수 있다. 렌즈(104)는 개구를 통과하는 방사선을 시준하며, 여기서 시준된 방사선은 도 9a와 관련하여 전술한 방식으로 광전자 증배관들 사이에 분배된다.
일부의 구현예에서, 상기 시스템(10)은 여기 방사선을 사용하여 (샘플의 부재시의 유동 세포의) 샘플의 암시야 이미지 및 명시야 이미지를 제공하도록 구성될 수 있다. 예로서, 도 9c는 샘플의 암시야 이미지 및 명시야 이미지를 각각 검출하기 위한 2개의 검출 아암(200 및 202)을 포함하는 시스템(10)의 일 구현예를 개략적으로 도시하고 있다.
보다 구체적으로는, 검출 아암(200)은 유동 세포를 통해 유동하는 샘플에 의해 산란된 여기 방사선의 일부분을 수용하도록 여기 방사선의 전파에 수직하게 위치된다. 검출 아암(200)은 2개의 렌즈(204 및 206)를 포함하고, 이들 렌즈는 샘플에 의해 산란된 여기 방사선의 적어도 일부분을 렌즈(204)에 의해 대응되는 입체각으로 광전자 증배관(208) 상으로 집합적으로 지향시킨다. 보다 구체적으로는, 렌즈(204)는 수용된 산란 방사선을 시준하고, 렌즈(206)는 평행한 산란 방사선을 광전자 증배관(208) 상에 포커싱시킨다. 본 구현예에서, 적절한 대역 통과 필터(210)는 원하는 주파수를 갖는 방사선을 광전자 증배관(208)으로 통과시키면서 원치 않는 주파수의 방사선을 차단하도록 광전자 증배관(208)의 전방에 배치된다. 광전자 증배관(208)의 출력은 당업계에 알려진 방식으로, 예를 들어 후술하는 바와 같은 분석 모듈에 의해 처리되어 암시야 이미지를 생성할 수 있다.
검출 아암(202)은 차례로 2개의 렌즈(212 및 214)를 포함하며, 여기서 렌즈(212)는 전방 방향으로(실질적으로 유동 세포(54)에 진입하는 여기 방사선의 전파 방향을 따라) 유동 세포를 빠져나가는 여기 방사선을 시준하고, 렌즈(214)는 시준된 방사선을 광검출기(216) 상에 포커싱시킨다. 광검출기의 전방에 배치된 적절한 필터(218), 예를 들어 대역 통과 필터는 여기 주파수를 광검출기(216)로 투과시키면서 다른 방사선 주파수를 실질적으로 차단한다. 광검출기(216)의 출력은 당업계에 알려진 방식으로 처리되어 유동 세포의 명시야 이미지를 생성할 수 있다.
따라서, 검출 아암(200)은 세포를 통해 유동하는 유체에 의해 산란된 여기 방사선을 검출하고, 검출 아암(202)은 유동 세포를 통해 투과되는 여기 방사선을 검출한다. 유체가 유동 세포를 통해 유동하지 않을 때, 광전자 증배관(208)에 의해 검출된 신호는 낮고, 광검출기(216)에 의해 검출된 신호는 높은데, 이는 유동 세포를 통과하는 여기 방사선의 산란이 거의 없기 때문이며, 따라서 대부분의 여기 방사선, 및 일부 경우에는 모든 여기 방사선이 유동 세포를 통해 투과된다. 대조적으로, 유동 세포를 통한 유체 샘플의 유동은 샘플에 의한 여기 방사선의 일부분의 산란으로 인해 광전자 증배관(208)에 의해 생성된 신호를 증대시킬 수 있고, 광검출기(216)에 의해 생성된 신호는 유동 세포를 통해 투과된 여기 방사선의 레벨이 감소하므로 감소한다.
다른 예로서, 그리고 도 9d를 참조하면, 본 교시에 따른 시스템의 일 구현예에서, 여기 방사선의 전파 방향에 실질적으로 직교하는 방향으로 유동 세포(54)에 대해 위치된 검출 아암(220a)은 샘플 내의 복수의 형광단에 의해 방출된 형광 방사선뿐만 아니라, 샘플에 의해 산란된 여기 방사선 둘 모두를 검출하기 위한 광검출기를 포함한다. 보다 구체적으로는, 검출 아암(220)은 비집속 방사선을 배제하는 개구(226) 상에 형광 방사선뿐만 아니라 산란된 여기 방사선을 지향시키는 렌즈(222 및 224)를 포함한다. 렌즈(228)는 개구를 통과하는 방사선을 시준한다. 다이크로익 미러(230)는 암시야 이미지의 검출을 위해 여기 주파수의 방사선의 일부분을 광전자 증배관(232) 상으로 반사시키면서 형광 방사선을 통과시킨다. 광전자 증배관(232)의 전방에 배치된 적절한 필터(232a), 예를 들어 대역 통과 필터는 여기 주파수의 방사선을 광전자 증배관(232)으로 통과시키면서 원치 않는 방사선 주파수를 차단한다. 다른 다이크로익 미러(234)는 제1 주파수로 형광단에 의해 방출된 형광 방사선을 광전자 증배관(236) 상으로 반사시키면서 다른 주파수로 다른 형광단에 의해 방출된 형광 방사선을 통과시킨다. 다른 다이크로익 미러(238)는 제2 주파수로 다른 형광단에 의해 방출된 형광 방사선을 광전자 증배관(240) 상으로 반사시키면서 제3 주파수로 또 다른 형광단에 의해 방출된 형광 방사선을 통과시키며, 여기서 이것이 광전자 증배관(242)에 의해 검출된다. 이전의 구현예와 유사하게, 복수의 필터(236a, 240a 및 242a)는 광전자 증배관(236, 240 및 242)의 전방에 각각 배치되어, 원하는 주파수의 방사선을 투과시키면서 원치 않는 방사선 주파수를 실질적으로 차단한다.
계속해서 도 9d를 참조하면, 본 교시에 따른 시스템의 이와 같은 실행예는, 예를 들어 도 9c와 관련하여 논의된 방식으로, 명시야 이미지를 생성하기 위한 다른 검출 아암(220b)을 추가로 포함한다. 보다 구체적으로는, 검출 아암(202)은 여기 방사선의 명시야 이미지를 생성하기 위해 광검출기(216) 상에 광을 포커싱시키는 2개의 렌즈(212 및 214)를 포함한다. 필터(218), 예를 들어 대역 통과 필터는 광검출기(216)의 전방에 배치되어, 검출기로 여기 방사선을 통과시키면서 원치 않는 방사선 주파수를 배제한다.
도 1뿐만 아니라 도 10을 다시 참조하면, 본 구현예에서, 트랜스임피던스 증폭기(transimpedance amplifier)(70)는 광검출기에 의해 생성된 신호를 증폭하기 위해 광검출기(64)(또는 도 9a 내지 9d와 관련하여 논의된 각각의 광검출기)의 출력부에 결합될 수 있다. 데이터 분석 유닛(72)(본 명세서에서는 분석 모듈 또는 분석기라고도 지칭됨)은 증폭된 신호를 수신하고 신호를 분석하여 샘플의 형광 이미지를 생성한다. 데이터 분석 유닛(72)은 하드웨어, 펌웨어 및/또는 소프트웨어로 구현될 수 있다. 예로서, 검출된 형광 데이터를 분석하기 위한 방법은 프로세서의 제어하에서 액세스되는 분석 모듈의 판독 전용 메모리(ROM) 유닛에 저장되어 수신된 형광 신호를 분석할 수 있다.
보다 상세하게 후술하는 바와 같이, 분석 방법은 시변 광검출기의 출력의 주파수 성분을 결정하고, 이와 같은 주파수 성분에 기초하여 샘플의 형광 이미지를 구성한다. 광검출기 출력의 주파수 성분을 결정하기 위한 다양한 방법이 이용될 수 있다. 이와 같은 적절한 방법의 일부 예는 푸리에 변환, 록인 검출(lock-in detection), 필터링, I/Q 복조, 호모다인 검출(homodyne detection) 및 헤테로다인 검출(heterodyne detection)을, 제한 없이, 포함한다.
예로서, 도 11a 및 도 11b는 샘플의 형광 이미지를 생성하기 위해 분석 모듈(72)에 의해 수행될 수 있는 예시적인 분석 단계를 도시하고 있다. 단계 (1)에서, 아날로그 증폭 신호는 디지털화되어 디지털화된 형광 데이터를 생성한다. 단계 (2)에서, 디지털화된 데이터의 적절한 부분(길이)이 분석을 위해 선택된다. 예를 들면, 샘플의 조명된 열(본 명세서에서는 프레임이라고도 지칭됨)에 대응하는 형광 데이터가 분석을 위해 선택될 수 있다. 대안적으로, 데이터 프레임의 일부분이 분석을 위해 선택될 수 있다.
단계 (3)에서, 선택된 데이터의 푸리에 변환이 수행된다. 예로서, 일부의 구현예에서, 데이터의 고속 푸리에 변환(Fast Fourier Transform; FFT)이 수행되어 데이터의 주파수 성분을 결정한다. 일부의 이와 같은 구현예에서, FFT의 빈(bin)은 데이터 획득을 위해 선택된 주파수에 대응할 수 있다. 예를 들면, 256 MHz 샘플링 속도의 경우, 256개의 샘플은 1 MHz만큼 서로 분리된 주파수 빈, 예를 들어 DC로부터 128 MHz까지를 산출할 수 있다. FFT 분석은 방출된 형광 방출이 진폭 변조를 나타내는 비트 주파수에 대응하는 주파수를 제공한다.
계속해서 도 11a 및 도 11b를 참조하면, 본 구현예에 있어서, 단계 (4)에서, FFT 데이터에 존재하는 각각의 주파수 성분의 진폭의 크기는 그와 같은 주파수 성분의 실수 및 허수 성분의 제곱의 합의 제곱근을 얻음으로써 산출된다. 각각의 주파수 성분이 샘플의 특정 위치로부터 형광 방사선을 유도하는 데 이용되는 비트 주파수 중 하나에 대응하므로, 주파수 성분의 진폭의 크기는 샘플의 수평 열을 따르는 그와 같은 주파수 성분과 연관된 위치에 대한 픽셀 값을 제공할 수 있다. 이와 같은 방식으로, 샘플의 수평 열의 이미지에 대한 픽셀 값이 결정될 수 있다. 샘플이 수직 방향으로 유동 세포를 통해 유동할 때 샘플의 각 수평 열에 대해 얻어진 형광 데이터에 대하여 상기 단계가 반복될 수 있다. 픽셀 값은 형광 이미지를 구성하는 데 사용될 수 있다(단계 5).
전술한 바와 같이, 분석 모듈(72)은 당업계에 알려진 기술을 사용하여 그리고 본 교시에 따라 하드웨어, 펌웨어 및/또는 소프트웨어로 구현될 수 있다. 예로서, 도 12는 증폭기(70)로부터 증폭된 형광 신호를 수신하고 그와 같은 신호를 디지털화하여 디지털화된 형광 데이터를 생성하기 위한 아날로그-디지털 변환기(74)를 포함하는 분석기(72)의 예시적인 실행예를 개략적으로 도시하고 있다. 분석 모듈은, 계산 및 논리 연산을 수행하는 것을 포함하여, 분석 모듈의 작동을 제어하기 위한 중앙 처리 장치(CPU)(76)를 추가로 포함한다. 분석 모듈은 또한 ROM(판독 전용 메모리)(78), RAM(랜덤 액세스 메모리)(80) 및 영구 메모리(permanent memory)(82)를 포함한다. 통신 버스(84)는, CPU(76)와 다른 구성요소 사이의 통신을 포함하여, 분석 모듈의 다양한 구성요소들 사이의 통신을 용이하게 한다. 메모리 모듈은 형광 데이터 및 분석 결과를 분석하기 위한 명령을 저장하는 데 사용될 수 있다. 예로서, 일부의 구현예에서, 데이터 분석을 위한 명령, 예를 들어 도 11a 및 도 11b와 관련하여 논의된 상기 단계를 수행하기 위한 명령이 ROM(78)에 저장될 수 있다. CPU는 RAM(80)에 저장된 디지털화된 형광 데이터를 연산하여 샘플의 형광 이미지(예를 들면, 1차원 또는 2차원 이미지)를 생성하도록 ROM(78)에 저장된 명령을 이용할 수 있다. CPU는 영구 메모리(82), 예를 들어 데이터베이스에 형광 이미지의 저장을 실행할 수 있다. 도 12에 개략적으로 도시된 바와 같이, 분석 모듈은 수신된 데이터(예를 들면, 형광 데이터)로부터 픽셀 강도 및 다른 양의 계산을 수행하기 위한 그래픽 처리 유닛(GPU)(76')을 선택적으로 포함할 수 있다.
일부의 구현예에 있어서, 광검출기에 의해 생성된 출력 신호의 주파수 복조는 록인 검출 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 예로서, 도 13a 및 도 13b를 참조하면, 이와 같은 일 구현예에서, 증폭된 형광 신호는 디지털화되고(단계 1), 디지털화된 형광 신호의 몇 개의 사본이 생성되며(단계 2), 여기서 디지털화된 사본의 수(N)는 RF 콤 빔과 연관된 주파수의 수에 대응한다. 신호의 각각의 디지털화된 사본은 RF 콤 빔 중 하나와 LO 빔의 주파수들 사이의 차이와 동일한 비트 주파수에 대응하는 주파수를 갖는 사인파 및 코사인파와 곱해져서 복수의 중간 신호를 생성한다(단계 2). 각각의 중간 신호는 RF 콤 주파수들 사이의 주파수 간격의 절반과 동일한 대역폭을 갖는 저역 통과 필터를 통과한다(단계 3).
RF 콤 주파수 중 하나에 대응하는 각각의 비트 주파수(다시 말해서, 조명된 샘플의 공간 위치에 대응하는 각각의 주파수)에 대하여, 그와 같은 주파수에 대응하는 2개의 필터링된 중간 신호의 제곱의 합의 제곱근은 그와 같은 주파수를 갖는 RF 콤 빔 및 LO 빔에 의해 조명된 샘플 위치에 대응하는 이미지 픽셀의 진폭의 크기로서 얻어진다(단계 4). 일부의 구현예에서, 동일한 비트 주파수에 대응하는(즉, 동일한 샘플 위치에 대응하는) 다수의 형광 데이터 신호는 전술한 방식으로 처리될 수 있고, 픽셀 값이 평균되어 평균 픽셀 값을 얻을 수 있다.
샘플이 수직 방향으로 유동 세포를 통해 유동할 때 샘플의 각 수평 열에 대해 얻어진 형광 데이터에 대하여 상기 단계가 반복될 수 있다. 픽셀 값은 형광 이미지를 구성하는 데 사용될 수 있다(단계 5).
상기 록인 검출 방법은 소프트웨어, 펌웨어 및/또는 하드웨어로 구현될 수 있다. 예로서, 일 구현예에서, 상기 록인 검출 방법은, 특히 6개 초과의 주파수가 사용되는 경우, 필드 프로그래머블 게이트 어레이(field programmable gate array; FPGA)를 사용하여 구현될 수 있다. 일부의 구현예에서, 취리히 인스트루먼츠(Zurich Instruments)(Zurich, Switzerland)에 의해 시판되는 HF2L-MF 다중 주파수 증폭기와 같은 다중 주파수 록인 증폭기가 이용될 수 있다.
다른 예로서, 일부의 구현예에서, 검출된 형광 신호의 주파수 복조는 대역 통과 필터-기반 이미지 복조 기술을 이용함으로써 달성될 수 있다. 도 14a 및 도 14b를 참조하면, 이와 같은 주파수 복조 방법의 일 구현예에서, 광검출기(64) 및 증폭기(70)에 의해 제공된 형광 신호는 디지털화되고(단계 1), 디지털화된 신호의 몇 개의 사본이 생성되며(단계 2), 여기서 디지털화된 사본의 수(N)는 RF 콤 빔과 연관된 주파수의 수에 대응한다. 디지털화된 형광 신호의 각각의 사본은 RF 콤 빔 중 하나와 연관된 비트 주파수(즉, 샘플의 특정 위치와 연관된 비트 주파수)에 중심설정된 대역 통과 필터를 통해 그와 같은 신호를 통과시킴으로써 필터링된다(단계 3). 보다 구체적으로는, 각각의 대역 통과 필터는 N개의 비트 주파수 중 하나에 중심설정되고, 인접한 비트 주파수들 사이의 주파수 간격의 절반과 동일한 대역폭을 갖는다.
각각의 비트 주파수에서의 포락선 검출기는, 각각의 수평 라인에 대해, 그와 같은 주파수에 대응하는 각 픽셀의 진폭을 추정하는 데 이용된다(단계 4). 일부 경우에, 픽셀에 대응하는 것으로서, 그와 같은 픽셀과 연관된 샘플 위치에 대응하는 다수의 형광 신호를 처리함으로써 얻어진 복수의 픽셀 값이 평균되어 평균 픽셀 값을 얻는다. 샘플이 수직 방향으로 유동 세포를 통해 유동할 때 샘플의 각 수평 열에 대해 얻어진 형광 데이터에 대하여 상기 단계가 반복될 수 있다. 픽셀 값은 샘플의 1차원 또는 2차원 형광 이미지를 구성하는 데 사용될 수 있다(단계 5).
분석 모듈은 또한 명시야 및 암시야 이미지 데이터를 수신 및 처리하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 도 9c 및 도 10을 참조하면, 분석 모듈(72)은 암시야 및 명시야 이미지를 생성하기 위해 광검출기(208 및 218)로부터 암시야 및 명시야 이미지 데이터를 수신하도록 추가로 구성될 수 있다. 예를 들면, 도 12를 참조하면, 예컨대 당업계에 알려진 방식으로 암시야 및 명시야 이미지를 생성하기 위한 명령이 영구 메모리(82)에 저장될 수 있다. 프로세서(76)는 이와 같은 명령을 이용하여 수신된 암시야 및 명시야 이미지 데이터를 처리하여 이미지를 생성할 수 있다. 분석 모듈은 또한, 예를 들어 명시야 및 암시야 이미지 중 하나 또는 둘 모두 및 형광 이미지를 오버레이함으로써 합성 이미지를 생성하도록 구성될 수 있다.
상기 시스템(10)과 같은 본 교시에 따른 시스템에 의해 생성된 명시야 및 암시야 이미지뿐만 아니라 형광 이미지가 다양한 상이한 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 형광 이미지는 종래의 유동 세포 계측기에 의해 생성된 데이터와 필적하는 값을 생성하도록 통합될 수 있다. 형광 이미지는 또한 그와 같은 이미지를 유발하는 형광 프로브의 위치를 결정하도록 분석될 수 있다(예를 들면, 프로브가 세포핵에 있는지, 세포질에 있는지, 세포 기관에 국소화되어 있는지 또는 세포막 외부에 있는지가 결정될 수 있음). 또한, 일부 응용에서, 모두가 동일한 세포로부터 취해진 상이한 형광 대역을 검출함으로써 얻어진 다수의 형광 이미지는 세포 내의 다수의 형광 프로브의 코로컬리제이션(co-localization) 정도를 결정하는 데 사용될 수 있다. 추가적으로, 그 중에서도, 세포 형태, 세포 신호전달, 내재화(internalization), 세포-세포 상호작용, 세포 사멸, 세포 주기 및 스폿 계수(예를 들면, FISH)의 분석이 다색 형광, 명시야 및 암시야 이미지를 사용하여 가능하다.
전술한 바와 같이, 상기 시스템(10)은 적어도 3개의 상이한 모드로 작동될 수 있다. 전술한 하나의 모드에서, LO 빔 및 복수의 RF 콤 빔은 샘플의 일부분(예를 들면, 수평 범위를 따라 배치된 위치)을 동시에 조명하고, 조명된 위치로부터 방출된 형광 방사선이 검출 및 분석되어 샘플의 형광 이미지를 구성한다. 다른 작동 모드에서, 복수의 RF 구동 신호를 AOD에 동시에 인가하기보다는, 레이저 빔의 주파수가 시작 주파수(f 1)로부터 종료 주파수(f 2)까지 시간에 따라 변화되도록 구동 신호를 포함하는 주파수 램프가 AOD에 인가된다. 주파수 램프에서의 각 구동 주파수에 대하여, 레이저 빔의 주파수는 그와 같은 구동 주파수에 의해 편이되고, 샘플은 주파수 편이된 레이저 빔에 의해 조명되어 샘플로부터 형광 방사선을 유도한다. 다시 말해서, 이와 같은 모드에서, 상기 시스템은 중심 레이저 주파수로부터 편이되는 복수의 주파수로 소정 시간 간격에 걸쳐 샘플을 연속적으로 조명함으로써 샘플로부터 형광 방사선을 얻도록 작동된다. AOD에 의해 생성된 주파수 편이는 각도 편향을 수반하여, 동일한 광학 경로를 사용하여 빔이 샘플을 가로질러 고속으로 스캐닝되게 한다.
보다 구체적으로는, 이와 같은 작동 모드에서, RF 주파수 합성기(10)는 AOD(18)에 인가된 구동 신호를 시작 주파수(f 1)로부터 종료 주파수(f 2)까지 램핑(ramping)하는 데 이용된다. 예로서, 구동 신호가 램핑되는 주파수 범위는 약 50 MHz 내지 약 250 MHz일 수 있다. 일부의 구현예에서, 구동 신호는 약 100 MHz 내지 약 150 MHz로 램핑된다. 본 구현예에서, 구동 주파수는, 예를 들어 고속을 달성하기 위해, 시간에 따라 연속적으로 변화된다. 다른 구현예에서, 구동 주파수는 시작 주파수(f 1)로부터 종료 주파수(f 2)까지 별개 스텝으로 변화될 수 있다.
주파수 편이된 빔이 미러(28)를 지나치고, 렌즈(26), 렌즈(30), 미러(40/42), 빔 스플리터(44), 렌즈(46), 미러(56), 렌즈(50), 미러(58) 및 대물 렌즈(52)에 의해 규정된 광학 경로를 따라 전파하여 샘플 홀더를 통해 유동하는 샘플의 일부분을 조명하도록, 구동 주파수가 선택된다. 램프 속도는, 샘플이 빔을 가로질러 유동할 때 방출된 형광 방사선에 기초하여 생성될 형광 이미지의 수직 방향에서의 임의의 흐림(blur)을 개선하고 바람직하게는 방지하기에 충분하게 빠른 것이 바람직하다. 이것은 예를 들어 램프 속도를 샘플의 유동 속도와 정합시킴으로써 얻어질 수 있다. 샘플에서의 레이저 스폿 크기는 적절한 속도를 추정하는 데 사용될 수 있다. 예로서, 1 마이크로미터의 레이저 스폿 크기에 대하여, 1 라인을 가로지르는 스캔 시간은 이미지 흐림을 회피하기 위해 초당 0.1 미터의 샘플 유동 속도에 대해 10 마이크로초 이하이어야 한다.
여기 방사선에 의한 조사에 반응하여 샘플로부터 방출된 형광 방사선은 전술한 방식으로 수집 및 검출된다. 구체적으로는, 도 10을 참조하면, 형광 방사선은 광검출기(64)에 의해 검출된다. 검출된 형광은 증폭기(70)에 의해 증폭되고, 증폭된 신호는 분석 모듈(72)에 의해 분석되어 샘플의 형광 이미지를 재구성한다. 이미지의 재구성은 시작 주파수(f 1)로부터 종료 주파수(f 2)까지의 스캔 기간 내의 특정 시간에 대해 수평 픽셀 위치를 할당함으로써 수행된다. 상기 작동 모드에서와 같이 픽셀 값을 얻기 위해 주파수 성분의 진폭을 분석하는 것과는 대조적으로, 본 작동 모드에서 사용되는 복조 접근법은 검출된 형광 신호의 시간 영역 값만을 사용하여 이미지의 픽셀에 대해 값을 할당한다. 샘플이 수직 방향으로 유동할 때 샘플의 2차원 형광 이미지를 얻기 위해 프로세스가 반복될 수 있다.
샘플에 의해 방출된 형광 방사선은, 만약 있다면, 광검출기(64)에 의해 수집된다. 도 10을 참조하면, 검출된 형광 방사선은 증폭기(70)에 의해 증폭된다. 분석 모듈(72)은 증폭된 신호를 수신한다. 본 작동 모드에서, 분석 모듈은 형광 신호를 분석하여 샘플, 예를 들어 세포/입자의 형광 성분을 결정한다. 본 작동 모드에서 샘플을 여기시키는 빔이 하나뿐이기 때문에, 샘플을 여기하는 것에 반응하여 비트 주파수가 생성되지 않는다. 따라서, 형광 신호의 주파수 영역에서는 이미지 정보가 없다. 오히려, 검출된 형광 신호는 시간 영역에서 인코딩된 이미지 정보를 갖는다. 본 작동 모드에서, 이미지는 검출된 형광 신호의 시간 값을 수평 픽셀 좌표로서 사용하고 형광 신호의 디지털화된 전압 값을 픽셀 값(밝기)으로서 사용하여 디지털적으로 재구성될 수 있다. AOD에 인가된 구동 주파수의 각 스캔은 이미지의 하나의 수평 라인(열)을 생성한다. 이미지 재구성은 샘플이 조명 영역(지점)을 통해 유동할 때 연속 스캔을 통해 달성된다.
또 다른 작동 모드에서, 상기 시스템(10)은 예를 들어 고주파에 의해 레이저 빔의 중심 주파수를 편이시킴으로써 생성될 수 있는 단일 여기 주파수에 의해 동시에 샘플의 복수의 위치를 조명하도록 작동될 수 있다. 보다 구체적으로는, 도 1을 다시 참조하면, 이와 같은 작동 모드에서, 단일 구동 고주파는 AOD(18)에 진입하는 레이저 빔에 대해 편이되는 주파수를 갖는 레이저 빔을 생성하도록 AOD(18)에 인가될 수 있다. 또한, 주파수 편이된 레이저 빔은 AOD에 진입하는 레이저 빔에 대해 각도 편이를 나타내어, 고주파 레이저 빔이 미러(28)에 의해 차단되고 렌즈(32) 및 미러(33 및 35)를 통해 톱햇 빔 셰이퍼(34)를 향해 반사된다. 톱햇 빔 셰이퍼를 빠져나가는 빔은 빔 스플리터(44)에 의해 반사되고, 렌즈(46)에 의해 중간 이미지 평면(48) 상에 포커싱된다. 이와 같은 평면에서, 도 15a에 개략적으로 도시된 바와 같이, 레이저 빔(1000)은 수평 방향을 따라 신장된 프로파일을 나타낸다.
수평으로 신장된 레이저 빔은 미러(56)에 의해 포지티브 렌즈(50)로 반사된다. 렌즈(50)를 통과한 후에, 레이저 빔은 미러(58)에 의해 대물 렌즈(52)로 반사된다. 전술한 바와 같이, 포지티브 렌즈(50) 및 대물 렌즈(52)는 톱햇 프로파일형 레이저 빔을 중간 이미지 평면(48)으로부터 유동 세포(54)를 통해 유동하는 샘플 상으로 중계하기 위한 망원경을 형성한다.
수평으로 신장된 레이저 빔은 샘플의 수평 범위를 조명하여, 샘플에 존재한다면, 관심 있는 형광단을 수평 범위를 따라 여기시킨다. 따라서, 본 작동 모드에서, 샘플의 복수의 수평 위치가 상이한 여기 주파수로 조명되는 제1 작동 모드와는 달리, 샘플의 복수의 수평 위치가 동일한 여기 주파수로 조명된다. 본 작동 모드는 사용자가 유동하는 세포 또는 입자의 이미지를 얻을 수 없게 한다. 그러나, 본 작동 모드에서는, 전형적으로 다른 2개의 작동 모드에서보다 높은 광 파워가 샘플에 인가될 수 있으며, 이는 이미지가 필요하지 않은 경우에 보다 높은 신호대 잡음비 데이터를 얻는 데 유용할 수 있다. 본 작동 모드는, 시스템에 어떠한 기계적인 변화도 가할 필요 없이, 음향-광학 디플렉터를 구동하는 전자 신호를 단지 변경함으로써 액세스할 수 있다.
따라서, 상기 시스템(10)은 샘플로부터 형광 방사선을 유도하기 위해 3개의 별개 작동 모드로 작동될 수 있다.
일부의 구현예에 있어서, 형광 수명 측정은, 예를 들어 고주파 편이된 국부 발진기 빔 각각의 비트의 위상을 검출된 형광 신호 내의 각각의 고주파 성분의 위상과 비교함으로써, 샘플 상의 각각의 공간 위치에서 수행될 수 있다. 예로서, 도 15b는 이와 같은 형광 수명 측정(도 1에 도시된 특정 구성요소는 간략화를 위해 이 도면에 도시되어 있지 않음)을 허용하는, 전술한 시스템(10)의 변형된 버전인 시스템(10')을 도시하고 있다. 구체적으로는, 빔 스플리터(44)에 입사하는 RF 콤 빔의 일부분은 빔 스플리터에 의해 수렴 렌즈(400) 상으로 반사된다(예시로서, 본 구현예에서는, 렌즈(400)가 200 ㎜의 초점 거리를 갖지만, 다른 초점 거리가 또한 사용될 수 있음). 렌즈(400)는 여기 빔을 검출하는 포토다이오드(402) 상으로 RF 콤 빔의 그와 같은 부분을 포커싱시킨다. 포토다이오드(402)의 출력은 분석 모듈(72)에 의해 수신될 수 있다(도 10 참조). 분석 모듈은, 예를 들어 전술한 복조 기술 중 하나를 사용하여, 여기 빔의 주파수 역다중화를 제공하고, 여기 빔 내의 각각의 고주파 성분의 위상을 결정할 수 있다. 이것은, 검출된 형광 신호의 각각의 고주파 성분에 대하여, 그와 같은 고주파 성분의 위상을 비교할 수 있는 기준 위상을 제공할 수 있다. 예를 들면, 여기 신호의 FFT의 실수 및 허수 성분, 또는 록인형 복조의 I 및 Q 성분이 이용될 수 있다. 대안적으로, 샘플/유동 세포의 명시야 이미지를 검출하는 검출기의 출력은 형광 비트 주파수의 위상을 비교할 수 있는 기준 위상을 얻는 데 사용될 수 있다.
보다 구체적으로는, 분석 모듈(72)은, 예를 들어 전술한 방식으로, 검출된 형광 신호의 주파수 역다중화를 제공할 수 있다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 형광 신호의 각각의 비트 주파수에 대하여, 고주파 성분의 위상은 여기 빔의 각각의 기준 위상과 비교되어 공간적으로 분해된 형광 수명 측정치 및 형광 수명 이미지를 얻을 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 본 시스템은 전술한 광학적 구성을 이용하여 유동 스트림 내의 샘플에 의해 방출된 광을 검출하는 유동 세포 계측기 시스템을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 시스템은, 미국 특허 제3,960,449호; 제4,347,935호; 제4,667,830호; 제4,704,891호; 제4,770,992호; 제5,030,002호; 제5,040,890호; 제5,047,321호; 제5,245,318호; 제5,317,162호; 제5,464,581호; 제5,483,469호; 제5,602,039호; 제5,620,842호; 제5,627,040호; 제5,643,796호; 제5,700,692호; 제6,372,506호; 제6,809,804호; 제6,813,017호; 제6,821,740호; 제7,129,505호; 제7,201,875호; 제7,544,326호; 제8,140,300호; 제8,233,146호; 제8,753,573호; 제8,975,595호; 제9,092,034호; 제9,095,494호 및 제9,097,640호에 개시된 유동 세포 계측기의 하나 이상의 구성요소를 포함하는 유동 세포 계측기 시스템이며; 이들 특허 문헌의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
전술한 바와 같이, 일부의 구현예에서, 본 시스템은 유동 세포 계측기의 유동 스트림과 같은 유동 스트림을 유동하는 샘플 내의 입자(예를 들면, 세포)를 이미징하도록 구성된다. 유동 스트림 내의 입자의 유속은, 25 m/s 이상을 포함하여, 0.00001 m/s 이상, 예컨대 0.00005 m/s 이상, 예컨대 0.0001 m/s 이상, 예컨대 0.0005 m/s 이상, 예컨대 0.001 m/s 이상, 예컨대 0.005 m/s 이상, 예컨대 0.01 m/s 이상, 예컨대 0.05 m/s 이상, 예컨대 0.1 m/s 이상, 예컨대 0.5 m/s 이상, 예컨대 1 m/s 이상, 예컨대 2 m/s 이상, 예컨대 3 m/s 이상, 예컨대 4 m/s 이상, 예컨대 5 m/s 이상, 예컨대 6 m/s 이상, 예컨대 7 m/s 이상, 예컨대 8 m/s 이상, 예컨대 9 m/s 이상, 예컨대 10 m/s 이상, 예컨대 15 m/s 이상일 수 있다. 예를 들면, 유동 스트림(예컨대, 유동 노즐 오리피스)의 크기에 따라, 본 시스템에서, 유동 스트림은, 500 μL/분 이상을 포함하여, 0.001 μL/분 이상, 예컨대 0.005 μL/분 이상, 예컨대 0.01 μL/분 이상, 예컨대 0.05 μL/분 이상, 예컨대 0.1 μL/분 이상, 예컨대 0.5 μL/분 이상, 예컨대 1 μL/분 이상, 예컨대 5 μL/분 이상, 예컨대 10 μL/분 이상, 예컨대 25 μL/분 이상, 예컨대 50 μL/분 이상, 예컨대 100 μL/분 이상, 예컨대 250 μL/분 이상의 유량을 가질 수 있다.
하기의 실시예는 본 교시의 다양한 양태의 추가적인 설명을 위해서만 제공되며, 본 발명의 교시를 구현하는 최적의 방법 또는 얻어질 수 있는 최적의 결과를 반드시 예시하도록 의도되지는 않는다.
실시예 1
도 9a와 관련하여 전술한 것과 유사한 검출 시스템을 갖는 도 1과 관련하여 전술한 것과 유사한 시스템이, 스피로테크 인코퍼레이티드(Spherotech Inc.)(Lake Forest, IL)에 의해 상표명 RCP-30-5A로 시판되는 8개의 이산 레벨의 형광 염료로 착색된 폴리스티렌 비드로부터 형광 방사선을 측정하는 데 이용되었다. 이 시스템은 또한 전술한 방식으로 명시야 및 암시야 이미지를 생성하는 데 사용되었다.
도 16a는 암시야 강도 대 명시야 강도의 산포도이다. 측정된 모든 이벤트(50,000개의 총 이벤트가 검출됨)의 약 32%를 포함하는 이 산포도의 직사각형 섹션이 도 16b, 도 16c 및 도 16d에 도시된 데이터를 생성하기 위한 게이트(gate)로서 사용되었다. 도 16b는 각 입자에 의해 방출된 적색 형광(PI) 대 녹색 형광(FITC)의 산포도를 도시하고 있다. 이와 같은 산포도는 가변하는 밝기 레벨을 갖는 8개의 집단(population)을 명확하게 나타내고 있다. 도 16c 및 도 16d는 동일한 데이터의 히스토그램이다.
실시예 2
도 9a와 관련하여 전술한 것과 유사한 검출 시스템을 갖는 도 1과 관련하여 전술한 것과 유사한 시스템을 사용하여, CD45-FITC 및 프로피디움 요오드화물로 착색된 고정 말초 혈액 백혈구의 FIRE, 명시야 및 암시야 이미지가 얻어졌다. 샘플은 또한 Calcein-AM으로 착색된 살아있는 HeLa 세포의 일부를 포함하고 있다. 세포는 데이터 획득 동안에 0.5 m/초의 속도로 유동 세포를 통해 유동하고 있었다.
도 17a에 도시된 이미지는, 상부로부터 하부로, 명시야, CD45-FITC 및 프로피디움 요오드화물 형광 채널, 명시야, 암시야, CD45-FITC, 및 PI 채널 형광의 오버레이이다. 보정은 적용되지 않았으며, 모든 이미지는 보기 위해 오토-스케일링되어 있다. 2, 3, 5, 8, 9, 12, 17, 20 및 21로 번호가 매겨진 세포는 HeLa 세포(B 집단)이고, 나머지는 백혈구(A 집단)이다.
도 17b는 집단 A가 백혈구를 나타내고 집단 B가 HeLa 세포를 나타내는 산포도이다.
실시예 3
도 9a와 관련하여 전술한 것과 유사한 검출 시스템을 갖는 도 1과 관련하여 전술한 것과 유사한 시스템을 사용하여, CD45-FITC 및 프로피디움 요오드화물로 착색된 고정 말초 혈액 백혈구의 FIRE, 명시야 및 암시야 이미지가 얻어졌다. 샘플에는 항-EpCAM-FITC 및 프로피디움 요오드화물(PI)로 착색된 소량의 고정 MCF-7 세포가 섞여 있었다. 세포는 데이터 획득 동안에 0.5 m/초의 속도로 유동 세포를 통해 유동하고 있었다.
도 18a에 도시된 이미지는, 상부로부터 하부로, 명시야, FITC 및 PI 채널 형광, 명시야, 암시야, FITC 및 PI 형광의 오버레이이다. 백혈구 집단에서는, 녹색 형광이 PI 착색제로부터의 형광 스필오버(spillover)의 인위구조(artifact)이다. 모든 이미지는 보기 위해 밝기가 오토-스케일링되어 있고, 그에 따라 백혈구가 FITC 형광을 나타내는 것으로 보이지만, 이것은 PI로부터의 작은 형광 스필오버 신호이다. 1, 2, 4, 5, 10, 13, 15 및 16으로 번호가 매겨진 세포는 MCF-7 세포이다.
도 18b는 집단 A가 백혈구를 나타내고 집단 B가 MCF-7 세포를 나타내는 산포도이다.
당업자는 본 교시의 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 변경이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 특히, 전술한 구현예의 다양한 특징, 구조 또는 특성이 적절한 방식으로 조합될 수 있다. 예를 들면, 하나의 구현예와 관련하여 논의된 검출 시스템이 다른 구현예에서 사용될 수 있다.

Claims (32)

  1. 시스템으로서:
    고주파 구동 신호가 인가되도록 구성된 음향 광학 장치;
    상기 음향 광학 장치를 조사하여 복수의 각도 편향 레이저빔을 생성하도록 구성된 레이저;
    제1 광학 경로를 따라 제1 각도 편향 레이저 빔을 전파하고, 제2 광학 경로를 따라 적어도 제2 각도 편향 레이저 빔을 전파하도록 구성된 제1 광학 조정 구성요소; 및
    상기 제1 각도 편향 레이저 빔과 상기 제2 각도 편향 레이저 빔을 결합하여 샘플 상으로 지향시키도록 구성된 제2 광학 조정 구성요소
    를 포함하는, 광 빔 생성기 구성요소; 및
    상기 조사된 샘플로부터 광을 검출하기 위한 검출기
    를 포함하는, 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 음향 광학 장치는 음향-광학 디플렉터인, 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 각도 편향 레이저 빔은 국부 발진기(LO) 빔을 포함하고, 상기 적어도 제2 각도 편향 레이저 빔은 복수의 무선 주파수 콤 빔을 포함하는, 시스템.
  4. 제3항에 있어서, 상기 시스템은 수평축을 따라 실질적으로 일정한 강도 프로파일을 갖는 국부 발진기 빔을 생성하도록 구성된 톱햇형 빔 형성기를 더 포함하는, 시스템.
  5. 제4항에 있어서, 상기 국부 발진기 빔은 수직축을 따라 가우스 강도 프로파일을 갖는, 시스템.
  6. 제1항에 있어서, 각각의 무선 주파수 편향된 레이저 빔이 상기 각도 편향된 빔과 중첩되는 상기 샘플로부터의 광은 상기 각도 편향된 레이저 빔과 각각의 무선 주파수 콤 빔 간의 주파수 차를 포함하는 비트 주파수를 나타내는, 시스템.
  7. 제1항에 있어서, 상기 복수의 각도 편향 레이저 빔의 강도를 변조하도록 구성된 직접 디지털 합성기를 더 포함하는, 시스템.
  8. 제7항에 있어서, 상기 복수의 각도 편향 레이저 빔 각각의 상기 강도는 상기 제1 각도 편향 레이저 빔의 상기 강도와 동일하도록 변조되는, 시스템.
  9. 제1항에 있어서, 상기 시스템은 상기 프로세서에 작동 가능하게 결합된 메모리를 포함하는 프로세서를 포함하고, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때 상기 프로세서로 하여금 검출된 광에 응답하여 데이터 신호를 생성하도록 하는 명령어를 저장하고 있는, 시스템.
  10. 제9항에 있어서, 상기 데이터 신호는 시간-영역 형광 방출 신호를 포함하는, 시스템.
  11. 제10항에 있어서, 상기 시스템은 상기 프로세서에 작동 가능하게 결합된 메모리를 포함하는 프로세서를 포함하고, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때 상기 프로세서로 하여금 복수의 시간-영역 형광 방출 신호에 기초하여 상기 샘플의 이미지를 생성하도록 하는 명령어를 저장하고 있는, 시스템.
  12. 제11항에 있어서, 상기 이미지는, 상기 제1 각도 편향 레이저 빔과 상기 제2 각도 편향 레이저 빔이 중첩되는 상기 샘플 상의 위치에서 상기 비트 주파수를 결정하기 위해서 각 형광 방출 신호를 주파수 역다중화하는 것으로 생성되는, 시스템.
  13. 제12항에 있어서, 상기 주파수 역다중화는 상기 비트 주파수를 결정하기 위해 상기 형광 신호의 푸리에 변환을 획득하는 단계를 포함하는, 시스템.
  14. 제13항에 있어서, 상기 이미지는, 상기 이미지의 위치에 대응하는 픽셀값을 제공하기 위해서 상기 비트 주파수의 진폭을 연산하는 것으로 생성되는, 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 상기 시스템은 상기 프로세서에 작동 가능하게 결합된 메모리를 포함하는 프로세서를 포함하고, 상기 메모리는 상기 프로세서에 의해 실행될 때 상기 프로세서로 하여금 상기 샘플의 암시야 이미지를 생성하고 상기 샘플의 명시야 이미지를 생성함으로써 상기 이미지를 생성하도록 하는 명령어를 저장하고 있는, 시스템.
  16. 방법으로서:
    음향 광학 장치에 무선 주파수 구동 신호를 인가하는 단계;
    복수의 각도 편향된 복수의 레이저 빔을 생성하기 위해 레이저로 상기 음향 광학 장치를 조사하는 단계;
    제1 각도 편향 레이저 빔을 제2 각도 편향 레이저 빔과 다른 광학 경로를 따라 전파하는 단계; 및
    상기 제1 각도 편향 레이저 빔을 상기 제2 각도 편향 레이저 빔과 결합하고 상기 결합된 레이저 빔을 샘플 상으로 지향시키는 단계; 및
    상기 샘플에서 하나 이상의 광 신호를 감지하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 음향 광학 장치는 음향-광학 디플렉터인, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 제1 각도 편향 레이저 빔은 국부 발진기(LO) 빔을 포함하고, 상기 제2 각도 편향 레이저 빔은 복수의 무선주파수 콤 빔을 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 방법은 수평축을 따라 실질적으로 일정한 강도 프로파일을 갖는 국부 발진기 빔을 생성하기 위해 탑햇형 빔 성형기를 통해 상기 국부 발진기 빔을 전파하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 복수의 무선주파수 콤 빔 각각은 상기 샘플 상의 서로 다른 공간 위치에 조사되는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 복수의 무선주파수 콤 빔 각각은 상기 샘플 상의 상기 국부 발진기 빔과 중첩하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 각각의 중첩 위치에서 상기 샘플로부터의 형광은 상기 국부 발진기 빔과 상기 무선주파수 콤 빔 간의 주파수 차를 포함하는 비트 주파수를 나타내는, 방법.
  23. 제18항에 있어서, 상기 무선 주파수 콤 빔 각각의 강도를 변조하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 무선주파수 콤 빔의 강도를 변조하는 단계는 각 무선 주파수 콤 빔의 상기 강도를 상기 국부 발진기 빔의 강도와 동일하도록 조정하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 검출된 광 신호는 시간-영역 형광 방출 신호를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 복수의 시간-영역 형광 방출 신호에 기초하여 상기 샘플의 이미지를 생성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 이미지를 생성하는 단계는 상기 샘플의 각 중첩 위치에서 상기 비트 주파수를 결정하기 위해 각 형광 방출 신호를 주파수 역다중화하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 주파수 역다중화는 상기 샘플의 각 중첩 위치에서 상기 비트 주파수를 결정하기 위해 상기 형광 신호의 푸리에 변환을 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 이미지를 생성하는 단계는 상기 이미지의 위치에 대응하는 픽셀값을 제공하기 위해 각 비트 주파수의 상기 진폭을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 이미지를 생성하는 단계는 상기 샘플의 암시야 이미지를 생성하는 단계 및 상기 샘플의 명시야 이미지를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제16항에 있어서, 상기 샘플은 유동 스트림에 존재하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 유동 스트림은 1m/s 이상의 입자 유속을 갖는, 방법.
KR1020237038247A 2015-10-13 2016-10-13 다중모드 형광 이미징 유동 세포 계측 시스템 KR20230157532A (ko)

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