CN113439205A - 用于对样本的荧光团进行光谱解析的方法及其系统 - Google Patents
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Abstract
本公开的方面包括用于对来自样本中具有重叠的荧光光谱的荧光团的光进行光谱解析的方法。根据某些实施例的方法包括利用光探测系统来探测来自样本的光，该样本包括具有重叠的荧光光谱的多个荧光团，并且对来自样本中每个荧光团的光进行光谱解析。在一些实施例中，方法包括估算样本中(诸如颗粒上)的一个或更多个荧光团的丰度。在某些情况下，方法包括基于每个荧光团的丰度来识别样本中的颗粒，并对颗粒进行分选。根据一些实施例的方法包括通过计算每个荧光团的荧光光谱来计算光谱解混矩阵，从而对来自每个荧光团的光进行光谱解析。还提供了用于实践本主题方法的系统和集成电路设备(例如，现场可编程门阵列)。
Description
相关申请的交叉引用
本申请与2018年12月28日提交的第62/786,186号美国临时专利申请；2019年2月11日提交的第62/803,975号美国临时专利申请以及2019年10月23日提交的第62/924,999号美国临时专利申请有关；这些申请的公开内容通过引用并入本文。
前言
流式颗粒分选系统(诸如分选流式细胞仪)用于基于至少一个测量的颗粒特征来对流体样本中的颗粒进行分选。在流式颗粒分选系统中，流体悬浮液中的颗粒(例如分子、分析物结合珠或单个细胞)在流中穿过探测区域，在该探测区域中传感器探测该类型的流中所包括的待分选的颗粒。传感器在探测到待分选的该类颗粒后，会触发可选择性地隔离目标颗粒的分选机制。
颗粒感测通常通过使流体流穿过探测区域来进行，在该探测区域中颗粒暴露于一个或更多个激光器的照射光下，并测量颗粒的光散射和荧光性质。能够利用荧光染料标记其颗粒或组分以促进探测，并且通过使用光谱不同的荧光染料来标记不同的颗粒或组分来同时探测多种不同的颗粒或组分。使用一个或更多个光电传感器来进行探测，以有助于每个不同荧光染料的荧光的独立测量。
为了对样本中的颗粒进行分选，液滴充电机制会在流的分流点处向包括待分选颗粒类型的流的液滴充电，以使其带有电荷。液滴穿过静电场，并根据液滴上电荷的极性和大小偏转到一个或更多个收集容器中。不带电的液滴不会被静电场偏转。
发明内容
本公开的方面包括用于对来自样本中具有重叠的荧光光谱的荧光团的光进行光谱解析的方法。根据某些实施例的方法包括利用光探测系统来探测来自具有多个荧光团的样本中的光，该多个荧光团具有重叠的荧光光谱，并且包括对来自样本中每个荧光团的光进行光谱解析。在一些实施例中，方法包括估算样本中(诸如颗粒上)的一个或更多个荧光团的丰度。在某些情况下，方法包括基于每个荧光团的丰度来识别样本中的颗粒，并对颗粒进行分选。根据一些实施例的方法包括通过计算每个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵，对来自每个荧光团的光进行光谱解析。还提供了用于实践本主题方法的系统和集成电路设备(例如，现场可编程门阵列)。
在一些实施例中，所关注的样本包括多个荧光团，其中每个荧光团的荧光光谱都与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠。在某些情况下，每个荧光团的荧光光谱都与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠10nm或更多，诸如重叠25nm或更多、并且包括重叠50nm或更多。在一些情况下，样本中一个或更多个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠，诸如重叠10nm或更多、诸如重叠25nm或更多并且包括重叠50nm或更多。在其他实施例中，所关注的样本包括具有不重叠的荧光光谱的多个荧光团。在这些实施例中，每个荧光团的荧光光谱与至少一个其他荧光团相邻为10nm或以下、诸如9nm或以下、诸如8nm或以下、诸如7nm或以下、诸如6nm或以下、诸如5nm或以下、诸如4nm或以下、诸如3nm或以下、诸如2nm或以下，并且包括1nm或以下。
在一些实施例中，方法包括通过针对样本中每个荧光团的荧光光谱来计算光谱解混矩阵，从而对来自每个荧光团的光进行光谱解析。在一些情况下，计算光谱解混矩阵包括使用加权最小二乘算法。在一些情况下，加权最小二乘算法是根据下式来计算的：
其中，y是光探测系统中多个光电探测器针对每个颗粒(例如细胞)所测量的探测器值；
是所估算的荧光团丰度；X是溢出；并且W是
在一些实施例中，根据下式来计算每个Wii：
其中σi 2是探测器i处的方差；yi是探测器i处的信号；并且λi是探测器i处的恒定噪声。在某些实施例中，光谱解混矩阵根据下式来计算：(XTWX)-1XTW。在一些情况下，针对由光探测系统所探测到的每个颗粒来对(XTWX)求逆，以计算光谱解混矩阵。
在某些实施例中，用于对来自每个荧光团的光进行光谱解析的方法包括针对由光探测系统所探测到的每个颗粒，在加权最小二乘算法中来近似(XTWX)的逆，例如以便对样本中的颗粒进行实时地分选。在一些实施例中，对(XTWX)求逆包括根据下式使用迭代Newton-Raphson计算来近似(XTWX)-1：
A-1＝(XTWX)-1；
其中WG是W的预定近似值，该W是根据光探测系统中的每个光电探测器的基线方差(即，由于颗粒不存在荧光)来确定的。在一些实施例中，方法还包括估算每个光电探测器的基线方差。在一些情况下，方法包括使用单染色对照样本来确定光电探测器噪声分量(例如，电子噪声、背景光等)。在某些情况下，方法包括在利用光源照射样本之前，确定每个光电探测器的方差。在其他情况下，方法包括在利用光源照射样本之前，确定W的预定近似值WG。在某些实施例中，方法包括利用预确定的WG来预计算A0 -1。在这些实施例中，针对由光探测系统所探测到的每个颗粒，都可以将预计算出的A0 -1用作A-1的第一近似值。
在其他实施例中，用于对来自每个荧光团的光进行光谱解析的方法包括使用Sherman-Morrison迭代逆更新器。在一些情况下，方法包括使用Sherman-Morrison公式来计算A：
在某些情况下，方法包括使用Sherman-Morrison公式来预计算A0 -1以计算A0扰动的逆。在一些实施例中，通过公式XTW0X来计算A0的逆，并且通过公式XTWX来计算A的逆。在一些情况下，方法包括根据下式来计算ΔA(即A-A0)作为列向量与每个迭代W的乘积：
其中Wii＝W0 ii+αi，其中i∈[1，ND]。
根据实施例，ΔAi＝XTΔWiX＝αimimi T，其中A能够表示为：
在这些实施例中，能够使用对每个wi的改变，利用每个新的加权矩阵W(即带有与W0不同的值)根据A0来重新计算每个A。在一些实施例中，方法包括实施Sherman-Morrison迭代逆更新器，以根据下式来近似光谱解混矩阵：
在一些实施例中，将用于A0 -1的预计算的值用于计算A1 -1。然后将预计算的A1 -1用于计算A2 -1。能够通过使用从i＝1到ND的每个(Ai-1)-1来重复计算Ai -1，从而计算值A-1。
在一些实施例中，用于对来自每个荧光团的光进行光谱解析的方法包括通过矩阵分解(即，因式分解)来计算加权最小二乘算法。在某些情况下，方法包括LU矩阵分解，诸如其中将矩阵分解为下三角(L)矩阵和上三角(U)矩阵的乘积。在某些情况下，LU分解包括高斯消除。在其他情况下，LU分解包括修正的Cholesky分解、LDL分解，其中D是对角矩阵。在某些实施例中，加权最小二乘算法(a)是根据下式使用修正的Cholesky分解来计算的：
XTWXa＝XTWy
Aa＝B
LDLTa＝B LDL分解
Lz＝B其中z＝DLTa 下三角矩阵解
Dx＝Z其中x＝LTa 对角矩阵解
LTa＝X 上三角矩阵解
在其他实施例中，用于对来自每个荧光团的光进行光谱解析的方法包括通过QR因式分解来计算加权最小二乘算法。在一些情况下，QR因式分解是矩阵，该矩阵是正交(Q)矩阵和上三角(R)矩阵的乘积。在一些实施例中，加权最小二乘算法(a)是根据下式使用QR因式分解来计算的：
XTWXa＝XTWy
在其他实施例中，用于对来自每个荧光团的光进行光谱解析的方法包括通过奇异值分解(SVD)来计算加权最小二乘算法。在一些情况下，奇异值分解是矩阵，该矩阵是乘积
其中U和V是正交矩阵，并且∑是含有
奇异值的对角矩阵。在某些情况下，加权最小二乘算法(a)是根据下式使用奇异值分解来计算的：
z＝UTy
∑w＝z
a＝Vw。
在一些实施例中，样本中(例如颗粒上)的一个或更多个荧光团的丰度是通过对来自每个荧光团的光进行光谱解析来确定的。在一些实施例中，对来自样本中每个荧光团的光进行光谱解析包括计算(例如，目标颗粒上)每个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵。在一些情况下，方法包括估算颗粒上一个或更多个荧光团的丰度，并基于每个荧光团所估算出的丰度来识别样本中的颗粒。在某些情况下，将样本中识别出的颗粒(例如，生物样本中的细胞)进行分选。
还提供了用于实践本主题方法的系统。根据某些实施例的系统包括：配置为照射具有多个荧光团的样本的光源，该多个荧光团具有重叠的荧光光谱；光探测系统，其包括多个光电探测器；以及处理器，该处理器带有可操作地耦接到处理器的存储器，其中该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器对来自样本中每个荧光团的光进行光谱解析。在一些实施例中，处理器包括带有指令的存储器，该指令在由处理器执行时使得处理器通过计算样本中每个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵，从而对来自每个荧光团的荧光进行光谱解析。在一些情况下，加权最小二乘算法是根据下式来计算的：
其中，y是光探测系统中多个光电探测器针对每个颗粒所测量的探测器值；
是所估算的荧光团丰度；X是溢出；并且W是
在一些实施例中，根据下式来计算每个Wii：
其中σi 2是探测器i处的方差；yi是探测器i处的信号；并且λi是探测器i处的恒定噪声。在某些实施例中，光谱解混矩阵根据下式来计算：(XTWX)-1XTW。在一些情况下，针对由光探测系统所探测到的每个颗粒来对(XTWX)求逆，以计算光谱解混矩阵。
在某些实施例中，系统包括处理器，该处理器带有可操作地耦接到该处理器的存储器，其中该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器针对由光探测系统所探测到的每个颗粒，来在加权最小二乘算法中近似(XTWX)的逆，以便对样本中的颗粒进行实时地分选。在某些情况下，根据下式使用迭代Newton-Raphson计算来近似(XTWX)的逆：
A-1＝(XTWX)-1；
其中WG是W的预定近似值，该W是根据光探测系统中的每个光电探测器的方差来确定的。在一些实施例中，该方差具有光电探测器噪声分量。例如，该光电探测器噪声分量可以包括电子噪声和光学背景光中的一个或更多个。在一些实施例中，光电探测器的方差与由光电探测器所测得的光强度成比例。在一些实施例中，使用单染色对照样本来估算光电探测器噪声分量。在某些实施例中，存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器在利用光源照射样本之前自动地确定每个光电探测器的方差。在其他实施例中，存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器在利用光源照射样本之前自动地预确定WG。在某些实施例中，存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器利用预确定的WG来预计算A0-1。在这些实施例中，预计算的A0-1可以存储在存储器中，并且可以被处理器用作针对由光探测系统所探测到的每个颗粒的A-1的第一近似值。
在其他实施例中，系统包括处理器，该处理器带有可操作地耦接到该处理器的存储器，其中该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器利用Sherman-Morrison迭代逆更新器针对每个颗粒来近似加权最小二乘算法。在一些情况下，存储器包括用于使用Sherman-Morrison公式来计算A的指令：
在某些情况下，存储器包括用于使用Sherman-Morrison公式来预计算A0-1以计算A0扰动的逆的指令。在一些实施例中，通过公式XTW0X来计算A0的逆，并且通过公式XTWX来计算A的逆。在一些情况下，存储器包括用于根据下式来计算ΔA(即A-A0)作为列向量与每个迭代W的乘积的指令：
其中Wii＝w0 ii+αi，其中i∈[1，ND]。
根据实施例，ΔAi＝XTΔWiX＝αimimi T，其中A能够表示为：
在这些实施例中，能够使用对每个wi的改变，利用每个新的加权矩阵W(即带有与W0不同的值)根据A0来重新计算每个A。在一些实施例中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦接到该处理器的存储器，其中该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器实施Sherman-Morrison迭代逆更新器，以根据下式来近似光谱解混矩阵：
在一些实施例中，将用于A0 -1的预计算的值用于计算A1 -1。然后将预计算的A1 -1用于计算A2 -1。能够通过使用从i＝1到ND的每个(Ai-1)-1来重复计算Ai -1，从而计算值A-1。
在其他实施例中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦接到该处理器的存储器，其中该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器针对每个颗粒通过矩阵分解来计算加权最小二乘算法。在一些情况下，存储器包括用于LU矩阵分解的指令，诸如其中将矩阵分解为下三角(L)矩阵和上三角(U)矩阵的乘积。在某些情况下，LU分解包括高斯消除。在其他情况下，LU分解包括修正的Cholesky分解、LDL分解，其中D是对角矩阵。在某些实施例中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦接到处理器的存储器，其中该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器通过使用修正的Cholesky分解来计算加权最小二乘算法(a)：
XTWXa＝XTWy
Aa＝B
LDLTa＝B LDL分解
Lz＝B其中z＝DLTa 下三角矩阵解
Dx＝Z其中x＝LTa 对角矩阵解
LTa＝X 上三角矩阵解
在其他实施例中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦接到该处理器的存储器，其中该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器通过QR因式分解来计算加权最小二乘算法。在一些情况下，QR因式分解是矩阵，该矩阵是正交(Q)矩阵和上三角(R)矩阵的乘积。在一些实施例中，存储器包括用于根据以下使用QR因式分解来计算加权最小二乘算法(a)的指令：
XTWXa＝XTWy
在其他实施例中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦接到处理器的存储器，其中该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器通过奇异值分解(SVD)来计算加权最小二乘算法。在一些情况下，奇异值分解是矩阵，该矩阵是乘积
其中U和V是正交矩阵，并且∑是含有
奇异值的对角矩阵。在某些情况下，存储器包括用于根据下式使用奇异值分解来计算加权最小二乘算法(a)的指令：
z＝UTy
∑w＝z
a＝Vw
在一些实施例中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦接到该处理器的存储器，其中该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器基于计算出的光谱解混矩阵来估算样本中一个或更多个荧光团的丰度。在某些情况下，存储器包括用于估算样本中颗粒上的一个或更多个荧光团的丰度的指令。在一些实施例中，存储器包括用于基于颗粒上每个荧光团的所估算丰度来识别样本中的颗粒的指令。在某些情况下，系统包括用于对样本中所识别的颗粒进行分选的颗粒分选器。
还提供了集成电路设备，该集成电路设备被编程为对来自样本中多个荧光团的光进行光谱解析。在实施例中，集成电路设备可以是现场可编程门阵列(FPGA)、专用集成电路(ASIC)或复杂可编程逻辑设备(CPLD)，或者是一些其他集成电路设备。在一些实施例中，集成电路设备被编程为通过计算样本中每个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵，从而对来自每个荧光团的荧光进行光谱解析。在一些情况下，加权最小二乘算法是根据下式来计算的：
其中，y是光探测系统中多个光电探测器针对每个颗粒所测量的探测器值；
是所估算的荧光团丰度；X是溢出；并且W是
在一些实施例中，根据下式来计算每个Wii：
其中σi 2是探测器i处的方差；yi是探测器i处的信号；并且λi是探测器i处的恒定噪声。在某些实施例中，光谱解混矩阵根据下式来计算：(XTWX)-1XTW。在一些情况下，针对由光探测系统所探测到的每个颗粒来对(XTWX)求逆，以计算光谱解混矩阵。
在某些实施例中，集成电路设备被编程为针对由光探测系统所探测到的每个颗粒，在加权最小二乘算法中来近似(XTWX)的逆，以便对样本中的颗粒进行实时地分选。在某些情况下，根据下式使用迭代Newton-Raphson计算来近似(XTWX)的逆：
A-1＝(XTWX)-1；
其中WG是W的预定近似值，该W是根据光探测系统中的每个光电探测器的方差来确定的。在一些实施例中，将集成电路设备编程为还估算每个光电探测器的方差。在某些情况下，基于单染色对照样本利用光电探测器噪声分量的估算来对集成电路设备进行编程。在其他情况下，在利用光源照射样本之前，将每个光电探测器的方差都编程到集成电路设备中。在其他情况下，在利用光源照射样本之前，将迭代Newton-Raphson计算中的W的预定近似值WG编程到集成电路设备中。在某些实施例中，将集成电路设备编程为利用预确定的WG来预计算A0 -1。在这些实施例中，可以将预计算的A0 -1编程到集成电路设备中，并且用作针对由光探测系统所探测到每个颗粒的A-1的第一近似值。
在其他实施例中，将关注的集成电路设备编程为利用Sherman-Morrison迭代逆更新器针对每个颗粒来近似加权最小二乘算法。在一些情况下，将集成电路设备编程为用于使用Sherman-Morrison公式来计算A：
在某些情况下，将集成电路设备编程为用于使用Sherman-Morrison公式来预计算A0 -1以计算A0扰动的逆。在一些实施例中，通过公式XTW0X来计算A0的逆，并且通过公式XTWX来计算A的逆。在一些情况下，将集成电路设备编程为根据下式来计算ΔA(即A-A0)作为列向量与每个迭代W的乘积：
其中Wii＝w0 ii+αi，其中i∈[1，ND]。
根据实施例，ΔAi＝XTΔWiX＝aimimi T，其中A能够表示为：
在这些实施例中，能够使用对每个wi的改变，利用每个新的加权矩阵W(即带有与W0不同的值)根据A0来重新计算每个A。在一些实施例中，将集成电路设备编程为实施Sherman-Morrison迭代逆更新器，以根据下式来近似光谱解混矩阵：
在一些实施例中，将用于A0 -1的预计算的值用于计算A1 -1。然后将预计算的A1 -1用于计算A2 -1。能够通过使用从i＝1到ND的每个(Ai-1)-1来重复计算Ai -1，从而计算值A-1。
在其他实施例中，将关注的集成电路设备编程为通过矩阵分解针对每个颗粒来计算加权最小二乘算法。在一些情况下，将集成电路设备编程为用于LU矩阵分解的指令，诸如其中将矩阵分解为下三角(L)矩阵和上三角(U)矩阵的乘积。在某些情况下，LU分解包括高斯消除。在其他情况下，LU分解包括修正的Cholesky分解、LDL分解，其中D是对角矩阵。在某些实施例中，将集成电路设备编程为根据下式使用修正的Cholesky分解来计算加权最小二乘算法(a)：
XTWXa＝XTWy
Aa＝B
LDLTa＝B LDL分解
Lz＝B其中z＝DLTa 下三角矩阵解
Dx＝Z其中x＝LTa 对角矩阵解
LTa＝x 上三角矩阵解
在其他实施例中，将集成电路设备编程为通过QR因式分解来计算加权最小二乘算法。在一些情况下，QR因式分解是矩阵，该矩阵是正交(Q)矩阵和上三角(R)矩阵的乘积。在一些实施例中，将集成电路设备编程为根据下式使用OR因式分解来计算加权最小二乘算法(a)：
XTWXa＝XTWy
在其他实施例中，将集成电路设备编程为通过奇异值分解(SVD)来计算加权最小二乘算法。在一些情况下，奇异值分解是矩阵，该矩阵是乘积
其中U和V是正交矩阵，并且∑是含有
奇异值的对角矩阵。在某些情况下，将集成电路设备编程为根据下式使用奇异值分解来计算加权最小二乘算法(a)：
z＝UTy
∑w＝z
a＝Vw
在一些实施例中，将集成电路设备编程为基于计算出的光谱解混矩阵来估算样本中一个或更多个荧光团的丰度。在某些情况下，将集成电路设备编程为估算样本中颗粒上的一个或更多个荧光团的丰度。在一些实施例中，将集成电路设备编程为基于颗粒上每个荧光团的所估算丰度来识别样本中的颗粒。在某些情况下，将集成电路设备编程为对样本中所识别出的颗粒进行分选。
附图说明
当结合附图来阅读以下详细描述时可以最好地理解本发明。附图中包括以下图：
图1描绘了通过以下方式来确定荧光团丰度的比较：a)传统的光谱重叠补偿；b)通过使用普通最小二乘算法所计算出的光谱解混；c)根据某些实施例的通过使用加权最小二乘算法所计算出的光谱解混，其中加权因子(W)是针对每个细胞进行的实时地近似。
图2描绘了根据某些实施例的通过加权最小二乘算法和加权因子(W)的近似对细胞进行实时分选的光谱解混的比较。
具体实施方式
本公开的方面包括用于对来自样本中具有重叠的荧光光谱的荧光团的光进行光谱解析的方法。根据某些实施例的方法包括利用光探测系统来探测来自具有多个荧光团的样本中的光，该多个荧光团具有重叠的荧光光谱，并包括对来自样本中每个荧光团的光进行光谱解析。在一些实施例中，方法包括估算样本中(诸如颗粒上)的一个或更多个荧光团的丰度。在某些情况下，方法包括基于每个荧光团的丰度来识别样本中的颗粒，并对颗粒进行分选。根据一些实施例的方法包括通过计算每个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵，从而对来自每个荧光团的光进行光谱解析。还提供了用于实践本主题方法的系统和集成电路设备(例如，现场可编程门阵列)。
在更详细地描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施例，因为这些实施例当然可以发生变化。还应理解，本文中所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并且不旨在限制本发明，因为本发明的范围仅由所附权利要求书限定。
在提供数值范围的情况下，应当理解，在该范围上限值与下限值之间的每个中间值(除非上下文另有明确规定了到下限值单位的十分之一)以及该所述范围内的任何其他所述值或中间值，都涵盖在本发明内。这些较小范围的上限值和下限值可以独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在本发明内，但要遵守所述范围内任何明确排除的限值。当所述范围包括一个或两个限值时，排除那些所包括限值中任一个或两个的范围也包括在本发明中。
本文提供的某些范围的数值之前带有术语“约”。术语“约”在本文中用于为其后的确切数字以及与该术语后的数字相接近或近似的数字来提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体列举的数字时，相接近或近似的未列举数字可以是该数字，即在给出数字的上下文中，该数字提供了具体列举的数字的基本等同形式。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员之一通常理解的含义相同的含义。尽管类似于或等同于本文描述那些方法和材料的任何方法和材料也能够用于本发明的实践或测试中，但是现在描述代表性的说明性方法和材料。
本说明书中引证的所有出版物和专利均通过引用并入本文，就如同每个单个出版物或专利均被具体且单个地指出要通过引用并入本文一样，并且该所有出版物和专利通过引用并入本文以公开并描述与所引证出版物相关的方法和/或材料。引证的任何出版物的公开均在本申请日之前，并且不应解释为承认由于在先发明，本发明无权优于此类出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，该实际出版日期可能需要独立确认。
应当注意，除非上下文另外明确指出，否则如本文和所附权利要求书中所使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示。还应注意，权利要求书可以撰写为排除任何可选元素。这样，该陈述旨在作为使用诸如“单独”、“仅”等与权利要求元素的列举相关联的排他性术语的引用基础或使用“否定性”限制的引用基础。
对于本领域技术人员而言，在阅读本公开后将显而易见的是，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，本文所描述并示出的每个单个实施例都具有离散的组件和特征，这些组件和特征可以与任一个其他几个实施例中的特征容易地分隔或组合在一起。任何所列举的方法都能够以所列举事件的顺序或者以在逻辑上可能的任何其他顺序来执行。
虽然为了语法流畅性起见，已经或将要利用功能性解释来描述该装置和方法，但应明确理解，除非根据美国专利法35U.S.C.§112明确规定，否则权利要求不应解释为以任何方式受到“手段”或“步骤”限制的构造的必要限制，而应在司法等同原则下被赋予权利要求所定义的全部含义和等同含义，并且在权利要求是根据美国专利法35U.S.C.§112明确提出的情况下，则应根据美国专利法35U.S.C.§112赋予该权利要求全部法定等同含义。
如上所述，本公开提供了用于对样本中的荧光团进行光谱解析的方法。在本公开的进一步描述的实施例中，首先更详细地描述了用于对样本中的荧光团进行光谱解析的方法，该方法包括估算样本中(例如，样本中的颗粒上)的每个荧光团的丰度，并且包括基于每个荧光团所估算的丰度来识别和分选颗粒。接下来描述了编程为通过计算光谱解混矩阵来实践本主题方法的系统和集成电路设备。
用于对来自样本中具有重叠的荧光光谱的荧光团的光进行光谱解析的方法
本公开的方面包括用于对来自样本中的荧光团的光进行光谱解析的方法，该荧光团的光包括具有重叠的荧光光谱的光。术语“光谱解析”在本文中以其常规含义来使用，即是指通过将光的重叠波长分配或归类到每个起作用的荧光团，来对样本中的每个荧光团进行光谱区分。在实施例中，通过计算光谱解混矩阵来进行确定归类到每个荧光团的荧光的重叠光谱组分(如以下更详细描述的)。在一些实施例中，目标样本具有多个荧光团，其中每个荧光团的荧光光谱都与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠。在一些情况下，每个荧光团的荧光光谱都与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠5nm或更多，诸如重叠10nm或更多、诸如重叠25nm或更多并且包括重叠50nm或更多。在某些情况下，样本中一个或更多个荧光团的荧光光谱与样本中两个或更多个不同荧光团的荧光光谱重叠，诸如其中荧光光谱的每个都重叠5nm或更多，诸如重叠10nm或更多、诸如重叠25nm或更多并且包括重叠50nm或更多。在其他实施例中，目标样本包括具有不重叠的荧光光谱的多个荧光团。在这些实施例中，每个荧光团的荧光光谱与至少一个其他荧光团相邻为10nm或以下，诸如9nm或以下、诸如8nm或以下、诸如7nm或以下、诸如6nm或以下、诸如5nm或以下、诸如4nm或以下、诸如3nm或以下、诸如2nm或以下并且包括1nm或以下。
在实践本主题方法时，利用光源来照射样本，并利用具有多个光电探测器的光探测系统来探测来自样本的光。在一些实施例中，样本是生物样本。术语“生物样本”以其常规含义来使用，即是指在某些情况下可能存在于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、支气管肺泡灌洗液、羊水、羊膜脐血、尿液、阴道液和精液中的整个生物体、植物、真菌或动物组织、细胞或组成部分的子集。这样，“生物样本”既指天然生物体或其组织的子集，也指从该生物体或其组织的子集中制备的匀浆、裂解物或提取物，其包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、部分皮肤、部分呼吸道、部分胃肠道、部分心血管和部分泌尿生殖道、眼泪、唾液、奶、血细胞、肿瘤、器官。生物样本可以是任何类型的生物组织，既包括健康组织又包括患病组织(例如癌性、恶性、坏死性组织等)。在某些实施例中，生物样本是液体样本，诸如血液或其衍生物，例如血浆、眼泪、尿液、精液等，其中在一些情况下，样本是血液样本，包括全血，诸如从静脉穿刺或指尖获取的血液(其中血液在测定前可能会或可能不会与任何试剂，诸如防腐剂、抗凝剂等相结合)
在某些实施例中，样本的来源是“哺乳动物”或“哺乳类”，其中这些术语广泛地用于描述哺乳动物类别内的生物体，包括食肉动物(例如狗和猫)、啮齿类动物(例如小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长类动物(例如人、黑猩猩和猴子)。在一些情况下，受试者是人类。所述方法可以施加到从两性和任何成长阶段(即新生儿、婴儿、少年、青少年、成人)的人类受试者那里获得的样本，其中在某些实施例中，人类受试者是少年、青少年或成人。尽管本发明可以施加到来自人类受试者的样本，但是应当理解，该方法也可以在来自其他动物受试者(即在“非人类受试者”中)的样本上执行，诸如但不限于鸟类、小鼠、大鼠、狗、猫、家畜和马。
在实践本主题方法时，利用来自光源的光来照射(例如，在流式细胞仪的流中的)样本。在一些实施例中，光源是宽波段光源，其发射具有宽范围波长的光，例如跨度为50nm或更大，诸如100nm或更大、诸如150nm或更大、诸如200nm或更大、诸如250nm或更大、诸如300nm或更大、诸如350nm或更大、诸如400nm或更大并且包括跨度为500nm或更大。例如，一种合适的宽波段光源发射具有从200nm至1500nm波长的光。合适的宽波段光源的另一示例包括发射具有从400nm至1000nm波长的光的光源。在方法包括利用宽波段光源来进行照射的情况下，关注的宽波段光源方案可能包括但不限于卤素灯、氘弧灯、氙弧灯、稳定化的光纤连接宽波段光源、带有连续光谱的宽波段LED、超发光二极管、半导体发光二极管、宽光谱LED白光源、多LED集成白光源以及其他宽波段光源或它们的任何组合。
在其他实施例中，方法包括利用发射特定波长或窄波长范围的窄波段光源来进行照射，诸如利用在如50nm或更小范围波长的窄范围内发射光的光源来进行照射，该窄范围还诸如40nm或更小、诸如30nm或更小、诸如25nm或更小、诸如20nm或更小、诸如15nm或更小、诸如10nm或更小、诸如5nm或更小、诸如为2nm或更小并且包括发射特定波长光(即单色光)的光源。在方法包括利用窄波段光源进行照射的情况下，关注的窄波段光源方案可以包括但不限于窄波长LED、激光二极管或耦接到一个或更多个光学带通滤波器、衍射光栅、单色仪或其任何组合的宽波段光源。
在某些实施例中，方法包括利用一个或更多个激光器来照射样本。如上所述，激光器的类型和数量将根据样本以及收集的所需光变化，并且可以是气体激光器，诸如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮气激光器、CO2激光器、CO激光器、氩氟(ArF)准分子激光器、氪氟(KrF)准分子激光器、氙氯(XeCl)准分子激光器或氙氟(XeF)准分子激光器或者是它们的组合。在其他情况下，该方法包括利用染料激光器(诸如二苯乙烯、香豆素或若丹明激光器)来照射束流。在其他情况下，方法包括利用金属蒸气激光器来照射束流，该金属蒸气激光器诸如氦-镉(HeCd)激光器、氦-汞(HeHg)激光器、氦-硒(HeSe)激光器、氦-银(HeAg)激光器、锶激光器、氖铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及其组合。在其他情况下，方法包括利用固态激光器来照射束流，该固态激光器诸如红宝石激光器、Nd：YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er：YAG激光器、Nd：YLF激光器、Nd：YVO4激光器、Nd：YCa4O(BO3)3激光器、Nd：YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、Tm：YAG激光器(thulim YAG laser)、Yb：YAG激光器(ytterbium YAG laser)、Yb2O3激光器或铈掺杂激光器以及其组合。
可以利用一个或更多个上述光源来照射样本，该光源为诸如2个或更多个光源、诸如3个或更多个光源、诸如4个或更多个光源、诸如5个或更多个光源并且包括10个或更多个光源。光源可以包括多类型光源的任何组合。例如，在一些实施例中，该方法包括利用激光器阵列来照射束流中的样本，该激光器阵列诸如具有一个或更多个气体激光器、一个或更多个染料激光器以及一个或更多个固态激光器的阵列。
可以利用200nm至1500nm的波长来照射样本，该波长诸如为250nm至1250nm、诸如为300nm至1000nm、诸如为350nm至900nm并且包括为400nm至800nm。例如，在光源是宽波段光源的情况下，可以利用200nm至900nm的波长来照射样本。在其他情况下，在光源包括多个窄波段光源的情况下，可以利用200nm至900nm范围内的特定波长来照射样本。例如，光源可以是多个窄波段LED(1nm–25nm)，每个窄波段LED独立地发射出波长范围为200nm至900nm的光。在其他实施例中，窄波段光源包括一个或更多个激光器(诸如激光器阵列)，并且利用200nm至700nm范围内的特定波长来照射样本，诸如利用具有如上所述的气体激光器、准分子激光器、染料激光器、金属蒸气激光器和固态激光器的激光器阵列来照射样本。
在采用一个以上光源的情况下，可以同步地或顺序地或以其组合的方式利用光源来照射样本。例如，可以用光源中的每个同时照射样本。在其他实施例中，利用光源中的每个来顺序地照射束流。在采用一个以上光源来顺序地照射样本的情况下，每个光源照射样本的时间可以独立地为0.001微秒或更多，诸如0.01微秒或更多、诸如0.1微秒或更多、诸如1微秒或更多、诸如5微秒或更多、诸如10微秒或更多、诸如30微秒或更多并且包括60微秒或更多。例如，方法可以包括利用光源(例如激光器)来照射样本以持续0.001微秒至100微秒，诸如持续0.01微秒至75微秒、诸如持续0.1微秒至50微秒、诸如持续1微秒至25微秒并且包括5微秒至10微秒。在利用两个或更多个光源来顺序地照射样本的实施例中，由每个光源所照射的持续时间可以相同或不同。
每个光源的照射之间的时间段也可以根据需要来变化，其间隔为0.001微秒或更多，诸如为0.01微秒或更多、诸如为0.1微秒或更多、诸如为1微秒或更多、诸如为5微秒或更多、诸如为10微秒或更多、诸如为15微秒或更多、诸如为30微秒或更多并且包括60微秒或更多。例如，每个光源的照射之间的时间段可以为0.001微秒至60微秒、诸如为0.01微秒至50微秒、诸如为0.1微秒至35微秒、诸如为1微秒至25微秒并且包括5微秒至10微秒。在某些实施例中，每个光源的照射之间的时间段是10微秒。在通过两个以上(即3个或更多个)光源来顺序地照射样本的实施例中，每个光源的照射之间的延迟可以相同或不同。
样本可以连续或以离散的间隔来进行照射。在一些情况下，方法包括利用光源来连续地照射样本中的样本。在其他情况下，利用光源以不离散的间隔来照射样本，诸如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒并且包括每1000毫秒或者其他间隔来进行照射。
根据光源，可以从一定距离来照射样本，该距离诸如为0.01mm或更大、诸如为0.05mm或更大、诸如为0.1mm或更大、诸如为0.5mm或更大、诸如为1mm或更大、诸如为2.5mm或更大、诸如为5mm或更大、诸如为10mm或更大、诸如为15mm或更大、诸如为25mm或更大并且包括为50mm或更大。而且，角度或照射也可以变化，范围为10°至90°，诸如为15°至85°、诸如为20°至80°、诸如为25°至75°并且包括为30°至60°，例如为90°角。
在某些实施例中，方法包括利用两个或更多个频移光束来照射样本。如上所述，可以采用光束产生器组件以使其具有激光器和用于使激光频移的声光设备。在这些实施例中，方法包括利用激光器来照射声光设备。根据在输出激光束中产生的光的所需波长(例如，以用于照射束流中的样本)，激光器的特定波长的变化范围可以为200nm至1500nm，诸如为250nm至1250nm、诸如为300nm至1000nm、诸如为350nm至900nm并且包括为400nm至800nm。可以利用一个或更多个激光器来照射声光设备，诸如利用2个或更多个激光器、诸如利用3个或更多个激光器、诸如利用4个或更多个激光器、诸如利用5个或更多个激光器并且包括利用10个或更多个激光器。激光器可以包括多类型激光器的任何组合。例如，在一些实施例中，该方法包括利用激光器阵列来照射声光设备，该激光器阵列诸如为具有一个或更多个气体激光器、一个或更多个染料激光器以及一个或更多个固态激光器的阵列。
在采用一个以上激光器的情况下，可以同步地或顺序地或以其组合的方式利用激光器来照射声光设备。例如，可以利用激光器中的每个来同步地照射声光设备。在其他实施例中，利用激光器中的每个来顺序地照射声光设备。在采用一个以上激光器来顺序地照射声光设备的情况下，每个激光器照射声光设备的时间可以独立地为0.001微秒或更多，诸如0.01微秒或更多、诸如0.1微秒或更多、诸如1微秒或更多、诸如5微秒或更多、诸如10微秒或更多、诸如30微秒或更多并且包括60微秒或更多。例如，方法可以包括利用激光器来照射声光设备以持续0.001微秒至100微秒，诸如持续0.01微秒至75微秒、诸如持续0.1微秒至50微秒、诸如持续1微秒至25微秒并且包括5微秒至10微秒。在利用两个或更多个激光器来顺序地照射声光设备的实施例中，每个激光器照射声光设备的持续时间可以相同或不同。
每个激光器的照射之间的时间段也可以根据需要来变化，其间隔为0.001微秒或更多，诸如为0.01微秒或更多、诸如为0.1微秒或更多、诸如为1微秒或更多、诸如为5微秒或更多、诸如为10微秒或更多、诸如为15微秒或更多、诸如为30微秒或更多并且包括60微秒或更多。例如，每个光源的照射之间的时间段可以为0.001微秒至60微秒，诸如为0.01微秒至50微秒、诸如为0.1微秒至35微秒、诸如为1微秒至25微秒，并且包括为5微秒至10微秒。在某些实施例中，每个激光器的照射之间的时间段是10微秒。在通过两个以上(即3个或更多个)激光器来顺序地照射声光设备的实施例中，每个激光器的照射之间的延迟可以相同或不同。
声光设备可以连续或以离散的间隔来进行照射。在一些情况下，方法包括利用激光器来连续地照射声光设备。在其他情况下，利用激光器以离散的间隔来照射声光设备，诸如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒并且包括每1000毫秒，或者以其他间隔来进行照射。
根据激光器，可以从一定距离来照射声光设备，该距离诸如为0.01mm或更大、诸如为0.05mm或更大、诸如为0.1mm或更大、诸如为0.5mm或更大、诸如为1mm或更大、诸如为2.5mm或更大、诸如为5mm或更大、诸如为10mm或更大、诸如为15mm或更大、诸如为25mm或更大并且包括50mm或更大。而且，角度或照射也可以变化，范围为10°至90°(例如为90°角)，诸如为15°至85°、诸如为20°至80°、诸如为25°至75°并且包括为30°至60°。
在实施例中，方法包括将射频驱动信号施加到声光设备以产生角度偏转的激光束。可以将两个或更多个射频驱动信号施加到声光设备，以产生带有期望数量的角度偏转激光束的输出激光束，诸如施加3个或更多个射频驱动信号、诸如施加4个或更多个射频驱动信号、诸如施加5个或更多射频驱动信号、诸如施加6个或更多射频驱动信号、诸如施加7个或更多射频驱动信号、诸如施加8个或更多个射频驱动信号、诸如施加9个或更多个射频驱动信号、诸如施加10个或更多个射频驱动信号、诸如施加15个或更多个射频驱动信号、诸如施加25个或更多的射频驱动信号、诸如施加50个或更多个射频驱动信号并且包括施加100个或更多个射频驱动信号。
由射频驱动信号所产生的角度偏转激光束分别具有基于所施加射频驱动信号的振幅的强度。在一些实施例中，方法包括施加射频驱动信号，该射频驱动信号具有足以产生所期望强度的角度偏转激光束的振幅。在一些情况下，每个所施加的射频驱动信号的振幅独立地为约0.001V至约500V，诸如为约0.005V至约400V、诸如为约0.01V至约300V、诸如为约0.05V至约200V、诸如为约0.1V至约100V、诸如为约0.5V至约75V、诸如为约1V至50V、诸如为约2V至40V、诸如为3V至约30V并且包括为约5V至约25V。在一些实施例中，每个所施加的射频驱动信号的频率为约0.001MHz至约500MHz，诸如为约0.005MHz至约400MHz、诸如为约0.01MHz至约300MHz、诸如为约0.05MHz至约200MHz、诸如为约0.1MHz至约100MHz、诸如为约0.5MHz至约90MHz、诸如为约1MHz至约75MHz、诸如为约2MHz至约70MHz、诸如为约3MHz至约65MHz、诸如为约4MHz至约60MHz并且包括为约5MHz至约50MHz。
在这些实施例中，输出激光束中的角度偏转激光束在空间上是分隔开的。根据所施加的射频驱动信号和输出激光束的期望照射曲线，角度偏转的激光束可以分隔开0.001μm或更多，诸如分隔开0.005μm或更多、诸如分隔开0.01μm或更多、诸如分隔开0.05μm或更多、诸如分隔开0.1μm或更多、诸如分隔开0.5μm或更多、诸如分隔开1μm或更多、诸如分隔开5μm或更多、诸如分隔开10μm或更多、诸如分隔开100μm或更多、诸如分隔开500μm或更多、诸如分隔开1000μm或更多并且包括分隔开5000μm或更多。在一些实施例中，角度偏转激光束沿着输出激光束的水平轴线与诸如相邻的角度偏转激光束重叠。相邻的角度偏转激光束之间的重叠(诸如束斑的重叠)可以是重叠0.001μm或更多，诸如重叠0.005μm或更多、诸如重叠0.01μm或更多、诸如重叠0.05μm或更多、诸如重叠0.1μm或更多、诸如重叠0.5μm或更多、诸如重叠1μm或更多、诸如重叠5μm或更多、诸如重叠10μm或更多并且包括重叠100μm或更多。
在某些情况下，利用多个频移光束来照射束流，并通过使用射频标记发射(FIRE)来进行荧光成像从而对束流中的细胞进行成像以生成频率编码图像，诸如Diebold等人在《自然光子学(Nature Photonics)》第7卷(10)806-810页(2013)中所描述的那些，和第9423353；9784661和10006852号美国专利以及第2017/0133857和2017/0350803号美国专利公开中所描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。
如上所述，在实施例中，将来自被照射样本的光传输到光探测系统，并由多个光电探测器来进行测量，如下面更详细描述的。在一些实施例中，方法包括测量在一定波长范围内(例如200nm至1000nm)的收集的光。例如，方法可以包括收集200nm至1000nm波长范围中一个或更多个的光的光谱。在其他实施例中，方法包括测量在一个或更多个特定波长处收集的光。例如，可以在450nm、518nm、519nm、561nm、578nm、605nm、607nm、625nm、650nm、660nm、667nm、670nm、668nm、695nm、710nm、723nm、780nm、785nm、647nm、617nm及其任何组合中的一个或更多个处来测量所收集的光。在某些实施例中，方法包括测量与荧光团的荧光峰值波长相对应的光的波长。在一些实施例中，方法包括测量样本中每个荧光团的整个荧光光谱的收集的光。
所收集的光可以以连续或以离散的间隔来进行测量。在一些情况下，方法包括连续地进行光的测量。在其他情况下，以离散的间隔来测量光，诸如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒并且包括每1000毫秒，或者以其他间隔来测量光。
所收集的光的测量可以在主题方法期间进行一次或更多次，诸如2次或更多次、诸如3次或更多次、诸如5次或更多次并且包括10次或更多次。在某些实施例中，将光传播测量两次或更多次，在某些情况下将该数据平均。
来自样本的光可以在一个或更多个波长下进行测量，诸如在5个或更多个不同波长下、诸如在10个或更多个不同波长下、诸如在25个或更多个不同波长下、诸如在50个或更多个不同波长下、诸如在100个或更多个不同波长下、诸如在200个或更多个不同波长下、诸如在300个或更多个不同波长下并且包括在400个或更多个不同波长下测量所收集的光。
在实施例中，方法包括对来自样本中每个荧光团的光进行光谱解析。在一些实施例中，确定了每个不同荧光团之间的重叠，并计算了每个荧光团对重叠荧光的贡献。在一些实施例中，对来自每个荧光团的光进行光谱解析包括针对由光探测系统所探测到的样本中具有重叠荧光的多个荧光团中的每个来计算荧光光谱的光谱解混矩阵。如以下更详细描述的，对来自每个荧光团的光进行光谱解析并计算每个荧光团的光谱解混矩阵可以用于估算样本中每个荧光团的丰度。在某些实施例中，可以确定与目标颗粒相关联的每个荧光团的丰度。与目标颗粒相关联的每个荧光团的丰度可以用于识别颗粒并将其分类。在一些情况下，经识别或分类的颗粒可以用于对样本中的目标颗粒(例如细胞)进行分选。在某些实施例中，诸如通过计算光谱解混，来对样本中的荧光团进行光谱解析，以使得分选足够快以在光探测系统进行探测之后实时地分选颗粒。
在一些实施例中，对来自具有重叠荧光的每个荧光团的光进行光谱解析包括使用加权最小二乘算法来计算光谱解混矩阵。在一些情况下，加权最小二乘算法是根据下式来计算的：
其中，y是光探测系统的多个光电探测器针对每个细胞测量的探测器值；
是所估算的荧光团丰度；X是溢出；并且W是
在一些实施例中，根据下式来计算每个Wii：
其中σi 2是探测器i处的方差；yi是探测器i处的信号；并且λi是探测器i处的恒定噪声。在某些实施例中，光谱解混矩阵根据下式来计算：(XTWX)-1XTW。在一些情况下，该方法包括针对由光探测系统所探测到的每个细胞来对(XTWX)求逆，以计算光谱解混矩阵。
在某些实施例中，方法包括针对由光探测系统所探测到的每个细胞在加权最小二乘算法中近似对(XTWX)求逆。在一些实施例中，对(XTWX)求逆包括根据下式使用迭代Newton-Raphson计算来近似(XTWX)：
A-1＝(XTWX)-1；
其中WG是W的预定近似值，该W是根据光探测系统中的每个光电探测器的方差来确定的。在一些实施例中，方法还包括估算每个光电探测器的方差。在一些情况下，方法包括使用单染色对照样本来确定光电探测器噪声分量(例如，电子噪声、背景光等)。在某些情况下，方法包括在利用光源照射样本之前，确定每个光电探测器的方差。在其他情况下，方法包括在利用光源照射样本之前，确定W的预定近似值WG。在某些实施例中，方法包括利用预定近似值WG来预计算A0 -1。在这些实施例中，针对由光探测系统所探测到的每个颗粒，都可以将预计算出的A0 -1用作A-1的第一近似值。
在其他实施例中，用于对来自每个荧光团的光进行光谱解析的方法包括使用Sherman-Morrison迭代逆更新器。在一些情况下，方法包括使用Sherman-Morrison公式来计算A：
在某些情况下，方法包括使用Sherman-Morrison公式来预计算A0 -1以计算A0扰动的逆。在一些实施例中，通过公式XTW0X来计算A0的逆，并且通过公式XTWX来计算A的逆。在一些情况下，方法包括根据下式来计算ΔA(即A-A0)作为列向量与每个迭代W的乘积：
其中Wii＝w0 ii+αi，其中i∈[1，ND]。
根据实施例，ΔAi＝XTΔWiX＝αjmimi T，其中A能够表示为：
在这些实施例中，能够使用对每个wi的改变，利用每个新的加权矩阵W(即带有与W0不同的值)根据A0来重新计算每个A。在一些实施例中，方法包括实施Sherman-Morrison迭代逆更新器，以根据下式来近似光谱解混矩阵：
在一些实施例中，用于A0 -1的预计算的值被用于计算A1 -1。然后预计算的Al -1用于计算A2 -1。能够通过使用从i＝1到ND的每个(Ai-1)-1来重复计算Ai -1，从而计算值A-1。
在一些实施例中，用于对来自每个荧光团的光进行光谱解析的方法包括通过矩阵分解(即，因式分解)来计算加权最小二乘算法。在某些情况下，方法包括LU矩阵分解，诸如其中将矩阵分解为下三角(L)矩阵和上三角(U)矩阵的乘积。在某些情况下，LU分解包括高斯消除。在其他情况下，LU分解包括修正的Cholesky分解、LDL分解，其中D是对角矩阵。在某些实施例中，加权最小二乘算法(a)是根据下式使用修正的Cholesky分解来计算的：
XTWXa＝XTWy
Aa＝B
LDLTa＝B LDL分解
Lz＝B其中z＝DLTa 下三角矩阵解
Dx＝z其中x＝LTa 对角矩阵解
LTa＝x 上三角矩阵解
在其他实施例中，用于对来自每个荧光团的光进行光谱解析的方法包括通过QR因式分解来计算加权最小二乘算法。在一些情况下，QR因式分解是矩阵，该矩阵是正交(Q)矩阵和上三角(R)矩阵的乘积。在一些实施例中，加权最小二乘算法(a)是根据下式使用QR因式分解来计算的：
XTWXa＝XTWy
在其他实施例中，用于对来自每个荧光团的光进行光谱解析的方法包括通过奇异值分解(SVD)来计算加权最小二乘算法。在一些情况下，奇异值分解是矩阵，该矩阵是乘积
其中U和V是正交矩阵，并且∑是含有
奇异值的对角矩阵。在某些情况下，加权最小二乘算法(a)是根据下式使用奇异值分解来计算的：
z＝UTy
∑w＝z
a＝Vw
在一些实施例中，方法包括通过对每个荧光团的光进行光谱解析来计算样本中一个或更多个荧光团的丰度。在某些情况下，对与颗粒相关联的每个荧光团的光进行光谱解析来计算与目标颗粒相关联(例如，化学相关(即，共价、离子)或物理相关)的荧光团的丰度。例如，在一个示例中，对每个荧光团的光进行光谱解析来计算与目标颗粒相关联的每个荧光团的相对丰度。在另一示例中，对每个荧光团的光进行光谱解析来计算与目标颗粒相关联的每个荧光团的绝对丰度。在某些实施例中，可以基于确定为与颗粒相关联的每个荧光团的相对丰度来对颗粒进行识别或分类。在这些实施例中，可以通过任何方便的方案来对颗粒进行识别或分类，诸如通过：将与颗粒相关联的每个荧光团的相对或绝对丰度与具有已知一致性颗粒的对照样本进行比较；或者通过对具有相关联的荧光团所计算出的相对或绝对丰度的颗粒(例如细胞)群体进行光谱或其他测定分析。
在某些实施例中，方法包括对样本的一个或更多个颗粒(例如，细胞)进行分选，基于与颗粒相关联的荧光团估算出的丰度来对样本进行识别。术语“分选”在本文中以其常规含义使用，即是指样本的分离成分(例如，含有细胞的液滴、含有非细胞性颗粒(诸如生物大分子)的液滴)，并且在一些情况下将所分离的成分传输到一个或更多个样本收集容器。例如，方法可以包括分选样本的2个或更多个组分，诸如分选3个或更多个组分、诸如分选4个或更多个组分、诸如分选5个或更多个组分、诸如分选10个或更多个组分、诸如分选15个或更多个组分并且包括分选样本的25个或更多个组分。
在对基于与颗粒相关联的荧光团的丰度所识别的颗粒进行分选时，方法包括诸如利用计算机来进行数据采集、分析和记录，其中多个数据信道记录来自每个探测器的数据，这些探测器用于获得与颗粒相关联的多个荧光团的重叠光谱。在这些实施例中，分析包括(例如通过计算光谱解混矩阵)对来自具有重叠光谱的与颗粒相关联的多个荧光团的光进行光谱解析，并基于与颗粒相关联的每个荧光团所估算的丰度来识别颗粒。该分析可以传送到分选系统，该分选系统配置为基于颗粒分类来生成一组数字化参数。
在一些实施例中，用于对样本组分进行分选的方法包括利用具有偏转板的颗粒分选模块来对颗粒(例如，生物样本中的细胞)进行分选，诸如在2017年3月28日提交的第2017/0299493号美国专利公开文本中所描述的，其公开内容通过引用并入本文。在某些实施例中，使用具有多个分选决定单元的分选决定模块来对样本的细胞进行分选，所述分选决定单元为诸如在2019年2月8日提交的第62/803,264号美国临时专利申请中所描述的，其公开内容通过引用并入本文。
用于对来自样本中具有重叠的荧光光谱的荧光团的光进行光谱解析的系统
如上所述，本公开的方面包括用于对来自样本中具有重叠的荧光光谱的荧光团的光进行光谱解析的系统。如上所述，术语“光谱解析”在本文中以其常规含义来使用，即是指通过将光的重叠波长分配或归类到每个起作用的荧光团来对样本中的每个荧光团进行光谱区分。在实施例中，归类到每个荧光团的荧光的重叠光谱分量通过计算光谱解混矩阵来进行确定。在实施例中，本主题系统用于表征具有多个荧光团的样本，其中每个荧光团的荧光光谱都与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠。在一些情况下，每个荧光团的荧光光谱都与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠5nm或更大，诸如重叠10nm或更大、诸如重叠25nm或更大并且包括重叠50nm或更大。在某些情况下，样本中一个或更多个荧光团的荧光光谱与样本中两个或更多个不同荧光团的荧光光谱重叠，诸如其中荧光光谱的每个都重叠5nm或更多、诸如重叠10nm或更多、诸如重叠25nm或更多并且包括重叠50nm或更多。在实施例中，系统包括配置为照射样本的光源，该样本具有多个荧光团，其中每个荧光团的荧光光谱都与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠。在实施例中，光源可以是任何合适的宽波段或窄波段的光。根据样本中的组分(例如，细胞、微珠、非细胞性颗粒等)，光源可以配置为发射波长在200nm至1500nm范围内变化的光，该范围诸如为250nm至1250nm、诸如为300nm至1000nm、诸如为350nm至900nm并且包括为400nm至800nm。例如，光源可以包括宽波段光源，其发射具有从200nm至900nm波长的光。在其他情况下，光源包括窄波段光源，其发射波长范围为200nm至900nm的光。例如，光源可以是窄波段LED(1nm–25nm)，其发射波长范围为200nm至900nm的光。在某些实施例中，光源是激光器。在一些情况下，本主题系统包括气体激光器，诸如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮气激光器、CO2激光器、CO激光器、氩氟(ArF)准分子激光器、氪氟(KrF)准分子激光器、氙氯(XeCl)准分子激光器或氙氟(XeF)准分子激光器或者是它们的组合。在其他情况下，本主题系统包括染料激光器(诸如二苯乙烯、香豆素或罗丹明激光器)。在其他情况下，关注的激光器包括金属蒸气激光器，诸如氦-镉(HeCd)激光器、氦-汞(HeHg)激光器、氦-硒(HeSe)激光器、氦-银(HeAg)激光器、锶激光器、氖铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及其组合。在其他情况下，本主题系统包括固态激光器，诸如红宝石激光器、Nd：YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er：YAG激光器、Nd：YLF激光器、Nd：YVO4激光器、Nd：YCa4O(BO3)3激光器、Nd：YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、Tm：YAG激光器、Yb：YAG激光器、Yb2O3(ytterbium2O3)激光器或铈掺杂激光器以及其组合。
在其他实施例中，光源是非激光器光源，诸如灯，包括但不限于卤素灯、氘弧灯、氙弧灯，发光二极管，诸如带有连续光谱的宽波段LED、超发光二极管、半导体发光二极管、宽光谱LED白光源、集成的多LED。在一些情况下，非激光器光源是稳定的光纤耦合宽波段光源、白光源以及其他光源或者是它们的任何组合。
光源可以定位成与样本(例如，流式细胞仪中的束流)相距任何合适的距离，诸如与束流相距0.001mm或更多、诸如0.005mm或更多、诸如0.01mm或更多、诸如0.05mm或更多、诸如0.1mm或更多、诸如0.5mm或更多、诸如1mm或更多、诸如5mm或更多、诸如10mm或更多，诸如25mm或更多并且包括相距100mm或更多。另外，光源以任何合适的角度(例如，相对于束流的竖直轴线)来照射样本，诸如以10°至90°的角度(例如以90°的角度)，诸如以15°至85°的角度、诸如以20°至80°的角度、诸如以25°至75°的角度并且包括以30°至60°的角度。
光源可以配置为连续地或以离散的间隔来照射样本。在一些情况下，系统包括配置为连续地照射样本的光源，诸如利用在流式细胞仪中的探询点处来连续地照射束流的连续波激光器。在其他情况下，关注的系统包括配置为以离散的间隔来照射样本的光源，该离散的间隔诸如为每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒并且包括每1000毫秒，或者为其他间隔。在将光源配置为以离散的间隔来照射样本的情况下，系统可以包括一个或更多个附加组件以利用光源来提供对样本的间歇照射。例如，在这些实施例中的主题系统可以包括一个或更多个激光斩波器、手动或计算机控制的光阑以用于阻隔样本和将样本暴露于光源。
在一些实施例中，光源是激光器。关注的激光器可以包括脉冲激光器或连续波激光器。例如，该激光器可以是气体激光器，诸如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮气激光器、CO2激光器、CO激光器、氩氟(ArF)准分子激光器、氪氟(KrF)准分子激光器、氙氯(XeCl)准分子激光器或氙氟(XeF)准分子激光器或者是它们的组合；染料激光器，诸如二苯乙烯、香豆素或罗丹明激光器；金属蒸气激光器，诸如氦-镉(HeCd)激光器、氦-汞(HeHg)激光器、氦-硒(HeSe)激光器、氦-银(HeAg)激光器、锶激光器、氖铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器以及其组合；固态激光器，诸如红宝石激光器、Nd：YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er：YAG激光器、Nd：YLF激光器、Nd：YVO4激光器、Nd：YCa4O(BO3)3激光器、Nd：YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、Tm：YAG激光器、Yb：YAG激光器、Yb2O3激光器或铈掺杂激光器以及其组合；半导体二极管激光器、光泵浦半导体激光器(OPSL)，或者是任何上述激光器的倍频或三倍频的实现方式。
在某些实施例中，光源是配置为生成两个或更多个频移光光束的光束生成器。在一些情况下，该光束生成器包括激光器、射频发生器，其配置为向声光设备施加射频驱动信号以生成两个或更多个角度偏转的激光束。在这些实施例中，激光器可以是脉冲激光器或连续波激光器。例如，关注的光束生成器中的激光器可以是气体激光器，诸如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮气激光器、CO2激光器、CO激光器、氩氟(ArF)准分子激光器、氪氟(KrF)准分子激光器、氙氯(XeCl)准分子激光器或氙氟(XeF)准分子激光器或者是它们的组合；染料激光器，诸如二苯乙烯、香豆素或罗丹明激光器；金属蒸气激光器，诸如氦-镉(HeCd)激光器、氦-汞(HeHg)激光器、氦-硒(HeSe)激光器、氦-银(HeAg)激光器、锶激光器、氖铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器以及其组合；固态激光器，诸如红宝石激光器、Nd：YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er：YAG激光器、Nd：YLF激光器、Nd：YVO4激光器、Nd：YCa4O(BO3)3激光器、Nd：YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、Tm：YAG激光器、Yb：YAG激光器、Yb2O3激光器或铈掺杂激光器以及其组合。
声光设备可以是配置为使用所施加声波来使激光发生频移的任何方便的声光方案。在某些实施例中，声光设备是声光偏转器。将本主题系统中的声光设备配置为根据来自激光器的光和所施加的射频驱动信号来生成角度偏转的激光束。可以利用任何合适的射频驱动信号源来将射频驱动信号施加到声光设备，该合适的射频驱动信号源诸如为直接数字合成器(DDS)、任意波形生成器(AWG)或电脉冲生成器。
在实施例中，将控制器配置为将射频驱动信号施加到声光设备以在输出激光束中产生期望数量的角度偏转激光束，诸如配置为施加3个或更多个射频驱动信号、诸如施加4个或更多个射频驱动信号、诸如施加5个或更多射频驱动信号、诸如施加6个或更多射频驱动信号、诸如施加7个或更多射频驱动信号、诸如施加8个或更多个射频驱动信号、诸如施加9个或更多个射频驱动信号、诸如施加10个或更多个射频驱动信号、诸如施加15个或更多个射频驱动信号、诸如施加25个或更多的射频驱动信号、诸如施加50个或更多个射频驱动信号并且包括配置为施加100个或更多个射频驱动信号。
在一些情况下，为了在输出激光束中产生角度偏转激光束的强度曲线，控制器被配置为施加射频驱动信号，该射频驱动信号的振幅诸如为约0.001V至约500V、诸如为约0.005V至约400V、诸如为约0.01V至约300V、诸如为约0.05V至约200V、诸如为约0.1V至约100V、诸如为约0.5V至约75V、诸如为约1V至50V、诸如为约2V至40V、诸如为3V至约30V并且包括为约5V至约25V。在一些实施例中，每个所施加的射频驱动信号的频率为约0.001MHz至约500MHz，诸如为约0.005MHz至约400MHz、诸如为约0.01MHz至约300MHz、诸如为约0.05MHz至约200MHz、诸如为约0.1MHz至约100MHz、诸如为约0.5MHz至约90MHz、诸如为约1MHz至约75MHz、诸如为约2MHz至约70MHz、诸如为约3MHz至约65MHz、诸如为约4MHz至约60MHz并且包括为约5MHz至约50MHz。
在某些实施例中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦接到该处理器的存储器，以使得该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器产生输出激光束，输出激光束带有具有所期望强度曲线的角度偏转激光束。例如，该存储器可以包括指令以产生带有相同强度的两个或更多个角度偏转激光束，诸如3个或更多个、诸如4个或更多个、诸如5个或更多个、诸如10个或更多个、诸如25个或更多个、诸如50个或更多个，并且存储器可以包括指令以产生具有相同强度的100个或更多个角度偏转激光束。在其他实施例中，该存储器可以包括指令以产生具有不同强度的两个或更多个角度偏转激光束，诸如3个或更多个、诸如4个或更多个、诸如5个或更多个、诸如10个或更多个、诸如25个或更多个、诸如50个或更多个，并且存储器可以包括指令以产生具有不同强度的100个或更多个角度偏转激光束。
在某些实施例中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦接到该处理器的存储器，以使得该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器产生沿着水平轴线从边缘到输出激光束中心的强度增加的输出激光束。在这些情况下，在输出激光束中心处的角度偏转激光束的强度可以是沿着水平轴线在输出激光束边缘处的角度偏转激光束的强度的0.1％至约99％，诸如0.5％至约95％、诸如1％至约90％、诸如约2％至约85％、诸如约3％至约80％、诸如约4％至约75％、诸如约5％至约70％、诸如约6％至约65％、诸如约7％至约60％、诸如为约8％至约55％并且包括可以是沿着水平轴线在输出激光束边缘处的角度偏转激光束的强度的10％至约50％。在其他实施例中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦接到处理器的存储器，以使得该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器产生沿着水平轴线从边缘到输出激光束中心的强度增加的输出激光束。在这些情况下，在输出激光束边缘处的角度偏转激光束的强度可以是沿着水平轴线在输出激光束中心处的角度偏转激光束的强度的0.1％至约99％，诸如0.5％至约95％、诸如1％至约90％、诸如约2％至约85％、诸如约3％至约80％、诸如约4％至约75％、诸如约5％至约70％、诸如约6％至约65％、诸如约7％至约60％、诸如为约8％至约55％并且包括可以是沿着水平轴线在输出激光束中心处的角度偏转激光束的强度的10％至约50％。在其他实施例中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦接到该处理器的存储器，以使得该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器产生沿着水平轴线具有高斯分布的强度曲线的输出激光束。在其他实施例中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦接到该处理器的存储器，以使得该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器产生沿着水平轴线具有TOP-HAT强度曲线的输出激光束。
在实施例中，关注的光束生成器可以配置为在空间分离的输出激光束中产生角度偏转激光束。根据所施加的射频驱动信号和输出激光束的期望照射曲线，角度偏转的激光束可以分开0.001μm或更多，诸如分开0.005μm或更多、诸如分开0.01μm或更多、诸如分开0.05μm或更多、诸如分开0.1μm或更多、诸如分开0.5μm或更多、诸如分开1μm或更多、诸如分开5μm或更多、诸如分开10μm或更多、诸如分开100μm或更多、诸如分开500μm或更多、诸如分开1000μm或更多并且包括分开5000μm或更多。在一些实施例中，系统配置为在输出激光束中产生重叠的角度偏转激光束，例如沿着输出激光束的水平轴线与相邻的角度偏转激光束重叠。相邻的角度偏转激光束之间的重叠(诸如束斑的重叠)可以是重叠0.001μm或更多，诸如重叠0.005μm或更多、诸如重叠0.01μm或更多、诸如重叠0.05μm或更多、诸如重叠0.1μm或更多、诸如重叠0.5μm或更多、诸如重叠1μm或更多、诸如重叠5μm或更多、诸如重叠10μm或更多并且包括重叠100μm或更多。
在某些情况下，配置为生成两个或更多个频移光束的光束生成器包括如第美国专利号9,423,353；9,784,661和10,006,852以及美国专利公开号2017/0133857和2017/0350803中所描述的激光激发模块，其公开内容通过引用并入本文。在实施例中，系统包括具有多个光电探测器的光探测系统。关注的光电探测器可以包括但不限于光学传感器，诸如有源像素传感器(APS)，雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件(CCD)、增强电荷耦合器件(ICCD)、发光二极管、光子计数器、辐射热计、热电探测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合，以及其他光电探测器。在某些实施例中，利用电荷耦合器件(CCD)、半导体电荷耦合器件(CCD)、有源像素传感器(APS)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器或N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器来测量来自样本的光。
在一些实施例中，关注的光探测系统包括多个光电探测器。在一些情况下，光探测系统包括多个固态探测器，诸如光电二极管。在某些情况下，光探测系统包括光电探测器阵列，例如光电二极管阵列。在这些实施例中，光电探测器阵列可以包括4个或更多个光电探测器，诸如10个或更多个光电探测器、诸如25个或更多个光电探测器、诸如50个或更多个光电探测器、诸如100个或更多个光电探测器、诸如250个或更多个光电探测器、诸如500个或更多个光电探测器、诸如750个或更多个光电探测器并且包括1000个或更多个光电探测器。例如，探测器可以是光电二极管阵列，该光电二极管阵列具有4个或更多个光电二极管，诸如具有10个或更多个光电二极管、诸如具有25个或更多个光电二极管、诸如具有50个或更多个光电二极管、诸如具有100个或更多个光电二极管、诸如具有250个或更多个光电二极管、诸如具有500个或更多个光电二极管、诸如具有750个或更多个光电二极管并且包括具有1000个或更多个光电二极管。
光电探测器可以按需要以任何几何形状配置来布置，其中关注的布置包括但不限于正方形配置、矩形配置、梯形配置、三角形配置、六边形配置、七边形配置、八边形配置、非对角配置、十边形配置、十二边形配置、圆形配置、椭圆形配置以及不规则图案配置。光电探测器阵列中的光电探测器可以相对于彼此来定向(如在XZ平面中参考的)为角度呈10°至180°，诸如呈15°至170°、诸如呈20°至160°、诸如呈25°至150°、诸如呈30°至120°、并且包括呈45°至90°。光电探测器阵列可以是任何合适的形状，并且可以是直线形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等；曲线形状，例如圆形、椭圆形；以及不规则形状，例如耦接到平坦顶部部分的抛物线形底部部分。在某些实施例中，光电探测器阵列具有矩形的有源表面。
阵列中每个光电探测器(例如，光电二极管)可以具有有源表面，该有源表面的宽度为5μm至250μm，诸如为10μm至225μm、诸如为15μm至200μm、诸如20μm至175μm、诸如25μm至150μm、诸如30μm至125μm并且包括为50μm至100μm，并且该有源表面的长度为5μm至250μm，诸如为10μm至225μm、诸如15μm至200μm、诸如为20μm至175μm、诸如25μm至150μm、诸如为30μm至125μm并且包括为50μm至100μm，其中阵列中每个光电探测器(例如光电二极管)的表面积为25μm2至10000μm2，诸如为50μm2至9000μm2、诸如为75μm2至8000μm2、诸如为100μm2至7000μm2、诸如为150μm2至6000μm2并且包括为200μm2至5000μm2。
光电探测器阵列的尺寸可以根据光的量和强度、光电探测器的数量和所需灵敏度来变化，并且其长度可以为0.01mm至100mm，诸如为0.05mm至90mm、诸如为0.1mm至80mm、诸如为0.5mm至70mm、诸如为1mm至60mm、诸如为2mm至50mm、诸如为3mm至40mm、诸如为4mm至30mm并且包括为5mm至25mm。光电探测器阵列的宽度可以为0.01mm至100mm，诸如为0.05mm至90mm、诸如为0.1mm至80mm、诸如为0.5mm至70mm、诸如为1mm至60mm、诸如为2mm至50mm、诸如为3mm至40mm、诸如为4mm至30mm并且包括为5mm至25mm。这样，光电探测器阵列的有源表面可以为0.1mm2至10000mm2，诸如为0.5mm2至5000mm2、诸如为1mm2至1000mm2、诸如为5mm2至500mm2并且包括为10mm2至100mm2。
关注的光电探测器配置为在一个或更多个波长下测量所收集的光，诸如在2个或更多个波长下、诸如在5个或更多个不同波长下、诸如在10个或更多个不同波长下、诸如在25个或更多个不同波长下、诸如在50个或更多个不同波长下、诸如在100个或更多个不同波长下、诸如在200个或更多个不同波长下、诸如在300个或更多个不同波长下并且包括在400个或更多个不同波长下测量由束流中样本所发射出的光。
在一些实施例中，光电探测器配置为测量在一定波长范围内(例如200nm至1000nm)的所收集的光。在某些实施例中，关注的光电探测器配置为收集一定波长范围内的光的光谱。例如，系统可以包括一个或更多个探测器，其配置为收集200nm至1000nm波长范围中一个或更多个范围内的光的光谱。在其他实施例中，关注的探测器配置为在一个或更多个特定波长处测量来自束流中样本的光。例如，系统可以包括一个或更多个探测器，其配置为在450nm、518nm、519nm、561nm、578nm、605nm、607nm、625nm、650nm、660nm、667nm、670nm、668nm、695nm、710nm、723nm、780nm、785nm、647nm、617nm及其任何组合中的一个或更多个处来测量光。在某些实施例中，光电探测器可以配置为与特定的荧光团配对，诸如与在荧光测定中与样本一起使用的那些特定荧光团配对。在一些实施例中，光电探测器配置为在样本中每个荧光团的整个荧光光谱上测量所收集的光。
光探测系统配置为连续地或以离散的间隔来测量光。在某些情况下，关注的光电探测器配置为连续地测量所收集的光。在其他情况下，光探测系统配置为以离散的间隔来进行测量，诸如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒并且包括每1000毫秒，或者以其他间隔来进行测量。
在实施例中，系统配置为分析来自被照射样本的光并且对来自样本中每个荧光团的光进行光谱解析。在一些实施例中，系统包括存储器，该存储器具有存储在其上的指令，以用于确定样本中每个不同荧光团之间的重叠并计算每个荧光团对重叠荧光的贡献。在某些实施例中，系统配置为针对由光探测系统所探测到的样本中具有重叠荧光的多个荧光团的荧光光谱来计算光谱解混矩阵。如以下更详细描述的，系统还可以配置为估算样本中每个荧光团的丰度。在某些实施例中，可以确定与目标颗粒相关联的每个荧光团的丰度。该系统可以配置为基于与目标颗粒相关联的每个荧光团的丰度来识别目标颗粒并将其分类。在某些情况下，系统被配置为对已识别或分类的颗粒进行分选。在这些实施例中，系统可以包括计算机控制的系统，其中该系统还包括一个或更多个计算机，以用于实践本文所述的方法的系统的完全自动化或部分自动化。在一些实施例中，系统包括具有计算机可读存储介质的计算机，该计算机可读存储介质上存储有计算机程序，其中该计算机程序在加载到计算机上时包括以下指令，该指令用于：利用光源来照射束流中的具有样本的流细胞并利用具有多个光电探测器的光探测系统来探测来自流细胞的光、针对由光探测系统所探测到的每个颗粒来计算多个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵、使用该光谱解混矩阵来估算每个荧光团的丰度；并基于所估算的荧光团丰度对样本中的颗粒进行分选。
在一些实施例中，系统包括具有计算机可读存储介质的计算机，该计算机可读存储介质上存储有计算机程序，其中该计算机程序在加载到计算机上时还包括以下指令，该指令用于通过使用加权最小二乘算法来计算光谱解混矩阵从而对具有重叠荧光的每个荧光团的光进行光谱解析。在一些情况下，加权最小二乘算法是根据下式来计算的：
其中，y是光探测系统的多个光电探测器针对每个细胞测量的探测器值；
是估算的荧光团丰度；X是溢出；并且W是
在一些实施例中，根据下式来计算每个Wii：
其中σi 2是探测器i处的方差；yi是探测器i处的信号；并且λi是探测器i处的恒定噪声。在某些实施例中，光谱解混矩阵根据下式来计算：(XTWX)-1XTW。在一些情况下，本主题系统包括带有指令的存储器，该指令针对由光探测系统所探测到的每个细胞来对(XTWX)求逆以计算光谱解混矩阵。在某些实施例中，系统包括具有计算机可读存储介质的计算机，该计算机可读存储介质上存储有计算机程序，其中该计算机程序在加载到计算机上时还包括以下指令，该指令用于针对由光探测系统所探测到的每个细胞在加权最小二乘算法中对(XTWX)近似求逆，以便对样本中的细胞进行实时地分选。在一些实施例中，计算机程序在加载到计算机上时还包括使用迭代Newton-Raphson计算根据下式来对(XTWX)求逆的指令：
A-1＝(XTWX)-1；
其中WG是W的预定近似值，该W是根据光探测系统中的每个光电探测器的方差来确定的。
在一些实施例中，系统包括具有计算机可读存储介质的计算机，该计算机可读存储介质上存储有计算机程序，其中该计算机程序在加载到计算机上时还包括以下指令，该指令用于估算每个光电探测器的方差。在一些情况下，该指令包括使用单染色对照样本来确定光电探测器噪声分量(例如，电子噪声、背景光等)。在其他情况下，该指令包括在利用光源照射样本之前，确定每个光电探测器的方差。在其他情况下，该指令包括在利用光源照射样本之前，确定W的预定近似值WG。在某些实施例中，存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器利用预确定的WG来预计算A0 -1。在这些实施例中，预计算的A0 -1可以存储在存储器中，并且可以被处理器用作针对由光探测系统所探测到的每个颗粒的A-1的第一近似值。
在其他实施例中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦接到该处理器的存储器，其中该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器利用Sherman-Morrison迭代逆更新器针对每个颗粒来近似加权最小二乘算法。在一些情况下，存储器包括用于使用Sherman-Morrison公式来计算A的指令：
在某些情况下，存储器包括用于使用Sherman-Morrison公式来预计算A0 -1以计算A0扰动的逆的指令。在一些实施例中，通过公式XTW0X来计算A0的逆，并且通过公式XTWX来计算A的逆。在一些情况下，存储器包括用于根据下式来计算ΔA(即A-A0)作为列向量与每个迭代W的乘积的指令：
其中Wii＝W0 ii+αi，其中i∈[1，ND]。
根据实施例，ΔAi＝XTΔWiX＝αimimi T，其中A能够表示为：
在这些实施例中，能够使用对每个wi的改变，利用每个新的加权矩阵W(即具有与W0不同的值)根据A0来重新计算每个A。在一些实施例中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦接到该处理器的存储器，其中该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器实施Sherman-Morrison迭代逆更新器，以根据下式来近似光谱解混矩阵：
在一些实施例中，用于A0 -1的预计算的值被用于计算A1 -1。然后将预计算的A1 -1用于计算A2 -1。能够通过使用从i＝1到ND的每个(Ai-1)-1来重复计算Ai -1，从而计算值A-1。在某些实施例中，本主题系统包括现场可编程门阵列，并且在现场可编程门阵列上针对每个细胞来实时地计算光谱解混算法。
在其他实施例中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦接到处理器的存储器，其中该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器针对每个颗粒通过矩阵分解来计算加权最小二乘算法。在一些情况下，存储器包括用于LU矩阵分解的指令，诸如其中将矩阵分解为下三角(L)矩阵和上三角(U)矩阵的乘积。在某些情况下，LU分解包括高斯消除。在其他情况下，LU分解包括修正的Cholesky分解、LDL分解，其中D是对角矩阵。在某些实施例中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦接到处理器的存储器，其中该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器通过使用修正的Cholesky分解来计算加权最小二乘算法(a)：
XTWXa＝XTWy
Aa＝B
LDLTa＝B LDL分解
Lz＝B其中z＝DLTa 下三角矩阵解
Dx＝Z其中x＝LTa 对角矩阵解
LTa＝x 上三角矩阵解
在其他实施例中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦接到处理器的存储器，其中该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器通过QR因式分解来计算加权最小二乘算法。在一些情况下，QR因式分解是矩阵，该矩阵是正交(Q)矩阵和上三角(R)矩阵的乘积。在一些实施例中，存储器包括用于根据下式使用QR因式分解来计算加权最小二乘算法(a)的指令：
XTWXa＝XTWy
在其他实施例中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦接到处理器的存储器，其中该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器通过奇异值分解(SVD)来计算加权最小二乘算法。在一些情况下，奇异值分解是矩阵，该矩阵是乘积
其中U和V是正交矩阵，并且∑是含有
奇异值的对角矩阵。在某些情况下，存储器包括用于根据下式使用奇异值分解来计算加权最小二乘算法(a)的指令：
z＝UTy
∑w＝z
a＝Vw
在一些实施例中，系统包括具有计算机可读存储介质的计算机，该计算机可读存储介质上存储有计算机程序，其中该计算机程序在加载到计算机上时还包括以下指令，该指令用于通过对每个荧光团的光进行光谱解析来计算样本中一个或更多个荧光团的丰度。在某些情况下，通过对与颗粒相关联的每个荧光团的光进行光谱解析来计算与目标颗粒相关联(例如，化学相关(即，共价、离子)或物理相关)的荧光团的丰度。例如，在一个示例中，通过对每个荧光团的光进行光谱解析来计算与目标颗粒相关联的每个荧光团的相对丰度。在另一示例中，通过对每个荧光团的光进行光谱解析来计算与目标颗粒相关联的每个荧光团的绝对丰度。
在某些实施例中，系统配置为基于确定为与颗粒相关联的每个荧光团的相对丰度来对颗粒进行识别或分类。在这些实施例中，本主题系统可以配置为通过任何方便的方案来对颗粒进行识别或分类，诸如通过：将与颗粒相关联的每个荧光团的相对或绝对丰度与具有已知一致性颗粒的对照样本进行比较；或者通过对具有相关联荧光团所计算出的相对或绝对丰度的颗粒(例如细胞)群体进行光谱或其他测定分析。
根据一些实施例的系统可以包括显示器和操作员输入设备。操作员输入设备可以例如是键盘、鼠标等。处理模块包括处理器，该处理器可以访问其上存储有用于执行本主题方法的步骤的指令的存储器。处理模块可以包括操作系统、图形用户界面(GUI)控制器、系统存储器、存储器存储设备以及输入输出控制器、高速缓冲存储器、数据备份单元以及许多其他设备。该处理器可以是可商购的处理器，或者可以是已经可用或将要可用的其他处理器之一。处理器执行操作系统，并且该操作系统以众所周知的方式与固件和硬件相连接，并且有助于处理器协调并执行可以用各种编程语言(诸如Java、Perl、C++、如本领域中已知的其他高级或低级语言及其组合)来编写的各种计算机程序的功能。操作系统通常与处理器合作地协调并执行计算机其他组件的功能。操作系统还根据已知技术来提供调度、输入输出控制、文件和数据管理、内存管理以及通信控制和相关服务。处理器可以是任何合适的模拟或数字系统。在一些实施例中，处理器包括提供反馈控制(诸如负反馈控制)的模拟电子器件。
系统存储器可以是多种已知或将来的存储器存储设备中的任一种。示例包括任何通常可用的随机存取存储器(RAM)、磁性介质(诸如驻留的硬盘或磁带)、光学介质(诸如读写光盘)、闪存设备或其他内存存储设备。存储器存储设备可以是多种已知或将来设备中的任一种，包括光盘驱动器、磁带驱动器、可移动硬盘驱动器或软盘驱动器。这种类型的存储器存储设备通常从程序存储介质(未示出)中读取和/或写入程序存储介质(诸如分别为光盘、磁带、可移动硬盘或软盘)。这些程序存储介质中的任一个，或者现在正在使用的或以后可能开发的其他介质，都可以视为计算机程序产品。将会理解，这些程序存储介质通常存储计算机软件程序和/或数据。计算机软件程序(也称为计算机控制逻辑)通常存储在系统存储器和/或与存储器存储设备相结合使用的程序存储设备中。
在一些实施例中，描述了一种包括计算机可用介质的计算机程序产品，该计算机可用介质具有存储在其中的控制逻辑(计算机软件程序，包括程序代码)。该控制逻辑在由计算机处理器执行时使得处理器实施本文所述的功能。在其他实施例中，一些功能主要通过使用例如硬件状态机来在硬件中实现。硬件状态机用于实施本文所描述功能的实现方式对于相关领域的技术人员而言将是显而易见的。
存储器可以是处理器能够在其中存储并检索数据的任何合适的设备，诸如磁、光或固态存储设备(包括磁盘、光盘、磁带或RAM，或任何其他合适的设备，这些设备可以是固定的也可以是便携的)。处理器可以包括通用数字微处理器，该通用数字微处理器根据携带必要程序代码的计算机可读介质来进行适当地编程。能够将程序经由通信信道来远程地提供给处理器，或者可以通过使用与存储器相连接的那些设备中的任一个，来将程序预先保存在计算机程序产品(诸如存储器)或其他便携或固定的计算机可读存储介质中。例如，磁盘或光盘可以承载程序，并且能够由磁盘写入器/读取器来进行读取。本发明的系统还包括例如以计算机程序产品、算法形式的程序以用于实践上述方法。可以将根据本发明的编程记录在计算机可读介质上，例如记录在能够由计算机直接读取并访问的任何介质上。此类介质包括但不限于：磁存储介质，诸如软盘、硬盘存储介质和磁带；光学存储介质，诸如CD-ROM；电存储介质，诸如RAM和ROM；便携式闪存驱动器；以及这些类别的混合形式，诸如磁/光学存储介质。
处理器还可以访问通信信道以与远程位置处的用户进行通信。远程位置是指用户与系统没有直接接触，而是将输入信息从外部设备(诸如连接到广域网(WAN)、电话网络、卫星网络或任何其他合适通信信道的计算机，包括移动电话(即智能手机))来接转到输入管理器。
在一些实施例中，根据本公开的系统可以配置为包括通信接口。在一些实施例中，该通信接口包括用于与网络和/或另一设备进行通信的接收器和/或发送器。该通信接口能够配置为用于有线或无线通信，包括但不限于射频(RF)通信，例如射频识别(RFID)、Zigbee通信协议、WiFi、红外、无线通用串行总线(USB)、超宽带(UWB)、
通信协议以及蜂窝通信，诸如码分多址(CDMA)或全球移动通信系统(GSM)。
在一个实施例中，通信接口配置为包括一个或更多个通信端口，例如物理端口或接口，诸如USB端口、RS-232端口或任何其他合适的电连接端口，以允许本主题系统与其他外部设备(诸如配置为(例如，在医生办公室或医院环境中)用于类似补充数据通信的计算机终端)之间进行数据通信。
在一个实施例中，通信接口配置为用于红外通信、
通信或任何其他合适的无线通信协议，以使得本主题系统能够与其他设备进行通信，其他设备诸如计算机终端和/或网络、支持通信的移动电话、个人数字助手或者用户可以结合使用的任何其他通信设备。
在一个实施例中，通信接口配置为提供利用互联网协议(IP)通过蜂窝电话网络、短消息服务(SMS)、连接到因特网的局域网(LAN)上的个人计算机(PC)的无线连接或者以WiFi热点连接到因特网的WiFi连接进行数据传输的连接。
在一个实施例中，本主题系统配置为例如通过使用诸如802.11或
RF协议或IrDA红外协议的通用标准，来经由通信接口与服务器设备进行无线通信。该服务器设备可以是另一便携式设备，诸如智能电话、个人数字助理(PDA)或笔记本计算机；或者是诸如台式计算机、电器等的更大型设备。在一些实施例中，该服务器设备具有显示器，诸如液晶显示器(LCD)，以及具有输入设备，诸如按钮、键盘、鼠标或触摸屏。
在一些实施例中，通信接口配置为使用上述一个或更多个通信协议和/或机制来与网络或服务器设备进行自动地或半自动地传送存储在本主题系统中(例如在可选数据存储单元中)的数据。
输出控制器可以包括用于各种已知显示设备中任一个的控制器，以向用户(无论是人还是机器，无论是本地的还是远程的)呈现信息。如果显示设备之一提供了视觉信息，则该信息通常可以在逻辑上和/或物理上组织为图片元素阵列。图形用户界面(GUI)控制器可以包括各种已知的或将来的软件程序中的任一个，以用于在系统与用户之间提供图形输入和输出接口，并用于处理用户输入。计算机的功能元件可以经由系统总线来彼此通信。这些通信中的一些可以在替代实施例中通过使用网络或其他类型的远程通信来完成。根据已知技术，输出管理器还可以例如通过因特网、电话或卫星网络来向远程位置处的用户提供由处理模块生成的信息。由输出管理器进行的数据的呈现可以根据各种已知技术来实现。作为一些示例，数据可以包括SQL、HTML或XML文档、电子邮件或其他文件或者是其他形式的数据。数据可以包括因特网URL地址，以使得用户可以从远程源中检索附加的SQL、HTML、XML或其他文档或数据。本主题系统中存在的一个或更多个平台可以是任何类型的已知计算机平台或者是将来要开发的类型，尽管它们通常是常称为服务器的一类计算机。然而，它们也可以是主机计算机、工作站或其他计算机类型。它们可以经由任何已知或未来类型的电缆或其他通信系统(包括联网的或其他方式的无线系统)来进行连接。它们可以位于同一地点，也可以在物理上分开。可以根据所选择的计算机平台类型和/或制造，来在任何计算机平台上采用各种操作系统。适当的操作系统包括Windows 10、
WindowsXP、Windows 7、Windows8、iOS、Sun Solaris、Linux、OS/400、Compaq Tru64 Unix、SGIIRIX、Siemens Reliant Unix、Ubuntu、Zorin OS等。
在某些实施例中，本主题系统包括一个或更多个光学调节组件，以用于调节光，诸如(例如，来自激光器)照射到样本上的光或者是从样本中收集的光(例如，散射的荧光)。例如，光学调节可以是增加光的尺寸、光的焦点或者是使光准直。在一些情况下，光学调节是放大方案以增加光(例如束斑)的尺寸，诸如将尺寸增加5％或更多，诸如增加10％或更多、诸如增加25％或更多、诸如增加50％或更多并且包括将尺寸增加75％或更多。在其他实施例中，光学调节包括将光聚焦以减小光尺寸，诸如减小5％或以上、诸如减小10％或以上、诸如减小25％或以上、诸如减小50％或以上并且包括将束斑的尺寸减小75％或以上。在某些实施例中，光学调节包括将光准直。术语“准直”以其常规意义使用，即是指光学地调节光传播的共线性或者减小来自公共传播轴线的光的发散。在一些情况下，准直包括使光束的空间横截面变窄(例如，减小激光器的光束轮廓)。
在一些实施例中，光学调节组件是聚焦透镜，其具有为0.1至0.95的放大倍率，诸如为0.2至0.9的放大倍率、诸如为0.3至0.85的放大倍率、诸如为0.35至0.8的放大倍率、诸如为0.5至0.75的放大倍率并且包括为0.55至0.7的放大倍率，例如为0.6的放大倍率。例如，在某些情况下，聚焦透镜是具有约0.6放大倍率的双消色差缩小透镜。聚焦透镜的焦距可以为5mm至20mm，诸如为6mm至19mm、诸如为7mm至18mm、诸如为8mm至17mm、诸如为9mm至16mm并且包括焦距为10mm至15mm。在某些实施例中，聚焦透镜具有约13mm的焦距。
在其他实施例中，光学调节组件是准直仪。准直仪可以是任何方便的准直方案，诸如一个或更多个镜或曲面透镜或者是其组合。例如，在某些情况下，准直仪是单准直透镜。在其他情况下，准直仪是准直镜。在其他情况下，准直仪包括两个透镜。在其他情况下，准直仪包括镜和透镜。在准直仪包括一个或更多个透镜的情况下，准直透镜的焦距可以为5mm至40mm，诸如为6mm至37.5mm、诸如为7mm至35mm、诸如为8mm至32.5mm、诸如为9mm至30mm、诸如为10mm至27.5mm、诸如为12.5mm至25mm并且包括焦距为15mm至20mm。
在一些实施例中，本主题系统包括具有喷嘴孔口的流细胞喷嘴，该喷嘴孔口配置为使束流流过该流细胞喷嘴。该主题流细胞喷嘴具有将流体样本传播到样本探询区域的孔口，其中在一些实施例中，该流细胞喷嘴包括限定纵向轴线的近端圆柱形部分和终止在平坦表面的远端截头圆锥形部分，该平坦表面具有横向于纵向轴线的喷嘴孔口。近端圆柱形部分的长度(如沿着纵向轴线来测量)可以为1mm至15mm，诸如为1.5mm至12.5mm、诸如为2mm至10mm、诸如为3mm至9mm并且包括为4mm至8mm。远端截头圆锥形部分的长度(如沿着纵向轴线来测量)可以为1mm至10mm，诸如为2mm至9mm、诸如为3mm至8mm并且包括为4mm至7mm。在一些实施例中，流细胞喷嘴腔室的直径可以为1mm至10mm，诸如为2mm至9mm、诸如为3mm至8mm并且包括为4mm至7mm。
在某些情况下，喷嘴腔室不包括圆柱形部分，并且整个流细胞喷嘴腔室为截头圆锥形状。在这些实施例中，截头圆锥形喷嘴腔室的长度(如沿着横向于喷嘴孔口的纵向轴线来测量)可以为1mm至15mm，诸如为1.5mm至12.5mm、诸如为2mm至10mm、诸如为3mm至9mm并且包括为4mm至8mm。截头圆锥形喷嘴腔室的近端部分的直径可以为1mm至10mm，诸如为2mm至9mm、诸如为3mm至8mm并且包括为4mm至7mm。
在实施例中，样本束流从流细胞喷嘴远端处的孔口中散发。根据束流的所期望特性，流细胞喷嘴孔口可以是任何合适的形状，其中关注的横截面形状包括但不限于：直线形横截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等，曲线形横截面形状，例如圆形、椭圆形，以及不规则形状，例如耦接到平面顶部部分的抛物线形底部部分。在某些实施例中，关注的流细胞喷嘴具有圆形孔口。在一些实施例中，喷嘴孔口的尺寸可以为1μm至20000μm，诸如为2μm至17500μm、诸如为5μm至15000μm、诸如为10μm至12500μm、诸如为15μm至10000μm、诸如为25μm至7500μm、诸如为50μm至5000μm、诸如为75μm至1000μm、诸如为100μm至750μm并且包括为150μm至500μm。在某些实施例中，喷嘴孔口为100μm。
在一些实施例中，流细胞喷嘴包括样本注入端口，该样本注入端口配置为向流细胞喷嘴提供样本。在实施例中，样本注入系统配置为向流细胞喷嘴腔室提供合适的样本流。根据束流的所期望的特性，样本通过样本注入端口来传送到流细胞喷嘴腔室的速率可以为1μL/秒或更高，诸如为2μL/秒或更高、诸如为3μL/秒或更高、诸如为5μL/秒或更高、诸如为10μL/秒或更高、诸如为15μL/秒或更高、诸如为25μL/秒或更高、诸如为50μL/秒或更高、诸如为100μL/秒或更高、诸如为150μL/秒或更高、诸如为200μL/秒或更高、诸如为250μL/秒或更高、诸如为300μL/秒或更高、诸如为350μL/秒或更高、诸如为400μL/秒或更高、诸如为450μL/秒或更高并且包括为500μL/秒或更高。例如，样本流速率可以为1μL/秒至约500μL/秒，诸如为2μL/秒至约450μL/秒、诸如为3μL/秒至约400/秒、诸如为4μL/秒至约350μL/秒、诸如为5μL/秒至约300μL/秒、诸如为6μL/秒至约250μL/秒、诸如为7μL/秒至约200μL/秒、诸如为8μL/秒至约150μL/秒、诸如为9μL/秒至约125μL/秒并且包括为10μL/秒至约100μL/秒。
样本注入端口可以是定位在喷嘴腔室壁中的孔口，或者可以是定位在喷嘴腔室近端处的导管。在样本注入端口是定位在喷嘴腔室壁中的孔口的情况下，该样本注入端口孔口可以是任何合适的形状，其中关注的横截面形状包括但不限于：直线形横截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等，曲线形横截面形状，例如圆形、椭圆形等，以及不规则形状，例如耦接到平面顶部部分的抛物线形底部部分。在某些实施例中，样本注入端口具有圆形孔口。样本注入端口孔口的尺寸可以根据形状来变化，在某些情况下，其开口范围为0.1mm至5.0mm，例如为0.2至3.0mm、例如为0.5mm至2.5mm、诸如为0.75mm至2.25mm、诸如为1mm至2mm并且包括为1.25mm至1.75mm，例如为1.5mm。
在某些情况下，样本注入端口是定位在流细胞喷嘴腔室近端处的导管。例如，样本注入端口可以是定位为使得样本注入端口的孔口与流细胞喷嘴孔口成一直线的导管。在样本注入端口是定位成与流细胞喷嘴孔口成一直线的导管的情况下，该样本注入管的横截面形状可以是任何合适的形状，其中关注的横截面形状包括但不限于：直线形横截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等，曲线形横截面形状，例如圆形、椭圆形，以及不规则形状，例如耦接到平面顶部部分的抛物线形底部部分。导管的孔口可以根据形状来变化，在某些情况下，其开口范围为0.1mm至5.0mm，例如为0.2至3.0mm、例如为0.5mm至2.5mm、诸如为0.75mm至2.25mm、诸如为1mm至2mm并且包括为1.25mm至1.75mm，例如为1.5mm。样本注入端口的尖端的形状与样本注入管的横截面形状可以相同也可以不同。例如，样本注入端口的孔口可以包括斜面尖端，该斜面尖端的斜角范围为1°至10°，诸如为2°至9°、诸如为3°至8°、诸如为4°至7°并且包括5°的斜角。
在一些实施例中，流细胞喷嘴还包括鞘液注入端口，该鞘液注入端口配置为向流细胞喷嘴提供鞘液。在实施例中，鞘液注入系统配置为向流细胞喷嘴腔室提供鞘液流，例如与样本一起来产生围绕样本束流的鞘液层状束流。根据束流的所期望的特性，鞘液传送到流细胞喷嘴腔室的速率可以为25μL/秒或更高，诸如为50μL/秒或更高、诸如为75μL/秒或更高、诸如为100μL/秒或更高、诸如为250μL/秒或更高、诸如为500μL/秒或更高、诸如为750μL/秒或更高、诸如为1000μL/秒或更高并且包括为2500μL/秒或更高。例如，鞘液流速率可以为1μL/秒至约500μL/秒，诸如为2μL/秒至约450μL/秒、诸如为3μL/秒至约400μL/秒、诸如为4μL/秒至约350μL/秒、诸如为5μL/秒至约300μL/秒、诸如为6μL/秒至约250μL/秒、诸如为7μL/秒至约200μL/秒、诸如为8μL/秒至约150μL/秒、诸如为9μL/秒至约125μL/秒并且包括为10μL/秒至约100μL/秒。
在一些实施例中，鞘液注入端口是定位在喷嘴腔室壁中的孔口。鞘液注入端口孔口可以是任何合适的形状，其中关注的横截面形状包括但不限于：直线形横截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等，曲线形横截面形状，例如圆形、椭圆形，以及不规则形状，例如耦接到平面顶部部分的抛物线形底部部分。样本注入端口孔口的尺寸可以根据形状来变化，在某些情况下，其开口范围为0.1mm至5.0mm，例如为0.2至3.0mm、例如为0.5mm至2.5mm、诸如为0.75mm至2.25mm、诸如为1mm至2mm并且包括为1.25mm至1.75mm，例如为1.5mm。
在某些情况下，本主题系统包括与流细胞喷嘴孔口进行流体连通的样本探询区域。在这些情况下，样本束流从流细胞喷嘴远端处的孔口中散发，并且束流中的颗粒可以利用样本探询区域处的光源来进行照射。探询区域的尺寸可以根据流动喷嘴的特性(诸如喷嘴孔口的尺寸和样本注入端口尺寸)来变化。在实施例中，探询区域的宽度可以为0.01mm或更大，诸如为0.05mm或更大、诸如为0.1mm或更大、诸如为0.5mm或更大、诸如为1mm或更大、诸如为2mm或更大、诸如为3mm或更大、诸如为5mm或更大并且包括为10mm或更大。在一些情况下，探询区域的长度可以为0.01mm或更大，诸如为0.1mm或更大、诸如为0.5mm或更大、诸如为1mm或更大、诸如为1.5mm或更大、诸如为2mm或更大、诸如为3mm或更大、诸如为5mm或更大、诸如为10mm或更大、诸如为15mm或更大、诸如为20mm或更大、诸如为25mm或更大并且包括为50mm或更大。
探询区域可以配置为有助于照射散发束流的平坦横截面，或者可以配置为有助于(例如，利用扩散激光器或灯)照射预定长度的扩散场。在一些实施例中，探询区域包括有助于照射预定长度的散发束流的透明窗口，该长度诸如为1mm或更大，诸如为2mm或更大、诸如为3mm或更大、诸如为4mm或更大、诸如为5mm或更大并且包括为10mm或更大。根据用于照射散发出束流的光源(如下所述)，探询区域可以配置为使光穿过，该光范围为100nm至1500nm，诸如为150nm至1400nm、诸如为200nm至1300nm、诸如为250nm至1200nm、诸如为300nm至1100nm、诸如为350nm至1000nm、诸如为400nm至900nm并且包括为500nm至800nm。这样，探询区域可以由使所期望范围波长穿过的任何透明材料来形成，包括但不限于光学玻璃、硼硅酸盐玻璃、Pyrex玻璃、紫外石英、红外石英、蓝宝石以及塑料，诸如聚碳酸酯、聚氯乙烯(PVC)、聚氨酯、聚醚、聚酰胺、聚酰亚胺，或者是这些热塑性材料的共聚物，诸如PETG(乙二醇改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯)，以及其他聚合塑性材料，包括聚酯，其中关注的聚酯可以包括但不限于聚对苯二甲酸亚烷基酯，诸如聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、瓶级PET(基于单乙二醇、对苯二甲酸和其他共聚单体(诸如间苯二甲酸、环己烯二甲醇等)制成的共聚物)，聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)，和聚对苯二甲酸六亚甲基酯；聚(己二酸亚烷基酯)，诸如聚(己二酸乙二酯)，聚(1，4-丁烯酸己二酯)和聚(己二酸六亚甲基酯)；聚(亚烷基辛二酸酯)，诸如聚(亚乙基二辛酸酯)；聚(癸二酸亚烷基酯)，诸如聚(癸二酸亚乙酯)；聚(ε-己内酯)和聚(β-丙内酯)；聚(间苯二甲酸亚烷基酯)，诸如聚(间苯二甲酸乙二酯)；聚(亚烷基2，6-萘-二羧酸酯)，诸如聚(亚乙基2，6-萘-二羧酸酯)；聚(亚烷基磺酰基-4,4'-二苯甲酸酯)，诸如聚(亚乙基磺酰基-4,4'-二苯甲酸酯)；聚(对亚苯基亚烷基二羧酸酯)，诸如聚(对亚苯基亚乙基二羧酸酯)；聚(反式1，4-环己二基亚烷基二羧酸酯)，诸如聚(反式1，4-环己二基亚乙基二羧酸酯)；聚(1，4-环己烷-二亚甲基亚烷基二羧酸酯)，诸如聚(1，4-环己烷-二亚甲基亚乙基二羧酸酯)；聚([2.2.2]-双环辛烷-1,4-二亚甲基亚烷基二羧酸酯)，诸如聚([2.2.2]-双环辛烷-1,4-二亚甲基亚乙基二羧酸酯)；乳酸聚合物和共聚物，诸如(S)-聚丙交酯，(R,S)-聚丙交酯，聚(四甲基乙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)；以及双酚A，3,3'-二甲基双酚A，3,3'，5,5'-四氯双酚A，3,3'，5,5'-四甲基双酚A的聚碳酸酯；聚酰胺，诸如聚对苯二甲酰对苯二甲酰胺；聚酯，例如聚对苯二甲酸乙二酯，例如MylarTM聚对苯二甲酸乙二酯；等。在一些实施例中，本主题系统包括定位在样本探询区域中的比色杯。在实施例中，该比色杯可以使光穿过，该光范围为100nm至1500nm，诸如为150nm至1400nm、诸如为200nm至1300nm、诸如为250nm至1200nm、诸如为300nm至1100nm、诸如为350nm至1000nm、诸如为400nm至900nm并且包括为500nm至800nm。
在某些实施例中，本主题系统是采用上述加权最小二乘算法以用于分析并分选样本中颗粒(例如，生物样本中的细胞)的流式细胞术系统。合适的流式细胞术系统可以包括但不限于以下所描述的：Ormerod(ed.),Flow Cytometry:APractical Approach,OxfordUniv.Press(1997)；Jaroszeski et al.(eds.),Flow Cytometry Protocols,Methods inMolecular Biology No.91,Humana Press(1997)；Practical Flow Cytometry,3rd ed.,Wiley-Liss(1995)；Virgo,et al.(2012)Ann Clin Biochem.Jan；49(pt 1):17-28；Linden,et.al.,Semin Throm Hemost.2004Oct；30(5):502-11；Alison,et al.J Pathol,2010Dec；222(4):335-344；和Herbig,et al.(2007)Crit Rev Ther Drug CarrierSyst.24(3):203-255；其公开内容通过引用并入本文。在某些情况下，关注的流式细胞术系统包括BD Biosciences FACSCantoTM II流式细胞仪、BD AccuriTM流式细胞仪、BDBiosciences FACSCelestaTM流式细胞仪、BD Biosciences FACSLyricTM流式细胞仪、BDBiosciences FACSVerseTM流式细胞仪、BD Biosciences FACSymphonyTM流式细胞仪、BDBiosciences LSRFortessTM X-20流式细胞仪和BD Biosciences FACSCaliburTM细胞分选仪、BD Biosciences FACSCountTM细胞分选仪、BD Biosciences FACSLyricTM细胞分选仪和BD Biosciences ViaTM细胞分选仪、BD Biosciences InfluxTM细胞分选仪、BDBiosciences JazzTM细胞分选仪、BD Biosciences AriaTM细胞分选仪和BD BioodysFACSMelodyTM细胞分选仪等。
在一些实施例中，本主题颗粒分选系统是流式细胞术系统，诸如在第9,952,076号；第9,933,341号；第9,726,527号；第9,453,789号；第9,200,334号；第9,097,640号；第9,095,494号；第9,092,034号；第8,975,595号；第8,753,573号；第8,233,146号；第8,140,300号；第7,544,326号；第7,201,875号；第7,129,505号；第6,821,740号；第6,813,017号；第6,809,804号；第6,372,506号；第5,700,692号；第5,643,796号；第5,627,040号；第5,620,842号；第5,602,039号美国专利中所描述的那些；其全部公开内容通过引用并入本文。
在某些实施例中，本主题系统配置为对样本的一个或更多个颗粒(例如，细胞)进行分选，如上所述基于与颗粒相关联的荧光团而估算出的丰度来识别该样本。术语“分选”在本文中以其常规含义使用，即是指分离样本的组分(例如，细胞、非细胞性颗粒(诸如生物大分子))，并且在一些情况下将所分离的组分传输到一个或更多个样本收集容器。例如，本主题系统配置为用于分选以下样本，该样本具有2个或更多个组分，诸如具有3个或更多个组分、诸如具有4个或更多个组分、诸如具有5个或更多个组分、诸如具有10个或更多个组分、诸如具有15个或更多个组分并且包括分选具有25个或更多个组分的样本。可以将一个或更多个样本组分与样本分离并发送到样本收集容器，诸如2个或更多个样本组分、诸如3个或更多个样本组分、诸如4个或更多个样本组分、诸如5个或更多个样本组分、诸如10个或更多个样本组分并且包括将15个或更多个样本组分与样本分离并发送到样本收集容器。
在一些实施例中，关注的颗粒分选系统配置为利用封闭的颗粒分选模块来对颗粒进行分选，诸如在2017年3月28日提交的美国专利公开文本2017/0299493中所描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。在某些实施例中，使用具有多个分选决定单元的分选决定模块来对样本的颗粒(例如细胞)进行分选，所述分选决定单元为诸如在2019年2月8日提交的第62/803,264号美国临时专利申请中所描述的，其公开内容通过引用并入本文。在一些实施例中，用于对样本组分进行分选的方法包括利用具有偏转板的颗粒分选模块来对颗粒(例如，生物样本中的细胞)进行分选，诸如在2017年3月28日提交的美国专利公开文本2017/0299493中所描述的，其公开内容通过引用并入本文。
集成电路设备
本公开的方面也包括集成电路设备，该集成电路设备编程为对来自样本中每个荧光团的光进行光谱解析，所述样本包括具有重叠的荧光光谱的多个荧光团。在一些实施例中，关注的集成电路设备包括现场可编程门阵列(FPGA)。在其他实施例中，集成电路设备包括专用集成电路(ASIC)。在其他实施例中，集成电路设备包括复杂可编程逻辑设备(CPLD)。在一些实施例中，本主题集成电路设备编程为确定样本中每个不同荧光团之间的重叠，并计算每个荧光团对重叠荧光的贡献。在某些实施例中，集成电路编程为针对由具有多个光电探测器的光探测系统所探测到的样本中具有重叠荧光的多个荧光团的荧光光谱来计算光谱解混矩阵。在某些实施例中，将根据某些实施例的集成电路设备编程为针对样本中每个细胞来计算多个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵。如以下更详细描述的，集成电路设备可以编程为估算样本中每个荧光团的丰度。在某些实施例中，可以确定与目标颗粒相关联的每个荧光团的丰度。该集成电路可以编程为基于与目标颗粒相关联的每个荧光团的丰度来识别目标颗粒并将其分类。在某些情况下，将集成电路配置为将所识别或分选的颗粒进行分选。
在一些实施例中，该集成电路编程为使用加权最小二乘算法来计算光谱解混矩阵。在一些情况下，将集成电路编程为根据下式来计算加权最小二乘算法：
其中，y是光探测系统的多个光电探测器针对每个颗粒测量的探测器值；
是估算的荧光团丰度；X是溢出；并且W是
在一些实施例中，根据下式来计算每个Wii：
其中σi 2是探测器i处的方差；yi是探测器i处的信号；并且λi是探测器i处的恒定噪声。在某些实施例中，现场可编程门阵列配置为根据下式来计算光谱解混矩阵：(XTWX)-1XTW。在一些情况下，该方法包括针对由光探测系统所探测到的每个细胞对(XTWX)求逆，以计算光谱解混矩阵。在一些情况下，将该集成电路编程为针对由光探测系统所探测到的每个细胞来对(XTWX)求逆，以计算光谱解混矩阵。
在某些实施例中，将集成电路编程为针对所探测到的每个细胞在加权最小二乘算法中对(XTWX)近似求逆，以便对样本中的细胞进行实时地分选。在一些实施例中，集成电路配置为根据下式使用迭代Newton-Raphson计算来近似(XTWX)，以对(XTWX)求逆：
A-1＝(XTWX)-1；
其中WG是W的预定近似值，该W是根据光探测系统中的每个光电探测器的方差来确定的。在一些实施例中，将集成电路编程为进一步估算每个光电探测器的方差。在某些情况下，基于单染色对照样本、利用光电探测器噪声分量的估算来对集成电路进行编程。在其他情况下，在利用光源照射样本之前，将每个光电探测器的方差都编程到集成电路中。在其他情况下，在利用光源照射样本之前，将迭代Newton-Raphson计算中的W的预定近似值WG编程到集成电路中。在某些实施例中，将集成电路设备编程为利用预定的WG来预计算A0 -1。在这些实施例中，可以将预计算的A0 -1编程到集成电路设备中，并且用作针对由光探测系统所探测到每个颗粒的A-1的第一近似值。
在其他实施例中，将关注的集成电路设备编程为利用Sherman-Morrison迭代逆更新器针对每个颗粒来近似加权最小二乘算法。在一些情况下，将集成电路设备编程为用于使用Sherman-Morrison公式来计算A：
在某些情况下，将集成电路设备编程为用于使用Sherman-Morrison公式来预计算A0 -1以计算A0扰动的逆。在一些实施例中，通过公式XTW0X来计算A0的逆，并且通过公式XTWX来计算A的逆。在一些情况下，将集成电路设备编程为根据下式来计算ΔA(即A-A0)作为列向量与每个迭代W的乘积：
其中Wii＝w0 ii+αi，其中i∈[1，ND]。
根据实施例，ΔAi＝XTΔWiX＝αimimi T，其中A能够表示为：
在这些实施例中，能够使用对每个wi的改变，利用每个新的加权矩阵W(即具有与W0不同的值)根据A0来重新计算每个A。在一些实施例中，将集成电路设备编程为实施Sherman-Morrison迭代逆更新器，以根据下式来近似光谱解混矩阵：
在一些实施例中，将用于A0 -1的预计算的值用于计算A1 -1。然后将预计算的A1 -1用于计算A2 -1。能够通过使用从i＝1到ND的每个(Ai-1)-1来重复计算Ai -1，从而计算值A-1。
在其他实施例中，将关注的集成电路设备编程为通过矩阵分解针对每个颗粒来计算加权最小二乘算法。在一些情况下，将集成电路设备编程为用于LU矩阵分解的指令，诸如其中将矩阵分解为下三角(L)矩阵和上三角(U)矩阵的乘积。在某些情况下，LU分解包括高斯消除。在其他情况下，LU分解包括修正的Cholesky分解、LDL分解，其中D是对角矩阵。在某些实施例中，将集成电路设备编程为根据下式使用修正的Cholesky分解来计算加权最小二乘算法(a)：
XTWXa＝XTWy
Aa＝B
LDLTa＝B LDL分解
Lz＝B其中z＝DLTa 下三角矩阵解
Dx＝Z其中x＝LTa对角矩阵解
LTa＝x 上三角矩阵解
在其他实施例中，将集成电路设备编程为通过QR因式分解来计算加权最小二乘算法。在一些情况下，QR因式分解是矩阵，该矩阵是正交(Q)矩阵和上三角(R)矩阵的乘积。在一些实施例中，将集成电路设备编程为根据下式使用QR因式分解来计算加权最小二乘算法(a)：
XTWXa＝XTWy
在其他实施例中，将集成电路设备编程为通过奇异值分解(SVD)来计算加权最小二乘算法。在一些情况下，奇异值分解是矩阵，该矩阵是乘积
其中U和V是正交矩阵，并且∑是含有
奇异值的对角矩阵。在某些情况下，将集成电路设备编程为根据下式使用奇异值分解来计算加权最小二乘算法(a)：
z＝UTy
∑w＝z
a＝Vw
在一些实施例中，将关注的集成电路编程为通过对每个荧光团的光进行光谱解析来计算样本中一个或更多个荧光团的丰度。在某些情况下，通过对与颗粒相关联的每个荧光团的光进行光谱解析来计算与目标颗粒相关联(例如，化学相关(即，共价、离子)或物理相关)的荧光团的丰度。例如，在一个示例中，将集成电路编程为通过对每个荧光团的光进行光谱解析来计算与目标颗粒相关联的每个荧光团的相对丰度。在另一示例中，将集成电路编程为通过对每个荧光团的光进行光谱解析来计算与目标颗粒相关联的每个荧光团的绝对丰度。
在某些实施例中，将该集成电路编程为基于确定为与颗粒相关联的每个荧光团的相对丰度来对颗粒进行识别或分类。在这些实施例中，该集成电路可以编程为通过任何方便的方案来对颗粒进行识别或分类，诸如通过：将与颗粒相关联的每个荧光团的相对或绝对丰度与具有已知一致性颗粒的对照样本进行比较；或者通过对具有相关联荧光团所计算出的相对或绝对丰度的颗粒(例如细胞)群体进行光谱或其他测定分析。
套件
本公开的方面还包括套件，其中套件包括本文所述集成电路中的一个或更多个。在一些实施例中，套件还可以包括用于本主题系统的程序，诸如以计算机可读介质(例如，闪存驱动器、USB存储器、光盘、DVD、蓝光盘等)的形式，或者包括用于从互联网web协议或云服务器中下载程序的指令。套件还可以包括用于实践本主题方法的指令。这些指令可以以多种形式存在于本主题套件中，其中的一个或更多个可以存在于所述套件中。这些指令可以存在的其中一种形式是在套件包装中、在包装插入件等的适当的介质或基材(例如在信息打印于其上的一张或多张纸)上打印的信息。这些指令的另一形式是其上已经记录有信息的计算机可读介质，例如软盘、光盘(CD)、便携式闪存驱动器等。这些指令可能存在的另一形式是网站地址，可以使用该网站地址经由互联网来访问已删除站点处的信息。
用途
本主题系统、方法和计算机系统可用于各种需要分析并分选流体介质中样本(诸如生物样本)中的颗粒组分的应用中。在一些实施例中，本文所描述的系统和方法可以用于利用荧光标签来标记的生物样本的流式细胞术表征。在其他实施例中，该系统和方法可以用于所发射光的光谱学。另外，本主题系统和方法可以用于增加从(例如，在束流中)样本所收集的光的可获得的信号。在某些情况下，本公开可以用于增强对从样本中所收集的光的测量，该样本在流式细胞仪中的束流中进行照射。本公开的实施例可以用于需要在细胞分选期间提供具有改进的细胞分选准确性、增强颗粒收集、颗粒带电效率、更精确颗粒带电以及增强颗粒偏转的流式细胞仪。
本公开的实施例也可以用于可能需要由生物样本制备的细胞以用于研究、实验室测试或用于治疗的应用中。在一些实施例中，本主题方法和设备可以有助于获得由目标流体或组织生物样本制备的单个细胞。例如，本主题方法和系统有助于从流体或组织样本中获得细胞，以用作诸如癌症的疾病的研究或诊断样品。同样，本主题方法和系统可以有助于从流体或组织样本中获得细胞以用于治疗。与传统流式细胞术系统相比，本公开的方法和设备允许以增强的效率和低成本来从生物样本(例如，器官、组织、组织片段、流体)中分离和收集细胞。
本文所描述主题的多方面(包括实施例)单独使用或与一个或更多个其他方面或实施例相结合都是有益的。在不限制说明书的情况下，以下提供编号1-320的本公开的某些非限制性方面。对于本领域技术人员而言，在阅读本公开后将显而易见的是，各个单独编号的方面中的每个都可以与之前或之后的单独编号的方面中的任一个相结合使用或组合。这旨在为各方面的所有此类组合来提供支持，并且不限于以下明确提供的各方面的组合：
1、一种方法，包括：
利用光探测系统探测来自样本的光，所述样本包括具有重叠的荧光光谱的多个荧光团；以及
对来自样本中每个荧光团的光进行光谱解析。
2、根据1所述的方法，其中，每个荧光团的荧光光谱与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠。
3、根据2所述的方法，其中，每个荧光团的荧光光谱与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠10nm或更多。
4、根据2所述的方法，其中，每个荧光团的荧光光谱与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠25nm或更多。
5、根据1所述的方法，其中，样本中至少一个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠。
6、根据5所述的方法，其中，样本中至少一个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠10nm或更多。
7、根据5所述的方法，其中，样本中至少一个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠25nm或更多。
8、根据1-7中任一项所述的方法，其中，对来自每个荧光团的光进行光谱解析包括计算样本中每个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵。
9、根据8所述的方法，其中，所述方法包括使用加权最小二乘算法来计算光谱解混矩阵。
10、根据9所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式来计算的：
其中：
y是光探测系统的多个光电探测器针对每个细胞所测量的探测器值；
X是溢出；以及
W是
11、根据10所述的方法，其中每个Wii是根据下式来计算的：
其中：
σi 2是探测器i处的方差；
yi是探测器i处的信号；以及
λi是探测器i处的恒定噪声。
12、根据9-11中任一项所述的方法，其中，所述方法包括根据下式来计算光谱解混矩阵：
(XTWX)-1XTW
13、根据9-11中任一项所述的方法，其中，所述方法包括针对每个细胞对(XTWX，)求逆来计算光谱解混矩阵。
14、根据13所述的方法，其中，对(XTWX)求逆包括根据下式使用迭代Newton-Raphson计算来近似(XTWX)：
A-1＝(XTWX)-1；
其中WG是W的预定近似值，该W是根据光探测系统中的每个光电探测器的方差来确定的。
15、根据14所述的方法，还包括在利用光源照射样本之前确定WG。
16、根据15所述的方法，还包括利用所计算的WG值来预计算A0 -1。
17、根据9-13中任一项所述的方法，其中，所述方法包括根据下式使用Sherman-Morrison迭代逆更新器来近似(XTWX)：
18、根据17所述的方法，其中，ΔAi＝XTΔWiX＝αimimi T，其中：
19、根据18所述的方法，还包括根据下式来近似光谱解混矩阵：
20、根据19所述的方法，其中，使用A0 -1的预计算值来计算A1 -1，并且通过使用从i＝1到ND的每个(Ai-1)-1进行重复计算Ai -1来计算A-1。
21、根据9-13中任一项所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是通过矩阵分解来计算的。
22、根据21所述的方法，其中，所述矩阵分解包括LU分解。
23、根据22所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式使用修正的Cholesky分解来计算的：
XTWXa＝XTWy
Aa＝B
LDLTa＝B
Lz＝B其中z＝DLTa
Dx＝z其中x＝LTa
LTa＝x
24、根据21所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是通过QR因式分解来计算的。
25、根据24所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式使用QR因式分解来计算的：
XTWXa＝XTWy
26、根据21所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是通过奇异值分解来计算的。
27、根据26所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式使用奇异值分解来计算的：
z＝UTy
∑w＝z
a＝VW
其中U和V是正交矩阵，并且∑是含有
的奇异值的对角矩阵。
28、根据13-27中任一项所述的方法，其中，所述光谱解混矩阵是在现场可编程门阵列上计算的。
29、根据1-28中任一项所述的方法，还包括利用光源来照射样本。
30、根据29所述的方法，其中，所述光源包括激光器。
31、根据30所述的方法，其中，所述光源包括多个激光器。
32、根据1-31中任一项所述的方法，其中，所述光探测系统包括多个光电探测器。
33、根据32所述的方法，其中，所述光电探测器包括一个或更多个光电倍增管。
34、根据1-31中任一项所述的方法，其中，所述光探测系统包括光电探测器阵列。
35、根据34所述的方法，其中，所述光电探测器阵列包括光电二极管。
36、根据34所述的方法，其中，所述光电探测器阵列包括电荷耦合器件。
37、一种系统，包括：
光源，其配置为照射包括具有重叠的荧光光谱的多个荧光团的样本；
光探测系统，其包括多个光电探测器；以及
处理器，所述处理器包括可操作地耦接到处理器的存储器，其中所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器对来自样本的每个荧光团的光进行光谱解析。
38、根据37所述的系统，其中，每个荧光团的荧光光谱与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠。
39、根据38所述的系统，其中，每个荧光团的荧光光谱与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠10nm或更多。
40、根据38所述的系统，其中，每个荧光团的荧光光谱与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠25nm或更多。
41、根据37所述的系统，其中，样本中至少一个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠。
42、根据41所述的系统，其中，样本中至少一个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠10nm或更多。
43、根据41所述的系统，其中，样本中至少一个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠25nm或更多。
44、根据37-43中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器计算样本中每个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵。
45、根据44所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器通过加权最小二乘算法来计算光谱解混矩阵。
46、根据45所述的系统，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式来计算的：
其中：
y是光探测系统的多个光电探测器针对每个细胞所测量的探测器值；
X是溢出；以及
W是
47、根据46所述的系统，其中，每个Wii是根据下式来计算的：
其中：
σi 2是探测器i处的方差；
yi是探测器i处的信号；以及
λi是探测器i处的恒定噪声。
48、根据45-47中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器根据下式来计算光谱解混矩阵：
(XTWX)-1XTW。
49、根据48所述的系统，其中，针对由光探测系统所探测到的每个细胞对(XTWX)求逆，以计算光谱解混矩阵。
50、根据49所述的系统，其中，根据下式使用迭代Newton-Raphson计算来近似(XTWX)的逆：
A-1＝(XTWX)-1；
其中WG是W的预定近似值，该W是根据光探测系统中的每个光电探测器的方差来确定的。
51、根据50所述的系统，其中，所述光电探测器的方差包括光电探测器噪声分量。
52、根据51所述的系统，其中，所述光电探测器噪声分量包括电子噪声和光学背景光中的一个或更多个。
53、根据51-52中任一项所述的系统，其中，所述光电探测器的方差与由光电探测器所测得的光强度成比例。
54、根据51-53中任一项所述的系统，其中，所述光电探测器噪声分量是使用单染色对照样本来估算的。
55、根据51-54中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器在利用光源照射样本之前自动地确定每个光电探测器的方差。
56、根据51-55中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器在利用光源照射样本之前自动地确定WG。
57、根据56所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器基于所确定的WG值来计算A0 -1。
58、根据44-49中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器根据下式使用Sherman-Morrison迭代逆更新器来近似(XTWX)：
59、根据58所述的系统，其中ΔAi＝XTΔWiX＝αimimi T，其中：
60、根据59所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器根据下式来近似光谱解混矩阵：
61、根据60所述的系统，其中，使用A0 -1的预计算值来计算A1 -1，并且使用从i＝1到ND的每个(Ai-1)-1通过重复计算Ai -1来计算A-1。
62、根据44-49中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器通过矩阵分解来计算加权最小二乘算法。
63、根据62所述的系统，其中，所述矩阵分解包括LU分解。
64、根据63所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器根据下式使用修正的Cholesky分解来计算加权最小二乘算法：
XTWXa＝XTWy
Aa＝B
LDLTa＝B
Lz＝B其中z＝DLTa
Dx＝z其中x＝LTa
LTa＝x
65、根据62所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器通过QR因式分解来计算加权最小二乘算法。
66、根据65所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器根据下式使用QR因式分解来计算加权最小二乘算法：
XTWXa＝XTWy
67、根据62所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器通过奇异值分解来计算加权最小二乘算法。
68、根据67所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器根据下式使用奇异值分解来计算加权最小二乘算法：
z＝UTy
∑W＝Z
a＝Vw，
其中U和V是正交矩阵，并且∑是含有
的奇异值的对角矩阵。
69、根据37-68中任一项所述的系统，其中，所述光谱解混矩阵是在现场可编程门阵列上计算的。
70、根据37-69中任一项所述的系统，其中，所述光源包括激光器。
71、根据70所述的系统，其中，所述光源包括多个激光器。
72、根据37-71中任一项所述的系统，其中，所述光探测系统包括光电倍增管。
73、根据37-72中任一项所述的系统，其中，所述光探测系统包括光电探测器阵列。
74、根据73所述的系统，其中，所述光电探测器阵列包括光电二极管。
75、根据74所述的系统，其中，所述光电探测器阵列包括电荷耦合器件。
76、一种集成电路，其被编程为对来自样本中的每个荧光团的光进行光谱解析，所述样本包括具有重叠的荧光光谱的多个荧光团。
77、根据76所述的集成电路，其中，每个荧光团的荧光光谱与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠。
78、根据77所述的集成电路，其中，每个荧光团的荧光光谱与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠10nm或更多。
79、根据77所述的集成电路，其中，每个荧光团的荧光光谱与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠25nm或更多。
80、根据76所述的集成电路，其中，样本中至少一个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠。
81、根据80所述的集成电路，其中，样本中至少一个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠10nm或更多。
82、根据80所述的集成电路，其中，样本中至少一个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠25nm或更多。
83、根据76-82中任一项所述的集成电路，其中，所述集成电路编程为计算样本中每个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵。
84、根据83所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为通过加权最小二乘算法来计算光谱解混矩阵。
85、根据84所述的集成电路，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式来计算的：
其中：
y是光探测系统的多个光电探测器针对每个细胞所测量的探测器值；
X是溢出；以及
W是
86、根据85所述的集成电路，其中每个Wii是根据下式来计算的：
其中：
σi 2是探测器i处的方差；
yi是探测器i处的信号；以及
λi是探测器i处的恒定噪声。
87、根据84-86中任一项所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为根据下式来计算光谱解混矩阵：
(XTWX)-1XTW。
88、根据87所述的集成电路，其中，针对由光探测系统所探测到的每个细胞来对(XTWX)求逆，以计算光谱解混矩阵。
89、根据88所述的集成电路，其中，根据下式使用迭代Newton-Raphson计算来近似(XTWX)的逆：
A-1＝(XTWX)-1；
其中WG是W的预定近似值，W是由用于探测来自样本中荧光团的荧光的光探测系统中的每个光电探测器的方差来确定的。
90、根据89所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为在利用光源照射样本之前自动地确定WG。
91、根据90所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为基于所确定的WG值来计算A0 -1。
92、根据83-88中任一项所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为根据下式使用Sherman-Morrison迭代逆更新器来近似(XTWX)：
93、根据92所述的集成电路，其中，ΔAi＝XTΔWiX＝αimimi T，其中：
94、根据93所述的集成电路，其中，所述集成电路编程为根据下式来近似光谱解混矩阵：
95、根据94所述的集成电路，其中，使用A0 -1的预计算值来计算A1 -1，并且使用从i＝1到ND的每个(Ai-1)-1通过重复计算Ai -1来计算A-1。
96、根据84所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为通过矩阵分解来计算加权最小二乘算法。
97、根据96所述的集成电路，其中，所述矩阵分解包括LU分解。
98、根据97所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为根据下式使用修正的Cholesky分解来计算加权最小二乘算法：
XTWXa＝XTWy
Aa＝B
LDLTa＝B
Lz＝B其中z＝DLTa
Dx＝z其中x＝LTa
LTa＝x。
99、根据96所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为通过QR因式分解来计算加权最小二乘算法。
100、根据99所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为根据下式使用QR因式分解来计算加权最小二乘算法：
XTWXa＝XTWy
101、根据96所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为通过奇异值分解来计算加权最小二乘算法。
102、根据101所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为根据下式使用奇异值分解来计算加权最小二乘算法：
z＝UTy
∑w＝z
a＝Vw
其中U和V是正交矩阵，并且∑是含有
的奇异值的对角矩阵。
103、根据76-102中任一项所述的集成电路，其中，所述集成电路是现场可编程门阵列(FPGA)。
104、根据权利要求76-102中任一项所述的集成电路，其中，所述集成电路是专用集成电路(ASIC)。
105、根据62-102中任一项所述的集成电路，其中，所述集成电路是复杂可编程逻辑器件(CPLD)。
106、一种方法，包括：
利用光探测系统来探测来自样本的光，所述样本包括多个荧光团，所述多个荧光团具有重叠的荧光光谱；以及
估算样本中颗粒上的一个或更多个荧光团的丰度。
107、根据106所述的方法，其中，每个荧光团的荧光光谱与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠。
108、根据107所述的方法，其中，每个荧光团的荧光光谱与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠10nm或更多。
109、根据107所述的方法，其中，每个荧光团的荧光光谱与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠25nm或更多。
110、根据106所述的方法，其中，样本中至少一个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠。
111、根据110所述的方法，其中，样本中至少一个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠10nm或更多。
112、根据111所述的方法，其中，样本中至少一个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠25nm或更多。
113、根据106-112中任一项所述的方法，其中，估算荧光团的丰度包括对来自颗粒上每个荧光团的光进行光谱解析。
114、根据113所述的方法，其中，对来自每个荧光团的光进行光谱解析包括计算颗粒上每个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵。
115、根据114所述的方法，其中，所述方法包括使用加权最小二乘算法来计算光谱解混矩阵。
116、根据115所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式来计算的：
其中：
y是光探测系统的多个光电探测器针对每个细胞所测量的探测器值；
X是溢出；以及
W是
117、根据116所述的方法，其中，每个Wii是根据下式来计算的：
其中：
σi 2是探测器i处的方差；
yi是探测器i处的信号；以及
λi是探测器i处的恒定噪声。
118、根据115-117中任一项所述的方法，其中，所述方法包括根据下式来计算光谱解混矩阵：
(XTWX)-1XTW。
119、根据115-117中任一项所述的方法，其中，所述方法包括针对每个细胞对(XTWX)求逆以计算光谱解混矩阵。
120、根据119所述的方法，其中，对(XTWX)求逆包括根据下式使用迭代Newton-Raphson计算来近似(XTWX)：
A-1＝(XTWX)-1；
其中WG是W的预定近似值，W是根据光探测系统中的每个光电探测器的方差来确定的。
121、根据120所述的方法，还包括在利用光源照射样本之前确定WG。
122、根据121所述的方法，还包括利用所计算的WG值来预计算A0 -1。
123、根据114-119中任一项所述的方法，其中，所述方法包括根据下式使用Sherman-Morrison迭代逆更新器来近似(XTWX)：
124、根据123所述的方法，其中，ΔAi＝XTΔWiX＝αimimi T，其中：
125、根据124所述的方法，还包括根据下式来近似光谱解混矩阵：
126、根据125所述的方法，其中，使用A0 -1的预计算值来计算A1 -1，并且使用从i＝1到ND的每个(Ai-1)-1通过重复计算Ai -1来计算A-1。
127、根据114-119中任一项所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是通过矩阵分解来计算的。
128、根据127所述的方法，其中，所述矩阵分解包括LU分解。
129、根据128所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式使用修正的Cholesky分解来计算的：
XTWXa＝XTWy
Aa＝B
LDLTa＝B
Lz＝B其中z＝DLTa
Dx＝z其中x＝LTa
LTa＝x。
130、根据127所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是通过QR因式分解来计算的。
131、根据130所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式使用QR因式分解来计算的：
XTWXa＝XTWy
132、根据131所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是通过奇异值分解来计算的。
133、根据132所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式使用奇异值分解来计算的：
z＝UTy
∑W＝Z
a＝VW
其中U和V是正交矩阵，并且∑是含有
的奇异值的对角矩阵。
134、根据114-133中任一项所述的方法，其中，所述光谱解混矩阵是在现场可编程门阵列上计算的。
135、根据106-134中任一项所述的方法，还包括基于颗粒上每个荧光团的估算的丰度来识别样本中的颗粒。
136、根据106-135中任一项所述的方法，其中，所述颗粒为细胞。
137、根据106-136中任一项所述的方法，其中，每个荧光团都偶联到生物分子。
138、根据137所述的方法，其中，所述生物分子是选自多肽、核酸和多糖的化合物。
139、根据135-138中任一项所述的方法，还包括基于颗粒上每个荧光团的估算的丰度来分选颗粒。
140、根据106-139中任一项所述的方法，还包括利用光源来照射样本。
141、根据140所述的方法，其中，所述光源包括激光器。
142、根据141所述的方法，其中，所述光源包括多个激光器。
143、根据106-142中任一项所述的方法，其中，所述光探测系统包括多个光电探测器。
144、根据143所述的方法，其中，所述光电探测器包括一个或更多个光电倍增管。
145、根据106-142中任一项所述的方法，其中，所述光探测系统包括光电探测器阵列。
146、根据145所述的方法，其中，所述光电探测器阵列包括光电二极管。
147、根据146所述的方法，其中，所述光电探测器阵列包括电荷耦合器件。
148、一种系统，包括：
光源，其配置为照射包括具有重叠的荧光光谱的多个荧光团的样本；
光探测系统，其包括多个光电探测器；以及
处理器，所述处理器包括可操作地耦接到处理器的存储器，其中所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器估算样本中颗粒上的一个或更多个荧光团的丰度。
149、根据148所述的系统，其中，每个荧光团的荧光光谱与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠。
150、根据149所述的系统，其中，每个荧光团的荧光光谱与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠10nm或更多。
151、根据149所述的系统，其中，每个荧光团的荧光光谱与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠25nm或更多。
152、根据148所述的系统，其中，样本中至少一个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠。
153、根据152所述的系统，其中，样本中至少一个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠10nm或更多。
154、根据152所述的系统，其中，样本中至少一个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠25nm或更多。
155、根据148-154中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器通过对来自颗粒上每个荧光团的光进行光谱解析来估算荧光团的丰度。
156、根据155所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器计算样本中每个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵。
157、根据156所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器通过加权最小二乘算法来计算光谱解混矩阵。
158、根据157所述的系统，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式来计算的：
其中：
y是光探测系统的多个光电探测器针对每个细胞所测量的探测器值；
X是溢出；以及
W是
159、根据158所述的系统，其中每个Wii是根据下式来计算的：
其中：
σi 2是探测器i处的方差；
yi是探测器i处的信号；以及
λi是探测器i处的恒定噪声。
160、根据157-159中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器根据下式来计算光谱解混矩阵：
(XTWX)-1XTW。
161、根据160所述的系统，其中，针对由光探测系统所探测到的每个细胞来对(XTWX)求逆，以计算光谱解混矩阵。
162、根据161所述的系统，其中，根据下式使用迭代Newton-Raphson计算来近似(XTWX)的逆：
A-1＝(XTWX)-1；
其中WG是W的预定近似值，W是根据光探测系统中的每个光电探测器的方差来确定的。
163、根据162所述的系统，其中，所述光电探测器的方差包括光电探测器噪声分量。
164、根据163所述的系统，其中，所述光电探测器噪声分量包括电子噪声和光学背景光中的一个或更多个。
165、根据163-164中任一项所述的系统，其中，所述光电探测器的方差与由光电探测器所测得的光强度成比例。
166、根据163-164中任一项所述的系统，其中，所述光电探测器噪声分量是使用单染色对照样本来估算的。
167、根据165-166中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器在利用光源照射样本之前自动地确定每个光电探测器的方差。
168、根据164-167中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器在利用光源照射样本之前自动地确定WG。
169、根据168所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器基于所确定的WG值来计算Ab -1。
170、根据156-161中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器根据下式使用Sherman-Morrison迭代逆更新器来近似(XTWX)：
171、根据权利要求170所述的系统，其中，ΔAi＝XTΔWjX＝αimimi T，其中：
172、根据171所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器根据下式来近似光谱解混矩阵：
173、根据172所述的系统，其中，使用A0 -1的预计算值来计算A1 -1，并且使用从i＝1到ND的每个(Ai-1)-1通过重复计算Ai -1来计算A-1。
174、根据156-161中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器通过矩阵分解来计算加权最小二乘算法。
175、根据174所述的系统，其中，所述矩阵分解包括LU分解。
176、根据175所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器根据下式使用修正的Cholesky分解来计算加权最小二乘算法：
XTWXa＝XTWy
Aa＝B
LDLTa＝B
Lz＝B其中z＝DLTa
Dx＝z其中x＝LTa
LTa＝x。
177、根据174所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器通过QR因式分解来计算加权最小二乘算法。
178、根据177所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器根据下式使用QR因式分解来计算加权最小二乘算法：
XTWXa＝XTWy
179、根据174所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器通过奇异值分解来计算加权最小二乘算法。
180、根据179所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器根据下式使用奇异值分解来计算加权最小二乘算法：
z＝UTy
∑W＝Z
a＝VW
其中U和V是正交矩阵，并且Σ是含有
的奇异值的对角矩阵。
181、根据156-180中任一项所述的系统，其中，所述光谱解混矩阵是在现场可编程门阵列上计算的。
182、根据148-181中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器基于颗粒上每个荧光团的所估算的丰度来识别样本中的颗粒。
183、根据148-182中任一项所述的系统，其中，所述颗粒为细胞。
184、根据148-183中任一项所述的系统，其中，每个荧光团都偶联到生物分子。
185、根据184所述的系统，其中，所述生物分子是选自多肽、核酸和多糖的化合物。
186、根据182-185中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器基于颗粒上每个荧光团的所估算的丰度来分选颗粒。
187、根据148-186中任一项所述的系统，其中，所述光源包括激光器。
188、根据187所述的系统，其中，所述光源包括多个激光器。
189、根据148-188中任一项所述的系统，其中，所述光探测系统包括光电倍增管。
190、根据148-189中任一项所述的系统，其中，所述光探测系统包括光电探测器阵列。
191、根据190所述的系统，其中，所述光电探测器阵列包括光电二极管。
192、根据190所述的系统，其中，所述光电探测器阵列包括电荷耦合器件。
193、一种集成电路，其被编程为估算样本中颗粒上的一个或更多个荧光团的丰度，所述样本包括具有重叠的荧光光谱的多个荧光团。
194、根据193所述的集成电路，其中，每个荧光团的荧光光谱与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠。
195、根据194所述的集成电路，其中，每个荧光团的荧光光谱与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠10nm或更多。
196、根据194所述的集成电路，其中，每个荧光团的荧光光谱与样本中至少一个其他荧光团的荧光光谱重叠25nm或更多。
197、根据193所述的集成电路，其中，样本中至少一个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠。
198、根据197所述的集成电路，其中，样本中至少一个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠10nm或更多。
199、根据197所述的集成电路，其中，样本中至少一个荧光团的荧光光谱与样本中两个不同荧光团的荧光光谱重叠25nm或更多。
200、根据193-199中任一项所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为通过对来自颗粒上每个荧光团的光进行光谱解析来估算荧光团的丰度。
201、根据193-199中任一项所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为计算样本中每个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵。
202、根据201所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为通过加权最小二乘算法来计算光谱解混矩阵。
203、根据202所述的集成电路，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式来计算的：
其中：
y是光探测系统的多个光电探测器针对每个细胞所测量的探测器值；
X是溢出；以及
W是
204、根据202所述的集成电路，其中每个Wii是根据下式来计算的：
其中：
σi 2是探测器i处的方差；
yi是探测器i处的信号；以及
λi是探测器i处的恒定噪声。
205、根据202-204中任一项所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为根据下式来计算光谱解混矩阵：
(XTWX)-1XTW。
206、根据205所述的集成电路，其中，针对由光探测系统所探测到的每个细胞来对(XTWX)求逆，以计算光谱解混矩阵。
207、根据205所述的集成电路，其中，根据下式使用迭代Newton-Raphson计算来近似(XTWX)的逆：
A-1＝(XTWX)-1；
其中WG是W的预定近似值，W是根据用于探测来自样本中荧光团的荧光的光探测系统中的每个光电探测器的方差来确定的。
208、根据207所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为在利用光源照射样本之前自动地确定WG。
209、根据208所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为基于所确定的WG值来计算A0 -1。
210、根据201-206中任一项所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为根据下式使用Sherman-Morrison迭代逆更新器来近似(XTWX)：
211、根据210所述的集成电路，其中，ΔAi＝XTΔWiX＝cimimi T，其中：
212、根据211所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为根据下式来近似光谱解混矩阵：
213、根据212所述的集成电路，其中，使用A0 -1的预计算值来计算A1 -1，并且使用从i＝1到ND的每个(Ai-1)-1通过重复计算Ai -1来计算A-1。
214、根据201-206中任一项所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为通过矩阵分解来计算加权最小二乘算法。
215、根据214所述的集成电路，其中，所述矩阵分解包括LU分解。
216、根据215所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为根据下式使用修正的Cholesky分解来计算加权最小二乘算法：
XTWXa＝XTWy
Aa＝B
LDLTa＝B
Lz＝B其中z＝DLTa
Dx＝z其中x＝LTa
LTa＝x。
217、根据214所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为通过QR因式分解来计算加权最小二乘算法。
218、根据217所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为根据下式使用QR因式分解来计算加权最小二乘算法：
XTWXa＝XTWy
219、根据218所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为通过奇异值分解来计算加权最小二乘算法。
220、根据219所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为根据下式使用奇异值分解来计算加权最小二乘算法：
z＝UTy
∑w＝z
a＝Vw
其中U和V是正交矩阵，并且∑是含有
的奇异值的对角矩阵。
221、根据193-220中任一项所述的集成电路，其中，所述集成电路被编程为基于颗粒上每个荧光团的所估算的丰度来识别样本中的颗粒。
222、根据221所述的集成电路，其中，所述集成电路编程为基于颗粒上每个荧光团的所估算的丰度来分选颗粒。
223、根据193-222中任一项所述的集成电路，其中，所述集成电路是现场可编程门阵列(FPGA)。
224、根据193-222中任一项所述的集成电路，其中，所述集成电路是专用集成电路(ASIC)。
225、根据193-222中任一项所述的集成电路，其中，所述集成电路是复杂可编程逻辑器件(CPLD)。
226、一种系统，包括：
光源，其配置为照射包括多个荧光团的样本；
光探测系统，其包括多个光电探测器；以及
处理器，其包括可操作地耦接到所述处理器的存储器，其中所述存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器：
针对由光探测系统所探测到的每个细胞来计算多个荧光团的荧光光谱的光谱分解矩阵；以及
使用所述光谱解混矩阵来估算每个荧光团的丰度；以及
细胞分选组件，其配置为基于所估算的荧光团丰度来对样本中的细胞进行分选。
227、根据226所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器通过加权最小二乘算法来计算光谱解混矩阵。
228、根据227所述的系统，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式来计算的：
其中：
y是光探测系统的多个光电探测器针对每个细胞所测量的探测器值；
X是溢出；以及
W是
229、根据228所述的系统，其中，每个Wii是根据下式来计算的：
其中：
σi 2是探测器i处的方差；
yi是探测器i处的信号；以及
λi是探测器i处的恒定噪声。
230、根据228所述的系统，其中，所述光谱解混矩阵根据下式来计算：
(XTWX)-1XTW。
231、根据228所述的系统，其中，针对由光探测系统所探测到的每个细胞来对(XTWX)求逆，以计算光谱解混矩阵。
232、根据231所述的系统，其中，根据下式使用迭代Newton-Raphson计算来近似(XTWX)的逆：
A-1＝(XTWX)-1；
其中WG是W的预定近似值，W是根据光探测系统中的每个光电探测器的方差来确定的。
233、根据232所述的系统，其中，所述光电探测器的方差包括光电探测器噪声分量。
234、根据233所述的系统，其中所述光电探测器噪声分量包括电子噪声和光学背景光中的一个或更多个。
235、根据233-234中任一项所述的系统，其中，所述光电探测器的方差与由光电探测器所测得的光强度成比例。
236、根据233-235中任一项所述的系统，其中，所述光电探测器噪声分量是使用单染色对照样本来估算的。
237、根据233-236中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器在利用光源照射样本之前自动地确定每个光电探测器的方差。
238、根据232-237中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使得处理器在利用光源照射样本之前自动地确定WG。
239、根据238所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器基于所确定的WG值来计算A0 -1。
240、根据239所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器基于所确定的WG值来计算A0 -1。
241、根据227-231中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器根据下式使用Sherman-Morrison迭代逆更新器来近似XTWX：
242、根据241所述的系统，其中，ΔAi＝XTΔWiX＝αimimi T，其中：
243、根据242所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器根据下式来近似光谱解混矩阵：
244、根据243所述的系统，其中，使用A0 -1的预计算值来计算A1 -1，并且使用从i＝1到ND的每个(Ai-1)-1通过重复计算Ai -1来计算A-1。
245、根据227-231中任一项所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器通过矩阵分解来计算加权最小二乘算法。
246、根据245所述的系统，其中，所述矩阵分解包括LU分解。
247、根据246所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器根据下式使用修正的Cholesky分解来计算加权最小二乘算法：
XTWXa＝XTWy
Aa＝B
LDLTa＝B
Lz＝B其中z＝DLTa
Dx＝z其中x＝LTa
LTa＝x。
248、根据245所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器通过QR因式分解来计算加权最小二乘算法。
249、根据248所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器根据下式使用QR因式分解来计算加权最小二乘算法：
XTWXa＝XTWy
250、根据245所述的系统，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器通过奇异值分解来计算加权最小二乘算法。
251、根据250所述的系统，其中所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由处理器执行时使得处理器根据下式使用奇异值分解来计算加权最小二乘算法：
z＝UTy
∑W＝z
a＝VW
其中U和V是正交矩阵，并且Σ是含有
的奇异值的对角矩阵。
252、根据226-251中任一项所述的系统，其中所述光谱解混矩阵是在现场可编程门阵列上计算的。
253、根据226-252中任一项所述的系统，其中，所述光源包括激光器。
254、根据253所述的系统，其中，所述光源包括多个激光器。
255、根据226-254中任一项所述的系统，其中，所述光探测系统包括光电倍增管。
256、根据226-255中任一项所述的系统，其中，所述光探测系统包括光电探测器阵列。
257、根据256所述的系统，其中，所述光电探测器阵列包括光电二极管。
258、根据256所述的系统，其中，所述光电探测器阵列包括电荷耦合器件。
259、根据226-258中任一项所述的系统，其中，所述细胞分选组件包括液滴偏转器。
260、根据226-259中任一项所述的系统，其中，所述系统还包括：
包括孔口的流细胞喷嘴；以及
与流细胞喷嘴孔口流体连通的样本探询区域，以用于利用光源来照射样本。
261、根据260所述的系统，还包括定位在所述样本探询区域中的比色杯。
262、一种用于对样本的细胞进行分选的方法，所述方法包括：
利用包括多个光电探测器的光探测系统来探测来自包括多个荧光团的样本所发射的光；
针对由光探测系统所探测到的每个细胞来计算多个荧光团荧光光谱的光谱分解矩阵；
使用所述光谱解混矩阵来估算每个荧光团的丰度；以及
基于所估算的荧光团丰度来对样本中的细胞进行分选。
263、根据262所述的方法，其中，所述方法包括使用加权最小二乘算法来计算光谱解混矩阵。
264、根据263所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式来计算的：
其中：
y是光探测系统的多个光电探测器针对每个细胞所测量的探测器值；
X是溢出；以及
W是
265、根据264所述的方法，其中每个Wii是根据下式来计算的：
其中：
σi 2是探测器i处的方差；
yi是探测器i处的信号；以及
λi是探测器i处的恒定噪声。
266、根据264所述的方法，其中，所述方法包括根据下式来计算光谱解混矩阵：
(XTWX)-1XTW。
267、根据264所述的方法，其中，所述方法包括针对由光探测系统所探测到的每个细胞来对(XTWX)求逆，以计算光谱解混矩阵。
268、根据267所述的方法，其中，对(XTWX)求逆包括根据下式使用迭代Newton-Raphson计算来近似(XTWX)：
A-1＝(XTWX)-1；
其中WG是W的预定近似值，W是根据光探测系统中的每个光电探测器的方差来确定的。
269、根据268所述的方法，还包括利用所计算的WG值来预计算A0 -1。
270、根据263-267中任一项所述的方法，其中，所述方法包括根据下式使用Sherman-Morrison迭代逆更新器来近似(XTWX)：
271、根据270所述的方法，其中，ΔAi＝XTΔWiX＝αimimi T，其中：
272、根据271所述的方法，还包括根据下式来近似光谱解混矩阵：
273、根据272所述的方法，其中，使用A0 -1的预计算值来计算A1 -1，并且使用从i＝1到ND的每个(Ai-1)-1通过重复计算Ai -1来计算A-1。
274、根据263-267中任一项所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是通过矩阵分解来计算的。
275、根据274所述的方法，其中，所述矩阵分解包括LU分解。
276、根据275所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式使用修正的Cholesky分解来计算的：
XTWXa＝XTWy
Aa＝B
LDLTa＝B
Lz＝B其中z＝DLTa
Dx＝z其中x＝LTa
LTa＝x。
277、根据274所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是通过QR因式分解来计算的。
278、根据277所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式使用QR因式分解来计算的：
XTWXa＝XTWy
279、根据274所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是通过奇异值分解来计算的。
280、根据279所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式使用奇异值分解来计算的：
z＝UTy
∑w＝z
a＝Vw
其中U和V是正交矩阵，并且∑是含有
的奇异值的对角矩阵。
281、根据268所述的方法，其中，所述光电探测器的方差包括光电探测器噪声分量。
282、根据281所述的方法，其中，所述光电探测器噪声分量包括电子噪声和光学背景光中的一个或更多个。
283、根据281-282中任一项所述的方法，其中，所述光电探测器的方差与由光电探测器所测得的光强度成比例。
284、根据281-283中任一项所述的方法，还包括使用单染色对照样本来估算光电探测器噪声分量。
285、根据281-284中任一项所述的方法，还包括在利用光源照射样本之前确定每个光电探测器的方差。
286、根据268-285中任一项所述的方法，还包括在利用光源照射样本之前确定WG。
287、根据262-286中任一项所述的方法，其中，所述光谱解混矩阵是在现场可编程门阵列上计算的。
288、根据262-287中任一项所述的方法，还包括利用光源来照射样本。
289、根据288所述的方法，其中，所述光源包括激光器。
290、根据289所述的方法，其中，所述光源包括多个激光器。
291、根据262-290中任一项所述的方法，其中，利用包括光电倍增管的多个光电探测器来探测所发射的光。
292、根据262-290中任一项所述的方法，其中，利用光电探测器阵列来探测所发射的光。
293、根据292所述的方法，其中，所述光电探测器阵列包括光电二极管。
294、根据292所述的方法，其中，所述光电探测器阵列包括电荷耦合器件。
295、一种现场可编程门阵列，其编程为：
针对由具有多个光电探测器的光探测系统所探测到的样本中的每个细胞来计算多个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵；以及
使用所述光谱解混矩阵来估算每个荧光团的丰度。
296、根据295所述的现场可编程门阵列，其中，所述现场可编程门阵列被配置为使用加权最小二乘算法来计算光谱解混矩阵。
297、根据296所述的现场可编程门阵列，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式来计算的：
其中：
y是光探测系统的多个光电探测器针对每个细胞所测量的探测器值；
X是溢出；以及
W是
298、根据297所述的现场可编程门阵列，其中，每个Wii是根据以下来计算的：
其中：
σi 2是探测器i处的方差；
yi是探测器i处的信号；以及
λi是探测器i处的恒定噪声。
299、根据295所述的现场可编程门阵列，其中，所述现场可编程门阵列被配置为根据下式来计算光谱解混矩阵：
(XTWX)-1XTW。
300、根据297所述的现场可编程门阵列，其中，所述现场可编程门阵列被配置为针对所探测到的每个细胞来对(XTWX)求逆，以计算光谱解混矩阵。
301、根据300所述的现场可编程门阵列，其中，所述现场可编程门阵列被配置为通过根据下式使用迭代Newton-Raphson计算来近似(XTWX)，以对(XTWX)求逆：
A-1＝(XTWX)-1；
其中WG是W的预定近似值，W是根据光探测系统中的每个光电探测器的方差来确定的。
302、根据301所述的现场可编程门阵列，其中，所述集成电路被编程为在利用光源照射样本之前自动地确定WG。
303、根据302所述的现场可编程门阵列，其中，所述集成电路被编程为基于所确定的WG值来计算A0 -1。
304、根据296-300中任一项所述的现场可编程门阵列，其中，所述现场可编程门阵列被编程为根据下式使用Sherman-Morrison迭代逆更新器来近似(XTWX).
305、根据304所述的现场可编程门阵列，其中，ΔAi＝XTΔWjX＝αimimi T，其中：
306、根据305所述的现场可编程门阵列，其中，所述集成电路被编程为根据下式来近似光谱解混矩阵：
307、根据306所述的现场可编程门阵列，其中，使用A0 -1的预计算值来计算A1 -1，并且使用从i＝1到ND的每个(Ai-1)-1通过重复计算Ai -1来计算A-1。
308、根据296-300中任一项所述的现场可编程门阵列，其中，所述集成电路被编程为通过矩阵分解来计算加权最小二乘算法。
309、根据308所述的现场可编程门阵列，其中，所述矩阵分解包括LU分解。
310、根据309所述的现场可编程门阵列，其中，所述集成电路被编程为根据下式使用修正的Cholesky分解来计算加权最小二乘算法：
XTWXa＝XTWy
Aa＝B
LDLTa＝B
Lz＝B其中z＝DLTa
Dx＝z其中x＝LTa
LTa＝x。
311、根据310所述的现场可编程门阵列，其中，所述集成电路被编程为通过QR因式分解来计算加权最小二乘算法。
312、根据311所述的现场可编程门阵列，其中，所述集成电路被编程为根据下式使用QR因式分解来计算加权最小二乘算法：
XTWXa＝XTWy
313、根据312所述的现场可编程门阵列，其中，所述集成电路被编程为通过奇异值分解来计算加权最小二乘算法。
314、根据313所述的现场可编程门阵列，其中，所述集成电路被编程为根据下式使用奇异值分解来计算加权最小二乘算法：
z＝UTy
∑w＝z
a＝Vw
其中U和V是正交矩阵，并且∑是含有
的奇异值的对角矩阵。
315、根据301所述的现场可编程门阵列，其中，所述光电探测器的方差包括光电探测器噪声分量。
316、根据315所述的现场可编程门阵列，其中，所述光电探测器噪声分量包括电子噪声和光学背景光中的一个或更多个。
317、根据295-316中任一项所述的现场可编程门阵列，其中，所述光电探测器的方差与由光电探测器所测得的光强度成比例。
318、根据295-316中任一项所述的现场可编程门阵列，其中，所述现场可编程门阵列是用基于单染色对照样本的光电探测器噪声分量的估算来编程的。
319、根据295-316中任一项所述的现场可编程门阵列，其中，在利用光源照射样本之前将每个光电探测器的方差编程到现场可编程门阵列。
320、根据295-316中任一项所述的现场可编程门阵列，其中，在利用光源照射样本之前将WG编程到现场可编程门阵列。
尽管出于清楚理解的目的已经通过图示和示例的方式来详细地描述了前述发明，但是根据本发明的教导，对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，在不背离所附权利要求书的精神或范围的情况下，可以进行某些改变和修改。
因此，前面仅说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计出各种布置，尽管本文未明确描述或示出，但是它们也体现了本发明的原理并且包括在本发明的精神和范围内。此外，本文所列举的所有示例和条件语言都主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为进一步发展本领域所做出的构思，并且应解释为不限于此类具体列举的示例和条件。此外，本文中列举本发明的原理、方面和实施例以及其特定示例的所有陈述，都旨在既涵盖其结构上的等同物又涵盖其功能上的等同物。另外，旨在此类等同物既包括当前已知的等同物也包括将来开发的等同物(即所开发的实施相同功能而与结构无关的任何元件)。此外，无论权利要求中是否明确引用了此类公开，本文公开的任何内容均不旨在专供公众使用。
因此，本发明的范围不旨在限于本文所示出和所描述的示例性实施例。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求书来体现。在权利要求书中，美国专利法35U.S.C.§112(f)或35U.S.C.§112(6)明确地定义为仅当在权利要求中的某一限制开始处引用了“手段”或“步骤”这一确切短语时，才被援引以用于权利要求中的限制；如果权利要求中的限制中未使用该确切短语，则不援引35U.S.C.§112(f)或35U.S.C.§112(6)。
Claims (15)
1.一种方法，包括：
利用光探测系统来探测来自样本的光，所述样本包括具有重叠的荧光光谱的多个荧光团；以及
通过计算样本中每个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵，来对样本中的每个荧光团的光进行光谱解析。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述光谱解混矩阵是使用加权最小二乘算法来计算的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是根据下式来计算的：
其中：
y是所述光探测系统的多个光电探测器针对每个细胞测量的探测器值；
X是溢出；以及
W是
其中每个Wii是根据下式来计算的：
其中：
σi 2是探测器i处的方差；
yi是探测器i处的信号；以及
λi是探测器i处的恒定噪声。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述方法包括根据下式来计算所述光谱解混矩阵：
(XTWX)-1XTW
其中所述方法包括针对每个细胞来对(XTWX)求逆以计算所述光谱解混矩阵；以及
其中对(XTWX)求逆包括根据下式使用迭代Newton-Raphson计算来近似(XTWX)：
A-1＝(XTWX)-1；
其中，WG是根据所述光探测系统中的每个光电探测器的方差确定的W的预定近似值。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述方法包括根据下式使用Sherman-Morrison迭代逆更新器来近似(XTWX)：
6.根据权利要求2所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是通过矩阵分解来计算的，其中所述矩阵分解选自：
LU分解；
QR因式分解；以及
奇异值分解。
7.一种系统，包括：
光源，其配置为照射包括具有重叠的荧光光谱的多个荧光团的样本；
光探测系统，其包括多个光电探测器；以及
处理器，其包括可操作地耦接到所述处理器的存储器，其中所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由所述处理器执行时使得所述处理器通过计算样本中每个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵，来对样本中的每个荧光团的光进行光谱解析。
8.一种集成电路，其被编程为通过计算样本中每个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵，来对样本中的每个荧光团的光进行光谱解析，所述样本包括具有重叠的荧光光谱的多个荧光团。
9.一种方法，包括：
利用光探测系统来探测来自包括多个荧光团的样本的光，所述多个荧光团具有重叠的荧光光谱；以及
通过计算样本中每个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵，来估算样本中颗粒上的一个或更多个荧光团的丰度，
基于所估算的荧光团丰度来对样本中的细胞进行分选。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，计算所述光谱解混矩阵包括使用加权最小二乘算法，加权最小二乘算法根据下式计算：
其中：
y是所述光探测系统的多个光电探测器针对每个细胞测量的探测器值；
X是溢出；以及
W是
其中每个Wii是根据下式来计算的：
其中：
σi 2是探测器i处的方差；
yi是探测器i处的信号；以及
λi是探测器i处的恒定噪声。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述方法包括根据下式来计算所述光谱解混矩阵：
(XTWX)-1XTW
其中所述方法包括针对每个细胞来对(XTWX)求逆以计算所述光谱解混矩阵；以及
其中对(XTWX)求逆包括根据下式使用迭代Newton-Raphson计算来近似(XTWX)：
A-1＝(XTWX)-1；
其中WG是是根据所述光探测系统中的每个光电探测器的方差确定的W的预定近似值。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述方法包括根据下式使用Sherman-Morrison迭代逆更新器来近似(XTWX)：
13.根据权利要求10所述的方法，其中，所述加权最小二乘算法是通过矩阵分解来计算的，其中所述矩阵分解选自：
LU分解；
QR因式分解；以及
奇异值分解。
14.一种系统，包括：
光源，其配置为照射包括具有重叠的荧光光谱的多个荧光团的样本；
光探测系统，其包括多个光电探测器；以及
处理器，其包括可操作地耦接到所述处理器的存储器，其中所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由所述处理器执行时使得所述处理器通过计算样本中每个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵，来估算样本中颗粒上的一个或更多个荧光团的丰度；以及
细胞分选组件，其配置为基于所估算的荧光团丰度对样本中的细胞进行分选。
15.一种集成电路，其被编程为通过计算样本中每个荧光团的荧光光谱的光谱解混矩阵，来估算样本中颗粒上的一个或更多个荧光团的丰度，所述样本包括具有重叠的荧光光谱的多个荧光团。
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