CN115917293A - 在流式细胞仪中调节和同步检测的方法及系统 - Google Patents

Abstract

描述了用于根据散射光(例如，在流式细胞仪的粒子分析器中)确定流动流中的粒子的参数的方法。根据某些实施例的方法包括用以参考频率调制的调频激光束照射流动流中的粒子、用光电检测器检测来自粒子的散射光、根据检测到的散射光生成频率编码数据信号、将频率编码数据信号与参考频率同步以及基于同步的频率编码数据信号确定粒子的一个或更多个参数。还提供了用于实践主题方法的系统和具有用于实践主题方法的指令的非暂时性计算机可读存储介质。

Description

在流式细胞仪中调节和同步检测的方法及系统

相关申请的交叉引用

本申请与2020年4月29日提交的美国临时专利申请序列号63/017,365相关；该美国临时专利申请的公开内容通过引用并入本文。

背景技术

光检测通常用于表征样本(例如，生物样本)的组分，例如当样本用于疾病或病况的诊断时。当样本被照射时，光能够被样本散射、透射通过样本以及由样本(例如，由荧光)发射。样本组分的变化，例如形态、吸收率和荧光标签的存在，可能会导致由样本散射、透射或发射的光发生变化。为了量化这些变化，光被收集并引导至检测器的表面。

一种利用光检测来表征样本中组分的技术是流式细胞术。使用根据检测到的光生成的数据，能够记录组分的特性，并可以对所需的材料进行分选。流式细胞仪通常包括用于接收流体样本(例如血液样本)的样本容器和包含鞘液的鞘容器。流式细胞仪将流体样本中的粒子(包括细胞)作为细胞流传输至流动池，同时还将鞘液引导至流动池。在流动池内，围绕细胞流形成液体鞘，从而对细胞流施加基本均匀的速度。流动池以流体动力学方式将流中的细胞聚焦以通过流动池中光源的中心。来自光源的光能够被检测为散射或透射光谱，或者能够被样本中的一种或更多种组分吸收并重新发射为发光。

发明内容

本公开的方面包括用于根据散射光确定流动流中的粒子(例如，生物样本中的细胞)的参数的方法。根据某些实施例的方法包括用以参考频率调制的调频激光束照射流动流中的粒子，用光电检测器检测来自粒子的散射光，根据检测到的散射光生成频率编码数据信号，将频率编码数据信号与参考频率同步，并基于同步的频率编码数据信号确定粒子的一个或更多个参数。还提供了用于实践主题方法的系统和具有用于实践主题方法的指令的非暂时性计算机可读存储介质。

在实施例中，用调频激光照射流动流中的粒子。在一些实施例中，方法包括通过用一种或更多种激光照射光调制器来生成调频光，以生成调频光束。在一些实施例中，光调制器是电光调制器。在某些实施例中，电光调制器是压电光调制器。在其他实施例中，光调制器是声光调制器。在一些情况下，生成调频激光包括通过输入偏振器用激光器照射光调制器以生成偏振的调频激光束。在实施例中，生成(例如，使用控制器)参考频率信号并且参考频率信号被传递到光调制器。在一些实施例中，光调制器被配置为生成参考频率。在一些实施例中，调频激光在参考频率处具有振荡频率。

在实施例中，用一个或更多个散射光电检测器检测散射光。在一些实施例中，用侧向散射光电检测器检测光。在其他实施例中，用前向散射光电检测器检测光。在又一些实施例中，用后向散射光电检测器检测光。在一些实施例中，散射光通过输出偏振器传送到散射光电检测器。在某些情况下，散射光通过四分之一波片传送到散射光电检测器。在某些情况下，散射光通过四分之一波片和输出偏振器传送到散射光电检测器。在某些实施例中，在两个不同的检测器通道中检测散射光。在某些情况下，在两个不同的侧向散射检测器通道中检测散射光。在一些实施例中，侧向散射检测器通道包括具有第一偏振的第一偏振器和具有垂直于第一偏振的第二偏振的第二偏振器。

由光电检测器响应于检测到的散射光来生成频率编码数据信号。在一些实施例中，生成频率编码数据信号包括检测由正以参考频率振荡的粒子散射的光的幅度。在一些实施例中，参考频率是参考波形。在实施例中，频率编码数据信号与参考频率信号同步。在一些实施例中，将频率编码数据信号与参考频率信号同步包括将频率编码数据信号与参考波形相乘。在某些实施例中，频率编码数据信号通过锁相放大器与参考频率信号同步。在某些情况下，锁相放大在现场可编程门阵列(FPGA)上实现。在其他实施例中，频率编码数据信号与参考频率信号是数字同步的，例如其中粒子分析器包括具有存储器的处理器，该存储器可操作地耦合到处理器，其中存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时，使处理器将频率编码数据信号与参考波形相乘。在一些实施例中，锁定放大包括将低通滤波器应用于同步的频率编码数据信号以生成数据信号分布。在某些情况下，通过应用低通滤波器生成的数据信号分布具有高斯信号分布。在其他情况下，通过应用低通滤波器生成的数据信号分布具有超高斯信号分布。

在一些实施例中，同步的频率编码数据信号和生成的数据信号分布中的一个或更多个用于确定流动流中粒子的一个或更多个参数。在一些情况下，方法包括基于确定的参数识别流动流中的粒子。在其他情况下，方法包括对粒子进行分选。

本公开的方面还包括用于确定流动流中粒子的一个或更多个参数的系统。根据某些实施例的系统包括：具有激光器和光调制器部件的光源，光调制器部件被配置为以参考频率生成调频激光束；具有光散射光电检测器的光检测系统；以及处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时，使处理器根据检测到的散射光生成频率编码数据信号，将频率编码数据信号与参考频率同步，以及基于同步的频率编码数据信号确定粒子的一个或更多个参数。在一些实施例中，该系统是粒子分析器，例如结合到流式细胞仪中的粒子分析器。在一些实施例中，该系统包括用于从流动流中分选一种或更多种粒子的粒子分选仪。

在实施例中，系统包括用于通过激光器生成调频光束的光调制器。在一些实施例中，光调制器是电光调制器。在某些实施例中，电光调制器是压电光调制器。在其他实施例中，光调制器是声光调制器。在一些实施例中，光源包括用于在光调制器的照射之前使激光束偏振的输入偏振器。在一些实施例中，系统包括用于将频率驱动信号施加到光调制器的控制器。在一些实施例中，控制器被配置为将参考频率驱动信号施加到光调制器。在其他实施例中，光调制器被配置为生成参考频率。

系统包括具有用于检测散射光的一个或更多个光电检测器的光检测系统。在一些实施例中，光电检测器被配置为检测侧向散射光。在其他实施例中，光电检测器被配置为检测前向散射光。在又一些实施例中，光电检测器被配置为检测后向散射光。在一些情况下，光检测系统包括与光电检测器进行光通信的输出偏振器。在这些实施例中，散射光通过输出偏振器被传送到散射光电检测器。在某些实施例中，输出偏振器部件另外包括四分之一波片。在一些实施例中，光检测系统包括两个不同的检测器通道。在一些情况下，光检测通道包括两个不同的侧向散射检测器通道。在一些实施例中，侧向散射检测器通道包括具有第一偏振的第一偏振器和具有垂直于第一偏振的第二偏振的第二偏振器。

目标光检测系统的光电检测器被置为响应于检测到的散射光生成频率编码数据信号。在一些实施例中，光电检测器被配置为检测由控制器或光调制器产生的以参考频率振荡的散射光的幅度。在一些实施例中，控制器被配置为生成参考频率波形。在实施例中，频率编码数据信号与参考频率信号同步。在一些实施例中，系统包括处理器，处理器包括可操作地耦合到处理器的存储器，其中，存储器具有存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时，使处理器：检测由正以参考频率振荡的粒子散射的光的幅度并将频率编码数据信号与参考波形相乘。在一些实施例中，系统包括与控制器和光电检测器进行操作通信的锁定放大器，锁定放大器被配置为将频率编码数据信号与参考波形同步。在一些实施例中，系统包括具有编程以进行锁相放大的FPGA。在其他实施例中，存储器包括存储在其上的用于将频率编码数据信号与参考波形数字同步的指令。在某些实施例中，系统被配置为应用具有锁相放大器的低通滤波器或将低通滤波器数字地应用到同步的频率编码数据信号。在某些情况下，将低通滤波器应用于同步的频率编码数据信号会生成数据信号分布，例如高斯数据信号分布或超高斯数据信号分布。

本公开的方面还包括用于实践主题方法的非暂时性计算机可读存储介质。根据某些实施例的非暂时性计算机可读存储介质包括用于利用以参考频率调制的调频激光束照射流动流中的粒子的算法，用于用光电检测器检测来自粒子的散射光的算法，用于根据检测到的散射光生成频率编码数据信号的算法，用于将频率编码数据信号与参考频率同步的算法以及用于基于同步的频率编码数据信号确定粒子的一个或更多个参数的算法。

在一些实施例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于用激光器照射电光调制器以产生调频激光束的算法。在一些情况下，非暂时性计算机可读存储介质包括用于通过输入偏振器用激光器照射电光调制器以生成偏振的调频激光束的算法。在一些实施例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于生成参考频率信号的算法。在一些实施例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于生成参考频率波形的算法。

在实施例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于将频率编码数据信号与参考频率同步的算法。在一些实施例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于通过将频率编码数据信号与参考频率波形相乘来使频率编码数据信号与参考频率同步的算法。在一些情况下，非暂时性计算机可读存储介质包括用于使用锁相放大器将频率编码数据信号与参考频率同步的算法。在其他实施例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于使频率编码数据信号数字同步的算法，例如利用具有用于将频率编码数据信号与参考频率波形相乘的程序的FPGA。在一些实施例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于将低通滤波器应用于同步的频率编码数据信号以生成数据信号分布的算法。在某些情况下，通过应用低通滤波器生成的数据信号分布具有高斯信号分布。在其他情况下，通过应用低通滤波器生成的数据信号分布具有超高斯信号分布。

还提供了包括主题系统的一个或更多个部件的套件。根据某些实施例的套件包括一个或更多个激光器和光调制器。在一些实施例中，套件包括电光调制器，例如压电光调制器。在一些实施例中，套件还包括一个或更多个光偏振器。在其他实施例中，套件包括四分之一波片。在一些实施例中，套件可以包括一个或更多个光电检测器。在某些情况下，套件包括锁锁相放大器。在某些实施例中，套件包括集成电路设备，该集成电路设备被编程以执行锁相放大，例如以将频率编码数据信号与参考频率同步。在一些实施例中，集成电路设备是现场可编程门阵列(FPGA)。在其他实施例中，集成电路设备是专用集成电路(ASIC)。在又一些实施例中，集成电路设备是复杂可编程逻辑器件(CPLD)。在某些实施例中，主题套件还可以包括用于将来自流动流的光传播到光电检测器的光收集部件，例如透镜、反射镜或光纤。

附图说明

当结合附图阅读时，可以从以下详细描述最好地理解本发明。附图中包括以下图：

图1A描绘了根据某些实施例的粒子分析器。图1B描绘了根据某些实施例的光源的光学调制部件。

图2A描绘了根据某些实施例的用于确定流动流中的粒子的参数的流程图。图2B描绘了根据某些实施例的根据流动流中的粒子的照射生成和处理数据信号分布。

图3A描绘了根据某些实施例的高斯数据信号分布的检测和恢复。图3B描绘了根据某些实施例的超高斯数据信号分布的检测和恢复。

图4A描绘了根据某些实施例的用于基于计算的样本分析和粒子表征的粒子分析系统的功能框图。图4B描绘了根据某些实施例的流式细胞仪。

图5描绘了根据某些实施例的粒子分析器控制系统的一个示例的功能框图。

图6描绘了根据某些实施例的计算系统的框图。

具体实施方式

描述了用于根据散射光确定流动流中(例如，流式细胞仪的粒子分析器中)的粒子的参数的方法。根据某些实施例的方法包括用以参考频率调制的调频激光束照射流动流中的粒子，用光电检测器检测来自粒子的散射光，根据检测到的散射光生成频率编码数据信号，将频率编码数据信号与参考频率同步，并基于同步的频率编码数据信号确定粒子的一个或更多个参数。还提供了具有用于实践主题方法的指令的系统和非暂时性计算机可读存储介质。

在更详细地描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施例，当然因为这样可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限制。

在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的至下限单位的十分之一的每个中间值以及在所述范围中的任何其他所述值或中间值包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内并且也包括在本发明内，但须遵守所述范围中任何具体排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些包括的限制之一或两个的范围也包括在本发明中。

某些范围在本文中以术语“约”开头的数值呈现。术语“约”在本文中用于为其前面的确切数字以及接近或近似于该术语前面的数字的数字提供字面支持。在确定数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近的或近似的未列举的数字可以是在其呈现的上下文中提供具体列举的数字的实质等效的数字。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所述的那些相似或等效的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试，但现在描述代表性的说明性方法和材料。

本说明书中引用的所有出版物和专利均以引用方式并入本文，犹如每个单独的出版物或专利被具体地和单独地指示以引用方式并入并且以引用方式并入本文以公开和描述与这些出版物记载的相关的方法和/或材料。对任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开，并且不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类出版物。此外，所提供的公布日期可能与实际公布日期不同，可能需要单独确认。

注意，除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物。还应注意，可以起草权利要求以排除任何可选元素。因此，本声明旨在作为在引用权利要求要素或使用“否定”限制时使用诸如“唯一”、“仅”的排他性术语的引用基础。

如本领域技术人员在阅读本公开后将显而易见的，在不背离脱离本发明的范围或精神的情况下，在此描述和说明的每个单独的实施例都具有分立的部件和特征，它们可以容易地与其他几个实施例中的任何一个的特征分离或组合。任何列举的方法都可以按照列举的事件的顺序或任何其他逻辑上可能的顺序来执行。

尽管为了语法上的流畅性和功能性解释，已经或将要描述设备和方法，但应明确理解，除非根据35U.S.C.§112明确表述，否则不应将权利要求解释为必须以任何方式通过构建“手段”或“步骤”限制进行限制，而是应在等效司法原则下赋予权利要求所提供的定义的全部范围的含义和等效物，并且在权利要求根据35U.S.C.§112被明确表述的情况下，应被赋予35U.S.C.§112规定的完全法定同等效力。

如上所述，本公开提供了用于根据检测到的散射光确定流动流中的粒子(例如，生物样本中的细胞)的参数的方法。在另外描述本公开的实施例中，首先更详细地描述以下方法：该方法用于利用以参考频率调制的调频激光束照射流动流中的粒子、用光电检测器检测来自粒子的散射光、根据检测到的散射光生成频率编码数据信号以及将频率编码数据信号与参考频率同步。接下来，描述具有激光器、光调制器、散射检测器和用于将频率编码数据信号与参考频率信号同步的控制器的系统。还提供了具有用于实践目主题方法的指令的非暂时性计算机可读存储介质。

用于确定流动流中的被照射样本中粒子的参数的方法

本公开的各方面还包括用于根据被照射流动流的散射光确定粒子的参数的方法。在实践根据某些实施例的方法中，在流动流中用调制的激光束照射具有粒子的样本(例如，具有细胞的生物样本)。术语“调制”在本文中以其常规含义使用，是指对激光束的一种或更多种特性施加改变，例如对激光束的相位、频率、幅度或偏振施加改变。如上所述，根据本公开的方法包括用调频激光束照射流动流中的样本。可以使用任何方便的协议来调制激光束的频率，例如通过照射并使激光通过光调制器来对激光束进行频率调制。在一些实施例中，调制器是电光调制器。在一些情况下电光调制器包括响应于施加直流电而改变折射率的部件(例如，非线性光学材料，例如非线性有机聚合物或结晶铌酸锂)，并且用激光器照射电光调制器足以从激光器输出调频光束。在其他情况下，电光调制器包括响应于低频电场的施加而改变折射率的部件，并且用激光器照射电光调制器足以从激光器输出调频光束。在某些实施例中，方法包括通过用激光器照射如压电光调制器的声光调制器来生成调频激光束。

如下文更详细描述的，在一些实施例中，光调制器可操作地耦合到控制器，控制器将频率信号传送到光调制器以生成调频激光束。在生成调频激光束时应用的频率可以变化，例如振荡频率为约0.001MHz至约500MHz，例如约0.005MHz至约400MHz，例如约0.01MHz至约300MHz，例如约0.05MHz至约200MHz，例如约0.1MHz至约100MHz，例如约0.5MHz至约90MHz，例如约1MHz至约75MHz，例如约2MHz至约70MHz，例如约3MHz至约65MHz，例如约4MHz至约60MHz并且包括约5MHz至约50MHz。

在一些实施例中，控制器被配置为将电流或电场施加到光调制器。在某些实施例中，控制器被配置有电脉冲发生器。在其他实施例中，控制器被配置为施加射频驱动信号，例如控制器包括直接数字合成器(direct digital synthesizer，DDS)或任意波形发生器(AWS)。在一些实施例中，方法包括利用控制器生成参考频率信号波形。根据某些实施例生成的参考频率信号波形具有振荡频率，该振荡频率为例如约0.001MHz至约500MHz、例如约0.005MHz至约400MHz，例如约0.01MHz至约300MHz，例如约0.05MHz至约200MHz，例如约0.1MHz至约100MHz，例如约0.5MHz至约90MHz，例如约1MHz至约75MHz，例如约2MHz至约70MHz，例如约3MHz至约65MHz，例如约4MHz至约60MHz并且包括约5MHz至约50MHz。

在一些实施例中，通过输入偏振器用激光器照射光调制器以生成调频激光的偏振光束。术语“偏振器”在本文中以其常规含义使用，是指被配置为使具有预定偏振的光通过并阻挡具有其他偏振的光波的光学调节部件。输入偏振器可以是任何方便的光学偏振器，包括但不限于线性偏振器、吸收偏振器、分束偏振器、双折射偏振器、薄膜偏振器、线栅偏振器、圆偏振器以及被配置用于通过菲涅耳反射进行偏振的光学偏振器。激光在被传送通过光调制器之前可以通过一个或更多个输入偏振器，例如2个或更多个，例如3个或更多个，例如4个或更多个，并且包括5个或更多个输入偏振器。可以根据距离用激光照射输入偏振器，所述距离会变化，例如0.01mm或更远，例如0.05mm或更远，例如0.1mm或更远，例如0.5mm或更远，例如1mm或更远，例如2.5mm或更远，例如5mm或更远，例如10mm或更远，例如15mm或更远，例如25mm或更远并且包括50mm或更远。此外，照射角度也可以变化，其相对于偏振器的平面表面为10°至90°，例如15°至85°，例如20°至80°，例如25°至75°并且包括30°至60°，例如90°角。

在实施例中，方法包括用激光器照射光调制器。感兴趣的激光器可以包括脉冲激光器或连续波激光器。在主题方法中使用的激光器的类型和数量可以变化并且可以是气体激光器，例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO₂激光器、CO激光器、氩氟(ArF)准分子激光器、氪氟(KrF)准分子激光器、氙氯(XeCl)准分子激光器或氙氟(XeF)准分子激光器或其组合。在其他情况下，方法包括用染料激光器(例如二苯乙烯、香豆素或罗丹明激光器)照射光调制器。在其他情况下，方法包括用金属蒸汽激光器照射光调制器，例如氦镉(HeCd)激光器、氦汞(HeHg)激光器、氦硒(HeSe)激光器、氦银(HeAg)激光器、锶激光器、氖铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及其组合。在又一些情况下，方法包括用固态激光器照射光调制器，例如红宝石激光器、Nd:YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器、Nd:YVO₄激光器、Nd:YCa₄O(BO₃)₃激光器、Nd:YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、氧化镱激光器或掺铈激光器及其组合。在又一些情况下，方法包括用半导体二极管激光器、光泵浦半导体激光器(optically pumped semiconductorlaser，OPSL)或任何上述激光器的二倍频或三倍频实现方式照射光调制器。

取决于在输出激光束(例如，用于照射流动流中的样本)中产生的光的期望波长，激光可以具有从200nm至1500nm变化的特定波长，例如从250nm至1250nm、例如从300nm至1000nm、例如从350nm至900nm变化并且包括400nm至800nm的特定波长。可以用一种或更多种激光器照射光调制器，例如2种或更多种激光器，例如3种或更多种激光器，例如4种或更多种激光器，例如5种或更多种激光器并且包括10种或更多种激光器。激光器可以包括激光器类型的任何组合。例如，在一些实施例中，方法包括用激光器阵列照射光调制器，例如具有一个或更多个气体激光器、一个或更多个染料激光器和一个或更多个固态激光器的阵列。

在使用多于一个激光器的情况下，可以使用多个激光器同时或按顺序照射光调制器或使用激光器的组合照射光调制器。例如，可以用多个激光器中的每一个激光器同时照射光调制器。在其他实施例中，使用多个激光器的每一个激光器按顺序照射光调制器。在使用多于一个激光器按顺序照射光调制器的情况下，每个激光器照射光调制器的时间可以独立地为0.001微秒或更多，例如0.01微秒或更多，例如0.1微秒或更多，例如1微秒或更多，例如5微秒或更多，例如10微秒或更多，例如30微秒或更多并且包括60微秒或更多。例如，方法可以包括在持续时间内用激光器照射声光设备，该持续时间为0.001微秒至100微秒，例如0.01微秒至75微秒，例如0.1微秒至50微秒，例如1微秒至25微秒，并且包括5微秒至10微秒。在使用两个或更多个激光器按顺序照射光调制器的实施例中，光调制器被每个激光器照射的持续时间可以相同或不同。

每个激光器进行照射之间的时间段也可以根据需要变化，由0.001微秒或更多的延迟独立分隔开，该延迟为例如0.01微秒或更多，例如0.1微秒或更多，例如1微秒或更多，例如5微秒或更多，例如10微秒或更多，例如15微秒或更多，例如30微秒或更多并且包括60微秒或更多。例如，每个光源进行照射之间的时间段可以为0.001微秒至60微秒，例如0.01微秒至50微秒，例如0.1微秒至35微秒，例如1微秒至25微秒并且包括5微秒至10微秒。在某些实施例中，每个激光器进行照射之间的时间段是10微秒。在光调制器设备被多于两个(即3个或更多个)激光器按顺序照射的实施例中，每个激光器进行照射之间的延迟可以相同或不同。

可以连续或以离散间隔照射光调制器。在一些情况下，方法包括使用激光器连续照射光调制器。在其他情况下，用激光器以离散间隔照射光调制器，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒并且包括每1000毫秒或以一些其他间隔照射光调制器。

根据激光器，可以根据变化的距离照射光调制器，该距离为例如0.01mm或更远，例如0.05mm或更远，例如0.1mm或更远，例如0.5mm或更远，例如1mm或更远，例如2.5mm或更远，例如5mm或更远，例如10mm或更远，例如15mm或更远，例如25mm或更远并且包括50mm或更远。此外，角度或照射也可以变化，为10°至90°，例如15°至85°，例如20°至80°，例如25°至75°并且包括30°至60°，例如90°角。

在某些实施例中，方法包括用两个或更多个频移光束照射样本。在这些实施例中，可以使用具有激光器和用于使激光频移的声光设备(例如，声光调制器)的光束发生器部件。在这些实施例中，方法包括使用激光器(例如，通过如上所述的输入偏振器)照射声光设备。根据在输出激光束(例如，用于照射流动流中的样本)中产生的光的期望波长，激光器可以具有从200nm至1500nm变化的特定波长，例如从250nm至1250nm，例如从300nm至1000nm，例如从350nm至900nm变化并且包括400nm至800nm的特定波长。可以使用一种或更多种激光器照射声光设备，例如2种或更多种激光器，例如3种或更多种激光器，例如4种或更多种激光器，例如5种或更多种激光器并且包括10种或更多种激光器。激光器可以包括激光器类型的任何组合。例如，在一些实施例中，方法包括用激光器的阵列照射声光设备，例如具有一个或更多个气体激光器、一个或跟多个染料激光器和一个或跟多个固态激光器的阵列。

在使用多于一个激光器的情况下，可以使用多个激光器同时或按顺序照射声光设备或者使用激光器的组合照射声光设备。例如，可以用多个激光器中的每一个激光器同时照射声光设备。在其他实施例中，使用多个激光器中的每一个激光器按顺序照射声光设备。在使用多于一个激光器按顺序照射声光设备的情况下，每个激光器照射声光设备的时间可以独立地为0.001微秒或更多，例如0.01微秒或更多，例如0.1微秒或更多，例如1微秒或更多，例如5微秒或更多，例如10微秒或更多，例如30微秒或更多并且包括60微秒或更多。例如，方法可以包括在持续时间内用激光器照射声光设备，该持续时间为0.001微秒至100微秒，例如0.01微秒至75微秒，例如0.1微秒至50微秒，例如1微秒至25微秒，并且包括5微秒至10微秒。在声光设备被两个或更多个激光器按顺序照射的实施例中，声光设备被每个激光器照射的持续时间可以相同或不同。

每个激光器进行照射之间的时间段也可以根据需要变化，由0.001微秒或更多的延迟独立分隔开，该延迟为例如0.01微秒或更多，例如0.1微秒或更多，例如1微秒或更多，例如5微秒或更多，例如10微秒或更多，例如15微秒或更多，例如30微秒或更多并且包括60微秒或更多。例如，每个光源进行照射之间的时间段可以为0.001微秒至60微秒，例如0.01微秒至50微秒，例如0.1微秒至35微秒，例如1微秒至25微秒，并且包括5微秒至10微秒。在某些实施例中，每个激光源进行照射之间的时间段是10微秒。在声光设备被多于两个(即3个或更多个)激光器按顺序照射的实施例中，每个激光器进行照射之间的延迟可以相同或不同。

可以连续或以离散间隔照射声光设备。在一些情况下，方法包括使用激光器连续照射声光设备。在其他情况下，用激光器以离散间隔照射声光设备，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒并且包括每1000毫秒或以一些其他间隔照射声光设备。

根据激光器，可以根据变化的距离照射声光设备，该距离为例如0.01mm或更远，例如0.05mm或更远，例如0.1mm或更远，例如0.5mm或更远，例如1mm或更远，例如2.5mm或更远，例如5mm或更远，例如10mm或更远，例如15mm或更远，例如25mm或更远并且包括50mm或更远。此外，角度或照射也可以变化，为10°至90°，例如15°至85°，例如20°至80°，例如25°至75°并且包括30°至60°，例如90°角。

在实施例中，方法包括将射频驱动信号施加到声光设备以生成角度偏转激光束。可以将两个或更多个射频驱动信号施加到声光设备以生成具有期望数量的角度偏转激光束的输出激光束，例如3个或更多个射频驱动信号，例如4个或更多个射频驱动信号，例如5个或更多个射频驱动信号，例如6个或更多个射频驱动信号，例如7个或更多个射频驱动信号，例如8个或更多个射频驱动信号，例如9个或更多个射频驱动信号，例如10个或更多个射频驱动信号，例如15个或更多个射频驱动信号，例如25个或更多个射频驱动信号，例如50个或更多个射频驱动信号并且包括100个或更多个射频驱动信号。

由射频驱动信号产生的角度偏转激光束各自具有基于所施加的射频驱动信号的幅度的强度。在一些实施例中，方法包括施加具有足以产生具有期望强度的角度偏转激光束的幅度的射频驱动信号。在一些情况下，每个施加的射频驱动信号独立地具有约0.001V至约500V的幅度，例如约0.005V至约400V，例如约0.01V至约300V，例如约0.05V至约200V，例如约0.1V至约100V，例如约0.5V至约75V，例如约1V至50V，例如约2V至40V，例如3V至约30V并且包括约5V至约25V的幅度。在一些实施例中，每个施加的射频驱动信号具有约0.001MHz至约500MHz的频率，例如约0.005MHz至约400MHz，例如约0.01MHz至约300MHz，例如约0.05MHz至约200MHz，例如约0.1MHz至约100MHz，例如约0.5MHz至约90MHz，例如约1MHz至约75MHz，例如约2MHz至约70MHz，例如约3MHz至约65MHz，例如约4MHz至约60MHz并且包括约5MHz至约50MHz的频率。

在这些实施例中，输出激光束中的角度偏转激光束在空间上是分隔开的。根据施加的射频驱动信号和输出激光束的期望照射分布，角度偏转激光束可以间隔0.001μm或更远，例如0.005μm或更远，例如0.01μm或更远，例如0.05μm或更远，例如0.1μm或更远，例如0.5μm或更远，例如1μm或更远，例如5μm或更远，例如10μm或更远，例如100μm或更远，例如500μm或更远，例如1000μm或更远并且包括5000μm或更远。在一些实施例中，角度偏转激光束重叠，例如沿输出激光束的水平轴线的与相邻的角度偏转激光束重叠。相邻的角度偏转激光束之间的重叠(例如光束点的重叠)可以是0.001μm或更多的重叠，例如0.005μm或更多的重叠，例如0.01μm或更多的重叠，例如0.05μm或更多的重叠，例如0.1μm或更多的重叠，例如0.5μm或更多的重叠，例如1μm或更多的重叠，例如5μm或更多的重叠，例如10μm或更多的重叠并且包括100μm或更多的重叠。

在某些情况下，光源包括光束发生器，例如如Diebold等人的Nature Photonics第7(10)卷806-810(2013)所描述的；以及美国专利号9,423,353、9,784,661、9,983,132、10,006,852、10,078,045、10,036,699、10,222,316、10,288,546、10,324,019、10,408,758、10,451,538、10,620,111和美国专利公布号2017/0133857、2017/0328826、2017/0350803、2018/0275042、2019/0376895和2019/0376894中所描述的，其公开内容通过引用并入本文。

在实施例中，流动流中被照射的粒子可以是细胞，例如流动流中的样本是生物样本。术语“生物样本”以其常规含义使用，是指在某些情况下可在血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、支气管肺泡灌洗液、羊水、羊脐带血、尿液、阴道液和精液中发现的整个生物体、植株、真菌或动物组织、细胞或组成部分的子集。因此，“生物样本”既指天然生物体或其组织的子集，也指根据生物体或其组织的子集制备的匀浆、裂解物或提取物，包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤切片、呼吸道、胃肠道、心血管和泌尿生殖道、眼泪、唾液、奶、血细胞、肿瘤、器官。生物样本可以是任何类型的有机组织，包括健康组织和患病组织(例如，癌性组织、恶性组织、坏死组织等)。在某些实施例中，生物样本是液体样本，例如血液或血液衍生物，例如血浆、泪液、尿液、精液等，在一些情况下样本是血液样本，包括全血，例如从静脉穿刺或手指穿刺获得的血液(血液可能会或可能不会在化验前与任何试剂(例如防腐剂、抗凝剂等)混合)。

在某些实施例中，样本的来源是“哺乳动物”或“哺乳类动物”，这些术语广泛用于描述属于哺乳动物纲的生物体，哺乳动物纲包括食肉目(例如，狗和猫)、啮齿目(例如，小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长目(例如人类、黑猩猩和猴子)。在某些情况下，受试者是人类。该方法可以应用于从两种性别和处于任何发育阶段(即，新生儿、婴儿、少年、青少年、成人)的人类受试者获得的样本，在某些实施例中，人类受试者是少年、青少年或成人。虽然本发明可以应用于来自人类受试者的样本，但是应当理解，这些方法也可以在来自其他动物受试者(即，在“非人类受试者”中)的样本上进行，其他动物受试者例如但不限于鸟、鼠、老鼠、狗、猫、牲畜和马。

在实践主题方法中，使用一个或更多个光电检测器检测来自样本的散射光。在实施例中，散射光电检测器可以是侧向散射光电检测器、前向散射光电检测器、后向散射光电检测器及其组合。术语“光散射”在本文中以其常规含义使用，是指来自样本中的粒子(例如，在流动流中流动)的光能的传播，所述粒子从入射光束路径偏转，例如通过反射、折射或光束的偏转从入射光路径偏转。在一些实施例中，散射光不是来自粒子的组分(例如，荧光团)的发光。在实施例中，根据本公开的散射光不是荧光或磷光。在某些实施例中，从流动流中的粒子检测到的散射光包括米氏散射(Mie scattering)。在其他实施例中，从流动流中的粒子检测到的散射光包括瑞利散射(Rayleigh scattering)。在又一些实施例中，从流动流中的粒子检测到的散射光包括米氏散射和瑞利散射。

在实施例中，散射光可以由每个光电检测器以相对于入射光束照射的角度来检测，例如以1°或更大(例如10°或更大，例如15°或更大，例如20°或更大，例如25°或更大，例如30°或更大，例如45°或更大，例如60°或更大，例如75°或更大，例如90°或更大，例如135°或更大，例如150°或更大)的角度来检测并且包括散射光检测器被配置为以相对于入射光束照射为180°或更大的角度检测来自样本中的粒子的光的情况。在某些情况下，光散射光电检测器包括侧向散射光电检测器，例如光电检测器被定位以检测相对于入射光束照射以30°至120°传播的散射光，例如以45°至105°并且包括以60°至90°传播的散射光。在某些情况下，光散射检测器是相对于入射光束照射成90°角定位的侧向散射光电检测器。在其他情况下，光散射检测器是前向散射检测器，例如检测器被定位以检测相对于入射光束照射以120°至240°传播的散射光，例如以100°至220°，例如以120°至200°并且包括相对于入射光束照射以140°至180°传播的散射光。在某些情况下，光散射检测器是被定位以检测相对于入射光束照射以180°角度传播的散射光的前向散射光电检测器。在又一些情况下，光散射检测器是被定位以检测相对于入射光束照射以1°至30°传播的散射光(例如以5°至25°并且包括相对于入射光束照射以10°至20°传播的散射光)的后向散射光电检测器。在某些情况下，散射光由后向散射光电检测器检测，该后向散射光电检测器被定位以检测相对于入射光束照射以30°角度传播的散射光。

本公开的方法包括使用一个或更多个光电检测器检测散射光。在一些实施例中，使用2个或更多个侧向散射光电检测器检测散射光，例如3个或更多个侧向散射光电检测器，例如4个或更多个侧向散射光电检测器，例如5个或更多个侧向散射光电检测器，例如6个或更多个侧向散射光电检测器，例如7个或更多个侧向散射光电检测器，例如8个或更多个侧向散射光电检测器，例如9个或更多个侧向散射光电检测器并且包括10个或更多个侧向散射光电检测器。在其他实施例中，使用侧向散射光电检测器和前向散射光电检测器检测散射光，所述侧向散射光电检测器和前向散射光电检测器为例如2个或更多个侧向散射光电检测器和前向散射光电检测器，例如3个或更多个侧向散射光电检测器和前向散射光电检测器，例如4个或更多个侧向散射光电检测器和前向散射光电检测器，例如5个或更多个侧向散射光电检测器和前向散射光电检测器，例如6个或更多个侧向散射光电检测器和前向散射光电检测器，例如7个或更多个侧向散射光电检测器和前向散射光电检测器，例如8个或更多个侧向散射光电检测器和前向散射光电检测器，例如9个或更多个侧向散射光电检测器和前向散射光电检测器并且包括10个或更多个侧向散射光电检测器和前向散射光电检测器。在又一些实施例中，使用侧向散射光电检测器和后向散射光电检测器检测散射光，所述侧向散射光电检测器和后向散射光电检测器为例如2个或更多个侧向散射光电检测器和后向散射光电检测器，例如3个或更多个侧向散射光电检测器和后向散射光电检测器，例如4个或更多个侧向散射光电检测器和后向散射光电检测器，例如5个或更多个侧向散射光电检测器和后向散射光电检测器，例如6个或更多个侧向散射光电检测器和后向散射光电检测器，例如7个或更多个侧向散射光电检测器和后向散射光电检测器，例如8个或更多个侧向散射光电检测器和后向散射光电检测器，例如9个或更多个侧向散射光电检测器和后向散射光电检测器并且包括10个或更多个侧向散射光电检测器和后向散射光电检测器。在又一些实施例中，使用侧向散射光电检测器、前向散射光电检测器和后向散射光电检测器检测散射光，所述侧向散射光电检测器、前向散射光电检测器和后向散射光电检测器为例如2个或更多个侧向散射光电检测器、前向散射光电检测器和后向散射光电检测器，例如3个或更多个侧向散射光电检测器、前向散射光电检测器和后向散射光电检测器，例如4个或更多个侧向散射光电检测器、前向散射光电检测器和后向散射光电检测器，例如5个或更多个侧向散射光电检测器、前向散射光电检测器和后向散射光电检测器，例如6个或更多个侧向散射光电检测器、前向散射光电检测器和后向散射光电检测器，例如7个或更多个侧向散射光电检测器、前向散射光电检测器和后向散射光电检测器，例如8个或更多个侧向散射光电检测器、前向散射光电检测器和后向散射光电检测器，例如9个或更多个侧向散射光电检测器、前向散射光电检测器和后向散射光电检测器并且包括10个或更多个侧向散射光电检测器、前向散射光电检测器和后向散射光电检测器。

在某些实施例中，散射光由光检测系统检测，该光检测系统包括相对于入射光束照射以90°角度定位的第一侧向散射光电检测器和相对于入射光束照射以小于90°的角度定位的第二侧向散射光电检测器。在一些情况下，第一侧向散射光电检测器被配置为检测相对于入射光束照射以30°至150°的角度散射的光，例如以60°至120°的角度散射的光并且包括相对于入射光束照射以90°角度散射的光，并且第二侧向散射光电检测器被配置为检测相对于入射光束照射以5至30度角度散射的光，例如相对于入射光束照射以10至30°角度散射的光。在某些实施例中，第二侧向散射光电检测器被配置为检测侧向散射光和后向散射光二者。在这些实施例中，后向散射光可以通过反射镜从流动流传播到检测器，例如通过具有孔的反射镜(例如，以通过来自光源的照射光)从流动流传播到检测器。

在一些实施例中，来自流动流的散射光通过一个或更多个光学调节部件被传送到散射光电检测器。术语“光学调节”在本文中以其常规含义使用，是指改变或调节传播到光散射光电检测器的光的光学部件。例如，光学调节可以是改变光束的分布、光束的焦点、光束传播的方向或准直光束。在某些实施例中，散射光通过分色镜和带通滤光片中的一个或更多个被传送到散射光电检测器。在某些情况下，来自流动流中的粒子的散射光通过分色镜和带通滤光片传送到每个散射光电检测器。

通过光学调节部件传播到光散射光电检测器的光量也可以变化，在一些实施例中，收集的光de 50％或更多被传送到光散射光电检测器，例如收集的光的55％或更多，例如60％或更多，例如65％或更多，例如75％或更多，例如80％或更多，例如90％或更多被传送到光散射光电检测器并且包括来自流动流的光的95％或更多通过光学调节部件被传送到光散射光电检测器。例如，通过光学调节部件传播到光散射光电检测器的光量可以为25％至99％，例如30％至95％，例如35％至90％，例如40％至85％，例如45％至80％并且包括50％至75％。

光散射光电检测器可以是任何合适的光电传感器，在其他类型的光电检测器中，例如有源像素传感器(APSs)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合设备(CCD)、增强电荷耦合设备(ICCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器或N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器、发光二极管、光子计数器、辐射热计、热释电探测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合以及其他类型的光电检测器。在实施例中，光散射光电检测器可以包括1个或更多个光电传感器，例如2个或更多个，例如3个或更多个，例如5个或更多个，例如10个或更多个光电传感器并且包括25个或更多个光电传感器。在一些情况下，光散射光电检测器是光电检测器阵列。术语“光电检测器阵列”以其常规含义使用，指代被配置为检测光的两个或更多个光电检测器的设置或系列。在实施例中，光电检测器阵列可以包括2个或更多个光电检测器，例如3个或更多个光电检测器，例如4个或更多个光电检测器，例如5个或更多个光电检测器，例如6个或更多个光电检测器，例如7个或更多个光电检测器，例如8个或更多个光电检测器，例如9个或更多个光电检测器，例如10个或更多个光电检测器，例如12个或更多个光电检测器并且包括15个或更多个光电检测器。在某些实施例中，光电检测器阵列包括5个光电检测器。光电检测器可以根据需要设置成任何几何配置，其中感兴趣的设置包括但不限于正方形配置、矩形配置、梯形配置、三角形配置、六边形配置、七边形配置、八边形配置、九边形配置、十边形配置、十二边形配置、圆形配置、椭圆形配置以及不规则形状的配置。光散射光电检测器阵列中的光电检测器可以相对于另一个光电检测器(如在X-Z平面中所参考的)以10°至180°的角度定向，该角度为例如15°至170°，例如20°至160°，例如25°至150°，例如30°至120°并且包括45°至90°。

本公开的光散射光电检测器被配置为测量在一个或更多个波长处收集的光，例如在2个或更多个波长处、例如在5个或更多个不同波长处、例如在10个或更多个不同波长处、例如在25个或更多个不同波长处、例如在50个或更多个不同波长处、例如在100个或更多个不同波长处、例如在200个或更多个不同波长处、例如在300个或更多个不同波长处收集的光并且包括测量由流动流中的样本以400个或更多个不同的波长发射的光。

在一些实施例中，主题光电检测器被配置为测量在波长范围(例如，200nm至1000nm)内收集的光。在某些实施例中，感兴趣的检测器被配置为收集波长范围内的光的光谱。例如，系统可以包括一个或更多个检测器，一个或更多个检测器被配置为收集200nm至1000nm波长范围中的一个或更多个波长范围内的光的光谱。在又一些实施例中，感兴趣的检测器被配置为测量由流动流中的样本以一个或跟多个特定波长发射的光。在实施例中，光检测系统被配置为连续或以离散间隔测量光。在某些情况下，感兴趣的检测器被配置为连续对收集的光进行测量。在其他情况下，光检测系统被配置为以离散间隔进行测量，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒并且包括每1000毫秒测量光，或以一些其他间隔测量光。

在一些实施例中，由流动流中的粒子散射的光通过一个或更多个输出偏振器传送到光电检测器。在某些实施例中，使散射光通过输出偏振器可以生成以参考频率振荡的偏振散射光。输出偏振器可以是任何方便的光学偏振器，包括但不限于线性偏振器、吸收偏振器、分束偏振器、双折射偏振器、薄膜偏振器、线栅偏振器、圆偏振器以及被配置用于通过菲涅耳反射进行偏振的光学偏振器。在某些实施例中，输出偏振器包括四分之一波片。来自流动流的散射光可以通过一个或更多个输出偏振器传送到光电检测器，一个或更多个输出偏振器为例如2个或更多个，例如3个或更多个，例如4个或更多个并且包括5个或更多个输出偏振器。输出偏振器可以定位在距流动流的变化的距离处，该距离为例如0.01mm或更远，例如0.05mm或更远，例如0.1mm或更远，例如0.5mm或更远，例如1mm或更远，例如2.5mm或更远，例如5mm或更远，例如10mm或更远，例如15mm或更远，例如25mm或更远并且包括50mm或更远。此外，偏振器相对于流动流的角度也可以变化，该角度相对于偏振器的平面表面为10°至90°，例如15°至85°，例如20°至80°，例如25°至75°并且包括30°至60°，例如90°角度。

在某些实施例中，在两个或更多个不同检测器通道中检测散射光，例如在两个或更多个不同检测器通道中检测侧向散射光。在一些情况下，在两个或更多个不同检测器通道中检测散射光的情况下，每个检测器通道光学耦合到偏振器。例如，方法可以包括在两个不同的散射检测器通道中检测侧向散射光，其中利用第一侧向散射检测器检测被传送通过具有第一偏振的第一偏振器的光，并利用第二侧向散射检测器检测被传送通过具有第二偏振的第二偏振器的光。在一些情况下，第一偏振和第二偏振彼此相差5°或更多，例如相差10°或更多，例如相差15°或更多，例如相差20°或更多，例如相差25°或更多，例如相差30°或更多，例如相差45°或更多，例如相差60°或更多，例如相差75°或更多并且包括其中第一偏振器具有垂直于第二偏振器(即第一偏振器的偏振与第二偏振器的偏振相差90°)的偏振的情况。

在实施例中，方法包括使用多个光电检测器中的每一个光电检测器根据散射光生成频率编码数据信号。在一些实施例中，频率编码数据信号是通过检测以参考频率振荡的散射光的幅度来生成的。在一些情况下，方法包括检测来自光电检测器的具有以下振荡频率的数据信号的幅度：该振荡频率为0.001MHz至约500MHz，例如约0.005MHz至约400MHz，例如约0.01MHz至约300MHz，例如约0.05MHz至约200MHz，例如约0.1MHz至约100MHz，例如约0.5MHz至约90MHz，例如约1MHz至约75MHz，例如约2MHz至约70MHz，例如约3MHz至约65MHz，例如约4MHz至约60MHz并且包括约5MHz至约50MHz。

在一些实施例中，生成频率编码数据信号足以减少或消除来自光电检测器数据信号的低频噪声分量的贡献，例如检测以参考频率振荡的散射光的幅度能够将来自光电检测器数据信号的低频噪声分量的贡献降低5％或更多，例如10％或更多，例如15％或更多，例如20％或更多，例如25％或更多，例如30％或更多，例如50％或更多，例如60％或更多，例如75％或更多，例如90％或更多，例如95％或更多，例如97％或更多，例如99％或更多并且包括检测以参考频率振荡的散射光的幅度足以消除低频噪声对光电检测器数据信号的任何贡献的情况。在其他实施例中，检测以参考频率振荡的散射光的幅度能够降低光电检测器偏移对光电检测器数据信号的贡献，例如降低5％或更多，例如降低10％或更多，例如降低15％或更多，例如降低20％或更多，例如降低25％或更多，例如降低了30％或更多，例如降低了50％或更多，例如降低了60％或更多，例如降低了75％或更多，例如降低了90％或更多，例如降低了95％或更多，例如降低了97％或更多，例如降低了99％或更多并且包括检测以参考频率振荡的散射光的幅度足以消除光电检测器偏移对光电检测器数据信号的任何贡献的情况。

生成的频率编码数据信号与参考频率信号同步。术语“同步”在本文中以其常规含义使用，是指将参考信号的调制频率(例如，由耦合到光调制器的控制器生成)与由光电检测器响应于检测到的散射光而生成的数据信号的振荡频率相匹配。在一些实施例中，当频率编码数据信号的振荡频率与参考数据信号的频率相差10％或更小时，例如相差9％或更小，例如相差8％或更小，例如相差7％或更小，例如相差6％或更小，例如相差5％或更小，例如相差4％或更小，例如相差3％或更小，例如相差2％或更小，例如相差1％或更小，例如相差0.5％或更小，例如相差0.1％或更小，例如相差0.01％或更小，例如相差0.001％或更小，例如相差0.0001％或更小并且包括频率编码数据信号的振荡频率与参考数据信号的频率相差0.00001％或更小的情况，频率编码数据信号与参考数据信号同步。在某些实施例中，当频率编码数据信号的振荡频率与参考数据信号的频率一致匹配时，频率编码数据信号与参考数据信号同步。

在一些实施例中，使用锁定放大器将频率编码数据信号与参考数据信号同步。在一些情况下，频率编码数据信号被传送到锁定放大器并与参考波形同步。在一些实施例中，为了将频率编码数据信号与参考频率波形同步，将频率编码数据信号的每一个与参考频率波形相乘。在某些情况下，未调制的背景信号通过锁定放大被转换为双极方波。在一些实施例中，在集成电路设备上执行锁定放大。在某些情况下，在现场可编程门阵列(FPGA)上执行锁定放大。在其他情况下，在专用集成电路(ASIC)上执行锁定放大。在又一些实施例中，在复杂可编程逻辑器件(CPLD)上执行锁定放大。在某些实施例中，频率编码数据信号与参考频率数字同步。例如，可以在具有存储器的处理器上处理频率编码数据信号，存储器可操作地耦合到处理器，其中存储器具有存储在其上的指令，所述指令为当由处理器执行时，使处理器接收来自光电检测器的频率编码数据信号并将参考信号与频率编码数据信号同步。在某些情况下，参考频率信号存储在存储器上。在其他情况下，参考频率信号从与光调制器部件通信的控制器传送到处理器。

在一些实施例中，方法包括根据同步的频率编码数据信号生成数据信号分布。在某些情况下，为了生成数据信号分布，将低通滤波器应用于同步的频率编码数据信号。在一些实施例中，使用锁定放大器将低通滤波器应用于同步的频率编码数据信号。在其他实施例中，低通滤波器数字地应用于同步的频率编码数据信号。在某些情况下，将低通滤波器应用于同步的频率编码数据信号能够生成高斯信号分布。在其他情况下，将低通滤波器应用于同步的频率编码数据信号能够生成超高斯信号分布。

图1A描绘了根据某些实施例的粒子分析器。粒子分析器100包括激光器101，激光器101被配置为生成激光束，该激光束通过输入偏振器102传送到光调制器103(例如电光调制器)，光调制器103接收来自控制器104的参考频率信号。输出的调频光束照射源于流动池106的流动流105中的粒子。对流动流105中的粒子的照射产生由荧光电检测器107a、107b、107c检测到的荧光，并产生由侧向散射光电检测器108和前向散射检测器109检测到的散射光。来自粒子的散射光通过输出偏振器108a被传送到侧向散射光电检测器108并通过输出偏振器109a被传送到前向散射光电检测器109。散射光电检测器108和109与锁定放大器110进行通信以将生成的频率编码数据信号与来自控制器104的参考频率同步。

图1B描绘了根据某些实施例的光源的光学调制部件。光学调制部件包括用于生成偏振激光的输入偏振器，该偏振激光被传送到电光晶体的光接收端，用于对偏振激光束施加频率调制。源于电光晶体的调频激光通过四分之一波片和输出偏振器以另外对激光束施加偏振。

图2A描绘了根据某些实施例的用于确定流动流中的粒子的参数的流程图。在步骤201处，为光调制器生成参考频率信号，该光调制器在步骤202处当被用激光器照射时对激光束施加频率调制，从而产生在参考频率处具有振荡频率的调频激光束。在步骤203处，用调频激光束照射流动流中的粒子。在步骤204处，检测来自粒子的散射光。在一些实施例中，通过输出偏振器检测散射光。在某些情况下，在两个不同的检测器通道中检测散射光，其中检测器通道具有带有垂直偏振的输出偏振器。在步骤205处，生成频率编码数据信号，其中该数据信号在参考频率处具有振荡频率。在步骤206处，使生成的数据信号与参考频率同步。频率编码数据信号能够与系统处理器或锁定放大器数字同步。在某些实施例中，在具有用于接收参考频率信号并将频率编码数据信号与参考频率信号同步的程序设计的FPGA上执行锁定放大。在一些实施例中，在步骤208处，基于同步的频率编码数据信号确定一个或更多个参数(例如，粒子尺寸、形态)。在其他实施例中，在步骤207处，根据同步的频率编码数据信号生成数据分布。也能够基于生成的数据分布来确定一个或更多个参数。

图2B描绘了根据某些实施例的根据流动流中的粒子的照射生成和处理数据信号分布。在面板210处产生具有振荡频率ω_R的参考波形。检测来自流动流中的被照射粒子的散射光并且在面板211处生成调制的峰值数据信号。调制峰值在参考频率ω_R处表现出振荡。在偏振调制之后，背景信号被引入到面板212中描绘的总信号中。面板212中的这个信号被建模为随机游走，它表现出数据信号的失真。在面板213处，通过使用锁定放大器将频率编码数据信号与参考波形相乘，将由散射光电检测器生成的数据信号与参考波形同步。未调制的背景信号被转换成双极方波。在面板214处在锁定放大期间将低通滤波器应用于同步的数据信号以生成恢复的数据信号分布。

图3A和图3B描绘了根据某些实施例的高斯数据信号分布(图3A)和超高斯数据信号分布(图3B)的检测和恢复。对被照射粒子的检测会生成由数据信号和背景信号产生的数据点。还描绘了基础基线背景信号。通过将检测到的信号(和基线)与参考频率波形同步而恢复的频率编码数据信号生成恢复的信号，恢复的信号消除了背景信号的任何干扰，例如来自低频噪声分量或检测系统的检测器偏移的干扰。如图3A和图3B所示，恢复的数据信号分布与仿真的基础数据信号密切对应。

在某些实施例中，方法还包括确定流动流中粒子的一个或更多个参数。在一些情况下，流动流中的样本包括细胞，并且方法包括检测样本中的细胞。在一些实施例中，检测细胞包括识别样本中的细胞类型。在其他实施例中，方法包括表征样本的细胞。在其他实施例中，方法包括区分样本中的细胞类型。在某些实施例中，方法包括基于同步的频率编码数据信号或根据生成的数据信号分布来识别和区分细胞类型。在一些情况下，方法包括生成流动流的图像并基于同步的频率编码数据信号或根据生成的数据信号分布来识别样本中的细胞类型。

在一些实施例中，方法包括从流动流中的样本中分选一种或更多种粒子。术语“分选”在本文中以其常规含义使用，是指分离样本的组分(例如，包含细胞的微滴、包含非细胞粒子例如生物大分子的微滴)并且在一些情况下将分离的组分递送至一个或更多个样本收集容器。例如，粒子分类可以包括用于分选样本的2种或更多种组分的分选门(sortinggate)，2种或更多种组分为例如3种或更多种组分，例如4种或更多种组分，例如5种或更多种组分，例如10种或更多种组分，例如15种或更多种组分并且包括样本的25种或更多种组分。在对粒子进行分选时，方法包括例如使用计算机进行数据采集、分析和记录，其中多个数据通道记录来自每个使用的检测器的数据。在这些实施例中，分析可以包括光谱式解析光(例如，通过计算光谱分离矩阵(unmixing matrix))。该分析可以被传送到分选系统，分选系统被配置为基于粒子分类生成一组数字化参数。

在一些实施例中，用于分选样本的组分的方法包括分选粒子(例如，生物样本中的细胞)，例如如美国专利号3,960,449、4,347,935、4,667,830、5,245,318、5,464,581、5,483,469、5,602,039、5,643,796、5,700,692、6,372,506和and 6,809,804中所描述的述，其公开内容通过引用并入本文。在一些实施例中，方法包括用粒子分选模块分选样本的组分，例如在美国专利号9,551,643和10,324,019、美国专利公布公开号2017/0299493和国际专利公布公开号WO/2017/040151中所描述的那些粒子分选模块，其公开内容通过引用并入本文。在某些实施例中，使用具有多个分选决策单元的分选决策模块对样本的细胞进行分选，例如在2019年12月23日提交的美国专利申请号16/725,756中所描述的那些分选决策模块，其公开内容通过引用并入本文。

用于确定流动流中的被照射样本中的粒子的参数的系统

本公开的方面包括用于确定流动流中的被照射样本中的粒子的参数的系统。根据某些实施例的系统包括具有激光器和光调制器部件的光源、具有光散射光电检测器的光检测系统以及处理器，光调制器部件被配置为以参考频率产生调频激光束，处理器具有耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时，使处理器根据检测到的散射光生成频率编码数据信号，将频率编码数据信号与参考频率同步，以及基于同步的频率编码数据信号确定粒子的一个或更多个参数。

在实施例中，系统包括被配置为生成以参考频率调制的调制激光束的光源。光源包括一个或更多个激光器(如下文更详细描述的)和被配置为接收来自激光器的光并生成调制激光束的光调制器部件。在实施例中，可以通过使激光通过光调制器部件来改变激光的一种或更多种特性，包括激光束的相位、频率、幅度或偏振。在某些实施例中，光调制器被配置为生成调频光束。在一些实施例中，调制器是电光调制器。在一些情况下，电光调制器包括响应于施加直流电而改变折射率的部件(例如，非线性光学材料，例如非线性有机聚合物或结晶铌酸锂)，并且用激光器照射电光调制器足以从激光器输出调频光束。在其他情况下，电光调制器包括响应于施加低频电场而改变折射率的部件，并且用激光器照射电光调制器足以从激光器输出调频光束。在某些实施例中，光调制器是声光调制器，例如具有激光器的压电光调制器。

在一些实施例中，光调制器被配置为调制激光束的频率。在一些情况下，光调制器被配置为以参考频率调制激光束的频率，例如以约0.001MHz至约500MHz的振荡频率调制激光束的频率，该振荡频率为例如约0.005MHz至约400MHz，例如约0.01MHz至约300MHz，例如约0.05MHz至约200MHz，例如约0.1MHz至约100MHz，例如约0.5MHz至约90MHz，例如约1MHz至约75MHz，例如约2MHz至约70MHz，例如约3MHz至约65MHz，例如约4MHz至约60MHz并且包括约5MHz至约50MHz。

在一些实施例中，系统包括用于将电流或电场施加到光调制器的控制器。在某些实施例中，所述控制器配置有电脉冲发生器。在其他实施例中，控制器被配置为施加射频驱动信号，例如控制器包括直接数字合成器(DDS)或任意波形发生器(AWS)。在一些实施例中，控制器被配置为生成参考频率信号波形。根据某些实施例所生成的参考频率信号波形具有振荡频率，该振荡频率为例如约0.001MHz至约500MHz、例如约0.005MHz至约400MHz，例如约0.01MHz至约300MHz，例如约0.05MHz至约200MHz，例如约0.1MHz至约100MHz，例如约0.5MHz至约90MHz，例如约1MHz至约75MHz，例如约2MHz至约70MHz，例如约3MHz至约65MHz，例如约4MHz至约60MHz并且包括约5MHz至约50MHz。

在一些实施例中，光调制器与输入偏振器进行光通信。在这些实施例中，输入偏振器位于激光器和光调制器之间，使得激光通过输入偏振器传送到光调制器的光接收端。输入偏振器可以是任何方便的光学偏振器，包括但不限于线性偏振器、吸收偏振器、分束偏振器、双折射偏振器、薄膜偏振器、线栅偏振器、圆偏振器以及被配置用于通过菲涅耳反射进行偏振的光学偏振器。光源可以包括一个或更多个输入偏振器，一个或更多个输入偏振器为例如2个或更多个，例如3个或更多个，例如4个或更多个并且包括5个或更多个输入偏振器。输入偏振器可以定位在距激光器0.01mm或更远，例如0.05mm或更远，例如0.1mm或更远，例如0.5mm或更远，例如1mm或更远，例如2.5mm或更远，例如5mm或更远，例如10mm或更远，例如15mm或更远，例如25mm或更远并且包括50mm或更远。此外，输入偏振器可以相对于激光器以变化的角度定位，该角度为相对于偏振器的平面表面为10°至90°，例如15°至85°，例如20°至80°，例如25°至75°并且包括30°至60°，例如90°角度。

在实施例中，主题系统的光源包括一个或更多个激光器，例如2个或更多个激光器，例如3个或更多个激光器，例如4个或更多个激光器，例如8个或更多个激光器，例如12个或更多个激光器，例如16个或更多激光器，例如24个或更多个激光器，例如36个或更多个激光器，例如48个或更多个激光器并且包括60个或更多个激光器。感兴趣的激光器可以包括脉冲激光器或连续波激光器。主题光源中激光器的类型和数量可以变化并且可以包括气体激光器，例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO₂激光器、CO激光器、氩氟(ArF)准分子激光器、氪氟(KrF)准分子激光器、氙氯(XeCl)准分子激光器或氙氟(XeF)准分子激光器或其组合。在其他情况下，光源包括染料激光器，例如二苯乙烯(stilbene)、香豆素或罗丹明激光器。在又一些情况下，光源包括金属蒸汽激光器，例如氦镉(HeCd)激光器、氦汞(HeHg)激光器、氦硒(HeSe)激光器、氦银(HeAg)激光器、锶激光器、氖铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及其组合。在又一些情况下，光源包括固态激光器，例如红宝石激光器、Nd:YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器、Nd:YVO₄激光器、Nd:YCa₄O(BO₃)₃激光器、Nd:YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、氧化镱激光器或掺铈激光器及其组合。在又一些情况下，光源包括半导体二极管激光器、光泵浦半导体激光器(OPSL)，或任何上述激光器的二倍频或三倍频实现。

取决于在输出激光束(例如，用于照射流动流中的样本)中产生的光的期望波长，激光可以具有从200nm至1500nm变化的特定波长，例如从250nm至1250nm，例如从300nm至1000nm，例如从350nm至900nm变化并且包括400nm至800nm的波长。系统可以包括激光器类型的任何组合。例如，在一些实施例中，方法包括用激光器阵列照射光调制器，例如具有一个或更多个气体激光器、一个或更多个染料激光器和一个或更多个固态激光器的阵列。

在使用多于一个激光器的情况下，光源可以被配置为使用多个激光器同时或按顺序照射光调制器或者使用激光器的组合照射光调制器。例如，多个激光器可以被配置为同时照射光调制器。在其他实施例中，多个激光器被配置为按顺序照射光调制器。在激光器被配置为按顺序照射光调制器的情况下，每个激光器可以被配置为独立地照射光调制器的时间为0.001微秒或更多，例如0.01微秒或更多，例如0.1微秒或更多，例如1微秒或更多，例如5微秒或更多，例如10微秒或更多，例如30微秒或更多并且包括60微秒或更多。例如，激光器可以被配置为在持续时间内用激光器照射电光调制器设备，该持续时间为0.001微秒至100微秒，例如0.01微秒至75微秒，例如0.1微秒至50微秒，例如1微秒至25微秒并且包括5微秒至10微秒。在实施例中，每个激光器可以被配置为以彼此相同或不同的持续时间照射光调制器。

每个激光器进行照射之间的时间段也可以根据需要变化，由0.001微秒或更多的延迟独立分隔开，该延迟为例如0.01微秒或更多，例如0.1微秒或更多，例如1微秒或更多，例如5微秒或更多，例如10微秒或更多，例如15微秒或更多，例如30微秒或更多并且包括60微秒或更多。例如，每个光源进行照射之间的时间段可以为0.001微秒至60微秒，例如0.01微秒至50微秒，例如0.1微秒至35微秒，例如1微秒至25微秒并且包括5微秒至10微秒。在某些实施例中，每个激光进行照射之间的时间段是10微秒。在光调制器设备由多于两个(即3个或更多个)激光器按顺序照射的实施例中，每个激光器进行照射之间的延迟可以相同或不同。

激光器可以被配置用于连续或以离散间隔照射光调制器。在一些情况下，每个激光器可以被配置为连续照射光调制器。在其他情况下，每个激光器可以被配置为以离散间隔照射光调制器，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒照射光调制器并且包括每1000毫秒或以一些其他间隔照射光调制器。

激光器可以定位在主题光源中距光调制器变化的距离处，该距离为例如0.01mm或更远，例如0.05mm或更远，例如0.1mm或更远，例如0.5mm或更远，例如1mm或更远，例如2.5mm或更远，例如5mm或更远，例如10mm或更远，例如15mm或更远，例如25mm或更远并且包括50mm或更远。此外，激光器可以被定位成与光调制器成一定角度，该角度为例如10°到90°，例如15°至85°，例如20°至80°，例如25°至75°并且包括30°至60°，例如90°角度。

在某些实施例中，光源是光束发生器，该光束发生器被配置为生成两束或更多束频移光束。在一些情况下，光束发生器包括激光器和射频发生器，该射频发生器被配置为将射频驱动信号施加到声光设备以生成两个或更多个角度偏转激光束。在这些实施例中，激光器可以是脉冲激光器或连续波激光器。例如，感兴趣的光束发生器中的激光器可以是气体激光器，例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO₂激光器、CO激光器、氩氟(ArF)准分子激光器、氪氟(KrF)准分子激光器、氙氯(XeCl)准分子激光器或氙氟(XeF)准分子激光器或其组合；染料激光器，例如二苯乙烯、香豆素或罗丹明激光器；金属蒸汽激光器，例如氦镉(HeCd)激光器、氦汞(HeHg)激光器、氦硒(HeSe)激光器、氦银(HeAg)激光器、锶激光器、氖铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及其组合；固态激光器，例如红宝石激光器、Nd:YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器、Nd:YVO₄激光器、Nd:YCa₄O(BO₃)₃激光器、Nd:YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、氧化镱激光器或掺铈激光器及其组合。

声光设备可以是被配置为使用施加的声波对激光进行频移的任何方便的声光协议。在某些实施例中，声光设备是声光偏转器。主题系统中的声光设备被配置为根据来自激光器的光和所施加的射频驱动信号生成角度偏转激光束。射频驱动信号可以通过任何合适的射频驱动信号源施加到声光设备，例如直接数字合成器(DDS)、任意波形发生器(AWG)或电脉冲发生器。

在实施例中，控制器被配置为将射频驱动信号施加到声光设备以在输出激光束中产生期望数量的角度偏转激光束，例如被配置为施加3个或更多个射频驱动信号，例如4个或更多个射频驱动信号，例如5个或更多个射频驱动信号，例如6个或更多个射频驱动信号，例如7个或更多个射频驱动信号，例如8个或更多个射频驱动信号，例如9个或更多个射频驱动信号，例如10个或更多个射频驱动信号，例如15个或更多个射频驱动信号，例如25个或更多个射频驱动信号，例如50个或更多射频驱动信号并且包括被配置为施加100个或更多个射频驱动信号。

在一些情况下，为了在输出激光束中产生角度偏转激光束的强度分布，控制器被配置为施加具有变化的幅度的射频驱动信号，该幅度为约0.001V至约500V，例如约0.005V至约400V，例如约0.01V至约300V，例如约0.05V至约200V，例如约0.1V至约100V，例如约0.5V至约75V，例如约1V至50V，例如约2V至40V，例如3V至约30V并且包括约5V至约25V。在一些实施例中，每个施加的射频驱动信号具有以下频率：该频率为约0.001MHz至约500MHz，例如约0.005MHz至约400MHz，例如约0.01MHz至约300MHz，例如约0.05MHz至约200MHz，例如约0.1MHz至约100MHz，例如约0.5MHz至约90MHz，例如约1MHz至约75MHz，例如约2MHz至约70MHz，例如约3MHz至约65MHz，例如约4MHz至约60MHz并且包括约5MHz至约50MHz。

在某些实施例中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时，使处理器产生具有角度偏转激光束的输出激光束，所述角度偏转激光束具有期望的强度分布。例如，存储器可以包括用于产生具有相同强度的两个或更多个角度偏转激光束的指令，例如3个或更多个、例如4个或更多个、例如5个或更多个、例如10个或更多个、例如25个或更多个、例如50个或更多个角度偏转激光束，并且包括：存储器可以包括用于产生具有相同强度的100个或更多个角度偏转激光束的指令。在其他实施例中，可以包括用于产生具有不同强度的两个或更多个角度偏转激光束的指令，例如3个或更多个、例如4个或更多个、例如5个或更多个、例如10个或更多个、例如25个或更多个、例如50个或更多个角度偏转激光束，并且包括：存储器可以包括用于产生具有不同强度的100个或更多个角度偏转激光束的指令。

在某些实施例中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时，使处理器产生激光束，该激光束的强度沿水平轴线从输出激光束的边缘到中心增加。在这些情况下，在输出光束中心处的角度偏转激光束的强度可以是沿水平轴线在输出激光束边缘处的角度偏转激光束的强度的0.1％至约99％，例如0.5％至约95％，例如1％至约90％，例如约2％至约85％，例如约3％至约80％，例如约4％至约75％，例如约5％至约70％，例如约6％至约65％，例如约7％至约60％，例如约8％至约55％并且包括沿水平轴线在输出激光束边缘处的角度偏转激光束的强度的约10％至约50％。在其他实施例中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时，使处理器产生输出激光束，该输出激光束的强度沿水平轴线从输出激光束的边缘到中心增加。在这些情况下，在输出光束边缘处的角度偏转激光束的强度可以是沿水平轴线在输出激光束中心处的角度偏转激光束的强度的0.1％至约99％，例如0.5％至约95％，例如1％至约90％，例如约2％至约85％，例如约3％至约80％，例如约4％至约75％，例如约5％至约70％，例如约6％至约65％，例如约7％至约60％，例如约8％至约55％并且包括沿水平轴线在输出激光束中心处的角度偏转激光束的强度的约10％至约50％。在又一些实施例中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时，使处理器产生输出激光束，该输出光束具有沿水平轴线具有高斯分布的强度分布。在又一些实施例中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时，使处理器产生沿水平轴线具有顶帽强度分布(top hat intensity)的输出激光束。

在实施例中，感兴趣的光束发生器可以被配置为在输出激光束中产生空间分离的角度偏转激光束。根据所施加的射频驱动信号和输出激光束的期望照射分布，角度偏转激光束可以间隔0.001μm或更远，例如0.005μm或更远，例如0.01μm或更远，例如0.05μm或更远，例如0.1μm或更远，例如0.5μm或更远，例如1μm或更远，例如5μm或更远，例如10μm或更远，例如100μm或更远，例如500μm或更远，例如1000μm或更远并且包括5000μm或更远。在一些实施例中，系统被配置为在输出激光束中产生角度偏转激光束，所述角度偏转激光束例如与沿输出激光束的水平轴线的相邻角度偏转激光束重叠。相邻的角度偏转激光束之间的重叠(例如光束点的重叠)可以是0.001μm或更多的重叠，例如0.005μm或更多的重叠，例如0.01μm或更多的重叠，例如0.05μm或更多的重叠，例如0.1μm或更多的重叠，例如0.5μm或更多的重叠，例如1μm或更多的重叠，例如5μm或更多的重叠，例如10μm或更多的重叠并且包括100μm或更多的重叠。

在某些情况下，被配置为生成两个或更多个频移光束的光束发生器包括激光激发模块，如Diebold等人的Nature Photonics第7(10)卷806-810(2013)所描述的以及如美国专利号9,423,353、9,784,661、9,983,132、10,006,852、10,078,045、10,036,699、10,222,316、10,288,546、10,324,019、10,408,758、10,451,538、10,620,111和美国专利公布号2017/0133857、2017/0328826、2017/0350803、2018/0275042、2019/0376895和2019/0376894中所描述的，其公开内容通过引用并入本文。

感兴趣的系统包括一个或更多个光电检测器，一个或更多个光电检测器被配置为检测来自流动流中样本的散射光。在实施例中，散射光电检测器可以是侧向散射光电检测器、前向散射光电检测器、后向散射光电检测器及其组合。在一些实施例中，由光电检测器检测到的散射光不是来自粒子的组分(例如，荧光团)的发光。在实施例中，由光电检测器检测到的散射光不是荧光或磷光。在某些实施例中，光电检测器被配置为检测米氏散射。在其他实施例中，光电检测器被配置为检测瑞利散射。在又一些实施例中，光电检测器被配置为检测米氏散射和瑞利散射。

光电检测器可以相对于流动流以1°或更大的角度定位，该角度为例如10°或更大，例如15°或更大，例如20°或更大，例如25°或更大，例如30°或更大，例如45°或更大，例如60°或更大，例如75°或更大，例如90°或更大，例如135°或更大，例如150°或更大，并且包括散射光检测器被配置为相对于入射光束照射以180°或更大的角度检测来自样本中的粒子的光的情况。在某些情况下，光散射光电检测器包括侧向散射光电检测器，例如其中光电检测器被定位成检测相对于入射光束照射以30°至120°传播的散射光，例如以45°至105°并且包括以60°至90°传播的散射光。在某些情况下，光散射检测器是相对于入射光束照射以90°角度定位的侧向散射光电检测器。在其他情况下，光散射检测器是前向散射检测器，例如其中检测器被定位成检测相对于入射光束照射以120°至240°传播的散射光，例如以100°至220°、例如以120°至200°传播的散射光并且包括相对于入射光束照射以140°至180°传播的散射光。在某些情况下，光散射检测器是前向散射光电检测器，其被定位成检测相对于入射光束照射以180°角度传播的散射光。在又一些情况下，光散射检测器是后向散射光电检测器，其被定位成检测相对于入射光束照射以1°至30°传播的散射光，例如以5°至25°传播的散射光并且包括相对于入射光束照射以10°至20°传播的散射光。在某些情况下，散射光由后向散射光电检测器检测，所述后向散射光电检测器定位成检测相对于入射光束以30°角传播的散射光。

本公开所述的系统包括一个或更多个光电检测器。在一些实施例中，光检测系统包括2个或更多个侧向散射光电检测器，例如3个或更多个侧向散射光电检测器，例如4个或更多个侧向散射光电检测器，例如5个或更多个侧向散射光电检测器，例如6个或更多个侧向散射光电检测器，例如7个或更多个侧向散射光电检测器，例如8个或更多个侧向散射光电检测器，例如9个或更多个侧向散射光电检测器并且包括10个或更多个侧向散射光电检测器。在其他实施例中，光检测系统包括侧向散射光电检测器和前向散射光电检测器，例如前向散射光电检测器和2个或更多个侧向散射光电检测器，例如前向散射光电检测器和3个或更多个侧向散射光电检测器，例如前向散射光电检测器和4个或更多个侧向散射光电检测器，例如前向散射光电检测器和5个或更多个侧向散射光电检测器，例如前向散射光电检测器和6个或更多个侧向散射光电检测器，例如前向散射光电检测器和7个或更多个侧向散射光电检测器，例如前向散射光电检测器和8个或更多个侧向散射光电检测器，例如前向散射光电检测器和9个或更多个侧向散射光电检测器并且包括前向散射光电检测器和10个或更多个侧向散射光电检测器。在其他实施例中，光检测系统包括侧向散射光电检测器和后向散射光电检测器，例如后向散射光电检测器和2个或更多个侧向散射光电检测器，例如后向散射光电检测器和3个或更多个侧向散射光电检测器，例如后向散射光电检测器和4个或更多个侧向散射光电检测器，例如后向散射光电检测器和5个或更多个侧向散射光电检测器，例如后向散射光电检测器和6个或更多个侧向散射光电检测器，例如后向散射光电检测器和7个或更多个侧向散射光电检测器，例如后向散射光电检测器和8个或更多个侧向散射光电检测器，例如后向散射光电检测器和9个或更多个侧向散射光电检测器并且包括后向散射光电检测器和10个或更多个侧向散射光电检测器。在又一些实施例中，光检测系统包括侧向散射光电检测器、前向散射光电检测器和后向散射光电检测器，例如2个或更多个侧向散射光电检测器、前向散射光电检测器和后向散射光电检测器，例如前向散射光电检测器、后向散射光电检测器和3个或更多个侧向散射光电检测器，例如前向散射光电检测器、后向散射光电检测器和4个或更多个侧向散射光电检测器，例如前向散射光电检测器、后向散射光电检测器和5个或更多个侧向散射光电检测器，例如前向散射光电检测器、后向散射光电检测器和6个或更多个侧向散射光电检测器，例如前向散射光电检测器、后向散射光电检测器和7个或更多个侧向散射光电检测器，例如前向散射光电检测器、后向散射光电检测器和8个或更多个侧向散射光电检测器，例如前向散射光电检测器、后向散射光电检测器和9个或更多个侧向散射光电检测器并且包括前向散射光电检测器、后向散射光电检测器和10个或更多个侧向散射光电检测器。

在某些实施例中，光检测系统包括相对于入射光束照射成90°角定位的第一侧向散射光电检测器和相对于入射光束照射以小于90°的角度定位的第二侧向散射光电检测器。在一些情况下，第一侧向散射光电检测器被配置为检测相对于入射光束照射以30°至150°的角度散射的光，例如以60°至120°的角度散射的光并且包括相对于入射光束照射以90°角度散射的光，并且第二侧向散射光电检测器被配置为检测相对于入射光束照射以5至30度的角度散射的光，例如相对于入射光束照射以10至30°的角度散射的光。在某些实施例中，第二侧向散射光电检测器被配置为检测侧向散射光和后向散射光二者。在这些实施例中，后向散射光可以通过反射镜从流动流传播到检测器，例如通过具有孔的反射镜(例如，以通过来自光源的照射光)从流动流传播到检测器。

在一些实施例中，光检测系统包括一个或更多个光学调节部件，一个或更多个光学调节部件被配置为将来自流动流的散射光传送到光电检测器中的一个或更多个。例如，光学调节可以是改变光束的分布、光束的焦点、光束传播的方向或者光学调节可以是准直光束。在某些实施例中，光检测系统包括被定位成将来自流动流的散射光传送到光电检测器的一个或更多个反射镜(例如，分色镜)。在其他实施例中，光检测系统包括被定位成将来自流动流的散射光传送到光电检测器的一个或更多个分束器。在又一实施例中，光检测系统包括被定位成将来自流动流的散射光传送到光电检测器的一个或更多个透镜。在其他实施例中，来自流动流的光被直接传送到光电检测器而不通过光学调节部件。

光散射光电检测器可以是任何合适的光电传感器，在其他类型的光电检测器中，例如有源像素传感器(APS)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件(CCD)、增强电荷耦合器件(ICCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)、图像传感器或N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器、发光二极管、光子计数器、辐射热计、热释电探测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合以及其他类型的光电检测器。在实施例中，光散射光电检测器可以包括1个或更多个光电传感器，例如2个或更多个、例如3个或更多个、例如5个或更多个、例如10个或更多个光电传感器并且包括25个或更多个光电传感器。在一些情况下，光散射光电检测器是光电检测器阵列。术语“光电检测器阵列”以在其常规含义使用，指代被配置为检测光的两个或更多个光电检测器的设置或系列。在实施例中，光电检测器阵列可以包括2个或更多个光电检测器，例如3个或更多个光电检测器，例如4个或更多个光电检测器，例如5个或更多个光电检测器，例如6个或更多个光电检测器，例如7个或更多个光电检测器，例如8个或更多个光电检测器，例如9个或更多个光电检测器，例如10个或更多个光电检测器，例如12个或更多个光电检测器并且包括15个或更多个光电检测器。在某些实施例中，光电检测器阵列包括5个光电检测器。光电检测器可以根据需要设置成任何几何配置，其中感兴趣的设置包括但不限于正方形配置、矩形配置、梯形配置、三角形配置、六边形配置、七边形配置、八边形配置、九边形配置、十边形配置，十二边形配置，圆形配置，椭圆形配置以及不规则形状的配置。光散射光电检测器阵列中的光电检测器可以相对于另一个光电检测器(如在X-Z平面中所参考的)以10°至180°的角度定向，例如以15°至170°、例如20°至160°、例如25°至150°、例如30°至120°并且包括45°至90°的角度定向。

本公开的光散射光电检测器被配置为测量在一个或更多个波长处收集的光，例如在2个或更多个波长处、例如在5个或更多个不同波长处、例如在10个或更多个不同波长处、例如在25个或更多个不同波长处、例如在50个或更多个不同波长处、例如在100个或更多个不同波长处、例如在200个或更多个不同波长处、例如在300个或更多个不同波长处收集的光并且包括测量由流动流中的样本以400个或更多个不同波长发射的光。

在一些实施例中，主题光电检测器被配置为测量在波长范围(例如，200nm至1000nm)内收集的光。在某些实施例中，感兴趣的检测器被配置为收集波长范围内的光的光谱。例如，系统可以包括一个或更多个检测器，一个或更多个检测器被配置为收集200nm至1000nm波长范围中的一个或更多个波长范围内的光的光谱。在又一实施例中，感兴趣的检测器被配置为测量由流动流中的样本以一种或更多种特定波长发射的光。在实施例中，光检测系统被配置为连续或以离散间隔测量光。在某些情况下，感兴趣的检测器被配置为连续测量收集的光。在其他情况下，光检测系统被配置成以离散间隔进行测量，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒测量光并且包括每1000毫秒或以一些其他间隔测量测量光。

在一些实施例中，系统包括一个或更多个输出偏振器。在一些情况下，如上所述，输出偏振器被配置为生成以参考频率振荡的偏振散射光。输出偏振器可以是任何方便的光学偏振器，包括但不限于线性偏振器、吸收偏振器、分束偏振器、双折射偏振器、薄膜偏振器、线栅偏振器、圆偏振器以及被配置用于通过菲涅耳反射进行偏振的光学偏振器。在某些实施例中，输出偏振器包括四分之一波片。光检测系统可以包括光电检测器的一个或更多个输出偏振器，例如2个或更多个、例如3个或更多个、例如4个或更多个输出偏振器并且包括5个或更多个输出偏振器。输出偏振器可以定位在距流动流的变化的距离处，该距离为例如0.01mm或更远，例如0.05mm或更远，例如0.1mm或更远，例如0.5mm或更远，例如1mm或更远，例如2.5mm或更远，例如5mm或更远，例如10mm或更远，例如15mm或更远，例如25mm或更远并且包括50mm或更远。此外，偏振器相对于流动流的角度也可以变化，该角度为相对于偏振器的平面表面为10°至90°，例如15°至85°，例如20°至80°，例如25°至75°并且包括30°至60°，例如90°角度。

在某些实施例中，光检测系统包括两个或更多个散射光电检测器，其中在两个或更多个不同检测器通道中检测散射光，例如在两个或更多个不同检测器通道中检测侧向散射光。在一些情况下，每个检测器通道都光学耦合到偏振器。例如，系统可以包括具有第一侧向散射检测器和第二侧向散射检测器的两个不同的散射检测器通道，第一侧向散射检测器光学耦合到具有第一偏振的第一偏振器，并且第二侧向散射检测器光学耦合到具有第二偏振的第二偏振器。在一些情况下，第一偏振器的偏振和第二偏振器的偏振彼此相差5°或更多，例如相差10°或更多，例如相差15°或更多，例如相差20°或更多，例如相差25°或更多，例如相差30°或更多，例如相差45°或更多，例如相差60°或更多，例如相差75°或更多。在某些实施例中，第一偏振器的偏振垂直于第二偏振器的偏振(即，第一偏振器的偏振与第二偏振器的偏振相差90°)。

在实施例中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时，使处理器根据检测到的散射光生成频率编码数据信号。在一些实施例中，存储器包括用于检测以参考频率振荡的散射光的幅度的指令。在某些实施例中，存储器包括用于检测来自光电检测器的数据信号的幅度的指令，该数据信号具有0.001MHz至约500MHz的振荡频率，例如约0.005MHz至约400MHz、例如约0.01MHz至约300MHz、例如约0.05MHz至约200MHz、例如约0.1MHz至约100MHz、例如约0.5MHz至约90MHz、例如约1MHz至约75MHz、例如约2MHz至约70MHz、例如约3MHz至约65MHz、例如约4MHz至约60MHz的振荡频率并且包括约5MHz至约50MHz的振荡频率。

在一些实施例中，处理器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时，使处理器将生成的频率编码数据信号与参考频率信号同步。在一些实施例中，存储器包括用于当频率编码数据信号的振荡频率与参考数据信号的频率相差10％或更小(例如相差9％或更少，例如8％或更少，例如7％或更少，例如6％或更少，例如5％或更少，例如4％或更少，例如3％或更少，例如2％或更少，例如1％或更少，例如0.5％或更少，例如0.1％或更少，例如0.01％或更少，例如0.001％或更少，例如0.0001％或更少并且包括频率编码数据信号的振荡频率与参考数据信号的频率相差0.00001％或更少的情况)时将频率编码数据信号与参考数据信号同步的指令。在某些实施例中，存储器包括用于当频率编码数据信号的振荡频率与参考数据信号的频率一致匹配时将频率编码数据信号与参考数据信号同步的指令。

在某些实施例中，系统包括用于将参考数据信号与频率编码数据信号同步的锁定放大器。在一些情况下，锁定放大器被配置为将频率编码数据信号与参考频率波形同步。在某些情况下，锁定放大器被配置为将频率编码数据信号与参考频率波形相乘。在某些实施例中，系统包括被配置为执行锁定放大的集成电路设备。在一些实施例中，集成电路是现场可编程门阵列(FPGA)。在其他情况下，集成电路是专用集成电路(ASIC)。在又一些实施例中，集成电路是复杂可编程逻辑器件(CPLD)。在某些实施例中，系统被配置为将频率编码数据信号与参考频率数字同步。例如，可以在处理器上对频率编码数据信号进行处理，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，该存储器具有存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时，使处理器接收来自光电检测器的频率编码数据信号并将参考信号与频率编码数据信号同步。在某些情况下，参考频率信号存储在存储器上。在其他情况下，主题系统的处理器被配置为从与光调制器部件通信的控制器接收参考频率信号。

在一些实施例中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时，使处理器根据同步的频率编码数据信号生成数据信号分布。在一些情况下，存储器包括用于将低通滤波器应用于同步的频率编码数据信号以生成数据信号分布的指令。在一些实施例中，锁定放大器被配置为将低通滤波器应用于同步的频率编码数据信号。在其他实施例中，存储器包括用于将低通滤波器数字地应用于同步的频率编码数据信号的指令。在某些情况下，存储器包括用于将低通滤波器应用于同步的频率编码数据信号以生成高斯信号分布的指令。在其他情况下，存储器包括用于将低通滤波器应用于同步的频率编码数据信号以生成超高斯信号轮廓的指令。

在某些实施例中，系统另外包括被配置为在流动流中传播样本的流动池。可以使用将流体样本传播到样本询问区域的任何方便的流动池，其中在一些实施例中，流动池包括限定纵向轴线的近端圆柱部分和远端截头圆锥部分，该远端截头圆锥部分终止于具有横向于纵向轴线的孔口的平坦表面。近端圆柱部分的长度(如沿纵向轴线测量的长度)可以为1mm至15mm，例如1.5mm至12.5mm，例如2mm至10mm，例如3mm至9mm并且包括4mm至8mm。远端截头圆锥部分的长度(如沿纵向轴线测量的长度)也可以为1mm至10mm，例如2mm至9mm，例如3mm至8mm并且包括4mm7mm。在一些实施例中，流动池喷嘴室的直径可以为1mm至10mm，例如2mm至9mm，例如3mm至8mm并且包括4mm至7mm。

在某些情况下，流动池不包括圆柱部分并且整个流动池内部室是截头圆锥形的。在这些实施例中，截头圆锥形内部室的长度(沿横向于喷嘴孔口的纵向轴线测量)可以为1mm至15mm，例如1.5mm至12.5mm，例如2mm至10mm，例如3mm至9mm并且包括4mm至8mm。截头圆锥形内部室的近端部分的直径可以为1mm至10mm，例如2mm至9mm，例如3mm至8mm并且包括4mm至7mm。

在一些实施例中，样本流动流源于流动池远端处的孔口。根据流动流的所需特性，流动池孔口可以是任何合适的形状，其中感兴趣的截面形状包括但不限于：直线截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等；曲线截面形状，例如圆形、椭圆形；以及不规则形状，例如耦合到平面顶部部分的抛物线底部部分。在某些实施例中，感兴趣的流动池具有圆形孔口。在一些实施例中，喷嘴孔口的尺寸可以变化，该尺寸为1μm至20000μm，例如2μm至17500μm，例如5μm至15000μm，例如10μm至12500μm，例如15μm至10000μm，例如25μm至7500μm，例如50μm至5000μm，例如75μm至1000μm，例如100μm至750μm，并且包括150μm至500μm。在某些实施例中，喷嘴孔口为100μm。

在一些实施例中，流动池包括被配置为向流动池提供样本的样本注入口。在实施例中，样本注入系统被配置为向流动池内部室提供合适的样本流。根据流动流的所需特性，通过样本注入口将样本传送到流动池室的速率可以是1μL/min或更高，例如2μL/min或更高，例如3μL/min或更高，例如5μL/min或更高，例如10μL/min或更高，例如15μL/min或更高，例如25μL/min或更高，例如50μL/min或更高并且包括100μL/min或更高，其中在某些情况下，通过样本注入口将样本传送到流动池室的速率为1μL/sec或更高，例如2μL/sec或更高，例如3μL/sec或更高，例如5μL/sec或更高，例如10μL/sec或更高，例如15μL/sec或更高，例如25μL/sec或更高，例如50μL/sec或更高并且包括100μL/sec或更高。

样本注入口可以是位于内部室的壁中的孔口或者可以是位于内部室近端处的导管。在样本注入口是位于内部室的壁中的孔口的情况下，样本注入口孔口可以是任何合适的形状，其中感兴趣的截面形状包括但不限于：直线截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等；曲线截面形状，例如圆形、椭圆形等；以及不规则形状，例如耦合到平面顶部部分的抛物线底部部分。在某些实施例中，样本注入口具有圆形孔口。在某些情况下，样本注入端口孔口的尺寸可以根据形状而变化，其开口为0.1mm至5.0mm，例如0.2mm至3.0mm，例如0.5mm至2.5mm，例如0.75mm至2.25mm，例如1mm至2mm并且包括1.25mm至1.75mm，例如1.5mm。

在某些情况下，样本注入口是位于流动池内部室近端处的导管。例如，样本注入口可以是被定位成使样本注入口的孔口与流动池的孔口对齐的导管。在样本注入口是被定位成与流动池孔口对齐的导管的情况下，样本注入管的截面形状可以是任何合适的形状，其中感兴趣的截面形状包括但不限于：直线截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等；曲线截面形状，例如圆形、椭圆形；以及不规则形状，例如耦合到平面顶部部分的抛物线底部部分。在某些情况下，导管的孔口可以根据形状而变化，其开口为0.1mm至5.0mm，例如0.2mm至3.0mm，例如0.5mm至2.5mm，例如0.75mm至2.25mm，例如1mm至2mm并且包括1.25mm至1.75mm，例如1.5mm。样本注入口的尖端的形状可以与样本注入管的截面形状相同或者不同。例如，样本注入口的孔口可以包括斜角尖端(beveled tip)，其斜角为1°至10°，例如2°至9°，例如3°至8°，例如4°至7°并且包括5°的斜角。

在一些实施例中，流动池还包括鞘液注入口，该鞘液注入口被配置为向流动池提供鞘液。在实施例中，鞘液注入系统被配置为向流动池内部室提供鞘液流，例如与样本结合以产生围绕样本流动流的分层鞘液流动流。根据流动流的所需特性，鞘液传送到流动池室的速率可以是25μL/sec或更高，例如50μL/sec或更高，例如75μL/sec或更高，例如100μL/sec或更高，例如250μL/sec或更高，例如500μL/sec或更高，例如750μL/sec或更高，例如1000μL/sec或更高并且包括2500μL/sec或更高。

在一些实施例中，鞘液注入口是位于内部室的壁中的孔口。鞘液注入口孔口可以是任何合适的形状，其中感兴趣的截面形状包括但不限于：直线截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等；曲线截面形状，例如圆形、椭圆形；以及不规则形状，例如耦合到平面顶部部分的抛物线底部部分。在某些情况下，样本注入口孔口的尺寸可以根据形状而变化，其开口为0.1mm至5.0mm，例如0.2mm至3.0mm，例如0.5mm至2.5mm，例如0.75mm至2.25mm，例如1mm至2mm并且包括1.25mm至1.75mm，例如1.5mm。

在一些实施例中，系统还包括与流动池流体连通以使流动流传播通过流动池的泵。可以使用任何方便的流体泵协议来控制流动流通过流动池的流动。在某些情况下，系统包括蠕动泵，例如具有脉冲阻尼器的蠕动泵。主题系统中的泵被配置成以适于检测来自流动流中的样本的光的速率传送流体通过流动池。在某些情况下，流动池中的样本流的速率为1uL/min(微升/分钟)或更高，例如2uL/min或更高，例如3uL/min或更高，例如5uL/min或更高，例如10uL/min或更高，例如25uL/min或更高，例如50uL/min或更高，例如75uL/min或更高，例如100uL/min或更高，例如250uL/min或更高，例如500uL/min或更高，例如750uL/min或更高并且包括1000uL/min或更高的速率。例如，系统可以包括被配置为使样本以一定速率流过流动池的泵，该速率为1μL/min至500μL/min，例如1uL/min至250uL/min，例如1uL/min至100uL/min，例如2uL/min至90uL/min，例如3uL/min至80uL/min，例如4uL/min至70uL/min，例如5uL/min至60uL/min并且包括10uL/min至50uL/min。在某些实施例中，流动流的流速为5μL/min至6μL/min。

在某些实施例中，主题系统是流式细胞仪系统，该流式细胞仪系统使用上述光检测系统来检测由流动流中的样本发射的光。在某些实施例中，主题系统是流式细胞仪系统。合适的流式细胞仪系统可以包括但不限于以下中描述的那些流式细胞仪系统：Ormerod(ed.)，Flow Cytometry：A Practical Approach，Oxford Univ.Press(1997)；Jaroszeski等人(eds.)，Flow Cytometry Protocols，Methods in Molecular Biology第91期，HumanaPress(1997)；Practical Flow Cytometry，第3版，Wiley-Liss(1995)；Virgo等人(2012)Ann Clin Biochem.Jan；49(pt 1)：17-28；Linden等人，Semin Throm Hemost.2004年10月；30(5)：502-11；Alison等人.J Pathol，2010年12月；222(4)：335-344；以及Herbig等人(2007)Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.24(3)：203-255，其公开内容通过引用并入本文。在某些情况下，感兴趣的流式细胞仪系统包括BD生物科学(BD Biosciences)FACSCanto^TM II流式细胞仪、BDAccuri^TM流式细胞仪、BD生物科学FACSCelesta^TM流式细胞仪、BD生物科学FACSLyric^TM流式细胞仪、BD生物科学FACSVerse^TM流式细胞仪、BD生物科学FACSymphony^TM流式细胞仪、BD生物科学LSRFortessa^TM流式细胞仪、BD生物科学LSRFortess^TMX-20流式细胞仪和BD生物科学FACSCalibur^TM细胞分选仪、BD生物科学FACSCount^TM细胞分选仪、BD生物科学FACSLyric^TM细胞分选仪和BD生物科学Via^TM细胞分选仪、BD生物科学Influx^TM细胞分选仪、BD生物科学Jazz^TM细胞分选仪、BD生物科学Aria^TM细胞分选仪和BD生物科学FACSMelody^TM细胞分选仪等。

在一些实施例中，主题粒子分选系统是流式细胞仪系统，例如在美国专利号10,006,852、9,952,076、9,933,341、9,784,661、9,726,527、9,453,789、9,200,334、9,097,640、9,095,494、9,092,034、8,975,595、8,753,573、8,233,146、8,140,300、7,544,326、7,201,875、7,129,505、6,821,740、6,813,017、6,809,804、6,372,506、5,700,692、5,643,796、5,627,040、5,620,842、5,602,039中所描述的呢些流式细胞仪，其公开内容通过引用全部并入本文。

在某些情况下，主题系统是流式细胞仪系统，该流式细胞仪系统被配置用于通过使用射频标记发射(adiofrequency tagged emission，FIRE)的荧光成像对流动流中的粒子进行成像，例如Diebold等人Nature Photonics第7(10)卷；806-810(2013)中描述的以及美国专利号9,423,353、9,784,661、9,983,132、10,006,852、10,078,045、10,036,699、10,222,316、10,288,546、10,324,019、10,408,758、10,451,538、10,620,111以及美国专利公布号2017/0133857、2017/0328826、2017/0350803、2018/0275042、2019/0376895和2019/0376894中所描述的，其公开内容通过引用并入本文。

在某些实施例中，主题系统被配置为分选样本的粒子中的一种或更多种粒子(例如，细胞)。术语“分选”在本文中以其常规含义使用，是指分离样本的组分(例如，细胞、非细胞粒子，例如生物大分子)，并且在一些情况下将分离的组分递送至一个或更多个样本收集容器。例如，主题系统可以被配置用于对具有2种或更多种组分的样本进行分选，例如对具有3种或更多种组分，例如4种或更多种组分，例如5种或更多种组分，例如10种或更多种组分，例如15种或更多种组分的样本进行分选并且包括对具有25种或更多种组分的样本进行分选。样本组分中的一种或更多种样本组分可以从样本中分离并被递送至样本收集容器，例如2种或更多种样本组分，例如3种或更多种样本组分，例如4种或更多种样本组分，例如5种或更多种样本组分，例如10种或更多种样本组分，并且包括：15种或更多种样本组分可以从样本中分离并被递送至样本收集容器。

在一些实施例中，感兴趣的粒子分选系统被配置为对粒子进行分选，例如美国专利号3,960,449、4,347,935、4,667,830、5,245,318、5,464,581、5,483,469、5,602,039、5,643,796、5,700,692、6,372,506和6,809,804中所描述的，其公开内容通过引用并入本文。在一些实施例中，粒子分选系统被配置为利用所附的粒子分选模块对粒子进行分选，例如在美国专利号9,551,643和10,324,019、美国专利公布号2017/0299493和国际专利公布号WO/2017/040151中所描述的那些粒子分选模块，其公开内容通过引用并入本文。在某些实施例中，使用具有多个分选决策单元的分选决策模块对样本的粒子(例如，细胞)进行分选，例如在2019年12月23日提交的美国专利申请号16/725,756中所描述的那些分选决策模块，其公开内容通过引用并入本文。

在一些实施例中，系统是粒子分析仪，其中无论是否将粒子物理分选到收集器中，401(图4A)都能够用于分析和表征粒子。图4A示出用于基于计算的样本分析和粒子表征的粒子分析系统的功能框图。在一些实施例中，粒子分析系统401是流系统。例如，图4所示的粒子分析系统401可以被配置为全部或部分地执行本文描述的方法。粒子分析系统401包括液流系统(fluidics system)402。射流系统402可以包括样本管405或与所述样本管405耦合以及样本管内的移动流体柱，在该样本管中，样本的粒子403(例如，细胞)沿着公共样本路径409移动。

粒子分析系统401包括检测系统404，检测系统404被配置为当每个粒子沿公共样本路径通过一个或更多个检测站时收集来自每个粒子的信号。检测站408通常是指公共样本路径的监测区域407。在一些实施例中，检测可以包括当粒子403穿过监测区域407时检测光或粒子403的一种或更多种其他特性。在图4A中，示出了具有一个监测区域407的一个检测站408。粒子分析系统401的一些实施方式可以包括多个检测站。此外，一些检测站可以监测多于一个区域。

为每个信号分配了信号值，从而对每个粒子形成数据点。如上所述，该数据可以称为事件数据。数据点可以是包括针对粒子测量的各个特性的值的多维数据点。检测系统404被配置为在第一时间间隔内收集一系列这样的数据点。

粒子分析系统401还可以包括控制系统306。控制系统406可以包括一个或更多个处理器、幅度控制电路和/或频率控制电路。所示的控制系统可以在操作上与液流系统402相关联。控制系统可以被配置为基于泊松分布和由检测系统404在第一时间间隔期间收集的数据点的数量为第一时间间隔的至少一部分生成计算的信号频率。控制系统406能够另外被配置为基于在第一时间间隔的一部分中的数据点的数量生成实验信号频率。控制系统406另外能够将实验信号频率与计算的信号频率或预定信号频率进行比较。

图4B示出了根据本发明的说明性实施例的用于流式细胞术的系统400。系统400包括流式细胞仪410、控制器/处理器490和存储器495。流式细胞仪410包括一个或更多个激发激光器415a-415c、聚焦透镜420、流动室425、前向散射检测器430、侧向散射检测器435、荧光收集透镜440、一个或更多个分束器445a-445g、一个或更多个带通滤波器450a-450e、一个或更多个长通(“LP”)滤波器455a-455b和一个或更多个荧光检测器460a-460f。

激发激光器115a-c发射激光束形式的光。在图4B的示例系统中，从激发激光器415a-415c发射的激光束的波长分别为488nm、633nm和325nm。激光束首先被引导通过分束器445a和445b中的一个或更多个。分束器445a透射488nm的光并反射633nm的光。分束器445b透射UV光(波长为10nm至400nm的光)并反射488nm和633nm的光。

然后将激光束引导至聚焦透镜420，聚焦透镜420将光束聚焦到流动室425内流动流的样本粒子所位于的部分上。流动室是液流系统的一部分，该液流系统将流中的粒子引导(通常一次引导一个粒子)到聚焦的激光束以进行询问。流动室可以包括台式细胞仪中的流动池或空气流式(stream-in-air)细胞仪中的喷嘴尖端。

来自激光束的光通过在根据所述粒子特征(例如粒子尺寸、内部结构，以及附接至粒子或自然存在于粒子上或粒子内的一种或更多种荧光分子的存在)以各种不同波长重新发射的情况下衍射、折射、反射、散射和吸收与样本中的粒子相互作用。荧光发射以及衍射光、折射光、反射光和散射光可以通过分束器445a-445g、带通滤波器450a-450e、长通滤波器455a-455b和荧光收集透镜440中的一个或更多个而路由至前向散射检测器430、侧向散射检测器435中的一个或更多个以及一个或更多个荧光检测器460a-460f。

荧光收集透镜440收集从粒子-激光束相互作用而发射的光并将该光朝向一个或更多个分束器和滤波器路由。带通滤波器例如带通滤波器450a-450e允许窄范围的波长通过滤波器。例如，带通滤波器450a是510/20滤波器。第一个数字代表光谱带的中心。第二个数字提供了光谱带的范围。因此，510/20滤波器在所述光谱带中心的每一侧延伸10nm，或从500nm至520nm。短通滤波器透射波长等于或短于特定波长的光。长通滤波器例如长通滤波器455a-455b透射波长等于或长于特定光波长的光。例如，作为670nm长通滤波器的长通滤波器455a透射等于或长于670nm的光。通常选择滤波器以优化检测器对特别的荧光染料的特异性。滤波器能够配置为使得透射到检测器的光的光谱带接近荧光染料的发射峰。

分束器将不同波长的光沿不同方向引导。分束器能够通过滤波器特性(例如短通和长通)来表征。例如，分束器445g是620SP分束器，这意味着所述分束器445g透射波长为620nm或更短的光并且沿不同方向反射波长大于620nm的光。在一个实施例中，分束器445a-445g能够包括光学镜，例如分色镜。

前向散射检测器430被定位成稍微偏离通过流动池的直接光束的轴线并且被配置为检测衍射光，即主要沿前向方向通过或围绕粒子传播的激发光。前向散射检测器检测到的光的强度取决于所述粒子的整体尺寸。前向散射检测器可以包括光电二极管。侧向散射检测器435被配置为检测来自粒子的表面和内部结构的折射和反射光，并且倾向于随着粒子结构复杂性的增加而增加。一个或更多个荧光检测器460a-460f能够检测来自与所述粒子相关联的荧光分子的荧光发射。侧向散射检测器435和荧光检测器可以包括光电倍增管。在前向散射检测器430、侧向散射检测器435和荧光电检测器处检测到的信号可以通过检测器转换成电子信号(电压)。该数据可以提供有关样本的信息。

本领域技术人员将认识到，根据本发明实施例的流式细胞仪不限于图4B描绘的流式细胞仪，但能够包括本领域已知的任何流式细胞仪。例如，流式细胞仪可以具有任何数量的具有各种波长和各种不同的配置的激光器、分束器、滤波器和检测器。

在操作中，细胞仪操作由控制器/处理器490控制，并且来自检测器的测量数据能够存储在存储器495中并由控制器/处理器490处理。尽管未明确示出，但控制器/处理器190耦合到检测器以从检测器接收输出信号，并且控制器/处理器190还可以耦合到流式细胞仪400的电气和机电部件以控制激光器、流体流动参数等。还可以在系统中提供输入/输出(I/O)能力497。存储器495、控制器/处理器490和I/O 497可以完全作为流式细胞仪410的集成部分提供。在这样的实施例中，显示器也可以形成用于向细胞仪400的使用者呈现实验数据的I/O能力497的一部分。替选地，存储器495和控制器/处理器490和I/O能力中的一些或全部可以是一个或更多个外部设备例如通用计算机的一部分。在一些实施例中，存储器495和控制器/处理器490中的一些或全部能够与细胞仪410进行无线或有线通信。控制器/处理器490连同存储器495和I/O 497能够被配置为执行与流式细胞仪实验的准备和分析相关的各种功能。

图4B所示的系统包括六个不同的检测器，这些检测器检测在如由从流动池425到每个检测器的光束路径中的滤波器和/或分束器的配置所定义的六个不同波长带(在本文中可以将其称为用于给定检测器的“滤波窗”)中的荧光。用于流式细胞仪实验的不同荧光分子将发射在它们自己的特征波长带中的光。可以选择用于实验的特定荧光标签和与荧光标签相关联的荧光发射带，以通常与检测器的滤波窗一致。然而，随着提供更多检测器和使用更多标签，滤波窗和荧光发射光谱之间的完美对应是不可能的。一般情况下，虽然特定荧光分子的发射光谱的峰确实可能位于一个特定检测器的滤波窗内，但该标签的一些发射光谱也将与一个或更多个其他检测器的滤波窗重叠。这可以称为溢出。I/O 497能够被配置为接收关于流式细胞仪实验的数据，该流式细胞仪实验具有一组荧光标签和具有多个标记的多个细胞群，每个细胞群具有多个标记的子集。I/O 497还能够被配置为接收将一个或更多个标记分配给一个或跟多个细胞群的生物学数据、标记密度数据、发射光谱数据、将标签分配给一个或更多个标记的数据，以及细胞仪配置数据。流式细胞仪实验数据，例如标签光谱特征和流式细胞仪配置数据也能够存储在存储器495中。控制器/处理器490能够被配置为评估将标签分配给标记的一个或更多个分配。

图5示出用于分析和显示生物事件的粒子分析器控制系统(例如分析控制器500)的一个示例的功能框图。分析控制器500能够被配置为实现用于控制生物事件的图形显示的各种过程。

粒子分析器502能够被配置为获取生物事件数据。例如，流式细胞仪能够生成流式细胞仪事件数据。粒子分析器502能够被配置为向分析控制器500提供生物事件数据。能够在粒子分析器502和分析控制器500之间包括数据通信通道。生物事件数据能够通过数据通信通道提供给分析控制器500。

分析控制器500能够被配置为从粒子分析器502接收生物事件数据。从粒子分析器502接收的生物事件数据能够包括流式细胞仪事件数据。分析控制器500能够被配置为向显示设备506提供包括生物事件数据的第一图表的图形显示。分析控制器500能够另外被配置为将感兴趣区域呈现为由显示设备506示出的生物事件数据群周围的门(gate)，例如，覆盖在第一图表上。在一些实施例中，门能够是在单个参数直方图或二元图上绘制的一个或更多个感兴趣图形区域的逻辑组合。在一些实施例中，显示器可以用于显示粒子参数或饱和的检测器数据。

分析控制器500能够另外被配置为与门外的生物事件数据中的其他事件不同地在显示设备506上显示门内的生物事件数据。例如，分析控制器500能够被配置为使包含在门内的生物事件数据的颜色与门外的生物事件数据的颜色呈现不同。显示设备506能够被实现为监视器、平板电脑、智能手机或被配置为呈现图形界面的其他电子设备。

分析控制器500能够被配置为接收来自第一输入设备的识别门的门选择信号。例如，第一输入设备可以被实现为鼠标510。鼠标510能够向分析控制器500发起门选择信号，从而识别要显示在显示设备506上或要通过显示设备506操纵的门(例如，当光标位于所需的门处时通过点击期望的门)。在一些实现方式中，第一设备能够实现为键盘508或用于向分析控制器500提供输入信号的其他装置，例如触摸屏、指示笔、光学检测器或语音识别系统。一些输入设备能够包括多种输入功能。在这样的实现方式中，输入功能中的每个都能够被认为是输入设备。例如，如图5所示，鼠标510能够包括鼠标右键和鼠标左键，鼠标右键和鼠标左键中的每一个都能够生成触发事件。

触发事件能够使分析控制器500改变显示数据的方式(数据的哪些部分被实际显示在显示设备506上)，和/或为另外的处理(例如选择感兴趣的群)提供输入以用于粒子分选。

在一些实施例中，分析控制器500能够被配置为检测何时由鼠标510发起门选择。分析控制器500能够另外被配置为自动修改图表可视化以促进门控过程。修改能够基于由分析控制器500接收的生物事件数据的特定分布。

分析控制器500能够连接到存储设备504。存储设备504能够被配置为接收和存储来自分析控制器500的生物事件数据。存储设备504还能够被配置为接收和存储来自分析控制器500的流式细胞仪事件数据。存储设备504能够另外被配置为允许由分析控制器500检索生物事件数据，例如流式细胞仪事件数据。

显示设备506能够被配置为接收来自分析控制器500的显示数据。显示数据能够包括生物事件数据的图表并选通图表的轮廓部分。显示设备506能够另外被配置为改变根据从分析控制器500接收的输入连同来自粒子分析器502、存储设备504、键盘508和/或鼠标510的输入而呈现的信息。

在一些实现方式中，分析控制器500能够生成用户界面从而接收示例事件以用于分选。例如，用户界面能够包括用于接收示例事件或示例图像的控制件。示例事件或图像或示例门能够在收集样本的事件数据之前提供，或者基于样本的一部分的最初的一组事件提供。

计算机控制系统

本公开的各方面还包括用于实践主题方法的计算机控制系统，其中该系统还包括用于实践本文所述方法的系统的完全自动化或部分自动化的一台或更多台计算机。在一些实施例中，系统包括具有计算机可读存储介质的计算机，计算机可读存储介质上存储有计算机程序，其中所述计算机程序在加载到计算机上时包括用于利用以参考频率调制的调频激光束照射流动流中的粒子的指令，用于利用光电检测器检测来自粒子的散射光的指令，用于根据检测到的散射光生成频率编码数据信号的指令以及用于将频率编码数据信号与参考频率同步的指令。在某些实施例中，计算机可读存储介质包括用于基于同步的频率编码数据信号确定粒子的一个或更多个参数的指令。

在某些情况下，系统包括具有计算机可读存储介质的计算机，其中计算机可读存储介质上存储有计算机程序，其中计算机程序在加载到计算机上时还包括用于照射光调制器(例如电光调制器、压电光调制器或声光调制器设备)以生成调频激光束的指令。在一些实施例中，计算机程序包括用于将电流或电场施加到电光调制器以生成调频激光束的指令。在某些实施例中，计算机程序包括用于将电流或电场施加到电光调制器以生成具有约0.001MHz至约500MHz振荡频率的调频光束的指令，该振荡频率为例如约0.005MHz至约400MHz，例如约0.01MHz至约300MHz，例如约0.05MHz至约200MHz，例如约0.1MHz至约100MHz，例如约0.5MHz至约90MHz，例如约1MHz至约75MHz，例如约2MHz至约70MHz，例如约3MHz至约65MHz，例如约4MHz至约60MHz并且包括约5MHz至约50MHz。

在一些情况下，计算机程序包括用于为光调制器生成参考频率信号的指令，例如其中参考频率信号具有约0.001MHz至约500MHz的振荡频率，例如约0.005MHz至约400MHz、例如约0.01MHz至约300MHz、例如约0.05MHz至约200MHz、例如约0.1MHz至约100MHz、例如约0.5MHz至约90MHz、例如约1MHz至约75MHz、例如约2MHz至约70MHz、例如约3MHz至约65MHz、例如约4MHz至约60MHz的振荡频率并且包括约5MHz至约50MHz的振荡频率。

在一些实施例中，系统包括具有计算机可读存储介质的计算机，计算机可读存储介质上存储有计算机程序，其中计算机程序在加载到计算机上时另外包括用于将频率编码数据信号与参考频率同步的指令。在一些实施例中，计算机程序包括用于通过将频率编码数据信号与参考频率波形相乘来使频率编码数据信号与参考频率同步的指令。在一些情况下，计算机程序包括用于使用锁定放大器将频率编码数据信号与参考频率同步的指令。在其他实施例中，计算机程序包括用于使频率编码数据信号数字同步的指令，例如用于利用具有用于将频率编码数据信号与参考频率波形相乘的程序设计的FPGA使频率编码数据信号数字同步的指令。在一些实施例中，计算机程序包括用于将低通滤波器应用于同步的频率编码数据信号以生成数据信号分布的指令。在某些情况下，通过应用低通滤波器生成的数据信号分布具有高斯信号分布。在其他情况下，通过应用低通滤波器生成的数据信号分布具有超高斯信号分布。

在实施例中，系统包括输入模块、处理模块和输出模块。主题系统可以包括硬件部件和软件部件二者，其中硬件部件可以采用一个或更多个平台的形式，例如服务器的形式，使得功能元件，即系统的执行特定的系统任务(例如管理信息的输入和输出、处理信息等)的那些元件，可以通过在代表系统的一个或更多个计算机平台上和跨一个或更多个计算机平台执行软件应用来实现。

系统可以包括显示器和操作员输入设备。操作员输入设备例如可以是键盘、鼠标等。处理模块包括处理器，该处理器可以访问存储器，该存储器上存储有用于执行主题方法的步骤的指令。处理模块可以包括操作系统、图形用户界面(GUI)控制器、系统存储器、存储器存储设备和输入-输出控制器、高速缓冲存储器、数据备份单元和许多其他设备。处理器可以是市场上可获得的处理器或者它可以是现有或将变得可用的其他处理器之一。处理器以众所周知的方式执行操作系统和操作系统与固件和硬件的接口，并促进处理器协调和执行可以用本领域已知的各种编程语言(例如Java、Perl、C++、其他高级或低级语言，以及它们的组合)编写的各种计算机程序的功能。操作系统(通常与处理器合作)协调和执行计算机其他部件的功能。操作系统还提供均按照已知技术进行的调度、输入-输出控制、文件和数据管理、存储器管理以及通信控制和相关服务。处理器可以是任何合适的模拟或数字系统。在一些实施例中，处理器包括模拟电子设备，该模拟电子设备允许用户基于第一光信号和第二光信号手动地将光源与流动流对齐。在一些实施例中，处理器包括提供反馈控制例如负反馈控制的模拟电子设备。

系统存储器可以是多种已知的或未来的存储器存储设备中的任何一种。示例包括任何常用的随机存取存储器(RAM)、磁介质(例如常驻(resident)硬盘或磁带)、光学介质(例如读写致密盘)、闪存设备或其他存储器器存储设备。存储器存储设备可以是多种已知或未来设备中的任何一种，包括致密盘驱动器、磁带驱动器、可移除硬盘驱动器或软盘驱动器。这种类型的存储器存储设备通常从程序存储介质(未示出)读取和/或向程序存储介质写入，例如分别为致密盘、磁带、可移除硬盘或软盘。这些程序存储介质中的任何一个或其他现在使用的或以后可能开发的程序存储介质，都可以被认为是计算机程序产品。如将理解的，这些程序存储介质通常存储计算机软件程序和/或数据。计算机软件程序(也称为计算机控制逻辑)通常存储在系统存储器和/或与存储器存储设备结合使用的程序存储设备中。

在一些实施例中，描述了一种计算机程序产品，该计算机程序产品包括具有存储在其中的控制逻辑(计算机软件程序，包括程序代码)的计算机可用介质。控制逻辑在由计算机的处理器执行时，使处理器执行本文描述的功能。在其他实施例中，一些功能主要以使用例如硬件状态机的硬件实现。实现硬件状态机以执行本文所描述的功能对于相关领域的技术人员来说将是显而易见的。

存储器可以是处理器能够在其中存储和检索数据的任何合适的设备，例如磁性、光学或固态存储设备(包括磁盘或光盘或磁带或RAM，或任何其他合适的设备，无论是固定的还是便携式的)。处理器可以包括通用数字微处理器，该通用微处理器从携带必要程序代码的计算机可读介质适当地编程。编程能够通过通信信道远程提供给处理器，或者预先保存在计算机程序产品中，例如存储器或使用与存储器连接的那些设备的任一个的一些其他便携式或固定计算机可读存储介质。例如，磁盘或光盘可以携载程序，并且能够被磁盘写入器/读取器读取。本发明的系统还包括编程，例如，用于实践上述方法的计算机程序产品、算法形式的编程。根据本发明的编程能够被记录在计算机可读介质上，例如被记录在任何能够被计算机直接读取和访问的介质上。此类介质包括但不限于：磁存储介质，例如软盘、硬盘存储介质和磁带；光存储介质，如CD-ROM；电存储介质，例如RAM和ROM；便携式闪存驱动器；以及这些类别的混合体，例如磁/光存储介质。

处理器还可以访问通信信道以与远程位置处的用户进行通信。通过远程位置是指用户不直接与系统接触，并将输入信息从外部设备中继到输入管理器，外部设备例如连接到广域网(“WAN”)、电话网络、卫星网络的计算机或任何其他合适的通信信道，包括移动电话(即智能手机)。

在一些实施例中，根据本公开的系统可以被配置为包括通信接口。在一些实施例中，通信接口包括用于与网络和/或另一设备进行通信的接收器和/或发射器。通信接口能够被配置用于有线或无线通信，包括但不限于射频(RF)通信例如射频识别(RFID)、Zigbee通信协议、WiFi、红外、无线通用串行总线(USB)、超宽带(UWB)、

通信协议和蜂窝通信，例如码分多址(CDMA)或全球移动通信系统(GSM)。

在一个实施例中，通信接口被配置为包括一个或更多个通信端口，例如物理端口或接口(例如USB端口、RS-232端口、或任何其他合适的电连接端口)，以允许主题系统和其他外部设备(例如配置用于类似的补充数据通信的计算机终端(例如，在医生办公室或医院环境中))之间进行数据通信。

在一个实施例中，通信接口被配置用于红外通信、蓝牙通信或任何其他合适的无线通信协议，从而使主题系统能够与其他设备(例如计算机终端和/或网络、支持通信的移动电话、个人数字助手，或用户可以结合使用的任何其他通信设备)进行通信。

在一个实施例中，通信接口被配置为通过蜂窝电话网络、短消息服务(SMS)、与连接到互联网的局域网(LAN)上的个人计算机(PC)的无线连接，或通过WiFi热点连接到互联网的WiFi连接，为使用互联网协议(IP)的数据传输提供连接。

在一个实施例中，主题系统被配置为通过通信接口与服务器设备进行无线通信，例如，使用诸如802.11或

RF协议、或IrDA红外协议的通用标准通过通信接口与服务器设备进行无线通信。服务器设备可以是其他便携式设备，例如智能手机、个人数字助手(PDA)或笔记本电脑；或大型设备，例如台式电脑、电器等。在一些实施例中，服务器设备具有显示器，例如液晶显示器(LCD)，以及输入设备，例如按钮、键盘、鼠标或触摸屏。

在一些实施例中，通信接口被配置为使用如上所述的通信协议和/或机制中的一个或更多个与网络或服务器设备自动或半自动地传送存储在主题系统中的数据，例如，存储在可选的数据存储单元中的数据。

输出控制器可以包括用于向用户(无论是人类还是机器，无论是本地的还是远程的)呈现信息的各种已知显示设备中的任何显示设备的控制器。如果显示设备中的一个提供视觉信息，则该信息通常可以在逻辑上和/或物理上被组织为图片元素的阵列。图形用户界面(GUI)控制器可以包括用于在系统和用户之间提供图形输入和输出界面以及用于处理用户输入的多种已知或未来软件程序中的任何软件程序。计算机的功能元件可以通过系统总线彼此进行通信。这些通信中的一些可以在替代实施例中使用网络或其他类型的远程通信来完成。根据已知技术，输出管理器还可以将由处理模块生成的信息例如通过互联网、电话或卫星网络提供给位于远程位置的用户。可以根据多种已知技术来实现输出管理器对数据的呈现。作为一些示例，数据可以包括SQL、HTML或XML文档、电子邮件或其他文件，或其他形式的数据。数据可以包括互联网URL地址，使得用户可以从远程源检索额外的SQL、HTML、XML或其他文档或数据。主题系统中存在的一个或更多个平台可以是任何类型的已知计算机平台或将在未来开发的类型，尽管它们通常属于通常被称为服务器的一类计算机。然而，它们也可以是大型计算机、工作站或其他计算机类型。它们可以通过任何已知或未来类型的线缆或其他通信系统(包括无线系统)连接，无论是联网的还是以其他方式。它们可以在同一位置，也可以在物理上分开。可以在任何计算机平台上采用各种操作系统，这可能取决于所选择的计算机平台的类型和/或制作。适用的操作系统包括Windows

WindowsXP、Windows 7、Windows 8、iOS、Oracle Solaris、Linux、OS/400、Compaq Tru64 Unix、SGIIRIX、Siemens Reliant Unix、Ubuntu、Zorin OS等。

图6描绘了根据某些实施例的示例计算设备600的总体架构。图6中描绘的计算设备600的总体架构包括计算机硬件和软件部件的设置。计算设备600可以包括比图6中所示的元件更多(或更少)的元件。然而，为了提供有利的公开，没有必要示出所有这些通常常规的元件。如图所示，计算设备600包括处理单元610、网络接口620、计算机可读介质驱动器630、输入/输出设备接口640、显示器650和输入设备660，所有这些都可以通过通信总线彼此进行通信。网络接口620可以提供与一个或更多个网络或计算系统的连接性。处理单元610因此可以通过网络接收来自其他计算系统或服务的信息和指令。处理单元610还可以与存储器670进行往来通信，并且另外通过输入/输出设备接口640为可选显示器650提供输出信息。输入/输出设备接口840也可以接受来自可选输入设备660(例如键盘、鼠标、数字笔、麦克风、触摸屏、手势识别系统、语音识别系统、游戏手柄、加速度计、陀螺仪或其他输入设备)的输入。

存储器670可以包含处理单元610执行以实现一个或更多个实施例的计算机程序指令(在一些实施例中被分组为模块或部件)。存储器670通常包括RAM、ROM和/或其他持久性、辅助性或非暂时性计算机可读介质。存储器670可以存储操作系统672，操作系统672提供计算机程序指令用于供处理单元610在计算设备600的总体管理和操作中使用。存储器670可以还包括用于实现本公开的各个方面的计算机程序指令和其他信息。

非暂时性计算机可读存储介质

本公开的方面还包括具有用于实践主题方法的指令的非暂时性计算机可读存储介质。可以在一台或更多台计算机上使用计算机可读存储介质用于系统的完全自动化或部分自动化，以实践本文描述的方法。在某些实施例中，根据本文描述的方法的指令能够以“编程”的形式编码到计算机可读介质上，其中本文使用的术语“计算机可读介质”是指参与向计算机提供指令和数据以用于执行和处理的任何非暂时性存储介质。合适的非暂时性存储介质的示例包括软盘、硬盘、光盘、磁光盘、CD-ROM、CD-R、磁带、非易失性存储卡、ROM、DVD-ROM、蓝光磁盘、固态磁盘和网络附加存储(network attached storage，NAS)，无论这些设备是在计算机内部还是外部。包含信息的文件能够“存储”在计算机可读介质上，其中“存储”是指记录信息，使得其可以由计算机以后访问和检索。本文描述的计算机实现的方法能够使用能够以任意数量的计算机编程语言中的一种或更多种编写的编程来执行。例如，这些语言包括Java(Sun Microsystems,Inc.，Santa Clara，CA)、Visual Basic(Microsoft Corp.，Redmond，WA)和C++(AT&T Corp.，Bedminster，NJ)，以及任何许多其他编程语言。

在一些实施例中，感兴趣的计算机可读存储介质包括存储在其上的计算机程序，其中所述计算机程序在加载到计算机上时包括指令，所述指令具有用于使用以参考频率调制的调频激光束照射流动流中的粒子的算法、用于使用光电检测器检测来自粒子的散射光的算法、用于根据检测到的散射光生成频率编码数据信号的算法，以及用于将频率编码数据信号与参考频率同步的算法。在一些实施例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于同步的频率编码数据信号确定粒子的一个或更多个参数的算法。

在一些实施例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于照射光调制器(例如电光调制器、压电光调制器或声光调制器设备)以生成调频激光束的算法。在一些实施例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于将电流或电场施加到电光调制器以生成调频激光束的算法。在某些实施例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于将电流或电场施加到电光调制器以生成具有约0.001MHz至约500MHz的振荡频率的调频光束的算法，该振荡频率为例如约0.005MHz至约400MHz，例如约0.01MHz至约300MHz，例如约0.05MHz至约200MHz，例如约0.1MHz至约100MHz，例如约0.5MHz至约90MHz，例如约1MHz至约75MHz，例如约2MHz至约70MHz，例如约3MHz至约65MHz，例如约4MHz至约60MHz并且包括约5MHz至约50MHz。

在一些情况下，非暂时性计算机可读存储介质包括用于为光调制器生成参考频率信号的算法，例如其中参考频率信号具有约0.001MHz至约500MHz的振荡频率，例如约0.005MHz至约400MHz、例如约0.01MHz至约300MHz、例如约0.05MHz至约200MHz、例如约0.1MHz至约100MHz、例如约0.5MHz至约90MHz、例如约1MHz至约75MHz、例如约2MHz至约70MHz、例如约3MHz至约65MHz、例如约4MHz至约60MHz的振荡频率并且包括约5MHz至约50MHz的振荡频率。

在一些实施例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于将频率编码数据信号与参考频率同步的算法。在一些实施例中，计算机程序包括用于通过将频率编码数据信号与参考频率波形相乘来使频率编码数据信号与参考频率同步的指令。在一些情况下，非暂时性计算机可读存储介质包括用于使用锁定放大器将频率编码数据信号与参考频率同步的算法。在其他实施例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于例如通过具有用于将频率编码数据信号与参考频率波形相乘的程编程设计的FPGA使频率编码数据信号数字同步的算法。在一些实施例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于将低通滤波器应用于同步的频率编码数据信号以生成数据信号分布的算法。在某些情况下，通过应用低通滤波器生成的数据信号分布具有高斯信号分布。在其他情况下，通过应用低通滤波器生成的数据信号分布具有超高斯信号分布。

在一些实施例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于根据同步的频率调制数据信号确定流动流中的被照射粒子的一个或更多个参数的算法。在一些实施例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于粒子的所确定的一个或更多个参数来识别粒子的算法。在其他实施例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于粒子的所确定的一个或更多个参数对粒子进行分选的算法。

可以在具有显示器和操作员输入设备的一个或更多个计算机系统上采用非暂时性计算机可读存储介质。操作员输入设备例如可以是键盘、鼠标等。处理模块包括处理器，该处理器可以访问存储器，该存储器上存储有用于执行主题方法的步骤的指令。处理模块可以包括操作系统、图形用户界面(GUI)控制器、系统存储器、存储器存储设备和输入-输出控制器、高速缓冲存储器、数据备份单元和许多其他设备。处理器可以是市场上可获得的处理器或者它可以是现有或将变得可用的其他处理器之一。处理器以众所周知的方式执行操作系统和操作系统与固件和硬件的接口，并促进处理器协调和执行可以用如本领域已知的各种编程语言(例如Java、Perl、C++、其他高级或低级语言，以及它们的组合)编写的各种计算机程序的功能。操作系统(通常与处理器合作)协调和执行计算机其他部件的功能。操作系统还提供都是按照已知技术进行的调度、输入-输出控制、文件和数据管理、存储器管理以及通信控制和相关服务。

套件

本发明的方面还包括套件，其中所述套件包括激光器、光调制器和一个或更多个光偏振器。在一些实施例中，光调制器是电光调制器。在其他实施例中，光调制器是压电光调制器。在又一些实施例中，光调制器是声光调制器。套件还可以包括光学调节部件，例如用于将光从流动流传送到散射光电检测器的反射镜或分束器。在某些实施例中，套件包括锁定放大器。在一些情况下，套件还包括集成电路，例如具有用于将生成的频率编码数据信号与来自光调制器的参考频率信号同步的编程设计的现场可编程门阵列。在某些实施例中，套件包括光束发生器的一个或更多个部件，例如波形脉冲发生器、直接数字合成器、声光偏转器、光束组合透镜和鲍威尔(Powell)透镜。

套件的各种测定组分可以存在于单独的容器中，或者它们中的一些或全部可以预先组合。例如，在一些情况下，套件的一个或更多个部件，例如，一个或更多个散射光电检测器、激光器、光调制器存在于密封袋(例如无菌箔袋或包膜)中。

除了上述部件之外，主题套件还可以包括(在某些实施方案中)用于实实践主题方法的指令。这些指令可以以各种形式存在于主题套件中，这些形式中的一种或更多种可以存在于套件中。这些指令可以存在的一种形式是作为印刷信息存在于合适的介质或基材(例如，其上印刷有信息的一张或多张纸)上、在套件的封装中、在包装插页中等。这些指令的又一种形式是其上记录有信息的计算机可读介质，例如磁盘、致密盘(CD)、便携式闪存驱动器等。可能存在的这些指令的另一种形式是网站地址，该网站地址可以用于通过互联网访问已删除站点上的信息。

实用性

主题系统、方法和计算机系统可用于各种应用中，在这些应用中，需要分析和分选流体介质中的样本(例如生物样本)中的粒子组分。本公开还发现在流式细胞术中的用途，其中希望提供一种具有改进的细胞分选精度、增强的粒子收集、降低的能量消耗、粒子充电效率、更准确的粒子充电和在细胞分选期间增强的粒子偏转的流式细胞仪。在实施例中，本公开减少了在使用流式细胞仪进行样本分析期间对用户输入或手动调节的需要。在某些实施例中，主题系统提供完全自动化的协议，使得在使用期间对流式细胞仪的调节只需要很少的(如果有的话)人工输入。

本公开还发现了用于可能需要根据生物样本制备的细胞用于研究、实验室测试或用于治疗的应用。在一些实施例中，主题方法和设备可以有助于获得根据目标流体或组织生物样本制备的单个细胞。例如，主题方法和系统有助于从流体或组织样本中获得细胞，以用作对疾病例如癌症的研究或诊断标本。同样，主题方法和系统有助于从流体或组织样本中获得细胞以用于治疗。与传统的流式细胞仪系统相比，本公开的方法和设备允许以提高的效率和低成本从生物样本(例如，器官、组织、组织片段、流体)中分离和收集细胞。

尽管有所附权利要求，本公开也由以下条款定义：

1、一种用于在粒子分析器中确定流动流中的粒子的参数的方法，所述方法包括：

用以参考频率调制的调频激光束照射流动流中的粒子；

用光电检测器检测来自粒子的散射光；

根据检测到的散射光生成频率编码数据信号；

将频率编码数据信号与参考频率同步；和

基于同步的频率编码数据信号确定粒子的一个或更多个参数。

2、根据条款1所述的方法，其中，所述方法包括用激光器照射电光调制器以产生所述调频激光束。

3、根据条款2所述的方法，其中，所述电光调制器是压电光调制器。

4、根据条款2至3中任一项所述的方法，其中，所述方法包括通过输入偏振器用激光器照射所述电光调制器以产生偏振的调频激光束。

5、根据条款1至4中任一项所述的方法，其中，所述散射光包括前向散射光。

6、根据条款1至5中任一项所述的方法，其中，所述散射光包括侧向散射光。

7、根据条款1至6中任一项所述的方法，其中，所述散射光通过输出偏振器被传送到所述光电检测器。

8、根据条款7所述的方法，其中，所述输出偏振器包括四分之一波片。

9、根据条款6至8中任一项所述的方法，其中，在两个检测器通道中检测所述侧向散射光。

10、根据条款9所述的方法，其中，所述侧向散射检测器通道包括具有第一偏振的第一偏振器和具有垂直于第一偏振的第二偏振的第二偏振器。

11、根据条款1至10中任一项所述的方法，其中，生成所述频率编码数据信号包括检测由正以所述参考频率振荡的粒子散射的光的幅度。

12、根据条款1-11中任一项所述的方法，还包括生成参考频率信号。

13、根据条款12所述的方法，其中，所述参考频率信号包括参考波形。

14、根据条款13所述的方法，其中，将所述频率编码数据信号同步包括将所述频率编码数据信号与所述参考波形相乘。

15、根据条款1至14中任一项所述的方法，其中，所述频率编码数据信号通过锁定放大器与所述参考频率同步。

16、根据条款15所述的方法，其中，锁定放大在现场可编程门阵列(FPGA)上实现。

17、根据条款1至14中任一项所述的方法，其中，所述频率编码数据信号与所述参考频率数字同步。

18、根据条款1至17中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括将低通滤波器应用于所述同步的频率编码数据信号以生成数据信号分布。

19、根据条款18所述的方法，其中，将低通滤波器应用于所述同步的频率编码数据信号生成高斯信号分布。

20、根据条款18所述的方法，其中，将低通滤波器应用于所述同步的频率编码数据信号生成超高斯信号分布。

21、根据条款1至20中任一项所述的方法，其中，所述粒子分析器是流式细胞仪的一部分。

22、根据条款21所述的方法，其中，所述方法还包括基于粒子的所确定的参数中的一个或更多个来识别所述粒子。

23、根据条款21至22中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括基于粒子的所确定的参数中的一个或更多个来分选所述粒子。

24、一种方法，包括：

用以参考频率调制的调频激光束照射流动流中的粒子；

用光电检测器检测来自粒子的散射光；

根据检测到的散射光生成频率编码数据信号；和

将频率编码数据信号与参考频率同步。

25、根据条款24所述的方法，其中，所述方法包括用激光照射电光调制器以生成所述调频激光束。

26、根据条款25所述的方法，其中，所述电光调制器是压电光调制器。

27、根据条款25至26中任一项所述的方法，其中，所述方法包括通过输入偏振器用激光器照射所述电光调制器以生成偏振的调频激光束。

28、根据条款24至27中任一项所述的方法，其中，所述散射光包括前向散射光。

29、根据条款24至28中任一项所述的方法，其中，所述散射光包括侧向散射光。

30、根据条款24至29中任一项所述的方法，其中，将所述散射光通过输出偏振器传送到所述光电检测器。

31、根据条款30所述的方法，其中，所述输出偏振器包括四分之一波片。

32、根据条款29至31中任一项所述的方法，其中，在两个检测器通道中检测所述侧向散射光。

33、根据条款32所述的方法，其中，所述侧向散射检测器通道包括具有第一偏振的第一偏振器和具有垂直于第一偏振的第二偏振的第二偏振器。

34、根据条款24至33中任一项所述的方法，其中，生成所述频率编码数据信号包括检测由正以所述参考频率振荡的粒子散射的光的幅度。

35、根据条款24至34中任一项所述的方法，还包括生成参考频率信号。

36、根据条款35所述的方法，其中，所述参考频率信号包括参考波形。

37、根据条款36所述的方法，其中，将所述频率编码数据信号同步包括将所述频率编码数据信号与所述参考波形相乘。

38、根据条款24至37中任一项所述的方法，其中，使用锁定放大器将所述频率编码数据信号与所述参考频率同步。

39、根据条款38所述的方法，其中，锁定放大在现场可编程门阵列(FPGA)上实现。

40、根据条款24至37中任一项所述的方法，其中，所述频率编码数据信号与所述参考频率数字同步。

41、根据条款24至40中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括将低通滤波器应用于所述同步的频率编码数据信号以生成数据信号分布。

42、根据条款41所述的方法，其中，将低通滤波器应用于所述同步的频率编码数据信号生成高斯信号分布。

43、根据条款41所述的方法，其中，将低通滤波器应用于所述同步的频率编码数据信号生成超高斯信号分布。

44、一种用于确定流动流中的粒子的一个或更多个参数的粒子分析器，所述粒子分析器包括：

光源，包括：

激光器；和

光调制器部件，其被配置为以参考频率生成调频激光束；

包括光电检测器的光检测系统，所述光电检测器被配置为检测来自流动流中的被照射粒子的散射光；和

处理器，其包括可操作地耦合到所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由所述处理器执行时，使所述处理器：

根据检测到的散射光生成频率编码数据信号；

将频率编码数据信号与参考频率同步；和

基于同步的频率编码数据信号确定粒子的一个或更多个参数。

45、根据条款44所述的粒子分析器，其中，所述粒子分析器被结合到流式细胞仪中。

46、根据条款44至45中任一项所述的粒子分析器，还包括用于基于粒子的所确定的参数中的一个或更多个来分选粒子的粒子分选仪。

47、根据条款44至46中任一项所述的粒子分析器，其中，所述光调制器部件包括电光调制器。

48、根据条款47所述的粒子分析器，其中，所述电光调制器是压电光调制器。

49、根据条款47至48中任一项所述的粒子分析器，其中，所述光调制器部件还包括输入偏振器。

50、根据条款44至49中任一项所述的粒子分析器，其中，所述光电检测器包括前向散射检测器。

51、根据条款44至50中任一项所述的粒子分析器，其中，所述光电检测器包括侧向散射检测器。

52、根据条款44至51中任一项所述的粒子分析器，其中，光检测系统还包括输出偏振器。

53、根据条款52所述的粒子分析器，其中，所述输出偏振器包括四分之一波片。

54、根据条款51至53中任一项所述的粒子分析器，其中，所述光检测系统包括两个侧向散射检测器。

55、根据条款54所述的粒子分析器，其中，所述光检测系统包括：

第一侧向散射检测器，其包括具有第一偏振的第一偏振器；和

第二侧向散射检测器，其包括具有垂直于第一偏振的第二偏振的第二偏振器。

56、根据条款44至55中任一项所述的粒子分析器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由所述处理器执行时使所述处理器检测由正以参考频率振荡的粒子散射的光的幅度。

57、根据条款44至56中任一项所述的粒子分析器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由所述处理器执行时使所述处理器生成参考频率信号。

58、根据条款57所述的粒子分析器，其中，所述参考频率信号包括参考波形。

59、根据条款58所述的粒子分析器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由所述处理器执行时使所述处理器通过将所述频率编码数据信号与所述参考波形相乘来同步所述频率编码数据信号。

60、根据条款44至59中任一项所述的粒子分析器，其中，所述粒子分析器与锁定放大器进行通信，所述锁定放大器被配置为将所述频率编码数据信号与所述参考频率同步。

61、根据条款60所述的粒子分析器，还包括FPGA，所述FPGA被配置为通过锁定放大将所述频率编码数据信号与所述参考频率同步。

62、根据条款60至61中任一项所述的粒子分析器，其中，所述锁定放大器被配置为将低通滤波器应用于所述同步的频率编码数据信号以生成数据信号分布。

63、根据条款44至62中任一项所述的粒子分析器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由所述处理器执行时使所述处理器将所述频率编码数据信号与所述参考频率数字同步。

64、根据条款63所述的粒子分析器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由所述处理器执行时使所述处理器将低通滤波器应用于所述同步的频率编码数据信号以生成数据信号分布。

65、根据条款62和64中任一项所述的粒子分析器，其中，所生成的数据信号分布是高斯信号分布。

66、根据条款62和64中任一项所述的粒子分析器，其中，所生成的数据信号分布是超高斯信号分布。

67、一种系统，包括：

光源，包括：

激光器；和

光调制器部件，其被配置为以参考频率生成调频激光束；

包括光电检测器的光检测系统，所述光电检测器被配置为检测来自流动流中的被照射粒子的散射光；和

处理器，其包括可操作地耦合到所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令为当由所述处理器执行时，使所述处理器：

根据检测到的散射光生成频率编码数据信号；和

将频率编码数据信号与参考频率同步。

68、根据条款67所述的系统，其中，所述光调制器部件包括电光调制器。

69、根据条款68所述的系统，其中，所述电光调制器是压电光调制器。

70、根据条款68至69中任一项所述的系统，其中，所述光调制器部件另还包括输入偏振器。

71、根据条款67至70中任一项所述的系统，其中，所述光电检测器包括前向散射检测器。

72、根据条款67至70中任一项所述的系统，其中，所述光电检测器包括侧向散射检测器。

73、根据条款67至72中任一项所述的系统，其中，光检测系统另还包括输出偏振器。

74、根据条款73所述的系统，其中，所述输出偏振器包括四分之一波片。

75、根据条款72至74中任一项所述的系统，其中，所述光检测系统包括两个侧向散射检测器。

76、根据条款75所述的系统，其中，所述光检测系统包括：

第一侧向散射检测器，其包括具有第一偏振的第一偏振器；和

第二侧向散射检测器，其包括具有垂直于第一偏振的第二偏振的第二偏振器。

77、根据条款67至76中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由所述处理器执行时使所述处理器检测由正以所述参考频率振荡的粒子散射的光的幅度。

78、根据条款67至77中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由所述处理器执行时使所述处理器生成参考频率信号。

79、根据条款78所述的系统，其中，所述参考频率信号包括参考波形。

80、根据条款79所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由所述处理器执行时使所述处理器通过将所述频率编码数据信号与所述参考波形相乘来同步所述频率编码数据信号。

81、根据条款67至80中任一项所述的系统，还包括锁定放大器，所述锁定放大器被配置为将所述频率编码数据信号与所述参考频率同步。

82、根据条款81所述的系统，还包括FPGA，所述FPGA被配置为通过锁定放大将所述频率编码数据信号与所述参考频率同步。

83、根据条款81至82中任一项所述的系统，其中，所述锁定放大器被配置为将低通滤波器应用于所述同步的频率编码数据信号以生成数据信号分布。

84、根据条款67至80中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由所述处理器执行时使所述处理器将所述频率编码数据信号与所述参考频率数字同步。

85、根据条款84所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由所述处理器执行时使所述处理器将低通滤波器应用于所述同步的频率编码数据信号以生成数据信号分布。

86、根据条款83和85中任一项所述的系统，其中，所生成的数据信号分布是高斯信号分布。

87、根据条款83和85中任一项所述的系统，其中，所生成的数据信号分布是超高斯信号分布。

88、一种非暂时性计算机可读存储介质，包括存储在其上的指令，所述指令用于在粒子分析器中确定流动流中的粒子的参数，所述指令包括：

用于使用以参考频率调制的调频激光束照射流动流中的粒子的算法；

用于使用光电检测器检测来自粒子的散射光的算法；

用于根据检测到的散射光生成频率编码数据信号的算法；

用于将频率编码数据信号与参考频率同步的算法；和

用于基于同步的频率编码数据信号确定粒子的一个或更多个参数的算法。

89、根据条款88所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于使用激光器照射电光调制器以生成所述调频激光束的算法。

90、根据条款89所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述电光调制器是压电光调制器。

91、根据条款89至90中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于通过输入偏振器使用激光器照射所述电光调制器以生成偏振的调频激光束的算法。

92、根据条款88至91中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于检测前向散射光的算法

93、根据条款88至92中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于检测侧向散射光的算法。

94、根据条款93所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于在两个检测器通道中检测侧向散射光的算法。

95、根据条款88至94中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于生成所述频率编码数据信号的算法，所述算法包括检测由正以参考频率振荡的粒子散射的光的幅度。

96、根据条款88至95中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于生成参考频率信号的算法。

97、根据条款96所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述参考频率信号包括参考波形。

98、根据条款97所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于将所述频率编码数据信号与所述参考波形相乘以生成所述同步的频率编码数据信号的算法。

99、根据条款88至98中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于使用锁定放大器将所述频率编码数据信号与所述参考频率同步的算法。

100、根据条款88至99中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于将低通滤波器应用于所述同步的频率编码数据信号以生成数据信号分布的算法。

101、根据条款100所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于生成高斯信号分布的算法。

102、根据条款100所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中，所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于生成超高斯信号分布的算法。

103、一种套件，包括：

激光器；

光调制器；和

一个或更多个光偏振器。

104、根据条款103所述的套件，其中，所述光调制器是电光调制器。

105、根据条款104所述的套件，其中，所述电光调制器是压电光调制器。

106、根据条款103至105中任一项所述的套件，还包括锁定放大器。

107、根据条款103至106中任一项所述的套件，还包括四分之一波片。

尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和示例的方式对前述发明进行了一些详细的描述，但是根据本发明的教导，对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对其进行某些改变和修改。

因此，前述仅说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计出各种装置，这些装置尽管本文没有明确地描述或示出，但体现了本发明的原理并且被包括在其精神和范围内。此外，本文中列举的所有示例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域而贡献的概念，并且应被解释为不限于这些具体列举的示例和条件。此外，本文中引用本发明的原理、方面和实施例及其具体示例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等效物。此外，这些等效物旨在包括当前已知的等效物和未来开发的等效物，即，所开发的执行相同功能的任何元件，无论结构如何。此外，无论本文公开内容是否在权利要求中明确记载，本文所公开的任何内容均不旨在献给公众。

因此，本发明的范围不旨在限于本文所示和描述的示例性实施例。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求来体现。在权利要求中，35U.S.C.§112(f)或35U.S.C.§112(6)被明确定义为仅当在权利要求的此类限制开始引用确切的短语“用于……的手段”或确切的短语“用于……的步骤”时才调用权利要求中的限制；如果在权利要求的限制中没有使用这样的确切短语，则不援引35U.S.C.§112(f)或35U.S.C.§112(6)。

Claims (15)

1.一种用于在粒子分析器中确定流动流中的粒子的参数的方法，所述方法包括：

用以参考频率调制的调频激光束照射流动流中的粒子；

用光电检测器检测来自粒子的散射光；

根据检测到的散射光生成频率编码数据信号；

将频率编码数据信号与参考频率同步；和

基于同步的频率编码数据信号确定粒子的一个或更多个参数。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括用激光器照射电光调制器以生成所述调频激光束。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述电光调制器是压电光调制器。

4.根据权利要求2至3中任一项所述的方法，其中，所述方法包括通过输入偏振器用激光器照射所述电光调制器以生成偏振的调频激光束。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述散射光包括前向散射光和侧向散射光中的至少一种。

6.根据权利要求5中任一项所述的方法，其中，所述散射光通过输出偏振器被传送到所述光电检测器。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述输出偏振器包括四分之一波片。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中，在两个检测器通道中检测所述侧向散射光。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，侧向散射检测器通道包括具有第一偏振的第一偏振器和具有垂直于第一偏振的第二偏振的第二偏振器。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，生成所述频率编码数据信号包括检测由正以所述参考频率振荡的粒子散射的光的幅度。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，还包括生成参考频率信号。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述参考频率信号包括参考波形。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，将所述频率编码数据信号同步包括将所述频率编码数据信号与所述参考波形相乘。

14.一种用于确定流动流中的粒子的一个或更多个参数的粒子分析器，所述粒子分析器包括：

光源，包括：

激光器；和

光调制器部件，其被配置为以参考频率生成调频激光束；

包括光电检测器的光检测系统，所述光电检测器被配置为检测来自流动流中的被照射粒子的散射光；和

处理器，其包括可操作地耦合到所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由所述处理器执行时，使所述处理器：

根据检测到的散射光生成频率编码数据信号；

将所述频率编码数据信号与所述参考频率同步；和

基于同步的频率编码数据信号确定粒子的一个或更多个参数。

15.一种系统，包括：

光源，包括：

激光器；和

光调制器部件，其被配置为以参考频率生成调频激光束；

包括光电检测器的光检测系统，所述光电检测器被配置为检测来自流动流中的被照射粒子的散射光；和

处理器，其包括可操作地耦合到所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由所述处理器执行时，使所述处理器：

根据检测到的散射光生成频率编码数据信号；和

将所述频率编码数据信号与所述参考频率同步。

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