JP2024512029A - Ｔ細胞共培養効力アッセイのための方法及び組成物、ならびに細胞療法製品との使用 - Google Patents

Ｔ細胞共培養効力アッセイのための方法及び組成物、ならびに細胞療法製品との使用 Download PDF

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フリゴー，マシュー，ジェイ．
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Abstract

本発明は、ヒトがん療法を含む治療法に使用するための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）製品の効力及び／または機能性を分析またはアッセイするための、ならびに骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）製品及び末梢血リンパ球（ＰＢＬ）製品などの他のポリクローナル製品の効力及び／または機能性を分析またはアッセイするための新規のプロセス、組成物、及び方法を提供する。ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、及びＰＢＬ製品を使用して調製し、がんを治療するための組成物、方法、及びキットも提供される。【選択図】なし

Description

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子自家移入を使用した巨大な不応性がんの治療は、予後不良の患者の治療に対する強力なアプローチとなる。Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６，６，３８３－３９３。ＩＬ－２ベースのＴＩＬ拡張とそれに続く「急速拡張プロセス」（ＲＥＰ）は、その速度及び効率のためにＴＩＬ拡張の好ましい方法になっている。Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２００２，２９８，８５０－５４、Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００５，２３，２３４６－５７、Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００８，２６，５２３３－３９、Ｒｉｄｄｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９２，２５７，２３８－４１、Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００３，２６，３３２－４２。黒色腫におけるＴＩＬ療法への応答を改善し、ＴＩＬ療法を他の腫瘍タイプに拡大するための多くのアプローチが限られた成功を収めており、この分野は依然として困難である。Ｇｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１６，３４，２３８９－９７、Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００８，２６，５２３３－３９、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１，１７，４５５０－５７。単一免疫チェックポイント阻害剤との併用研究も記載されているが、さらなる研究が進行中であり、追加の治療方法が必要である（Ｋｖｅｒｎｅｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０２０，１１（２２），２０９２－２１０５）。
さらに、現行のＴＩＬの製造及び治療プロセスは、長さ、コスト、無菌性の懸念、及び本明細書に記載される他の要因によって制限されているため、他のチェックポイント阻害剤療法に対して不応性である患者を治療する可能性は厳しく制限されている。ＴＩＬ製造プロセス及び実行可能な治療選択肢がほとんどまたはまったく残っていない患者を治療する際に使用するのに適したかかるプロセスに基づく治療法の品質制御プロセスを提供することが緊急に必要である。本発明は、拡張ＴＩＬの効力及び／または機能性を評価するための機序を提供する追加のステップを用いて、ＴＩＬを生成する際に使用するための短縮製造プロセスを提供することによって、この必要性を満たす。
本発明は、例えば、がんの治療のための治療効果が増加した治療効果を有する治療的ＴＩＬ集団を調製するために、ＴＩＬを含むＴ細胞の効力及び／または機能性を調製及び評価するための改善されたプロセス、方法、及び組成物を提供する。これらの効力アッセイは、当該技術分野で知られているアッセイと比較して、とりわけ、優れた性能、Ｔ細胞製品の効力に対するより良い制御、及び生物学的関連性の増加といった改善を提供することができる。効力アッセイを使用した製造プロセス、投与方法、及び薬学的組成物も記載されている。これらのプロセス及び方法は、追加として、本明細書に記載のＣＴＬＡ－４ならびにＰＤ－１阻害剤及び／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤と組み合わせて、ＴＩＬの投与とともに使用することができる。
拡張ＴＩＬ、ならびに骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）及び末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を含む他のポリクローナルＴ細胞製品の効力及び／または機能性を評価するための方法であって、ＴＩＬ、ＭＩＬ、ＰＢＬ、またはこれらの方法によって評価される他のポリクローナルＴ細胞製品を投与することによってがんの治療に用いることができる、方法が本明細書に提供される。
一態様では、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法であって、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、この方法は、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との（ｉ）細胞または（ｉｉ）ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遮断抗体及び標的細胞を含む陰性対照の第２の共培養を、第２の期間行う追加のステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得する追加のステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得する追加のステップと、
ｇ．ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定する追加のステップであって、各々の観測値が対応する対照値と比較される、Ｔ細胞製品の効力を決定する追加のステップと、を含む。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞製品は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）製品、骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）製品、または末梢血リンパ球（ＰＢＬ）製品からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞製品は、ヒト由来のＴＩＬ製品であり、ＴＩＬ製品が、腫瘍の切除または腫瘍の断片化もしくは消化によって取得され、急速拡張プロトコルステップを含むＴＩＬ拡張プロセスによって製造される。
いくつかの実施形態では、方法は、ヒト患者の治療において使用するためにＴ細胞製品を放出するステップを含む。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、照射されたＲａｊｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。
いくつかの実施形態では、陰性対照細胞は、ＭＨＣまたはＨＬＡクラスＩ及びＭＨＣまたはＨＬＡクラスＩＩ発現を欠いている。
いくつかの実施形態では、陰性対照細胞は、照射されたＫ５６２細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ遮断抗体は、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体、ＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品細胞の数と標的細胞の数との比は、５：１～１：５である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品細胞の数と陰性対照細胞の数との比は、５：１～１：５である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品細胞の数と標的細胞の数との比は、３：１～１：３である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品細胞の数と陰性対照細胞の数との比は、３：１～１：３である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品細胞の数と標的細胞の数との間の比は、１：２～１：４である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品細胞の数と陰性対照細胞の数との比は、１：２～１：４である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品細胞の数と標的細胞の数との比は、１：２５～１：３５である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品細胞の数と陰性対照細胞の数との比は、１：２５～１：３５である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品細胞の数と標的細胞の数との比は、約１：２である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品細胞の数と陰性対照細胞の数との比は、約１：２である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品細胞の数と標的細胞の数との比は、約１：３である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品細胞の数と陰性対照細胞の数との比は、約１：３である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品細胞の数と標的細胞の数との比は、約１：４である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品細胞の数と陰性対照細胞の数との比は、約１：４である。
いくつかの実施形態では、共培養は、凍結保存されたＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品を解凍し、解凍されたＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品を、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、及び７２時間からなる群から選択される期間、インキュベーション下で回復させた後に行われる。
いくつかの実施形態では、第１の期間は、約６時間～約４８時間である。
いくつかの実施形態では、第２の期間は、約６時間～約４８時間である。
いくつかの実施形態では、第１の期間は、約１２時間、約１８時間、及び約２４時間からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第２の期間は、約１２時間、約１８時間、及び約２４時間からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第１の期間及び第２の期間は、同じ期間である。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞製品上の１つ以上のマーカーが、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０、ＫＬＲＧ１、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞製品から分泌された１つ以上の分析対象物は、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、パーフォリン、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２２、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＭＩＰ－１β、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品から分泌された１つ以上の分析物は、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、パーフォリン、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２２、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＭＩＰ－１β、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、観測値の量は、１つ以上の分析物の各々について対照値の量に対して正規化され、１つ以上の分析物の各々について対照値を上回る観測値の増加は、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、及び少なくとも５倍からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品は、外科的切除、針生検、コア生検、小生検、またはヒト患者からの腫瘍細胞とＴＩＬ細胞との混合物を含有する試料を取得するための他の手段によって取得された腫瘍から製造される。
別の態様では、本発明は、がんの治療を必要とする患者において腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団でそれを治療する方法であって、
（ａ）外科的切除、針生検、コア生検、小生検、または患者から取得された腫瘍試料を（ｉ）複数の腫瘍断片もしくは（ｉｉ）腫瘍消化物に処理することによる他の手段によって患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得及び／または受容するステップと、
（ｂ）第１のＴＩＬ集団を閉鎖系に付加するステップと、
（ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生するステップであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１４日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２のＴＩＬ集団を産生するステップと、
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生するステップであって、第２の拡張が、約７～１４日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行が、系を開くことなく起こる、第３のＴＩＬ集団を産生するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取するステップであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、系を開くことなく起こる、採取するステップと、
（ｆ）治療的ＴＩＬ集団の効力を決定するステップであって、
ｉ．治療的ＴＩＬ集団の部分との標的細胞の共培養を、第１の期間行うことと、
ｉｉ．共培養から採取物を取得することと、
ｉｉｉ．採取物を、（１）治療的ＴＩＬ集団の部分上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）治療的ＴＩＬ集団の部分から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得して、治療的ＴＩＬ集団の効力を決定することと、
ｉｖ．治療的ＴＩＬ集団の第２の部分との、陰性対照細胞または（ｉ）陰性対照細胞もしくは（ｉｉ）ヒト白血球抗原遮断抗体の、第２の共培養を、第２の期間行うことと、
ｖ．第２の共培養から第２の採取物を取得することと、
ｖｉ．第２の採取物を、（１）治療的ＴＩＬ集団の第２の部分上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）治療的ＴＩＬ集団の第２の部分から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得することと、
ｖｉｉ．１つ以上の観測値を１つ以上の対照値と比較して、治療的ＴＩＬ集団の効力を決定することであって、各観測値が、その対応する対照値と比較される、治療的ＴＩＬ集団の効力を決定することと、を含む、治療的ＴＩＬ集団の効力を決定するステップと、
（ｇ）ステップ（ｅ）からの治療的ＴＩＬ集団を注入バッグに移すステップであって、ステップ（ｅ）から（ｇ）への移行が、系を開くことなく起こる、移すステップと、
（ｈ）任意選択で、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｇ）からの治療的ＴＩＬ集団を含む注入バッグを凍結保存することと、
（ｉ）治療的ＴＩＬ集団が有効であると決定された場合、治療上有効な投与量の治療的ＴＩＬ集団を、ステップ（ｇ）または（ｈ）の注入バッグから患者に投与するステップと、を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、採取されたＴＩＬの効力及び／または機能性を調べることは、凍結保存後に、または任意選択で凍結保存ステップの前後に行われる。
いくつかの実施形態では、患者は、切除不能、転移性、耐性、またはＣＴＬＡ－４阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、もしくはＰＤ－Ｌ１阻害剤に対して不応性である腫瘍を有し、任意選択で、患者は、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、またはＰＤ－Ｌ１阻害剤で以前に治療されている。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数が少なくとも５０倍多い。
いくつかの実施形態では、第１の拡張は、約１０～約１２日の期間にわたって行われる。
いくつかの実施形態では、第２の拡張は、約１０～約１２日の期間にわたって行われる。
いくつかの実施形態では、第１の拡張は、約１１日の期間にわたって行われる。
いくつかの実施形態では、第２の拡張は、約１１日の期間にわたって行われる。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、第１の拡張において、細胞培養培地中に１０００ＩＵ／ｍＬ～６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、第２の拡張ステップにおいて、ＩＬ－２は、１０００ＩＵ／ｍＬ～６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、ＯＫＴ－３抗体は、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、この方法は、ＴＩＬを患者に投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンで患者を治療するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、治療的ＴＩＬ集団を患者に投与した翌日から開始するＩＬ－２レジメンで患者を治療するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、治療的ＴＩＬ集団を患者に投与したのと同じ日に開始するＩＬ－２レジメンで患者を治療するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、治療的ＴＩＬ集団の患者への投与の完了の約３～約２４時間後に投与される。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、許容範囲まで８時間毎に１５分間のボーラス静脈内注入として投与される、６００，０００もしくは７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキン、またはそのバイオシミラーもしくはバリアントを含む高用量ＩＬ－２レジメンである。
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）において患者から取得された腫瘍試料を腫瘍消化物に処理することは、腫瘍試料を酵素培地中でインキュベートすることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）において患者から取得された腫瘍試料を腫瘍消化物に処理することは、腫瘍試料を機械的に破壊して腫瘍試料を解離することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）において患者から取得された腫瘍試料を腫瘍消化物に処理することは、密度勾配分離を使用して解離された腫瘍試料を精製することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、酵素培地は、ＤＮａｓｅを含む。
いくつかの実施形態では、酵素培地は、３０単位／ｍＬのＤＮａｓｅを含む。
いくつかの実施形態では、酵素培地は、コラゲナーゼを含む。
いくつかの実施形態では、酵素培地は、約１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼを含む。
いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌、神経膠芽細胞腫、胃腸癌、腎臓癌、肉腫、及び腎細胞癌からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、方法は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、またはＣＴＬＡ－４阻害剤を患者に投与するステップを含む。
別の態様では、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法であって、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で行うステップと、
ｂ．Ｔ細胞参照標準細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で行うステップと、
ｃ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｄ．上清を、Ｔ細胞製品細胞及びＴ細胞参照標準細胞から分泌されたサイトカインについて評価して、Ｔ細胞製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞が、単球細胞である、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞製品は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）製品、骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）製品、または末梢血リンパ球（ＰＢＬ）製品である。
いくつかの実施形態では、単球細胞は、Ｕ９３７もしくはＴｈｐ１細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、サイトカインは、インターフェロン－γである。
いくつかの実施形態では、共培養は、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、及び約４８時間からなる群から選択される期間行われる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞製品は、ＴＩＬ製品であり、１ウェル当たり約４×１０５、約２×１０５、約１×１０５、及び約０．５×１０５標的細胞の４つの標的細胞用量濃度、ならびに１ウェル当たり約１．５×１０６ＴＩＬの単一のＴＩＬ細胞濃度が使用される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の少なくとも４つの共培養及びＴ細胞参照標準細胞との標的細胞の少なくとも４つの共培養を使用し、平行線分析を行い、１つの外れ値標的細胞用量濃度を破棄する。
いくつかの実施形態では、方法は、効力アッセイマトリックスの構成要素である。
いくつかの実施形態では、効力アッセイマトリックスは、ＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ１３７刺激及び報告インターフェロン－γ、グランザイムＢ、または腫瘍壊死因子－αを使用したビーズまたはプレートベースのアッセイ、総生細胞についてのアッセイ、生細胞パーセンテージについてのアッセイ、ＣＤ４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＬＡＧ３＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＫＬＲＧ１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ１０１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ６９＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＳＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭＲＡ細胞含有量についてのアッセイ、Ｔｒｅｇ細胞含有量についてのアッセイ、ＰＤ－１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＭ３＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２５＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２７＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ５６＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＴＬＡ－４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＧＩＴ＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＣＤ５７＋細胞含有量についてのアッセイからなる群から選択される１つ以上のアッセイを含む。
別の態様では、本発明は、がんを有する対象を治療するための方法であって、
（ａ）腫瘍消化物または腫瘍断片を閉鎖系に追加することであって、腫瘍消化物または腫瘍断片が、第１のＴＩＬ集団を含み、対象から切除された腫瘍から取得される、追加することと、
（ｂ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１１日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｃ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む追加の細胞培養培地を補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１１日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開くことなく起こる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）ステップ（ｃ）から取得された第３のＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行が、系を開くことなく起こる、採取することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）からの採取された第３のＴＩＬ集団を注入バッグに移すことであって、ステップ（ｄ）から（ｅ）への移行が、系を開くことなく起こる、移すことと、
（ｆ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を含む注入バッグを凍結保存することと、
（ｇ）治療上有効な投与量の第３のＴＩＬ集団を、ステップ（ｆ）における注入バッグから対象に投与することと、を含む、拡張された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含み、
ＡＰＣが、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫からなる群から選択される、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫（転移性黒色腫及びブドウ膜黒色腫を含む）、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、食道癌、食道・胃接合部癌、胃癌、胃腸癌、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）における第１の拡張及びステップ（ｂ）における第２の拡張は、各々１１日間の期間内に個別に行われる。
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）～（ｄ）は、約１０日～約２２日で行われる。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの効力は、本明細書に記載の方法を使用して決定されている。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの効力は、本明細書に記載の方法を使用して決定されている。
ステップＡ～Ｆの概要を提供する例示的なＧｅｎ２（プロセス２Ａ）チャート。 ＴＩＬ製造のためのＧｅｎ２（プロセス２Ａ）の実施形態のプロセスフローチャート。 ＴＩＬ製造のためのＧｅｎ２（プロセス２Ａ）の実施形態のプロセスフローチャート。 ＴＩＬ製造のためのＧｅｎ２（プロセス２Ａ）の実施形態のプロセスフローチャート。 凍結保存されたＴＩＬの例示的な製造プロセス（約２２日）の実施形態の図を示す。 ＴＩＬ製造のための２２日プロセスである、Ｇｅｎ２（プロセス２Ａ）の実施形態の図を示す。 ＴＩＬ製造のためのプロセス１Ｃ及びＧｅｎ２（プロセス２Ａ）の例示的な実施形態からのステップＡ～Ｆの比較表。 ＴＩＬ製造のためのプロセス１Ｃの実施形態とＧｅｎ２（プロセス２Ａ）の実施形態との詳細な比較。 例示的なＧｅｎ３型ＴＩＬ製造プロセス。 ＴＩＬ製造のための２Ａプロセス（およそ２２日プロセス）とＧｅｎ３プロセス（およそ１４日～１６日プロセス）の実施形態との比較を示す。 ステップＡ～Ｆの概要を提供する例示的なプロセスＧｅｎ３チャート（およそ１４日～１６日プロセス）。 ３つのプロセスバリエーションの各々について、ステップＡ～Ｆ（およそ１４日～１６日プロセス）の概要とともに３つの例示的なＧｅｎ３プロセスを提供するチャート。 ステップＡ～Ｆの概要を提供する例示的な修正Ｇｅｎ２様プロセス（およそ２２日プロセス）。 Ｇｅｎ２（プロセス２Ａ）とＧｅｎ３プロセスとの比較のための実験フローチャートを提供する。 様々なＧｅｎ２（プロセス２Ａ）とＧｅｎ３．１プロセス実施形態との比較を示す。 Ｇｅｎ２、Ｇｅｎ２．１及びＧｅｎ３．０プロセスの実施形態の様々な特徴を説明する表。 Ｇｅｎ３．１と称される、Ｇｅｎ３プロセスの実施形態のための培地条件の概要。 Ｇｅｎ２、Ｇｅｎ２．１及びＧｅｎ３．０プロセスの実施形態の様々な特徴を説明する表。 Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３．０プロセスの実施形態の様々な特徴を比較する表。 記載された拡張プロセスの様々な実施形態における培地の使用を提供する表。 Ｇｅｎ３プロセス（１６日プロセス）の例示的な実施形態の概略図。 Ｇｅｎ３拡張プラットフォームを使用して造血器悪性腫瘍からＴ細胞を拡張するための方法の例示的な実施形態の概略図。 構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂを提供する。円筒は、個々のポリペプチド結合ドメインを指す。構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂは、例えば、４－１ＢＢＬまたは４－１ＢＢに結合する抗体から誘導される３つの線形に結合したＴＮＦＲＳＦ結合ドメインを含み、これらを折り畳んで三価タンパク質を形成し、次いでこれをＩｇＧ１－Ｆｃ（ＣＨ３及びＣＨ２ドメインを含む）によって第２の三価タンパク質に結合し、次いでこれを使用して、三価タンパク質のうちの２つをジスルフィド結合（小さい長楕円）によって一緒に結合し、構造を安定化し、６つの受容体及びシグナル伝達タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインを一緒にして、シグナル伝達複合体を形成することができるアゴニストを提供する。円筒として示されるＴＮＦＲＳＦ結合ドメインは、例えば、親水性残基及び柔軟性のためのＧｌｙ及びＳｅｒ配列、ならびに溶解性のためのＧｌｕ及びＬｙｓを含み得るリンカーによって結合されたＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む、ｓｃＦｖドメインであり得る。 Ｇｅｎ３プロセス（１６日プロセス）の例示的な実施形態の概略図。 Ｇｅｎ３．１プロセス（１６日プロセス）の例示的な実施形態のプロセス概要を提供する。 Ｇｅｎ３．１試験プロセス（１６～１７日プロセス）の例示的な実施形態の概略図。 Ｇｅｎ３プロセス（１６日プロセス）の例示的な実施形態の概略図。 例示的なＧｅｎ２プロセス及び例示的なＧｅｎ３プロセスの比較表。 Ｇｅｎ３プロセス（１６～１７日プロセス）の調製タイムラインの例示的な実施形態の概略図。 Ｇｅｎ３プロセス（１４～１６日プロセス）の例示的な実施形態の概略図。 Ｇｅｎ３プロセス（１６日プロセス）の例示的な実施形態の概略図。 Ｇｅｎ３プロセス（１６日プロセス）の例示的な実施形態の概略図。 Ｇｅｎ３プロセス（１６日プロセス）の例示的な実施形態の概略図。 Ｇｅｎ２、Ｇｅｎ２．１、及びＧｅｎ３プロセス（１６日プロセス）の実施形態の比較。 Ｇｅｎ２、Ｇｅｎ２．１、及びＧｅｎ３プロセス（１６日プロセス）の実施形態の比較。 Ｇｅｎ３実施形態の構成要素。 Ｇｅｎ３実施形態のフローチャート比較（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、Ｇｅｎ３．１試験）。 Ｇｅｎ３プロセス（１６～１７日プロセス）の例示的な実施形態の構成要素が示される。 承認基準表。 ＴＩＬ－Ｋ５６２陰性対照、ならびにＭＬＲ（患者適合型ＰＢＭＣ）及びビーズベースの陽性対照を用いたＴＩＬ－Ｒａｊｉ共培養アッセイの実施形態の図。 ＴＩＬ－Ｒａｊｉ共培養アッセイを使用して、肺腫瘍（Ｌ４２２４）及び黒色腫腫瘍（Ｍ１１５２）について異なる共培養期間及びＴＩＬ：標的比のフローサイトメトリー（ＣＤ３の％）によって観察されたＣＤ２５レベル。 ＴＩＬ－Ｒａｊｉ共培養アッセイを使用して、肺腫瘍（Ｌ４２２４）及び黒色腫腫瘍（Ｍ１１５２）について異なる共培養期間及びＴＩＬ：標的比のフローサイトメトリー（ＣＤ３の％）によって観察されたＣＤ６９レベル。 ＴＩＬ－Ｒａｊｉ共培養アッセイを使用して、肺腫瘍（Ｌ４２２４）及び黒色腫腫瘍（Ｍ１１５２）について異なる共培養期間及びＴＩＬ：標的比のフローサイトメトリー（ＣＤ３の％）によって観察されたＣＤ１３７（４－１ＢＢ）レベル。 ＴＩＬ－Ｒａｊｉ共培養アッセイを使用して、肺腫瘍（Ｌ４２２４）及び黒色腫腫瘍（Ｍ１１５２）について異なる共培養期間及びＴＩＬ：標的比のフローサイトメトリー（ＣＤ３の％）によって観察されたＣＤ１３４（ＯＸ４０）レベル。 ＴＩＬ－Ｒａｊｉ共培養アッセイを使用して、肺腫瘍（Ｌ４２２４）及び黒色腫腫瘍（Ｍ１１５２）について異なる共培養期間及びＴＩＬ：標的比のＩＦＮ－γ分泌。 ＴＩＬ－Ｒａｊｉ共培養アッセイを使用して、肺腫瘍（Ｌ４２２４）及び黒色腫腫瘍（Ｍ１１５２）について異なる共培養期間及びＴＩＬ：標的比のＣＣＬ４分泌。 ＴＩＬ－Ｒａｊｉ共培養アッセイを使用して、肺腫瘍（Ｌ４２２４）及び黒色腫腫瘍（Ｍ１１５２）について異なる共培養期間及びＴＩＬ：標的比のグランザイムＢ分泌。 ＴＩＬ－Ｋ５６２陰性対照を用いたＴＩＬ－Ｒａｊｉ共培養アッセイの実施形態の図。 ＴＩＬ－Ｒａｊｉ細胞ベースの効力アッセイの例示的な実施形態のための共培養実験設定。 ＴＩＬ－Ｒａｊｉ共培養アッセイにおける活性化マーカーの表現型発現。 ＴＩＬ－Ｒａｊｉ共培養におけるＣＤ６９（Ｇｅｎ２ ＴＩＬ：３０１－００１）の表現型発現。 ＩＦＮ－γ分泌レベル（ｐｇ／ｍＬ）。 グランザイムＢ分泌レベル（ｐｇ／ｍＬ）。 ＩＦＮ－γ及びグランザイムＢ分泌レベル。 ＩＦＮ－γ放出の倍率変化：ＴＩＬ＋細胞株／ＴＩＬ単独。 グランザイムの倍率変化：ＴＩＬ＋細胞株／ＴＩＬ単独。 サイトカイン放出の倍率変化：ＴＩＬ＋細胞株／ＴＩＬ単独。 ＩＦＮ－γ放出の倍率変化：ＴＩＬ＋細胞株／ＴＩＬ＋Ｋ５６２。 グランザイムＢ放出の倍率変化：ＴＩＬ＋細胞株／ＴＩＬ＋Ｋ５６２。 サイトカイン放出の倍率変化：ＴＩＬ＋細胞株／ＴＩＬ＋Ｋ５６２。 ＩＦＮ－γ及びグランザイムＢ分泌の要約表。 ＭＨＣ優性認識によるＴＩＬ活性化を示す、ＴＩＬ－Ｒａｊｉ細胞ベースの効力アッセイの実施形態の概略図。 ＴＩＬ－Ｒａｊｉ細胞ベースの効力アッセイの例示的な実施形態のための共培養実験プレート設定。 任意選択のＴＩＬ－Ｋ５６２陰性対照を用いたＴＩＬ－Ｒａｊｉ共培養アッセイの実施形態の図。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットのＩＦＮ－γ分泌（ｐｇ／ｍＬ）。分泌レベル（ｐｇ／ｍＬ）はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットのＩＦＮ－γ分泌（ｐｇ／ｍＬ）。分泌レベル（ｐｇ／ｍＬ）はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットのＩＦＮ－γ分泌（ｐｇ／ｍＬ）。分泌レベル（ｐｇ／ｍＬ）はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットの、ＴＩＬ単独からのＩＦＮ－γ放出に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのＩＦＮ－γ放出の倍率変化。倍率変化はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットの、ＴＩＬ単独からのＩＦＮ－γ放出に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのＩＦＮ－γ放出の倍率変化。倍率変化はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットの、ＴＩＬ単独からのＩＦＮ－γ放出に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのＩＦＮ－γ放出の倍率変化。倍率変化はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットの、ＴＩＬ＋Ｋ５６２細胞からのＩＦＮ－γ放出に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのＩＦＮ－γ放出の倍率変化。倍率変化はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットの、ＴＩＬ＋Ｋ５６２細胞からのＩＦＮ－γ放出に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのＩＦＮ－γ放出の倍率変化。倍率変化はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットの、ＴＩＬ＋Ｋ５６２細胞からのＩＦＮ－γ放出に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのＩＦＮ－γ放出の倍率変化。倍率変化はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 １２及び１８時間のインキュベーション時間におけるＴＩＬ単独に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのＩＦＮ－γ放出の倍率変化であり、１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２細胞比での累積データセットを示し、＊は、０．０５以下のｐ値を示し、＊＊は、０．０１以下のｐ値を示し、＊＊＊は、０．００１以下のｐ値を示す。 １２及び１８時間のインキュベーション時間におけるＴＩＬ単独またはＫ５６２細胞に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのＩＦＮ－γ放出の倍率変化であり、１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２細胞比での累積データセットを示し、＊は、０．０５以下のｐ値を示し、＊＊は、０．０１以下のｐ値を示し、＊＊＊は、０．００１以下のｐ値を示す。 １２及び１８時間のインキュベーション時間におけるＴＩＬ＋Ｋ５６２細胞またはＴＩＬに対するＴＩＬ＋Ｒａｊｉ細胞についてのＩＦＮ－γ放出の倍率変化であり、１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２細胞比での累積データセットを示し、＊は、０．０５以下のｐ値を示し、ＮＳは、フルスケールで有意でないことを示す。 １２及び１８時間のインキュベーション時間におけるＴＩＬ＋Ｋ５６２細胞またはＴＩＬに対するＴＩＬ＋Ｒａｊｉ細胞についてのＩＦＮ－γ放出の変化であり、１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２細胞比での累積データを示し、より低い倍率変化レベルの詳細を示すように拡張された。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットのグランザイムＢ分泌（ｐｇ／ｍＬ）。分泌レベル（ｐｇ／ｍＬ）はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットのグランザイムＢ分泌（ｐｇ／ｍＬ）。分泌レベル（ｐｇ／ｍＬ）はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットのグランザイムＢ分泌（ｐｇ／ｍＬ）。分泌レベル（ｐｇ／ｍＬ）はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットの、ＴＩＬ単独からのグランザイムＢ放出に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのグランザイムＢの倍率変化。倍率変化はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットの、ＴＩＬ単独からのグランザイムＢ放出に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのグランザイムＢ放出の倍率変化。倍率変化はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットの、ＴＩＬ単独からのグランザイムＢ放出に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのグランザイムＢの倍率変化。倍率変化はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットの、ＴＩＬ＋Ｋ５６２細胞からのグランザイムＢ放出に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのグランザイムＢ放出の倍率変化。倍率変化はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットの、ＴＩＬ＋Ｋ５６２細胞からのグランザイムＢ放出に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのグランザイムＢの倍率変化。倍率変化はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットの、ＴＩＬ＋Ｋ５６２細胞からのグランザイムＢ放出に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのグランザイムＢ放出の倍率変化。倍率変化はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 １２及び１８時間のインキュベーション時間におけるＴＩＬのグランザイムＢ放出（ｐｇ／ｍＬ／ＴＩＬ）。 １２及び１８時間のインキュベーション時間におけるＴＩＬ単独に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのグランザイムＢ放出であり、１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２細胞比での累積データセットを示し、＊＊＊は、０．００１以下のｐ値を示し、＊＊＊＊は、０．０００１以下のｐ値を示す。 １２及び１８時間のインキュベーション時間におけるＫ５６２細胞に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのグランザイムＢ放出であり、１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２細胞比での累積データセットを示し、＊＊＊＊は、０．０００１以下のｐ値を示す。 １２及び１８時間のインキュベーション時間におけるＴＩＬ＋Ｋ５６２細胞またはＴＩＬに対するＴＩＬ＋Ｒａｊｉ細胞についてのグランザイムＢ放出の倍率変化であり、１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２細胞比での累積データセットを示し、＊＊は、０．０１以下のｐ値を示し、ＮＳは、有意でないことを示す。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットのＴＮＦ－α分泌（ｐｇ／ｍＬ）。分泌レベル（ｐｇ／ｍＬ）はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットのＴＮＦ－α分泌（ｐｇ／ｍＬ）。分泌レベル（ｐｇ／ｍＬ）はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットのＴＮＦ－α分泌（ｐｇ／ｍＬ）。分泌レベル（ｐｇ／ｍＬ）はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットの、ＴＩＬ単独からのグランザイムＢ放出に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのＴＮＦ－α放出の倍率変化。倍率変化はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットの、ＴＩＬ単独からのグランザイムＢ放出に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのＴＮＦ－α放出の倍率変化。倍率変化はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットの、ＴＩＬ単独からのグランザイムＢ放出に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのＴＮＦ－αの倍率変化。倍率変化はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットの、ＴＩＬ＋Ｋ５６２細胞からのグランザイムＢ放出に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのＴＮＦ－α放出の倍率変化。倍率変化はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットの、ＴＩＬ＋Ｋ５６２細胞からのグランザイムＢ放出に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのＴＮＦ－α放出の倍率変化。倍率変化はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 ３：１、１：１、及び１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２の比の黒色腫ＴＩＬロットの、ＴＩＬ＋Ｋ５６２細胞からのグランザイムＢ放出に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのＴＮＦ－α放出の倍率変化。倍率変化はｙ軸に示され、ＴＩＬ：標的比は、ｘ軸に示される。 １８時間のインキュベーション時間におけるＴＩＬ単独に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのＴＮＦ－αの倍率変化であり、１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２細胞比での累積データセットを示し、＊＊＊＊は、０．０００１以下のｐ値を示す。 １８時間のインキュベーション時間におけるＫ５６２細胞に対するＴＩＬ＋ＲａｊｉまたはＫ５６２細胞についてのＴＮＦ－α放出のバイルラスタであり、１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２細胞比での累積データセットを示し、＊＊＊＊は、０．０００１以下のｐ値を示す。 １８時間のインキュベーション時間におけるＴＩＬ単独またはＴＩＬ＋Ｋ５６２細胞に対するＴＩＬ＋Ｒａｊｉ細胞についてのＴＮＦ－α放出の倍率変化であり、１：３のＴＩＬ：ＲａｊｉまたはＴＩＬ：Ｋ５６２細胞比での累積データセットを示し、＊＊＊＊は、０．０００１以下のｐ値を示す。 Ｒａｊｉ細胞共培養アッセイの実施形態を使用して試験した２２個の試料のグランザイムＢ及びＩＦＮ－γ結果の要約表。 任意選択のＴＩＬ－Ｋ５６２陰性対照を用いたＴＩＬ－Ｒａｊｉ共培養アッセイの実施形態の図。 ＴＩＬロットＭ１１７３のアッセイ結果。 ＴＩＬロットＭ１１５２のアッセイ結果。 ＴＩＬロットＭ１１８７のアッセイ結果。 ＴＩＬロットＭ１１７９のアッセイ結果。 ＴＩＬロットＭ１１８３のアッセイ結果。 異なる解凍後回復時間におけるＴＩＬ単独に対するＴＩＬ＋Ｋ５６２またはＲａｊｉ細胞の倍率変化を示す、ＩＦＮ－γのサイトカイン分泌結果。 異なる解凍後回復時間におけるＴＩＬ＋Ｋ５６２細胞に対するＴＩＬ＋Ｋ５６２またはＲａｊｉ細胞の倍率変化を示す、ＩＦＮ－γのサイトカイン分泌結果。 異なる解凍後回復時間におけるＴＩＬ単独に対するＴＩＬ＋Ｋ５６２またはＲａｊｉ細胞の倍率変化を示す、グランザイムＢのサイトカイン分泌結果。 異なる解凍後回復時間におけるＴＩＬ＋Ｋ５６２細胞に対するＴＩＬ＋Ｋ５６２またはＲａｊｉ細胞の倍率変化を示す、グランザイムＢのサイトカイン分泌結果。 同種異系認識アッセイの実施形態。 同種異系認識アッセイ検出方法の実施形態。 解凍後状態１の結果（解凍後１８～２４時間一晩静置した）。試験したエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比は、３５：１～２．５：１の範囲であり、試験した共培養持続時間は、４時間、８時間、１６時間、及び３６時間であった。 解凍後状態２の結果（解凍後の静置なし）。試験したエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比は、１０：１～１：１０の範囲であり、共培養持続時間は、一晩（１６～２４時間）であった。卵巣癌腫瘍（ＯＶ８１７８）及び黒色腫腫瘍（Ｍ１２０３）から産生されたＴＩＬを試験した。 ＴＩＬ－Ｒａｊｉ細胞ベースの効力アッセイの例示的な実施形態。 総生細胞（ＴＶＣ、上部プロット）及び生存率％（下部プロット）対静置時間。 ３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の有無にかかわらず、２つのＴＩＬ細胞株を用いたＲａｊｉ及びＫ５６２共培養実験の結果であり、ＩＦＮ－γ分泌（ｐｇ／ｍＬ）を示す。 ３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の有無にかかわらず、２つのＴＩＬ細胞株を用いたＲａｊｉ及びＫ５６２共培養実験の結果であり、ＩＦＮ－γ分泌（倍率変化の単位）を示す。 異なる共培養条件下での２つのＴＩＬ細胞株とのＲａｊｉ及びＫ５６２共培養実験の結果であり、ＩＦＮ－γ分泌（ｐｇ／ｍＬ）を示す。 異なる共培養条件下での２つのＴＩＬ細胞株を用いたＲａｊｉ及びＫ５６２共培養実験の結果であり、ＩＦＮ－γ分泌（倍率変化の単位）を示す。 ＴＩＬ解凍後の回復期間が延長されるにつれてサイトカイン分泌効果を評価するための、異なる共培養条件下での２つのＴＩＬ細胞株を用いたＲａｊｉ及びＫ５６２の共培養実験の結果であり、ＩＦＮ－γ分泌（ｐｇ／ｍＬ）を示す。 ＴＩＬ解凍後の回復期間が延長されるにつれてサイトカイン分泌効果を評価するための、本発明の実施形態である、異なる共培養条件下での２つのＴＩＬ細胞株とのＲａｊｉ及びＫ５６２共培養実験の結果であり、ＩＦＮ－γ分泌（倍数変化の単位）を示す。 ７２時間の静置期間における共培養条件の２つの実施形態における、ＴＩＬ株Ｍ１１７９の親生体集団の残留細胞集団のフローサイトメトリー分析。 Ｒａｊｉ細胞株の増殖プロファイル。 Ｋ５６２細胞株の増殖プロファイル。 本発明の実施形態でもある、ＴＩＬ：腫瘍細胞株共培養アッセイの実験計画の図。 本発明の実施形態である、３つのＴＩＬ：標的細胞の比（３：１、１：１、及び１：３）での試験した標的（Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｔｈｐ１及びＵ９３７）細胞株及び陰性対照（Ｋ５６２）細胞株（ｐｇ／ｍＬ、絶対値）のＩＦＮ－γ分泌。 本発明の実施形態である、３つのＴＩＬ：標的細胞の比（３：１、１：１、及び１：３）での試験した標的（Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｔｈｐ１及びＵ９３７）細胞株及び陰性対照（Ｋ５６２）細胞株（［ＴＩＬ＋標的］／［ＴＩＬ単独］の倍率変化）のＩＦＮ－γ分泌。 本発明の実施形態である、３つのＴＩＬ：標的細胞の比（３：１、１：１、及び１：３）での試験した標的（Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｔｈｐ１及びＵ９３７）細胞株及び陰性対照（Ｋ５６２）細胞株（［ＴＩＬ＋標的］／［ＴＩＬ＋Ｋ５６２］）のＩＦＮ－γ分泌。 本発明の実施形態である、３つのＴＩＬ：標的細胞の比（３：１、１：１、及び１：３）での試験した標的（Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｔｈｐ１及びＵ９３７）細胞株及び陰性対照（Ｋ５６２）細胞株（ｐｇ／ｍＬ、絶対値）のＴＮＦ－α分泌。 本発明の実施形態である、３つのＴＩＬ：標的細胞の比（３：１、１：１、及び１：３）での試験した標的（Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｔｈｐ１及びＵ９３７）細胞株及び陰性対照（Ｋ５６２）細胞株（［ＴＩＬ＋標的］／［ＴＩＬ単独］の倍率変化）のＴＮＦ－α分泌。 本発明の実施形態である、３つのＴＩＬ：標的細胞の比（３：１、１：１、及び１：３）での試験した標的（Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｔｈｐ１及びＵ９３７）細胞株及び陰性対照（Ｋ５６２）細胞株（［ＴＩＬ＋標的］／［ＴＩＬ＋Ｋ５６２］）のＴＮＦ－α分泌。 本発明の実施形態でもある、ＴＩＬ：腫瘍細胞株共培養アッセイの実験計画の図。 本発明の実施形態である、試験した標的及び陰性対照（Ｋ５６２）細胞株のＩＦＮ－γ分泌（ｐｇ／ｍＬ）。 本発明の実施形態である、試験した標的及び陰性対照（Ｋ５６２）細胞株のＩＦＮ－γ分泌（［ＴＩＬ＋標的］／［ＴＩＬ単独］の倍率変化）。 本発明の実施形態である、試験した標的及び陰性対照（Ｋ５６２）細胞株（［ＴＩＬ＋標的］／［ＴＩＬ＋Ｋ５６２］の倍数変化）のＩＦＮ－γ分泌。 ＴＩＬ単独（左パネル）に対するＴＩＬ＋標的細胞株（または組み合わせ）、及びＴＩＬ＋Ｋ５６２（右パネル）に対するＴＩＬ＋標的細胞株（または組み合わせ）の倍率変化の平均及び範囲。 黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１５２、Ｍ１１８７、Ｍ１１９８、及びＭ１２００についての、組み合わせ標的細胞株を含む、試験した標的及び陰性対照細胞株のＴＮＦ－α分泌（ｐｇ／ｍＬ）。 黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１５２、Ｍ１１８７、Ｍ１１９８、及びＭ１２００についての、組み合わせ標的細胞株を含む、試験した標的及び陰性対照細胞株のＴＮＦ－α分泌（［ＴＩＬ＋腫瘍細胞株または組み合わせ］／［ＴＩＬ単独］の倍率変化）。 黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１５２、Ｍ１１８７、Ｍ１１９８、及びＭ１２００についての、組み合わせ標的細胞株を含む、試験した標的及び陰性対照細胞株のＴＮＦ－α分泌（［ＴＩＬ＋腫瘍細胞株または組み合わせ］／［ＴＩＬ＋Ｋ５６２］の倍率変化）。 黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１５２、Ｍ１１８７、Ｍ１１９８、及びＭ１２００についての、組み合わせ標的細胞株を含む、試験した標的及び陰性対照細胞株のグランザイムＢ分泌（ｐｇ／ｍＬ）。 黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１５２、Ｍ１１８７、Ｍ１１９８、及びＭ１２００についての、組み合わせ標的細胞株を含む、試験した標的及び陰性対照細胞株のグランザイムＢ分泌（［ＴＩＬ＋腫瘍細胞株または組み合わせ］／［ＴＩＬ単独］の倍率変化）。 黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１５２、Ｍ１１８７、Ｍ１１９８、及びＭ１２００についての、組み合わせ標的細胞株を含む、試験した標的及び陰性対照細胞株のグランザイムＢ分泌（［ＴＩＬ＋腫瘍細胞株または組み合わせ］／［ＴＩＬ＋Ｋ５６２］の倍率変化）。 本発明の実施形態でもある、ＴＩＬ：腫瘍細胞株共培養アッセイの実験計画の図。 研究ＮＳＣＬＣ ＴＩＬ株Ｌ４２５３、Ｌ４２５４、Ｌ４２６２、及びＬ４２７０についての、組み合わせ標的細胞株を含む、試験した標的及び陰性対照細胞株のＩＦＮ－γ分泌（ｐｇ／ｍＬ）。黒色の点線：３：１ ＴＩＬ単独。灰色の点線：１：１ ＴＩＬ単独。 研究ＮＳＣＬＣ ＴＩＬ株Ｌ４２５３、Ｌ４２５４、Ｌ４２６２、及びＬ４２７０についての、組み合わせ標的細胞株を含む、試験した標的及びＮＳＣＬＣ細胞株の倍率ＩＦＮ－γ分泌（ＴＩＬ＋腫瘍細胞株／ＴＩＬ単独）。 研究ＮＳＣＬＣ ＴＩＬ株Ｌ４２５３、Ｌ４２５４、Ｌ４２６２、及びＬ４２７０についての、組み合わせ標的細胞株を含む、試験した標的及びＮＳＣＬＣ細胞株の倍率ＩＦＮ－γ分泌（ＴＩＬ＋腫瘍細胞株／［ＴＩＬ＋Ｋ５６２］）。 臨床ＮＳＣＬＣ ＴＩＬ株１０１３－３０４、１０３６－３０７、１０５７－３０４、１００４－３０３、１０５７－３０２、及び１０８８－３０３についての、組み合わせ標的細胞株を含む、試験した標的及び陰性対照細胞株のＩＦＮ－γ分泌（ｐｇ／ｍＬ）。黒色の点線：ＴＩＬ単独。データは、１：１のＴＩＬ：標的比で取得した。
臨床ＮＳＣＬＣ ＴＩＬ株１０１３－３０４、１０３６－３０７、１０５７－３０４、１００４－３０３、１０５７－３０２、及び１０８８－３０３についての、組み合わせ標的細胞株を含む、試験した標的及び陰性対照細胞株の倍率ＩＦＮ－γ分泌（ＴＩＬ＋腫瘍細胞株／ＴＩＬ単独）。黒色の点線：ＴＩＬ単独。データは、１：１のＴＩＬ：標的比で取得した。 臨床ＮＳＣＬＣ ＴＩＬ株１０１３－３０４、１０３６－３０７、１０５７－３０４、１００４－３０３、１０５７－３０２、及び１０８８－３０３についての、組み合わせ標的細胞株を含む、試験した標的及び陰性対照細胞株の倍率ＩＦＮ－γ分泌（ＴＩＬ＋腫瘍細胞株／［ＴＩＬ＋Ｋ５６２］）。黒色の点線：ＴＩＬ単独。データは、１：１のＴＩＬ：標的比で取得した。 臨床ＮＳＣＬＣ ＴＩＬ株１０１３－３０４、１０３６－３０７、１０５７－３０４、１００４－３０３、１０５７－３０２、及び１０８８－３０３についての、試験した標的及び陰性対照細胞株のＩＦＮ－γ分泌（ＴＩＬ＋腫瘍細胞株／ＴＩＬ単独）の倍率変化の要約。塗りつぶされた赤い記号は、臨床的部分応答を表し、残りの記号は、臨床的に安定した疾患応答を表す。 臨床ＮＳＣＬＣ ＴＩＬ株１０１３－３０４、１０３６－３０７、１０５７－３０４、１００４－３０３、１０５７－３０２、及び１０８８－３０３についての、試験した標的及び陰性対照細胞株のＩＦＮ－γ分泌（ＴＩＬ＋腫瘍細胞株／［ＴＩＬ＋Ｋ５６２］）の倍率変化の要約。塗りつぶされた赤い記号は、臨床的部分応答を表し、残りの記号は、臨床的安定した疾患応答を表す。 １９の研究及び臨床黒色腫及びＮＳＣＬＣ ＴＩＬ株についての試験された標的及び陰性対照細胞株についての、ＩＦＮ－γ分泌（ＴＩＬ＋腫瘍細胞株／ＴＩＬ単独）の倍率変化の要約。ボックスは、平均のいずれかの側にある１つの標準偏差を表し、これは線で示される。 １９の研究及び臨床黒色腫及びＮＳＣＬＣ ＴＩＬ株についての試験された標的及び陰性対照細胞株についての、ＩＦＮ－γ分泌（ＴＩＬ＋腫瘍細胞株／［ＴＩＬ＋Ｋ５６２］の倍率変化の要約。ボックスは、平均のいずれかの側にある１つの標準偏差を表し、これは線で示される。 ２４時間の共培養中のＲａｊｉ細胞及びＫ５６２細胞の増殖（総生細胞、ＴＶＣ）に対する照射の影響。 ２つの子宮頸癌ＴＩＬロットについて、照射されていないＲａｊｉ細胞及び照射されたＲａｊｉ細胞との共培養時の分泌されたＩＦＮ－γの濃度。 照射を伴う（「Ｉｒｒ．」）及び照射を伴わない（「Ｎｏｎ－ｉｒｒ．」）３つのマーカーについて、フローサイトメトリーによって決定されたＫ５６２及びＲａｊｉ細胞上の表面マーカー発現。 ３つの黒色腫、２つの子宮頸部、及び１つのＮＳＣＬＣ ＴＩＬ株を使用した、ＴＩＬ単独に対するＩＦＮ－γ倍率変化（３重試料）対アッセイ共培養期間（時間）。 本発明の実施形態でもある、ＴＩＬ：腫瘍細胞株共培養アッセイの実験計画の図。 １２の黒色腫ＴＩＬ株についての１．０×１０６ＴＶＣ／ウェルのＴＩＬ単独に対する腫瘍細胞株のＩＦＮ－γ＋ＴＩＬの平均倍率変化。ボックスは、平均のいずれかの側にある１つの標準偏差を表し、これは線で示される。 １２の黒色腫ＴＩＬ株についての２．０×１０６ＴＶＣ／ウェルのＴＩＬ単独に対する腫瘍細胞株＋ＴＩＬのＩＦＮ－γの平均倍率変化。ボックスは、平均のいずれかの側にある１つの標準偏差を表し、これは線で示される。 １２の黒色腫ＴＩＬ株についての１．０×１０６ＴＶＣ／ウェルのＫ５６２陰性対照細胞に対する腫瘍細胞株＋ＴＩＬのＩＦＮ－γの平均倍率変化。ボックスは、平均のいずれかの側にある１つの標準偏差を表し、これは線で示される。 １２の黒色腫ＴＩＬ株について２．０×１０６ＴＶＣ／ウェルのＫ５６２陰性対照細胞に対する腫瘍細胞株＋ＴＩＬのＩＦＮ－γの平均倍率変化。ボックスは、平均のいずれかの側にある１つの標準偏差を表し、これは線で示される。 本発明の実施形態でもある、野生型（ＷＴ）及び遺伝子修飾型の２つのタイプのＴｈｐ１（ＴＨＰ－１）単球細胞株についてのＴＩＬ：腫瘍細胞株共培養アッセイの実験計画の図。 ＷＴ及び遺伝子修飾型Ｔｈｐ１標的細胞について取得されたＩＦＮ－γ値（ｐｇ／ｍＬ）の比較。 ＷＴ及び遺伝子修飾型Ｔｈｐ１標的細胞について取得されたＴＩＬ単独値に対するＩＦＮ－γ倍率変化の比較。 ある特定の実施形態における本発明のアッセイの陰性対照である、ＨＬＡ遮断を示す図。 各単球細胞株について生存率パーセントによって測定される、異なる抗体濃度でのＴｈｐ１（ＴＨＰ－１）及びＵ９３７単球細胞株に対するＨＬＡ－Ｉ遮断の効果。 各単球細胞株について生存率パーセントによって測定される、異なる抗体濃度でのＴｈｐ１（ＴＨＰ－１）及びＵ９３７単球細胞株に対するＨＬＡ－ＩＩ遮断の効果。 Ｒａｊｉ細胞及び遺伝子修飾されたＲａｊｉ細胞（Ｂ２Ｍ ＫＯ）の生存率パーセントによって測定される、異なる抗体濃度でのＲａｊｉ細胞に対するＨＬＡ－ＩＩ遮断の効果。 ＴＩＬ細胞株Ｍ１２１３に対するＨＬＡ－Ｉ（ａＭＨＣ Ｉ）及びＨＬＡ－ＩＩ（ａＭＨＣ ＩＩ）抗体遮断の効果。 ＴＩＬ細胞株Ｍ１２１４に対するＨＬＡ－Ｉ（ａＭＨＣ Ｉ）及びＨＬＡ－ＩＩ（ａＭＨＣ ＩＩ）抗体遮断の効果。 ＴＩＬ細胞株ＰＤ－ＬＩＭ－２０－０８に対するＨＬＡ－Ｉ（ａＭＨＣ Ｉ）及びＨＬＡ－ＩＩ（ａＭＨＣ ＩＩ）抗体遮断の効果。 ＨＬＡ（ＭＨＣ）クラスＩ及びＩＩ抗体用量滴定の結果。ＨＬＡ遮断陰性対照法の実施形態Ｉは、２０μｇ／ｍＬのＨＬＡ－Ｉ遮断抗体及び１０μｇ／ｍＬのＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体を使用して行った。ＨＬＡ遮断陰性対照法の実施形態ＩＩは、１０μｇ／ｍＬのＨＬＡ－Ｉ遮断抗体及び５μｇ／ｍＬのＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体を使用して行った。 各々が３回行われた、抗ＨＬＡ－Ｉ抗体（αＭＨＣ Ｉと表記される）及び抗ＨＬＡ－ＩＩ抗体（αＭＨＣ ＩＩと表記される）の添加時の１０個のＴＩＬ株からのバックグラウンドＩＦＮ－γ分泌の結果。実施形態Ｉ及び実施形態ＩＩは、それぞれ、図１７３及び図１８４に示され、本明細書の他の箇所に記載される実験実施形態を指し、実施形態Ｉについては２０μｇ／ｍＬのＨＬＡ－Ｉ遮断抗体及び１０μｇ／ｍＬのＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体、ならびに実施形態ＩＩについては１０μｇ／ｍＬのＨＬＡ－Ｉ遮断抗体及び５μｇ／ｍＬのＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体の使用を含む。 陰性対照細胞株の代わりにＨＬＡ遮断抗体を陰性対照として使用する、ＴＩＬ：腫瘍細胞株共培養アッセイの実験計画の図であり、これらのアッセイは、本明細書では、該当する場合「実施形態Ｉ」と総称され、本発明の実施形態でもある。 ＩＦＮ－γのｐｇ／ｍＬとして報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１５２のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。 ＩＦＮ－γのｐｇ／ｍＬとして報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１８７のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。 ＩＦＮ－γのｐｇ／ｍＬとして報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１６４のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。 ＩＦＮ－γのｐｇ／ｍＬとして報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１２１３のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。 ＩＦＮ－γのｐｇ／ｍＬとして報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１２１４のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。 ＴＩＬ単独に対するＩＦＮ－γ放出の倍率増強として報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１５２のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。 ＴＩＬ単独に対するＩＦＮ－γ放出の倍率増強として報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１８７のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。 ＴＩＬ単独に対するＩＦＮ－γ放出の倍率増強として報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１６４のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。 ＴＩＬ単独に対するＩＦＮ－γ放出の倍率増強として報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１２１３のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。 ＴＩＬ単独に対するＩＦＮ－γ放出の倍率増強として報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１２１４のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。 陰性対照細胞株の代わりにＨＬＡ遮断抗体を陰性対照として使用する、ＴＩＬ：腫瘍細胞株共培養アッセイの実験計画の図であり、これらのアッセイは、本明細書では、該当する場合「実施形態ＩＩ」と総称され、本発明の実施形態でもある。 ＩＦＮ－γのｐｇ／ｍＬとして報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１６１のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。Ｍ１１６１のＣＤ４＋集団及びＣＤ８＋集団は、フローサイトメトリーによってそれぞれ１．４％及び９７．６％であることが決定された。 ＩＦＮ－γのｐｇ／ｍＬとして報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１６３のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。Ｍ１１６３のＣＤ４＋集団及びＣＤ８＋集団を、フローサイトメトリーによってそれぞれ６０．６％及び３４．９％であることが決定された。 ＩＦＮ－γのｐｇ／ｍＬとして報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１７２のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。Ｍ１１７２のＣＤ４＋集団及びＣＤ８＋集団は、フローサイトメトリーによってそれぞれ７１．８％及び２２．２％であることが決定された。 ＩＦＮ－γのｐｇ／ｍＬとして報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１７３のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。Ｍ１１７３のＣＤ４＋集団及びＣＤ８＋集団を、フローサイトメトリーによってそれぞれ１３．４％及び８１．６％であることが決定された。 ＩＦＮ－γのｐｇ／ｍＬとして報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１７４のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。Ｍ１１７４のＣＤ４＋集団及びＣＤ８＋集団は、フローサイトメトリーによってそれぞれ９２．３％及び６．２％であることが決定された。 ＴＩＬ単独に対するＩＦＮ－γ放出の倍率増強として報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１６１のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。Ｍ１１６１のＣＤ４＋集団及びＣＤ８＋集団は、フローサイトメトリーによってそれぞれ１．４％及び９７．６％であることが決定された。 ＴＩＬ単独に対するＩＦＮ－γ放出の倍率増強として報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１６３のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。Ｍ１１６３のＣＤ４＋集団及びＣＤ８＋集団を、フローサイトメトリーによってそれぞれ６０．６％及び３４．９％であることが決定された。 ＴＩＬ単独に対するＩＦＮ－γ放出の倍率増強として報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１７２のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。Ｍ１１７２のＣＤ４＋集団及びＣＤ８＋集団は、フローサイトメトリーによってそれぞれ７１．８％及び２２．２％であることが決定された。 ＴＩＬ単独に対するＩＦＮ－γ放出の倍率増強として報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１７３のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。Ｍ１１７３のＣＤ４＋集団及びＣＤ８＋集団を、フローサイトメトリーによってそれぞれ１３．４％及び８１．６％であることが決定された。 ＴＩＬ単独に対するＩＦＮ－γ放出の倍率増強として報告される、標的細胞及び対照としてのＫ５６２細胞と共培養された黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１７４のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。Ｍ１１７４のＣＤ４＋集団及びＣＤ８＋集団は、フローサイトメトリーによってそれぞれ９２．３％及び６．２％であることが決定された。 陰性対照細胞株の代わりに、またはＴＩＬ単独対照実験に加えて、ＨＬＡ遮断抗体を陰性対照として使用する、ＴＩＬ：腫瘍細胞株共培養アッセイの実験計画の図であり、これらのアッセイのすべてもまた、本発明の実施形態である。１５個の黒色腫細胞株が使用される。 Ｕ９３７標的細胞と共培養した１５個の黒色腫ＴＩＬ株のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。 Ｔｈｐ１（ＴＨＰ－１）標的細胞と共培養した１５個の黒色腫ＴＩＬ株のＨＬＡ遮断陰性対照実験の結果。 Ｔｈｐ１細胞に対する有効ＴＩＬ濃度の決定。星は、２×１０６ＴＶＣでの３：１のＴＩＬ：Ｔｈｐ１比を示す。 Ｕ９３７細胞に対する有効ＴＩＬ濃度の決定。星は、２×１０６ＴＶＣでの３：１のＴＩＬ：Ｕ９３７比を示す。 Ｔｈｐ１及びＵ９３７標的細胞を使用した、３つのＴＩＬロット（Ｍ１１６４、Ｍ１１６３、及びＭ１１６９）の用量反応曲線。 Ｔｈｐ１及びＵ９３７標的細胞を使用した、３つの追加のＴＩＬロット（Ｍ１２１８、Ｍ１１７４、及びＭ１１５０Ａ）の用量反応曲線。 Ｕ９３７標的細胞を使用した、６つのＴＩＬロットの平行線分析。６つのＴＩＬはすべて、明確な用量反応を示す。 Ｔｈｐ１標的細胞を使用した、６つのＴＩＬロットの平行線分析。ＴＩＬ Ｍ１１７３及びＴＩＬ Ｍ１２１３は、明確な用量反応を示す。 Ｕ９３７標的細胞を使用した、ＨＬＡ遮断抗体の有無にかかわらず１．５×１０６ＴＩＬ濃度での３つのＴＩＬロット（Ｍ１１４５、Ｍ１１６１、及びＭ１１７３）の用量反応曲線。３つのＴＩＬロットはすべて、明確な用量反応を示し、また抗体処置によるシグナルの完全な阻害（特異的阻害）を示す。 Ｕ９３７標的細胞を使用した、ＨＬＡ遮断抗体の有無にかかわらず１．５×１０６ＴＩＬ濃度での３つのＴＩＬロット（Ｍ１１９７、Ｍ１２１３、及びＭ１２１４）の用量反応曲線。３つのＴＩＬロットはすべて、明確な用量反応を示し、また抗体処置によるシグナルの完全な阻害（特異的阻害）を示す。 黒色腫ＴＩＬ臨床試料についての、フローサイトメトリーによるＬＡＧ３発現のヒストグラム。 黒色腫ＴＩＬ臨床試料についての、フローサイトメトリーによるＫＬＲＧ１発現のヒストグラム。 Ｕ９３７アロ反応性共培養アッセイを使用した、２８個の過去の臨床ロットの相対効力に関するヒストグラムの対数分布評価。各ＴＩＬロットについて計算された相対効力測定値を対数変換したところ、得られた分布は正規分布であり、基礎となる分布が対数正規分布であることを示す。 ＲＥＰ中にＵ９３７細胞または同種異系ＰＢＭＣとインキュベートしたＴＩＬの拡張。 Ｕ９３７細胞または同種異系ＰＢＭＣによるＲＥＰ後に、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ビーズで刺激されたＴＩＬにおけるＩＦＮ－γ分泌。 Ｔ細胞効力試験のための、本発明のアロ反応性共培養アッセイ（「ａｌｌｏ－ｐＭＨＣ－ＴＣＲ相互作用誘導Ｔ細胞」と表示される）の実施形態と、従来の抗体ビーズベースのアッセイとの比較。
配列表の簡単な説明
配列番号１は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号２は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号３は、組換えヒトＩＬ－２タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。
配列番号５は、ＩＬ－２形態である。
配列番号６は、ＩＬ－２形態である。
配列番号７は、ＩＬ－２形態である。
配列番号８は、ムチンドメインポリペプチドである。
配列番号９は、組換えヒトＩＬ－４タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１０は、組換えヒトＩＬ－７タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、組換えヒトＩＬ－１５タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１２は、組換えヒトＩＬ－２１タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ＩＬ－２配列である。
配列番号１４は、ＩＬ－２ムテイン配列である。
配列番号１５は、ＩＬ－２ムテイン配列である。
配列番号１６は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ１＿ＩＬ－２である。
配列番号１７は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ２である。
配列番号１８は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ３である。
配列番号１９は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ１＿ＩＬ－２カバットである。
配列番号２０は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ２カバットである。
配列番号２１は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ３カバットである。
配列番号２２は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ１＿ＩＬ－２クロチアである。
配列番号２３は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ２クロチアである。
配列番号２４は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ３クロチアである。
配列番号２５は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ１＿ＩＬ－２ ＩＭＧＴである。
配列番号２６は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ２ ＩＭＧＴである。
配列番号２７は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ３ ＩＭＧＴである。
配列番号２８は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＶＨ鎖である。
配列番号２９は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の重鎖である。
配列番号３０は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＬＣＤＲ１カバットである。
配列番号３１は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＬＣＤＲ２カバットである。
配列番号３２は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＬＣＤＲ３カバットである。
配列番号３３は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＬＣＤＲ１ ｃｈｏｔｈｉａである。
配列番号３４は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＬＣＤＲ２ ｃｈｏｔｈｉａである。
配列番号３５は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＬＣＤＲ３ ｃｈｏｔｈｉａである。
配列番号３６は、ＶＬ鎖である。
配列番号３７は、軽鎖である。
配列番号３８は、軽鎖である。
配列番号３９は、軽鎖である。
配列番号４０は、ヒト４－１ＢＢのアミノ酸配列である。
配列番号４１は、マウス４－１ＢＢのアミノ酸配列である。
配列番号４２は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖である。
配列番号４３は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖である。
配列番号４４は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号４５は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号４６は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ１である。
配列番号４７は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ２である。
配列番号４８は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ３である。
配列番号４９は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ１である。
配列番号５０は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ２である。
配列番号５１は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ３である。
配列番号５２は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖である。
配列番号５３は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖である。
配列番号５４は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号５５は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号５６は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ１である。
配列番号５７は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ２である。
配列番号５８は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ３である。
配列番号５９は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ１である。
配列番号６０は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ２である。
配列番号６１は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ３である。
配列番号６２は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のＦｃドメインである。
配列番号６３は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
配列番号６４は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
配列番号６５は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
配列番号６６は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
配列番号６７は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
配列番号６８は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
配列番号６９は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
配列番号７０は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
配列番号７１は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
配列番号７２は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
配列番号７３は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のＦｃドメインである。
配列番号７４は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
配列番号７５は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
配列番号７６は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
配列番号７７は、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）アミノ酸配列である。
配列番号７８は、４－１ＢＢＬポリペプチドの可溶性部分である。
配列番号７９は、４－１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４－１－１バージョン１の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号８０は、４－１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４－１－１バージョン１の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号８１は、４－１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４－１－１バージョン２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号８２は、４－１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４－１－１バージョン２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号８３は、４－１ＢＢアゴニスト抗体Ｈ３９Ｅ３－２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号８４は、４－１ＢＢアゴニスト抗体Ｈ３９Ｅ３－２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号８５は、ヒトＯＸ４０のアミノ酸配列である。
配列番号８６は、マウスＯＸ４０のアミノ酸配列である。
配列番号８７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖である。
配列番号８８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖である。
配列番号８９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号９０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号９１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖ＣＤＲ１である。
配列番号９２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖ＣＤＲ２である。
配列番号９３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖ＣＤＲ３である。
配列番号９４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖ＣＤＲ１である。
配列番号９５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖ＣＤＲ２である。
配列番号９６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖ＣＤＲ３である。
配列番号９７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖である。
配列番号９８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖である。
配列番号９９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号１００は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号１０１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖ＣＤＲ１である。
配列番号１０２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖ＣＤＲ２である。
配列番号１０３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖ＣＤＲ３である。
配列番号１０４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ１である。
配列番号１０５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ２である。
配列番号１０６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ３である。
配列番号１０７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖である。
配列番号１０８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖である。
配列番号１０９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号１１０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号１１１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖ＣＤＲ１である。
配列番号１１２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖ＣＤＲ２である。
配列番号１１３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖ＣＤＲ３である。
配列番号１１４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖ＣＤＲ１である。
配列番号１１５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖ＣＤＲ２である。
配列番号１１６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖ＣＤＲ３である。
配列番号１１７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号１１８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号１１９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の重鎖ＣＤＲ１である。
配列番号１２０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の重鎖ＣＤＲ２である。
配列番号１２１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の重鎖ＣＤＲ３である。
配列番号１２２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の軽鎖ＣＤＲ１である。
配列番号１２３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の軽鎖ＣＤＲ２である。
配列番号１２４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の軽鎖ＣＤＲ３である。
配列番号１２５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号１２６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号１２７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の重鎖ＣＤＲ１である。
配列番号１２８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の重鎖ＣＤＲ２である。
配列番号１２９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の重鎖ＣＤＲ３である。
配列番号１３０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の軽鎖ＣＤＲ１である。
配列番号１３１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の軽鎖ＣＤＲ２である。
配列番号１３２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の軽鎖ＣＤＲ３である。
配列番号１３３は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）アミノ酸配列である。
配列番号１３４は、ＯＸ４０Ｌポリペプチドの可溶性部分である。
配列番号１３５は、ＯＸ４０Ｌポリペプチドの代替可溶性部分である。
配列番号１３６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体００８の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号１３７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体００８の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号１３８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０１１の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号１３９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０１１の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号１４０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２１の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号１４１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号１４２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２３の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号１４３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２３の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号１４４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号１４５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号１４６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号１４７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号１４８は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号１４９は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号１５０は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号１５１は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号１５２は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号１５３は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号１５４は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号１５５は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号１５６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
配列番号１５７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
配列番号１５８は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの重鎖アミノ酸配列である。
配列番号１５９は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの軽鎖アミノ酸配列である。
配列番号１６０は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列である。
配列番号１６１は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列である。
配列番号１６２は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号１６３は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号１６４は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号１６５は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号１６６は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号１６７は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号１６８は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの重鎖アミノ酸配列である。
配列番号１６９は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの軽鎖アミノ酸配列である。
配列番号１７０は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列である。
配列番号１７１は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列である。
配列番号１７２は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号１７３は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号１７４は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号１７５は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号１７６は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号１７７は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号１７８は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの重鎖アミノ酸配列である。
配列番号１７９は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの軽鎖アミノ酸配列である。
配列番号１８０は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列である。
配列番号１８１は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列である。
配列番号１８２は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号１８３は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号１８４は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号１８５は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号１８６は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号１８７は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号１８８は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの重鎖アミノ酸配列である。
配列番号１８９は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの軽鎖アミノ酸配列である。
配列番号１９０は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列である。
配列番号１９１は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列である。
配列番号１９２は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号１９３は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号１９４は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号１９５は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号１９６は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号１９７は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号１９８は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの重鎖アミノ酸配列である。
配列番号１９９は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの軽鎖アミノ酸配列である。
配列番号２００は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列である。
配列番号２０１は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列である。
配列番号２０２は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号２０３は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号２０４は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号２０５は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号２０６は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号２０７は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号２０８は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの重鎖アミノ酸配列である。
配列番号２０９は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの軽鎖アミノ酸配列である。
配列番号２１０は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列である。
配列番号２１１は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列である。
配列番号２１２は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号２１３は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号２１４は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号２１５は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号２１６は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号２１７は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号２１８は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの重鎖アミノ酸配列である。
配列番号２１９は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの軽鎖アミノ酸配列である。
配列番号２２０は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列である。
配列番号２２１は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列である。
配列番号２２２は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号２２３は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号２２４は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号２２５は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号２２６は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号２２７は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号２２８は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの重鎖アミノ酸配列である。
配列番号２２９は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの軽鎖アミノ酸配列である。
配列番号２３０は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列である。
配列番号２３１は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列である。
配列番号２３２は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号２３３は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号２３４は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号２３５は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号２３６は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号２３７は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
Ｉ．導入
急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）によってエクスビボで培養されたＴＩＬを利用した養子細胞療法は、黒色腫などのがんを有する患者の宿主免疫抑制後の養子細胞療法に成功している。現在の注入受容パラメータは、ＴＩＬ（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８、またはＣＤ４陽性）の組成の読み取り値、ビーズベースの効力アッセイ（ＩＦＮ－γなど）における刺激時の様々なサイトカイン及び他のマーカーの発現、ならびにＲＥＰ製品の拡張及び生存率の数値倍率に依存している。当該技術分野で知られているアッセイと比較して、とりわけ、優れた性能、Ｔ細胞製品の効力に対するより良い制御、及び生物学的関連性の増加といった改善を提供することができる、効力アッセイが本明細書に記載される。
ＩＩ．定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じである。本明細書で参照されるすべての特許及び刊行物は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
本明細書で使用される「同時投与」、「同時投与すること」、「組み合わせて投与される」、「組み合わせて投与すること」、「同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）」、及び「同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）」という用語は、対象または患者への２つ以上の医薬品有効成分（本発明の好ましい実施形態では、例えば、複数のＴＩＬ）の投与を包含し、医薬品有効成分及び／またはそれらの代謝物の両方が、対象または患者において同時に存在するようにする。同時投与には、別個の組成物での同時投与、別個の組成物での異なる時間での投与、または２つ以上の医薬品有効成分が存在する組成物での投与が含まれる。別個の組成物での同時投与及び両方の薬剤が存在する組成物での投与が好ましい。
「インビボ」という用語は、対象の体内または患者の体内で起こる事象を指す。
「インビトロ」という用語は、対象の体外または患者の体外で起こる事象を指す。インビトロアッセイには、生きている細胞または死んでいる細胞が用いられる細胞ベースのアッセイが包含され、無傷の細胞が用いられない無細胞アッセイも含み得る。
「エクスビボ」という用語は、対象の体または患者の体から除去された細胞、組織、及び／または器官に対して治療または処置を行うことを伴う事象を指す。適切には、細胞、組織、及び／または器官は、外科手術または治療の方法で対象の体または患者の体に戻され得る。
「急速拡張」という用語は、１週間の期間にわたって少なくとも約３倍（または４、５、６、７、８、もしくは９倍）、より好ましくは１週間の期間にわたって少なくとも約１０倍（または２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０倍）、あるいは最も好ましくは１週間の期間にわたって少なくとも約１００倍の抗原特異的ＴＩＬの数の増加を意味する。本明細書では、いくつかの急速拡張プロトコルが説明されている。
本明細書における「腫瘍浸潤リンパ球」または「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍に移動した白血球として最初に取得された細胞の集団を意味する。ＴＩＬには、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、ならびにＭ１マクロファージが含まれるが、これらに限定されない。ＴＩＬには、一次ＴＩＬ及び二次ＴＩＬの両方が含まれる。「一次ＴＩＬ」は、本明細書に概説されるように患者組織試料から得られるもの（「新たに採取された」と称されることもある）であり、「二次ＴＩＬ」は、本明細書で考察される拡張または増殖された任意のＴＩＬ細胞集団であり、バルクＴＩＬ及び拡張ＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」または「ｐｏｓｔ－ＲＥＰ ＴＩＬ」）が含まれるが、これらに限定されない。ＴＩＬ細胞集団には、遺伝子修飾ＴＩＬが含まれ得る。
本明細書における「細胞の集団」（ＴＩＬを含む）とは、共通の形質を共有するいくつかの細胞を意味する。一般に、集団は、概して１×１０６～１×１０１０の数の範囲であり、異なるＴＩＬ集団は、異なる数を含む。例えば、ＩＬ－２の存在下での一次ＴＩＬの初期成長は、およそ１×１０８細胞のバルクＴＩＬの集団をもたらす。ＲＥＰ拡張は、一般に、注入用の１．５×１０９～１．５×１０１０細胞の集団を提供するために行われる。
本明細書における「凍結保存されたＴＩＬ」とは、一次、バルク、または拡張（ＲＥＰ ＴＩＬ）のいずれかのＴＩＬが、約－１５０℃～－６０℃の範囲で処理及び保管されることを意味する。凍結保存のための一般的な方法は、実施例を含む本明細書の他の場所にも記載されている。明確にするために、「凍結保存されたＴＩＬ」は、一次ＴＩＬのソースとして使用される可能性のある凍結組織試料と区別することができる。
本明細書における「解凍された凍結保存ＴＩＬ」とは、以前に凍結保存され、その後、細胞培養温度またはＴＩＬが患者に投与され得る温度を含むがこれらに限定されない、室温以上に戻るように処理されたＴＩＬの集団を意味する。
ＴＩＬは、一般に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に定義されるか、または腫瘍に浸潤して治療を達成するそれらの能力によって機能的に定義されるかのいずれかであり得る。ＴＩＬは、一般に、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ－１、及びＣＤ２５のうちの１つ以上のバイオマーカーの発現によって分類され得る。さらに及び代替的に、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤する能力により機能的に定義され得る。
「凍結保存培地（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ）」または「凍結保存培地（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）」という用語は、細胞の凍結保存に使用できる任意の培地を指す。かかる培地は、７％～１０％のＤＭＳＯを含む培地を含むことができる。例示的な培地には、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０、Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍａｓｏｌ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。「ＣＳ１０」という用語は、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＢｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓから入手した凍結保存培地を指す。ＣＳ１０培地は、商品名「ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０」と称され得る。ＣＳ１０培地は、ＤＭＳＯを含む無血清の動物成分を含まない培地である。
「セントラルメモリーＴ細胞」という用語は、ヒトではＣＤ４５Ｒ０＋であり、ＣＣＲ７（ＣＣＲ７ｈｉまたはＣＣＲ７＋）及びＣＤ６２Ｌ（ＣＤ６２ｈｉ）を構成的に発現するＴ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型には、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒ）、及びＩＬ－１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ－６Ｂ、ＭＢＤ２、及びＢＭＩ１が含まれる。セントラルメモリーＴ細胞は、ＴＣＲトリガー後、エフェクター分子としてＩＬ－２及びＣＤ４０Ｌを主に分泌する。セントラルメモリーＴ細胞は、血液中のＣＤ４コンパートメントで優勢であり、ヒトではリンパ節及び扁桃腺において比例して濃縮される。自己再生幹メモリーＴ細胞、または「ＴＳＣＭ」は、ＴＣＭまたはＴＥＭ細胞に分化することができるサブセットであり、Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２０１１，１７，１２９０－９７に記載されている。
「エフェクターメモリーＴ細胞」、「エフェクターメモリーＴ細胞」または「ＴＥＭ」という用語は、セントラルメモリーＴ細胞と同様にＣＤ４５Ｒ０＋であるが、ＣＣＲ７（ＣＣＲ７ｌｏまたはＣＣＲ－）の構成的発現を失っており、ＣＤ６２Ｌ発現が不均一であるかまたは低い（ＣＤ６２Ｌｌｏ）、ヒトまたは哺乳動物Ｔ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型には、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒ）、及びＩＬ－１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＬＩＭＰ１が含まれる。エフェクターメモリーＴ細胞は、インターフェロンγ、ＩＬ－４、及びＩＬ－５を含む、抗原刺激後に高レベルの炎症性サイトカインを急速に分泌する。エフェクターメモリーＴ細胞は、血液中のＣＤ８コンパートメントで優勢であり、ヒトでは肺、肝臓、及び腸において比例して濃縮される。ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞は、大量のパーフォリンを担持する。ＣＤ４５ＲＡマーカーを再発現する末端分化ＴＥＭ細胞は、「ＴＥＭＲＡ」または「ＴＥＭＲＡ」細胞と称される。
「閉鎖系」という用語は、外部環境に対して閉鎖されている系を指す。細胞培養法に適した任意の閉鎖系を、本発明の方法で用いることができる。閉鎖系には、例えば、密閉Ｇ容器が含まれるが、これに限定されない。腫瘍セグメントが閉鎖系に付加されると、ＴＩＬを患者に投与する準備ができるまで、系は外部環境に開かれない。
腫瘍を破壊するためのプロセスを説明するために本明細書で使用される「断片化すること」、「断片」、及び「断片化された」という用語は、腫瘍組織を破砕、スライス、分割、及び細切するなどの機械的断片化法、ならびに腫瘍組織の物理的構造を破壊するための任意の他の方法を含む。
「末梢血単核細胞」及び「ＰＢＭＣ」という用語は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球を含む、丸い核を有する末梢血細胞を指す。抗原提示細胞として使用される場合（ＰＢＭＣは抗原提示細胞の一種である）、末梢血単核細胞は、好ましくは、照射された同種異系末梢血単核細胞である。
「末梢血リンパ球」及び「ＰＢＬ」という用語は、末梢血から拡張したＴ細胞を指す。いくつかの実施形態では、ＰＢＬは、ドナーからの全血またはアフェレーシス産物から分離される。いくつかの実施形態では、ＰＢＬは、ＣＤ３＋ＣＤ４５＋のＴ細胞表現型などのＴ細胞表現型の正または負の選択によって、ドナー由来の全血またはアフェレーシス産物から分離される。
「主要組織適合性複合体」または「ＭＨＣ」という用語は、適応免疫系の機能に不可欠な、ＭＨＣ分子として知られる細胞表面タンパク質をコードする一連の密接に連結された多型遺伝子を含む脊椎動物ＤＮＡ上の大きな遺伝子座を指す。ＭＨＣ遺伝子は、非常に多型であり、２つの主要産物、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ分子をもたらす。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、細胞質から発生する内因性抗原を提示する。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、細菌などの異物から細胞外に発生する外因性抗原を提示する。
「ＭＨＣ優性認識」という用語は、Ｔ細胞のＴＣＲ複合体と標的細胞のＨＬＡ－ペプチド複合体との同種異系相互作用を指す。ＭＨＣ優性認識は、Ｆｅｌｉｘ ａｎｄ Ａｌｌｅｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００７，７（１２），９４２－５３、Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｂｅｖａｎ，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９７７，２９（１），１－５、及びＪａｎｅｗａｙ，Ｔｈｅ Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＭＨＣ優性認識では、同種異系ＭＨＣ分子は、Ｔ細胞受容体により適合し、ＭＨＣ分子に結合するペプチドへの依存性が低い強結合をもたらし得る。
「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」または「ＨＬＡ複合体」という用語は、ヒト細胞の表面上で発現したＭＨＣ分子を指す。ヒト白血球抗原は、ヒトにおけるＭＨＣ遺伝子複合体によってコードされる。
「標的細胞」及び「標的細胞株」という用語は、ＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬなどのＴ細胞のアッセイ標的である細胞を指す。ある実施形態では、標的細胞は、ＭＨＣクラスＩ及び／またはクラスＩＩを発現する。ある実施形態では、標的細胞は、Ｒａｊｉ細胞及びその誘導体、バリアント、修飾、及び子孫、ならびにＭＨＣクラスＩ及び／またはクラスＩＩを発現する他の細胞を含む。ある実施形態では、標的細胞は、Ｔｈｐ１細胞及びその誘導体、バリアント、修飾、及び子孫を含む。ある実施形態では、標的細胞は、Ｒａｍｏｓ細胞及びその誘導体、バリアント、修飾、及び子孫を含む。ある実施形態では、標的細胞は、Ｕ９３７細胞及びその誘導体、バリアント、修飾、及び子孫を含む。ある実施形態では、標的細胞は、Ｄａｕｄｉ細胞及びその誘導体、バリアント、修飾、及び子孫を含む。ある実施形態では、標的細胞は、照射される。ある実施形態では、標的細胞は、照射されない。ある実施形態では、標的細胞株は、Ｒａｊｉ細胞株、Ｔｈｐ１細胞株、Ｒａｍｏｓ細胞株、Ｕ９３７細胞株、及びＤａｕｄｉ細胞株のうちの任意の２つの組み合わせである。ある実施形態では、標的細胞株は、Ｒａｊｉ細胞株、Ｔｈｐ１細胞株、Ｒａｍｏｓ細胞株、Ｕ９３７細胞株、及びＤａｕｄｉ細胞株のうちの任意の３つの組み合わせである。ある実施形態では、標的細胞株は、Ｒａｊｉ細胞株、Ｔｈｐ１細胞株、Ｒａｍｏｓ細胞株、Ｕ９３７細胞株、及びＤａｕｄｉ細胞株のうちの任意の４つの組み合わせである。ある実施形態では、標的細胞株は、Ｒａｊｉ細胞株、Ｔｈｐ１細胞株、Ｒａｍｏｓ細胞株、Ｕ９３７細胞株、及びＤａｕｄｉ細胞株の組み合わせである。ある実施形態では、標的細胞株は、混合腫瘍標的細胞株である。ある実施形態では、標的細胞株は、アロ反応性標的細胞株である。ある実施形態では、標的細胞株は、混合腫瘍アロ反応性標的細胞株である。ある実施形態では、標的細胞株は、次の細胞株：Ｒａｊｉ細胞株、Ｒａｍｏｓ細胞株、Ｔｈｐ１細胞株、Ｕ９３７細胞株、及びＤａｕｄｉ細胞株のうちの少なくとも２つの組み合わせを含む混合腫瘍アロ反応性標的細胞株である。
「Ｒａｊｉ細胞」または「Ｒａｊｉ細胞株」という用語は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）を含む複数のベンダーから入手可能なＢ細胞特性を有するバーキットリンパ腫細胞株、ならびにその誘導体、バリアント、修飾、及び子孫を意味する。Ｒａｊｉ細胞は、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９７６，５７，１６９－１８２、Ｓｏｂｅｌ ａｎｄ Ｂｏｋｉｓｃｈ，Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．１９７５，３４，９６５、及びＴｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７４，１４０，１２３０－１２４４に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。Ｒａｊｉ細胞は、膜結合免疫グロブリンを欠いているが、ＩｇＧ Ｆｃ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｄ、及びＣｌｑに対する受容体を有する。ある実施形態では、Ｒａｊｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫が、標的細胞である。ある実施形態では、Ｒａｊｉ細胞は、蛍光、リン光、化学発光、または生物発光標識を発現するように遺伝子修飾され、それによりその細胞膜が破壊されると、蛍光、リン光、化学発光、または生物発光標識が、検出において潜在的に使用するために培地に放出される。例えば、米国特許第１０，４１５，０１５号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される生物発光検出のための遺伝子修飾アプローチは、Ｒａｊｉ細胞の修飾に用いられ得る。
「Ｔｈｐ１細胞」または「Ｔｈｐ１細胞株」という用語は、「ＴＨＰ－１細胞」または「ＴＨＰ－１細胞株」とも呼ばれ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）を含む複数のベンダーから入手可能なヒト急性単球性白血病細胞株、ならびにその誘導体、バリアント、修飾、及び子孫を意味する。Ｔｈｐ１細胞株は、Ｔｓｕｃｈｉｙａ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １９８０，２６，１７１－１７６及びＢｏｓｓｈａｒｔ ａｎｄ Ｈｅｉｎｚｅｌｍａｎｎ，Ａｎｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１６，４（２１），４３８に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、Ｔｈｐ１細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫が、標的細胞である。ある実施形態では、Ｔｈｐ１細胞は、蛍光、リン光、化学発光、または生物発光標識を発現するように遺伝子修飾され、それによりその細胞膜が破壊されると、蛍光、リン光、化学発光、または生物発光標識が、検出において潜在的に使用するために培地に放出される。例えば、米国特許第１０，４１５，０１５号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される生物発光検出のための遺伝子修飾アプローチは、Ｔｈｐ１細胞の修飾に用いられ得る。
「Ｒａｍｏｓ細胞」または「Ｒａｍｏｓ細胞株」という用語は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）を含む複数のベンダーから入手可能なヒトバーキットリンパ腫細胞株、ならびにその誘導体、バリアント、修飾、及び子孫を意味する。Ｒａｍｏｓ細胞株は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８２，１２９，１３３６－１３４２に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、Ｒａｍｏｓ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫が、標的細胞である。ある実施形態では、Ｒａｍｏｓ細胞は、蛍光、リン光、化学発光、または生物発光標識を発現するように遺伝子修飾され、それによりその細胞膜が破壊されると、蛍光、リン光、化学発光、または生物発光標識が、検出において潜在的に使用するために培地に放出される。例えば、米国特許第１０，４１５，０１５号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される生物発光検出のための遺伝子修飾アプローチは、Ｒａｍｏｓ細胞の修飾に用いられ得る。
「Ｕ９３７細胞」または「Ｕ９３７細胞株」という用語は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）を含む複数のベンダーから入手可能なヒト組織球性リンパ腫細胞株、ならびにその誘導体、バリアント、修飾、及び子孫を意味する。Ｕ９３７細胞株は、Ｋｒａｕｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，４５，３７７７－３７８０に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、Ｕ９３７細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫は、標的細胞である。ある実施形態では、Ｕ９３７細胞は、蛍光、リン光、化学発光、または生物発光標識を発現するように遺伝子修飾され、それによりその細胞膜が破壊されると、蛍光、リン光、化学発光、または生物発光標識が、検出において潜在的に使用するために培地に放出される。例えば、米国特許第１０，４１５，０１５号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される生物発光検出のための遺伝子修飾アプローチは、Ｕ９３７細胞の修飾に用いられ得る。
「Ｄａｕｄｉ細胞」または「Ｄａｕｄｉ細胞株」という用語は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）を含む複数のベンダーから入手可能なヒトバーキットリンパ腫細胞株、ならびにその誘導体、バリアント、修飾、及び子孫を意味する。Ｄａｕｄｉ細胞株は、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９７，７１，８４－９４に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、Ｄａｕｄｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫が、標的細胞である。ある実施形態では、Ｄａｕｄｉ細胞は、蛍光、リン光、化学発光、または生物発光標識を発現するように遺伝子修飾され、それによりその細胞膜が破壊されると、蛍光、リン光、化学発光、または生物発光標識が、検出において潜在的に使用するために培地に放出される。例えば、米国特許第１０，４１５，０１５号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される生物発光検出のための遺伝子修飾アプローチは、Ｄａｕｄｉ細胞の修飾に用いられ得る。
「陰性対照」、「陰性対照細胞」、及び「陰性対照細胞株」という用語は、ＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬアッセイを含むＴ細胞アッセイの陰性対照として使用される細胞を指す。ある実施形態では、標的細胞は、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ発現を欠いている。ある実施形態では、標的細胞は、ＭＨＣクラスＩ発現を欠いている。ある実施形態では、標的細胞は、ＭＨＣまたはＨＬＡクラスＩ発現を欠いている。ある実施形態では、標的細胞は、ＭＨＣまたはＨＬＡクラスＩ及び／またはクラスＩＩを最小レベルで発現する。
「Ｋ５６２細胞」または「Ｋ５６２細胞株」という用語は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）を含む複数のベンダーから入手可能なリンパ芽球形態を有するヒト白人慢性骨髄性白血病細胞株を意味する。Ｋ５６２細胞は、Ｌｏｚｚｉｏ ａｎｄ Ｌｏｚｚｉｏ，Ｂｌｏｏｄ，１９７５，４５，３２１－３４に記載されており、ある実施形態では、陰性対照細胞は、Ｋ５６２細胞及びその誘導体、バリアント、修飾、及び子孫、ならびにＭＨＣまたはＨＬＡクラスＩもしくはクラスＩＩを発現しない他の細胞を含む。
「抗ＣＤ３抗体」という用語は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対するヒト、ヒト化、キメラ、またはマウス抗体を含む、抗体またはそのバリアント、例えば、モノクローナル抗体を指す。抗ＣＤ３抗体には、ムロモナブとしても知られるＯＫＴ－３が含まれる。抗ＣＤ３抗体には、Ｔ３及びＣＤ３εとしても知られるＵＨＣＴ１クローンも含まれる。他の抗ＣＤ３抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ、及びビシリズマブが含まれる。
「ＯＫＴ－３」（本明細書では「ＯＫＴ３」とも称される）という用語は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対するヒト、ヒト化、キメラ、またはマウス抗体を含む、モノクローナル抗体またはそのバイオシミラーもしくはバリアントを指し、市販の形態、例えば、ＯＫＴ－３（３０ｎｇ／ｍＬ、ＭＡＣＳ ＧＭＰ ＣＤ３ ｐｕｒｅ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びムロモナブ、またはそれらのバリアント、保存的アミノ酸置換物、グリコフォーム、またはバイオシミラーを含む。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表１に示す（配列番号１及び配列番号２）。ＯＫＴ－３を産生することができるハイブリドーマは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ８００１が割り当てられている。ＯＫＴ－３を産生することができるハイブリドーマは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）にも寄託され、カタログ番号８６０２２７０６が割り当てられている。
Figure 2024512029000001
「ＩＬ－２」（本明細書では「ＩＬ２」とも称される）という用語は、インターロイキン－２として知られるＴ細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物形態、保存的アミノ酸置換物、グリコフォーム、バイオシミラー、及びバリアントを含む、ＩＬ－２のすべての形態を含む。ＩＬ－２は、例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７２，３９８３－８８及びＭａｌｅｋ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，２６，４５３－７９に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－２のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号３）。例えば、ＩＬ－２という用語は、アルデスロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ、単回使用バイアル当たり２２００万ＩＵで複数の供給業者から市販されている）などのヒト組換えＩＬ－２形態、ならびにＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ，ＵＳＡ（ＣＥＬＬＧＲＯ ＧＭＰ）またはＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡによって市販されている組換えＩＬ－２形態（カタログ番号ＣＹＴ－２０９－ｂ）及び他のベンダーからの他の商用同等物を包含する。アルデスロイキン（デス－アラニル－１、セリン－１２５ヒトＩＬ－２）は、およそ１５ｋＤａの分子量を有する非グリコシル化ヒト組換えＩＬ－２形態である。本発明での使用に好適なアルデスロイキンのアミノ酸配列を表２に示す（配列番号４）。ＩＬ－２という用語は、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手可能なペグ化ＩＬ２プロドラッグＮＫＴＲ－２１４を含む、本明細書に記載のペグ化ＩＬ－２形態も包含する。本発明での使用に好適なＮＫＴＲ－２１４及びペグ化ＩＬ－２は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０３２８７９１Ａ１号及び国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／０６５０８６Ａ１号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。本発明での使用に好適なコンジュゲートされたＩＬ－２の代替形態は、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号、同第５，０８９，２６１号、及び同第４９０２，５０２号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。本発明での使用に好適なＩＬ－２の製剤は、米国特許第６，７０６，２８９号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、ＴＨＯＲ－７０７である。本発明での使用に好適なＩＬ－２の追加の代替形態は、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０１８１２２０Ａ１号及び米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０３３０６０１Ａ１号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、ＡＬＫＳ－４２３０である。本発明での使用に好適なＩＬ－２の追加の代替形態は、米国特許出願公開第ＵＳ２０２１／００３８６８４Ａ１号及び米国特許第１０，１８３，９７９号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、単離及び精製ＩＬ－２ポリペプチドと、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６１、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｋ６４、Ｐ６５、Ｖ６９、Ｌ７２、及びＹ１０７から選択されるアミノ酸位置で単離及び精製ＩＬ－２ポリペプチドに結合する複合部分と、を含む、インターロイキン２（ＩＬ－２）コンジュゲートであり、アミノ酸残基の番号付けは、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０１８１２０号における配列番号１に対応する。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置は、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６１、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｋ６４、Ｐ６５、Ｖ６９、Ｌ７２、及びＹ１０７から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置は、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６１、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｐ６５、Ｖ６９、Ｌ７２、及びＹ１０７から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置は、Ｔ３７、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｐ６５、Ｖ６９、Ｌ７２、及びＹ１０７から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置は、Ｒ３８及びＫ６４から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置は、Ｅ６１、Ｅ６２、及びＥ６８から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置は、Ｅ６２である。いくつかの実施形態では、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６１、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｋ６４、Ｐ６５、Ｖ６９、Ｌ７２、及びＹ１０７から選択されるアミノ酸残基は、リジン、システイン、またはヒスチジンにさらに変異する。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基は、システインに変異する。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基は、リジンに変異する。いくつかの実施形態では、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６１、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｋ６４、Ｐ６５、Ｖ６９、Ｌ７２、及びＹ１０７から選択されるアミノ酸残基は、非天然アミノ酸にさらに変異する。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）、ＢＣＮ－Ｌ－リジン、ノルボルネンリジン、ＴＣＯ－リジン、メチルテトラジンリジン、アリルオキシカルボニルリジン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、２－アミノ－８－オキソオクタン酸、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｍ－アセチルフェニルアラニン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｌ－ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリルチロシン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、ホスホノチロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、２－アミノ－３－（（２－（（３－（ベンジルオキシ）－３－オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸、２－アミノ－３－（フェニルセラニル）プロパン酸、またはセレノシステインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２コンジュゲートは、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＩＬ－２受容体α（ＩＬ－２Ｒα）サブユニットに対する減少した親和性を有する。いくつかの実施形態では、減少した親和性は、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＩＬ－２Ｒαに対する結合親和性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９％を超える減少である。いくつかの実施形態では、減少した親和性は、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、５００倍、１０００倍以上である。いくつかの実施形態では、複合部分は、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの結合を損なうかまたは遮断する。いくつかの実施形態では、複合部分は、水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、追加の複合部分は、水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーの各々は、独立して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、エチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）、ポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーの各々は、独立して、ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、直鎖状ＰＥＧまたは分岐状ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーの各々は、独立して、ポリサッカライドを含む。いくつかの実施形態では、ポリサッカライドは、デキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アミロース、ヘパリン、ヘパランサルフェート（ＨＳ）、デキストリン、またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーの各々は、独立して、グリカンを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーの各々は、独立して、ポリアミンを含む。いくつかの実施形態では、複合部分は、タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、追加の複合部分は、タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質の各々は、独立して、アルブミン、トランスフェリン、またはトランスサイレチンを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質の各々は、独立して、Ｆｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質の各々は、独立して、ＩｇＧのＦｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、複合部分は、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、追加の複合部分は、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質の各々は、独立して、ＸＴＥＮペプチド、グリシンリッチホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、ＰＡＳポリペプチド、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）、ＣＴＰペプチド、またはゼラチン様タンパク質（ＧＬＫ）ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、単離及び精製ＩＬ－２ポリペプチドは、グルタミル化によって修飾される。いくつかの実施形態では、複合部分は、単離及び精製ＩＬ－２ポリペプチドと直接的に結合される。いくつかの実施形態では、複合部分は、リンカーを介して単離及び精製されたＩＬ－２ポリペプチドと間接的に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、ホモ二官能性リンカーを含む。いくつかの実施形態では、ホモ二官能性リンカーは、ロマント試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）ＤＳＰ、３’３’－ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、ジスクシンイミジルスベラート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート（ＢＳ）、ジスクシンイミジルタータラート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルタータラート（スルホＤＳＴ）、エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルグルタラート（ＤＳＧ）、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボナート（ＤＳＣ）、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）、ジメチル－３，３’－ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、１，４－ジ－（３’－（２’－ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ハロゲン化アリール含有化合物（ＤＦＤＮＢ）、例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンまたは１，３－ジフルオロ－４，６－ジニトロベンゼン、４，４’－ジフルオロ－３，３’－ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）、ビス－［β－（４－アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、ｏ－トルイジン、３，３’－ジメチルベンジジン、ベンジジン、α，α’－ｐ－ジアミノジフェニル、ジヨード－ｐ－キシレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’－エチレン－ビス（ヨードアセトアミド）、またはＮ，Ｎ’－ヘキサメチレンビス（ヨードアセトアミド）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ヘテロ二官能性リンカーを含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二官能性リンカーは、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ｓＰＤＰ）、長鎖Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＬＣ－ｓＰＤＰ）、水溶性長鎖Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（スルホ－ＬＣ－ｓＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルエン（ｓＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル－６－［α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ－ＬＣ－ｓＭＰＴ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ｓＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＭＢ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ｓＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ－ｓＩＡＢ）、スクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ｓＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ－ｓＭＰＢ）、Ｎ－（γ－マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢ）、Ｎ－（γ－マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＧＭＢ）、スクシンイミジル６－（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノエート（ｓＩＡＸ）、スクシンイミジル６－［６－（（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ］ヘキサノエート（ｓｌＡＸＸ）、スクシンイミジル４－（（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＩＡＣ）、スクシンイミジル６－（（（（（４－ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン－１－カルボニル）アミノ）ヘキサノエート（ｓＩＡＣＸ）、ｐ－ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）、カルボニル反応性及びスルフヒドリル反応性架橋剤、例えば、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサ








ン－１－カルボキシル－ヒドラジド－８（Ｍ２Ｃ２Ｈ）、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－４－アジドサリチル酸（ＮＨｓ－ＡｓＡ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル－４－アジドサリチル酸（スルホ－ＮＨｓ－ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル－（４－アジドサリチルアミド）ヘキサノエート（スルホ－ＮＨｓ－ＬＣ－ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル－２－（ｐ－アジドサリチルアミド）エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡｓＤ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－４－アジドベンゾエート（ＨｓＡＢ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル－４－アジドベンゾエート（スルホ－ＨｓＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル－６－（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ｓＡＮＰＡＨ）、スルホスクシンイミジル－６－（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（スルホ－ｓＡＮＰＡＨ）、Ｎ－５－アジド－２－ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ－ＮＯ）、スルホスクシンイミジル－２－（ｍ－アジド－ｏ－ニトロベンズアミド）－エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＮＤ）、Ｎ－スクシンイミジル－４（４－アジドフェニル）１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＤＰ）、Ｎ－スルホスクシンイミジル（４－アジドフェニル）－１，３’－ジチオプロピオネート（スルホ－ｓＡＤＰ）、スルホスクシンイミジル４－（ｐ－アジドフェニル）ブチレート（スルホ－ｓＡＰＢ）、スルホスクシンイミジル２－（７－アジド－４－メチルクマリン－３－アセトアミド）エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＥＤ）、スルホスクシンイミジル７－アジド－４－メチルクマリン－３－アセテート（スルホ－ｓＡＭＣＡ）、ｐ－ニトロフェニルジアゾピルベート（ｐＮＰＤＰ）、ｐ－ニトロフェニル－２－ジアゾ－３，３，３－トリフルオロプロピオネート（ＰＮＰ－ＤＴＰ）、１－（ρ－アジドサリチルアミド）－４－（ヨードアセトアミド）ブタン（ＡｓＩＢ）、Ｎ－［４－（ρ－アジドサリチルアミド）ブチル］－３’－（２’－ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、ベンゾフェノン－４－ヨードアセトアミド、ｐ－アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）、４－（ρ－アジドサリチルアミド）ブチルアミン（ＡｓＢＡ）、またはｐ－アジドフェニルグリオキサール（ＡＰＧ）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、任意選択でジペプチドリンカーを含む、切断可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ジペプチドリンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｌａ、またはＶａｌ－Ｌｙｓを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断不可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、任意選択で、マレイミドカプロイル（ｍｃ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＭＣＣ）、またはスルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ｓＭＣＣ）を含むマレイミド基を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、スペーサーをさらに含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ｐ－アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）、その誘導体、または類似体を含む。いくつかの実施形態では、複合部分は、ＩＬ－２コンジュゲートの血清半減期を延長することができる。いくつかの実施形態では、追加の複合部分は、ＩＬ－２コンジュゲートの血清半減期を延長することができる。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、本明細書に記載のＩＬ－２形態のうちのいずれかの断片である。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０１８１２２０Ａ１号及び米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０３３０６０１Ａ１号に開示されているようにペグ化されている。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む複合部分に共有結合したＮ６－アジドエトキシ－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）を含むＩＬ－２ポリペプチドを含む、ＩＬ－２コンジュゲートであり、ＩＬ－２ポリペプチドは、米国特許出願公開第２０２０／０３３０６０１における配列番号１（本明細書では表２に配列番号５として列挙される）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡｚＫは、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０３３０６０１号における配列番号１（本明細書では表２に配列番号５として列挙される）内のアミノ酸位置に関して、Ｋ３５位、Ｆ４２位、Ｆ４４位、Ｋ４３位、Ｅ６２位、Ｐ６５位、Ｒ３８位、Ｔ４１位、Ｅ６８位、Ｙ４５位、Ｖ６９位、またはＬ７２位でアミノ酸を置換する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ポリペプチドは、米国特許公開出願第ＵＳ２０２０／０３３０６０１号における配列番号１（本明細書では表２に配列番号５として列挙される）に対して１残基のＮ末端欠失を含む。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、ＩＬ－２Ｒアルファ鎖会合を欠いているが、中間親和性ＩＬ－２Ｒベータ－ガンマシグナル伝達複合体との正常な結合を保持している。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、ＡＬＫＳ－４２３０である。本発明での使用に好適なＩＬ－２の形態は、米国特許出願公開第ＵＳ２０２１／００３８６８４Ａ１号に配列番号１として記載されている（本明細書では表２に配列番号６として列挙されている）。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、米国特許第１０，１８３，９７９号における配列番号２（本明細書では表２に配列番号７として列挙される、米国特許第１０，１８３，９７９号における配列番号２）のアミノ酸２４～４５２を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、米国特許第１０，１８３，９７９号における配列番号２のアミノ酸２４～４５２を含む融合タンパク質、または米国特許第１０，１８３，９７９号における配列番号２のアミノ酸２４～４５２と相同なアミノ酸配列であり、米国特許第１０，１８３，９７９号における配列番号２のアミノ酸２４～４５２の全長にわたって少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有し、米国特許第１０，１８３，９７９号における配列番号２のアミノ酸２４～４５２の受容体アンタゴニスト活性を有する。任意選択で、いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、ムチンドメインポリペプチドリンカーによって第２の融合パートナーと連結された第１の融合パートナーを含む融合タンパク質であり、第１の融合パートナーは、ＩＬ－１Ｒα、またはＩＬ－１Ｒαと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有し、ＩＬ－Ｒαの受容体アンタゴニスト活性を有するタンパク質であり、第２の融合パートナーは、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンの全部または一部を含み、ムチンドメインポリペプチドリンカーは、米国特許第１０，１８３，９７９号における配列番号１４（本明細書では表２に配列番号８として列挙される）または米国特許第１０，１８３，９７９号における配列番号１４（本明細書では表２に配列番号８として列挙される）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、融合タンパク質の半減期は、ムチンドメインポリペプチドリンカーの非存在下での第２の融合パートナーとの第１の融合パートナー

Figure 2024512029000002
いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲに移植されたＩＬ－２分子またはその断片と、を含む抗体サイトカイン移植タンパク質を含み、抗体サイトカイン移植タンパク質は、制御性Ｔ細胞よりもＴエフェクター細胞を優先的に拡張させる。ある実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲに移植されたＩＬ－２分子またはその断片と、を含み、ＩＬ－２分子は、ムテインであり、抗体サイトカイン移植タンパク質は、制御性Ｔ細胞よりもＴエフェクター細胞を優先的に拡張させる。ある実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号に記載されている抗体の投与を含み、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲに移植されたＩＬ－２分子またはその断片と、を含み、ＩＬ－２分子は、ムテインであり、抗体サイトカイン移植タンパク質は、制御性Ｔ細胞よりもＴエフェクター細胞を優先的に拡張させ、抗体は、米国特許第出願公開第ＵＳ２０２０／０２７０３３４Ａ１における配列番号６９を含むＩｇＧクラス軽鎖及び米国特許第出願公開第ＵＳ２０２０／０２７０３３４Ａ１における配列番号５３を含むＩｇＧクラス重鎖、米国特許第出願公開第ＵＳ２０２０／０２７０３３４Ａ１における配列番号３７を含むＩｇＧクラス軽鎖及び米国特許第出願公開第ＵＳ２０２０／０２７０３３４Ａ１における配列番号２１を含むＩｇＧクラス重鎖、米国特許第出願公開第ＵＳ２０２０／０２７０３３４Ａ１における配列番号６９を含むＩｇＧクラス軽鎖及び米国特許第出願公開第ＵＳ２０２０／０２７０３３４Ａ１における配列番号２１を含むＩｇＧクラス重鎖、ならびに配列番号３７を含むＩｇＧクラス軽鎖及び米国特許第出願公開第ＵＳ２０２０／０２７０３３４Ａ１における配列番号５３を含むＩｇＧクラス重鎖からなる群から選択されたＩｇＧクラス重鎖及びＩｇＧクラス軽鎖をさらに含む。
ある実施形態では、ＩＬ－２分子またはその断片は、ＶＨのＨＣＤＲ１に移植され、ＩＬ－２分子は、ムテインである。ある実施形態では、ＩＬ－２分子またはその断片は、ＶＨのＨＣＤＲ２に移植され、ＩＬ－２分子は、ムテインである。ある実施形態では、ＩＬ－２分子またはその断片は、ＶＨのＨＣＤＲ３に移植され、ＩＬ－２分子は、ムテインである。ある実施形態では、ＩＬ－２分子またはその断片は、ＶＬのＬＣＤＲ１に移植され、ＩＬ－２分子は、ムテインである。ある実施形態では、ＩＬ－２分子またはその断片は、ＶＬのＬＣＤＲ２に移植され、ＩＬ－２分子は、ムテインである。ある実施形態では、ＩＬ－２分子またはその断片は、ＶＬのＬＣＤＲ３に移植され、ＩＬ－２分子は、ムテインである。
ＩＬ－２分子の挿入は、ＣＤＲのＮ末端領域もしくはその近く、ＣＤＲの中間領域、またはＣＤＲのＣ末端領域もしくはその近くであり得る。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、ＣＤＲに組み込まれたＩＬ－２分子を含み、ＩＬ２配列はＣＤＲ配列をフレームシフトしない。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、ＣＤＲに組み込まれたＩＬ－２分子を含み、ＩＬ－２配列はＣＤＲ配列のすべてまたは一部を置き換える。ＩＬ－２分子による置き換えは、ＣＤＲのＮ末端領域、ＣＤＲの中間領域、またはＣＤＲのＣ末端領域もしくはその近くであり得る。ＩＬ－２分子による置き換えは、ＣＤＲ配列のわずか１個もしくは２個のアミノ酸、またはＣＤＲ配列全体であり得る。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子は、ペプチドリンカーなしで、ＣＤＲ配列とＩＬ－２配列との間に追加のアミノ酸なしで、ＣＤＲに直接的に移植される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子は、ペプチドリンカーを用いて、ＣＤＲ配列とＩＬ－２配列との間に１つ以上の追加のアミノ酸を伴って、ＣＤＲに間接的に移植される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＩＬ－２分子は、ＩＬ－２ムテインである。いくつかの事例では、ＩＬ－２ムテインは、Ｒ６７Ａ置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号のアミノ酸配列配列番号４または配列番号６を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０２７０３３４Ａ１号の表１のアミノ酸配列を含み、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
ある実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号７、配列番号１０、配列番号１３及び配列番号１６からなる群から選択されるＨＣＤＲ１を含む。ある実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号７、配列番号１０、配列番号１３及び配列番号１６からなる群から選択されるＨＣＤＲ１、ならびに配列番号８、配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１７からなる群から選択されるＨＣＤＲ２を含む。ある実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号７、配列番号１０、配列番号１３及び配列番号１６からなる群から選択されるＨＣＤＲ１、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１７からなる群から選択されるＨＣＤＲ２、ならびに配列番号９、配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１８からなる群から選択されるＨＣＤＲ３を含む。ある実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。ある実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。ある実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。ある実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、米国特許公開第ＵＳ２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。ある実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。ある実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０２７０３３４Ａ１号の配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖領域、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。ある実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４Ａ１号のＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１を含む。ある実施形態では、本明細書に記載の抗体サイトカイン移植タンパク質の抗体成分は、免疫グロブリン配列、フレームワーク配列、またはパリビズマブのＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体サイトカイン移植タンパク質は、アルデスロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））または同等の分子などであるがこれらに限定されない野生型ＩＬ－２分子よりも長い血清半減期を有する。
ある実施形態では、本明細書に記載の抗体サイトカイン移植タンパク質は、表３に記載される配列を有する。
Figure 2024512029000003
Figure 2024512029000004
Figure 2024512029000005
Figure 2024512029000006
「ＩＬ－４」（本明細書では「ＩＬ４」とも称される）という用語は、インターロイキン４として知られるサイトカインを指し、これは、Ｔｈ２ Ｔ細胞、ならびに好酸球、好塩基球、及び肥満細胞によって産生される。ＩＬ－４は、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）からＴｈ２ Ｔ細胞への分化を調節する。Ｓｔｅｉｎｋｅ ａｎｄ Ｂｏｒｉｓｈ，Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．２００１，２，６６－７０。ＩＬ－４によって活性化されると、Ｔｈ２ Ｔ細胞は、その後、正のフィードバックループで追加のＩＬ－４を産生する。ＩＬ－４は、Ｂ細胞増殖及びクラスＩＩ ＭＨＣ発現も刺激し、Ｂ細胞からのＩｇＥ及びＩｇＧ１発現へのクラス切り替えを誘導する。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－４は、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ（カタログ番号ＣＹＴ－２１１）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ ＣＴＰ００４３）を含む、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－４のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号９）。
「ＩＬ－７」（本明細書では「ＩＬ７」とも称される）という用語は、インターロイキン７として知られるグリコシル化組織由来のサイトカインを指し、これは、間質細胞及び上皮細胞、ならびに樹状細胞から得ることができる。Ｆｒｙ ａｎｄ Ｍａｃｋａｌｌ，Ｂｌｏｏｄ ２００２，９９，３８９２－９０４。ＩＬ－７は、Ｔ細胞の発達を刺激することができる。ＩＬ－７は、ＩＬ－７受容体アルファ及び共通ガンマ鎖受容体からなるヘテロ二量体であるＩＬ－７受容体に結合し、これは、胸腺内でのＴ細胞発生及び末梢内での生存に重要な一連のシグナルである。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－７は、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ（カタログ番号ＣＹＴ－２５４）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ ＰＨＣ００７１）を含む、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－７のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号１０）。
「ＩＬ－１５」（本明細書では「ＩＬ１５」とも称される）という用語は、インターロイキン－１５として知られるＴ細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物形態、保存的アミノ酸置換物、グリコフォーム、バイオシミラー、及びバリアントを含む、ＩＬ－２のすべての形態を含む。ＩＬ－１５は、例えば、Ｆｅｈｎｉｇｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ，Ｂｌｏｏｄ ２００１，９７，１４－３２に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－１５は、β及びγシグナル伝達受容体サブユニットをＩＬ－２と共有する。組換えヒトＩＬ－１５は、１２．８ｋＤａの分子量を有する１１４個のアミノ酸（及びＮ末端メチオニン）を含む単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ－１５は、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ（カタログ番号ＣＹＴ－２３０－ｂ）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号３４－８１５９－８２）を含む、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－１５のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号１１）。
「ＩＬ－２１」（本明細書では「ＩＬ２１」とも称される）という用語は、インターロイキン－２１として知られる多面発現性サイトカインタンパク質を指し、ヒト及び哺乳動物形態、保存的アミノ酸置換物、グリコフォーム、バイオシミラー、及びバリアントを含む、ＩＬ－２１のすべての形態を含む。ＩＬ－２１は、例えば、Ｓｐｏｌｓｋｉ ａｎｄ Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃ．２０１４，１３，３７９－９５に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－２１は、主にナチュラルキラーＴ細胞及び活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生される。組換えヒトＩＬ－２１は、１５．４ｋＤａの分子量を有する１３２個のアミノ酸を含む単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ－２１は、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ（カタログ番号ＣＹＴ－４０８－ｂ）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ（ヒトＩＬ－２１組換えタンパク質、カタログ番号１４－８２１９－８０）を含む、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－２１のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号１２）。
「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、及び健康状態の個人差を考慮して、医師によって決定され得る。一般に、本明細書に記載される腫瘍浸潤リンパ球（例えば、二次ＴＩＬまたは遺伝子改変された細胞傷害性リンパ球）は、体重１ｋｇ当たり１０４～１０１１細胞（例えば、体重１ｋｇ当たり１０５～１０６、１０５～１０１０、１０５～１０１１、１０６～１０１０、１０６～１０１１、１０７～１０１１、１０７～１０１０、１０８～１０１１、１０８～１０１０、１０９～１０１１、または１０９～１０１０細胞）（それらの範囲内のすべての整数値を含む）の投与量で投与され得る。腫瘍浸潤リンパ球（場合によっては、遺伝子改変された細胞傷害性リンパ球を含む）組成物もまた、これらの投与量で複数回投与され得る。腫瘍浸潤リンパ球（場合によっては、遺伝的を含む）は、免疫療法で一般的に知られている注入技法を使用することにより投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照）。特定の患者に最適な投薬量及び治療レジーム（ｒｅｇｉｍｅ）は、患者を疾患の兆候について監視し、適宜に治療を調整することによって、医学分野の技術者によって容易に決定され得る。
「血液学的悪性腫瘍」、「血液系悪性腫瘍」という用語または相関する意味の用語は、血液、骨髄、リンパ節、及びリンパ系の組織を含むが、これらに限定されない、哺乳動物の造血組織及びリンパ組織のがん及び腫瘍を指す。血液学的悪性腫瘍は、「液体腫瘍」とも称される。血液学的悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫が含まれ得るが、これらに限定されない。「Ｂ細胞血液学的悪性腫瘍」という用語は、Ｂ細胞を冒す血液学的悪性腫瘍を指す。
「液体腫瘍」という用語は、本来流体である異常な細胞塊を指す。液体腫瘍癌には、白血病、骨髄腫、及びリンパ腫、ならびに他の血液学的悪性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。液体腫瘍から取得されたＴＩＬは、本明細書では骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）とも称され得る。末梢血中で循環する液体腫瘍を含む液体腫瘍から得られるＴＩＬは、本明細書ではＰＢＬとも称され得る。ＭＩＬ、ＴＩＬ、及びＰＢＬという用語は、本明細書で互換的に使用され、細胞が由来する組織タイプに基づいてのみ異なる。
本明細書で使用される「微小環境」という用語は、全体としての固形もしくは血液学的腫瘍微小環境、または微小環境内の細胞の個々のサブセットを指し得る。本明細書で使用される腫瘍微小環境は、Ｓｗａｒｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０１２，７２，２４７３に記載されるように、「腫瘍性形質転換を促進し、腫瘍成長及び浸潤を支持し、腫瘍を宿主免疫から保護し、治療抵抗性を助長し、かつ優勢な転移を成功させるニッチを提供する、細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス、及び機械的手がかり」の複合混合物を指す。腫瘍はＴ細胞によって認識されるべき抗原を発現するが、微小環境による免疫抑制のため、免疫系による腫瘍クリアランスはまれである。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ集団でがんを治療する方法を含み、患者は、本発明によるＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前治療される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団が提供され得、患者は、本発明によるＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前治療される。ある実施形態では、骨髄非破壊的化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）、ならびにフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日で５日間（ＴＩＬ注入の２７日前～２３日前）である。ある実施形態では、本発明による骨髄非破壊的化学療法及びＴＩＬ注入（０日目）後、患者は、生理学的許容範囲まで８時間毎に７２０，０００ＩＵ／ｋｇでＩＬ－２の静脈内注入を受ける。
実験的発見は、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、制御性Ｔ細胞及び免疫系の競合要素（「サイトカインシンク」）を排除することによって治療有効性を増強する上で重要な役割を果たすことを示す。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、本発明のＴＩＬを導入する前に、患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」と称されることもある）を利用する。
「有効量」または「治療有効量」という用語は、疾患治療を含むが、これに限定されない、意図された用途を達成するのに十分である、本明細書に記載の化合物または化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図される用途（インビトロもしくはインビボ）、または治療される対象及び病状（例えば、対象の体重、年齢、及び性別）、病状の重症度、または投与方法に応じて異なり得る。この用語は、標的細胞において特定の応答（例えば、血小板粘着及び／または細胞遊走の低減）を誘導する用量にも適用される。特定の用量は、選択された特定の化合物、従うべき投薬レジメン、化合物が他の化合物と組み合わせて投与されるか、投与のタイミング、それが投与される組織、及び化合物が運ばれる物理的送達系に応じて異なる。
「治療」、「治療すること」、「治療する」などの用語は、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、その疾患または症状を完全にまたは部分的に予防するという観点において予防的であり得、及び／または疾患及び／またはその疾患に起因する副作用の部分的または完全な治癒という観点において治療的であり得る。「治療」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患にかかりやすい可能性があるが、まだ疾患を有すると診断されていない対象に疾患が生じるのを予防すること、（ｂ）疾患を抑制すること、すなわち、その発症または進行を抑止すること、及び（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退行を引き起こし、及び／または１つ以上の疾患症状を軽減することを含む。「治療」は、疾患または状態がない場合でさえも、薬理学的効果を提供するための薬剤の送達を包含するようにも意図されている。例えば、「治療」は、病状がない場合、例えば、ワクチンの場合に免疫応答を誘発するか、または免疫を与えることができる組成物の送達を包含する。
「異種」という用語は、核酸またはタンパク質の一部に関して使用される場合、核酸またはタンパク質が、自然界では互いに同じ関係では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には、組換え的に産生され、新たな機能的核酸、例えば、ある供給源からのプロモーター及び別の供給源からのコード領域、または異なる供給源からのコード領域を作製するように配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列を有する。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、自然界では互いに同じ関係では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
２つ以上の核酸またはポリペプチドの文脈における「配列同一性」、「同一性パーセント」、及び「配列同一性パーセント」（もしくはそれらの同義語、例えば「９９％同一」）という用語は、同じであるか、または配列同一性の一部としていかなる保存的アミノ酸置換も考慮せずに、最大一致のために比較し整列させた場合（必要に応じてギャップを導入する）、特定のパーセンテージの同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定することができる。アミノ酸またはヌクレオチド配列のアラインメントを取得するために使用され得る様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当該技術分野で知られている。配列同一性パーセントの決定に好適なプログラムには、例えば、米国政府の国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴウェブサイトから入手可能なＢＬＡＳＴプログラム一式が含まれる。２つの配列間の比較は、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して実行することができる。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用され、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。ＤＮＡＳＴＡＲから入手可能なＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、またはＭｅｇＡｌｉｇｎは、配列を整列させるために使用することができる追加の公的に入手可能なソフトウェアプログラムである。当業者であれば、特定のアラインメントソフトウェアによって最大アラインメントに適切なパラメータを決定することができる。ある特定の実施形態では、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、参照抗体のアミノ酸配列内または隣接する特定の位置における１つ以上の置換、欠失、及び／または付加により参照抗体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む抗体または融合タンパク質を包含するが、これらに限定されない。バリアントは、参照抗体のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列に１つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様に荷電したまたは非荷電のアミノ酸の置換を含み得る。バリアントは、参照抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持している。バリアントという用語は、ペグ化抗体またはタンパク質も含む。
本明細書における「腫瘍浸潤リンパ球」または「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍に移動した白血球として最初に取得された細胞の集団を意味する。ＴＩＬには、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、ならびにＭ１マクロファージが含まれるが、これらに限定されない。ＴＩＬには、一次ＴＩＬ及び二次ＴＩＬの両方が含まれる。「一次ＴＩＬ」は、本明細書に概説されるように患者組織試料から得られるもの（「新たに採取された」と称されることもある）であり、「二次ＴＩＬ」は、本明細書で考察されるように拡張または増殖された任意のＴＩＬ細胞集団であり、本明細書で考察されるバルクＴＩＬ、拡張ＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」）、ならびに「ｒｅＲＥＰ ＴＩＬ」が含まれるが、これらに限定されない。ｒｅＲＥＰ ＴＩＬは、例えば、第２の拡張ＴＩＬまたは第２の追加の拡張ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ ＴＩＬと称されるＴＩＬを含む、図８のステップＤに記載されているものなど）を含み得る。
ＴＩＬは、一般に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に定義されるか、または腫瘍に浸潤して治療を達成するそれらの能力によって機能的に定義されるかのいずれかであり得る。ＴＩＬは、一般に、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ－１、及びＣＤ２５のうちの１つ以上のバイオマーカーの発現によって分類され得る。さらに及び代替的に、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤する能力により機能的に定義され得る。ＴＩＬは、効力によってさらに特徴付けられ得、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）放出が、約５０ｐｇ／ｍＬを超える、約１００ｐｇ／ｍＬを超える、約１５０ｐｇ／ｍＬを超える、または約２００ｐｇ／ｍＬを超える場合、ＴＩＬは強力であるとみなされ得る。
「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、天然及び合成の、未修飾及び修飾デオキシリボヌクレオチドを包含する。修飾には、糖部分、塩基部分、及び／またはオリゴヌクレオチド中のデオキシリボヌクレオチド間の結合への変更が含まれる。
「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を定義する。「リボヌクレオチド」という用語は、ｂ－Ｄ－リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを定義する。ＲＮＡという用語には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え的に産生されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び／または変化によって天然に存在するＲＮＡとは異なる変化したＲＮＡが含まれる。本明細書に記載のＲＮＡ分子のヌクレオチドはまた、非天然に存在するヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドを含み得る。これらの変化したＲＮＡは、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。
「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、ならびに不活性成分を含むよう意図されている。医薬品有効成分のためのかかる薬学的に許容される担体または薬学的に許容される賦形剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の薬学的に許容される担体または薬学的に許容される賦形剤が医薬品有効成分と適合しない場合を除いて、本発明の治療用組成物におけるその使用が企図される。他の薬物などの追加の医薬品有効成分を、記載された組成物及び方法に組み込むこともできる。
「約」及び「およそ」という用語は、値の統計的に有意な範囲内を意味する。かかる範囲は、所与の値または範囲の１桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、なおより好ましくは１０％以内、さらにより好ましくは５％以内であり得る。「約」または「およそ」という用語によって包含される許容偏差は、研究中の特定のシステムに依存し、当業者によって容易に理解され得る。さらに、本明細書で使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状、ならびに他の量及び特徴が正確でなく、かつ正確である必要はないが、公差、変換係数、四捨五入、測定誤差など、及び当業者に知られている他の要因を反映して、必要に応じて、およそであってもよく、及び／またはそれよりも大きくても小さくてもよいことを意味する。一般に、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状、または他の量もしくは特徴は、そのように明示的に述べられているかにかかわらず、「約」または「およそ」である。非常に異なるサイズ、形状、及び寸法の実施形態が記載された配置を採用し得ることに留意されたい。
添付の特許請求の範囲で使用される場合、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という移行用語は、元の形式及び補正された形式で、存在する場合、列挙されていない追加のクレーム要素またはステップが特許請求の範囲（複数可）から除外されるかに関して特許請求の範囲を定義する。「含む」という用語は、包括的または自由形式であるよう意図されており、いずれの追加の列挙されていない要素、方法、ステップ、または材料も除外しない。「からなる」という用語は、特許請求の範囲で指定されたもの以外のいずれの要素、ステップ、または材料も除外し、後者の場合、指定された材料（複数可）に通常関連する不純物も除外する。「から本質的になる」という用語は、特許請求の範囲を、特定の要素、ステップ、または材料（複数可）、及び特許請求された本発明の基本的及び新規の特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさないに限定する。本発明を具体化する本明細書に記載のすべての組成物、方法、及びキットは、代替の実施形態では、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という移行用語のうちのいずれかによってより具体的に定義され得る。
「抗体」及びその複数形の「抗体」という用語は、免疫グロブリン全体及び任意の抗原結合断片（「抗原結合部分」）またはその一本鎖を指す。「抗体」はさらに、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインで構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。抗体のＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域（ＨＶＲ）と称され、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在し得る、超可変性の領域にさらに細分化することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、１つまたは複数の抗原エピトープと相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
「抗原」という用語は、免疫応答を誘導する物質を指す。いくつかの実施形態では、抗原は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される場合、抗体またはＴＣＲによって結合されることができる分子である。本明細書で使用される「抗原」という用語はまた、Ｔ細胞エピトープを包含する。抗原は、追加として免疫系によって認識されることができる。いくつかの実施形態では、抗原は、体液性免疫応答または細胞性免疫応答を誘導することができ、Ｂリンパ球及び／またはＴリンパ球の活性化につながる。場合によっては、これは、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むか、またはそれに結合されることを必要とし得る。抗原はまた、１つ以上のエピトープ（例えば、Ｂ－及びＴ－エピトープ）を有し得る。いくつかの実施形態では、抗原は、好ましくは、典型的には非常に特異的かつ選択的な方法で、対応する抗体またはＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘導され得る多数の他の抗体またはＴＣＲとは反応しない。
「モノクローナル抗体」、「ｍＡｂ」、「モノクローナル抗体組成物」という用語、またはそれらの複数形は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。特定の受容体に特異的なモノクローナル抗体は、試験対象に好適な抗原を注入し、次いで、所望の配列または機能的特徴を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離するという当該技術分野における知識及び技術を使用して作製することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として機能する。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに入れられ、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を取得することができる。抗体の組換え産生については、以下でより詳細に説明する。
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」（または単に「抗体部分」もしくは「断片」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって行われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨまたはＶＬドメインからなり得るドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４１，５４４－５４６）、ならびに（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、これらは、組換え方法を使用して、ＶＬ及びＶＨ領域が対合して、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる一価分子を形成する単一タンパク質鎖としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって接合され得、例えば、Ｂｉｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８，２４２，４２３－４２６、及びＨｕｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９８８，８５，５８７９－５８８３）を参照されたい。かかるｓｃＦｖ抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」という用語に包含されることを意図している。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来の技法を使用して得られ、断片は、無傷の抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方が、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図している。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域はまた、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入される変異）。本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。ある実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作成、または単離されるすべてのヒト抗体、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子またはそれから調製されたハイブリドーマ（以下でさらに説明される）についてトランスジェニックまたはトランス染色体である動物（マウスなど）から単離された抗体、（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、及び（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む、任意の他の手段によって調製、発現、作成、または単離された抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、フレームワーク及びＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、かかる組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物が使用される場合、インビボ体細胞変異誘発）に供され得、したがって、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、関連しているが、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に自然に存在しない可能性がある配列である。
本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。
「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という句は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と交換可能に使用される。
「ヒト抗体誘導体」という用語は、抗体と別の医薬品有効成分または抗体とのコンジュゲートを含む、ヒト抗体の任意の修飾形態を指す。「コンジュゲート」、「抗体薬物コンジュゲート」、「ＡＤＣ」、または「免疫コンジュゲート」という用語は、別の治療部分にコンジュゲートされた抗体またはその断片を指し、これは当該技術分野において使用可能な方法を使用して、本明細書に記載の抗体にコンジュゲートされ得る。
「ヒト化抗体」、「ヒト化抗体（複数）」、及び「ヒト化」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を指すことを意図している。追加のフレームワーク領域の修飾は、ヒトフレームワーク配列内で行うことができる。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）または非ヒト霊長類の１５超可変領域からの残基によって置き換えられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに向上させるために行われる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的すべてを含むことになる。ヒト化抗体はまた、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１９８６，３２１，５２２－５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１９８８，３３２，３２３－３２９、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９２，２，５９３－５９６を参照されたい。本明細書に記載される抗体はまた、エフェクター機能及び／またはＦｃＲ結合の改善（例えば、低減）を与えることが知られている任意のＦｃバリアントを用いるように修飾され得る。Ｆｃバリアントは、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ１９８８／０７０８９Ａ１号、同第ＷＯ１９９６／１４３３９Ａ１号、同第ＷＯ１９９８／０５７８７Ａ１号、同第ＷＯ１９９８／２３２８９Ａ１号、同第ＷＯ１９９９／５１６４２Ａ１号、同第ＷＯ９９／５８５７２Ａ１号、同第ＷＯ２０００／０９５６０Ａ２号、同第ＷＯ２０００／３２７６７Ａ１号、同第ＷＯ２０００／４２０７２Ａ２号、同第ＷＯ２００２／４４２１５Ａ２号、同第ＷＯ２００２／０６０９１９Ａ２号、同第ＷＯ２００３／０７４５６９Ａ２号、同第ＷＯ２００４／０１６７５０Ａ２号、同第ＷＯ２００４／０２９２０７Ａ２号、同第ＷＯ２００４／０３５７５２Ａ２号、同第ＷＯ２００４／０６３３５１Ａ２号、同第ＷＯ２００４／０７４４５５Ａ２号、同第ＷＯ２００４／０９９２４９Ａ２号、同第ＷＯ２００５／０４０２１７Ａ２号、同第ＷＯ２００５／０７０９６３Ａ１号、同第ＷＯ２００５／０７７９８１Ａ２号、同第ＷＯ２００５／０９２９２５Ａ２号、同第ＷＯ２００５／１２３７８０Ａ２号、同第ＷＯ２００６／０１９４４７Ａ１号、同第ＷＯ２００６／０４７３５０Ａ２号、及び同第ＷＯ２００６／０８５９６７Ａ２号、ならびに米国特許第５，６４８，２６０号、同第５，７３９，２７７号、同第５，８３４，２５０号、同第５，８６９，０４６号、同第６，０９６，８７１号、同第６，１２１，０２２号、同第６，１９４，５５１号、同第６，２４２，１９５号、同第６，２７７，３７５号、同第６，５２８，６２４号、同第６，５３８，１２４号、同第６，７３７，０５６号、同第６，８２１，５０５号、同第６，９９８，２５３号、及び同第７，０８３，７８４号（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるアミノ酸置換のうちのいずれか１つを含み得る。
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指すことを意図している。
「二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片である。断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ）中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメインをペアリングするには短すぎるリンカーを使用すると、ドメインは別のチェーンの相補ドメインとペアリングさせられ、２つの抗原結合部位が作成される。二重特異性抗体は、例えば、欧州特許第ＥＰ４０４，０９７号、国際特許公開第ＷＯ９３／１１１６１号、及びＢｏｌｌｉｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９３，９０，６４４４－６４４８においてより完全に記載されている。
「グリコシル化」という用語は、抗体の修飾誘導体を指す。非グリコシル化抗体は、グリコシル化を欠いている。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるように変化され得る。かかる炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を変化させることによって達成され得る。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の排除をもたらす、１つ以上のアミノ酸置換を行ない、それによってその部位でのグリコシル化を排除することができる。米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号に記載されているように、非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高める可能性がある。加えてまたは代替的に、改変した種類のグリコシル化を有する抗体、例えば、フコシル残基の量が低減した低フコシル化抗体または二分ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体が作製され得る。かかるグリコシル化パターンの変化は、抗体の能力を増加させることが実証されている。かかる炭水化物修飾は、例えば、抗体をグリコシル化機構が変化した宿主細胞で発現させることによって達成され得る。グリコシル化機構が変化した細胞については、当該技術分野で説明されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それによりグリコシル化が変化した抗体を産生する宿主細胞として使用され得る。例えば、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９細胞株で発現される抗体が、それらの炭水化物上のフコースを欠くように、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（アルファ（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）を欠く。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９ ＦＵＴ８－／－細胞株は、２つの置換ベクターを使用したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中のＦＵＴ８遺伝子の標的破壊によって作成された（例えば、米国特許公開第２００４／０１１０７０４号またはＹａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００４，８７，６１４－６２２を参照）。別の例として、欧州特許第ＥＰ１，１７６，１９５号は、フコシルトランスフェラーゼをコードし、それによりかかる細胞株で発現される抗体が、アルファ１，６結合関連酵素を低減または排除することによって低フコシル化を示す、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株を説明しており、抗体のＦｃ領域に結合するＮ－アセチルグルコサミンにフコースを付加するための酵素活性が低いか、または酵素活性を有しない細胞株、例えばラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）についても説明している。国際特許公開第ＷＯ０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）結合型炭水化物に付着させる能力が低減し、さらにその宿主細胞で発現される抗体の低フコシル化ももたらすバリアントＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３細胞について説明している（Ｓｈｉｅｌｄｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７，２６７３３－２６７４０も参照）。国際特許公開第ＷＯ９９／５４３４２号は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作され、それにより操作された細胞株で発現される抗体が、二分性ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示し、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす、細胞株について記載している（Ｕｍａｎａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９９，１７，１７６－１８０も参照）。代替てきに、フコシダーゼ酵素を使用して、抗体のフコース残基を切断でき得る。例えば、フコシダーゼアルファ－Ｌ－フコシダーゼは、Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７５，１４，５５１６－５５２３に記載されているように、抗体からフコシル残基を除去する。
「ペグ化」は、１つ以上のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着する条件下で、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応させる、修飾抗体またはその断片を指す。ペグ化は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させることができる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実行される。本明細書で使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシ－もしくはアリールオキシ－ポリエチレングリコール、またはポリエチレングリコール－マレイミドなどの、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態のうちのいずれかを包含することが意図される。ペグ化される抗体は、非グリコシル化抗体であり得る。ペグ化のための方法は、当該技術分野で知られており、例えば欧州特許第ＥＰ０１５４３１６号及び同第ＥＰ０４０１３８４号、ならびに米国特許第５，８２４，７７８号（各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、本発明の抗体に適用することができる。
「バイオシミラー」という用語は、モノクローナル抗体またはタンパク質を含む、臨床的に不活性な成分にわずかな違いがあるにもかかわらず、米国で認可された参照バイオ製品と非常に類似しており、製品の安全性、純度、及び効力に関してバイオ製品と参照製品との間に臨床的に意味のある差異がない、バイオ製品を意味する。さらに、類似のバイオまたは「バイオシミラー」医薬品は、欧州医薬品庁によって既に使用が許可されている別のバイオ医薬品に類似したバイオ医薬品である。「バイオシミラー」という用語は、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用されている。バイオ製品またはバイオ医薬品は、細菌または酵母などの生物源によって作製された、またはそれに由来する医薬品である。それらは、ヒトインスリンもしくはエリスロポエチンなどの比較的小さな分子、またはモノクローナル抗体などの複雑な分子からなり得る。例えば、参照ＩＬ－２タンパク質がアルデスロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ）である場合、アルデスロイキンに関して薬物規制当局によって承認されたタンパク質は、アルデスロイキンの「バイオシミラー」であるか、またはアルデスロイキンの「そのバイオシミラー」である。欧州では、類似のバイオまたは「バイオシミラー」医薬品は、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって既に使用が許可されている別のバイオ医薬品に類似したバイオ医薬品である。欧州における同様の生物学的用途に関連する法的根拠は、補正されたＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ＥＣ）Ｎｏ ７２６／２００４の第６条及びＤｉｒｅｃｔｉｖｅ ２００１／８３／ＥＣの第１０（４）条であり、したがって欧州では、バイオシミラーは、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ＥＣ）Ｎｏ ７２６／２００４の第６条及びＤｉｒｅｃｔｉｖｅ ２００１／８３／ＥＣの第１０（４）条の下で、認可または認可申請の対象について認可、承認され得る。既に認可されているオリジナルのバイオ医薬品は、欧州では「参照医薬品」と称されることがある。バイオシミラーとみなされる製品に対する要件のうちのいくつかは、バイオシミラー医薬品に関するＣＨＭＰガイドラインに概説されている。さらに、モノクローナル抗体バイオシミラーに関連するガイドラインを含む製品固有のガイドラインは、ＥＭＡによって製品毎に提供され、そのウェブサイトで公開されている。本明細書に記載のバイオシミラーは、品質特徴、生物活性、作用機序、安全性プロファイル、及び／または有効性の点で、参照医薬品に類似している可能性がある。さらに、バイオシミラーは、参照医薬品と同じ状態を治療するために使用され得るか、または使用を意図され得る。したがって、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似または非常に類似した品質特徴を有するとみなされ得る。代替的に、またはさらに、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似または非常に類似した生物活性を有するとみなされ得る。代替的に、またはさらに、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似または非常に類似した安全性プロファイルを有するとみなされ得る。代替的に、またはさらに、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似または非常に類似した効力を有するとみなされ得る。本明細書に記載されているように、欧州におけるバイオシミラーは、ＥＭＡによって認可された参照医薬品と比較される。しかしながら、場合によっては、バイオシミラーは、特定の研究で欧州経済領域外で認可されたバイオ医薬品（ＥＥＡ認可されていない「コンパレーター」）と比較される場合がある。かかる研究には、例えば、特定の臨床研究及びインビボ非臨床研究が含まれる。本明細書で使用される場合、「バイオシミラー」という用語は、ＥＥＡ認可されていないコンパレーターと比較された、または比較され得るバイオ医薬品にも関する。特定のバイオシミラーは、抗体、抗体断片（例えば、抗原結合部分）、及び融合タンパク質などのタンパク質である。タンパク質バイオシミラーは、ポリペプチドの機能に有意な影響を及ぼさない、アミノ酸構造にわずかな修飾（例えば、アミノ酸の欠失、付加、及び／または置換を含む）を有するアミノ酸配列を有し得る。バイオシミラーは、その参照医薬品のアミノ酸配列に対して９７％以上、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。バイオシミラーは、その違いが医薬品の安全性及び／または有効性の変化をもたらさないならば、１つ以上の翻訳後修飾、例えば、限定されないが、参照医薬品の翻訳後修飾とは異なる、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び／または切断を含み得る。バイオシミラーは、参照医薬品と同一または異なるグリコシル化パターンを有し得る。特に、排他的ではないが、バイオシミラーは、その違いが参照医薬品に関連する安全性の懸念に対処するか、対処することを意図している場合、異なるグリコシル化パターンを有し得る。加えて、バイオシミラーは、医薬品の安全性及び有効性が損なわれないならば、例えば、その強度、剤形、製剤、賦形剤、及び／または提示において参照医薬品から逸脱する可能性がある。バイオシミラーは、参照医薬品と比較して、例えば薬物動態（ＰＫ）及び／または薬力学的（ＰＤ）プロファイルの違いを含み得るが、それでも、認可される、または認可に適しているとみなされるように、参照医薬品と十分に類似しているとみなされる。特定の状況において、バイオシミラーは、参照医薬品と比較して異なる結合特徴を示し、異なる結合特徴は、ＥＭＡなどの規制当局によって類似のバイオ製品としての認可の障壁ではないとみなされる。「バイオシミラー」という用語は、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用されている。
ＩＩＩ．効力アッセイ方法及び組成物
いかなる特定の理論にも限定されることなく、商業的に実行可能なＴＩＬ及びＴ細胞効力アッセイは、ネオ抗原発現標的細胞の利用不可能性、患者とその腫瘍によって発現されるネオ抗原との間の重複の欠如、ならびにアッセイを構築するためにすべての関連するネオ抗原を時間内に同定することができないことによって制限されると考えられる。その結果、場合によっては標的ベースのアッセイを使用して規制上の承認を受けている形質導入されたキメラ抗原受容体を使用する市販及び臨床Ｔ細胞療法とは異なり、標的ベースのアッセイは、ＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬ療法または製品などのポリクローナルＴ細胞製品のための効果的ながん療法に必要な時間スケールで実行可能ではない。同時に、ビーズベースのアッセイは、ＴＩＬまたはＴ細胞の自然な活性化及び殺傷能力を再現することができないことによって制限される。例えば、抗ＣＤ３コーティングを利用するビーズベースまたはプレートベースのアッセイは、ＴＣＲ自体に結合することがより好ましいときに、ＴＣＲと非共有結合的に会合しているＴＩＬまたはＴ細胞上のＣＤ３ε鎖に結合する。したがって、ＣＤ３を用いるビーズベースのアッセイの欠点は、それらの相互作用のためにＴＣＲのアルファ及びベータ成分を使用しないことである。ビーズ上のＣＤ２８またはＣＤ１３７（４－１ＢＢ）などの他の共刺激分子の存在はまた、少なくとも、これらの共刺激分子の活性化が、ＴＩＬなどの腫瘍に存在する細胞に対して選択性が低いアッセイをもたらすため、不自然であまり好ましくない相互作用をもたらす。本発明は、これらの問題に対する解決策を提供する。いかなる特定の理論にも限定されることなく、ＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬを含むＴ細胞のＴＣＲとの標的細胞上のＭＨＣまたはＨＬＡの相互作用は、がんのための療法の製造または提供を支援するためのその効力、同一性、または他の有用な特性などの、ＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬを含むＴ細胞の１つ以上の特性を評価するために、ＭＨＣ陰性対照と共培養されたＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬを含むＴ細胞によって産生された分析物と比較され得る分析物を産生すると考えられる。さらに、いかなる特定の理論にも限定されることなく、ＴＩＬ及びＭＩＬなどのＴ細胞が腫瘍の部位に見出されるか、またはＰＢＬが腫瘍曝露によって以前に活性化されているため、ＴＩＬ、ＭＩＬ、及びＰＢＬを含むそのようなＴ細胞は、既にクロスプライミングまたはプライミングされたＴ細胞であり、ＣＤ２８及び４－１ＢＢが既に活性化されていると考えられる。
ある実施形態では、本発明は、培地中で共培養されたＲａｊｉ細胞及びＴＩＬなどのＴ細胞を含む効力アッセイ組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、培地中で共培養されたＴｈｐ１細胞及びＴＩＬなどのＴ細胞を含む効力アッセイ組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、培地中で共培養されたＲａｍｏｓ細胞及びＴＩＬなどのＴ細胞を含む効力アッセイ組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、培地中で共培養されたＵ９３７細胞及びＴＩＬなどのＴ細胞を含む効力アッセイ組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、培地中で共培養されたＤａｕｄｉ細胞及びＴＩＬなどのＴ細胞を含む効力アッセイ組成物を含む。ある実施形態では、効力アッセイ組成物は、培地中で共培養され、陰性対照として使用されるＫ５６２細胞及びＴＩＬなどのＴ細胞を含む。ある実施形態では、効力アッセイ組成物は、培地中で共培養され、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）陽性対照として使用される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びＴＩＬなどのＴ細胞を含む。ある実施形態では、前述の実施形態におけるＴＩＬ及びＰＢＭＣは、同じ患者由来である。ある実施形態では、ＴＩＬは、Ｇｅｎ２もしくはＧｅｎ３プロセス、または本明細書に記載の他の製造プロセスを使用して製造される。ある実施形態では、ＴＩＬは、少なくとも１つのＲＥＰステップを使用して製造される。ある実施形態では、効力アッセイは、本明細書に記載の拡張または製造プロセスを使用して産生されたＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬを使用して行われる。ある実施形態では、ＴＩＬは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１８／０２８２６９４Ａ１または米国特許第１０，１３０，６５９号、同第１０，１６６，２５７号、同第１０，２７２，１１３号、同第１０，３６３，２７３号、同第１０，３９８，７３４号、同第１０，４２０，７９９号、同第１０，４６３，６９７号、同第１０，５３７，５９５号、同第１０，６４６，５１７号、同第１０，６５３，７２３号、同第１０，６９３，３３０号、同第１０，６９５，３７２号、同第１０，８９４，０６３号、及び同第１０，９０５，７１８号（これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載のプロセスを用いて製造した後、本明細書に記載の効力アッセイで試験される。ある実施形態では、ＴＩＬは、米国特許第１０，９１８，６６６号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載のプロセスを用いて製造した後に、本明細書に記載の効力アッセイで試験される。ある実施形態では、ＴＩＬは、米国特許出願公開第２０２０／０２７７５７３Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載のプロセスを用いて製造した後に、本明細書に記載の効力アッセイで試験される。ある実施形態では、ＴＩＬは、国際特許出願公開第２０１９／２１０１３１Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載のプロセスを用いて製造した後に、本明細書に記載の効力アッセイで試験される。ある実施形態では、ＴＩＬは、国際特許出願公開第２０１９／１３６４５６Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載のプロセスを用いて製造した後に、本明細書に記載の効力アッセイで試験される。ある実施形態では、ＴＩＬは、国際特許出願公開第２０２１／１２３８３２Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載のプロセスを用いて製造した後に、本明細書に記載の効力アッセイで試験される。ある実施形態では、ＭＩＬ及びＰＢＬは、米国特許出願公開第２０２０／０２２４１６１Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載のプロセスを用いて製造した後に、本明細書に記載の効力アッセイで試験される。ある実施形態では、ＴＩＬは、国際特許出願公開第２０１９／１４５７１１Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載のプロセスを用いて製造した後に、本明細書に記載の効力アッセイで試験される。ある実施形態では、ＴＩＬは、国際特許出願公開第２０２０／１５２４５１Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載のプロセスを用いて製造した後に、本明細書に記載の効力アッセイで試験される。
Ａ．アッセイ方法
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体に結合可能な標的細胞を使用してＴ細胞製品の効力を決定するための方法を含む。ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞またはＴＩＬ、ＭＩＬ、もしくはＰＢＬ ＴＣＲ複合体と、標的細胞のＨＬＡ－ペプチド複合体との同種異系相互作用（ＭＨＣ優性認識とも称される）に基づくアッセイを含む。ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞またはＴＩＬ、ＭＩＬ、もしくはＰＢＬ ＴＣＲ複合体と、標的細胞とのＭＨＣ優性認識を利用して分析物を産生するアッセイを含み、これは、ＭＨＣ陰性対照とのＴ細胞またはＴＩＬ共培養によって産生された分析物と比較される。ある実施形態では、Ｔ細胞またはＴＩＬ、ＭＩＬ、もしくはＰＢＬ ＴＣＲ複合体の、標的細胞への結合は、そのアルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖を介して起こる。ある実施形態では、標的細胞は、ＨＬＡを発現する。ある実施形態では、標的細胞は、Ｂ細胞である。ある実施形態では、標的細胞は、Ｂ細胞リンパ芽細胞またはＢリンパ芽細胞である。ある実施形態では、標的細胞は、バーキットリンパ腫細胞である。ある実施形態では、標的細胞は、骨髄系細胞である。ある実施形態では、標的細胞は、単球である。ある実施形態では、標的細胞は、急性単球性白血病細胞である。ある実施形態では、標的細胞は、Ｍ５サブタイプの急性単球性白血病細胞である。ある実施形態では、標的細胞は、Ｒａｊｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、標的細胞は、Ｔｈｐ１細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、標的細胞は、Ｒａｍｏｓ細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、標的細胞は、Ｕ９３７細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、標的細胞は、Ｄａｕｄｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、標的細胞は、メラノサイト細胞である。ある実施形態では、標的細胞は、ＨＬＡ－Ａ－０２陽性メラノサイト細胞である。ある実施形態では、標的細胞は、黒色腫細胞である。ある実施形態では、標的細胞は、ＨＬＡ－Ａ－０２陽性黒色腫細胞である。ある実施形態では、標的細胞は、Ｓｋ－ＭＥＬ－５、Ｍａｌｍｅ－３Ｍ、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、ＳＫ－ＭＥＬ－３、ＳＨ－４、ＳＫ－ＭＥＬ－２４、ＲＰＭＩ－７９５１、ＳＫ－ＭＥＬ－１、Ａ３７５、Ｇ－３６１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される黒色腫細胞である。
ある実施形態では、本発明は、腫瘍細胞と、本明細書に記載の拡張または製造プロセスを使用して産生されたＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬなどのＴ細胞との間で生じるアロ反応性ＴＣＲまたはＨＬＡ認識に基づくアッセイを含む。ある実施形態では、本発明は、Ｒａｊｉ、Ｔｈｐ１、Ｒａｍｏｓ、Ｕ９３７、もしくはＤａｕｄｉ細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫と、本明細書に記載の拡張または製造プロセスを使用して産生されたＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬなどのＴ細胞との間で生じるアロ反応性ＴＣＲまたはＨＬＡ認識に基づくアッセイを含む。ある実施形態では、本発明は、本明細書に記載の陰性対照と組み合わせた前述の実施形態の使用を含む。ある実施形態では、陰性対照は、ＭＨＣ優性認識に基づくＴ細胞アッセイと比較するための、ＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬなどのＴ細胞の基礎またはベースライン活性レベルとして機能する。ある実施形態では、陰性対照は、ＨＬＡクラスＩ及び／またはＨＬＡクラスＩＩ発現を欠く細胞株である。ある実施形態では、陰性対照は、ＭＨＣクラスＩ及び／またはＭＨＣクラスＩＩ発現を欠く細胞株である。ある実施形態では、陰性対照は、アッセイ変動性を制御するためのＨＬＡまたはＭＨＣを欠く細胞株である。ある実施形態では、陰性対照は、ＭＨＣ優性認識が効力アッセイの一次変数であることを実証するための、ＨＬＡまたはＭＨＣを欠く細胞株である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品などのＴ細胞製品をＫ５６２細胞と共培養することによる、本明細書に記載の陰性対照としてのＫ５６２細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫の使用を含む。陰性対照としてのＫ５６２細胞の使用は、本明細書に記載のアッセイとともに、ならびにＩＦＮ－γに対する抗ＣＤ３プレートアッセイなどのビーズ及びプレート結合抗体刺激バイオアッセイとともに用いることができる。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品などのＴ細胞製品の、陰性対照としての標的細胞または標的細胞の組み合わせとの共培養による、１つ以上のＨＬＡ遮断抗体、またはそれらの断片、誘導体、バリアント、もしくは修飾の使用を含む。陰性対照としてのＨＬＡ遮断抗体または複数のＨＬＡ遮断抗体の使用は、本明細書に記載のアッセイとともに用いることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で公知の方法によって産生された拡張ＴＩＬの効力及び／または機能性を調べる。拡張ＴＩＬの効力及び／または機能性を調べることは、臨床ＴＩＬ製品ロットの特徴付けを可能にする。ある実施形態では、ＴＩＬ効力は、任意選択で、Ｋ５６２細胞と比較して、Ｒａｊｉ細胞との共培養時に、マーカー陽性細胞のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表される選択的表面マーカーの増加した発現として定義される。あるいは、Ｒａｊｉ細胞、Ｋ５６２及びＴＩＬを単独で培養してもよい。いくつかの実施形態では、ＴＩＬまたはＭＩＬが取得される同じ患者由来のＰＢＭＣを、対照として使用する。いくつかの実施形態では、ビーズベースのＣＤ３／ＣＤ２８刺激を、対照として使用することもできる。いくつかの実施形態では、ビーズベースのＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１３７刺激を、対照として使用することもできる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８に対するマウスモノクローナル抗体の添加を使用して、Ｔ細胞応答を増幅するための追加の共刺激を確実にする。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、ＭＬＲ応答の陽性対照として各ＴＩＬロットと共培養されてもよい。
ある実施形態では、効力アッセイは、共培養が３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、３７時間、３８時間、３９時間、４０時間、４１時間、４２時間、４３時間、４４時間、４５時間、４６時間、４７時間、４８時間、４９時間、及び５０時間からなる群から選択される期間にわたって行われる、共培養ステップを含む。ある実施形態では、効力アッセイは、共培養が６時間、１２時間、１８時間、２４時間、及び３２時間からなる群から選択される期間にわたって行われる、共培養ステップを含む。
ある実施形態では、効力アッセイは、共培養が３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、３７時間、３８時間、３９時間、４０時間、４１時間、４２時間、４３時間、４４時間、４５時間、４６時間、４７時間、４８時間、４９時間、及び５０時間からなる群から選択される期間にわたって行われる、標的細胞及びＴ細胞（ＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬを含む）共培養ステップを含む。ある実施形態では、効力アッセイは、共培養が６時間、１２時間、１８時間、２４時間、及び３２時間からなる群から選択される期間にわたって行われる、共培養ステップを含む。
ある実施形態では、効力アッセイは、共培養が３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、３７時間、３８時間、３９時間、４０時間、４１時間、４２時間、４３時間、４４時間、４５時間、４６時間、４７時間、４８時間、４９時間、及び５０時間からなる群から選択される期間にわたって行われる、陰性対照細胞及びＴ細胞（ＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬを含む）共培養ステップを含む。ある実施形態では、効力アッセイは、共培養が６時間、１２時間、１８時間、２４時間、及び３２時間からなる群から選択される期間にわたって行われる、共培養ステップを含む。
ある実施形態では、本発明は、臨床的利益に関連するＴＩＬ、ＭＩＬ、ＰＢＬまたは他のＴ細胞製品の効力を決定するための効力アッセイ方法を含む。臨床的利益は、インビトロでの細胞機能の実証、疾患制御率、全奏効率、奏効期間、または臨床的利益もしくは潜在的臨床的利益の他の科学的尺度を含むが、これらに限定されない、複数の方法で測定することができる。
いくつかの実施形態では、拡張または製剤化されたＴＩＬ、ＭＩＬ、及びＰＢＬの効力は、本明細書に記載の共培養アッセイによって調べられる。拡張または製剤化されたＴＩＬ、ＭＩＬ、及びＰＢＬの効力を調べることは、ＴＩＬ製品ロット、ＭＩＬ製品ロット、またはＰＢＬ製品ロットの特徴付けを可能にする。活性化とも称されるＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬの効力は、ＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬの、Ｋ５６２細胞との共培養と比較して、ＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬの、Ｒａｊｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫との共培養時に、マーカー陽性細胞のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表される選択的表面マーカーの増加した発現として定義される。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体に結合することができる標的細胞を使用してＴ細胞製品の効力を決定するための方法を含み、効力を決定するための方法は、アロ認識アッセイである。ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体に結合することができる標的細胞を使用してＴ細胞製品の効力を決定するための方法を含み、効力を決定するための方法は、アロ認識アッセイである。ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体に結合することができるＲａｊｉ細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫を使用してＴ細胞製品の効力を決定するための方法を含み、効力を決定するための方法は、アロ認識アッセイである。ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体に結合することができるＴｈｐ１細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫を使用してＴ細胞製品の効力を決定するための方法を含み、効力を決定するための方法は、アロ認識アッセイである。ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体に結合することができるＲａｍｏｓ細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾体、もしくは子孫を使用してＴ細胞製品の効力を決定するための方法を含み、効力を決定するための方法は、アロ認識アッセイである。ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体に結合することができるＵ９３７細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫を使用してＴ細胞製品の効力を決定するための方法を含み、効力を決定するための方法は、アロ認識アッセイである。ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体に結合することができるＤａｕｄｉ細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫を使用してＴ細胞製品の効力を決定するための方法を含み、効力を決定するための方法は、アロ認識アッセイである。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体に結合可能な標的細胞を使用してＴ細胞製品の効力を決定するための方法を含み、タンパク質の分泌または発現は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）検出方法を使用して検出される。さらなる実施形態では、ＥＬＩＳＡ方法は、ＥＬＬＡシステム（ＢｉｏＴｅｃｈｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡのＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ部門から入手可能）、ＩＳＯＰＬＥＸＩＳシステム（Ｉｓｏｐｌｅｘｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ，ＵＳＡから入手可能）、またはＬＵＮＡＲＩＳシステム（ＡＹＯＸＸＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）などの自動化またはロボットシステムを使用して自動化される。ある実施形態では、効力アッセイ検出は、ＬＵＭＩＮＥＸシステム（ＢｉｏＴｅｃｈｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＭＮ，ＵＳＡのＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ部門から入手可能）などの多重アッセイ検出を使用して行われる。ある実施形態では、本発明は、フローサイトメトリー検出方法を使用する効力アッセイ方法を含む。ある実施形態では、本発明は、分泌タンパク質に対する効力アッセイ方法を含む。ある実施形態では、本発明は、細胞表面または結合タンパク質に対する効力アッセイ方法を含む。ある実施形態では、本発明は、結合アッセイ検出方法を使用する効力アッセイ方法を含む。ある実施形態では、ＥＬＬＡシステムは、本明細書に記載の共培養アッセイの活性化後のＩＦＮ－γ濃度を測定し、共培養から収集された上清は、各マルチウェル（７２ウェルなど）の商業的に検証されたカートリッジでのＩＦＮ－γ産生についてスクリーニングされる。ある実施形態では、ＥＬＬＡ自動化システムは、ダイナミックレンジ内の感度の４つのログを含む、サブピコグラムレベルの感度まで行う。ある実施形態では、アッセイの反復性及び精度は、従来のＥＬＩＳＡ方法と比較して、ＥＬＬＡシステムを使用して手順上のエラーを最小限に抑えることによって増加する。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体に結合可能な標的細胞を使用してＴ細胞製品の効力を決定するための方法を含み、分析物の分泌または発現は、検出方法を使用して検出される。ある実施形態では、検出される分析物は、タンパク質である。ある実施形態では、検出される分析物は、サイトカインである。ある実施形態では、検出される分析物は、インターフェロンである。ある実施形態では、検出される分析物は、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮαとも称される、インターフェロン－アルファである。ある実施形態では、検出される分析物は、ＩＦＮ－βまたはＩＦＮβとも称される、インターフェロン－アルファである。ある実施形態では、検出される分析物は、ＩＦＮ－γまたはＩＦＮγとも称される、インターフェロン－ガンマである。ある実施形態では、検出される分析物は、ＧｚｍＢとも称される、グランザイムＢである。ある実施形態では、検出される分析物は、パーフォリンである。ある実施形態では、検出される分析物は、ＴＮＦ－αまたはＴＮＦαとも称される、腫瘍壊死因子アルファである。ある実施形態では、検出される分析物は、インターロイキンである。ある実施形態では、検出される分析物は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２２、ＩＬ－２５、またはＩＬ－２６である。ある実施形態では、検出される分析物は、ＣＤ２５である。ある実施形態では、検出される分析物は、ＣＤ６９である。ある実施形態では、検出される分析物は、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）である。ある実施形態では、検出される分析物は、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）である。ある実施形態では、検出される分析物は、ＣＣＬ４である。ある実施形態では、検出される分析物は、ＣＤ１５０、別名ＳＬＡＭ、ＳＬＡＭ Ｆ１、またはシグナルリンパ球活性化分子１である。ある実施形態では、検出される分析物は、ＫＬＲＧ１である。ある実施形態では、検出される分析物は、ＫＬＲＧ１である。ある実施形態では、検出される分析物は、分泌ＭＩＰ－１βである。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体に結合可能な標的細胞を使用してＴ細胞製品の効力を決定するための方法を含み、分析物の分泌または発現は、検出方法を使用して検出され、Ｔ細胞製品は、ＴＩＬ製品であり、分析物は、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５０からなる群から選択される細胞表面マーカーである。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体に同種異系結合することができる細胞を使用してＴ細胞製品の効力を決定するための方法を含み、ＭＨＣ Ｉ及びＭＨＣ ＩＩ発現を欠く細胞を含む陰性対照を、Ｔ細胞製品（ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品またはＰＢＬ製品など）の、標的細胞との共培養との比較に使用する。ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体に同種異系結合することができるＲａｊｉ細胞を使用してＴＩＬ製品の効力を決定するための方法を含み、ＭＨＣ Ｉ及びＭＨＣ ＩＩ発現を欠くＫ５６２細胞を含む陰性対照を、ＴＩＬ製品の、Ｒａｊｉ細胞との共培養との比較に使用する。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のマーカー陽性細胞のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表される選択的な表面マーカーの発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のマーカー陽性細胞のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表される選択的な表面マーカーの発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の増加である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の共培養方法からの上清を、共培養から除去した直後に試験する。ある実施形態では、本明細書に記載の共培養方法からの上清を、共培養からの除去の１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間、または４８時間後に試験する。ある実施形態では、本明細書に記載の共培養方法からの上清は、共培養からの除去後に凍結され、後で試験のために解凍される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の共培養方法からの上清を、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、ＴＮＦ－α、ＣＣＬ４、及び／またはＭＩＰ－１β分泌について評価する。
いくつかの実施形態では、本発明は、任意選択で、アゴニストまたは超アゴニスト抗ＣＤ２８抗体を用いて、ａ）Ｒａｊｉ細胞及びＫ５６２細胞を照射するステップと、（ｂ）照射されたＲａｊｉ細胞及び照射されたＫ５６２細胞を、ＴＩＬと以下の標的比（５０：１、２５：１、１２．５：１、６．２５：１、３：１、１：１、１：３、１：６．２５、１：１２．５、１：２５）のうちの１つ以上で共培養するステップと、（ｃ）６～２４時間後に、ステップ（ｂ）において共培養細胞から上清を収集するステップと、（ｄ）ステップ（ｂ）から細胞を採取し、Ｔ細胞活性化の表面マーカー発現を測定するステップと、（ｅ）ステップ（ｃ）において収集された共培養細胞からの上清を、Ｔ細胞活性化のマーカーについてアッセイするステップと、を含む、ＴＩＬ活性をアッセイするための方法を提供する。
いくつかの実施形態では、拡張ＴＩＬの効力及び／または機能性は、ＴＩＬの凍結保存前に調べられる。いくつかの実施形態では、拡張ＴＩＬの効力及び／または機能性は、凍結保存前に調べられる。ある実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、医薬品の放出試験の一部として調べられる。ある実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、医薬品の安定性試験の一部として、例えば、凍結保存された製品の解凍後、または以前に解凍された、もしくは異なる環境条件下で定義された期間の間決して凍結されなかった製品の貯蔵後に調べられる。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のマーカー陽性細胞のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表される選択的な表面マーカーの発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のマーカー陽性細胞のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表される選択的表面マーカーの発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のマーカー陽性細胞のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるＣＤ２５の発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のマーカー陽性細胞のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるＣＤ２５の発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のマーカー陽性細胞のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるＣＤ６９の発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のマーカー陽性細胞のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるＣＤ６９の発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のマーカー陽性細胞のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるＣＤ１３４の発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のマーカー陽性細胞のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるＣＤ１３４の発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のマーカー陽性細胞のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるＣＤ１３７の発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のマーカー陽性細胞のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるＣＤ１３７の発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のマーカー陽性細胞のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるＣＤ１５０の発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のマーカー陽性細胞のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるＣＤ１５０の発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のＥＬＩＳＡ検出分析物または平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるか、または分泌されるグランザイムＢの発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のＥＬＩＳＡ検出分析物のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるか、または分泌されるグランザイムＢの発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のＥＬＩＳＡ検出分析物のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるか、または分泌されるＩＦＮ－γの発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のＥＬＩＳＡ検出分析物のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるか、または分泌されるＩＦＮ－γの発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のＥＬＩＳＡ検出分析物または平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるか、または分泌されるＴＮＦ－αの発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のＥＬＩＳＡ検出分析物のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるか、または分泌されるＴＮＦ－αの発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のＥＬＩＳＡ検出分析物のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるか、または分泌されるパーフォリンの発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のＥＬＩＳＡ検出分析物のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるか、または分泌されるパーフォリンの発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のＥＬＩＳＡ検出分析物または平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるか、または分泌されるＣＣＬ４の発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のＥＬＩＳＡ検出分析物のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるか、または分泌されるＣＣＬ４の発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のＥＬＩＳＡ検出分析物のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるか、または分泌されるＭＩＰ－１βの発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時のＥＬＩＳＡ検出分析物のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されるか、または分泌されるＭＩＰ－１βの発現の増加は、Ｋ５６２細胞と比較して、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍の増加である。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時に分泌されるグランザイムＢの量は、少なくとも２０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１１００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１２００ｐｇ／ｍＬであり、各ｍＬの被験試料は、１×１０５ＴＩＬ、２×１０５ＴＩＬ、３×１０５ＴＩＬ、４×１０５ＴＩＬ、５×１０５ＴＩＬ、６×１０５ＴＩＬ、７×１０５ＴＩＬ、８×１０５ＴＩＬ、９×１０５ＴＩＬ、または１０×１０５ＴＩＬを含有する。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時に分泌されるＩＦＮ－γの量は、少なくとも２０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１１００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１２００ｐｇ／ｍＬであり、各ｍＬの被験試料は、１×１０５ＴＩＬ、２×１０５ＴＩＬ、３×１０５ＴＩＬ、４×１０５ＴＩＬ、５×１０５ＴＩＬ、６×１０５ＴＩＬ、７×１０５ＴＩＬ、８×１０５ＴＩＬ、９×１０５ＴＩＬ、または１０×１０５ＴＩＬを含有する。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時に分泌されるＴＮＦ－αの量は、少なくとも２０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１１００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１２００ｐｇ／ｍＬであり、各ｍＬの被験試料は、１×１０５ＴＩＬ、２×１０５ＴＩＬ、３×１０５ＴＩＬ、４×１０５ＴＩＬ、５×１０５ＴＩＬ、６×１０５ＴＩＬ、７×１０５ＴＩＬ、８×１０５ＴＩＬ、９×１０５ＴＩＬ、または１０×１０５ＴＩＬを含有する。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時に分泌されるパーフォリンの量は、少なくとも２０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１１００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１２００ｐｇ／ｍＬであり、各ｍＬの被験試料は、１×１０５ＴＩＬ、２×１０５ＴＩＬ、３×１０５ＴＩＬ、４×１０５ＴＩＬ、５×１０５ＴＩＬ、６×１０５ＴＩＬ、７×１０５ＴＩＬ、８×１０５ＴＩＬ、９×１０５ＴＩＬ、または１０×１０５ＴＩＬを含有する。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時に分泌されるＣＣＬ４の量は、少なくとも２０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１１００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１２００ｐｇ／ｍＬであり、各ｍＬの被験試料は、１×１０５ＴＩＬ、２×１０５ＴＩＬ、３×１０５ＴＩＬ、４×１０５ＴＩＬ、５×１０５ＴＩＬ、６×１０５ＴＩＬ、７×１０５ＴＩＬ、８×１０５ＴＩＬ、９×１０５ＴＩＬ、または１０×１０５ＴＩＬを含有する。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞との共培養時に分泌されるＭＩＰ－１βの量は、少なくとも２０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１１００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１２００ｐｇ／ｍＬであり、各ｍＬの被験試料は、１×１０５ＴＩＬ、２×１０５ＴＩＬ、３×１０５ＴＩＬ、４×１０５ＴＩＬ、５×１０５ＴＩＬ、６×１０５ＴＩＬ、７×１０５ＴＩＬ、８×１０５ＴＩＬ、９×１０５ＴＩＬ、または１０×１０５ＴＩＬを含有する。
ある実施形態では、標的細胞対Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＭＩＬまたはＰＢＬを含む）の比は、約１：１．１、約１：１．２、約１：１．３、約１：１．４、約１：１．５、約１：１．６、約１：１．７、約１：１．８、約１：１．９、約１：２、約１：２．１、約１：２．２、約１：２．３、約１：２．４、約１：２．５、約１：２．６、約１：２．７、約１：２．８、約１：２．９、約１：３、約１：３．１、約１：３．２、約１：３．３、約１：３．４、約１：３．５、約１：３．６、約１：３．７、約１：３．８、約１：３．９、約１：４、約１：４．１、約１：４．２、約１：４．３、約１：４．４、約１：４．５、約１：４．６、約１：４．７、約１：４．８、約１：４．９、約１：５、約１：５．１、約１：５．２、約１：５．３、約１：５．４、約１：５．５、約１：５．６、約１：５．７、約１：５．８、約１：５．９、約１：６、約１：６．１、約１：６．２、約１：６．２５、約１：６．３、約１：６．４、約１：６．５、約１：６．６、約１：６．７、約１：６．８、約１：６．９、約１：７、約１：７．１、約１：７．２、約１：７．３、約１：７．４、約１：７．５、約１：７．６、約１：７．７、約１：７．８、約１：７．９、約１：８、約１：８．１、約１：８．２、約１：８．３、約１：８．４、約１：８．５、約１：８．６、約１：８．７、約１：８．８、約１：８．９、約１：９、約１：９．１、約１：９．２、約１：９．３、約１：９．４、約１：９．５、約１：９．６、約１：９．７、約１：９．８、約１：９．９、約１：１０、約１：１１、約１：１２、約１：１２．５、約１：１３、約１：１４、約１：１５、約１：１６、約１：１７、約１：１８、約１：１９、約１：２０、約１：２５、約１：３０、約１：３５、約１：４０、約１：４５、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、または約１：１００からなる群から選択される。
ある実施形態では、Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＭＩＬまたはＰＢＬを含む）対標的細胞の比は、約１：１．１、約１：１．２、約１：１．３、約１：１．４、約１：１．５、約１：１．６、約１：１．７、約１：１．８、約１：１．９、約１：２、約１：２．１、約１：２．２、約１：２．３、約１：２．４、約１：２．５、約１：２．６、約１：２．７、約１：２．８、約１：２．９、約１：３、約１：３．１、約１：３．２、約１：３．３、約１：３．４、約１：３．５、約１：３．６、約１：３．７、約１：３．８、約１：３．９、約１：４、約１：４．１、約１：４．２、約１：４．３、約１：４．４、約１：４．５、約１：４．６、約１：４．７、約１：４．８、約１：４．９、約１：５、約１：５．１、約１：５．２、約１：５．３、約１：５．４、約１：５．５、約１：５．６、約１：５．７、約１：５．８、約１：５．９、約１：６、約１：６．１、約１：６．２、約１：６．２５、約１：６．３、約１：６．４、約１：６．５、約１：６．６、約１：６．７、約１：６．８、約１：６．９、約１：７、約１：７．１、約１：７．２、約１：７．３、約１：７．４、約１：７．５、約１：７．６、約１：７．７、約１：７．８、約１：７．９、約１：８、約１：８．１、約１：８．２、約１：８．３、約１：８．４、約１：８．５、約１：８．６、約１：８．７、約１：８．８、約１：８．９、約１：９、約１：９．１、約１：９．２、約１：９．３、約１：９．４、約１：９．５、約１：９．６、約１：９．７、約１：９．８、約１：９．９、約１：１０、約１：１１、約１：１２、約１：１２．５、約１：１３、約１：１４、約１：１５、約１：１６、約１：１７、約１：１８、約１：１９、約１：２０、約１：２５、約１：３０、約１：３５、約１：４０、約１：４５、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、または約１：１００からなる群から選択される。
ある実施形態では、Ｒａｊｉ細胞対Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＭＩＬまたはＰＢＬを含む）の比は、約１：１．１、約１：１．２、約１：１．３、約１：１．４、約１：１．５、約１：１．６、約１：１．７、約１：１．８、約１：１．９、約１：２、約１：２．１、約１：２．２、約１：２．３、約１：２．４、約１：２．５、約１：２．６、約１：２．７、約１：２．８、約１：２．９、約１：３、約１：３．１、約１：３．２、約１：３．３、約１：３．４、約１：３．５、約１：３．６、約１：３．７、約１：３．８、約１：３．９、約１：４、約１：４．１、約１：４．２、約１：４．３、約１：４．４、約１：４．５、約１：４．６、約１：４．７、約１：４．８、約１：４．９、約１：５、約１：５．１、約１：５．２、約１：５．３、約１：５．４、約１：５．５、約１：５．６、約１：５．７、約１：５．８、約１：５．９、約１：６、約１：６．１、約１：６．２、約１：６．２５、約１：６．３、約１：６．４、約１：６．５、約１：６．６、約１：６．７、約１：６．８、約１：６．９、約１：７、約１：７．１、約１：７．２、約１：７．３、約１：７．４、約１：７．５、約１：７．６、約１：７．７、約１：７．８、約１：７．９、約１：８、約１：８．１、約１：８．２、約１：８．３、約１：８．４、約１：８．５、約１：８．６、約１：８．７、約１：８．８、約１：８．９、約１：９、約１：９．１、約１：９．２、約１：９．３、約１：９．４、約１：９．５、約１：９．６、約１：９．７、約１：９．８、約１：９．９、約１：１０、約１：１１、約１：１２、約１：１２．５、約１：１３、約１：１４、約１：１５、約１：１６、約１：１７、約１：１８、約１：１９、約１：２０、約１：２５、約１：３０、約１：３５、約１：４０、約１：４５、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、または約１：１００からなる群から選択される。
ある実施形態では、Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＭＩＬまたはＰＢＬを含む）対Ｒａｊｉ細胞の比は、約１：１．１、約１：１．２、約１：１．３、約１：１．４、約１：１．５、約１：１．６、約１：１．７、約１：１．８、約１：１．９、約１：２、約１：２．１、約１：２．２、約１：２．３、約１：２．４、約１：２．５、約１：２．６、約１：２．７、約１：２．８、約１：２．９、約１：３、約１：３．１、約１：３．２、約１：３．３、約１：３．４、約１：３．５、約１：３．６、約１：３．７、約１：３．８、約１：３．９、約１：４、約１：４．１、約１：４．２、約１：４．３、約１：４．４、約１：４．５、約１：４．６、約１：４．７、約１：４．８、約１：４．９、約１：５、約１：５．１、約１：５．２、約１：５．３、約１：５．４、約１：５．５、約１：５．６、約１：５．７、約１：５．８、約１：５．９、約１：６、約１：６．１、約１：６．２、約１：６．２５、約１：６．３、約１：６．４、約１：６．５、約１：６．６、約１：６．７、約１：６．８、約１：６．９、約１：７、約１：７．１、約１：７．２、約１：７．３、約１：７．４、約１：７．５、約１：７．６、約１：７．７、約１：７．８、約１：７．９、約１：８、約１：８．１、約１：８．２、約１：８．３、約１：８．４、約１：８．５、約１：８．６、約１：８．７、約１：８．８、約１：８．９、約１：９、約１：９．１、約１：９．２、約１：９．３、約１：９．４、約１：９．５、約１：９．６、約１：９．７、約１：９．８、約１：９．９、約１：１０、約１：１１、約１：１２、約１：１２．５、約１：１３、約１：１４、約１：１５、約１：１６、約１：１７、約１：１８、約１：１９、約１：２０、約１：２５、約１：３０、約１：３５、約１：４０、約１：４５、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、または約１：１００からなる群から選択される。
ある実施形態では、陰性対照細胞対Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＭＩＬまたはＰＢＬを含む）の比は、約１：１．１、約１：１．２、約１：１．３、約１：１．４、約１：１．５、約１：１．６、約１：１．７、約１：１．８、約１：１．９、約１：２、約１：２．１、約１：２．２、約１：２．３、約１：２．４、約１：２．５、約１：２．６、約１：２．７、約１：２．８、約１：２．９、約１：３、約１：３．１、約１：３．２、約１：３．３、約１：３．４、約１：３．５、約１：３．６、約１：３．７、約１：３．８、約１：３．９、約１：４、約１：４．１、約１：４．２、約１：４．３、約１：４．４、約１：４．５、約１：４．６、約１：４．７、約１：４．８、約１：４．９、約１：５、約１：５．１、約１：５．２、約１：５．３、約１：５．４、約１：５．５、約１：５．６、約１：５．７、約１：５．８、約１：５．９、約１：６、約１：６．１、約１：６．２、約１：６．２５、約１：６．３、約１：６．４、約１：６．５、約１：６．６、約１：６．７、約１：６．８、約１：６．９、約１：７、約１：７．１、約１：７．２、約１：７．３、約１：７．４、約１：７．５、約１：７．６、約１：７．７、約１：７．８、約１：７．９、約１：８、約１：８．１、約１：８．２、約１：８．３、約１：８．４、約１：８．５、約１：８．６、約１：８．７、約１：８．８、約１：８．９、約１：９、約１：９．１、約１：９．２、約１：９．３、約１：９．４、約１：９．５、約１：９．６、約１：９．７、約１：９．８、約１：９．９、約１：１０、約１：１１、約１：１２、約１：１２．５、約１：１３、約１：１４、約１：１５、約１：１６、約１：１７、約１：１８、約１：１９、約１：２０、約１：２５、約１：３０、約１：３５、約１：４０、約１：４５、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、または約１：１００からなる群から選択される。
ある実施形態では、Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＭＩＬまたはＰＢＬを含む）対陰性対照細胞の比は、約１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、１：３、１：３．１、１：３．２、１：３．３、１：３．４、１：３．５、１：３．６、１：３．７、１：３．８、１：３．９、１：４、１：４．１、１：４．２、１：４．３、１：４．４、１：４．５、１：４．６、１：４．７、１：４．８、１：４．９、１：５、１：５．１、１：５．２、１：５．３、１：５．４、１：５．５、１：５．６、１：５．７、１：５．８、１：５．９、１：６、１：６．１、１：６．２、１：６．２５、１：６．３、１：６．４、１：６．５、１：６．６、１：６．７、１：６．８、１：６．９、１：７、１：７．１、１：７．２、１：７．３、１：７．４、１：７．５、１：７．６、１：７．７、１：７．８、１：７．９、１：８、１：８．１、１：８．２、１：８．３、１：８．４、１：８．５、１：８．６、１：８．７、１：８．８、１：８．９、１：９、１：９．１、１：９．２、１：９．３、１：９．４、１：９．５、１：９．６、１：９．７、１：９．８、１：９．９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１２．５、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、または１：１００からなる群から選択される。
ある実施形態では、Ｋ５６２細胞対Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＭＩＬまたはＰＢＬを含む）の比は、約１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、１：３、１：３．１、１：３．２、１：３．３、１：３．４、１：３．５、１：３．６、１：３．７、１：３．８、１：３．９、１：４、１：４．１、１：４．２、１：４．３、１：４．４、１：４．５、１：４．６、１：４．７、１：４．８、１：４．９、１：５、１：５．１、１：５．２、１：５．３、１：５．４、１：５．５、１：５．６、１：５．７、１：５．８、１：５．９、１：６、１：６．１、１：６．２、１：６．２５、１：６．３、１：６．４、１：６．５、１：６．６、１：６．７、１：６．８、１：６．９、１：７、１：７．１、１：７．２、１：７．３、１：７．４、１：７．５、１：７．６、１：７．７、１：７．８、１：７．９、１：８、１：８．１、１：８．２、１：８．３、１：８．４、１：８．５、１：８．６、１：８．７、１：８．８、１：８．９、１：９、１：９．１、１：９．２、１：９．３、１：９．４、１：９．５、１：９．６、１：９．７、１：９．８、１：９．９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１２．５、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、または１：１００からなる群から選択される。
ある実施形態では、Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＭＩＬまたはＰＢＬを含む）対Ｋ５６２細胞の比は、約１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、１：３、１：３．１、１：３．２、１：３．３、１：３．４、１：３．５、１：３．６、１：３．７、１：３．８、１：３．９、１：４、１：４．１、１：４．２、１：４．３、１：４．４、１：４．５、１：４．６、１：４．７、１：４．８、１：４．９、１：５、１：５．１、１：５．２、１：５．３、１：５．４、１：５．５、１：５．６、１：５．７、１：５．８、１：５．９、１：６、１：６．１、１：６．２、１：６．２５、１：６．３、１：６．４、１：６．５、１：６．６、１：６．７、１：６．８、１：６．９、１：７、１：７．１、１：７．２、１：７．３、１：７．４、１：７．５、１：７．６、１：７．７、１：７．８、１：７．９、１：８、１：８．１、１：８．２、１：８．３、１：８．４、１：８．５、１：８．６、１：８．７、１：８．８、１：８．９、１：９、１：９．１、１：９．２、１：９．３、１：９．４、１：９．５、１：９．６、１：９．７、１：９．８、１：９．９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１２．５、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、または１：１００からなる群から選択される。
ある実施形態では、標的細胞対Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＭＩＬまたはＰＢＬを含む）の比は、１：１～１：２、１：２～１：３、１：３～１：４、１：４～１：５、１：５～１：６、１：６～１：７、１：７～１：８、１：８～１：９、１：９～１：１０、１：１０～１：１１、１：１１～１：１２、１：１２～１：１３、１：１３～１：１４、１：１４～１：１５、１：１５～１：１６、１：１６～１：１７、１：１７～１：１８、１：１８～１：１９、１：１９～１：２０、１：２０～１：２５、１：２５～１：３０、１：３０～１：３５、１：３５～１：４０、１：４０～１：４５、１：４５～１：５０、１：５０～１：５５、１：５５～１：６０、１：６０～１：７０、１：７０～１：８０、１：８０～１：９０、もしくは１：９０～１：１００、または代替的に、１：０．５～１：１００、１：０．５～１：５０、１：０．５～１：４０、１：０．５～１：３０、１：０．５～１：２５、１：０．５～１：２０、１：０．５～１：１５、１：０．５～１：１０、１：０．５～１：５、１：０．７５～１：５０、１：０．７５～１：４０、１：０．７５～１：３０、１：０．７５～１：２５、１：０．７５～１：２０、１：０．７５～１：１５、１：０．７５～１：１０、１：０．７５～１：５、１：０．５～１：２．５、１：１～１：２０、１：１～１：１０、１：１～１：５、１：１～１：２．５、１：２～１：５、１：２．５～１：５、もしくは１：３～１：５である。
ある実施形態では、Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＭＩＬまたはＰＢＬを含む）対標的細胞の比は、１：１～１：２、１：２～１：３、１：３～１：４、１：４～１：５、１：５～１：６、１：６～１：７、１：７～１：８、１：８～１：９、１：９～１：１０、１：１０～１：１１、１：１１～１：１２、１：１２～１：１３、１：１３～１：１４、１：１４～１：１５、１：１５～１：１６、１：１６～１：１７、１：１７～１：１８、１：１８～１：１９、１：１９～１：２０、１：２０～１：２５、１：２５～１：３０、１：３０～１：３５、１：３５～１：４０、１：４０～１：４５、１：４５～１：５０、１：５０～１：５５、１：５５～１：６０、１：６０～１：７０、１：７０～１：８０、１：８０～１：９０、もしくは１：９０～１：１００、または代替的に、１：０．５～１：１００、１：０．５～１：５０、１：０．５～１：４０、１：０．５～１：３０、１：０．５～１：２５、１：０．５～１：２０、１：０．５～１：１５、１：０．５～１：１０、１：０．５～１：５、１：０．７５～１：５０、１：０．７５～１：４０、１：０．７５～１：３０、１：０．７５～１：２５、１：０．７５～１：２０、１：０．７５～１：１５、１：０．７５～１：１０、１：０．７５～１：５、１：０．５～１：２．５、１：１～１：２０、１：１～１：１０、１：１～１：５、１：１～１：２．５、１：２～１：５、１：２．５～１：５、もしくは１：３～１：５である。
ある実施形態では、Ｒａｊｉ細胞対Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＭＩＬまたはＰＢＬを含む）の比は、１：１～１：２、１：２～１：３、１：３～１：４、１：４～１：５、１：５～１：６、１：６～１：７、１：７～１：８、１：８～１：９、１：９～１：１０、１：１０～１：１１、１：１１～１：１２、１：１２～１：１３、１：１３～１：１４、１：１４～１：１５、１：１５～１：１６、１：１６～１：１７、１：１７～１：１８、１：１８～１：１９、１：１９～１：２０、１：２０～１：２５、１：２５～１：３０、１：３０～１：３５、１：３５～１：４０、１：４０～１：４５、１：４５～１：５０、１：５０～１：５５、１：５５～１：６０、１：６０～１：７０、１：７０～１：８０、１：８０～１：９０、もしくは１：９０～１：１００、または代替的に、１：０．５～１：１００、１：０．５～１：５０、１：０．５～１：４０、１：０．５～１：３０、１：０．５～１：２５、１：０．５～１：２０、１：０．５～１：１５、１：０．５～１：１０、１：０．５～１：５、１：０．７５～１：５０、１：０．７５～１：４０、１：０．７５～１：３０、１：０．７５～１：２５、１：０．７５～１：２０、１：０．７５～１：１５、１：０．７５～１：１０、１：０．７５～１：５、１：０．５～１：２．５、１：１～１：２０、１：１～１：１０、１：１～１：５、１：１～１：２．５、１：２～１：５、１：２．５～１：５、もしくは１：３～１：５である。
ある実施形態では、Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＭＩＬまたはＰＢＬを含む）対Ｒａｊｉ細胞の比は、１：１～１：２、１：２～１：３、１：３～１：４、１：４～１：５、１：５～１：６、１：６～１：７、１：７～１：８、１：８～１：９、１：９～１：１０、１：１０～１：１１、１：１１～１：１２、１：１２～１：１３、１：１３～１：１４、１：１４～１：１５、１：１５～１：１６、１：１６～１：１７、１：１７～１：１８、１：１８～１：１９、１：１９～１：２０、１：２０～１：２５、１：２５～１：３０、１：３０～１：３５、１：３５～１：４０、１：４０～１：４５、１：４５～１：５０、１：５０～１：５５、１：５５～１：６０、１：６０～１：７０、１：７０～１：８０、１：８０～１：９０、もしくは１：９０～１：１００、または代替的に、１：０．５～１：１００、１：０．５～１：５０、１：０．５～１：４０、１：０．５～１：３０、１：０．５～１：２５、１：０．５～１：２０、１：０．５～１：１５、１：０．５～１：１０、１：０．５～１：５、１：０．７５～１：５０、１：０．７５～１：４０、１：０．７５～１：３０、１：０．７５～１：２５、１：０．７５～１：２０、１：０．７５～１：１５、１：０．７５～１：１０、１：０．７５～１：５、１：０．５～１：２．５、１：１～１：２０、１：１～１：１０、１：１～１：５、１：１～１：２．５、１：２～１：５、１：２．５～１：５、もしくは１：３～１：５である。
ある実施形態では、陰性対照細胞対Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＭＩＬまたはＰＢＬを含む）の比は、１：１～１：２、１：２～１：３、１：３～１：４、１：４～１：５、１：５～１：６、１：６～１：７、１：７～１：８、１：８～１：９、１：９～１：１０、１：１０～１：１１、１：１１～１：１２、１：１２～１：１３、１：１３～１：１４、１：１４～１：１５、１：１５～１：１６、１：１６～１：１７、１：１７～１：１８、１：１８～１：１９、１：１９～１：２０、１：２０～１：２５、１：２５～１：３０、１：３０～１：３５、１：３５～１：４０、１：４０～１：４５、１：４５～１：５０、１：５０～１：５５、１：５５～１：６０、１：６０～１：７０、１：７０～１：８０、１：８０～１：９０、もしくは１：９０～１：１００、または代替的に、１：０．５～１：１００、１：０．５～１：５０、１：０．５～１：４０、１：０．５～１：３０、１：０．５～１：２５、１：０．５～１：２０、１：０．５～１：１５、１：０．５～１：１０、１：０．５～１：５、１：０．７５～１：５０、１：０．７５～１：４０、１：０．７５～１：３０、１：０．７５～１：２５、１：０．７５～１：２０、１：０．７５～１：１５、１：０．７５～１：１０、１：０．７５～１：５、１：０．５～１：２．５、１：１～１：２０、１：１～１：１０、１：１～１：５、１：１～１：２．５、１：２～１：５、１：２．５～１：５、もしくは１：３～１：５である。
ある実施形態では、Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＭＩＬまたはＰＢＬを含む）対陰性対照細胞の比は、１：１～１：２、１：２～１：３、１：３～１：４、１：４～１：５、１：５～１：６、１：６～１：７、１：７～１：８、１：８～１：９、１：９～１：１０、１：１０～１：１１、１：１１～１：１２、１：１２～１：１３、１：１３～１：１４、１：１４～１：１５、１：１５～１：１６、１：１６～１：１７、１：１７～１：１８、１：１８～１：１９、１：１９～１：２０、１：２０～１：２５、１：２５～１：３０、１：３０～１：３５、１：３５～１：４０、１：４０～１：４５、１：４５～１：５０、１：５０～１：５５、１：５５～１：６０、１：６０～１：７０、１：７０～１：８０、１：８０～１：９０、もしくは１：９０～１：１００、または代替的に、１：０．５～１：１００、１：０．５～１：５０、１：０．５～１：４０、１：０．５～１：３０、１：０．５～１：２５、１：０．５～１：２０、１：０．５～１：１５、１：０．５～１：１０、１：０．５～１：５、１：０．７５～１：５０、１：０．７５～１：４０、１：０．７５～１：３０、１：０．７５～１：２５、１：０．７５～１：２０、１：０．７５～１：１５、１：０．７５～１：１０、１：０．７５～１：５、１：０．５～１：２．５、１：１～１：２０、１：１～１：１０、１：１～１：５、１：１～１：２．５、１：２～１：５、１：２．５～１：５、もしくは１：３～１：５である。
ある実施形態では、Ｋ５６２細胞対Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＭＩＬまたはＰＢＬを含む）の比は、１：１～１：２、１：２～１：３、１：３～１：４、１：４～１：５、１：５～１：６、１：６～１：７、１：７～１：８、１：８～１：９、１：９～１：１０、１：１０～１：１１、１：１１～１：１２、１：１２～１：１３、１：１３～１：１４、１：１４～１：１５、１：１５～１：１６、１：１６～１：１７、１：１７～１：１８、１：１８～１：１９、１：１９～１：２０、１：２０～１：２５、１：２５～１：３０、１：３０～１：３５、１：３５～１：４０、１：４０～１：４５、１：４５～１：５０、１：５０～１：５５、１：５５～１：６０、１：６０～１：７０、１：７０～１：８０、１：８０～１：９０、もしくは１：９０～１：１００、または代替的に、１：０．５～１：１００、１：０．５～１：５０、１：０．５～１：４０、１：０．５～１：３０、１：０．５～１：２５、１：０．５～１：２０、１：０．５～１：１５、１：０．５～１：１０、１：０．５～１：５、１：０．７５～１：５０、１：０．７５～１：４０、１：０．７５～１：３０、１：０．７５～１：２５、１：０．７５～１：２０、１：０．７５～１：１５、１：０．７５～１：１０、１：０．７５～１：５、１：０．５～１：２．５、１：１～１：２０、１：１～１：１０、１：１～１：５、１：１～１：２．５、１：２～１：５、１：２．５～１：５、もしくは１：３～１：５である。
ある実施形態では、Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＭＩＬまたはＰＢＬを含む）対Ｋ５６２細胞の比は、１：１～１：２、１：２～１：３、１：３～１：４、１：４～１：５、１：５～１：６、１：６～１：７、１：７～１：８、１：８～１：９、１：９～１：１０、１：１０～１：１１、１：１１～１：１２、１：１２～１：１３、１：１３～１：１４、１：１４～１：１５、１：１５～１：１６、１：１６～１：１７、１：１７～１：１８、１：１８～１：１９、１：１９～１：２０、１：２０～１：２５、１：２５～１：３０、１：３０～１：３５、１：３５～１：４０、１：４０～１：４５、１：４５～１：５０、１：５０～１：５５、１：５５～１：６０、１：６０～１：７０、１：７０～１：８０、１：８０～１：９０、もしくは１：９０～１：１００、または代替的に、１：０．５～１：１００、１：０．５～１：５０、１：０．５～１：４０、１：０．５～１：３０、１：０．５～１：２５、１：０．５～１：２０、１：０．５～１：１５、１：０．５～１：１０、１：０．５～１：５、１：０．７５～１：５０、１：０．７５～１：４０、１：０．７５～１：３０、１：０．７５～１：２５、１：０．７５～１：２０、１：０．７５～１：１５、１：０．７５～１：１０、１：０．７５～１：５、１：０．５～１：２．５、１：１～１：２０、１：１～１：１０、１：１～１：５、１：１～１：２．５、１：２～１：５、１：２．５～１：５、もしくは１：３～１：５である。
ある実施形態では、標的細胞共培養におけるＴＩＬ対Ｒａｊｉ細胞の比は、約１５：１、約１４：１、約１３：１、約１２：１、約１１：１、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４．５：１、約４：１、約３．５：１、約３：１、約２．５：１、約２：１、約１．５：１、約１：１、約１：１．５、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５、約１：４、約１：４．５、約１：５、約１：６、約１．７、約１：８、約１：９、約１：１０、約１：１１、約１：１２、約１：１３、約１：１４、及び約１：１５からなる群から選択される。
ある実施形態では、標的細胞共培養におけるＴＩＬ対Ｋ５６２細胞の比は、約１５：１、約１４：１、約１３：１、約１２：１、約１１：１、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４．５：１、約４：１、約３．５：１、約３：１、約２．５：１、約２：１、約１．５：１、約１：１、約１：１．５、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５、約１：４、約１：４．５、約１：５、約１：６、約１．７、約１：８、約１：９、約１：１０、約１：１１、約１：１２、約１：１３、約１：１４、及び約１：１５からなる群から選択される。
ある実施形態では、約１×１０５～１０×１０５ＴＩＬを、約１×１０５～１０×１０５Ｒａｊｉ細胞と共培養する。ある実施形態では、約３×１０５～７×１０５ＴＩＬを、約１×１０５～３×１０５Ｒａｊｉ細胞と共培養する。ある実施形態では、約５×１０５～６×１０５ＴＩＬを、約３×１０５～７×１０５Ｒａｊｉ細胞と共培養する。ある実施形態では、約４×１０５ＴＩＬを、約５×１０５Ｒａｊｉ細胞と共培養する。ある実施形態では、約５×１０５ＴＩＬを、約５×１０５Ｒａｊｉ細胞と共培養する。ある実施形態では、約５×１０５ＴＩＬを、約４×１０５Ｒａｊｉ細胞と共培養する。ある実施形態では、約３×１０５～７×１０５ＴＩＬを、約７×１０５～２０×１０５Ｒａｊｉ細胞と共培養する。ある実施形態では、約４×１０５～４×１０５ＴＩＬを、約１０×１０５～１５×１０５Ｒａｊｉ細胞と共培養する。ある実施形態では、約５×１０５ＴＩＬを、約１５×１０５Ｒａｊｉ細胞と共培養する。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ活性をアッセイするための方法であって、ａ）Ｒａｊｉ細胞及びＫ５６２細胞を照射するステップと、（ｂ）照射されたＲａｊｉ細胞及び照射されたＫ５６２細胞を、ＴＩＬと５０：１、２５：１、１２．５：１、６．２５：１、１：１、１：６．２５、１：１２．５、及び１：２５）からなる群から選択される標的比で共培養するステップであって、かかる共培養が、任意選択で抗ＣＤ２８抗体を使用して行われる、共培養するステップと、（ｃ）６～２４時間後に、ステップ（ｂ）における共培養細胞から上清を収集するステップと、（ｄ）ステップ（ｂ）から細胞を採取し、Ｔ細胞活性化の表面マーカー発現を測定するステップと、（ｅ）ステップ（ｃ）において収集された共培養細胞からの上清を、Ｔ細胞活性化のマーカーについてアッセイするステップと、を含む、方法を提供する。
ある実施形態では、効力アッセイは、ＴＩＬ凍結保存製品、ＭＩＬ凍結保存製品、またはＰＢＬ凍結保存製品を解凍し、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、３７時間、３８時間、３９時間、４０時間、４１時間、４２時間、４３時間、４４時間、４５時間、４６時間、４７時間、４８時間、４９時間、５０時間、５１時間、５２時間、５３時間、５４時間、５５時間、５６時間、５７時間、５８時間、５９時間、６０時間、６１時間、６２時間、６３時間、６４時間、６５時間、６６時間、６７時間、６８時間、６９時間、７０時間、７１時間、７２時間、７３時間、７４時間、７５時間、７６時間、７７時間、７８時間、７９時間、８０時間、８５時間、９０時間、９５時間、１００時間、１１０時間、及び１２０時間からなる群から選択される期間、周囲温度または冷蔵温度での回復を可能にする、回復ステップを含む。ある実施形態では、効力アッセイは、ＴＩＬ凍結保存製品、ＭＩＬ凍結保存製品、またはＰＢＬ凍結保存製品を解凍し、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間、及び約９６時間からなる群から選択される期間、周囲温度または冷蔵温度での回復を可能にする、回復ステップを含む。前述の持続時間は、解凍プロセスの完了から、または解凍プロセスの開始から測定され得る。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、を含む。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、を含み、
前述の方法は、ＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ１３７刺激及び報告インターフェロン－γ、グランザイムＢ、または腫瘍壊死因子－αを使用したビーズまたはプレートベースのアッセイ、総生細胞についてのアッセイ、生細胞パーセンテージについてのアッセイ、ＣＤ４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＬＡＧ３＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＫＬＲＧ１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ１０１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ６９＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＳＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭＲＡ細胞含有量についてのアッセイ、Ｔｒｅｇ細胞含有量についてのアッセイ、ＰＤ－１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＭ３＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２５＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２７＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ５６＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＴＬＡ－４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＧＩＴ＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＣＤ５７＋細胞含有量についてのアッセイからなる群から選択される少なくとも１つの他のアッセイを含む、効力アッセイマトリックスの構成要素である。ある実施形態では、前述のアッセイは、フローサイトメトリーアッセイである。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、を含む。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、を含み、
Ｔ細胞製品は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）製品、骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）製品、または末梢血リンパ球（ＰＢＬ）製品からなる群から選択される。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、を含み、
Ｔ細胞製品は、ヒト由来のＴＩＬ製品であり、ＴＩＬ製品は、腫瘍の切除または腫瘍の断片化もしくは消化によって取得され、急速拡張プロトコルステップを含むＴＩＬ拡張プロセスによって製造される。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｈ．ヒト患者の治療において使用するためのＴ細胞製品を放出することと、を含み、
Ｔ細胞製品は、ヒト由来のＴＩＬ製品であり、ＴＩＬ製品は、腫瘍の切除または腫瘍の断片化もしくは消化によって取得され、急速拡張プロトコルステップを含むＴＩＬ拡張プロセスによって製造される。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｈ．ヒト患者の治療において使用するためのＴ細胞製品を放出することと、を含み、
Ｔ細胞製品は、ヒト由来のＴＩＬ製品であり、ＴＩＬ製品は、腫瘍の切除、または腫瘍の断片化もしくは消化によって取得され、急速拡張プロトコルステップを含むＴＩＬ拡張プロセスによって製造され、標的細胞は、照射されたＲａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｕ９３７細胞、もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｈ．ヒト患者の治療において使用するためのＴ細胞製品を放出することと、を含み、
Ｔ細胞製品は、ヒト由来のＴＩＬ製品であり、ＴＩＬ製品は、腫瘍の切除、または腫瘍の断片化もしくは消化によって取得され、急速拡張プロトコルステップを含むＴＩＬ拡張プロセスによって製造され、標的細胞は、照射されたＲａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｕ９３７細胞、もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、陰性対照細胞は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ発現を欠いている。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｈ．ヒト患者の治療において使用するためのＴ細胞製品を放出することと、を含み、
Ｔ細胞製品は、ヒト由来のＴＩＬ製品であり、ＴＩＬ製品は、腫瘍の切除、または腫瘍の断片化もしくは消化によって取得され、急速拡張プロトコルステップを含むＴＩＬ拡張プロセスによって製造され、標的細胞は、照射されたＲａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｕ９３７細胞、もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、陰性対照細胞は、照射されたＫ５６２細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｈ．ヒト患者の治療において使用するためのＴ細胞製品を放出することと、を含み、
Ｔ細胞製品は、ヒト由来のＴＩＬ製品であり、ＴＩＬ製品は、腫瘍の切除、または腫瘍の断片化もしくは消化によって取得され、急速拡張プロトコルステップを含むＴＩＬ拡張プロセスによって製造され、標的細胞は、照射されたＲａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｕ９３７細胞、もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、陰性対照細胞は、照射されたＫ５６２細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、ＴＩＬ製品細胞の数と標的細胞の数との比は、５：１～１：５である。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｈ．ヒト患者の治療において使用するためのＴ細胞製品を放出することと、を含み、
Ｔ細胞製品は、ヒト由来のＴＩＬ製品であり、ＴＩＬ製品は、腫瘍の切除、または腫瘍の断片化もしくは消化によって取得され、急速拡張プロトコルステップを含むＴＩＬ拡張プロセスによって製造され、標的細胞は、照射されたＲａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｕ９３７細胞、もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、陰性対照細胞は、照射されたＫ５６２細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、ＴＩＬ製品細胞の数と標的細胞の数との比は、５：１～１：５であり、ＴＩＬ製品細胞の数と陰性対照細胞の数との比は、５：１～１：５である。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｈ．ヒト患者の治療において使用するためのＴ細胞製品を放出することと、を含み、
Ｔ細胞製品は、ヒト由来のＴＩＬ製品であり、ＴＩＬ製品は、腫瘍の切除、または腫瘍の断片化もしくは消化によって取得され、急速拡張プロトコルステップを含むＴＩＬ拡張プロセスによって製造され、標的細胞は、照射されたＲａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｕ９３７細胞、もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、陰性対照細胞は、照射されたＫ５６２細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、第１の期間は、約６時間～約４８時間であり、第２の期間は、約６時間～約４８時間である。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｈ．ヒト患者の治療において使用するためのＴ細胞製品を放出することと、を含み、
Ｔ細胞製品は、ヒト由来のＴＩＬ製品であり、ＴＩＬ製品は、腫瘍の切除、または腫瘍の断片化もしくは消化によって取得され、急速拡張プロトコルステップを含むＴＩＬ拡張プロセスによって製造され、標的細胞は、照射されたＲａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｕ９３７細胞、もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、陰性対照細胞は、照射されたＫ５６２細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、第１の期間は、約１２時間、約１８時間、及び約２４時間からなる群から選択され、第２の期間は、約１２時間、約１８時間、及び約２４時間からなる群から選択される。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｈ．ヒト患者の治療において使用するためのＴ細胞製品を放出することと、を含み、
Ｔ細胞製品は、ヒト由来のＴＩＬ製品であり、ＴＩＬ製品は、腫瘍の切除、または腫瘍の断片化もしくは消化によって取得され、急速拡張プロトコルステップを含むＴＩＬ拡張プロセスによって製造され、標的細胞は、照射されたＲａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｕ９３７細胞、もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、陰性対照細胞は、照射されたＫ５６２細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、Ｔ細胞製品上の１つ以上のマーカーは、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０、ＫＬＲＧ１、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｈ．ヒト患者の治療において使用するためのＴ細胞製品を放出することと、を含み、
Ｔ細胞製品は、ヒト由来のＴＩＬ製品であり、ＴＩＬ製品は、腫瘍の切除、または腫瘍の断片化もしくは消化によって取得され、急速拡張プロトコルステップを含むＴＩＬ拡張プロセスによって製造され、標的細胞は、照射されたＲａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｕ９３７細胞、もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、陰性対照細胞は、照射されたＫ５６２細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、Ｔ細胞製品から選択される１つ以上の分析物は、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、パーフォリン、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２２、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＭＩＰ－１β、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｈ．ヒト患者の治療において使用するためのＴ細胞製品を放出することと、を含み、
Ｔ細胞製品は、ヒト由来のＴＩＬ製品であり、ＴＩＬ製品は、腫瘍の切除、または腫瘍の断片化もしくは消化によって取得され、かつ急速拡張プロトコルステップを含むＴＩＬ拡張プロセスによって製造され、標的細胞は、照射されたＲａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｕ９３７細胞、もしくはＴｈｐ１細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、陰性対照細胞は、照射されたＫ５６２細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、Ｔ細胞製品から分泌された１つ以上の分析物は、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、パーフォリン、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２２、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＭＩＰ－１β、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、ＴＩＬ製品から分泌された１つ以上の分析物は、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、パーフォリン、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２２、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＭＩＰ－１β、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、観測値の量は、１つ以上の分析物の各々についての対照値の量に正規化され、１つ以上の分析物の各々についての対照値を上回る観測値の増加は、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、及び少なくとも５倍からなる群から選択される。
前述の実施形態のうちのいずれにおいても、腫瘍消化は、本明細書に記載の方法によって、または当該技術分野で知られている方法によって行われ得る。前述の実施形態のうちのいずれにおいても、腫瘍消化は、国際特許公開第ＷＯ２０２１／１２３８３２Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法に従って、またはその組成物またはデバイスを使用して行われる。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ、ＭＩＬ、ＰＢＬ、または評価される他のポリクローナルＴ細胞製品を投与することによってがんの治療に用いることができる、拡張ＴＩＬ、ならびにＭＩＬ及びＰＢＬを含む他のポリクローナルＴ細胞製品の効力及び／または機能性を評価するためのＴＩＬ多機能活性をアッセイするための方法を提供し、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された２つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、を含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行う追加のステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得する追加のステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された２つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得する追加のステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定する追加のステップと、を含み、
ＴＩＬ製品から分泌された２つ以上の分析物は、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、パーフォリン、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２２、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＭＩＰ－１β、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、観測値の量は、２つ以上の分析物の各々について対照値の量に対して正規化され、２つ以上の分析物の各々について対照値を上回る観測値の増加は、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、及び少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、及び少なくとも１０倍からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ、ＭＩＬ、ＰＢＬ、または評価される他のポリクローナルＴ細胞製品を投与することによってがんの治療に用いることができる、拡張ＴＩＬ、ならびにＭＩＬ及びＰＢＬを含む他のポリクローナルＴ細胞製品の効力及び／または機能性を評価するためのＴＩＬ多機能活性をアッセイするための方法を提供し、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された３つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、を含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行う追加のステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得する追加のステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された３つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得する追加のステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定する追加のステップと、を含み、
ＴＩＬ製品から分泌された３つ以上の分析物は、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、パーフォリン、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２２、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＭＩＰ－１β、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、観測値の量は、３つ以上の分析物の各々について対照値の量に対して正規化され、３つ以上の分析物の各々について対照値を上回る観測値の増加は、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、及び少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、及び少なくとも１０倍からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ、ＭＩＬ、ＰＢＬ、または評価される他のポリクローナルＴ細胞製品を投与することによってがんの治療に用いることができる、拡張ＴＩＬ、ならびにＭＩＬ及びＰＢＬを含む他のポリクローナルＴ細胞製品の効力及び／または機能性を評価するためのＴＩＬ多機能活性をアッセイするための方法を提供し、この方法は、
ａ．複数のＴ細胞製品細胞との複数の標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、を含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との複数の陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行う追加のステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得する追加のステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得する追加のステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定する追加のステップと、を含み、
ＴＩＬ製品から分泌された１つ以上の分析物は、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、パーフォリン、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２２、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＭＩＰ－１β、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、観測値の量は、１つ以上の分析物の各々について対照値の量に対して正規化され、１つ以上の分析物の各々について対照値を上回る観測値の増加は、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、及び少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、及び少なくとも１０倍からなる群から選択される。
ある実施形態では、本発明は、上記方法を含み、標的細胞は、Ｒａｊｉ細胞、Ｔｈｐ１細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｕ９３７細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。ある実施形態では、標的細胞は、２つ以上の細胞株の組み合わせである。ある実施形態では、標的細胞は、２つ以上の細胞株の１：１の組み合わせである。ある実施形態では、標的細胞は、２つ以上の細胞株の１：１の組み合わせであり、２つ以上の細胞株は、異なるものであり、各々独立して、Ｒａｊｉ細胞、Ｔｈｐ１細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｕ９３７細胞、及びＤａｕｄｉ細胞からなる群から選択される。ある実施形態では、標的細胞は、３つ以上の細胞株の１：１：１の組み合わせであり、３つ以上の細胞株は、異なるものであり、各々独立して、Ｒａｊｉ細胞、Ｔｈｐ１細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｕ９３７細胞、及びＤａｕｄｉ細胞からなる群から選択される。ある実施形態では、標的細胞は、４つ以上の細胞株の１：１：１：１の組み合わせであり、４つ以上の細胞株は、異なるものであり、各々独立して、Ｒａｊｉ細胞、Ｔｈｐ１細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｕ９３７細胞、及びＤａｕｄｉ細胞からなる群から選択される。ある実施形態では、標的細胞は、２つ以上の細胞株の１：１：１：１：１の組み合わせであり、２つ以上の細胞株は、異なるものであり、各々独立して、Ｒａｊｉ細胞、Ｔｈｐ１細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｕ９３７細胞、及びＤａｕｄｉ細胞からなる群から選択される。
ある実施形態では、標的細胞は、Ｒａｊｉ細胞とＴｈｐ１細胞との組み合わせであり、Ｒａｊｉ細胞対Ｔｈｐ１細胞の比は、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、及び１：５からなる群から選択される。ある実施形態では、標的細胞は、Ｒａｊｉ細胞とＲａｍｏｓ細胞との組み合わせであり、Ｒａｊｉ細胞対Ｒａｍｏｓ細胞の比は、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、及び１：５からなる群から選択される。ある実施形態では、標的細胞は、Ｒａｊｉ細胞とＵ９３７細胞との組み合わせであり、Ｒａｊｉ細胞対Ｕ９３７細胞の比は、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、及び１：５からなる群から選択される。ある実施形態では、標的細胞は、Ｒａｊｉ細胞とＤａｕｄｉ細胞との組み合わせであり、Ｒａｊｉ細胞対Ｄａｕｄｉ細胞の比は、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、及び１：５からなる群から選択される。
ある実施形態では、本発明は、前述の方法を含み、共培養は、細胞培養培地を含む。ある実施形態では、本発明は、前述の方法を含み、共培養は、ＣＭ１培地を含む。ある実施形態では、本発明は、前述の方法を含み、共培養は、ＡＩＭ－Ｖ培地（Ｌ－グルタミン、５０μＭの硫酸ストレプトマイシン、及び１０μＭの硫酸ゲンタマイシン）を含み、これは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から市販されているＡＩＭ Ｖ培地とも称される。ある実施形態では、本発明は、前述の方法を含み、共培養及び第２の共培養は、細胞培養培地を含む。ある実施形態では、本発明は、前述の方法を含み、共培養及び第２の共培養は、各々ＣＭ１培地を含む。ある実施形態では、本発明は、前述の方法を含み、共培養及び第２の共培養は、各々ＡＩＭ－Ｖ培地を含む。ある実施形態では、共培養は、ＩＬ－２を含み、ＩＬ－２は、共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、共培養中に５０ＩＵ／ｍＬ～１０００ＩＵ／ｍＬの濃度で維持される。ある実施形態では、共培養は、ＩＬ－２を含み、ＩＬ－２は、共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、共培養中に１００ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬの濃度で維持される。ある実施形態では、共培養は、ＩＬ－２を含み、ＩＬ－２は、共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、共培養中に２００ＩＵ／ｍＬ～４００ＩＵ／ｍＬの濃度で維持される。ある実施形態では、共培養は、ＩＬ－２を含み、ＩＬ－２は、共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、約５０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約３５０ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約４５０ＩＵ／ｍＬ、及び約５００ＩＵ／ｍＬからなる群から選択される濃度で維持される。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＩＬ－２は、共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、約５０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約３５０ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約４５０ＩＵ／ｍＬ、及び約５００ＩＵ／ｍＬからなる群から選択される共培養中の濃度で維持される。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行う追加のステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得する追加のステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得する追加のステップと、
ｇ．ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定する追加のステップであって、各々の観測値が対応する対照値と比較される、Ｔ細胞製品の効力を決定する追加のステップと、を含み、
ＩＬ－２は、共培養及び第２の共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、約５０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約３５０ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約４５０ＩＵ／ｍＬ、及び約５００ＩＵ／ｍＬからなる群から選択される濃度で、共培養及び第２の共培養の各々における濃度で維持される。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＩＬ－２は、共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、５０ＩＵ／ｍＬ～１０００ＩＵ／ｍＬの共培養における濃度で維持される。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得する追加のステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得する追加のステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定する追加のステップと、を含み、
ＩＬ－２は、共培養及び第２の共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、共培養及び第２の共培養の各々において、５０ＩＵ／ｍＬ～１０００ＩＵ／ｍＬの濃度で維持される。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ活性、ＭＩＬ活性、またはＰＢＬ活性をアッセイするための方法を提供し、殺傷アッセイが使用される。いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ活性、ＭＩＬ活性、またはＰＢＬ活性をアッセイするための方法を提供し、殺傷アッセイが使用され、細胞溶解エンドポイントが検出される。いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ活性、ＭＩＬ活性、またはＰＢＬ活性をアッセイするための方法を提供し、殺傷アッセイが使用される。いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ活性、ＭＩＬ活性、またはＰＢＬ活性をアッセイするための方法を提供し、殺傷アッセイが使用され、溶解されたときに蛍光、化学発光、または生物発光タンパク質を発現するように、標的細胞株の遺伝子修飾によって細胞溶解エンドポイントが検出される。好適な遺伝子修飾及びアッセイとしては、米国特許第９，６３１，２２５号に記載されるものなどのルシフェラーゼアッセイが挙げられ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。例えば、米国特許第１０，４１５，０１５号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）において生物発光検出について記載される遺伝子修飾アプローチは、Ｒａｊｉ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｕ９３７細胞、またはＴｈｐ１細胞などの標的細胞の修飾に用いられ得る。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力をアッセイするための方法を提供し、この方法は、標的細胞を事前照射して増殖を停止させるステップをさらに含む。ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力をアッセイするための方法を提供し、この方法は、増殖を停止させるために照射されていない標的細胞の使用を含む。ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力をアッセイするための方法を提供し、この方法は、標的細胞を化学的または生物学的に処理して増殖を停止させるステップをさらに含む。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力をアッセイするための方法を提供し、この方法は、陰性対照細胞を事前照射して増殖を停止させるステップをさらに含む。ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力をアッセイするための方法を提供し、この方法は、増殖を停止させるために照射されていない陰性対照細胞の使用を含む。ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力をアッセイするための方法を提供し、この方法は、陰性対照細胞を化学的または生物学的に処理して増殖を停止させるステップをさらに含む。
ある実施形態では、標的細胞には、Ｘ線またはガンマ線を使用して、約５Ｇｙ、１０Ｇｙ、１５Ｇｙ、２０Ｇｙ、２５Ｇｙ、３０Ｇｙ、３５Ｇｙ、４０Ｇｙ、４５Ｇｙ、５０Ｇｙ、５５Ｇｙ、６０Ｇｙ、６５Ｇｙ、７０Ｇｙ、７５Ｇｙ、８０Ｇｙ、８５Ｇｙ、９０Ｇｙ、９５Ｇｙ、１００Ｇｙ、１０５Ｇｙ、１１０Ｇｙ、１１５Ｇｙ、１２０Ｇｙ、１２５Ｇｙ、１３０Ｇｙ、１３５Ｇｙ、１４０Ｇｙ、１４５Ｇｙ、１５０Ｇｙ、１５５Ｇｙ、１６０Ｇｙ、１６５Ｇｙ、１７０Ｇｙ、１７５Ｇｙ、１８０Ｇｙ、１８５Ｇｙ、１９０Ｇｙ、または２００Ｇｙの総吸収線量の放射線が照射される。
ある実施形態では、標的細胞には、Ｘ線またはガンマ線を使用して、約１００ｒａｄｓ、２００ｒａｄｓ、３００ｒａｄｓ、４００ｒａｄｓ、５００ｒａｄｓ、６００ｒａｄｓ、７００ｒａｄｓ、８００ｒａｄｓ、９００ｒａｄｓ、１０００ｒａｄｓ、１１００ｒａｄｓ、１２００ｒａｄｓ、１３００ｒａｄｓ、１４００ｒａｄｓ、１５００ｒａｄｓ、１６００ｒａｄｓ、１７００ｒａｄｓ、１８００ｒａｄｓ、１９００ｒａｄｓ、２０００ｒａｄｓ、２１００ｒａｄｓ、２２００ｒａｄｓ、２３００ｒａｄｓ、２４００ｒａｄｓ、２５００ｒａｄｓ、２６００ｒａｄｓ、２７００ｒａｄｓ、２８００ｒａｄｓ、２９００ｒａｄｓ、３０００ｒａｄｓ、３１００ｒａｄｓ、３２００ｒａｄｓ、３３００ｒａｄｓ、３４００ｒａｄｓ、３５００ｒａｄｓ、３６００ｒａｄｓ、３７００ｒａｄｓ、３８００ｒａｄｓ、３９００ｒａｄｓ、４０００ｒａｄｓ、４１００ｒａｄｓ、４２００ｒａｄｓ、４３００ｒａｄｓ、４４００ｒａｄｓ、４５００ｒａｄｓ、４６００ｒａｄｓ、４７００ｒａｄｓ、４８００ｒａｄｓ、４９００ｒａｄｓ、５０００ｒａｄｓ、５１００ｒａｄｓ、５２００ｒａｄｓ、５３００ｒａｄｓ、５４００ｒａｄｓ、５５００ｒａｄｓ、５６００ｒａｄｓ、５７００ｒａｄｓ、５８００ｒａｄｓ、５９００ｒａｄｓ、６０００ｒａｄｓ、６１００ｒａｄｓ、６２００ｒａｄｓ、６３００ｒａｄｓ、６４００ｒａｄｓ、６５００ｒａｄｓ、６６００ｒａｄｓ、６７００ｒａｄｓ、６８００ｒａｄｓ、６９００ｒａｄｓ、７０００ｒａｄｓ、７５００ｒａｄｓ、８０００ｒａｄｓ、８５００ｒａｄｓ、９０００ｒａｄｓ、９５００ｒａｄｓ、または１００００ｒａｄｓの総吸収線量の放射線が照射される。
ある実施形態では、標的細胞は、Ｘ線またはガンマ線を使用して、約２０ｒａｄｓ／分、４０ｒａｄｓ／分、６０ｒａｄｓ／分、８０ｒａｄｓ／分、１００ｒａｄｓ／分、１２０ｒａｄｓ／分、１４０ｒａｄｓ／分、１６０ｒａｄｓ／分、１８０ｒａｄｓ／分、２００ｒａｄｓ／分、２２０ｒａｄｓ／分、２４０ｒａｄｓ／分、２６０ｒａｄｓ／分、２８０ｒａｄｓ／分、３００ｒａｄｓ／分、３２０ｒａｄｓ／分、３４０ｒａｄｓ／分、３６０ｒａｄｓ／分、３８０ｒａｄｓ／分、４００ｒａｄｓ／分、４２０ｒａｄｓ／分、４４０ｒａｄｓ／分、４６０ｒａｄｓ／分、４８０ｒａｄｓ／分、５００ｒａｄｓ／分、５２０ｒａｄｓ／分、５４０ｒａｄｓ／分、５６０ｒａｄｓ／分、５８０ｒａｄｓ／分、６００ｒａｄｓ／分、６２０ｒａｄｓ／分、６４０ｒａｄｓ／分、６６０ｒａｄｓ／分、６８０ｒａｄｓ／分、または７００ｒａｄｓ／分の吸収線量の放射線の速度で照射される。ある実施形態では、標的細胞は、Ｘ線またはガンマ線を使用して、約５０ｒａｄｓ／分、１００ｒａｄｓ／分、１５０ｒａｄｓ／分、２００ｒａｄｓ／分、２５０ｒａｄｓ／分、３００ｒａｄｓ／分、３５０ｒａｄｓ／分、４００ｒａｄｓ／分、４５０ｒａｄｓ／分、５００ｒａｄｓ／分、５５０ｒａｄｓ／分、６００ｒａｄｓ／分、６５０ｒａｄｓ／分、７００ｒａｄｓ／分、７５０ｒａｄｓ／分、８００ｒａｄｓ／分、８５０ｒａｄｓ／分、９００ｒａｄｓ／分、９５０ｒａｄｓ／分、１０００ｒａｄｓ／分、１０５０ｒａｄｓ／分、１１００ｒａｄｓ／分、１１５０ｒａｄｓ／分、１２００ｒａｄｓ／分、１２５０ｒａｄｓ／分、１３００ｒａｄｓ／分、１３５０ｒａｄｓ／分、１４００ｒａｄｓ／分、１４５０ｒａｄｓ／分、１５００ｒａｄｓ／分、１５５０ｒａｄｓ／分、１６００ｒａｄｓ／分、１６５０ｒａｄｓ／分、１７００ｒａｄｓ／分、１７５０ｒａｄｓ／分、１８００ｒａｄｓ／分、１８５０ｒａｄｓ／分、１９００ｒａｄｓ／分、１９５０ｒａｄｓ／分、または２０００ｒａｄｓ／分の吸収線量の放射線の速度で照射される。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品などのＴ細胞製品の効力を決定するための混合腫瘍アロ反応性アッセイ方法開示を行うための方法を含む。ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との混合腫瘍アロ反応性細胞株の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＩＬ－２は、共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、約５０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約３５０ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約４５０ＩＵ／ｍＬ、及び約５００ＩＵ／ｍＬからなる群から選択される共培養中の濃度で維持される。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との混合腫瘍アロ反応性細胞株の共培養を、第１の期間行うステップであって、混合腫瘍アロ反応性細胞株が、混合腫瘍細胞株である、共培養を第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定する追加のステップであって、各々の観測値が対応する対照値と比較される、Ｔ細胞製品の効力を決定する追加のステップと、を含み、
ＩＬ－２は、共培養及び第２の共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、約５０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約３５０ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約４５０ＩＵ／ｍＬ、及び約５００ＩＵ／ｍＬからなる群から選択される濃度で、共培養及び第２の共培養の各々における濃度で維持される。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との混合腫瘍アロ反応性細胞株の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＩＬ－２は、共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、５０ＩＵ／ｍＬ～１０００ＩＵ／ｍＬの共培養中の濃度に維持される。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｔ細胞製品細胞との混合腫瘍アロ反応性細胞株の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｔ細胞製品の効力を決定するステップと、
ｄ．Ｔ細胞製品細胞との陰性対照細胞の第２の共培養を、第２の期間行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するステップと、
ｆ．第２の採取物を、（１）Ｔ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｔ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、Ｔ細胞製品の効力を決定する追加のステップであって、各々の観測値が対応する対照値と比較される、Ｔ細胞製品の効力を決定する追加のステップと、を含み、
ＩＬ－２は、共培養及び第２の共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、共培養及び第２の共培養の各々において、５０ＩＵ／ｍＬ～１０００ＩＵ／ｍＬの濃度で維持される。
ある実施形態では、本発明は、標的細胞株または標的細胞株の組み合わせが、最大のＨＬＡ多様性のために最適化される、効力アッセイを行うための方法を含む。ある実施形態では、本発明は、標的細胞株または標的細胞株の組み合わせが、最大のヘテロ接合性のために最適化される、効力アッセイを行うための方法を含む。ある実施形態では、本発明は、標的細胞株または標的細胞株の組み合わせが、最大の免疫原性のために最適化される、効力アッセイを行うための方法を含む。ある実施形態では、本発明は、標的細胞株または標的細胞株の組み合わせが、最大のＨＬＡ－Ａ２免疫原性のために最適化される、効力アッセイを行うための方法を含む。ある実施形態では、本発明は、標的細胞株または標的細胞株の組み合わせが、ＨＬＡ特性に基づいて選択される、効力アッセイを行うための方法を含む。ある実施形態では、本発明は、標的細胞株または標的細胞株の組み合わせが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＱ（Ａ１）、ＨＬＡ－ＤＱ（Ａ２）、ＨＬＡ－ＤＲ（Ｂ１）、ＨＬＡ－ＤＰ（Ｂ１）、ＨＬＡ－ＤＰ（Ｂ２）、またはそれらの組み合わせを発現する、効力アッセイを行うための方法を含む。ある実施形態では、本発明は、標的細胞株または標的細胞株の組み合わせが、最大の同種異系ＨＬＡ－ＴＣＲ相互作用のために最適化される、効力アッセイを行うための方法を含む。ある実施形態では、本発明は、標的細胞株または標的細胞株の組み合わせが、最大の非抗原特異的ＨＬＡ－ＴＣＲ相互作用のために最適化される、効力アッセイを行うための方法を含む。
ある実施形態では、本発明は、バイアルまたはウェル当たりのＴＩＬ及び標的細胞の総数が、およそ１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、１．５×１０６、２×１０６、２．５×１０６、３×１０６、３．５×１０６、４×１０６、４．５×１０６、または５×１０６である、効力アッセイを行うための方法を含む。ある実施形態では、バイアルまたはウェルは、約０．５ｍＬ、１ｍＬ、１．５ｍＬ、２ｍＬ、２．５ｍＬ、３ｍＬ、３．５ｍＬ、４ｍＬ、４．５ｍＬ、または５ｍＬの体積を有する。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体は、陰性対照として、約０．１μｇ／ｍＬ、約０．２μｇ／ｍＬ、約０．３μｇ／ｍＬ、約０．４μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ、約０．６μｇ／ｍＬ、約０．７μｇ／ｍＬ、約０．８μｇ／ｍＬ、約０．９μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ、約１３μｇ／ｍＬ、約１４μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ、約１６μｇ／ｍＬ、約１７μｇ／ｍＬ、約１８μｇ／ｍＬ、約１９μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ、約２１μｇ／ｍＬ、約２２μｇ／ｍＬ、約２３μｇ／ｍＬ、約２４μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ、約２６μｇ／ｍＬ、約２７μｇ／ｍＬ、約２８μｇ／ｍＬ、約２９μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ、約４５μｇ／ｍＬ、または約５０μｇ／ｍＬの濃度で使用される。前述の実施形態のうちのいずれにおいても、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手可能なクローンＷ６／３２（抗ＨＬＡ－ＡＢＣ）である。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体は、陰性対照として、約０．１μｇ／ｍＬ、約０．２μｇ／ｍＬ、約０．３μｇ／ｍＬ、約０．４μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ、約０．６μｇ／ｍＬ、約０．７μｇ／ｍＬ、約０．８μｇ／ｍＬ、約０．９μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ、約１３μｇ／ｍＬ、約１４μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ、約１６μｇ／ｍＬ、約１７μｇ／ｍＬ、約１８μｇ／ｍＬ、約１９μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ、約２１μｇ／ｍＬ、約２２μｇ／ｍＬ、約２３μｇ／ｍＬ、約２４μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ、約２６μｇ／ｍＬ、約２７μｇ／ｍＬ、約２８μｇ／ｍＬ、約２９μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ、約４５μｇ／ｍＬ、または約５０μｇ／ｍＬの濃度で使用される。前述の実施形態のうちのいずれにおいても、ＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）から入手可能なクローンＴＵ３９（ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ）である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するか、または上清を抽出するステップと、
ｃ．（１）採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＴＩＬ対標的細胞の比は、約３：１であり、標的細胞は、単球細胞であり、ステップ（ａ）の共培養における総細胞は、約１×１０６／ｍＬである。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するか、または上清を抽出するステップと、
ｃ．（１）採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＴＩＬ対標的細胞比は、約３：１であり、標的細胞は、単球細胞であり、ステップ（ａ）の共培養における総細胞は、約１×１０６／ｍＬであり、前述の方法は、サイトカインについてのビーズまたはプレートベースのアッセイ、総生細胞についてのアッセイ、生細胞パーセンテージについてのアッセイ、ＣＤ４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＬＡＧ３＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＫＬＲＧ１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ１０１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ６９＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＳＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭＲＡ細胞含有量についてのアッセイ、Ｔｒｅｇ細胞含有量についてのアッセイ、ＰＤ－１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＭ３＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２５＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２７＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ５６＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＴＬＡ－４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＧＩＴ＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＣＤ５７＋細胞含有量についてのアッセイからなる群から選択される少なくとも１つの他のアッセイを含む効力アッセイマトリックスの構成要素である。ある実施形態では、前述のアッセイは、フローサイトメトリーアッセイである。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するか、または上清を抽出するステップと、
ｃ．（１）採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＴＩＬ対標的細胞の比は、約３：１であり、標的細胞は、単球細胞であり、ステップ（ａ）の共培養における総細胞は、約２×１０６／ｍＬである。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するか、または上清を抽出するステップと、
ｃ．（１）採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＴＩＬ対標的細胞比は、約３：１であり、標的細胞は、単球細胞であり、ステップ（ａ）の共培養における総細胞は、約２×１０６／ｍＬであり、前述の方法は、ＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ１３７刺激を使用し、インターフェロン－γ、グランザイムＢ、または腫瘍壊死因子－αを報告するビーズまたはプレートベースのアッセイ、総生細胞についてのアッセイ、生細胞パーセンテージについてのアッセイ、ＣＤ４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＬＡＧ３＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＫＬＲＧ１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ１０１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ６９＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＳＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭＲＡ細胞含有量についてのアッセイ、Ｔｒｅｇ細胞含有量についてのアッセイ、ＰＤ－１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＭ３＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２５＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２７＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ５６＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＴＬＡ－４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＧＩＴ＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＣＤ５７＋細胞含有量についてのアッセイからなる群から選択される少なくとも１つの他のアッセイを含む効力アッセイマトリックスの構成要素である。ある実施形態では、前述のアッセイは、フローサイトメトリーアッセイである。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するか、または上清を抽出するステップと、
ｃ．（１）採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＴＩＬ対標的細胞の比は、約１：１であり、標的細胞は、単球細胞であり、ステップ（ａ）の共培養における総細胞は、約１×１０６／ｍＬである。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するか、または上清を抽出するステップと、
ｃ．（１）採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、を含み、
標的細胞は、単球細胞であり、ステップ（ａ）の共培養における総細胞は、約１×１０６／ｍＬであり、前述の方法は、ＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ１３７刺激及び報告インターフェロン－γ、グランザイムＢ、または腫瘍壊死因子－αを使用したビーズまたはプレートベースのアッセイ、総生細胞についてのアッセイ、生細胞パーセンテージについてのアッセイ、ＣＤ４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＬＡＧ３＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＫＬＲＧ１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ１０１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ６９＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＳＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭＲＡ細胞含有量についてのアッセイ、Ｔｒｅｇ細胞含有量についてのアッセイ、ＰＤ－１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＭ３＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２５＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２７＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ５６＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＴＬＡ－４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＧＩＴ＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＣＤ５７＋細胞含有量についてのアッセイからなる群から選択される少なくとも１つの他のアッセイを含む、効力アッセイマトリックスの構成要素である。ある実施形態では、前述のアッセイは、フローサイトメトリーアッセイである。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するか、または上清を抽出するステップと、
ｃ．（１）採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＴＩＬ対標的細胞の比は、約１：１であり、標的細胞は、単球細胞であり、ステップ（ａ）の共培養における総細胞は、約２×１０６／ｍＬである。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するか、または上清を抽出するステップと、
ｃ．（１）採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、
ｄ．ＴＩＬ細胞及び標的細胞との、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遮断抗体を含む陰性対照の第２の共培養を、第２の期間（かかる第２の期間は、任意選択で、第１の期間と同時に起こる）行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するか、または第２の上清を抽出するステップと、
ｆ．（１）第２の採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）第２の上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＴＩＬ対標的細胞比は、３：１～１：１であり、標的細胞は、単球細胞であり、ステップ（ａ）の共培養及びステップ（ｄ）の第２の共培養における総細胞は、０．５×１０６／ｍＬ～３×１０６／ｍＬであり、ＨＬＡ遮断抗体は、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体、ＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するか、または上清を抽出するステップと、
ｃ．（１）採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、
ｄ．ＴＩＬ細胞及び標的細胞との、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遮断抗体を含む陰性対照の第２の共培養を、第２の期間（かかる第２の期間は、任意選択で、第１の期間と同時に起こる）行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するか、または第２の上清を抽出するステップと、
ｆ．（１）第２の採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）第２の上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＴＩＬ対標的細胞比は、３：１～１：１であり、標的細胞は、Ｔｈｐ１細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、ステップ（ａ）の共培養及びステップ（ｄ）の第２の共培養における総細胞は、０．５×１０６／ｍＬ～３×１０６／ｍＬであり、ＨＬＡ遮断抗体は、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体、ＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するか、または上清を抽出するステップと、
ｃ．（１）採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、
ｄ．ＴＩＬ細胞及び標的細胞との、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遮断抗体を含む陰性対照の第２の共培養を、第２の期間（かかる第２の期間は、任意選択で、第１の期間と同時に起こる）行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するか、または第２の上清を抽出するステップと、
ｆ．（１）第２の採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）第２の上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、ＴＩＬの効力を決定するステップと、を含み、
ＴＩＬ対標的細胞比は、３：１～１：１であり、標的細胞は、Ｕ９３７細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、ステップ（ａ）の共培養及びステップ（ｄ）の第２の共培養における総細胞は、０．５×１０６／ｍＬ～３×１０６／ｍＬであり、ＨＬＡ遮断抗体は、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体、ＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するか、または上清を抽出するステップと、
ｃ．（１）採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、
ｄ．ＴＩＬ細胞及び標的細胞との、ヒト白血球抗原クラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）遮断抗体及びヒト白血球抗原クラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ）遮断抗体を含む陰性対照の第２の共培養を、第２の期間（かかる第２の期間は、任意選択で、第１の期間と同時に起こる）行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するか、または第２の上清を抽出するステップと、
ｆ．（１）第２の採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）第２の上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＴＩＬ対標的細胞比は、３：１～１：１であり、標的細胞は、Ｔｈｐ１細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、ステップ（ａ）の共培養及びステップ（ｄ）の第２の共培養における総細胞は、０．５×１０６／ｍＬ～３×１０６／ｍＬであり、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体の濃度は、５μｇ／ｍＬ～２０μｇ／ｍＬであり、ＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体の濃度は、５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬである。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するか、または上清を抽出するステップと、
ｃ．（１）採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、
ｄ．ＴＩＬ細胞及び標的細胞との、ヒト白血球抗原クラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）遮断抗体及びヒト白血球抗原クラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ）遮断抗体を含む陰性対照の第２の共培養を、第２の期間（かかる第２の期間は、任意選択で、第１の期間と同時に起こる）行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するか、または第２の上清を抽出するステップと、
ｆ．（１）第２の採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）第２の上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＴＩＬ対標的細胞比は、３：１～１：１であり、標的細胞は、Ｔｈｐ１細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、ステップ（ａ）の共培養及びステップ（ｄ）の第２の共培養における総細胞は、０．５×１０６／ｍＬ～３×１０６／ｍＬであり、ＨＬＡ遮断抗体の濃度は、５μｇ／ｍＬ～２０μｇ／ｍＬであり、ＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体の濃度は、５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬである。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するか、または上清を抽出するステップと、
ｃ．（１）採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、
ｄ．ＴＩＬ細胞及び標的細胞との、ヒト白血球抗原クラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）遮断抗体及びヒト白血球抗原クラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ）遮断抗体を含む陰性対照の第２の共培養を、第２の期間（かかる第２の期間は、任意選択で、第１の期間と同時に起こる）行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するか、または第２の上清を抽出するステップと、
ｆ．（１）第２の採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）第２の上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＴＩＬ対標的細胞比は、３：１～１：１であり、標的細胞は、Ｔｈｐ１細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、ステップ（ａ）の共培養及びステップ（ｄ）の第２の共培養における総細胞は、０．５×１０６／ｍＬ～３×１０６／ｍＬであり、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体の濃度は、５μｇ／ｍＬ～２０μｇ／ｍＬであり、ＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体の濃度は、５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであり、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物は、インターフェロン－γを含む。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するか、または上清を抽出するステップと、
ｃ．（１）採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観察された値を取得して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、
ｄ．ＴＩＬ細胞及び標的細胞との、ヒト白血球抗原クラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）遮断抗体及びヒト白血球抗原クラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ）遮断抗体を含む陰性対照の第２の共培養を、第２の期間（かかる第２の期間は、任意選択で、第１の期間と同時に起こる）行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の採取物を取得するか、または第２の上清を抽出するステップと、
ｆ．（１）第２の採取物を、ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）第２の上清を、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得するステップと、
ｇ．各々の観測値が対応する対照値と比較される、ステップｃからの１つ以上の観測値をステップｆからの１つ以上の対照値と比較して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＴＩＬ対標的細胞比は、３：１～１：１であり、標的細胞は、Ｔｈｐ１細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、ステップ（ａ）の共培養及びステップ（ｄ）の第２の共培養における総細胞は、０．５×１０６／ｍＬ～３×１０６／ｍＬであり、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体の濃度は、５μｇ／ｍＬ～２０μｇ／ｍＬであり、ＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体の濃度は、５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであり、ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物は、インターフェロン－γを含む。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から上清を抽出するステップと、
ｃ．上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、観測値を取得するステップと、
ｄ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞及び標的細胞との、ヒト白血球抗原クラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）遮断抗体及びヒト白血球抗原クラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ）遮断抗体を含む陰性対照の第２の共培養を、第２の期間（かかる第２の期間は、任意選択で、第１の期間と同時に起こる）行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の上清を抽出するステップと、
ｆ．第２の上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、対照値を取得するステップと、
ｇ．倍率増強が計算される、ステップｃからの観測値をステップｆからの対照値と比較して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＴＩＬ対標的細胞比は、３：１～１：１であり、標的細胞は、Ｔｈｐ１細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、ステップ（ａ）の共培養及びステップ（ｄ）の第２の共培養における総細胞は、０．５×１０６／ｍＬ～３×１０６／ｍＬであり、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体の濃度は、５μｇ／ｍＬ～２０μｇ／ｍＬであり、ＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体の濃度は、５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬである。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から上清を抽出するステップと、
ｃ．上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、観測値を取得するステップと、
ｄ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞及び標的細胞との、ヒト白血球抗原クラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）遮断抗体及びヒト白血球抗原クラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ）遮断抗体を含む陰性対照の第２の共培養を、第２の期間（かかる第２の期間は、任意選択で、第１の期間と同時に起こる）行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の上清を抽出するステップと、
ｆ．第２の上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、対照値を取得するステップと、
ｇ．倍率増強が計算される、ステップｃからの観測値をステップｆからの対照値と比較して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＴＩＬ対標的細胞比は、３：１～１：１であり、標的細胞は、Ｕ９３７細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、ステップ（ａ）の共培養における総細胞は、０．５×１０６／ｍＬ～３×１０６／ｍＬであり、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体の濃度は、５μｇ／ｍＬ～２０μｇ／ｍＬであり、ＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体の濃度は、５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬである。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から上清を抽出するステップと、
ｃ．上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、観測値を取得するステップと、
ｄ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞及び標的細胞との、ヒト白血球抗原クラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）遮断抗体及びヒト白血球抗原クラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ）遮断抗体を含む陰性対照の第２の共培養を、第２の期間（かかる第２の期間は、任意選択で、第１の期間と同時に起こる）行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の上清を抽出するステップと、
ｆ．第２の上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、対照値を取得するステップと、
ｇ．倍率増強が計算される、ステップｃからの観測値をステップｆからの対照値と比較して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＴＩＬ対標的細胞比は、３：１～１：１であり、標的細胞は、Ｔｈｐ１細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、ステップ（ａ）の共培養及びステップ（ｄ）の第２の共培養における総細胞は、１×１０６／ｍＬ～３×１０６／ｍＬであり、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体の濃度は、５μｇ／ｍＬ～２０μｇ／ｍＬであり、ＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体の濃度は、５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであり、ＩＬ－２は、共培養及び第２の共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、共培養及び第２の共培養の各々において、１００ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍの濃度で維持され、共培養及び第２の共培養は、ＡＩＭ－Ｖ培地を使用して行われる。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から上清を抽出するステップと、
ｃ．上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、観測値を取得するステップと、
ｄ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞及び標的細胞との、ヒト白血球抗原クラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）遮断抗体及びヒト白血球抗原クラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ）遮断抗体を含む陰性対照の第２の共培養を、第２の期間（かかる第２の期間は、任意選択で、第１の期間と同時に起こる）行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の上清を抽出するステップと、
ｆ．第２の上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、対照値を取得するステップと、
ｇ．倍率増強が計算される、ステップｃからの観測値をステップｆからの対照値と比較して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＴＩＬ対標的細胞比は、３：１～１：１であり、標的細胞は、Ｕ９３７細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、ステップ（ａ）の共培養及びステップ（ｄ）の第２の共培養における総細胞は、１×１０６／ｍＬ～３×１０６／ｍＬであり、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体の濃度は、５μｇ／ｍＬ～２０μｇ／ｍＬであり、ＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体の濃度は、５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであり、ＩＬ－２は、共培養及び第２の共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、共培養及び第２の共培養の各々において、１００ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍの濃度で維持され、共培養及び第２の共培養は、ＡＩＭ－Ｖ培地を使用して行われる。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から上清を抽出するステップと、
ｃ．上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、観測値を取得するステップと、
ｄ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞及び標的細胞との、ヒト白血球抗原クラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）遮断抗体及びヒト白血球抗原クラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ）遮断抗体を含む陰性対照の第２の共培養を、第２の期間（かかる第２の期間は、任意選択で、第１の期間と同時に起こる）行うステップと、
ｅ．第２の共培養から第２の上清を抽出するステップと、
ｆ．第２の上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、対照値を取得するステップと、
ｇ．倍率増強が計算される、ステップｃからの観測値をステップｆからの対照値と比較して、ＴＩＬ製品の効力を決定するステップと、を含み、
ＴＩＬ対標的細胞の比は、３：１～１：１であり、標的細胞は、Ｕ９３７細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、ステップ（ａ）の共培養及びステップ（ｄ）の第２の共培養における総細胞は、１×１０６／ｍＬ～３×１０６／ｍＬであり、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体の濃度は、５μｇ／ｍＬ～２０μｇ／ｍＬであり、ＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体の濃度は、５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであり、ＩＬ－２は、共培養及び第２の共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、共培養及び第２の共培養の各々において、１００ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍの濃度で維持され、共培養及び第２の共培養は、ＡＩＭ－Ｖ培地を使用して行われ、前述の方法は、ＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ１３７刺激を使用し、インターフェロン－γ、グランザイムＢ、または腫瘍壊死因子－αを報告するビーズまたはプレートベースのアッセイ、総生細胞についてのアッセイ、生細胞パーセンテージについてのアッセイ、ＣＤ４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＬＡＧ３＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＫＬＲＧ１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ１０１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ６９＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＳＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭＲＡ細胞含有量についてのアッセイ、Ｔｒｅｇ細胞含有量についてのアッセイ、ＰＤ－１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＭ３＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２５＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２７＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ５６＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＴＬＡ－４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＧＩＴ＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＣＤ５７＋細胞含有量についてのアッセイからなる群から選択される少なくとも１つの他のアッセイを含む、効力アッセイマトリックスの構成要素である。ある実施形態では、前述のアッセイは、フローサイトメトリーアッセイである。
いくつかの実施形態では、標的細胞株は、２倍以下、３倍以下、４倍以下、５倍以下、６倍以下、７倍以下、８倍以下、９倍以下、または１０倍以下で継代したマスターセルバンクから調製される。前述の実施形態の別の実施形態では、継代の総数は、標的細胞株のプロバイダーによって報告された継代の数と比較することによって決定され得る。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、もしくはＴｈｐ１細胞株、またはそれらの組み合わせは、２倍以下、３倍以下、４倍以下、５倍以下、６倍以下、７倍以下、８倍以下、９倍以下、または１０倍以下で継代したマスターセルバンクから調製される。前述の実施形態の別の実施形態では、継代の総数は、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、もしくはＴｈｐ１細胞株、またはそれらの組み合わせのプロバイダー（複数可）によって報告された継代の数と比較することによって決定され得る。
いくつかの実施形態では、陰性対照細胞株は、２倍以下、３倍以下、４倍以下、５倍以下、６倍以下、７倍以下、８倍以下、９倍以下、または１０倍以下で継代したマスターセルバンクから調製される。前述の実施形態の別の実施形態では、継代の総数は、陰性対照細胞株のプロバイダーによって報告された継代の数と比較することによって決定され得る。
いくつかの実施形態では、Ｋ５６２細胞株は、２倍以下、３倍以下、４倍以下、５倍以下、６倍以下、７倍以下、８倍以下、９倍以下、または１０倍以下で継代したマスターセルバンクから調製される。前述の実施形態の別の実施形態では、継代の総数は、Ｋ５６２細胞株のプロバイダーによって報告された継代の数と比較することによって決定され得る。
いくつかの実施形態では、標的細胞株は、２倍以下、３倍以下、４倍以下、５倍以下、６倍以下、７倍以下、８倍以下、９倍以下、または１０倍以下で継代したワーキングセルバンクから調製される。前述の実施形態の別の実施形態では、継代の総数は、標的細胞株のプロバイダーによって報告された継代の数と比較することによって決定され得る。
いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、もしくはＴｈｐ１細胞株、またはそれらの組み合わせは、２倍以下、３倍以下、４倍以下、５倍以下、６倍以下、７倍以下、８倍以下、９倍以下、または１０倍以下で継代したワーキングセルバンクから調製される。前述の実施形態の別の実施形態では、継代の総数は、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、もしくはＴｈｐ１細胞株、またはそれらの組み合わせのプロバイダー（複数可）によって報告された継代の数と比較することによって決定され得る。
いくつかの実施形態では、陰性対照細胞株は、２倍以下、３倍以下、４倍以下、５倍以下、６倍以下、７倍以下、８倍以下、９倍以下、または１０倍以下で継代したワーキングセルバンクから調製される。前述の実施形態の別の実施形態では、継代の総数は、陰性対照細胞株のプロバイダーによって報告された継代の数と比較することによって決定され得る。
いくつかの実施形態では、Ｋ５６２細胞株は、２倍以下、３倍以下、４倍以下、５倍以下、６倍以下、７倍以下、８倍以下、９倍以下、または１０倍以下で継代したワーキングセルバンクから調製される。前述の実施形態の別の実施形態では、継代の総数は、Ｋ５６２細胞株のプロバイダーによって報告された継代の数と比較することによって決定され得る。
いくつかの実施形態では、陰性対照細胞株は、標的細胞株（単球細胞株、またはＲａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、もしくはＴｈｐ１細胞株など）との共培養で使用される条件での培養後のタンパク質（ＩＦＮ－γまたはグランザイムＢなど）の分泌または発現について試験されたＴＩＬ細胞株であるが、ただし、標的細胞株はＴＩＬ細胞株とともに含まれない。これらの陰性対照実験は、場合によっては「ＴＩＬ単独」対照実験と本明細書で称される。倍率増強及び平行線分析計算は、ＴＩＬ単独陰性対照実験と併せて用いてもよい。例えば、ＴＩＬ株の共培養は、本明細書に記載の方法に従って単球標的細胞株とともに行うことができ、同じ条件下で同時に実行する別個の実験では、ＴＩＬ株を単独で培養することができる。次いで、両方の実験は、ＩＦＮ－γ発現について分析され得、倍率増強を計算するために比較され得るか、または平行線分析勾配または他の分析基準の計算に使用され得る。
前述の実施形態のうちのいくつかでは、陽性対照ＴＩＬ細胞株も含まれ、これは、本明細書に記載される方法（例えば、関連する前述の実施形態におけるステップ（ａ）～（ｃ））を使用して、実験間、日間、分析間、または実験室間ベースでの再現性を確保するために測定される。
いくつかの実施形態では、前述の方法は、データ分析ステップとともに使用される。いくつかの実施形態では、データ分析ステップは、本明細書の他の箇所に詳細に記載されるように、倍率増強計算である。いくつかの実施形態では、データ分析ステップは、本明細書の他の箇所に詳細に記載されるように、平行線分析計算である。統計分析及び合格／不合格放出または安定性の決定に対する平行線分析アプローチは、１つまたは２つの外れ値（例えば、１つの外れ値を除去した４つの標的細胞濃度）を任意選択で除去して、単一のＴＩＬロット濃度に対する２、３、４、または５つの標的細胞濃度の測定と併せて用量反応を決定することを含む、前述のアッセイ実施形態のうちのいずれかとともに使用されてもよい。平行線分析は、ＵＳＰ Ｃｈａｐｔｅｒ＜１０３２＞Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ．ＵＳＰ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ：Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０１３、ＵＳＰ Ｃｈａｐｔｅｒ＜１１１＞Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ．ＵＳ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ：Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０１４、ＵＳＰ Ｃｈａｐｔｅｒ＜１０３３＞Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．ＵＳＰ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ：Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０１３、ＵＳＰ Ｃｈａｐｔｅｒ＜１０３４＞Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ．ＵＳ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ：Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０１３、Ｈａｕｃｋ，ｅｔ ａｌ．，ＰＤＡ Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，５９（２），１２７－１３７、Ｃａｌｌａｈａｎ ａｎｄ Ｓａｊｊａｄｉ，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｊ．２００３，２（２），７１－７７、Ｆｉｎｄｌａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．２０００，２１，１２４９－１２７３、及びＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ ａｎｄ Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．Ｓｔａｔ．２００５，１５（３），４３７－４６３に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、前述の方法は、ＵＳＰ＜１０３２＞Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に従って行われるデータ分析ステップとともに使用される。いくつかの実施形態では、前述の方法は、データがＵＳＰ＜１０３２＞Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ及びＵＳＰ＜１０３３＞Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ（これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる）に従ってログ変換されるデータ分析ステップとともに使用され、効力範囲にわたる測定における対称性、正規分布、及び変動性の均一性の要件を満たす。いくつかの実施形態では、前述の方法は、外れ値がＵＳＰ＜１０３４＞Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように評価され、分析から省略されるデータ分析ステップとともに使用される。いくつかの実施形態では、前述の方法は、線形回帰が、曲線の飽和に起因する最も高い濃度または最も低い濃度のいずれかのマスキング（必要であれば）を用いて、４点用量曲線にわたって行われるデータ分析ステップとともに使用される。いくつかの実施形態では、前述の方法は、少なくとも３つ、好ましくは４つの隣接する［用量－］濃度が使用されるデータ分析ステップとともに使用される。いくつかの実施形態では、前述の方法は、線形セグメントの勾配が十分に急であることが必要であるデータ分析ステップとともに使用される。いくつかの実施形態では、前述の方法は、線が標準に適合し、試験試料が直線であり、線が平行であることが必要であるデータ分析ステップとともに使用される。いくつかの実施形態では、前述の方法は、ＵＳＰ＜１０３２＞Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓに従って、ＴＩＬ被験試料と参照標準との間で平行線分析が行われるデータ分析ステップとともに使用され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、前述の方法は、平行度によって測定された参照標準とＴＩＬ被験試料との間の統計的類似性が、ＴＩＬ被験試料の参照標準に対する生物学的類似性を実証するデータ分析ステップとともに使用される。いくつかの実施形態では、前述の方法は、平行度勾配比、直線性比、回帰（Ｒ２）、及び二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）が計算され、報告されるデータ分析ステップとともに使用される。いくつかの実施形態では、前述の方法は、平行度及び直線性のアッセイの適合性及び妥当性をランク付けし、ＵＳＰ＜１０３３＞Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎによる制限内で妥当性基準に「合格」であるかまたは「不合格」であるかが決定されるデータ分析ステップとともに使用され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、前述の方法は、耐性のパーセントの範囲として９５％信頼区間内の相対効力が「報告可能」または「決定的でない」と決定されるデータ分析ステップとともに使用される。理論によって拘束されることはないが、ＵＳＰ＜１０３２＞Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓによれば、相対効力は、絶対値から導出される効力よりも好ましい。なぜなら、生体試料に固有の変動性及び細胞挙動の影響を時間の経過とともに無効にするキャリブレーターであるからである。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力を決定するための前述の方法のうちの１つを含み、他の効力アッセイ及び／または同一性アッセイと併せて前述の方法のうちの１つを使用して、効力アッセイ（もしくは効力及び同一性アッセイ）マトリックスを形成することをさらに含む。かかるマトリックスは、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力（もしくは効力及び同一性）を決定するための複数のステップを含む。効力アッセイマトリックスは、Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ’ｓ Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｐｏｔｅｎｃｙ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，２０１１，７６ Ｆｅｄ．Ｒｅｇ．９０２８に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明は、同種異系共培養アッセイ、例えば、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、またはＴｈｐ１標的細胞を使用する同種異系共培養アッセイ、ならびに少なくとも１つの追加のアッセイを含むマトリックスを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、同種異系共培養アッセイ、例えば、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、またはＴｈｐ１標的細胞を使用する同種異系共培養アッセイ、ならびに少なくとも２つの追加のアッセイを含むマトリックスを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、同種異系共培養アッセイ、例えば、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、またはＴｈｐ１標的細胞を使用する同種異系共培養アッセイ、ならびに少なくとも３つの追加のアッセイを含むマトリックスを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、同種異系共培養アッセイ、例えば、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、またはＴｈｐ１標的細胞を使用する同種異系共培養アッセイ、ならびに少なくとも４つの追加のアッセイを含むマトリックスを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、同種異系共培養アッセイ、例えば、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、またはＴｈｐ１標的細胞を使用する同種異系共培養アッセイ、ならびに少なくとも５つの追加のアッセイを含むマトリックスを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、同種異系共培養アッセイ、例えば、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、またはＴｈｐ１標的細胞を使用する同種異系共培養アッセイ、ならびに少なくとも６つの追加のアッセイを含むマトリックスを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、同種異系共培養アッセイ、例えば、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、またはＴｈｐ１標的細胞を使用する同種異系共培養アッセイ、ならびに少なくとも７つの追加のアッセイを含むマトリックスを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、同種異系共培養アッセイ、例えば、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、またはＴｈｐ１標的細胞を使用する同種異系共培養アッセイ、ならびに少なくとも８つの追加のアッセイを含むマトリックスを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、同種異系共培養アッセイ、例えば、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、またはＴｈｐ１標的細胞を使用する同種異系共培養アッセイ、ならびに少なくとも９つの追加のアッセイを含むマトリックスを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、同種異系共培養アッセイ、例えば、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、またはＴｈｐ１標的細胞を使用する同種異系共培養アッセイ、ならびに少なくとも１０の追加のアッセイを含むマトリックスを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、同種異系共培養アッセイ、例えば、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、またはＴｈｐ１標的細胞を使用する同種異系共培養アッセイ、ならびに少なくとも１１の追加のアッセイを含むマトリックスを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、同種異系共培養アッセイ、例えば、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、またはＴｈｐ１標的細胞を使用する同種異系共培養アッセイ、ならびに少なくとも１２の追加のアッセイを含むマトリックスを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定するための方法を含み、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、またはＴＮＦ－αのレベルは、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及び／または抗ＣＤ１３７抗体による刺激を含む、ビーズまたはプレートベースの刺激法によって測定される。かかる方法は、異なる機序を介してＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬの活性化を検出し、ＴＩＬ治療製品、ＭＩＬ治療製品、またはＰＢＬ治療製品の機能性または活性についてさらに報告するという点で、本明細書に記載の同種異系共培養アッセイと直交する。したがって、かかる方法は、本明細書に記載の効力アッセイマトリックスに、単独で、または本明細書に記載の同種異系共培養アッセイと併せて含めてもよい。好適なビーズ及びプレートベースの方法は、米国特許第１０，１３０，６５９号、同第１１，０８３，７５２号、同第１０，９１８，６６６号、同第１１，１６８，３０３号、及び同第１１，０２６，９７４号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１９／０２７６８０２Ａ１号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定するための方法を含み、ＴＣＭ細胞の数またはパーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定するための方法を含み、ＴＥＭ細胞の数またはパーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定するための方法を含み、ＴＳＣＭ細胞の数またはパーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定するための方法を含み、ＴＥＭＲＡ細胞の数またはパーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７－発現細胞のパーセンテージによるＴＥＭ細胞の測定によって決定され、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７－の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７＋発現細胞のパーセンテージによるＴＣＭ細胞の測定によって決定され、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７＋の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定するための方法を含み、全ＴＥＭ及びＴＣＭ細胞集団は、１００×１０６超、１５０×１０６超、２００×１０６超、２５０×１０６超、３００×１０６超、３５０×１０６超、４００×１０６超、４５０×１０６超、５００×１０６超、５５０×１０６超、６００×１０６超、６５０×１０６超、７００×１０６超、７５０×１０６超、８００×１０６超、８５０×１０６超、９００×１０６超、９５０×１０６超、１×１０９超、１．５×１０９超、２．０×１０９超、２．５×１０９超、３．０×１０９超、３．５×１０９超、４．０×１０９超、５．０×１０９超、６．０×１０９超、７．０×１０９超、８．０×１０９超、９．０×１０９超、または１０×１０９超の細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、ＣＤ８の発現パーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、ＣＤ８の測定は、フローサイトメトリーによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ８の測定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ８の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ８の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部であり、さらにアッセイマトリックスは、本明細書の他の箇所に記載されるアロ反応性共培養アッセイも含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ８の測定によって決定され、ＣＤ８の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、ＣＤ８の発現パーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、ＣＤ８の測定は、フローサイトメトリーによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ８の測定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ８の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ８の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部であり、さらにアッセイマトリックスは、本明細書の他の箇所に記載されるアロ反応性共培養アッセイも含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ８の測定によって決定され、ＣＤ８の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の２％超、３％超、４％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、ＣＤ４の発現パーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４の測定は、フローサイトメトリーによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ４の測定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ８の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ４の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部であり、さらにアッセイマトリックスは、本明細書の他の箇所に記載されるアロ反応性共培養アッセイも含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ４の測定によって決定され、ＣＤ４の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の２％超、３％超、４％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、ＣＤ４及びＣＤ８の両方の発現パーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４及びＣＤ８の両方の測定は、フローサイトメトリーによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ４及びＣＤ８の両方の測定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ４及びＣＤ８の両方の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ４及びＣＤ８の両方の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部であり、さらにアッセイマトリックスは、本明細書の他の箇所に記載されるアロ反応性共培養アッセイも含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ４及びＣＤ８の両方の測定によって決定され、ＣＤ４＋ＣＤ８の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定するための方法を含み、単一陽性ＣＤ４、単一陽性ＣＤ８、及び二重陽性サブセットを含む全ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞集団は、１００×１０６超、１５０×１０６超、２００×１０６超、２５０×１０６超、３００×１０６超、３５０×１０６超、４００×１０６超、４５０×１０６超、５００×１０６超、５５０×１０６超、６００×１０６超、６５０×１０６超、７００×１０６超、７５０×１０６超、８００×１０６超、８５０×１０６超、９００×１０６超、９５０×１０６超、１×１０９超、１．５×１０９超、２．０×１０９超、２．５×１０９超、３．０×１０９超、３．５×１０９超、４．０×１０９超、５．０×１０９超、６．０×１０９超、７．０×１０９超、８．０×１０９超、９．０×１０９超、または１０×１０９超の細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、ＬＡＧ３の発現パーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ３の測定は、フローサイトメトリーによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＬＡＧ３の測定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＬＡＧ３の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＬＡＧ３の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部であり、さらにアッセイマトリックスは、本明細書の他の箇所に記載されるアロ反応性共培養アッセイも含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＬＡＧ３の測定によって決定され、ＬＡＧ３の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、または９５％未満で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＬＡＧ３の測定によって決定され、ＬＡＧ３の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、ＬＡＧ３＋細胞の総数の測定によって決定され、ＬＡＧ３＋細胞の総数は、５０×１０６超、１００×１０６超、１５０×１０６超、２００×１０６超、２５０×１０６超、３００×１０６超、３５０×１０６超、４００×１０６超、４５０×１０６超、５００×１０６超、５５０×１０６超、６００×１０６超、６５０×１０６超、７００×１０６超、７５０×１０６超、８００×１０６超、８５０×１０６超、９００×１０６超、９５０×１０６超、１×１０９超、１．５×１０９超、２．０×１０９超、２．５×１０９超、３．０×１０９超、３．５×１０９超、４．０×１０９超、５．０×１０９超、６．０×１０９超、７．０×１０９超、８．０×１０９超、９．０×１０９超、または１０×１０９超の細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、ＫＬＲＧ１の発現パーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、ＫＬＲＧ１の測定は、フローサイトメトリーによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＫＬＲＧ１の測定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＫＬＲＧ１の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＫＬＲＧ１の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部であり、さらにアッセイマトリックスは、本明細書の他の箇所に記載されるアロ反応性共培養アッセイも含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＫＬＲＧ１の測定によって決定され、ＫＬＲＧ１の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、または９５％未満で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＫＬＲＧ１の測定によって決定され、ＫＬＲＧ１の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、ＫＬＲＧ１＋細胞の総数の測定によって決定され、ＫＬＲＧ１＋細胞の総数は、５０×１０６超、１００×１０６超、１５０×１０６超、２００×１０６超、２５０×１０６超、３００×１０６超、３５０×１０６超、４００×１０６超、４５０×１０６超、５００×１０６超、５５０×１０６超、６００×１０６超、６５０×１０６超、７００×１０６超、７５０×１０６超、８００×１０６超、８５０×１０６超、９００×１０６超、９５０×１０６超、１×１０９超、１．５×１０９超、２．０×１０９超、２．５×１０９超、３．０×１０９超、３．５×１０９超、４．０×１０９超、５．０×１０９超、６．０×１０９超、７．０×１０９超、８．０×１０９超、９．０×１０９超、または１０×１０９超の細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、ＣＤ１０１の発現パーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、ＣＤ１０１の測定は、フローサイトメトリーによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ１０１の測定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ１０１の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ１０１の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部であり、さらにアッセイマトリックスは、本明細書の他の箇所に記載されるアロ反応性共培養アッセイも含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ１０１の測定によって決定され、ＣＤ１０１の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、または９５％未満で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ１０１の測定によって決定され、ＣＤ１０１の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、ＣＤ１０１＋細胞の総数の測定によって決定され、ＣＤ１０１＋細胞の総数は、５０×１０６超、１００×１０６超、１５０×１０６超、２００×１０６超、２５０×１０６超、３００×１０６超、３５０×１０６超、４００×１０６超、４５０×１０６超、５００×１０６超、５５０×１０６超、６００×１０６超、６５０×１０６超、７００×１０６超、７５０×１０６超、８００×１０６超、８５０×１０６超、９００×１０６超、９５０×１０６超、１×１０９超、１．５×１０９超、２．０×１０９超、２．５×１０９超、３．０×１０９超、３．５×１０９超、４．０×１０９超、５．０×１０９超、６．０×１０９超、７．０×１０９超、８．０×１０９超、９．０×１０９超、または１０×１０９超の細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、ＣＤ６９の発現パーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、ＣＤ６９の測定は、フローサイトメトリーによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ６９の測定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ６９の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ６９の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部であり、さらにアッセイマトリックスは、本明細書の他の箇所に記載されるアロ反応性共培養アッセイも含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ６９の測定によって決定され、ＣＤ６９の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、または９５％未満で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ６９の測定によって決定され、ＣＤ６９の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、ＣＤ６９＋細胞の総数の測定によって決定され、ＣＤ６９＋細胞の総数は、５０×１０６超、１００×１０６超、１５０×１０６超、２００×１０６超、２５０×１０６超、３００×１０６超、３５０×１０６超、４００×１０６超、４５０×１０６超、５００×１０６超、５５０×１０６超、６００×１０６超、６５０×１０６超、７００×１０６超、７５０×１０６超、８００×１０６超、８５０×１０６超、９００×１０６超、９５０×１０６超、１×１０９超、１．５×１０９超、２．０×１０９超、２．５×１０９超、３．０×１０９超、３．５×１０９超、４．０×１０９超、５．０×１０９超、６．０×１０９超、７．０×１０９超、８．０×１０９超、９．０×１０９超、または１０×１０９超の細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、ＰＤ－１の発現パーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１の測定は、フローサイトメトリーによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＰＤ－１の測定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＰＤ－１の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＰＤ－１の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部であり、さらにアッセイマトリックスは、本明細書の他の箇所に記載されるアロ反応性共培養アッセイも含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＰＤ－１の測定によって決定され、ＰＤ－１の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、または９５％未満で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＰＤ－１の測定によって決定され、ＰＤ－１の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、ＰＤ－１＋細胞の総数の測定によって決定され、ＰＤ－１＋細胞の総数は、５０×１０６超、１００×１０６超、１５０×１０６超、２００×１０６超、２５０×１０６超、３００×１０６超、３５０×１０６超、４００×１０６超、４５０×１０６超、５００×１０６超、５５０×１０６超、６００×１０６超、６５０×１０６超、７００×１０６超、７５０×１０６超、８００×１０６超、８５０×１０６超、９００×１０６超、９５０×１０６超、１×１０９超、１．５×１０９超、２．０×１０９超、２．５×１０９超、３．０×１０９超、３．５×１０９超、４．０×１０９超、５．０×１０９超、６．０×１０９超、７．０×１０９超、８．０×１０９超、９．０×１０９超、または１０×１０９超の細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、ＴＩＭ３の発現パーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３の測定は、フローサイトメトリーによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＴＩＭ３の測定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＴＩＭ３の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＴＩＭ３の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部であり、さらにアッセイマトリックスは、本明細書の他の箇所に記載されるアロ反応性共培養アッセイも含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＴＩＭ３の測定によって決定され、ＴＩＭ３の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、または９５％未満で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＴＩＭ３の測定によって決定され、ＴＩＭ３の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、ＴＩＭ３＋細胞の総数の測定によって決定され、ＴＩＭ３＋細胞の総数は、５０×１０６超、１００×１０６超、１５０×１０６超、２００×１０６超、２５０×１０６超、３００×１０６超、３５０×１０６超、４００×１０６超、４５０×１０６超、５００×１０６超、５５０×１０６超、６００×１０６超、６５０×１０６超、７００×１０６超、７５０×１０６超、８００×１０６超、８５０×１０６超、９００×１０６超、９５０×１０６超、１×１０９超、１．５×１０９超、２．０×１０９超、２．５×１０９超、３．０×１０９超、３．５×１０９超、４．０×１０９超、５．０×１０９超、６．０×１０９超、７．０×１０９超、８．０×１０９超、９．０×１０９超、または１０×１０９超の細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、ＣＤ２５の発現パーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５の測定は、フローサイトメトリーによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ２５の測定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ２５の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ２５の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部であり、さらにアッセイマトリックスは、本明細書の他の箇所に記載されるアロ反応性共培養アッセイも含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ２５の測定によって決定され、ＣＤ２５の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、または９５％未満で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ２５の測定によって決定され、ＣＤ２５の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、ＣＤ２５＋細胞の総数の測定によって決定され、ＣＤ２５＋細胞の総数は、５０×１０６超、１００×１０６超、１５０×１０６超、２００×１０６超、２５０×１０６超、３００×１０６超、３５０×１０６超、４００×１０６超、４５０×１０６超、５００×１０６超、５５０×１０６超、６００×１０６超、６５０×１０６超、７００×１０６超、７５０×１０６超、８００×１０６超、８５０×１０６超、９００×１０６超、９５０×１０６超、１×１０９超、１．５×１０９超、２．０×１０９超、２．５×１０９超、３．０×１０９超、３．５×１０９超、４．０×１０９超、５．０×１０９超、６．０×１０９超、７．０×１０９超、８．０×１０９超、９．０×１０９超、または１０×１０９超の細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、ＣＤ２７の発現パーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２７の測定は、フローサイトメトリーによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ２７の測定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ２７の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ２７の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部であり、さらにアッセイマトリックスは、本明細書の他の箇所に記載されるアロ反応性共培養アッセイも含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ２７の測定によって決定され、ＣＤ２７の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、または９５％未満で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ２７の測定によって決定され、ＣＤ２７の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、ＣＤ２７＋細胞の総数の測定によって決定され、ＣＤ２７＋細胞の総数は、５０×１０６超、１００×１０６超、１５０×１０６超、２００×１０６超、２５０×１０６超、３００×１０６超、３５０×１０６超、４００×１０６超、４５０×１０６超、５００×１０６超、５５０×１０６超、６００×１０６超、６５０×１０６超、７００×１０６超、７５０×１０６超、８００×１０６超、８５０×１０６超、９００×１０６超、９５０×１０６超、１×１０９超、１．５×１０９超、２．０×１０９超、２．５×１０９超、３．０×１０９超、３．５×１０９超、４．０×１０９超、５．０×１０９超、６．０×１０９超、７．０×１０９超、８．０×１０９超、９．０×１０９超、または１０×１０９超の細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、ＣＤ２８の発現パーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８の測定は、フローサイトメトリーによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ２８の測定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ２８の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ２８の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部であり、さらにアッセイマトリックスは、本明細書の他の箇所に記載されるアロ反応性共培養アッセイも含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ２８の測定によって決定され、ＣＤ２８の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、または９５％未満で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ２８の測定によって決定され、ＣＤ２８の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、ＣＤ２８＋細胞の総数の測定によって決定され、ＣＤ２８＋細胞の総数は、５０×１０６超、１００×１０６超、１５０×１０６超、２００×１０６超、２５０×１０６超、３００×１０６超、３５０×１０６超、４００×１０６超、４５０×１０６超、５００×１０６超、５５０×１０６超、６００×１０６超、６５０×１０６超、７００×１０６超、７５０×１０６超、８００×１０６超、８５０×１０６超、９００×１０６超、９５０×１０６超、１×１０９超、１．５×１０９超、２．０×１０９超、２．５×１０９超、３．０×１０９超、３．５×１０９超、４．０×１０９超、５．０×１０９超、６．０×１０９超、７．０×１０９超、８．０×１０９超、９．０×１０９超、または１０×１０９超の細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、ＣＤ５６の発現パーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６の測定は、フローサイトメトリーによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ５６の測定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ５６の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ５６の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部であり、さらにアッセイマトリックスは、本明細書の他の箇所に記載されるアロ反応性共培養アッセイも含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ５６の測定によって決定され、ＣＤ５６の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、または９５％未満で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ５６の測定によって決定され、ＣＤ５６の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、ＣＤ５６＋細胞の総数の測定によって決定され、ＣＤ５６＋細胞の総数は、５０×１０６超、１００×１０６超、１５０×１０６超、２００×１０６超、２５０×１０６超、３００×１０６超、３５０×１０６超、４００×１０６超、４５０×１０６超、５００×１０６超、５５０×１０６超、６００×１０６超、６５０×１０６超、７００×１０６超、７５０×１０６超、８００×１０６超、８５０×１０６超、９００×１０６超、９５０×１０６超、１×１０９超、１．５×１０９超、２．０×１０９超、２．５×１０９超、３．０×１０９超、３．５×１０９超、４．０×１０９超、５．０×１０９超、６．０×１０９超、７．０×１０９超、８．０×１０９超、９．０×１０９超、または１０×１０９超の細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、ＣＤ５７の発現パーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、ＣＤ５７の測定は、フローサイトメトリーによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ５７の測定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ５７の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ５７の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部であり、さらにアッセイマトリックスは、本明細書の他の箇所に記載されるアロ反応性共培養アッセイも含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ５７の測定によって決定され、ＣＤ５７の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、または９５％未満で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＤ５７の測定によって決定され、ＣＤ５７の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、ＣＤ５７＋細胞の総数の測定によって決定され、ＣＤ５７＋細胞の総数は、５０×１０６超、１００×１０６超、１５０×１０６超、２００×１０６超、２５０×１０６超、３００×１０６超、３５０×１０６超、４００×１０６超、４５０×１０６超、５００×１０６超、５５０×１０６超、６００×１０６超、６５０×１０６超、７００×１０６超、７５０×１０６超、８００×１０６超、８５０×１０６超、９００×１０６超、９５０×１０６超、１×１０９超、１．５×１０９超、２．０×１０９超、２．５×１０９超、３．０×１０９超、３．５×１０９超、４．０×１０９超、５．０×１０９超、６．０×１０９超、７．０×１０９超、８．０×１０９超、９．０×１０９超、または１０×１０９超の細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞製品の効力を決定する方法を含み、ＣＴＬＡ－４の発現パーセンテージが測定される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４の測定は、フローサイトメトリーによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＴＬＡ－４の測定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＴＬＡ－４の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＴＬＡ－４の測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部であり、さらにアッセイマトリックスは、本明細書の他の箇所に記載されるアロ反応性共培養アッセイも含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＴＬＡ－４の測定によって決定され、ＣＴＬＡ－４の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、または９５％未満で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＣＴＬＡ－４の測定によって決定され、ＣＴＬＡ－４の発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、ＣＴＬＡ－４＋細胞の総数の測定によって決定され、ＣＴＬＡ－４＋細胞の総数は、５０×１０６超、１００×１０６超、１５０×１０６超、２００×１０６超、２５０×１０６超、３００×１０６超、３５０×１０６超、４００×１０６超、４５０×１０６超、５００×１０６超、５５０×１０６超、６００×１０６超、６５０×１０６超、７００×１０６超、７５０×１０６超、８００×１０６超、８５０×１０６超、９００×１０６超、９５０×１０６超、１×１０９超、１．５×１０９超、２．０×１０９超、２．５×１０９超、３．０×１０９超、３．５×１０９超、４．０×１０９超、５．０×１０９超、６．０×１０９超、７．０×１０９超、８．０×１０９超、９．０×１０９超、または１０×１０９超の細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＧＩＴの発現パーセンテージが測定される、Ｔ細胞製品の効力を決定するための方法を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴの測定は、フローサイトメトリーによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＴＩＧＩＴの測定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＴＩＧＩＴの測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＴＩＧＩＴの測定によって決定され、測定は、アッセイマトリックスに従って行われる一連の測定の一部であり、さらにアッセイマトリックスは、本明細書の他の箇所に記載されるアロ反応性共培養アッセイも含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＴＩＧＩＴの測定によって決定され、ＴＩＧＩＴの発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、または９５％未満で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、フローサイトメトリーによるＴＩＧＩＴの測定によって決定され、ＴＩＧＩＴの発現は、ＣＤ３＋細胞またはＴＣＲαβ陽性細胞の５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超で検出される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の効力は、ＴＩＧＩＴ＋細胞の総数の測定によって決定され、ＴＩＧＩＴ＋細胞の総数は、５０×１０６超、１００×１０６超、１５０×１０６超、２００×１０６超、２５０×１０６超、３００×１０６超、３５０×１０６超、４００×１０６超、４５０×１０６超、５００×１０６超、５５０×１０６超、６００×１０６超、６５０×１０６超、７００×１０６超、７５０×１０６超、８００×１０６超、８５０×１０６超、９００×１０６超、９５０×１０６超、１×１０９超、１．５×１０９超、２．０×１０９超、２．５×１０９超、３．０×１０９超、３．５×１０９超、４．０×１０９超、５．０×１０９超、６．０×１０９超、７．０×１０９超、８．０×１０９超、９．０×１０９超、または１０×１０９超の細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、当該技術分野で知られているように、ＦｏｘＰ３＋細胞に対する細胞内染色フローサイトメトリーアッセイを含む、Ｔｒｅｇ細胞の含有量が測定されるアッセイを含む、効力または同一性アッセイマトリックスを含む。
ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体に結合可能な標的細胞を使用してＴ細胞製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、少なくとも１つの他の効力アッセイを含む効力アッセイマトリックスで使用される。ある実施形態では、本発明は、Ｔ細胞またはＴＩＬ、ＭＩＬ、もしくはＰＢＬ ＴＣＲ複合体と、標的細胞のＨＬＡ－ペプチド複合体との同種異系相互作用（ＭＨＣ優性認識とも称される）に基づくアッセイを含み、このアッセイは、少なくとも１つの他の効力アッセイを含む効力アッセイマトリックスで使用される。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で１２～４８時間行うステップと、
ｂ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｃ．上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で１２～４８時間行うステップと、
ｂ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｃ．上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロンγについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、単球系細胞である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、少なくとも３つの異なる標的細胞濃度で約２４時間行うステップと、
ｂ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｃ．上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロンγについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、Ｔｈｐ１細胞もしくはＵ９３７細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、相対効力は、ＴＩＬ参照標準を使用した平行線分析によって決定される。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞との標的細胞の４つの共培養を、４つの異なる標的細胞濃度で１２～４８時間行うステップと、
ｂ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｃ．上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロンγについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、相対効力は、ステップａ～ｃを複製する別個の一連の実験におけるＴＩＬ参照標準物を使用した平行線分析によって決定される。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ｄ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞との標的細胞の４つの共培養を、４つの異なる標的細胞濃度で１２～４８時間行うステップと、
ｅ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｆ．上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロンγについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、相対効力は、ステップａ～ｃを複製する別個の一連の実験におけるＴＩＬ参照標準物を使用して平行線分析によって決定され、１ウェル当たり４×１０５、２×１０５、１×１０５、及び０．５×１０５細胞の４つの標的細胞用量濃度、ならびに１ウェル当たり１．５×１０６ＴＩＬの単一のＴＩＬ細胞濃度が使用される。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞との標的細胞の４つの共培養を、４つの異なる標的細胞濃度で１２～４８時間行うステップと、
ｂ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｃ．上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロンγについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、相対効力は、ステップａ～ｃを複製する別個の一連の実験におけるＴＩＬ参照標準物を使用して平行線分析によって決定され、１ウェル当たり４×１０５、２×１０５、１×１０５、及び０．５×１０５細胞の４つの標的細胞用量濃度、ならびに１ウェル当たり１．５×１０６ＴＩＬの単一のＴＩＬ細胞濃度が使用され、前述の方法は、サイトカインについてのビーズまたはプレートベースのアッセイ、総生細胞についてのアッセイ、生細胞パーセンテージについてのアッセイ、ＣＤ４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＬＡＧ３＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＫＬＲＧ１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ１０１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ６９＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＳＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭＲＡ細胞含有量についてのアッセイ、Ｔｒｅｇ細胞含有量についてのアッセイ、ＰＤ－１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＭ３＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２５＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２７＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ５６＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＴＬＡ－４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＧＩＴ＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＣＤ５７＋細胞含有量についてのアッセイからなる群から選択される少なくとも１つの他のアッセイを含む効力アッセイマトリックスの構成要素である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞との標的細胞の４つの共培養を、４つの異なる標的細胞濃度で１２～４８時間行うステップと、
ｂ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｃ．上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロンγについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、相対効力は、ステップａ～ｃを複製する別個の一連の実験におけるＴＩＬ参照標準物を使用して平行線分析によって決定され、１ウェル当たり４×１０５、２×１０５、１×１０５、及び０．５×１０５細胞の４つの標的細胞用量濃度、ならびに１ウェル当たり１．５×１０６ＴＩＬの単一のＴＩＬ細胞濃度が使用され、前述の方法は、ＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ１３７刺激を使用し、インターフェロン－γ、グランザイムＢ、または腫瘍壊死因子－αを報告するビーズまたはプレートベースのアッセイ、総生細胞についてのアッセイ、生細胞パーセンテージについてのアッセイ、ＣＤ４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＬＡＧ３＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＫＬＲＧ１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ１０１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ６９＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＳＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭＲＡ細胞含有量についてのアッセイ、Ｔｒｅｇ細胞含有量についてのアッセイ、ＰＤ－１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＭ３＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２５＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２７＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ５６＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＴＬＡ－４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＧＩＴ＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＣＤ５７＋細胞含有量についてのアッセイからなる群から選択される少なくとも１つの他のアッセイを含む効力アッセイマトリックスの構成要素である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞との標的細胞の４つの共培養を、４つの異なる標的細胞濃度で約２４時間行うステップと、
ｂ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｃ．上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロンγについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、相対効力は、ステップａ～ｃを複製する別個の一連の実験におけるＴＩＬ参照標準物を使用して平行線分析によって決定され、１ウェル当たり４×１０５、２×１０５、１×１０５、及び０．５×１０５細胞の４つの標的細胞用量濃度、ならびに１ウェル当たり１．５×１０６ＴＩＬの単一のＴＩＬ細胞濃度が使用され、１つの外れ値用量濃度が破棄され得、前述の方法は、ＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ１３７刺激を使用し、インターフェロン－γ、グランザイムＢ、または腫瘍壊死因子－αを報告するビーズまたはプレートベースのアッセイ、総生細胞についてのアッセイ、生細胞パーセンテージについてのアッセイ、ＣＤ４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＬＡＧ３＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＫＬＲＧ１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ１０１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ６９＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＳＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭＲＡ細胞含有量についてのアッセイ、Ｔｒｅｇ細胞含有量についてのアッセイ、ＰＤ－１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＭ３＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２５＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２７＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ５６＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＴＬＡ－４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＧＩＴ＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＣＤ５７＋細胞含有量についてのアッセイからなる群から選択される少なくとも１つの他のアッセイを含む効力アッセイマトリックスの構成要素である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品からのＴＩＬ細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で１２～４８時間行うステップと、
ｂ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｃ．上清を、ＴＩＬ細胞から分泌されたインターフェロンγについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、単球系細胞であり、相対効力は、ステップａ～ｃを複製する別個の一連の実験におけるＴＩＬ参照標準物を使用して平行線分析によって決定され、１ウェル当たり４×１０５、２×１０５、１×１０５、及び０．５×１０５細胞の４つの標的細胞用量濃度、ならびに１ウェル当たり１．５×１０６ＴＩＬの単一のＴＩＬ細胞濃度が使用され、１つの外れ値用量濃度が破棄され得、前述の方法は、ＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ１３７刺激を使用し、インターフェロン－γ、グランザイムＢ、または腫瘍壊死因子－αを報告するビーズまたはプレートベースのアッセイ、総生細胞についてのアッセイ、生細胞パーセンテージについてのアッセイ、ＣＤ４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＬＡＧ３＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＫＬＲＧ１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ１０１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ６９＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＳＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭＲＡ細胞含有量についてのアッセイ、Ｔｒｅｇ細胞含有量についてのアッセイ、ＰＤ－１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＭ３＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２５＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２７＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ５６＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＴＬＡ－４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＧＩＴ＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＣＤ５７＋細胞含有量についてのアッセイからなる群から選択される少なくとも１つの他のアッセイを含む効力アッセイマトリックスの構成要素である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．異なる標的細胞またはＴＩＬ製品細胞濃度のＴＩＬ製品細胞との標的細胞の複数の共培養を行うステップと、
ｂ．異なる標的細胞またはＴＩＬ参照標準細胞濃度のＴＩＬ参照標準細胞との標的細胞の複数の共培養を行うステップと、
ｃ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｄ．上清を、ＴＩＬ製品細胞及びＴＩＬ参照標準細胞から分泌されたサイトカインについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、単球系細胞である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品細胞との標的細胞の複数の共培養を、異なる標的細胞濃度で行うステップと、
ｂ．ＴＩＬ参照標準細胞との標的細胞の複数の共培養を、異なる標的細胞濃度で行うステップと、
ｃ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｄ．上清を、ＴＩＬ製品細胞及びＴＩＬ参照標準細胞から分泌されたサイトカインについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、単球系細胞である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品細胞との標的細胞の複数の共培養を、異なる標的細胞濃度で１２～４８時間行うステップと、
ｂ．ＴＩＬ参照標準細胞との標的細胞の複数の共培養を、異なる標的細胞濃度で１２～４８時間行うステップと、
ｃ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｄ．上清を、ＴＩＬ製品細胞及びＴＩＬ参照標準細胞から分泌されたサイトカインについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、単球系細胞である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品細胞との標的細胞の複数の共培養を、異なる標的細胞濃度で１２～４８時間行うステップと、
ｂ．ＴＩＬ参照標準細胞との標的細胞の複数の共培養を、異なる標的細胞濃度で１２～４８時間行うステップと、
ｃ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｄ．上清を、ＴＩＬ製品細胞及びＴＩＬ参照標準細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、Ｕ９３７またはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品細胞との標的細胞の複数の共培養を、異なる標的細胞濃度で１２～４８時間行うステップと、
ｂ．ＴＩＬ参照標準細胞との標的細胞の複数の共培養を、異なる標的細胞濃度で１２～４８時間行うステップと、
ｃ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｄ．上清を、ＴＩＬ製品細胞及びＴＩＬ参照標準細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、単球系細胞であり、前述の方法は、少なくとも１つの他のアッセイを含む効力アッセイマトリックスの構成要素である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品細胞との標的細胞の複数の共培養を、異なる標的細胞濃度で１２～４８時間行うステップと、
ｂ．ＴＩＬ参照標準細胞との標的細胞の複数の共培養を、異なる標的細胞濃度で１２～４８時間行うステップと、
ｃ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｄ．上清を、ＴＩＬ製品細胞及びＴＩＬ参照標準細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、Ｕ９３７もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、前述の方法は、少なくとも１つの他のアッセイを含む効力アッセイマトリックスの構成要素である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で１２～４８時間行うステップと、
ｂ．ＴＩＬ参照標準細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で１２～４８時間行うステップと、
ｃ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｄ．上清を、ＴＩＬ製品細胞及びＴＩＬ参照標準細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、Ｕ９３７もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、前述の方法は、少なくとも１つの他のアッセイを含む効力アッセイマトリックスの構成要素である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で約２４時間行うステップと、
ｂ．ＴＩＬ参照標準細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で約２４時間行うステップと、
ｃ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｄ．上清を、ＴＩＬ製品細胞及びＴＩＬ参照標準細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、Ｕ９３７もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、前述の方法は、少なくとも１つの他のアッセイを含む効力アッセイマトリックスの構成要素である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で約２４時間行うステップと、
ｂ．ＴＩＬ参照標準細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で約２４時間行うステップと、
ｃ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｄ．上清を、ＴＩＬ製品細胞及びＴＩＬ参照標準細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、Ｕ９３７もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、１ウェル当たり４×１０５、２×１０５、１×１０５、及び０．５×１０５細胞の４つの標的細胞用量濃度、ならびに１ウェル当たり１．５×１０６ＴＩＬの単一のＴＩＬ細胞濃度が使用され、１つの外れ値用量濃度が破棄され得、前述の方法は、ＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ１３７刺激を使用し、インターフェロン－γ、グランザイムＢ、または腫瘍壊死因子－αを報告するビーズまたはプレートベースのアッセイ、総生細胞についてのアッセイ、生細胞パーセンテージについてのアッセイ、ＣＤ４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＬＡＧ３＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＫＬＲＧ１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ１０１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ６９＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＳＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭＲＡ細胞含有量についてのアッセイ、Ｔｒｅｇ細胞含有量についてのアッセイ、ＰＤ－１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＭ３＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２５＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２７＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ５６＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＴＬＡ－４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＧＩＴ＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＣＤ５７＋細胞含有量についてのアッセイからなる群から選択される少なくとも１つの他のアッセイを含む効力アッセイマトリックスの構成要素である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で約２４時間行うステップと、
ｂ．ＴＩＬ参照標準細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で約２４時間行うステップと、
ｃ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｄ．上清を、ＴＩＬ製品細胞及びＴＩＬ参照標準細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、Ｕ９３７もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、１ウェル当たり４×１０５、２×１０５、１×１０５、及び０．５×１０５細胞の４つの標的細胞用量濃度、ならびに１ウェル当たり１．５×１０６ＴＩＬの単一のＴＩＬ細胞濃度が使用され（各々が少なくとも２つの複製で行われる）、１つの外れ値用量濃度が破棄され得、前述の方法は、ＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ１３７刺激を使用し、インターフェロン－γ、グランザイムＢ、または腫瘍壊死因子－αを報告するビーズまたはプレートベースのアッセイ、総生細胞についてのアッセイ、生細胞パーセンテージについてのアッセイ、ＣＤ４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＬＡＧ３＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＫＬＲＧ１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ１０１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ６９＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＳＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭＲＡ細胞含有量についてのアッセイ、Ｔｒｅｇ細胞含有量についてのアッセイ、ＰＤ－１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＭ３＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２５＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２７＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ５６＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＴＬＡ－４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＧＩＴ＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＣＤ５７＋細胞含有量についてのアッセイからなる群から選択される少なくとも１つの他のアッセイを含む効力アッセイマトリックスの構成要素である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で約２４時間行うステップと、
ｂ．ＴＩＬ参照標準細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で約２４時間行うステップと、
ｃ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｄ．上清を、ＴＩＬ製品細胞及びＴＩＬ参照標準細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、Ｕ９３７もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、１ウェル当たり４×１０５、２×１０５、１×１０５、及び０．５×１０５細胞の４つの標的細胞用量濃度、ならびに１ウェル当たり１．５×１０６ＴＩＬの単一のＴＩＬ細胞濃度が使用され（各々が少なくとも２つの複製で行われる）、１つの外れ値用量濃度が破棄され得、前述の方法は、ＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ１３７刺激を使用し、インターフェロン－γ、グランザイムＢ、または腫瘍壊死因子－αを報告するビーズまたはプレートベースのアッセイ、総生細胞についてのアッセイ、生細胞パーセンテージについてのアッセイ、ＣＤ４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＬＡＧ３＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＫＬＲＧ１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ１０１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ６９＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＳＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭＲＡ細胞含有量についてのアッセイ、Ｔｒｅｇ細胞含有量についてのアッセイ、ＰＤ－１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＭ３＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２５＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２７＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ５６＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＴＬＡ－４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＧＩＴ＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＣＤ５７＋細胞含有量についてのアッセイからなる群から選択される少なくとも３つの他のアッセイを含む効力アッセイマトリックスの構成要素である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で約２４時間行うステップと、
ｂ．ＴＩＬ参照標準細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で約２４時間行うステップと、
ｃ．共培養の各々から上清を抽出するステップと、
ｄ．上清を、ＴＩＬ製品細胞及びＴＩＬ参照標準細胞から分泌されたインターフェロン－γについて評価して、ＴＩＬ製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
標的細胞は、Ｕ９３７もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、１ウェル当たり４×１０５、２×１０５、１×１０５、及び０．５×１０５細胞の４つの標的細胞用量濃度、ならびに１ウェル当たり１．５×１０６ＴＩＬの単一のＴＩＬ細胞濃度が使用され（各々が少なくとも２つの複製で行われる）、１つの外れ値用量濃度が破棄され得、前述の方法は、ＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ１３７刺激を使用し、インターフェロン－γ、グランザイムＢ、または腫瘍壊死因子－αを報告するビーズまたはプレートベースのアッセイ、総生細胞についてのアッセイ、生細胞パーセンテージについてのアッセイ、ＣＤ４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＬＡＧ３＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＫＬＲＧ１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ１０１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ６９＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＳＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭＲＡ細胞含有量についてのアッセイ、Ｔｒｅｇ細胞含有量についてのアッセイ、ＰＤ－１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＭ３＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２５＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２７＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ５６＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＴＬＡ－４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＧＩＴ＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＣＤ５７＋細胞含有量についてのアッセイからなる群から選択される少なくとも５つの他のアッセイを含む効力アッセイマトリックスの構成要素である。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ生成物の効力を決定する方法を含み、この方法は、マルチチャネル及びマルチカラーのフローサイトメーターを含む、フローサイトメーターを使用してフローサイトメトリー分析を行うステップを含む。好適なフローサイトメーター及び方法は、米国特許第９，６４５，０１０号、同第１０，８１６，５５０号、同第１０，１３７，４７９号、同第９，４５３，７９１号、同第１０，９３５，４８２号、同第１０，６４８，９００号、同第９，３４１，５６２号、同第９，６７７，９８９号、同第４，７１０，６３５号、同第４，６６２，７４２号、同第４，６６０，９７１号、同第４，８１８，１０３号、同第５，０５７，４１３号、同第５，６４１，４５７号、同第５，６２０，８４２号、同第５，９８５，２１６号、同第６，０７９，８３６号、同第６，４９５，３３３号、同第６，２５６，０９６号、同第６，４８２，６５２号、同第６，７００，１３０号、同第７，８５５，０７８号、同第７，９９０，５２５号、及び同第１０，４３６，６９８号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２００１／０００６４１６Ａ１号及び同第ＵＳ２００２／０１８６３７５Ａ１号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、前述のフローサイトメトリー方法は、本明細書に記載の同種異系共培養アッセイと組み合わせられる。いくつかの実施形態では、前述のフローサイトメトリー方法は、ＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ１３７刺激を使用し、ＥＬＩＳＡベースの方法によってインターフェロン－γ、グランザイムＢ、または腫瘍壊死因子－αを報告する、ビーズまたはプレートベースのアッセイと組み合わせられる。
いくつかの実施形態では、前述の共培養は、インキュベーター内で行われる。いくつかの実施形態では、前述の共培養は、約４０℃でインキュベーター内で行われる。いくつかの実施形態では、前述の共培養は、約３５℃でインキュベーター内で行われる。いくつかの実施形態では、前述の共培養は、約３７℃でインキュベーター内で行われる。いくつかの実施形態では、前述の共培養は、約５％のＣＯ２ガスを伴うインキュベーター内で行われる。いくつかの実施形態では、前述の共培養は、約１０％のＣＯ２ガスを伴うインキュベーター内で行われる。いくつかの実施形態では、前述の共培養は、約１５％のＣＯ２ガスを伴うインキュベーター内で行われる。いくつかの実施形態では、前述の共培養は、約２０％のＣＯ２ガスを伴うインキュベーター内で行われる。いくつかの実施形態では、前述の共培養は、加湿を伴うインキュベーター内で行われる。
Ｂ．アッセイ組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品などのＴＩＬ、及び標的細胞を含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品などのＴＩＬ、及び標的細胞を培地中に含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品などのＴＩＬ、及び標的細胞を含む組成物を含み、標的細胞は、Ｒａｊｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品などのＴＩＬ、及び陰性対照細胞を含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品などのＴＩＬ、及び陰性対照細胞を培地中に含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品などのＴＩＬ、及び標的細胞を含む組成物を含み、陰性対照細胞は、Ｋ５６２細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、本発明は、任意選択で分泌タンパク質を含有する、本明細書に記載の共培養アッセイから取得された上清を含む組成物を含む。
ある実施形態では、本発明は、培地（ＡＩＭ－Ｖ培地など）と、Ｒａｊｉ細胞株、Ｔｈｐ１細胞株、Ｒａｍｏｓ細胞株、Ｕ９３７細胞株、Ｄａｕｄｉ細胞株、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞株からの少なくとも１つの細胞と、ＩＬ－２と、を含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、ＡＩＭ－Ｖ培地と、Ｒａｊｉ細胞株、Ｔｈｐ１細胞株、Ｒａｍｏｓ細胞株、Ｕ９３７細胞株、Ｄａｕｄｉ細胞株、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞株からの少なくとも１つの細胞と、ＩＬ－２と、を含む組成物を含み、ＩＬ－２は、共培養中に連続的に添加される。ある実施形態では、本発明は、ＡＩＭ－Ｖ培地と、Ｒａｊｉ細胞株、Ｔｈｐ１細胞株、Ｒａｍｏｓ細胞株、Ｕ９３７細胞株、Ｄａｕｄｉ細胞株、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞株からの少なくとも１つの細胞と、ＩＬ－２と、を含む組成物を含み、ＩＬ－２は、共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、共培養中に５０ＩＵ／ｍＬ～１０００ＩＵ／ｍＬの濃度で維持される。ある実施形態では、本発明は、ＡＩＭ－Ｖ培地と、Ｒａｊｉ細胞株、Ｔｈｐ１細胞株、Ｒａｍｏｓ細胞株、Ｕ９３７細胞株、Ｄａｕｄｉ細胞株、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞株からの少なくとも１つの細胞と、ＩＬ－２と、を含む組成物を含み、ＩＬ－２は、共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、共培養中に１００ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬの濃度で維持される。ある実施形態では、本発明は、ＡＩＭ－Ｖ培地と、Ｒａｊｉ細胞株、Ｔｈｐ１細胞株、Ｒａｍｏｓ細胞株、Ｕ９３７細胞株、Ｄａｕｄｉ細胞株、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞株からの少なくとも１つの細胞と、ＩＬ－２と、を含む組成物を含み、ＩＬ－２は、共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、共培養中に２００ＩＵ／ｍＬ～４００ＩＵ／ｍＬの濃度で維持される。ある実施形態では、本発明は、ＡＩＭ－Ｖ培地と、Ｒａｊｉ細胞株、Ｔｈｐ１細胞株、Ｒａｍｏｓ細胞株、Ｕ９３７細胞株、Ｄａｕｄｉ細胞株、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞株からの少なくとも１つの細胞と、ＩＬ－２と、を含む組成物を、約５０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約３５０ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約４５０ＩＵ／ｍＬ、及び約５００ＩＵ／ｍＬからなる群から選択される濃度で含む。ある実施形態では、本発明は、標的細胞を含む組成物を含み、標的細胞は、Ｒａｊｉ細胞とＴｈｐ１細胞との組み合わせであり、Ｒａｊｉ細胞対Ｔｈｐ１細胞の比は、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、及び１：５からなる群から選択される。ある実施形態では、本発明は、標的細胞を含む組成物を含み、標的細胞は、Ｒａｊｉ細胞とＲａｍｏｓ細胞との組み合わせであり、Ｒａｊｉ細胞対Ｒａｍｏｓ細胞の比は、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、及び１：５からなる群から選択される。ある実施形態では、本発明は、標的細胞を含む組成物を含み、標的細胞は、Ｒａｊｉ細胞とＵ９３７細胞との組み合わせであり、Ｒａｊｉ細胞対Ｕ９３７細胞の比は、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、及び１：５からなる群から選択される。ある実施形態では、本発明は、標的細胞を含む組成物を含み、標的細胞は、Ｒａｊｉ細胞とＤａｕｄｉ細胞との組み合わせであり、Ｒａｊｉ細胞対Ｄａｕｄｉ細胞の比は、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、及び１：５からなる群から選択される。
ある実施形態では、本発明は、培地（ＡＩＭ－Ｖ培地など）と、Ｂ細胞株、Ｂ細胞リンパ芽腫細胞株、バーキットリンパ腫細胞株、骨髄系細胞株、単球細胞株、急性単球性白血病細胞、Ｍ５サブタイプ急性単球性白血病細胞、黒色細胞株、黒色腫細胞株、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞株からの少なくとも１つの細胞と、ＩＬ－２と、を含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、ＡＩＭ－Ｖ培地と、Ｂ細胞株、Ｂ細胞リンパ芽腫細胞株、バーキットリンパ腫細胞株、骨髄系細胞株、単球細胞株、急性単球性白血病細胞、Ｍ５サブタイプ急性単球性白血病細胞、黒色細胞株、黒色腫細胞株、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞株からの少なくとも１つの細胞と、ＩＬ－２と、を含む組成物を含み、ＩＬ－２は、共培養中に連続的に添加される。ある実施形態では、本発明は、ＡＩＭ－Ｖ培地と、Ｂ細胞株、Ｂ細胞リンパ芽腫細胞株、バーキットリンパ腫細胞株、骨髄系細胞株、単球細胞株、急性単球性白血病細胞、Ｍ５サブタイプ急性単球性白血病細胞、黒色細胞株、黒色腫細胞株、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞株からの少なくとも１つの細胞と、ＩＬ－２と、を含む組成物を含み、ＩＬ－２は、共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、共培養中に５０ＩＵ／ｍＬ～１０００ＩＵ／ｍＬの濃度で維持される。ある実施形態では、本発明は、ＡＩＭ－Ｖ培地と、Ｂ細胞株、Ｂ細胞リンパ芽腫細胞株、バーキットリンパ腫細胞株、骨髄系細胞株、単球細胞株、急性単球性白血病細胞、Ｍ５サブタイプ急性単球性白血病細胞、黒色細胞株、黒色腫細胞株、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞株からの少なくとも１つの細胞と、ＩＬ－２と、を含む組成物を含み、ＩＬ－２は、共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、共培養中に１００ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬの濃度で維持される。ある実施形態では、本発明は、ＡＩＭ－Ｖ培地と、Ｂ細胞株、Ｂ細胞リンパ芽腫細胞株、バーキットリンパ腫細胞株、骨髄系細胞株、単球細胞株、急性単球性白血病細胞、Ｍ５サブタイプ急性単球性白血病細胞、黒色細胞株、黒色腫細胞株、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞株からの少なくとも１つの細胞と、ＩＬ－２と、を含む組成物を含み、ＩＬ－２は、共培養中に連続的に添加され、ＩＬ－２は、共培養中に２００ＩＵ／ｍＬ～４００ＩＵ／ｍＬの濃度で維持される。ある実施形態では、本発明は、ＡＩＭ－Ｖ培地と、Ｂ細胞株、Ｂ細胞リンパ芽腫細胞株、バーキットリンパ腫細胞株、骨髄系細胞株、単球細胞株、急性単球性白血病細胞、Ｍ５サブタイプ急性単球性白血病細胞、黒色細胞株、黒色腫細胞株、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞株からの少なくとも１つの細胞と、ＩＬ－２と、を含む組成物を、約５０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約３５０ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約４５０ＩＵ／ｍＬ、及び約５００ＩＵ／ｍＬからなる群から選択される濃度で含む。
ある実施形態では、標的細胞の先行実施形態のうちのいずれかは、照射された標的細胞を含む。ある実施形態では、標的細胞の先行実施形態のうちのいずれかは、照射されていない標的細胞を含む。ある実施形態では、陰性対照細胞の先行実施形態のうちのいずれかは、照射された陰性対照細胞を含む。ある実施形態では、陰性対照細胞の先行実施形態のうちのいずれかは、照射されていない陰性対照細胞を含む。
ある実施形態では、本発明は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＱ（Ａ１）、ＨＬＡ－ＤＱ（Ａ２）、ＨＬＡ－ＤＲ（Ｂ１）、ＨＬＡ－ＤＰ（Ｂ１）、ＨＬＡ－ＤＰ（Ｂ２）、またはそれらの組み合わせを発現する標的細胞株または標的細胞株の組み合わせを含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、標的細胞株または標的細胞株の組み合わせが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＱ（Ａ１）、ＨＬＡ－ＤＱ（Ａ２）、ＨＬＡ－ＤＲ（Ｂ１）、ＨＬＡ－ＤＰ（Ｂ１）、ＨＬＡ－ＤＰ（Ｂ２）、またはそれらの組み合わせを発現し、本明細書に記載の方法によって調製されたＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬの集団をさらに含む、効力アッセイを行うための方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、標的細胞株または標的細胞株の組み合わせが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＱ（Ａ１）、ＨＬＡ－ＤＱ（Ａ２）、ＨＬＡ－ＤＲ（Ｂ１）、ＨＬＡ－ＤＰ（Ｂ１）、ＨＬＡ－ＤＰ（Ｂ２）、またはそれらの組み合わせを発現し、本明細書に記載のＧｅｎ２プロセスによって調製されたＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬの集団をさらに含む、効力アッセイを行うための方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、標的細胞株または標的細胞株の組み合わせが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＱ（Ａ１）、ＨＬＡ－ＤＱ（Ａ２）、ＨＬＡ－ＤＲ（Ｂ１）、ＨＬＡ－ＤＰ（Ｂ１）、ＨＬＡ－ＤＰ（Ｂ２）、またはそれらの組み合わせを発現し、本明細書に記載のＧｅｎ３プロセスによって調製されたＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬの集団をさらに含む、効力アッセイを行うための方法を含む。ある実施形態では、本発明は、標的細胞株または標的細胞株の組み合わせが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＱ（Ａ１）、ＨＬＡ－ＤＱ（Ａ２）、ＨＬＡ－ＤＲ（Ｂ１）、ＨＬＡ－ＤＰ（Ｂ１）、ＨＬＡ－ＤＰ（Ｂ２）、またはそれらの組み合わせを発現し、米国特許第１０，８９４，０６３号、同第１０，３９８，７３４号、同第１０，５３７，５９５号、同第１０，６９５，３７２号、及び同第１０，６５３，７２３号（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に開示または特許請求される組成物に従ってＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬの集団をさらに含む、効力アッセイを行うための方法を含む。
ある実施形態では、本発明は、Ｂ細胞を含む標的細胞株または標的細胞株の組み合わせを含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、Ｂ細胞リンパ芽球様細胞を含む標的細胞株または標的細胞株の組み合わせを含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、バーキットリンパ腫細胞を含む標的細胞株または標的細胞株の組み合わせを含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、骨髄系細胞を含む標的細胞株または標的細胞株の組み合わせを含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、単球を含む標的細胞株または標的細胞株の組み合わせを含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、急性単球性白血病細胞を含む標的細胞株または標的細胞株の組み合わせを含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、Ｍ５サブタイプの急性単球性白血病細胞を含む標的細胞株または標的細胞株の組み合わせを含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、Ｒａｊｉ Ｂ２Ｍ細胞を含む、Ｒａｊｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫を含む標的細胞株または標的細胞株の組み合わせを含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、Ｔｈｐ１細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫を含む標的細胞株または標的細胞株の組み合わせを含む組成物であって、殺傷アッセイに好適な遺伝子修飾Ｔｈｐ１細胞を含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、Ｒａｍｏｓ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫を含む標的細胞株または標的細胞株の組み合わせを含む組成物であって、殺傷アッセイに好適な遺伝子修飾Ｒａｍｏｓ細胞を含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、Ｕ９３７細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫を含む標的細胞株または標的細胞株の組み合わせを含む組成物であって、殺傷アッセイに好適な遺伝子修飾Ｕ９３７細胞を含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、Ｄａｕｄｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫を含む標的細胞株または標的細胞株の組み合わせを含む組成物であって、殺傷アッセイに好適な遺伝子修飾Ｄａｕｄｉ細胞を含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、メラノサイト細胞を含む標的細胞株または標的細胞株の組み合わせを含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、ＨＬＡ－Ａ－０２陽性メラノサイト細胞を含む標的細胞株または標的細胞株の組み合わせを含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、黒色腫細胞を含む標的細胞株または標的細胞株の組み合わせを含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、ＨＬＡ－Ａ－０２陽性黒色腫細胞を含む標的細胞株または標的細胞株の組み合わせを含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、Ｓｋ－ＭＥＬ－５、Ｍａｌｍｅ－３Ｍ、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、ＳＫ－ＭＥＬ－３、ＳＨ－４、ＳＫ－ＭＥＬ－２４、ＲＰＭＩ－７９５１、ＳＫ－ＭＥＬ－１、Ａ３７５、Ｇ－３６１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される黒色腫細胞を含む、標的細胞株または標的細胞株の組み合わせを含む組成物含む。
ある実施形態では、本発明は、培地、標的細胞、及びＨＬＡ－Ｉ遮断抗体を含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、培地、標的細胞、及びＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体を含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、培地、標的細胞、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体、及びＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体を含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、培地、ＩＬ－２、標的細胞、及びＨＬＡ－Ｉ遮断抗体を含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、培地、ＩＬ－２、標的細胞、及びＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体を含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、培地、ＩＬ－２、標的細胞、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体、及びＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体を含む組成物を含む。前述の実施形態のうちのいずれにおいても、組成物は、分泌サイトカインをさらに含み、そのレベルは、ＨＬＡ－Ｉ及び／またはＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体の存在なしで取得されたレベルと比較され得る。前述の実施形態のうちのいずれにおいても、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体は、１μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬの濃度で存在する。前述の実施形態のうちのいずれにおいても、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体は、５μｇ／ｍＬ～２０μｇ／ｍＬの濃度で存在する。前述の実施形態のうちのいずれにおいても、ＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体は、１μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬの濃度で存在する。前述の実施形態のうちのいずれにおいても、ＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体は、５μｇ／ｍＬ～２０μｇ／ｍＬの濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の効力アッセイを使用して、米国特許出願公開第ＵＳ２０１８／０２８２６９４Ａ１号、同第ＵＳ２０２０／０２２４１６１Ａ１号、及び同第ＵＳ２０２０／０２７７５７３Ａ１号、国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／２１０１３１Ａ１号、同第ＷＯ２０１９／１３６４５６Ａ１号、同第ＷＯ２０１９／１４５７１１Ａ１号、同第ＷＯ２０１９／２１０１３１Ａ１号、同第ＷＯ２０２０／１５２４５１Ａ１号、及び同第ＷＯ２０２１／１２３８３２Ａ１号、ならびに米国特許第１０，１３０，６５９号、同第１０，１６６，２５７号、同第１０，２７２，１１３号、同第１０，３６３，２７３号、同第１０，３９８，７３４号、同第１０，４２０，７９９号、同第１０，４６３，６９７号、同第１０，５３７，５９５号、同第１０，６４６，５１７号、同第１０，６５３，７２３号、同第１０，６９３，３３０号、同第１０，６９５，３７２号、同第１０，８９４，０６３号、同第１０，９０５，７１８号、及び同第１０，９１８，６６６号（これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される、ＴＩＬ組成物、ＭＩＬ組成物、及びＰＢＬ組成物を含む、Ｔ細胞組成物の効力を決定することができる。
前述の実施形態のうちのいくつかでは、効力アッセイのための標的細胞は、ワーキングセルバンクとして調製される。前述の実施形態のうちのいくつかでは、効力アッセイのための標的細胞は、マスターセルバンクとして調製される。
Ｃ．アッセイキット
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品などのＴＩＬの効力を試験するためのキットを含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の標的細胞を含む。ある実施形態では、キットは、Ｒａｊｉ細胞、Ｔｈｐ１細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｕ９３７細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、それらの組み合わせ、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の陰性対照細胞を含む。ある実施形態では、キットは、Ｋ５６２細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫を含む。いくつかの実施形態では、キットは、培地、イムノアッセイ試薬、ＥＬＩＳＡまたは自動ＥＬＩＳＡシステム、分泌タンパク質を含む上清液、ＰＢＭＣ、本明細書に記載の陽性対照、または他の試験成分を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品またはＰＢＬ製品などのＴＩＬの効力を試験するためのキットを含み、このキットは、１～３つの標的細胞、培地、及び共培養容器を含む。いくつかの実施形態では、１～３つの標的細胞は、Ｒａｊｉ細胞、Ｔｈｐ１細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｕ９３７細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、ならびにそれらの組み合わせ、誘導体、バリアント、修飾、及び子孫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、培地は、ＡＩＭ－Ｖ培地を含む。いくつかの実施形態では、培地は、ＩＬ－２を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、単球標的細胞株を含む。いくつかの実施形態では、キットは、骨髄系標的細胞株を含む。いくつかの実施形態では、キットは、Ｂ細胞標的細胞株を含む。いくつかの実施形態では、キットは、Ｂ細胞リンパ芽細胞標的細胞株を含む。いくつかの実施形態では、キットは、バーキットリンパ腫細胞標的細胞株を含む。いくつかの実施形態では、キットは、急性単球性白血病細胞標的細胞株を含む。いくつかの実施形態では、キットは、Ｍ５－サブタイプの急性単球性白血病細胞株を含む。
ある実施形態では、キットの先行実施形態のうちのいずれかは、照射された標的細胞を含む。ある実施形態では、キットの先行実施形態のうちのいずれかは、照射されていない標的細胞を含む。ある実施形態では、キットの先行実施形態のうちのいずれかは、照射された陰性対照細胞を含む。ある実施形態では、キットの先行実施形態のうちのいずれかは、照射されていない陰性対照細胞を含む。ある実施形態では、キットの先行実施形態のうちのいずれかは、照射されていないＫ５６２陰性対照細胞を含む。ある実施形態では、キットの先行実施形態のうちのいずれかは、照射されたＫ５６２陰性対照細胞を含む。
ＴＩＬ、ＭＩＬ、及びＰＢＬを含むＴ細胞の効力または機能性をアッセイするために提案される方法の例示的な実施形態は、本明細書に含まれる実施例及び図面に見出すこともできる。
前述の実施形態のうちのいずれにおいても、キットはまた、ＨＬＡ－Ｉ遮断抗体を含む。前述の実施形態のうちのいずれにおいても、キットはまた、ＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体を含む。
前述の実施形態のうちのいずれにおいても、キットはまた、陽性対照ＴＩＬ細胞株を含む。好適な陽性対照ＴＩＬ細胞株としては、十分に特徴付けられ、大細胞数に拡大され、本発明の効力アッセイで再現可能に応答することが示され、後で使用するために凍結条件下で慎重に保管されたものが挙げられる。
ＩＶ．Ｇｅｎ２ ＴＩＬ製造プロセス
これらの特徴のうちのいくつかを含む、Ｇｅｎ２として知られる（プロセス２Ａとしても知られる）ＴＩＬプロセスの例示的なファミリーが、図１及び２に示される。Ｇｅｎ２の実施形態を図２に示す。プロセス１Ｃに対する本発明のこの実施形態の利点のうちのいくつかは、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１８／０８１４７３Ａ１号に記載されている。
本明細書で考察されるように、本発明は、患者への移植前に凍結保存されたＴＩＬを再刺激して、それらの代謝活性、ひいては相対的健康を向上させることに関するステップ、及び当該代謝健康を試験する方法を含み得る。本明細書で一般に概説されるように、ＴＩＬは、一般に、患者試料から採取され、患者への移植前にそれらの数を拡張するように操作される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、以下で考察されるように、任意で遺伝子操作され得る。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、凍結保存され得る。解凍した時点で、それらが再刺激されて、患者への注入前に代謝を高めることができる。
いくつかの実施形態では、以下ならびに実施例及び図で詳細に考察されるように、第１の拡張（ＲＥＰ前と称されるプロセス、ならびに図１にステップＡとして示されるプロセスを含む）は、３～１４日に短縮され、第２の拡張（ＲＥＰと称されるプロセス、ならびに図１にステップＢとして示されるプロセスを含む）は、７～１４日に短縮される。いくつかの実施形態では、第１の拡張（例えば、図１にステップＢとして記載される拡張）は、１１日に短縮され、第２の拡張（例えば、図１にステップＤとして記載される拡張）は、１１日に短縮される。いくつかの実施形態では、以下ならびに実施例及び図で詳細に考察されるように、第１の拡張と第２の拡張との組み合わせ（例えば、図１にステップＢ及びステップＤとして記載される拡張）は、２２日に短縮される。
以下の「ステップ」表記Ａ、Ｂ、Ｃなどは、図１を参照し、本明細書に記載のある特定の実施形態を参照する。以下及び図１におけるステップの順序は例示であり、ステップの任意の組み合わせまたは順序、ならびに追加のステップ、ステップの繰り返し、及び／またはステップの省略は、本出願及び本明細書に開示される方法によって企図される。
Ａ．ステップＡ：患者の腫瘍試料を取得する
一般に、ＴＩＬは、最初に患者の腫瘍試料から取得され（「一次ＴＩＬ」）、次いで本明細書に記載されるさらなる操作のためにより大きな集団に拡張され、任意選択で凍結保存され、本明細書に概説されるように再刺激され、任意選択でＴＩＬ健康の指標として表現型及び代謝パラメータについて評価される。
患者の腫瘍試料は、一般に外科的切除、針生検、コア生検、小生検、または腫瘍細胞とＴＩＬ細胞との混合物を含有する試料を取得するための他の手段を介して、当該技術分野で知られている方法を使用して取得することができる。いくつかの実施形態では、多病変サンプリングが使用される。いくつかの実施形態では、外科的切除、針生検、コア生検、小生検、または腫瘍細胞とＴＩＬ細胞との混合物を含有する試料を取得するための他の手段は、多病変サンプリングを含む（すなわち、患者の１つ以上の腫瘍引用及び／または場所、ならびに同じ場所または近接した１つ以上の腫瘍から試料を取得する）。一般に、腫瘍試料は、原発腫瘍、浸潤性腫瘍、または転移性腫瘍を含む、任意の固形腫瘍に由来し得る。腫瘍試料は、血液系悪性腫瘍から取得された腫瘍などの液体腫瘍であり得る。固形腫瘍は、皮膚組織のものであり得る。いくつかの実施形態では、有用なＴＩＬは、黒色腫から取得される。
取得された時点で、腫瘍試料は、一般に、鋭的解剖を使用して１～約８ｍｍ３の小片に断片化され、約２～３ｍｍ３が特に有用である。ＴＩＬは、酵素腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。かかる腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０緩衝液、２ｍＭグルタメート、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０単位／ｍＬ ＤＮａｓｅ、及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ）中でのインキュベーション、続いて、機械的解離（例えば、組織解離機を使用する）によって産生され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地に入れ、腫瘍をおよそ１分間機械的に解離させ、続いて５％ ＣＯ２中３７℃で３０分間インキュベートし、続いて小さな組織片のみが存在するまで、前述の条件下で機械的解離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことによって産生することができる。このプロセスの最後に、細胞懸濁液中に多数の赤血球または死細胞が含まれている場合、ＦＩＣＯＬＬ分岐親水性多糖類を使用した密度勾配分離が行われて、これらの細胞を除去することができる。米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものなどの当該技術分野で知られている代替の方法を使用することができる。前述の方法のうちのいずれかが、ＴＩＬを拡張する方法またはがんを治療する方法について本明細書に記載される実施形態のうちのいずれかにおいて使用され得る。いくつかの実施形態では、腫瘍は、方法に従って、または国際特許公開第ＷＯ２０２１／１２３８３２Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される組成物の形態で消化される。
上に示されるように、いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、固形腫瘍に由来する。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、断片化されない。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は断片化されず、全腫瘍として酵素消化に供される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で１～２時間消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で１～２時間、３７℃、５％ＣＯ２で消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で１～２時間、３７℃、５％ＣＯ２で回転を伴って消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、一定の回転を伴って一晩消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、３７℃、５％ＣＯ２で一定の回転を伴って一晩消化される。いくつかの実施形態では、全腫瘍が酵素と組み合わされて、腫瘍消化反応混合物が形成される。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、滅菌緩衝液中の凍結乾燥酵素で再構成される。いくつかの実施形態では、緩衝液は、滅菌ＨＢＳＳである。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、コラゲナーゼを含む。いくつかの実施形態では、コラゲナーゼは、コラゲナーゼＩＶである。いくつかの実施形態では、コラゲナーゼの作用ストックは、１００ｍｇ／ｍＬの１０倍作用ストックである。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、ＤＮＡｓｅを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡｓｅの作用ストックは、１０，０００ＩＵ／ｍＬの１０倍作用ストックである。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、ヒアルロニダーゼを含む。いくつかの実施形態では、ヒアルロニダーゼの作用ストックは、１０ｍｇ／ｍＬの１０倍作用ストックである。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、１０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ、１０００ＩＵ／ｍＬのＤＮＡｓｅ、及び１ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼを含む。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、１０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ、５００ＩＵ／ｍＬのＤＮＡｓｅ、及び１ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼを含む。
一般に、採取された細胞懸濁液は、「一次細胞集団」または「新たに採取された」細胞集団と呼ばれる。
いくつかの実施形態では、断片化は、例えば、解剖及び消化を含む物理的断片化を含む。いくつかの実施形態では、断片化は、物理的断片化である。いくつかの実施形態では、断片化は、解剖である。いくつかの実施形態では、断片化は、消化によるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、最初に、患者から取得された酵素腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養され得る。ある実施形態では、ＴＩＬは、最初に、患者から得られた酵素腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養され得る。
腫瘍が固形腫瘍であるいくつかの実施形態では、腫瘍試料が、例えば、ステップＡ（図１に提供される）で取得された後、腫瘍は物理的断片化を受ける。いくつかの実施形態では、断片化は、凍結保存前に起こる。いくつかの実施形態では、断片化は、凍結保存後に起こる。いくつかの実施形態では、断片化は、腫瘍を得た後に、いずれの凍結保存もない場合に起こる。いくつかの実施形態では、腫瘍は断片化され、１０、２０、３０、４０個またはそれ以上の断片または小片が、第１の拡張のために各容器内に配置される。いくつかの実施形態では、腫瘍は断片化され、３０または４０個の断片または小片が、第１の拡張のために各容器内に配置される。いくつかの実施形態では、腫瘍は断片化され、４０個の断片または小片が、第１の拡張のために各容器内に配置される。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約４～約５０個の断片を含み、各断片は、約２７ｍｍ３の体積を有する。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約１３００ｍｍ３～約１５００ｍｍ３の総体積を伴う約３０～約６０個の断片を含む。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総体積を伴う約５０個の断片を含む。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約１グラム～約１．５グラムの総質量を伴う約５０個の断片を含む。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約４個の断片を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、腫瘍断片から取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、鋭的解剖によって取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ３～１０ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ３～８ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約２ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約３ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約４ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約５ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約６ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約７ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約８ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約９ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１０ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、１～４ｍｍ×１～４ｍｍ×１～４ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍は、１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍は、２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍は、３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍は、４ｍｍ×４ｍｍ×４ｍｍである。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の出血性、壊死性、及び／または脂肪性組織の量を最小化するために切除される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の出血性組織の量を最小化するために切除される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の壊死性組織の量を最小化するために切除される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の脂肪性組織の量を最小化するために切除される。
いくつかの実施形態では、腫瘍の断片化は、腫瘍の内部構造を維持するために行われる。いくつかの実施形態では、腫瘍の断片化は、メスでのこ引き動作を行うことなく行われる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、腫瘍消化物から取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、例えば、ＲＰＭＩ１６４０（２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅ、及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ）であるが、これに限定されない酵素培地中でのインキュベーション、続いて、機械的解離（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）によって生成された。腫瘍を酵素培地に入れた後、腫瘍は、およそ１分間機械的に解離され得る。その後、溶液が５％ＣＯ２中３７℃で３０分間インキュベートされ、その後、およそ１分間再び機械的に破壊され得る。５％ ＣＯ２中３７℃で３０分間再びインキュベートした後、腫瘍を、およそ１分間、３回目に機械的に破壊することができる。いくつかの実施形態では、大きい組織片が存在する場合、３回目の機械的破壊後、５％ＣＯ２中３７℃でさらに３０分間インキュベートするかにかかわらず、１回または２回の追加の機械的解離が試料に適用された。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液が多数の赤血球または死細胞を含む場合、最終インキュベーションの終わりに、Ｆｉｃｏｌｌを使用した密度勾配分離が行われて、これらの細胞を除去することができる。
いくつかの実施形態では、第１の拡張ステップの前に採取された細胞懸濁液は、「一次細胞集団」または「新たに採取された」細胞集団と呼ばれる。
いくつかの実施形態では、細胞は、試料採取後に任意選択で凍結され、ステップＢに記載される拡張に入る前に凍結保存され得、これは、以下でさらに詳細に説明され、図１及び図８にも例示される。
１．胸水ＴＩＬ
いくつかの実施形態では、試料は、胸腔内液試料である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプロセスによる拡張のためのＴＩＬの供給源は、胸腔内液試料である。いくつかの実施形態では、試料は、胸水由来試料である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプロセスによる拡張のためのＴＩＬの供給源は、胸水由来試料である。例えば、米国特許公開第２０１４／０２９５４２６号に記載されている方法を参照されたく、これはすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬと思われる、及び／またはＴＩＬを含む任意の胸腔内液または胸水を利用することができる。かかる試料は、ＮＳＣＬＣもしくはＳＣＬＣなどの原発性または転移性肺癌に由来し得る。いくつかの実施形態では、試料は、別の臓器、例えば、乳房、卵巣、結腸、または前立腺に由来する二次転移性がん細胞であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の拡張方法で使用する試料は、胸膜浸出液である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の拡張方法で使用する試料は、胸膜漏出液である。他の生体試料は、例えば、腹部からの腹水または膵嚢胞液を含む、ＴＩＬを含有する他の漿液を含み得る。腹水及び胸腔内液は、非常に類似した化学系を伴い、腹部及び肺の両方が、悪性腫瘍における同じ物質の胸膜空間及び腹部空間に中皮線及び流体形態を有し、いくつかの実施形態では、かかる流体は、ＴＩＬを含有する。本開示が胸水を例示するいくつかの実施形態では、同じ方法が、胸腔内液またはＴＩＬを含有する他の嚢胞液を使用して同様の結果で実行されてもよい。
いくつかの実施形態では、胸腔内液は、患者から直接除去された未処理の形態である。いくつかの実施形態では、未処理の胸腔内液は、接触ステップの前に、ＥＤＴＡまたはヘパリンチューブなどの標準的な採血管に入れられる。いくつかの実施形態では、未処理の胸腔内液は、接触ステップの前に、標準的なＣｅｌｌＳａｖｅ（登録商標）チューブ（Ｖｅｒｉｄｅｘ）に入れられる。いくつかの実施形態では、試料は、生存ＴＩＬの数の減少を避けるために、患者から採取した直後にＣｅｌｌＳａｖｅチューブに入れられる。生存ＴＩＬの数は、４℃であっても、未処理の胸腔内液中に放置されると、２４時間以内に大幅に減少する可能性がある。いくつかの実施形態では、試料は、患者からの除去後１時間、５時間、１０時間、１５時間、または最大２４時間以内に適切な収集チューブ内に入れられる。いくつかの実施形態では、試料は、４℃で、患者からの除去後１時間、５時間、１０時間、１５時間、または最大２４時間以内に適切な収集チューブ内に入れられる。
いくつかの実施形態では、選択された対象からの胸腔内液試料は、希釈され得る。一実施形態では、希釈は、胸腔内液対希釈剤が１：１０である。別の実施形態では、希釈は、胸腔内液対希釈剤が１：９である。別の実施形態では、希釈は、胸腔内液対希釈剤が１：８である。別の実施形態では、希釈は、胸腔内液対希釈剤が１：５である。別の実施形態では、希釈は、胸腔内液対希釈剤が１：２である。別の実施形態では、希釈は、胸腔内液対希釈剤が１：１である。いくつかの実施形態では、希釈剤には、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、別の緩衝液、または生理学的に許容される希釈剤が含まれる。いくつかの実施形態では、試料は、患者からの収集及び希釈の直後にＣｅｌｌＳａｖｅチューブ内に入れられ、生存ＴＩＬの減少を回避し、これは、４℃であっても、未処理の胸腔内液中に放置された場合、２４～４８時間以内に有意に生じ得る。いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、患者からの除去及び希釈後１時間、５時間、１０時間、１５時間、２４時間、３６時間、最大４８時間以内に適切な収集チューブ内に入れられる。いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、４℃で、患者からの除去及び希釈後１時間、５時間、１０時間、１５時間、２４時間、３６時間、最大４８時間以内に適切な収集チューブ内に入れられる。
さらに別の実施形態では、胸腔内液試料は、さらなる処理ステップの前に、従来の手段によって濃縮される。いくつかの実施形態では、胸腔内液のこの前処理は、方法を実施する実験室への輸送のために、またはその後の分析のために（例えば、採取後２４～４８時間より後に）胸水を凍結保存しなければならない状況において好ましい。いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、それが対象から採取された後に胸腔内液試料を遠心分離し、遠心分離物またはペレットを緩衝液中に再懸濁することによって調製される。いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、輸送または後の分析及び／または処理のために凍結保存される前に、複数の遠心分離及び再懸濁に供される。
いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、濾過法を使用することによって、さらなる処理ステップの前に濃縮される。いくつかの実施形態では、接触ステップで使用される胸腔内液試料は、胸腔内液が膜を通過することを可能にするが腫瘍細胞を保持する、既知で本質的に均一な孔径を含むフィルターをとおして流体を濾過することによって調製される。いくつかの実施形態では、膜の細孔の直径は、少なくとも４μＭであり得る。別の実施形態では、細孔直径は、５μＭ以上であり得、他の実施形態では、６、７、８、９、または１０μＭのうちのいずれかであり得る。濾過後、膜によって保持されたＴＩＬを含む細胞を、膜から適切な生理学的に許容される緩衝液にすすいでもよい。次いで、このように濃縮されたＴＩＬを含む細胞は、方法の接触ステップで使用することができる。
いくつかの実施形態では、胸腔内液試料（例えば、未処理の胸腔内液を含む）、希釈胸腔内液、または再懸濁細胞ペレットは、試料中に存在する無核赤血球を特異的に溶解する溶解試薬と接触させる。いくつかの実施形態では、このステップは、胸腔内液がかなりの数のＲＢＣを含む状況で、さらなる処理ステップの前に行われる。好適な溶解試薬には、単一の溶解試薬もしくは溶解試薬及びクエンチ試薬、または溶解剤、クエンチ試薬及び固定試薬が含まれる。好適な溶解システムは市販されており、ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ（商標）システム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）が含まれる。他の溶解システムには、Ｖｅｒｓａｌｙｓｅ（商標）システム、ＦＡＣＳｌｙｓｅ（商標）システム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）、Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｐ（商標）システム、またはＥｒｙｔｈｒｏｌｙｓｅ ＩＩシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、または塩化アンモニウムシステムが含まれる。いくつかの実施形態では、溶解試薬は、赤血球の効率的な溶解、ならびに胸水におけるＴＩＬ及びＴＩＬの表現型特性の保存のような主要な要件によって異なり得る。溶解のための単一の試薬を利用することに加えて、本明細書に記載の方法に有用な溶解システムは、第２の試薬、例えば、方法の残りのステップ中に溶解試薬の効果をクエンチまたは遅延させるもの、例えばＳｔａｂｉｌｙｓｅ（商標）試薬（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を含むことができる。溶解試薬の選択または方法の好ましい実施に応じて、従来の固定試薬を使用することもできる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、未処理、希釈または多重遠心分離または処理された胸腔内液試料は、本明細書で提供されるようにさらに処理及び／または拡張される前に、約－１４０℃の温度で凍結保存される。
Ｂ．ステップＢ：第１の拡張
いくつかの実施形態では、本方法は、対象／患者への投与時に複製サイクルを増加させることができ、したがって、より古いＴＩＬ（すなわち、対象／患者への投与前により多くの複製ラウンドをさらに受けたＴＩＬ）よりも追加の治療的利益を提供し得る、若いＴＩＬを得ることを提供する。若いＴＩＬの特徴は、文献、例えば、Ｄｏｎｉａ，ａｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７５：１５７－１６７（２０１２）、Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１６：６１２２－６１３１（２０１０）、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２８（３）：２５８－２６７（２００５）、Ｂｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９（１７）：ＯＦ１－ＯＦ９（２０１３）、Ｂｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３２：４１５－４２３（２００９）、Ｒｏｂｂｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４；１７３：７１２５－７１３０、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，３０：１２３－１２９（２００７）、Ｚｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２８：５３－６２（２００５）、及びＴｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，３１：７４２－７５１（２００８）に記載されており、これらはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
Ｔリンパ球及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られた数であるが、多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメント：Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（接合）、及びＣ（一定）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリー多様性を示し、かつ増加させるＴＩＬを生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法によって取得されたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、本方法によって取得されたＴＩＬは、新たに採取されたＴＩＬ及び／または例えば、図１に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、本方法によって取得されたＴＩＬは、新たに採取されたＴＩＬ及び／または図５及び／または図６に例示されるようにプロセス１Ｃと称される方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、第１の拡張で取得されたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、多様性の増加は、免疫グロブリン多様性及び／またはＴ細胞受容体多様性の増加である。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリンにあり、免疫グロブリン重鎖にある。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリンにあり、免疫グロブリン軽鎖にある。いくつかの実施形態では、多様性は、Ｔ細胞受容体にある。いくつかの実施形態では、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体のうちの１つにある。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／またはベータの発現が増加する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲａｂ（すなわち、ＴＣＲα／β）の発現が増加する。
例えば、図１のステップＡに記載されるものなどの腫瘍断片の解剖または消化後に、結果として得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長を好む条件下で、ＩＬ－２を含む血清中で培養される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を有する不活性化ヒトＡＢ血清を含む培地中２ｍＬのウェル中でインキュベートされる。この一次細胞集団は、数日間、一般に３～１４日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８バルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、７～１４日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８バルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、１０～１４日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８バルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、約１１日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８バルクＴＩＬ細胞を生じる。
好ましい実施形態では、ＴＩＬの拡張は、以下及び本明細書に記載の初期バルクＴＩＬ拡張ステップ（例えば、ＲＥＰ前と称されるプロセスを含み得る、図１のステップＢに記載のものなど）、続いて以下のステップＤ及び本明細書に記載の第２の拡張（ステップＤ、急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）ステップと称されるプロセスを含む）、続いて任意の凍結保存、続いて以下及び本明細書に記載の第２のステップＤ（再刺激ＲＥＰステップと称されるプロセスを含む）を使用して行われ得る。このプロセスから取得されたＴＩＬは、本明細書に記載の表現型特徴及び代謝パラメータについて任意で特徴付けられ得る。
ＴＩＬ培養物が２４ウェルプレートで開始される実施形態では、例えば、Ｃｏｓｔａｒ ２４ウェル細胞培養クラスター、平底（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を使用して、ＩＬ－２（６０００ＩＵ／ｍＬ、Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を含む２ｍＬの完全培地（ＣＭ）中の１×１０６個の腫瘍消化細胞または１つの腫瘍断片を、各ウェルに播種することができる。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ３～１０ｍｍ３である。
いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、培養培地の略語である「ＣＭ」と称される。いくつかの実施形態では、ステップＢのＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充した、ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＲＰＭＩ １６４０からなる。培養物が４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底部（例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １０、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｂｒｉｇｈｔｏｎ，ＭＮ）を有するガス透過性フラスコ内で開始される実施形態では、各フラスコに、ＩＬ－２を含む１０～４０ｍＬのＣＭ中の１０～４０×１０６個の生きた腫瘍消化細胞または５～３０個の腫瘍断片を装填した。Ｇ－Ｒｅｘ １０及び２４ウェルプレートの両方を、５％ ＣＯ２中３７℃の加湿インキュベーター内でインキュベートし、培養開始から５日後、培地の半分を取り除き、新たなＣＭ及びＩＬ－２と交換し、５日目の後に培地の半分を２～３日毎に交換した。
腫瘍断片の調製後、結果として得られた細胞（すなわち、断片）は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長を好む条件下で、ＩＬ－２を含む血清中で培養される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を有する不活性化ヒトＡＢ血清を含む培地中２ｍＬのウェル中（または、いくつかの事例では、本明細書で概説されるように、ａＡＰＣ細胞集団の存在下）でインキュベートされる。この一次細胞集団は、数日間、一般に１０～１４日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、第１の拡張中の成長培地は、ＩＬ－２またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬは、組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき２０～３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき２０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき２５×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、４～８×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、５～７×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、６×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、実施例５に記載されるように調製される。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約１０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、または約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２をさらに含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、または約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ、または８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、または約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－１５をさらに含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。
いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、または約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２１をさらに含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。
ある実施形態では、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇの間、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含まない。いくつかの実施形態では、ＯＫＴ－３抗体は、ムロモナブである。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質、ならびにそれらの断片、誘導体、バリアント、バイオシミラー、及び組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、２０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストに加えて、細胞培養培地は、ＩＬ－２を約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で、及びＯＫＴ－３を約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度でさらに含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストが、４－１ＢＢアゴニストを含む。
いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、培養培地の略語である「ＣＭ」と称される。いくつかの実施形態では、それは、ＣＭ１（培養培地１）と称される。いくつかの実施形態では、ＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充した、ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＲＰＭＩ１６４０からなる。培養物が４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底部（例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １０、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｂｒｉｇｈｔｏｎ，ＭＮ）を有するガス透過性フラスコ内で開始される実施形態では、各フラスコに、ＩＬ－２を含む１０～４０ｍＬのＣＭ中の１０～４０×１０６個の生きた腫瘍消化細胞または５～３０個の腫瘍断片を装填した。Ｇ－Ｒｅｘ １０及び２４ウェルプレートの両方を、５％ ＣＯ２中３７℃の加湿インキュベーター内でインキュベートし、培養開始から５日後、培地の半分を取り除き、新たなＣＭ及びＩＬ－２と交換し、５日目の後に培地の半分を２～３日毎に交換した。いくつかの実施形態では、ＣＭは、実施例に記載されるＣＭ１であり、実施例１を参照されたい。いくつかの実施形態では、第１の拡張は、初期細胞培養培地または第１の細胞培養培地中で起こる。いくつかの実施形態では、初期細胞培養培地または第１の細胞培養培地は、ＩＬ－２を含む。
いくつかの実施形態では、実施例及び図で考察されるように、第１の拡張（例えば、ＲＥＰ前と称されることもあるものを含み得る、図１のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含む）プロセスは、３～１４日に短縮される。いくつかの実施形態では、実施例で考察され、かつ図４及び図５に示されるように、例えば、図１のステップＢに記載される拡張も含む、第１の拡張（例えば、ＲＥＰ前と称されることもあるものを含み得る、図１のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含む）は、７～１４日に短縮される。いくつかの実施形態では、ステップＢの第１の拡張は、１０～１４日に短縮される。いくつかの実施形態では、第１の拡張は、例えば、図１のステップＢに記載される拡張において考察されるように、１１日に短縮される。
いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、２日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、３日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、４日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、５日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、６日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、７日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、８日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、９日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１０日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１１日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１２日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１３日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、２日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、３日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、４日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、５日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、６日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、７日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、８日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、９日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１０日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１１日間続行することができる。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１の組み合わせは、第１の拡張中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図１よる、かつ本明細書に記載されるステップＢのプロセス中を含む、第１の拡張中に含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の組み合わせは、第１の拡張中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組み合わせは、図１による、かつ本明細書に記載されるステップＢのプロセス中に含まれ得る。
いくつかの実施形態では、実施例及び図で考察されるように、第１の拡張（ＲＥＰ前と称されるプロセスを含む、例えば、図１によるステップＢ）プロセスは、３～１４日に短縮される。いくつかの実施形態では、ステップＢの第１の拡張は、７～１４日に短縮される。いくつかの実施形態では、ステップＢの第１の拡張は、１０～１４日に短縮される。いくつかの実施形態では、第１の拡張は、１１日に短縮される。
いくつかの実施形態では、第１の拡張、例えば、図１によるステップＢは、閉鎖系バイオリアクター内で行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １０またはＧ－Ｒｅｘ １００である。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
Ｃ．ステップＣ：第１の拡張から第２の拡張へと移行
いくつかの事例では、例えば、図１に示されるステップＢから取得されたＴＩＬ集団を含む、第１の拡張から取得されたバルクＴＩＬ集団は、以下で考察されるプロトコルを使用して、直ちに凍結保存され得る。あるいは、第２のＴＩＬ集団と称される第１の拡張から取得されたＴＩＬ集団は、以下で考察されるように、第２の拡張（ＲＥＰと称されることもある拡張を含み得る）に供され、その後、凍結保存され得る。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬが治療に使用される場合、第１のＴＩＬ集団（バルクＴＩＬ集団と称されることもある）または第２のＴＩＬ集団（いくつかの実施形態では、ＲＥＰ ＴＩＬ集団と称される集団を含み得る）は、拡張前または第１の拡張後及び第２の拡張前に、好適な治療のために遺伝子修飾に供され得る。
いくつかの実施形態では、第１の拡張から（例えば、図１に示されるステップＢから）取得されたＴＩＬは、選択のために表現型決定されるまで保管される。いくつかの実施形態では、第１の拡張から（例えば、図１に示されるステップＢから）取得されたＴＩＬは保管されず、第２の拡張に直接進む。いくつかの実施形態では、第１の拡張から取得されたＴＩＬは、第１の拡張後及び第２の拡張前に凍結保存されない。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから約３日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから約４日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから約４日～１０日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから約７日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから約１４日で起こる。
いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから１日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、２日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第３の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第４の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第５の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第６の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第７の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第８の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第９の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第１０の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第１１の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第１２の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第１３の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから１日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第３の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第４の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第５の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第６の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第７の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第８の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第９の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第１０の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから１１日で起こる。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、第１の拡張後及び第２の拡張前に保管されず、ＴＩＬは、第２の拡張に直接進む（例えば、いくつかの実施形態では、図１に示されるステップＢからステップＤへの移行中に保管されない）。いくつかの実施形態では、移行は、本明細書に記載されるように、閉鎖系内で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張由来のＴＩＬである第２のＴＩＬ集団は、移行期間なしで第２の拡張に直接進む。
いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行、例えば、図１によるステップＣは、閉鎖系バイオリアクター内で行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １０またはＧ－Ｒｅｘ １００である。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
１．サイトカイン
本明細書に記載の拡張方法は、一般に、当該技術分野で知られているように、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培養培地を使用する。
あるいは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１７／０１０７４９０Ａ１及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／１８９３５７号（これらの各々は参照によりそれら全体が本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されているように、ＴＩＬの急速拡張及びまたは第２の拡張のためにサイトカインの組み合わせを使用することもさらに可能であり、組み合わせは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１のうちの２つ以上である。したがって、可能な組み合わせには、ＩＬ－２及びＩＬ－１５、ＩＬ－２及びＩＬ－２１、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１、ならびにＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１が含まれ、後者は多くの実施形態において特定の用途を見出す。サイトカインの組み合わせの使用は、リンパ球、特にそこに記載されているようにＴ細胞の生成に特に有利に働く。
Ｄ．ステップＤ：第２の拡張
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ細胞集団は、採取及び初期バルク処理後、例えば、図１に示される、ステップＡ及びステップＢ、ならびにステップＣと称される移行後に数が拡張される）。このさらなる拡張は、本明細書では第２の拡張と称され、これは、当該技術分野で一般に急速拡張プロセス（ＲＥＰ、ならびに図１のステップＤに示されるプロセス）と称される拡張プロセスを含み得る。第２の拡張は、一般に、フィーダー細胞、サイトカイン源、及び抗ＣＤ３抗体を含むいくつかの成分を含む培養培地を使用して、ガス透過性容器内で達成される。
いくつかの実施形態では、第２の拡張または第２のＴＩＬ拡張（ＲＥＰと称されることもある拡張、ならびに図１のステップＤに示されるプロセスを含み得る）は、当業者に知られている任意のＴＩＬフラスコまたは容器を使用して行われ得る。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約７日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約８日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約９日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約１０日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約１１日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約１２日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約１３日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約１４日間続行することができる。
ある実施形態では、第２の拡張は、本開示の方法（例えば、ＲＥＰと称される拡張、ならびに図１のステップＤに示されるプロセスを含む）を使用して、ガス透過性容器内で行われ得る。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）またはインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下で非特異的Ｔ細胞受容体刺激を使用して、急速に拡張され得る。非特異的Ｔ細胞受容体刺激は、例えば、抗ＣＤ３抗体、例えば約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ｏｒｔｈｏ－ＭｃＮｅｉｌ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪもしくはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡから市販）またはＵＨＣＴ－１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡから市販）を含み得る。ＴＩＬは、がんのエピトープ（複数可）などの抗原性部分を含む、第２の拡張中に１つ以上の抗原を含むことによって、インビトロでＴＩＬのさらなる刺激を誘導するように拡張することができ、これは任意選択で、ベクター、例えば、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）結合ペプチド、例えば、０．３μＭ ＭＡＲＴ－１：２６－３５（２７Ｌ）またはｇｐｌ ００：２０９－２１７（２１０Ｍ）から、任意選択で３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２またはＩＬ－１５などのＴ細胞成長因子の存在下で発現され得る。他の好適な抗原には、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼがん抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、及びＶＥＧＦＲ２、またはそれらの抗原性部分が含まれ得る。ＴＩＬは、ＨＬＡ－Ａ２を発現する抗原提示細胞にパルスされたがんの同じ抗原（複数可）で再刺激することによっても急速に拡張され得る。あるいは、ＴＩＬは、例えば、例として照射された自己リンパ球または照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２でさらに再刺激され得る。いくつかの実施形態では、再刺激は、第２の拡張の一部として起こる。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、照射された自己リンパ球の存在下で、または照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２を用いて起こる。
ある実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、または約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ、または８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
ある実施形態では、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇの間、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含まない。いくつかの実施形態では、ＯＫＴ－３抗体は、ムロモナブである。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質、ならびにそれらの断片、誘導体、バリアント、バイオシミラー、及び組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、２０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストに加えて、細胞培養培地は、ＩＬ－２を約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で、及びＯＫＴ－３を約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度でさらに含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストが、４－１ＢＢアゴニストを含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１の組み合わせは、第２の拡張中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図１による、かつ本明細書に記載されるステップＤのプロセス中を含む、第２の拡張中に含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の組み合わせは、第２の拡張中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組み合わせは、図１による、かつ本明細書に記載されるステップＤのプロセス中に含まれ得る。
いくつかの実施形態では、第２の拡張は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、抗原提示フィーダー細胞、及び任意でＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む補充された細胞培養培地において実施され得る。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、補充された細胞培養培地中で起こる。いくつかの実施形態では、補充された細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、第２の細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ、抗原提示フィーダー細胞とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞（すなわち、抗原提示細胞）を含む細胞培養培地中で起こる。
いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、または約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－１５をさらに含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。
いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、または約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２１をさらに含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。
いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）は、ＰＢＭＣである。ある実施形態では、急速拡張及び／または第２の拡張におけるＴＩＬのＰＢＭＣ及び／または抗原提示細胞に対する比率は、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００、または約１：５００である。ある実施形態では、急速拡張及び／または第２の拡張におけるＴＩＬのＰＢＭＣに対する比率は、１：５０～１：３００である。ある実施形態では、急速拡張及び／または第２の拡張におけるＴＩＬのＰＢＭＣに対する比率は、１：１００～１：２００である。
ある実施形態では、ＲＥＰ及び／または第２の拡張は、バルクＴＩＬが１５０ｍＬの培地中の１００倍または２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体、及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と混合されているフラスコ内で行われる。細胞が代替の成長チャンバに移されるまで、培地交換が行われる（一般に、新鮮な培地との呼吸による３分の２の培地交換）。代替の成長チャンバには、以下でより完全に考察されるように、Ｇ－Ｒｅｘフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
いくつかの実施形態では、実施例及び図で考察されるように、第２の拡張（ＲＥＰプロセスと称されるプロセスを含み得る）は、７～１４日に短縮される。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、１１日に短縮される。
ある実施形態では、ＲＥＰ及び／または第２の拡張は、以前に記載されたＴ－１７５フラスコ及びガス透過性バッグ（Ｔｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８，３１，７４２－５１、Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００３，２６，３３２－４２）またはガス透過性培養器具（Ｇ－Ｒｅｘフラスコ）を使用して行われ得る。いくつかの実施形態では、第２の拡張（急速拡張と称される拡張を含む）は、Ｔ－１７５フラスコ内で行われ、１５０ｍＬの培地に懸濁された約１×１０６個のＴＩＬが、各Ｔ－１７５フラスコに添加され得る。ＴＩＬは、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を補充した、１：１のＣＭとＡＩＭ－Ｖ培地との混合物中で培養され得る。Ｔ－１７５フラスコを、５％ ＣＯ２中３７℃でインキュベートすることができる。培地の半分が、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む５０／５０培地を使用して５日目に交換され得る。いくつかの実施形態では、７日目に、２つのＴ－１７５フラスコからの細胞が３Ｌバッグ内で組み合わせられ得、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む３００ｍＬのＡＩＭ Ｖが、３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に添加された。各バッグ内の細胞の数が毎日または隔日計数され、新鮮な培地が添加されて、０．５～２．０×１０６細胞／ｍＬの細胞数を維持した。
ある実施形態では、第２の拡張（ＲＥＰと称される拡張、ならびに図１のステップＤで参照される拡張を含み得る）は、１００ｃｍのガス透過性シリコン底部（Ｇ－Ｒｅｘ １００、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｂｒｉｇｈｔｏｎ，ＭＮ，ＵＳＡから市販されている）を有する５００ｍＬ容量のガス透過性フラスコ内で行われ得る。５×１０６または１０×１０６ＴＩＬは、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を補充した４００ｍＬの５０／５０培地中、ＰＢＭＣで培養され得る。Ｇ－Ｒｅｘ １００フラスコは、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートされ得る。５日目に、２５０ｍＬの上清が除去され、遠心分離ボトルに入れられ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心分離される。ＴＩＬペレットが、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮な培地で再懸濁され、元のＧ－Ｒｅｘ １００フラスコに戻し添加され得る。ＴＩＬがＧ－Ｒｅｘ １００フラスコ内で連続的に拡張される場合、７日目に、各Ｇ－Ｒｅｘ １００内のＴＩＬが、各フラスコに存在する３００ｍＬの培地に懸濁され得、細胞懸濁液が３つの１００ｍＬアリコートに分割され得、それを使用して、３つのＧ－Ｒｅｘ １００フラスコに播種することができる。その後、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ－Ｖが各フラスコに添加され得る。Ｇ－Ｒｅｘ １００フラスコが、５％ ＣＯ２中３７℃でインキュベートされ得、４日後に、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ－Ｖが、各Ｇ－Ｒｅｘ １００フラスコに添加され得る。培養１４日目に、細胞が採取され得る。
ある実施形態では、第２の拡張（ＲＥＰと称される拡張を含む）は、バルクＴＩＬが１５０ｍＬの培地中の１００倍または２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体、及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と混合されているフラスコで行われる。いくつかの実施形態では、培地交換は、細胞が代替の成長チャンバに移されるまで行われる。いくつかの実施形態では、培地の３分の２が、新鮮な培地と呼吸によって交換される。いくつかの実施形態では、代替の成長チャンバには、以下でより完全に考察されるように、Ｇ－Ｒｅｘフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
ある実施形態では、第２の拡張（ＲＥＰと称される拡張を含む）が行われ、ＴＩＬが優れた腫瘍反応性のために選択されるステップをさらに含む。当該技術分野で知られている任意の選択方法が使用され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１００５８Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法が、優れた腫瘍反応性のためのＴＩＬの選択に使用され得る。
任意選択で、細胞生存率アッセイは、当該技術分野で知られている標準的なアッセイを使用して、第２の拡張（ＲＥＰ拡張と称される拡張を含む）後に行われ得る。例えば、死細胞を選択的に標識し、生存率の評価を可能にするトリパンブルー排除アッセイが、バルクＴＩＬの試料上で行われ得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ試料は、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２自動セルカウンター（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＭＡ）を使用して計数され、生存率が決定され得る。いくつかの実施形態では、生存率は、標準のＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２ Ｉｍａｇｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒプロトコルに従って決定される。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの第２の拡張（ＲＥＰと称される拡張を含む）は、以前に記載されているＴ－１７５フラスコ及びガス透過性バッグ（Ｔｒａｎ ＫＱ，Ｚｈｏｕ Ｊ，Ｄｕｒｆｌｉｎｇｅｒ ＫＨ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３１：７４２－７５１及びＤｕｄｌｅｙ ＭＥ，Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ＪＲ，Ｓｈｅｌｔｏｎ ＴＥ，ｅｔ ａｌ．２００３，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２６：３３２－３４２）またはガス透過性Ｇ－Ｒｅｘフラスコを使用して行われ得る。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、フラスコを使用して行われる。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、ガス透過性Ｇ－Ｒｅｘフラスコを使用して行われる。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、Ｔ－１７５フラスコ内で行われ、約１×１０６個のＴＩＬが約１５０ｍＬの培地に懸濁され、これが各Ｔ－１７５フラスコに添加される。ＴＩＬは、「フィーダー」細胞として１対１００の比で照射された（５０Ｇｙ）同種異系ＰＢＭＣと培養され、細胞が、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を補充した、１：１のＣＭとＡＩＭ－Ｖ培地との混合物（５０／５０培地）中で培養された。Ｔ－１７５フラスコを、５％ ＣＯ２中３７℃でインキュベートする。いくつかの実施形態では、培地の半分が、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む５０／５０培地を使用して５日目に交換される。いくつかの実施形態では、７日目に、２つのＴ－１７５フラスコからの細胞が３Ｌバッグ内で組み合わせられ、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む３００ｍＬのＡＩＭ－Ｖが、３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に添加される。各バッグ内の細胞の数が毎日または隔日計数され得、新鮮な培地が添加されて、約０．５～約２．０×１０６細胞／ｍＬの細胞数を維持することができる。
いくつかの実施形態では、第２の拡張（ＲＥＰと称される拡張を含む）は、１００ｃｍ２のガス透過性シリコン底部（Ｇ－Ｒｅｘ １００、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）を有する５００ｍＬ容量のフラスコ内で行われ、約５×１０６または１０×１０６ＴＩＬが、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を補充した、４００ｍＬの５０／５０培地中、１対１００の比で照射された同種異系ＰＢＭＣと培養される。Ｇ－Ｒｅｘ １００フラスコは、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、５日目に、２５０ｍＬの上清が除去され、遠心分離ボトルに入れられ、１５００ｒｐｍ（４９１ｇ）で１０分間遠心分離される。その後、ＴＩＬペレットが、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮な５０／５０培地に再懸濁され、元のＧ－Ｒｅｘ １００フラスコに戻し添加され得る。ＴＩＬがＧ－Ｒｅｘ １００フラスコ内で連続的に拡張される実施形態では、７日目に、各Ｇ－Ｒｅｘ １００内のＴＩＬが、各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁され、細胞懸濁液が３つの１００ｍＬアリコートに分割されて、それを使用して、３つのＧ－Ｒｅｘ １００フラスコに播種された。その後、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ－Ｖが各フラスコに添加される。Ｇ－Ｒｅｘ １００フラスコが５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートされ、４日後に、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ－Ｖが、各Ｇ－Ｒｅｘ １００フラスコに添加される。培養１４日目に、細胞が採取される。
Ｔリンパ球及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られた数であるが、多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメント：Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（接合）、及びＣ（一定）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリー多様性を示し、かつ増加させるＴＩＬを生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法によって取得されたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、第２の拡張において取得されたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、多様性の増加は、免疫グロブリン多様性及び／またはＴ細胞受容体多様性の増加である。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリンにあり、免疫グロブリン重鎖にある。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリンにあり、免疫グロブリン軽鎖にある。いくつかの実施形態では、多様性は、Ｔ細胞受容体にある。いくつかの実施形態では、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体のうちの１つにある。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／またはベータの発現が増加する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲａｂ（すなわち、ＴＣＲα／β）の発現が増加する。
いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地（例えば、ＣＭ２または第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下でさらに詳細に考察されるように、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、ならびに抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。
いくつかの実施形態では、第２の拡張、例えば、図１によるステップＤは、閉鎖系バイオリアクター内で行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １０またはＧ－Ｒｅｘ １００である。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
１．フィーダー細胞及び抗原提示細胞
ある実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順（例えば、図１のステップＤに記載されるような拡張、ならびにＲＥＰと称されるものを含む）は、ＲＥＰ ＴＩＬ拡張中及び／または第２の拡張中に過剰のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態では、フィーダー細胞は、健康な献血者由来の標準の全血単位から得られる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配分離などの標準の方法を使用して取得される。
一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射または熱処理のいずれかによって不活性化され、実施例に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用され、これは、照射された同種異系ＰＢＭＣの複製無能力を評価するための例示的なプロトコルを提供する。
いくつかの実施形態では、１４日目の生細胞の総数が、ＲＥＰの０日目及び／または第２の拡張の０日目（すなわち、第２の拡張の開始日）に培養された初期の生細胞数よりも少ない場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。
いくつかの実施形態では、７日目及び１４日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、ＲＥＰの０日目及び／または第２の拡張の０日目（すなわち、第２の拡張の開始日）に培養された初期の生細胞数から増加しなかった場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。
いくつかの実施形態では、７日目及び１４日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、ＲＥＰの０日目及び／または第２の拡張の０日目（すなわち、第２の拡張の開始日）に培養された初期の生細胞数から増加しなかった場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、５～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び１０００～６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、１０～５０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、２０～４０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～４０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、２５～３５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２５００～３５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。
いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、ＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、人工抗原提示フィーダー細胞である。ある実施形態では、第２の拡張におけるＴＩＬの抗原提示フィーダー細胞に対する比率は、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００、または約１：５００である。ある実施形態では、第２の拡張におけるＴＩＬの抗原提示フィーダー細胞に対する比率は、１：５０～１：３００である。ある実施形態では、第２の拡張におけるＴＩＬの抗原提示フィーダー細胞に対する比率は、１：１００～１：２００である。
ある実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、約２．５×１０９フィーダー細胞：約１００×１０６ＴＩＬの比を必要とする。別の実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、約２．５×１０９フィーダー細胞：約５０×１０６ＴＩＬの比を必要とする。さらに別の実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、約２．５×１０９フィーダー細胞：約２５×１０６ＴＩＬを必要とする。
ある実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、第２の拡張中に過剰のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態では、フィーダー細胞は、健康な献血者由来の標準の全血単位から得られる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配分離などの標準の方法を使用して取得される。ある実施形態では、人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞が、ＰＢＭＣの代わりに使用される。
一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射または熱処理のいずれかによって不活性化され、図及び実施例に記載される例示的な手順を含む、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順で使用される。
ある実施形態では、ａＡＰＣは、ＰＢＭＣの代替物として、またはＰＢＭＣと組み合わせて、第２の拡張で使用される。
ある実施形態では、Ｇｅｎ２プロセスの第２の拡張で使用される抗原提示細胞は、単球細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｂ細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｂ細胞リンパ芽細胞またはＢ－リンパ芽細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、バーキットリンパ腫細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、骨髄系細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、単球である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、ＨＬＡ－Ａ－０２陽性単球である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、急性単球性白血病細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｍ５サブタイプの急性単球性白血病細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｒａｊｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｔｈｐ１細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｒａｍｏｓ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｕ９３７細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｄａｕｄｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、メラノサイト細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、ＨＬＡ－Ａ－０２陽性メラノサイト細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、黒色腫細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、ＨＬＡ－Ａ－０２陽性黒色腫細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｓｋ－ＭＥＬ－５、Ｍａｌｍｅ－３Ｍ、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、ＳＫ－ＭＥＬ－３、ＳＨ－４、ＳＫ－ＭＥＬ－２４、ＲＰＭＩ－７９５１、ＳＫ－ＭＥＬ－１、Ａ３７５、Ｇ－３６１、及びそれらの組み合わせ、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫からなる群から選択される。前述の実施形態のうちのいずれにおいても、抗原提示細胞は、本明細書の他の箇所に記載されるように照射され得るか、または照射されなくてもよい。
ある実施形態では、ａＡＰＣは、Ｇｅｎ２プロセスの第２の拡張で使用される。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾単球細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｂ細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｂ細胞リンパ芽細胞またはＢ－リンパ芽細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾バーキットリンパ腫細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾骨髄系譜細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾単球である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾ＨＬＡ－Ａ－０２陽性単球細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾急性単球性白血病細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｍ５サブタイプ急性単球性白血病細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｒａｊｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｔｈｐ１細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｒａｍｏｓ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｕ９３７細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｄａｕｄｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾メラノサイト細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾ＨＬＡ－Ａ－０２陽性メラノサイト細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾黒色腫細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾ＨＬＡ－Ａ－０２陽性黒色腫細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、Ｓｋ－ＭＥＬ－５、Ｍａｌｍｅ－３Ｍ、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、ＳＫ－ＭＥＬ－３、ＳＨ－４、ＳＫ－ＭＥＬ－２４、ＲＰＭＩ－７９５１、ＳＫ－ＭＥＬ－１、Ａ３７５、Ｇ－３６１、及びそれらの組み合わせ、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫からなる群から選択される遺伝子修飾抗原提示細胞である。ある実施形態では、遺伝子修飾細胞は、米国特許第１０，４１５，０１５号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＯＸ－４０アゴニスト抗体、４－１ＢＢアゴニスト抗体、ＯＫＴ－３のＦｃ鎖に結合可能な抗体、及び／またはＩＣＯＳ－Ｌを発現するように修飾される。前述の実施形態のうちのいずれにおいても、遺伝子修飾ａＡＰＣは、本明細書の他の箇所に記載されるように照射され得るか、または照射されなくてもよい。
２．サイトカイン
本明細書に記載の拡張方法は、一般に、当該技術分野で知られているように、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培養培地を使用する。
あるいは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１７／０１０７４９０Ａ１及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／１８９３５７号（これらの各々は参照によりそれら全体が本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されているように、ＴＩＬの急速拡張及びまたは第２の拡張のためにサイトカインの組み合わせを使用することもさらに可能であり、組み合わせは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１のうちの２つ以上である。したがって、可能な組み合わせには、ＩＬ－２及びＩＬ－１５、ＩＬ－２及びＩＬ－２１、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１、ならびにＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１が含まれ、後者は多くの実施形態において特定の用途を見出す。サイトカインの組み合わせの使用は、リンパ球、特にそこに記載されているようにＴ細胞の生成に特に有利に働く。
Ｅ．ステップＥ：ＴＩＬを採取する
第２の拡張ステップ後、細胞が採取され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、図１に提供されるように、１、２、３、４つ、またはそれ以上の拡張ステップ後に採取される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、図１に提供されるように、２つの拡張ステップ後に採取される。
ＴＩＬは、例えば、遠心分離を含む、任意の適切な滅菌様式で採取され得る。ＴＩＬを採取するための方法は、当該技術分野で周知であり、いずれかのかかる既知の方法が本プロセスで用いられ得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、自動化システムを使用して採取される。
細胞採取機及び／または細胞処理システムは、例えば、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ、Ｔｏｍｔｅｃ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、及びＩｎｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃを含む、様々な供給源から市販されている。任意の細胞ベースの採取機が本方法とともに用いられ得る。いくつかの実施形態では、細胞採取機及び／または細胞処理システムは、膜ベースの細胞採取機である。いくつかの実施形態では、細胞採取は、ＬＯＶＯシステム（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉによって製造されたもの）などの細胞処理システムによるものである。「ＬＯＶＯ細胞処理システム」という用語は、細胞を含む溶液を、滅菌及び／または閉鎖系環境で回転膜または回転フィルターなどの膜またはフィルターをとおしてポンプ輸送し、連続フローを可能にし、細胞を処理して、ペレット化せずに上清または細胞培養培地を除去する、任意のベンダーによって製造された任意の機器または装置も指す。いくつかの実施形態では、細胞採取機及び／または細胞処理システムは、滅菌閉鎖系内で、細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮、及び／または他の細胞処理ステップを行うことができる。
いくつかの実施形態では、採取、例えば、図１によるステップＥは、閉鎖系バイオリアクターから行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １０またはＧ－Ｒｅｘ １００である。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
いくつかの実施形態では、図１によるステップＥは、実施例１４に記載のプロセスに従って行われる。いくつかの実施形態では、閉鎖系は、閉鎖系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。いくつかの実施形態では、実施例１４に記載の閉鎖系が用いられる。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、実施例１４に記載の方法に従って採取される。いくつかの実施形態では、１日目～１１日目のＴＩＬは、記載されるような方法を使用して採取される（実施例１４では１１日目のＴＩＬ採取と称される）。いくつかの実施形態では、１２日目～２２日目のＴＩＬは、記載されるような方法を使用して採取される（実施例１４では２２日目のＴＩＬ採取と称される）。
Ｆ．ステップＦ：拡張ＴＩＬのアッセイ
いくつかの実施形態では、上記で提供されるステップからの拡張ＴＩＬの効力及び／または機能性は、本明細書に記載のアッセイ方法のうちの１つを使用して調べられる。
ある実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるＧｅｎ２ ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｇｅｎ２ ＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｇｅｎ２ ＴＩＬ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｇｅｎ２ ＴＩＬ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｇｅｎ２ ＴＩＬ細胞製品の効力を決定するステップと、を含む。
あるいは、いくつかの実施形態では、拡張ＴＩＬを、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、パーフォリン、及びＴＮＦ－αからなる群から選択される少なくとも２つの分析物の、ＥＬＩＳＡまたは自動ＥＬＩＳＡ（例えば、ＥＬＬＡ）検出によるＣＤ３またはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズベースの刺激を含む複合アッセイを使用して分析する。ある実施形態では、かかる複合アッセイの仕様は、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも６００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも７００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも８００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも９００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも１１００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも１２００ｐｇ／ｍＬであり、被験試料の各ｍＬは、１×１０５ＴＩＬ、２×１０５ＴＩＬ、３×１０５ＴＩＬ、４×１０５ＴＩＬ、５×１０５ＴＩＬ、６×１０５ＴＩＬ、７×１０５ＴＩＬ、８×１０５ＴＩＬ、９×１０５ＴＩＬ、または１０×１０５ＴＩＬを含有する。
Ｇ．ステップＧ：最終製剤及び輸液容器への移行
図１に例示的な順序で提供されるステップＡ～Ｅ、ならびに上及び本明細書で詳細に概説されるステップＦが完了した後、細胞は、患者への投与に使用するために容器に移される。いくつかの実施形態では、治療的に十分な数のＴＩＬが上記の拡張方法を使用して取得されると、それらは、本明細書に記載の薬学的組成物を含む薬学的組成物として患者に投与する際に使用するために、注入バッグまたは無菌バイアルを含み得る容器に移される。ＴＩＬは、かかる容器への移送後に効力について評価されてもよく、これは、安定性試験のためなど、移送直後または容器が一定期間保管された直後に起こり得る。
ある実施形態では、薬学的組成物は、滅菌緩衝液中のＴＩＬ懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡張されたＴＩＬは、当該技術分野で知られている任意の好適な経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、単回の動脈内または静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、およそ３０～６０分続く。他の好適な投与経路には、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内投与が含まれる。
Ｖ．Ｇｅｎ３ ＴＩＬ製造プロセス
いかなる特定の理論にも限定されることなく、本発明の方法に記載される、Ｔ細胞の活性化をプライミングする、プライミングによる第１の拡張と、それに続くＴ細胞の活性化を促進する急速な第２の拡張により、「より若い」表現型を保持する拡張されたＴ細胞の調製が可能になると考えられ、したがって、本発明の拡張されたＴ細胞が、他の方法によって拡張されたＴ細胞よりも高いがん細胞に対する細胞傷害性を示すことが予想される。特に、本発明の方法によって教示される、抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ－３）、ＩＬ－２、及び任意選択で抗原提示細胞（ＡＰＣ）への曝露によってプライミングされ、その後、追加の抗ＣＤ－３抗体（例えば、ＯＫＴ－３）、ＩＬ－２、及びＡＰＣへのその後の曝露によって促進されるＴ細胞の活性化が、培養下でＴ細胞の成熟を限定または回避し、成熟度の低い表現型を有するＴ細胞集団を産生し、これらのＴ細胞が、培養下での拡張によってあまり疲弊せず、より高いがん細胞に対する細胞傷害性を示すと考えられる。例示的なプロセスを図８に示す。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）Ｔ細胞を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養でのＴ細胞を、第１の容器よりも大きい第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移し、小規模培養由来のＴ細胞を、第２の容器内でのより大規模な培養で約４～７日間培養することとによって、培養のスケールアップを達成する。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）Ｔ細胞を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での第１の小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）第１の小規模培養由来のＴ細胞を、第１の容器とサイズが等しい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウトを達成し、各第２の容器内で、第１の小規模培養由来のかかる第２の容器に移されたＴ細胞の一部が、第２の小規模培養で約４～７日間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）Ｔ細胞を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養由来のＴ細胞を、第１の容器よりもサイズが大きい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養由来のかかる第２の容器に移されたＴ細胞の一部が、より大規模な培養で約４～７日間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）Ｔ細胞を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養由来のＴ細胞を、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養由来のかかる第２の容器に移されたＴ細胞の一部が、より大規模な培養で約５日間培養される。
いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張は、プライミングによる第１の拡張によってもたらされるＴ細胞の活性化が減少、軽減、衰退、または沈静化し始めた後に行われる。
いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張は、プライミングによる第１の拡張によってもたらされるＴ細胞の活性化が、正確にまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％減少した後に行われる。
いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張は、プライミングによる第１の拡張によってもたらされるＴ細胞の活性化が、正確にまたは約１％～１００％の範囲のパーセンテージ減少した後に行われる。
いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張は、プライミングによる第１の拡張によってもたらされるＴ細胞の活性化が、正確にまたは約１％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～１００％の範囲のパーセンテージ減少した後に行われる。
いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張は、プライミングによる第１の拡張によってもたらされるＴ細胞の活性化が、少なくとも正確にまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％減少した後に行われる。
いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張は、プライミングによる第１の拡張によってもたらされるＴ細胞の活性化が、最大で正確にまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％減少した後に行われる。
いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張によってもたらされるＴ細胞の活性化の減少は、抗原による刺激に応答してＴ細胞によって放出されるインターフェロンγの量の減少によって決定される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプライミングによる第１の拡張は、最大で正確にまたは約７日または約８日の期間中に行われる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプライミングによる第１の拡張は、最大で正確にまたは約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、または８日の期間中に行われる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプライミングによる第１の拡張は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、または８日の期間中に行われる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の急速な第２の拡張は、最大で正確にまたは約１１日の期間中に行われる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の急速な第２の拡張は、最大で正確にまたは約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、または１１日の期間中に行われる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の急速な第２の拡張は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、または１１日の期間中に行われる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプライミングによる第１の拡張は、正確にまたは約１日～正確にまたは約７日の期間中に行われ、Ｔ細胞の急速な第２の拡張は、正確にまたは約１日～正確にまたは約１１日の期間中に行われる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプライミングによる第１の拡張は、最大で正確にまたは約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、または８日の期間中に行われ、Ｔ細胞の急速な第２の拡張は、最大で正確にまたは約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、または１１日の期間中に行われる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプライミングによる第１の拡張は、正確にまたは約１日～正確にまたは約８日の期間中に行われ、Ｔ細胞の急速な第２の拡張は、正確にまたは約１日～正確にまたは約９日の期間中に行われる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプライミングによる第１の拡張は、８日の期間中に行われ、Ｔ細胞の急速な第２の拡張は、９日の期間中に行われる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプライミングによる第１の拡張は、正確にまたは約１日～正確にまたは約７日の期間中に行われ、Ｔ細胞の急速な第２の拡張は、正確にまたは約１日～正確にまたは約９日の期間中に行われる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプライミングによる第１の拡張は、７日の期間中に行われ、Ｔ細胞の急速な第２の拡張は、９日の期間中に行われる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）である。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、がんに罹患しているドナーから取得される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、がんに罹患している患者から切除された腫瘍から取得されたＴＩＬである。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、黒色腫に罹患している患者から切除された腫瘍から取得されたＴＩＬである。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、血液系悪性腫瘍に罹患している患者の骨髄から取得されたＭＩＬである。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から取得されたＰＢＬである。いくつかの実施形態では、ドナーは、がんに罹患している。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒト乳頭腫ウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒト乳頭腫ウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ドナーは、腫瘍に罹患している。いくつかの実施形態では、腫瘍は、液体腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、ドナーは、血液系悪性腫瘍に罹患している。
本開示の特定の態様では、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ分離などの当業者に知られている任意の数の技法を使用して対象から収集された血液の単位から得ることができる。好ましい一態様では、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって取得される。アフェレーシス産物は、典型的には、リンパ球、例えば、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、血小板を含む。一態様では、アフェレーシスによって収集された細胞が洗浄されて、血漿画分が除去され、任意選択で、その後の処理ステップのために細胞を適切な緩衝液または培地に入れられ得る。一実施形態では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替の実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠き得るか、またはすべてではないが多くの二価カチオンを欠き得る。一態様では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、かつ単球を枯渇させることによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ勾配による遠心分離によって、または対向流遠心溶出法によって末梢血リンパ球から単離される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ドナー由来のリンパ球が濃縮された全血またはアフェレーシス産物から分離されたＰＢＬである。いくつかの実施形態では、ドナーは、がんに罹患している。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒト乳頭腫ウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択されるがんである。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒト乳頭腫ウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ドナーは、腫瘍に罹患している。いくつかの実施形態では、腫瘍は、液体腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、ドナーは、血液系悪性腫瘍に罹患している。いくつかの実施形態では、ＰＢＬは、正または負の選択方法を使用することによって、すなわち、Ｔ細胞表現型について、マーカー（複数可）、例えば、ＣＤ３＋ＣＤ４５＋を使用してＰＢＬを除去することによって、または非Ｔ細胞表現型細胞を除去してＰＢＬを残すことによって、リンパ球が濃縮された全血またはアフェレーシス産物から単離される。他の実施形態では、ＰＢＬは、勾配遠心分離によって単離される。ドナー組織からＰＢＬを単離した時点で、ＰＢＬのプライミングによる第１の拡張は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかのプライミングによる第１の拡張ステップに従って、プライミングによる第１の拡張培養下で好適な数の単離されたＰＢＬ（いくつかの実施形態では、およそ１×１０７ＰＢＬ）を播種することによって開始され得る。
これらの特徴のうちのいくつかを含む、プロセス３として知られる（本明細書ではＧｅｎ３とも称される）例示的なＴＩＬプロセスが、図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に示され、本発明のこの実施形態の、プロセス２Ａを超える利点のうちのいくつかが、図１、２、８、３０、及び３１（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に記載される。プロセス３（Ｇｅｎ３）の実施形態は、図８及び３０（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に示される。プロセス２ＡまたはＧｅｎ２はまた、米国特許公開第２０１８／０２８０４３６号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｇｅｎ３プロセスはまた、国際特許公開第ＷＯ２０２０／０９６９８８号に記載されている。
本明細書で考察され、かつ一般に概説されるように、ＴＩＬは、患者試料から採取され、本明細書に記載され、かつＧｅｎ３と称されるＴＩＬ拡張プロセスを使用して患者に移植する前に、それらの数を拡張するように操作される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、以下で考察されるように、任意で遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、拡張前または拡張後に凍結保存され得る。解凍した時点で、それらが再刺激されて、患者への注入前に代謝を高めることができる。
いくつかの実施形態では、以下ならびに実施例及び図において詳細に考察されるように、プライミングによる第１の拡張（本明細書において急速拡張前（ＲＥＰ前）と称されるプロセス、ならびに図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＢとして示されるプロセスを含む）は、１～８日に短縮され、急速な第２の拡張（本明細書において急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）と称されるプロセス、ならびに図１（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＤとして示されるプロセスを含む）は、１～９日に短縮される。いくつかの実施形態では、以下ならびに実施例及び図において詳細に考察されるように、プライミングによる第１の拡張（本明細書において急速拡張前（ＲＥＰ前）と称されるプロセス、ならびに図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＢとして示されるプロセスを含む）は、１～８日に短縮され、急速な第２の拡張（本明細書において急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）と称されるプロセス、ならびに図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＤとして示されるプロセスを含む）は、１～８日に短縮される。いくつかの実施形態では、以下ならびに実施例及び図において詳細に考察されるように、プライミングによる第１の拡張（本明細書において急速拡張前（ＲＥＰ前）と称されるプロセス、ならびに図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＢとして示されるプロセスを含む）は、１～７日に短縮され、急速な第２の拡張（本明細書において急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）と称されるプロセス、ならびに図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＤとして示されるプロセスを含む）は、１～９日に短縮される。いくつかの実施形態では、以下ならびに実施例及び図において詳細に考察されるように、プライミングによる第１の拡張（本明細書において急速拡張前（ＲＥＰ前）と称されるプロセス、ならびに図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＢとして示されるプロセスを含む）は、１～７日間であり、急速な第２の拡張（本明細書において急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）と称されるプロセス、ならびに図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＤとして示されるプロセスを含む）は、１～１０日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＢとして記載される拡張）は、８日に短縮され、急速な第２の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＤに記載される拡張）は、７～９日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＢとして記載される拡張）は、８日間であり、急速な第２の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＤに記載される拡張）は、８～９日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＢとして記載される拡張）は、７日に短縮され、急速な第２の拡張（例えば、図１（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＤに記載される拡張）は、７～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＢとして記載される拡張）は、８日に短縮され、急速な第２の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＤに記載される拡張）は、８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＢとして記載される拡張）は、８日間であり、急速な第２の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＤに記載される拡張）は、９日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＢとして記載される拡張）は、８日間であり、急速な第２の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＤに記載される拡張）は、１０日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＢとして記載される拡張）は、７日間であり、急速な第２の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＤに記載される拡張）は、７～１０日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＢとして記載される拡張）は、７日間であり、急速な第２の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＤに記載される拡張）は、８～１０日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＢとして記載される拡張）は、７日間であり、急速な第２の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＤに記載される拡張）は、９～１０日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＢとして記載される拡張）は、７日に短縮され、急速な第２の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＤに記載される拡張）は、７～９日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張と急速な第２の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）においてステップＢ及びステップＤとして記載される拡張）との組み合わせは、以下ならびに実施例及び図面において詳細に考察されるように、１４～１６日間である。特に、本発明のある特定の実施形態が、ＩＬ－２の存在下での抗ＣＤ３抗体、例えば、ＯＫＴ－３への曝露、または少なくともＩＬ－２及び抗ＣＤ３抗体、例えば、ＯＫＴ－３の存在下での抗原への曝露によってＴＩＬが活性化される、プライミングによる第１の拡張ステップを含むと考えられる。ある特定の実施形態では、上記のようにプライミングによる第１の拡張ステップで活性化されるＴＩＬは、第１のＴＩＬ集団であり、すなわち、一次細胞集団である。
以下の「ステップ」指定Ａ、Ｂ、Ｃなどは、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）における非限定的な例を参照し、本明細書に記載されるある特定の非限定的な実施形態を参照している。以下及び図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）におけるステップの順序は例示であり、ステップの任意の組み合わせまたは順序、ならびに追加のステップ、ステップの繰り返し、及び／またはステップの省略は、本出願及び本明細書に開示される方法によって企図される。
Ａ．ステップＡ：患者の腫瘍試料を取得する
一般に、ＴＩＬは、最初に患者の腫瘍試料（「一次ＴＩＬ」）から、またはＴＩＬ様の特徴を有する末梢血リンパ球を含む末梢血リンパ球などの循環リンパ球から得られ、その後、本明細書に記載されるように、さらなる操作のためにより大きな集団に拡張され、任意選択で凍結保存され、任意選択でＴＩＬの健康の指標として表現型及び代謝パラメータについて評価される。
患者の腫瘍試料は、一般に、外科的切除、針生検、または腫瘍細胞とＴＩＬ細胞との混合物を含有する試料を得るための他の手段により、当該技術分野で知られている方法を使用して得ることができる。一般に、腫瘍試料は、原発腫瘍、浸潤性腫瘍、または転移性腫瘍を含む、任意の固形腫瘍に由来し得る。腫瘍試料は、血液系悪性腫瘍から取得された腫瘍などの液体腫瘍であり得る。固形腫瘍は、皮膚（扁平上皮癌、基底細胞癌、及び黒色腫を含むが、これらに限定されない）を含むが、これに限定されない、任意の種類のがんであり得る。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫である。いくつかの実施形態では、悪性黒色腫腫瘍が特に高レベルのＴＩＬを有することが報告されているため、有用なＴＩＬは、悪性黒色腫腫瘍から取得される。
取得された時点で、腫瘍試料は、一般に、鋭的解剖を使用して１～約８ｍｍ３の小片に断片化され、約２～３ｍｍ３が特に有用である。ＴＩＬは、酵素腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。かかる腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０緩衝液、２ｍＭのグルタメート、１０ｍｃｇ／ｍＬのゲンタマイシン、３０単位／ｍＬのＤＮａｓｅ、及び１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ）中でのインキュベーション、続いて、機械的解離（例えば、組織解離機を使用する）によって産生され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地に入れ、腫瘍をおよそ１分間機械的に解離させ、続いて５％ ＣＯ２中３７℃で３０分間インキュベートし、続いて小さな組織片のみが存在するまで、前述の条件下で機械的解離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことによって産生することができる。このプロセスの最後に、細胞懸濁液中に多数の赤血球または死細胞が含まれている場合、ＦＩＣＯＬＬ分岐親水性多糖類を使用した密度勾配分離が行われて、これらの細胞を除去することができる。米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものなどの当該技術分野で知られている代替の方法を使用することができる。前述の方法のうちのいずれかが、ＴＩＬを拡張する方法またはがんを治療する方法について本明細書に記載される実施形態のうちのいずれかにおいて使用され得る。
腫瘍解離酵素混合物には、１つ以上の解離（消化）酵素、例えば、限定されないが、コラゲナーゼ（任意のブレンドまたはコラゲナーゼの種類を含む）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）、ヒアルロニダーゼ、中性プロテアーゼ（ディスパーゼ）、キモトリプシン、キモパパイン、トリプシン、カゼイナーゼ、エラスターゼ、パパイン、ＸＩＶ型プロテアーゼ（プロナーゼ）、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ）、トリプシン阻害剤、任意の他の解離酵素またはタンパク質分解酵素、及びそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、解離酵素は、凍結乾燥酵素から再構成される。いくつかの実施形態では、凍結乾燥酵素は、ＨＢＳＳなどの滅菌緩衝液の量で再構成される。
いくつかの事例では、コラゲナーゼ（アニマルフリー１型コラゲナーゼなど）を、１０ｍＬの滅菌ＨＢＳＳまたは別の緩衝液で再構成する。凍結乾燥ストック酵素は、２８９２ＰＺ Ｕ／バイアルの濃度であり得る。いくつかの実施形態では、コラゲナーゼは、５ｍＬ～１５ｍＬの緩衝液中で再構成される。いくつかの実施形態では、再構成後のコラゲナーゼストックは、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約４００ＰＺ Ｕ／ｍＬの範囲、例えば、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約４００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約３５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約３００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約４００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２１０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２２０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２３０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２４０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２６０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２７０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２８０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２８９．２ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約３００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約３５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、または約４００ＰＺ Ｕ／ｍＬである。
いくつかの実施形態では、中性プロテアーゼは、１ｍＬの滅菌ＨＢＳＳまたは別の緩衝液中で再構成される。凍結乾燥ストック酵素は、１７５ＤＭＣ Ｕ／バイアルの濃度であり得る。凍結乾燥ストック酵素は、１７５ＤＭＣＵ／ｍＬの濃度であり得る。いくつかの実施形態では、再構成後の中性プロテアーゼストックは、約１００ＤＭＣ／ｍＬ～約４００ＤＭＣ／ｍＬの範囲、例えば、約１００ＤＭＣ／ｍＬ～約４００ＤＭＣ／ｍＬ、約１００ＤＭＣ／ｍＬ～約３５０ＤＭＣ／ｍＬ、約１００ＤＭＣ／ｍＬ～約３００ＤＭＣ／ｍＬ、約１５０ＤＭＣ／ｍＬ～約４００ＤＭＣ／ｍＬ、約１００ＤＭＣ／ｍＬ、約１１０ＤＭＣ／ｍＬ、約１２０ＤＭＣ／ｍＬ、約１３０ＤＭＣ／ｍＬ、約１４０ＤＭＣ／ｍＬ、約１５０ＤＭＣ／ｍＬ、約１６０ＤＭＣ／ｍＬ、約１７０ＤＭＣ／ｍＬ、約１７５ＤＭＣ／ｍＬ、約１８０ＤＭＣ／ｍＬ、約１９０ＤＭＣ／ｍＬ、約２００ＤＭＣ／ｍＬ、約２５０ＤＭＣ／ｍＬ、約３００ＤＭＣ／ｍＬ、約３５０ＤＭＣ／ｍＬ、または約４００ＤＭＣ／ｍＬである。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡｓｅ Ｉは、１ｍＬの滅菌ＨＢＳＳまたは別の緩衝液中で再構成される。凍結乾燥したストック酵素は、４ＫＵ／バイアルの濃度であった。いくつかの実施形態では、再構成後のＤＮａｓｅ Ｉストックは、約１ＫＵ／ｍＬ～１０ＫＵ／ｍＬ、例えば、約１ＫＵ／ｍＬ、約２ＫＵ／ｍＬ、約３ＫＵ／ｍＬ、約４ＫＵ／ｍＬ、約５ＫＵ／ｍＬ、約６ＫＵ／ｍＬ、約７ＫＵ／ｍＬ、約８ＫＵ／ｍＬ、約９ＫＵ／ｍＬ、または約１０ＫＵ／ｍＬの範囲である。
いくつかの実施形態では、酵素のストックは変化する可能性があるため、凍結乾燥ストックの濃度を確認し、それに応じて消化カクテルに追加される酵素の最終量を修正することに留意されたい。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、約４．７ｍＬの滅菌ＨＢＳＳ中に約１０．２ｕｌの中性プロテアーゼ（０．３６ＤＭＣ Ｕ／ｍＬ）、２１．３ｕｌのコラゲナーゼ（１．２ＰＺ／ｍＬ）及び２５０ｕｌのＤＮＡｓｅ Ｉ（２００Ｕ／ｍＬ）を含む。
上に示されるように、いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、固形腫瘍に由来する。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、断片化されない。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は断片化されず、全腫瘍として酵素消化に供される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で１～２時間消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で１～２時間、３７℃、５％ＣＯ２で消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で１～２時間、３７℃、５％ＣＯ２で回転を伴って消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、一定の回転を伴って一晩消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、３７℃、５％ＣＯ２で一定の回転を伴って一晩消化される。いくつかの実施形態では、全腫瘍が酵素と組み合わされて、腫瘍消化反応混合物が形成される。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、滅菌緩衝液中の凍結乾燥酵素で再構成される。いくつかの実施形態では、緩衝液は、滅菌ＨＢＳＳである。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、コラゲナーゼを含む。いくつかの実施形態では、コラゲナーゼは、コラゲナーゼＩＶである。いくつかの実施形態では、コラゲナーゼの作用ストックは、１００ｍｇ／ｍＬの１０倍作用ストックである。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、ＤＮＡｓｅを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡｓｅの作用ストックは、１０，０００ＩＵ／ｍＬの１０倍作用ストックである。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、ヒアルロニダーゼを含む。いくつかの実施形態では、ヒアルロニダーゼの作用ストックは、１０ｍｇ／ｍＬの１０倍作用ストックである。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、１０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ、１０００ＩＵ／ｍＬのＤＮＡｓｅ、及び１ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼを含む。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、１０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ、５００ＩＵ／ｍＬのＤＮＡｓｅ、及び１ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼを含む。
一般に、腫瘍から取得された細胞懸濁液は、「一次細胞集団」または「新たに取得された」または「新たに単離された」細胞集団と呼ばれる。ある特定の実施形態では、新たに取得されたＴＩＬ細胞集団は、抗原提示細胞、ＩＬ－１２、及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地に曝露される。
いくつかの実施形態では、断片化には、例えば、解剖及び消化を含む物理的断片化が含まれる。いくつかの実施形態では、断片化は、物理的断片化である。いくつかの実施形態では、断片化は、解剖である。いくつかの実施形態では、断片化は、消化によるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、最初に、患者から取得された酵素腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養され得る。ある実施形態では、ＴＩＬは、最初に、患者から得られた酵素腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養され得る。
腫瘍が固形腫瘍であるいくつかの実施形態では、腫瘍試料が、例えば、ステップＡ（図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に提供される）で得られた後、腫瘍は物理的断片化を受ける。いくつかの実施形態では、断片化は、凍結保存前に起こる。いくつかの実施形態では、断片化は、凍結保存後に起こる。いくつかの実施形態では、断片化は、腫瘍を得た後に、いずれの凍結保存もない場合に起こる。いくつかの実施形態では、断片化ステップは、インビトロまたはエクスビボプロセスである。いくつかの実施形態では、腫瘍が断片化され、１０、２０、３０、４０個、またはそれ以上の断片または小片が、プライミングによる第１の拡張のために各容器に入れられる。いくつかの実施形態では、腫瘍が断片化され、３０個または４０個の断片または小片が、プライミングによる第１の拡張のために各容器に入れられる。いくつかの実施形態では、腫瘍が断片化され、４０個の断片または小片が、プライミングによる第１の拡張のために各容器に入れられる。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約４～約５０個の断片を含み、各断片は、約２７ｍｍ３の体積を有する。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約１３００ｍｍ３～約１５００ｍｍ３の総体積を伴う約３０～約６０個の断片を含む。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総体積を伴う約５０個の断片を含む。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約１グラム～約１．５グラムの総質量を伴う約５０個の断片を含む。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約４個の断片を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、腫瘍断片から取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、鋭的解剖によって取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ３～１０ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ３～８ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約２ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約３ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約４ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約５ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約６ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約７ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約８ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約９ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１０ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、１～４ｍｍ×１～４ｍｍ×１～４ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、４ｍｍ×４ｍｍ×４ｍｍである。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の出血性、壊死性、及び／または脂肪性組織の量を最小限に抑えるために断片化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の出血性組織の量を最小限に抑えるために断片化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の壊死性組織の量を最小限に抑えるために断片化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の脂肪性組織の量を最小限に抑えるために断片化される。ある特定の実施形態では、腫瘍の断片化ステップは、インビトロまたはエクスビボ方法である。
いくつかの実施形態では、腫瘍の断片化は、腫瘍の内部構造を維持するために行われる。いくつかの実施形態では、腫瘍の断片化は、メスでのこ引き動作を行うことなく行われる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、腫瘍消化物から取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、例えば、ＲＰＭＩ１６４０（２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅ、及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ）であるが、これに限定されない酵素培地中でのインキュベーション、続いて、機械的解離（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）によって生成された。腫瘍を酵素培地に入れた後、腫瘍は、およそ１分間機械的に解離され得る。その後、溶液が５％ＣＯ２中３７℃で３０分間インキュベートされ、その後、およそ１分間再び機械的に破壊され得る。５％ ＣＯ２中３７℃で３０分間再びインキュベートした後、腫瘍を、およそ１分間、３回目に機械的に破壊することができる。いくつかの実施形態では、大きい組織片が存在する場合、３回目の機械的破壊後、５％ＣＯ２中３７℃でさらに３０分間インキュベートするかにかかわらず、１回または２回の追加の機械的解離が試料に適用された。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液が多数の赤血球または死細胞を含む場合、最終インキュベーションの終わりに、Ｆｉｃｏｌｌを使用した密度勾配分離が行われて、これらの細胞を除去することができる。
いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張ステップ前の細胞懸濁液は、「一次細胞集団」または「新たに取得された」または「新たに単離された」細胞集団と呼ばれる。
いくつかの実施形態では、細胞は、試料単離後（例えば、腫瘍試料を得た後及び／または腫瘍試料から細胞懸濁液を得た後）、任意選択で凍結され得、ステップＢに記載の拡張に入る前に凍結保存され得、これは以下でさらに詳細に説明されるとともに、図８（特に、例えば図８Ｂ）に例示される。
１．コア／小生検由来のＴＩＬ
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、最初に、コア生検または同様の手順によって取得された患者腫瘍試料（「一次ＴＩＬ」）から得られ、その後、本明細書に記載されるように、さらなる操作のためにより大きい集団に拡張され、任意で凍結保存され、任意で表現型及び代謝パラメータについて評価される。
いくつかの実施形態では、患者の腫瘍試料は、一般に、小生検、コア生検、針生検、または腫瘍細胞とＴＩＬ細胞との混合物を含有する試料を得るための他の手段により、当該技術分野で知られている方法を使用して取得することができる。一般に、腫瘍試料は、原発腫瘍、浸潤性腫瘍、または転移性腫瘍を含む、任意の固形腫瘍に由来し得る。腫瘍試料は、血液系悪性腫瘍から取得された腫瘍などの液体腫瘍であり得る。いくつかの実施形態では、試料は、複数の小さい腫瘍試料または生検に由来し得る。いくつかの実施形態では、試料は、同じ患者由来の単一の腫瘍からの複数の腫瘍試料を含むことができる。いくつかの実施形態では、試料は、同じ患者由来の１、２、３、または４つの腫瘍からの複数の腫瘍試料を含むことができる。いくつかの実施形態では、試料は、同じ患者由来の複数の腫瘍からの複数の腫瘍試料を含むことができる。固形腫瘍は、黒色腫である。
一般に、腫瘍コアまたは断片から取得された細胞懸濁液は、「一次細胞集団」または「新たに取得された」または「新たに単離された」細胞集団と呼ばれる。ある特定の実施形態では、新たに取得されたＴＩＬ細胞集団は、抗原提示細胞、ＩＬ－２、及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地に曝露される。
いくつかの実施形態では、腫瘍が転移性であり、かつ原発性病変が過去に効率的に治療／除去された場合、転移性病変のうちの１つの除去が必要とされ得る。いくつかの実施形態では、最も侵襲性の低いアプローチは、皮膚病変、または利用可能な場合、首または腋窩領域のリンパ節を除去することである。いくつかの実施形態では、皮膚病変が除去されるか、またはその小生検が除去される。いくつかの実施形態では、リンパ節またはその小生検が除去される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、黒色腫である。いくつかの実施形態では、黒色腫の小生検は、ほくろまたはその一部分を含む。
いくつかの実施形態では、小生検は、パンチ生検である。いくつかの実施形態では、パンチ生検は、皮膚に押し込まれた円形の刃で取得される。いくつかの実施形態では、パンチ生検は、疑わしいほくろの周りの皮膚に押し込まれた円形の刃で得られる。いくつかの実施形態では、パンチ生検は、皮膚に押し込まれた円形の刃で得られ、丸い皮膚片が採取される。いくつかの実施形態では、小生検は、パンチ生検であり、腫瘍の丸い部分が採取される。
いくつかの実施形態では、小生検は、切除生検である。いくつかの実施形態では、小生検は、切除生検であり、ほくろまたは増殖全体が除去される。いくつかの実施形態では、小生検は、切除生検であり、ほくろまたは増殖全体が、正常に見える皮膚の小縁とともに除去される。
いくつかの実施形態では、小生検は、切開生検である。いくつかの実施形態では、小生検は、切開生検であり、ほくろまたは増殖の最も不規則な部分のみが採取される。いくつかの実施形態では、小生検は、切開生検であり、切開生検は、疑わしいほくろが非常に大きい場合など、他の技法を達成することができない場合に使用される。
「固形腫瘍」という用語は、通常、嚢胞または液体領域を含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。「固形腫瘍癌」という用語は、悪性、腫瘍性、またはがん性の固形腫瘍を指す。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫である。固形腫瘍の組織構造には、実質（がん細胞）を含む相互依存的組織区画、及びがん細胞が分散しており、かつ支持微小環境を提供し得る支持間質細胞が含まれる。
いくつかの実施形態では、腫瘍由来の試料は、細針吸引物（ＦＮＡ）、コア生検、小生検（例えば、パンチ生検を含む）として取得される。いくつかの実施形態では、試料は、最初にＧ－Ｒｅｘ １０に入れられる。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのコア生検及び／または小生検試料が存在する場合、試料は、最初にＧ－Ｒｅｘ １０に入れられる。いくつかの実施形態では、３、４、５、６、８、９、または１０個以上のコア生検及び／または小生検試料が存在する場合、試料は、最初にＧ－Ｒｅｘ １００に入れられる。いくつかの実施形態では、３、４、５、６、８、９、または１０個以上のコア生検及び／または小生検試料が存在する場合、試料は、最初にＧ－Ｒｅｘ５００に入れられる。
ＦＮＡは、例えば、黒色腫を含む皮膚腫瘍から取得することができる。いくつかの事例では、黒色腫を有する患者は、外科的治療を以前に受けたことがある。
本明細書に記載のＴＩＬは、ＦＮＡ試料から得られ得る。いくつかの事例では、ＦＮＡ試料は、１８ゲージ針～２５ゲージ針の範囲の細いゲージ針を使用して、患者から得られるか、または単離される。細いゲージ針は、１８ゲージ、１９ゲージ、２０ゲージ、２１ゲージ、２２ゲージ、２３ゲージ、２４ゲージ、または２５ゲージであり得る。いくつかの実施形態では、患者由来のＦＮＡ試料は、少なくとも４００，０００個のＴＩＬ、例えば、４００，０００個のＴＩＬ、４５０，０００個のＴＩＬ、５００，０００個のＴＩＬ、５５０，０００個のＴＩＬ、６００，０００個のＴＩＬ、６５０，０００個のＴＩＬ、７００，０００個のＴＩＬ、７５０，０００個のＴＩＬ、８００，０００個のＴＩＬ、８５０，０００個のＴＩＬ、９００，０００個のＴＩＬ、９５０，０００個のＴＩＬ、またはそれ以上を含み得る。
いくつかの事例では、本明細書に記載のＴＩＬは、コア生検試料から取得される。いくつかの事例では、コア生検試料は、１１ゲージ針～１６ゲージ針の範囲の外科用または医療用針を使用して、患者から得られるか、または単離される。針は、１１ゲージ、１２ゲージ、１３ゲージ、１４ゲージ、１５ゲージ、または１６ゲージであり得る。いくつかの実施形態では、患者由来のコア生検試料は、少なくとも４００，０００個のＴＩＬ、例えば、４００，０００個のＴＩＬ、４５０，０００個のＴＩＬ、５００，０００個のＴＩＬ、５５０，０００個のＴＩＬ、６００，０００個のＴＩＬ、６５０，０００個のＴＩＬ、７００，０００個のＴＩＬ、７５０，０００個のＴＩＬ、８００，０００個のＴＩＬ、８５０，０００個のＴＩＬ、９００，０００個のＴＩＬ、９５０，０００個のＴＩＬ、またはそれ以上を含み得る。
一般に、採取された細胞懸濁液は、「一次細胞集団」または「新たに採取された」細胞集団と呼ばれる。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、腫瘍消化物から得られない。いくつかの実施形態では、固形腫瘍コアは、断片化されない。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、腫瘍消化物から取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、例えば、ＲＰＭＩ１６４０（２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅ、及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ）であるが、これに限定されない酵素培地中でのインキュベーション、続いて、機械的解離（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）によって生成された。腫瘍を酵素培地に入れた後、腫瘍は、およそ１分間機械的に解離され得る。その後、溶液が５％ＣＯ２中３７℃で３０分間インキュベートされ、その後、およそ１分間再び機械的に破壊され得る。５％ ＣＯ２中３７℃で３０分間再びインキュベートした後、腫瘍を、およそ１分間、３回目に機械的に破壊することができる。いくつかの実施形態では、大きい組織片が存在する場合、３回目の機械的破壊後、５％ＣＯ２中３７℃でさらに３０分間インキュベートするかにかかわらず、１回または２回の追加の機械的解離が試料に適用された。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液が多数の赤血球または死細胞を含む場合、最終インキュベーションの終わりに、Ｆｉｃｏｌｌを使用した密度勾配分離が行われて、これらの細胞を除去することができる。
いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ集団を取得することは、多病変サンプリング法を含む。
腫瘍解離酵素混合物には、１つ以上の解離（消化）酵素、例えば、限定されないが、コラゲナーゼ（任意のブレンドまたはコラゲナーゼの種類を含む）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）、ヒアルロニダーゼ、中性プロテアーゼ（ディスパーゼ）、キモトリプシン、キモパパイン、トリプシン、カゼイナーゼ、エラスターゼ、パパイン、ＸＩＶ型プロテアーゼ（プロナーゼ）、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ）、トリプシン阻害剤、任意の他の解離酵素またはタンパク質分解酵素、及びそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、解離酵素は、凍結乾燥酵素から再構成される。いくつかの実施形態では、凍結乾燥酵素は、ＨＢＳＳなどの滅菌緩衝液の量で再構成される。
いくつかの事例では、コラゲナーゼ（アニマルフリー１型コラゲナーゼなど）は、１０ｍＬの滅菌ＨＢＳＳまたは別の緩衝液中で再構成される。凍結乾燥ストック酵素は、２８９２ＰＺ Ｕ／バイアルの濃度であり得る。いくつかの実施形態では、コラゲナーゼは、５ｍＬ～１５ｍＬの緩衝液中で再構成される。いくつかの実施形態では、再構成後のコラゲナーゼストックは、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約４００ＰＺ Ｕ／ｍＬの範囲、例えば、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約４００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約３５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約３００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約４００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２１０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２２０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２３０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２４０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２６０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２７０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２８０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２８９．２ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約３００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約３５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、または約４００ＰＺ Ｕ／ｍＬである。
いくつかの実施形態では、中性プロテアーゼは、１ｍＬの滅菌ＨＢＳＳまたは別の緩衝液中で再構成される。凍結乾燥ストック酵素は、１７５ＤＭＣ Ｕ／バイアルの濃度であり得る。凍結乾燥ストック酵素は、１７５ＤＭＣ／ｍＬの濃度であり得る。いくつかの実施形態では、再構成後の中性プロテアーゼストックは、約１００ＤＭＣ／ｍＬ～約４００ＤＭＣ／ｍＬの範囲、例えば、約１００ＤＭＣ／ｍＬ～約４００ＤＭＣ／ｍＬ、約１００ＤＭＣ／ｍＬ～約３５０ＤＭＣ／ｍＬ、約１００ＤＭＣ／ｍＬ～約３００ＤＭＣ／ｍＬ、約１５０ＤＭＣ／ｍＬ～約４００ＤＭＣ／ｍＬ、約１００ＤＭＣ／ｍＬ、約１１０ＤＭＣ／ｍＬ、約１２０ＤＭＣ／ｍＬ、約１３０ＤＭＣ／ｍＬ、約１４０ＤＭＣ／ｍＬ、約１５０ＤＭＣ／ｍＬ、約１６０ＤＭＣ／ｍＬ、約１７０ＤＭＣ／ｍＬ、約１７５ＤＭＣ／ｍＬ、約１８０ＤＭＣ／ｍＬ、約１９０ＤＭＣ／ｍＬ、約２００ＤＭＣ／ｍＬ、約２５０ＤＭＣ／ｍＬ、約３００ＤＭＣ／ｍＬ、約３５０ＤＭＣ／ｍＬ、または約４００ＤＭＣ／ｍＬである。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡｓｅ Ｉは、１ｍＬの滅菌ＨＢＳＳまたは別の緩衝液中で再構成される。凍結乾燥したストック酵素は、４ＫＵ／バイアルの濃度であった。いくつかの実施形態では、再構成後のＤＮａｓｅ Ｉストックは、約１ＫＵ／ｍＬ～１０ＫＵ／ｍＬ、例えば、約１ＫＵ／ｍＬ、約２ＫＵ／ｍＬ、約３ＫＵ／ｍＬ、約４ＫＵ／ｍＬ、約５ＫＵ／ｍＬ、約６ＫＵ／ｍＬ、約７ＫＵ／ｍＬ、約８ＫＵ／ｍＬ、約９ＫＵ／ｍＬ、または約１０ＫＵ／ｍＬの範囲である。
いくつかの実施形態では、酵素のストックは変化する可能性があるため、凍結乾燥ストックの濃度を確認し、それに応じて消化カクテルに追加される酵素の最終量を修正することに留意されたい。
いくつかの実施形態では、酵素混合物は、約４．７ｍＬの滅菌ＨＢＳＳ中に約１０．２ｕｌの中性プロテアーゼ（０．３６ＤＭＣ Ｕ／ｍＬ）、２１．３ｕｌのコラゲナーゼ（１．２ＰＺ／ｍＬ）及び２５０ｕｌのＤＮＡｓｅ Ｉ（２００Ｕ／ｍＬ）を含む。
２．胸水ＴＩＬ
いくつかの実施形態では、試料は、胸腔内液試料である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプロセスによる拡張のためのＴＩＬの供給源は、胸腔内液試料である。いくつかの実施形態では、試料は、胸水由来試料である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプロセスによる拡張のためのＴＩＬの供給源は、胸水由来試料である。例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１４／０２９５４２６号に記載されている方法を参照されたく、これはすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬと思われる、及び／またはＴＩＬを含む任意の胸腔内液または胸水を利用することができる。かかる試料は、ＮＳＣＬＣもしくはＳＣＬＣなどの原発性または転移性肺癌に由来し得る。いくつかの実施形態では、試料は、別の臓器、例えば、乳房、卵巣、結腸、または前立腺に由来する二次転移性がん細胞であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の拡張方法で使用する試料は、胸膜浸出液である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の拡張方法で使用する試料は、胸膜漏出液である。他の生体試料は、例えば、腹部からの腹水または膵嚢胞液を含む、ＴＩＬを含有する他の漿液を含み得る。腹水及び胸腔内液は、非常に類似した化学系を伴い、腹部及び肺の両方が、悪性腫瘍における同じ物質の胸膜空間及び腹部空間に中皮線及び流体形態を有し、いくつかの実施形態では、かかる流体は、ＴＩＬを含有する。本開示が胸水を例示するいくつかの実施形態では、同じ方法が、胸腔内液またはＴＩＬを含有する他の嚢胞液を使用して同様の結果で実行されてもよい。
いくつかの実施形態では、胸腔内液は、患者から直接除去された未処理の形態である。いくつかの実施形態では、未処理の胸腔内液は、接触ステップの前に、ＥＤＴＡまたはヘパリンチューブなどの標準的な採血管に入れられる。いくつかの実施形態では、未処理の胸腔内液は、接触ステップの前に、標準的なＣｅｌｌＳａｖｅ（登録商標）チューブ（Ｖｅｒｉｄｅｘ）に入れられる。いくつかの実施形態では、試料は、生存ＴＩＬの数の減少を避けるために、患者から採取した直後にＣｅｌｌＳａｖｅチューブに入れられる。生存ＴＩＬの数は、４℃であっても、未処理の胸腔内液中に放置されると、２４時間以内に大幅に減少する可能性がある。いくつかの実施形態では、試料は、患者からの除去後１時間、５時間、１０時間、１５時間、または最大２４時間以内に適切な収集チューブ内に入れられる。いくつかの実施形態では、試料は、４℃で、患者からの除去後１時間、５時間、１０時間、１５時間、または最大２４時間以内に適切な収集チューブ内に入れられる。
いくつかの実施形態では、選択された対象からの胸腔内液試料は、希釈され得る。一実施形態では、希釈は、胸腔内液対希釈剤が１：１０である。別の実施形態では、希釈は、胸腔内液対希釈剤が１：９である。別の実施形態では、希釈は、胸腔内液対希釈剤が１：８である。別の実施形態では、希釈は、胸腔内液対希釈剤が１：５である。別の実施形態では、希釈は、胸腔内液対希釈剤が１：２である。別の実施形態では、希釈は、胸腔内液対希釈剤が１：１である。いくつかの実施形態では、希釈剤には、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、別の緩衝液、または生理学的に許容される希釈剤が含まれる。いくつかの実施形態では、試料は、患者からの収集及び希釈の直後にＣｅｌｌＳａｖｅチューブ内に入れられ、生存ＴＩＬの減少を回避し、これは、４℃であっても、未処理の胸腔内液中に放置された場合、２４～４８時間以内に有意に生じ得る。いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、患者からの除去及び希釈後１時間、５時間、１０時間、１５時間、２４時間、３６時間、最大４８時間以内に適切な収集チューブ内に入れられる。いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、４℃で、患者からの除去及び希釈後１時間、５時間、１０時間、１５時間、２４時間、３６時間、最大４８時間以内に適切な収集チューブ内に入れられる。
さらに別の実施形態では、胸腔内液試料は、さらなる処理ステップの前に、従来の手段によって濃縮される。いくつかの実施形態では、胸腔内液のこの前処理は、方法を実施する実験室への輸送のために、またはその後の分析のために（例えば、採取後２４～４８時間より後に）胸水を凍結保存しなければならない状況において好ましい。いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、それが対象から採取された後に胸腔内液試料を遠心分離し、遠心分離物またはペレットを緩衝液中に再懸濁することによって調製される。いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、輸送または後の分析及び／または処理のために凍結保存される前に、複数の遠心分離及び再懸濁に供される。
いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、濾過法を使用することによって、さらなる処理ステップの前に濃縮される。いくつかの実施形態では、接触ステップで使用される胸腔内液試料は、胸腔内液が膜を通過することを可能にするが腫瘍細胞を保持する、既知で本質的に均一な孔径を含むフィルターをとおして流体を濾過することによって調製される。いくつかの実施形態では、膜の細孔の直径は、少なくとも４μＭであり得る。別の実施形態では、細孔直径は、５μＭ以上であり得、他の実施形態では、６、７、８、９、または１０μＭのうちのいずれかであり得る。濾過後、膜によって保持されたＴＩＬを含む細胞を、膜から適切な生理学的に許容される緩衝液にすすいでもよい。次いで、このように濃縮されたＴＩＬを含む細胞は、方法の接触ステップで使用することができる。
いくつかの実施形態では、胸腔内液試料（例えば、未処理の胸腔内液を含む）、希釈胸腔内液、または再懸濁細胞ペレットは、試料中に存在する無核赤血球を特異的に溶解する溶解試薬と接触させる。いくつかの実施形態では、このステップは、胸腔内液がかなりの数のＲＢＣを含む状況で、さらなる処理ステップの前に行われる。好適な溶解試薬には、単一の溶解試薬もしくは溶解試薬及びクエンチ試薬、または溶解剤、クエンチ試薬及び固定試薬が含まれる。好適な溶解システムは市販されており、ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ（商標）システム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）が含まれる。他の溶解システムには、Ｖｅｒｓａｌｙｓｅ（商標）システム、ＦＡＣＳｌｙｓｅ（商標）システム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）、Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｐ（商標）システム、またはＥｒｙｔｈｒｏｌｙｓｅ ＩＩシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、または塩化アンモニウムシステムが含まれる。いくつかの実施形態では、溶解試薬は、赤血球の効率的な溶解、ならびに胸水におけるＴＩＬ及びＴＩＬの表現型特性の保存のような主要な要件によって異なり得る。溶解のための単一の試薬を利用することに加えて、本明細書に記載の方法に有用な溶解システムは、第２の試薬、例えば、方法の残りのステップ中に溶解試薬の効果をクエンチまたは遅延させるもの、例えばＳｔａｂｉｌｙｓｅ（商標）試薬（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を含むことができる。溶解試薬の選択または方法の好ましい実施に応じて、従来の固定試薬を使用することもできる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、未処理、希釈または多重遠心分離または処理された胸腔内液試料は、本明細書で提供されるようにさらに処理及び／または拡張される前に、約－１４０℃の温度で凍結保存される。
３．末梢血から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡張する方法
ＰＢＬ方法１。本発明のある実施形態では、ＰＢＬは、本明細書に記載のプロセスを使用して拡張される。本発明のある実施形態では、この方法は、全血からＰＢＭＣ試料を得ることを含む。ある実施形態では、この方法は、非ＣＤ１９＋画分の負の選択を使用して、ＰＢＭＣから純粋なＴ細胞を単離することによってＴ細胞を濃縮することを含む。ある実施形態では、この方法は、非ＣＤ１９＋画分の磁気ビーズベースの負の選択を使用して、ＰＢＭＣから純粋なＴ細胞を単離することによってＴ細胞を濃縮することを含む。
本発明のある実施形態では、ＰＢＬ方法１は、以下のように行われる。０日目に、凍結保存されたＰＢＭＣ試料を解凍し、ＰＢＭＣを計数する。Ｔ細胞を、ヒトＰａｎ Ｔ細胞単離キット及びＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離する。
ＰＢＬ方法２。本発明のある実施形態では、ＰＢＬは、全血からＰＢＭＣ試料を得ることを含むＰＢＬ方法２を使用して拡張される。ＰＢＭＣ由来のＴ細胞は、ＰＢＭＣを３７℃で少なくとも３時間インキュベートし、その後、次いで非接着細胞を単離することによって濃縮される。
本発明のある実施形態では、ＰＢＬ方法２は、以下のように行われる。０日目に、凍結保存されたＰＭＢＣ試料を解凍し、ＰＢＭＣ細胞を、ＣＭ－２培地中の６ウェルプレートに６００万細胞／ウェルで播種し、３７℃で３時間インキュベートする。３時間後、ＰＢＬである非接着細胞を取り出し、計数する。
ＰＢＬ方法３。本発明のある実施形態では、ＰＢＬは、末梢血からＰＢＭＣ試料を得ることを含むＰＢＬ方法３を使用して拡張される。Ｂ細胞は、ＣＤ１９＋選択を使用して単離され、Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ試料の非ＣＤ１９＋画分の負の選択を使用して選択される。
本発明のある実施形態では、ＰＢＬ方法３は、以下のように行われる。０日目に、末梢血から取得された凍結保存されたＰＢＭＣを解凍し、計数する。ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、ＣＤ１９ Ｍｕｌｔｉｓｏｒｔキット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して選別する。非ＣＤ１９＋細胞画分のうち、Ｔ細胞を、ヒトＰａｎ Ｔ細胞単離キット及びＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して精製する。
ある実施形態では、ＰＢＭＣは、全血試料から単離される。ある実施形態では、ＰＢＭＣ試料は、ＰＢＬを拡張するための出発材料として使用される。ある実施形態では、試料は、拡張プロセス前に凍結保存される。別の実施形態では、新鮮な試料が、ＰＢＬを拡張するための出発材料として使用される。本発明のある実施形態では、Ｔ細胞は、当該技術分野で知られている方法を使用してＰＢＭＣから単離される。ある実施形態では、Ｔ細胞は、ヒトＰａｎ Ｔ細胞単離キット及びＬＳカラムを使用して単離される。本発明のある実施形態では、Ｔ細胞は、当該技術分野で知られている抗体選択方法、例えば、ＣＤ１９の負の選択を使用して、ＰＢＭＣから単離される。
本発明のある実施形態では、ＰＢＭＣ試料は、非接着細胞を特定するのに有効な所望の温度である期間インキュベートされる。本発明のある実施形態では、インキュベーション時間は、約３時間である。本発明のある実施形態では、温度は、約３７℃である。その後、非接着細胞は、上記のプロセスを使用して拡張される。
いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣ試料は、キナーゼ阻害剤またはＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで任意選択で前治療された対象または患者由来のものである。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、キナーゼ阻害剤またはＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前治療された対象または患者由来のものである。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣ試料は、キナーゼ阻害剤またはＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前治療されており、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または１年間、またはそれ以上治療を受けた対象または患者由来のものである。別の実施形態では、ＰＢＭＣは、イブルチニブなどのＩＴＫ阻害剤レジメンを現在受けている患者に由来する。
いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣ試料は、キナーゼ阻害剤またはＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前治療されており、キナーゼ阻害剤またはイブルチニブなどのＩＴＫ阻害剤での治療に不応性である対象または患者由来のものである。
いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣ試料は、キナーゼ阻害剤またはＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前治療されたが、もはやキナーゼ阻害剤またはＩＴＫ阻害剤での治療を受けていない対象または患者由来のものである。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣ試料は、キナーゼ阻害剤またはＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前治療されたが、もはやキナーゼ阻害剤またはＩＴＫ阻害剤での治療を受けておらず、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１年間、またはそれ以上治療を受けていない対象または患者由来のものである。別の実施形態では、ＰＢＭＣは、ＩＴＫ阻害剤に以前に曝露されたが、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月、または少なくとも１年以内に治療されていない患者に由来する。
本発明のある実施形態では、０日目に、細胞がＣＤ１９＋について選択され、それに応じて選別される。本発明のある実施形態では、選択は、抗体結合ビーズを使用して行われる。本発明のある実施形態では、純粋なＴ細胞が、０日目にＰＢＭＣから単離される。
本発明のある実施形態では、イブルチニブまたは他のＩＴＫ阻害剤で前治療されていない患者の場合、１０～１５ｍＬのバフィーコートは、約５×１０９個のＰＢＭＣを産生し、これは、次いで、約５．５×１０７個のＰＢＬを産生する。
本発明のある実施形態では、イブルチニブまたは他のＩＴＫ阻害剤で前治療された患者の場合、拡張プロセスは、約２０×１０９個のＰＢＬを産生する。本発明のある実施形態では、４０．３×１０６個のＰＢＭＣは、約４．７×１０５個のＰＢＬを産生する。
前述の実施形態のうちのいずれにおいても、ＰＢＭＣは、全血試料から、アフェレーシスによって、バフィーコートから、またはＰＢＭＣを得るための当該技術分野で知られている任意の他の方法から得られ得る。
４．骨髄由来のＰＢＭＣから骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を拡張する方法
ＭＩＬ方法３。本発明のある実施形態では、この方法は、骨髄からＰＢＭＣを得ることを含む。０日目に、ＰＢＭＣがＣＤ３＋／ＣＤ３３＋／ＣＤ２０＋／ＣＤ１４＋について選択され、選別され、非ＣＤ３＋／ＣＤ３３＋／ＣＤ２０＋／ＣＤ１４＋細胞画分が超音波処理され、超音波処理された細胞画分の一部が選択された細胞画分に戻し追加される。
本発明のある実施形態では、ＭＩＬ方法３は、以下のように行われる。０日目に、凍結保存されたＰＢＭＣ試料を解凍し、ＰＢＭＣを計数する。細胞を、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ２０、及びＣＤ１４抗体で染色し、選別されたＳ３ｅ細胞（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して選別する。細胞を、免疫細胞画分（またはＭＩＬ画分）（ＣＤ３＋ＣＤ３３＋ＣＤ２０＋ＣＤ１４＋）及びＡＭＬ芽球画分（非ＣＤ３＋ＣＤ３３＋ＣＤ２０＋ＣＤ１４＋）の２つの画分に選別する。
本発明のある実施形態では、ＰＢＭＣは、骨髄から得られる。ある実施形態では、ＰＢＭＣは、アフェレーシス、吸引、針生検、または当該技術分野で知られている他の同様の手段により骨髄から得られる。ある実施形態では、ＰＢＭＣは、新鮮である。別の実施形態では、ＰＢＭＣは、凍結保存される。
本発明のある実施形態では、ＭＩＬは、１０～５０ｍＬの骨髄穿刺液から拡張される。本発明のある実施形態では、１０ｍＬの骨髄穿刺液が患者から取得される。別の実施形態では、２０ｍＬの骨髄穿刺液が患者から取得される。別の実施形態では、３０ｍＬの骨髄穿刺液が患者から取得される。別の実施形態では、４０ｍＬの骨髄穿刺液が患者から取得される。別の実施形態では、５０ｍＬの骨髄穿刺液が患者から取得される。
本発明のある実施形態では、約１０～５０ｍＬの骨髄穿刺液から産生されたＰＢＭＣの数は、約５×１０７～約１０×１０７個のＰＢＭＣである。別の実施形態では、産生されたＰＭＢＣの数は、約７×１０７個のＰＢＭＣである。
本発明のある実施形態では、約５×１０７～約１０×１０７個のＰＢＭＣは、約０．５×１０６～約１．５×１０６個のＭＩＬを産生する。本発明のある実施形態では、約１×１０６個のＭＩＬが産生される。
本発明のある実施形態では、骨髄吸引物から得られた１２×１０６個のＰＢＭＣは、およそ１．４×１０５個のＭＩＬを産生する。
前述の実施形態のうちのいずれにおいても、ＰＢＭＣは、全血試料から、骨髄から、アフェレーシスによって、バフィーコートから、またはＰＢＭＣを得るための当該技術分野で知られている任意の他の方法から得られ得る。
Ｂ．ステップＢ：プライミングによる第１の拡張
いくつかの実施形態では、本方法は、より古いＴＩＬ（すなわち、対象／患者への投与前により多くの複製ラウンドをさらに受けたＴＩＬ）よりも追加の治療的利益を提供し得る、より若いＴＩＬを提供する。若いＴＩＬの特徴は、文献、例えば、Ｄｏｎｉａ，ａｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７５：１５７－１６７（２０１２）、Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１６：６１２２－６１３１（２０１０）、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２８（３）：２５８－２６７（２００５）、Ｂｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９（１７）：ＯＦ１－ＯＦ９（２０１３）、Ｂｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３２：４１５－４２３（２００９）、Ｒｏｂｂｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４；１７３：７１２５－７１３０、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，３０：１２３－１２９（２００７）、Ｚｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２８：５３－６２（２００５）、及びＴｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，３１：７４２－７５１（２００８）に記載されており、これらはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図８Ｃ）のステップＡに記載されるものなどの腫瘍断片及び／または腫瘍断片の解剖または消化後に、得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長を好む条件下で、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びフィーダー細胞（例えば、抗原提示フィーダー細胞）を含有する血清中で培養される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びフィーダー細胞は、腫瘍消化物及び／または腫瘍断片とともに培養開始時に（例えば、０日目に）追加される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物及び／または腫瘍断片は、１容器当たり最大６０個の断片及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む容器内でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、数日間、一般に１～８日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、数日間、一般に１～７日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張は、１～８日間起こり、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張は、１～７日間起こり、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、このプライミングによる第１の拡張は、５～８日間起こり、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、このプライミングによる第１の拡張は、５～７日間起こり、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、このプライミングによる第１の拡張は、約６～８日間起こり、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に、約１×１０８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、このプライミングによる第１の拡張は、約６～７日間起こり、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に、約１×１０８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、このプライミングによる第１の拡張は、約７～８日間起こり、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に、約１×１０８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、このプライミングによる第１の拡張は、約７日間起こり、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８のバルクＴＩＬ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、このプライミングによる第１の拡張は、約８日間起こり、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８のバルクＴＩＬ細胞をもたらす。
好ましい実施形態では、ＴＩＬの拡張は、以下及び本明細書に記載されるプライミングによる第１の拡張ステップ（例えば、ｐｒｅ－ＲＥＰまたはプライミングＲＥＰと称されるプロセスを含み得、０日目及び／または培養開始からのフィーダー細胞を含有する、図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）のステップＢに記載されるものなど）、続いて以下のステップＤ及び本明細書に記載される急速な第２の拡張（ステップＤ、急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）ステップと称されるプロセスを含む）、続いて任意に凍結保存、続いて以下及び本明細書に記載される第２のステップＤ（再刺激ＲＥＰステップと称されるプロセスを含む）を使用して行うことができる。このプロセスから取得されたＴＩＬは、本明細書に記載の表現型特徴及び代謝パラメータについて任意で特徴付けられ得る。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ３～１０ｍｍ３である。
いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、培養培地の略語である「ＣＭ」と称される。いくつかの実施形態では、ステップＢのＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充した、ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＲＰＭＩ １６４０からなる。
いくつかの実施形態では、２４０個以下の腫瘍断片が存在する。いくつかの実施形態では、４つ以下の容器に入れられた２４０個以下の腫瘍断片が存在する。いくつかの実施形態では、容器は、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコである。いくつかの実施形態では、６０個以下の腫瘍断片が１つの容器に入れられる。いくつかの実施形態では、各容器は、１容器当たり５００ｍＬ以下の培地を含む。いくつかの実施形態では、培地は、ＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、培地は、抗原提示フィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、培地は、ＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、容器は、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコである。いくつかの実施形態では、培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇのＯＫＴ－３、及び２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３、及び２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。
腫瘍断片の調製後、結果として得られた細胞（すなわち、一次細胞集団である断片）は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長を好み、かつ０日目の培養開始からＴＩＬプライミング及び加速された成長を可能にする条件下で、ＩＬ－２、抗原提示フィーダー細胞、及びＯＫＴ－３を含む培地中で培養される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物及び／または腫瘍断片は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、ならびに抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３とインキュベートされる。この一次細胞集団は、数日間、一般に１～８日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８のバルクＴＩＬ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張中の成長培地は、ＩＬ－２またはそのバリアント、ならびに抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、数日間、一般に１～７日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８のバルクＴＩＬ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張中の成長培地は、ＩＬ－２またはそのバリアント、ならびに抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき２０～３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき２０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき２５×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、４～８×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、５～７×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、６×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、実施例Ｃに記載されるように調製される。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約１０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、または約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、ＩＬ－２をさらに含む。好ましい実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、または約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ、または約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、または約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。ある実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、ＩＬ－１５をさらに含む。好ましい実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。
いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、または約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２１をさらに含む。好ましい実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。
ある実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。ある実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇの間、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、１５ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＯＫＴ－３抗体は、ムロモナブである。
いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質、ならびにそれらの断片、誘導体、バリアント、バイオシミラー、及び組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、２０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストに加えて、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、ＩＬ－２を約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で、及びＯＫＴ－３を約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度でさらに含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストが、４－１ＢＢアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストに加えて、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、ＩＬ－２を約６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で、及びＯＫＴ－３を約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度でさらに含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストが、４－１ＢＢアゴニストを含む。
いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、培養培地の略語である「ＣＭ」と称される。いくつかの実施形態では、それは、ＣＭ１（培養培地１）と称される。いくつかの実施形態では、ＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充した、ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＲＰＭＩ１６４０からなる。いくつかの実施形態では、ＣＭは、実施例に記載されるＣＭ１であり、実施例Ａを参照されたい。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張は、初期細胞培養培地または第１の細胞培養培地中で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培地または初期細胞培養培地または第１の細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞（本明細書ではフィーダー細胞とも称される）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される拡張プロセスで使用される培地は、無血清培地または合成培地である。いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、基礎細胞培地ならびに血清サプリメント及び／または血清代替物を含む。いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、血清含有培地のロット間の変動に部分的に起因する実験変動を防止及び／または減少させるために使用される。
いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、基礎細胞培地ならびに血清サプリメント及び／または血清代替物を含む。いくつかの実施形態では、基礎細胞培地には、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ ＳＦＭ、ＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ成長培地、及びイスコフ改変ダルベッコ培地が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、血清サプリメントまたは血清代替物には、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｅｒｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代用物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代用物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代用物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の抗生物質、及び１つ以上の微量元素のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、合成培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸塩、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ならびに微量元素部分Ａｇ＋、Ａｌ３＋、Ｂａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｇｅ４＋、Ｓｅ４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ２＋、Ｐ、Ｓｉ４＋、Ｖ５＋、Ｍｏ６＋、Ｎｉ２＋、Ｒｂ＋、Ｓｎ２＋、及びＺｒ４＋を含有する化合物からなる群から選択される１つ以上の成分と、を含む。いくつかの実施形態では、合成培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム、及び／または２－メルカプトエタノールをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔは、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ ＳＦＭ、ＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ成長培地、及びイスコフ改変ダルベッコ培地を含むが、これらに限定されない、従来の成長培地とともに使用される。
いくつかの実施形態では、無血清または合成培地中の総血清代替物濃度（ｖｏｌ％）は、総無血清または合成培地の約１体積％、２体積％、３体積％、４体積％、５体積％、６体積％、７体積％、８体積％、９体積％、１０体積％、１１体積％、１２体積％、１３体積％、１４体積％、１５体積％、１６体積％、１７体積％、１８体積％、１９体積％、または２０体積％である。いくつかの実施形態では、総血清代替物濃度は、無血清または合成培地の総体積の約３％である。いくつかの実施形態では、総血清代替物濃度は、無血清または合成培地の総体積の約５％である。いくつかの実施形態では、総血清代替物濃度は、無血清または合成培地の総体積の約１０％である。
いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）のいずれの製剤も、本発明において有用である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭは、１ＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍと、２６ｍＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔとの組み合わせであり、これらは使用前に一緒に混合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールとともに、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されており、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は、５５μＭである。
いくつかの実施形態では、合成培地は、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）のいずれの製剤も、本発明において有用である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭは、１ＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍと、２６ｍＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔとの組み合わせであり、これらは使用前に一緒に混合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールとともに、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されており、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されており、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールが補充されており、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び約２ｍＭのグルタミンが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び約２ｍＭのグルタミンが補充されており、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び約２ｍＭのグルタミンが補充されており、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されており、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は、５５μＭである。
いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、０．５ｍＭ～約９ｍＭ、１ｍＭ～約８ｍＭ、２ｍＭ～約７ｍＭ、３ｍＭ～約６ｍＭ、または４ｍＭ～約５ｍＭの濃度でグルタミン（すなわち、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標））が補充されている。いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約２ｍＭの濃度でグルタミン（すなわち、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標））が補充されている。
いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約５ｍＭ～約１５０ｍＭ、１０ｍＭ～約１４０ｍＭ、１５ｍＭ～約１３０ｍＭ、２０ｍＭ～約１２０ｍＭ、２５ｍＭ～約１１０ｍＭ、３０ｍＭ～約１００ｍＭ、３５ｍＭ～約９５ｍＭ、４０ｍＭ～約９０ｍＭ、４５ｍＭ～約８５ｍＭ、５０ｍＭ～約８０ｍＭ、５５ｍＭ～約７５ｍＭ、６０ｍＭ～約７０ｍＭ、または約６５ｍＭの濃度で２－メルカプトエタノールが補充されている。いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約５５ｍＭの濃度で２－メルカプトエタノールが補充されている。いくつかの実施形態では、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は、５５μＭである。
いくつかの実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ公開第ＷＯ／１９９８／０３０６７９号に記載されている合成培地は、本発明において有用である。その刊行物には、無血清真核細胞培養培地が記載されている。無血清真核細胞培養培地には、無血清培養下で細胞の成長を支持することができる無血清サプリメントを補充した基礎細胞培養培地が含まれる。無血清真核細胞培養培地サプリメントは、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代用物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代用物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代用物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の微量元素、及び１つ以上の抗生物質からなる群から選択される１つ以上の成分を含むか、またはそれらを組み合わせることによって取得される。いくつかの実施形態では、合成培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム、及び／またはベータ－メルカプトエタノールをさらに含む。いくつかの実施形態では、合成培地は、アルブミンまたはアルブミン代用物と、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代用物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代用物、１つ以上のコラーゲン前駆体、及び１つ以上の微量元素からなる群から選択される１つ以上の成分と、を含む。いくつかの実施形態では、合成培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸塩、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ならびに微量元素部分Ａｇ＋、Ａｌ３＋、Ｂａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｇｅ４＋、Ｓｅ４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ２＋、Ｐ、Ｓｉ４＋、Ｖ５＋、Ｍｏ６＋、Ｎｉ２＋、Ｒｂ＋、Ｓｎ２＋、及びＺｒ４＋を含有する化合物からなる群から選択される１つ以上の成分と、を含む。いくつかの実施形態では、基礎細胞培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ成長培地、及びイスコフ改変ダルベッコ培地からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、合成培地中のグリシンの濃度は、約５～２００ｍｇ／Ｌの範囲であり、Ｌ－ヒスチジンの濃度は、約５～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－イソロイシンの濃度は、約５～３００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－メチオニンの濃度は、約５～２００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－フェニルアラニンの濃度は、約５～４００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－プロリンの濃度は、約１～１０００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－ヒドロキシプロリンの濃度は、約１～４５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－セリンの濃度は、約１～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－スレオニンの濃度は、約１０～５００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－トリプトファンの濃度は、約２～１１０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－チロシンの濃度は、約３～１７５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－バリンの濃度は、約５～５００ｍｇ／Ｌであり、チアミンの濃度は、約１～２０ｍｇ／Ｌであり、還元型グルタチオンの濃度は、約１～２０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸塩の濃度は、約１～２００ｍｇ／Ｌであり、鉄飽和トランスフェリンの濃度は、約１～５０ｍｇ／Ｌであり、インスリンの濃度は、約１～１００ｍｇ／Ｌであり、亜セレン酸ナトリウムの濃度は、約０．０００００１～０．０００１ｍｇ／Ｌであり、アルブミン（例えば、ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）Ｉ）の濃度は、約５０００～５０，０００ｍｇ／Ｌである。
いくつかの実施形態では、合成培地中の非微量元素部分成分は、以下の表４の「１×培地中の濃度範囲」という見出しの下の列にリストされた濃度範囲で存在する。他の実施形態では、合成培地中の非微量元素部分成分は、以下の表３の「１×培地の好ましい実施形態」という見出しの下の列にリストされた最終濃度で存在する。他の実施形態では、合成培地は、無血清サプリメントを含む基礎細胞培地である。これらの実施形態のうちのいくつかでは、無血清サプリメントは、以下の表４の「サプリメント中の好ましい実施形態」という見出しの下の列にリストされたタイプ及び濃度の非微量部分成分を含む。
Figure 2024512029000007
いくつかの実施形態では、合成培地の浸透圧は、約２６０～３５０ｍＯｓｍｏｌである。いくつかの実施形態では、浸透圧は、約２８０～３１０ｍＯｓｍｏｌである。いくつかの実施形態では、合成培地には、最大約３．７ｇ／Ｌ、または約２．２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムが補充されている。合成培地には、Ｌ－グルタミン（最終濃度約２ｍＭ）、１つ以上の抗生物質、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、最終濃度約１００μＭ）、２－メルカプトエタノール（最終濃度約１００μＭ）がさらに補充されていてもよい。
いくつかの実施形態では、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ Ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ ＣＴＳ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ，”Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４（１）２０１５（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｔｉ．２０１４．３１）に記載の定義された培地が、本発明において有用である。簡潔には、ＲＰＭＩまたはＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒを基礎細胞培地として使用し、０、２％、５％、または１０％のいずれかのＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔを補充した。
ある実施形態では、第１及び／または第２のガス透過性容器内の細胞培地は、ろ過されていない。濾過されていない細胞培地の使用は、細胞の数を拡張するために必要な手順を簡素化することができる。ある実施形態では、第１及び／または第２のガス透過性容器内の細胞培地は、β－メルカプトエタノール（ＢＭＥまたはβＭＥ、２－メルカプトエタノールとしても知られる、ＣＡＳ６０－２４－２）を欠いている。
いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、これは、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることもあるものを含み得る）プロセスは、実施例及び図において考察されるように、１～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、これは、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることもあるものを含み得る）プロセスは、２～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、これは、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることもあるものを含み得る）プロセスは、３～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、これは、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることもあるものを含み得る）プロセスは、実施例及び図において考察されるように、４～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、これは、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることもあるものを含み得る）プロセスは、実施例及び図において考察されるように、１～７日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、これは、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることもあるものを含み得る）プロセスは、２～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、これは、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることもあるものを含み得る）プロセスは、２～７日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、これは、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることもあるものを含み得る）プロセスは、３～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、これは、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることもあるものを含み得る）プロセスは、３～７日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、これは、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることもあるものを含み得る）プロセスは、４～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、これは、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることもあるものを含み得る）プロセスは、４～７日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、これは、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることもあるものを含み得る）プロセスは、５～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、これは、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることもあるものを含み得る）プロセスは、５～７日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、これは、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることもあるものを含み得る）プロセスは、６～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、これは、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることもあるものを含み得る）プロセスは、６～７日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１及び／または図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＢに提供されるものなどのプロセスを含み、これは、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることもあるものを含み得る）プロセスは、７～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＢに提供されるものなどのプロセスを含み、これは、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることもあるものを含み得る）プロセスは、８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＢに提供されるものなどのプロセスを含み、これは、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることもあるものを含み得る）プロセスは、７日間である。
いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから１日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから１日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから２日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから２日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから３日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから３日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから４日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから４日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから５日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから５日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから６日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから６日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから７日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから７日間続行することができる。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬのプライミングによる第１の拡張は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、または８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、２日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、２日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、３日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、３日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、４日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、４日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、５日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、５日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、６日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、６日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、７日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、７日間続行することができる。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１の組み合わせは、プライミングによる第１の拡張中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図８（特に、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）による、ならびに本明細書に記載されるステップＢプロセス中を含む、プライミングによる第１の拡張中に含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の組み合わせは、プライミングによる第１の拡張中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組み合わせは、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）による、及び本明細書に記載されるステップＢプロセス中に含まれ得る。
いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張、例えば、図８によるステップＢ（特に、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）は、閉鎖系バイオリアクターにおいて行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、バイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、バイオリアクターが容器として用いられる。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ－１０またはＧ－Ｒｅｘ－１００である。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、Ｇ－Ｒｅｘ－１００である。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、Ｇ－Ｒｅｘ－１０である。
１．フィーダー細胞及び抗原提示細胞
ある実施形態では、本明細書に記載されるプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図１（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む））は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろプライミングによる第１の拡張中に追加される。ある実施形態では、本明細書に記載されるプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む））は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろ４～８日目の間の任意の時点でプライミングによる第１の拡張中に追加される。ある実施形態では、本明細書に記載されるプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む））は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろ４～７日目の間の任意の時点でプライミングによる第１の拡張中に追加される。ある実施形態では、本明細書に記載されるプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む））は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろ５～８日目の間の任意の時点でプライミングによる第１の拡張中に追加される。ある実施形態では、本明細書に記載されるプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む））は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろ５～７日目の間の任意の時点でプライミングによる第１の拡張中に追加される。ある実施形態では、本明細書に記載されるプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む））は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろ６～８日目の間の任意の時点でプライミングによる第１の拡張中に追加される。ある実施形態では、本明細書に記載されるプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む））は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろ６～７日目の間の任意の時点でプライミングによる第１の拡張中に追加される。ある実施形態では、本明細書に記載されるプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む））は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろ７日目または８日目の間の任意の時点でプライミングによる第１の拡張中に追加される。ある実施形態では、本明細書に記載されるプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む））は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろ７日目の間の任意の時点でプライミングによる第１の拡張中に追加される。ある実施形態では、本明細書に記載されるプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む））は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろ８日目の間の任意の時点でプライミングによる第１の拡張中に追加される。
ある実施形態では、本明細書に記載されるプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図８（特に、例えば図８Ｂ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにｐｒｅ－ＲＥＰまたはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む））は、ＴＩＬ拡張の開始時及びプライミングによる第１の拡張中にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要する。多くの実施形態では、フィーダー細胞は、同種異系の健康な献血者由来の標準の全血単位から取得される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配分離などの標準の方法を使用して取得される。いくつかの実施形態では、２．５×１０８のフィーダー細胞が、プライミングによる第１の拡張中に使用される。いくつかの実施形態では、容器当たり２．５×１０８のフィーダー細胞が、プライミングによる第１の拡張中に使用される。いくつかの実施形態では、ＧＲＥＸ－１０当たり２．５×１０８のフィーダー細胞が、プライミングによる第１の拡張中に使用される。いくつかの実施形態では、ＧＲＥＸ－１００当たり２．５×１０８のフィーダー細胞が、プライミングによる第１の拡張中に使用される。
一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射または熱処理のいずれかによって不活性化され、実施例に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用され、これは、照射された同種異系ＰＢＭＣの複製無能力を評価するための例示的なプロトコルを提供する。
いくつかの実施形態では、１４日目の総生細胞数が、プライミングによる第１の拡張の０日目に培養された初期の生細胞数よりも少ない場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。
いくつかの実施形態では、７日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された総生細胞数が、プライミングによる第１の拡張の０日目に培養された初期の生細胞数から増加しなかった場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。
いくつかの実施形態では、７日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された総生細胞数が、プライミングによる第１の拡張の０日目に培養された初期の生細胞数から増加しなかった場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、５～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び１０００～６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、１０～５０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、２０～４０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～４０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、２５～３５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２５００～３５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、１５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、１５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。
いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、ＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、人工抗原提示フィーダー細胞である。ある実施形態では、第２の拡張におけるＴＩＬの抗原提示フィーダー細胞に対する比率は、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００、または約１：５００である。ある実施形態では、第２の拡張におけるＴＩＬの抗原提示フィーダー細胞に対する比率は、１：５０～１：３００である。ある実施形態では、第２の拡張におけるＴＩＬの抗原提示フィーダー細胞に対する比率は、１：１００～１：２００である。
ある実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張手順は、約２．５×１０８フィーダー細胞：約１００×１０６ＴＩＬの比率を必要とする。別の実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張手順は、約２．５×１０８フィーダー細胞：約５０×１０６ＴＩＬの比率を必要とする。さらに別の実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張は、約２．５×１０８フィーダー細胞：約２５×１０６ＴＩＬを必要とする。さらに別の実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張には、約２．５×１０８のフィーダー細胞が必要である。さらに別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張は、急速な第２の拡張で使用されるフィーダー細胞の数の４分の１、３分の１、１２分の５、または半分を必要とする。
いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張における培地は、ＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張における培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張における培地は、抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張における培地は、容器当たり２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張における培地は、ＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり３０ｎｇのＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、容器は、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコである。いくつかの実施形態では、培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３、及び２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３、及び２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり５００ｍＬの培養培地及び２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞当たり１５μｇのＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり５００ｍＬの培養培地及び１５μｇのＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、容器は、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコである。いくつかの実施形態では、培地は、５００ｍＬの培養培地、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３、及び２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり５００ｍＬの培養培地、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、１５μｇのＯＫＴ－３、及び２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり５００ｍＬの培養培地及び２．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞当たり１５μｇのＯＫＴ－３を含む。
ある実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張手順は、第２の拡張中にＴＩＬを超える過剰のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態では、フィーダー細胞は、同種異系の健康な献血者由来の標準の全血単位から取得される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配分離などの標準の方法を使用して取得される。ある実施形態では、人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞がＰＢＭＣの代わりに使用される。
一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射または熱処理のいずれかによって不活性化され、図及び実施例に記載される例示的な手順を含む、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順で使用される。
ある実施形態では、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替物として、またはＰＢＭＣと組み合わせて、プライミングによる第１の拡張において使用される。
ある実施形態では、Ｇｅｎ３プロセスのプライミングによる第１の拡張で使用される抗原提示細胞は、単球細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｂ細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｂ細胞リンパ芽細胞またはＢ－リンパ芽細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、バーキットリンパ腫細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、骨髄系細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、単球である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、ＨＬＡ－Ａ－０２陽性単球である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、急性単球性白血病細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｍ５サブタイプの急性単球性白血病細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｒａｊｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｔｈｐ１細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｒａｍｏｓ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｕ９３７細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｄａｕｄｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、メラノサイト細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、ＨＬＡ－Ａ－０２陽性メラノサイト細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、黒色腫細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、ＨＬＡ－Ａ－０２陽性黒色腫細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｓｋ－ＭＥＬ－５、Ｍａｌｍｅ－３Ｍ、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、ＳＫ－ＭＥＬ－３、ＳＨ－４、ＳＫ－ＭＥＬ－２４、ＲＰＭＩ－７９５１、ＳＫ－ＭＥＬ－１、Ａ３７５、Ｇ－３６１、及びそれらの組み合わせ、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫からなる群から選択される。前述の実施形態のうちのいずれにおいても、抗原提示細胞は、本明細書の他の箇所に記載されるように照射され得るか、または照射されなくてもよい。
ある実施形態では、ａＡＰＣは、Ｇｅｎ３プロセスのプライミングによる第１の拡張で使用される。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾単球細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｂ細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｂ細胞リンパ芽細胞またはＢ－リンパ芽細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾バーキットリンパ腫細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾骨髄系譜細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾単球である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾ＨＬＡ－Ａ－０２陽性単球細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾急性単球性白血病細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｍ５サブタイプ急性単球性白血病細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｒａｊｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｔｈｐ１細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｒａｍｏｓ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｕ９３７細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｄａｕｄｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾メラノサイト細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾ＨＬＡ－Ａ－０２陽性メラノサイト細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾黒色腫細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾ＨＬＡ－Ａ－０２陽性黒色腫細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、Ｓｋ－ＭＥＬ－５、Ｍａｌｍｅ－３Ｍ、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、ＳＫ－ＭＥＬ－３、ＳＨ－４、ＳＫ－ＭＥＬ－２４、ＲＰＭＩ－７９５１、ＳＫ－ＭＥＬ－１、Ａ３７５、Ｇ－３６１、及びそれらの組み合わせ、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫からなる群から選択される遺伝子修飾抗原提示細胞である。ある実施形態では、遺伝子修飾細胞は、米国特許第１０，４１５，０１５号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＯＸ－４０アゴニスト抗体、４－１ＢＢアゴニスト抗体、ＯＫＴ－３のＦｃ鎖に結合可能な抗体、及び／またはＩＣＯＳ－Ｌを発現するように修飾される。前述の実施形態のうちのいずれにおいても、遺伝子修飾ａＡＰＣは、本明細書の他の箇所に記載されるように照射され得るか、または照射されなくてもよい。
２．サイトカイン
本明細書に記載の拡張方法は、一般に、当該技術分野で知られているように、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培養培地を使用する。
あるいは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１７／０１０７４９０Ａ１及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／１８９３５７号（これらの各々は参照によりそれら全体が本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されているように、ＴＩＬのプライミングによる第１の拡張のためにサイトカインの組み合わせを使用することもさらに可能であり、組み合わせは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１のうちの２つ以上である。したがって、可能な組み合わせには、ＩＬ－２及びＩＬ－１５、ＩＬ－２及びＩＬ－２１、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１、ならびにＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１が含まれ、後者は多くの実施形態で特に有用である。サイトカインの組み合わせの使用は、リンパ球、特にそこに記載されているようにＴ細胞の生成に特に有利に働く。
Ｃ．ステップＣ：プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行
場合によっては、例えば図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に示されるようにステップＢから取得されるＴＩＬ集団を含む、プライミングによる第１の拡張から取得されたバルクＴＩＬ母集団（ＲＥＰ前と称されることもある拡張を含み得る）は、急速な第２の拡張（これは、急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）と称されることもある拡張を含み得る）に供され、次いで、以下で考察されるように凍結保存され得る。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬが療法に使用される場合、プライミングによる第１の拡張由来の拡張ＴＩＬ集団または急速な第２の拡張由来の拡張ＴＩＬ集団は、拡張ステップ前またはプライミングによる第１の拡張後及び急速な第２の拡張前に好適な治療のために遺伝子修飾に供され得る。
いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から（例えば、図８（特に、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に示されるステップＢから）取得されたＴＩＬは、選択のために表現型決定されるまで保管される。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から（例えば、図８（特に、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に示されるステップＢから）取得されたＴＩＬは保管されず、急速な第２の拡張に直接進む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から取得されたＴＩＬは、プライミングによる第１の拡張後及び急速な第２の拡張前に凍結保存されない。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、腫瘍の断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約２日、３日、４日、５日、６日、７日、または８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約３日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約３日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約４日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約４日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約５日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約５日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約６日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約６日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約７日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約８日で起こる。
いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、または８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから１日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから１日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから２日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから２日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから３日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから３日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから４日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから４日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから５日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから５日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから６日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから６日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから７日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき、及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき、及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから８日で起こる。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、一次の第１の拡張後、及び急速な第２の拡張前に保存されず、ＴＩＬは、急速な第２の拡張に直接進行する（例えば、いくつかの実施形態では、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に示されるようにステップＢからステップＤへの移行中の保存がない）。いくつかの実施形態では、移行は、本明細書に記載されるように、閉鎖系内で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張由来のＴＩＬである第２のＴＩＬ集団は、移行期間なしで急速な第２の拡張に直接進む。
いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行、例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）によるステップＣは、閉鎖系バイオリアクター内で行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、ＧＲＥＸ－１０またはＧＲＥＸ－１００である。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、容器サイズのスケールアップを伴う。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張は、急速な第２の拡張よりも小さい容器内で行われる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張は、ＧＲＥＸ－１００内で行われ、急速な第２の拡張は、ＧＲＥＸ－５００内で行われる。
Ｄ．ステップＤ：急速な第２の拡張
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ細胞集団は、採取及びプライミングによる第１の拡張後、ステップＡ及びステップＢ、ならびに図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に示されるように、ステップＣと称される移行後に数がさらに拡張される。このさらなる拡張は、本明細書では急速な第２の拡張と称され、これは、当該技術分野で一般に、急速拡張プロセス（急速拡張プロトコルまたはＲＥＰ、ならびに図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＤに示されるプロセス）と称される拡張プロセスを含み得る。急速な第２の拡張は、一般に、フィーダー細胞、サイトカイン源、及び抗ＣＤ３抗体を含む、いくつかの成分を含む培養培地を使用して、ガス透過性容器内で達成される。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張開始の１日、２日、３日、または４日後（すなわち、Ｇｅｎ３プロセス全体の８、９、１０、または１１日目）に、ＴＩＬは、より大容量の容器に移される。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの急速な第２の拡張（ＲＥＰと称されることもある拡張、ならびに図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＤに示されるプロセスを含み得る）は、当業者に知られている任意のＴＩＬフラスコまたは容器を使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日～約９日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日～約１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日～約９日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日～約１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第３のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日～約９日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第３のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日～約１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第４のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日～約９日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第４のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日～約１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第５のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日～約９日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第５のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日～約１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第６のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日～約９日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第６のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日～約１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第７のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日～約９日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第７のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日～約１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第８のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日～約９日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第８のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日～約１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第９のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日～約１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約３日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約５日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約６日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約９日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約１０日間続行することができる。
ある実施形態では、急速な第２の拡張は、本開示の方法（例えば、ＲＥＰと称される拡張、ならびに図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＤに示されるプロセスを含む）を使用して、ガス透過性容器内で行うことができる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）の存在下での急速な第２の拡張において拡張される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びフィーダー細胞の存在下での急速な第２の拡張において拡張され、フィーダー細胞は、プライミングによる第１の拡張において存在するフィーダー細胞の濃度の２倍、２．４倍、２．５倍、３倍、３．５倍、または４倍である最終濃度まで追加される。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）またはインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下で非特異的Ｔ細胞受容体刺激を使用して、急速に拡張され得る。非特異的Ｔ細胞受容体刺激は、例えば、抗ＣＤ３抗体、例えば約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ｏｒｔｈｏ－ＭｃＮｅｉｌ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪもしくはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡから市販されている）またはＵＨＣＴ－１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡから市販）を含み得る。ＴＩＬは、がんのエピトープ（複数可）などの抗原性部分を含む、第２の拡張中に１つ以上の抗原を含むことによって、インビトロでＴＩＬのさらなる刺激を誘導するように拡張することができ、これは任意選択で、ベクター、例えば、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）結合ペプチド、例えば、０．３μＭ ＭＡＲＴ－１：２６－３５（２７Ｌ）またはｇｐｌ ００：２０９－２１７（２１０Ｍ）から、任意選択で３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２またはＩＬ－１５などのＴ細胞成長因子の存在下で発現され得る。他の好適な抗原には、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼがん抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、及びＶＥＧＦＲ２、またはそれらの抗原性部分が含まれ得る。ＴＩＬは、ＨＬＡ－Ａ２を発現する抗原提示細胞にパルスされたがんの同じ抗原（複数可）で再刺激することによっても急速に拡張され得る。あるいは、ＴＩＬは、例えば、例として照射された自己リンパ球または照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２でさらに再刺激され得る。いくつかの実施形態では、再刺激は、第２の拡張の一部として起こる。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、照射された自己リンパ球の存在下で、または照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２を用いて起こる。
ある実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、または約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ、または８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
ある実施形態では、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇの間、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、１５ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、３０ｎｇ／ｍＬ～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、約６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、ＯＫＴ－３抗体は、ムロモナブである。
いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、ＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、容器当たり７．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、ＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張培地中に、容器当たり５００ｍＬの培養培地及び３０μｇのＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、容器は、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコである。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張培地中に、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３、及び７．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり５００ｍＬの培養培地、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０μｇのＯＫＴ－３、及び７．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。
いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、ＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり５×１０８～７．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、ＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、容器当たり５００ｍＬの培養培地及び３０μｇのＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、容器は、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコである。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３、及び５×１０８～７．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、容器当たり５００ｍＬの培養培地、ならびに６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０μｇのＯＫＴ－３、及び５×１０８～７．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞を含む。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質、ならびにそれらの断片、誘導体、バリアント、バイオシミラー、及び組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、２０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストに加えて、細胞培養培地は、ＩＬ－２を約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で、及びＯＫＴ－３を約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度でさらに含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストが、４－１ＢＢアゴニストを含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１の組み合わせは、第２の拡張中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）による、ならびに本明細書に記載されるステップＤプロセス中を含む、第２の拡張中に含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の組み合わせは、第２の拡張中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組み合わせは、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）による、及び本明細書に記載されるステップＤプロセス中に含まれ得る。
いくつかの実施形態では、第２の拡張は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、抗原提示フィーダー細胞、及び任意でＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む補充された細胞培養培地において実施され得る。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、補充された細胞培養培地中で起こる。いくつかの実施形態では、補充された細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、第２の細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ、抗原提示フィーダー細胞とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞（すなわち、抗原提示細胞）を含む細胞培養培地中で起こる。
いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、または約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－１５をさらに含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。
いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、または約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。ある実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２１をさらに含む。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。
いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）は、ＰＢＭＣである。ある実施形態では、急速拡張及び／または第２の拡張におけるＴＩＬのＰＢＭＣ及び／または抗原提示細胞に対する比率は、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：２５、約１：３０、約１：３５、約１：４０、約１：４５、約１：５０、約１：７５、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００、または約１：５００である。ある実施形態では、急速拡張及び／または第２の拡張におけるＴＩＬのＰＢＭＣに対する比率は、１：５０～１：３００である。ある実施形態では、急速拡張及び／または第２の拡張におけるＴＩＬのＰＢＭＣに対する比率は、１：１００～１：２００である。
ある実施形態では、ＲＥＰ及び／または急速な第２の拡張は、バルクＴＩＬを、１００倍または２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞（フィーダー細胞濃度は、プライミングによる第１の拡張におけるフィーダー細胞濃度の少なくとも１．１倍（１．１×）、１．２×、１．３×、１．４×、１．５×、１．６×、１．７×、１．８×、１．８×、２×、２．１×、２．２×、２．３×、２．４×、２．５×、２．６×、２．７×、２．８×、２．９×、３．０×、３．１×、３．２×、３．３×、３．４×、３．５×、３．６×、３．７×、３．８×、３．９×または４．０×である）、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体、及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と１５０ｍＬの培地中で混合して、フラスコ内で行われる。培地交換（一般に、使用済み培地の３分の２の吸引及び等量の新鮮な培地との交換による、３分の２培地交換）は、細胞が代替の成長チャンバに移されるまで行われる。代替の成長チャンバには、以下でより完全に考察されるように、Ｇ－Ｒｅｘフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張（ＲＥＰプロセスと称されるプロセスを含み得る）は、実施例及び図で論じられるように、７～９日間である。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、７日間である。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、８日間である。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、９日間である。
ある実施形態では、第２の拡張（ＲＥＰと称される拡張、ならびに図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）のステップＤで参照される拡張を含み得る）は、１００ｃｍのガス透過性シリコン底部（Ｇ－Ｒｅｘ １００、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｂｒｉｇｈｔｏｎ，ＭＮ，ＵＳＡから市販）を有する５００ｍＬ容量のガス透過性フラスコ内で行うことができ、５×１０６または１０×１０６ＴＩＬは、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）が補充された４００ｍＬの５０／５０培地中でＰＢＭＣとともに培養され得る。Ｇ－Ｒｅｘ １００フラスコは、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートされ得る。５日目に、２５０ｍＬの上清が除去され、遠心分離ボトルに入れられ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心分離される。ＴＩＬペレットが、５％ヒトＡＢ血清、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮な培地で再懸濁され、元のＧＲＥＸ－１００フラスコに戻し追加され得る。ＴＩＬがＧＲＥＸ－１００フラスコで連続して拡張される場合、１０日目または１１日目に、ＴＩＬは、ＧＲＥＸ－５００などのより大きいフラスコに移され得る。培養１４日目に、細胞が採取され得る。培養１５日目に、細胞が採取され得る。培養１６日目に、細胞が採取され得る。いくつかの実施形態では、培地交換は、細胞が代替の成長チャンバに移されるまで行われる。いくつかの実施形態では、培地の３分の２は、使用済み培地の吸引及び等体積の新鮮な培地との交換によって交換される。いくつかの実施形態では、代替の成長チャンバには、以下でより完全に考察されるように、ＧＲＥＸフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される拡張プロセスで使用される培地は、無血清培地または合成培地である。いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、基礎細胞培地ならびに血清サプリメント及び／または血清代替物を含む。いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、血清含有培地のロット間の変動に部分的に起因する実験変動を防止及び／または減少させるために使用される。
いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、基礎細胞培地ならびに血清サプリメント及び／または血清代替物を含む。いくつかの実施形態では、基礎細胞培地には、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ ＳＦＭ、ＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ成長培地、及びイスコフ改変ダルベッコ培地が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、血清サプリメントまたは血清代替物には、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｅｒｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代用物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代用物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代用物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の抗生物質、及び１つ以上の微量元素のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、合成培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸塩、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ならびに微量元素部分Ａｇ＋、Ａｌ３＋、Ｂａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｇｅ４＋、Ｓｅ４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ２＋、Ｐ、Ｓｉ４＋、Ｖ５＋、Ｍｏ６＋、Ｎｉ２＋、Ｒｂ＋、Ｓｎ２＋、及びＺｒ４＋を含有する化合物からなる群から選択される１つ以上の成分と、を含む。いくつかの実施形態では、合成培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム、及び／または２－メルカプトエタノールをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔは、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＳＴ（商標）ＡＩＭ－Ｖ ＳＦＭ、ＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ成長培地、及びイスコフ改変ダルベッコ培地を含むが、これらに限定されない、従来の成長培地とともに使用される。
いくつかの実施形態では、無血清または合成培地中の総血清代替物濃度（ｖｏｌ％）は、総無血清または合成培地の約１体積％、２体積％、３体積％、４体積％、５体積％、６体積％、７体積％、８体積％、９体積％、１０体積％、１１体積％、１２体積％、１３体積％、１４体積％、１５体積％、１６体積％、１７体積％、１８体積％、１９体積％、または２０体積％である。いくつかの実施形態では、総血清代替物濃度は、無血清または合成培地の総体積の約３％である。いくつかの実施形態では、総血清代替物濃度は、無血清または合成培地の総体積の約５％である。いくつかの実施形態では、総血清代替物濃度は、無血清または合成培地の総体積の約１０％である。
いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）のいずれの製剤も、本発明において有用である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭは、１ＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍと、２６ｍＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔとの組み合わせであり、これらは使用前に一緒に混合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールとともに、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されている。
いくつかの実施形態では、合成培地は、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）のいずれの製剤も、本発明において有用である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭは、１ＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍと、２６ｍＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔとの組み合わせであり、これらは使用前に一緒に混合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールとともに、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されており、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されており、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールが補充されており、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び約２ｍＭのグルタミンが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び約２ｍＭのグルタミンが補充されており、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び約２ｍＭのグルタミンが補充されており、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。
いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、０．５ｍＭ～約９ｍＭ、１ｍＭ～約８ｍＭ、２ｍＭ～約７ｍＭ、３ｍＭ～約６ｍＭ、または４ｍＭ～約５ｍＭの濃度でグルタミン（すなわち、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標））が補充されている。いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約２ｍＭの濃度でグルタミン（すなわち、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標））が補充されている。
いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約５ｍＭ～約１５０ｍＭ、１０ｍＭ～約１４０ｍＭ、１５ｍＭ～約１３０ｍＭ、２０ｍＭ～約１２０ｍＭ、２５ｍＭ～約１１０ｍＭ、３０ｍＭ～約１００ｍＭ、３５ｍＭ～約９５ｍＭ、４０ｍＭ～約９０ｍＭ、４５ｍＭ～約８５ｍＭ、５０ｍＭ～約８０ｍＭ、５５ｍＭ～約７５ｍＭ、６０ｍＭ～約７０ｍＭ、または約６５ｍＭの濃度で２－メルカプトエタノールが補充されている。いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約５５ｍＭの濃度で２－メルカプトエタノールが補充されている。
いくつかの実施形態では、国際特許公開第ＷＯ／１９９８／０３０６７９号（これは参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている合成培地は、本発明において有用である。その刊行物には、無血清真核細胞培養培地が記載されている。無血清真核細胞培養培地には、無血清培養下で細胞の成長を支持することができる無血清サプリメントを補充した基礎細胞培養培地が含まれる。無血清真核細胞培養培地サプリメントは、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代用物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代用物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代用物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の微量元素、及び１つ以上の抗生物質からなる群から選択される１つ以上の成分を含むか、またはそれらを組み合わせることによって取得される。いくつかの実施形態では、合成培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム、及び／またはベータ－メルカプトエタノールをさらに含む。いくつかの実施形態では、合成培地は、アルブミンまたはアルブミン代用物と、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代用物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代用物、１つ以上のコラーゲン前駆体、及び１つ以上の微量元素からなる群から選択される１つ以上の成分と、を含む。いくつかの実施形態では、合成培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸塩、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ならびに微量元素部分Ａｇ＋、Ａｌ３＋、Ｂａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｇｅ４＋、Ｓｅ４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ２＋、Ｐ、Ｓｉ４＋、Ｖ５＋、Ｍｏ６＋、Ｎｉ２＋、Ｒｂ＋、Ｓｎ２＋、及びＺｒ４＋を含有する化合物からなる群から選択される１つ以上の成分と、を含む。いくつかの実施形態では、基礎細胞培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ成長培地、及びイスコフ改変ダルベッコ培地からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、合成培地中のグリシンの濃度は、約５～２００ｍｇ／Ｌの範囲であり、Ｌ－ヒスチジンの濃度は、約５～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－イソロイシンの濃度は、約５～３００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－メチオニンの濃度は、約５～２００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－フェニルアラニンの濃度は、約５～４００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－プロリンの濃度は、約１～１０００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－ヒドロキシプロリンの濃度は、約１～４５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－セリンの濃度は、約１～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－スレオニンの濃度は、約１０～５００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－トリプトファンの濃度は、約２～１１０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－チロシンの濃度は、約３～１７５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－バリンの濃度は、約５～５００ｍｇ／Ｌであり、チアミンの濃度は、約１～２０ｍｇ／Ｌであり、還元型グルタチオンの濃度は、約１～２０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸塩の濃度は、約１～２００ｍｇ／Ｌであり、鉄飽和トランスフェリンの濃度は、約１～５０ｍｇ／Ｌであり、インスリンの濃度は、約１～１００ｍｇ／Ｌであり、亜セレン酸ナトリウムの濃度は、約０．０００００１～０．０００１ｍｇ／Ｌであり、アルブミン（例えば、ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）Ｉ）の濃度は、約５０００～５０，０００ｍｇ／Ｌである。
いくつかの実施形態では、合成培地中の非微量元素部分成分は、以下の表４の「１×培地中の濃度範囲」という見出しの下の列にリストされた濃度範囲で存在する。他の実施形態では、合成培地中の非微量元素部分成分は、「１×培地の好ましい実施形態」（上の表４を参照）という見出しの下の列にリストされた最終濃度で存在する。他の実施形態では、合成培地は、無血清サプリメントを含む基礎細胞培地である。これらの実施形態のうちのいくつかでは、無血清サプリメントは、「サプリメント中の好ましい実施形態」（上の表４を参照）という見出しの下の列にリストされたタイプ及び濃度の非微量部分成分を含む。
いくつかの実施形態では、合成培地の浸透圧は、約２６０～３５０ｍＯｓｍｏｌである。いくつかの実施形態では、浸透圧は、約２８０～３１０ｍＯｓｍｏｌである。いくつかの実施形態では、合成培地には、最大約３．７ｇ／Ｌ、または約２．２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムが補充されている。合成培地には、Ｌ－グルタミン（最終濃度約２ｍＭ）、１つ以上の抗生物質、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、最終濃度約１００μＭ）、２－メルカプトエタノール（最終濃度約１００μＭ）がさらに補充されていてもよい。
いくつかの実施形態では、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ Ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ ＣＴＳ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ，”Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４（１）２０１５（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｔｉ．２０１４．３１）に記載の合成培地が、本発明において有用である。簡潔には、ＲＰＭＩまたはＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒを基礎細胞培地として使用し、０、２％、５％、または１０％のいずれかのＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔを補充した。
ある実施形態では、第１及び／または第２のガス透過性容器内の細胞培地は、ろ過されていない。濾過されていない細胞培地の使用は、細胞の数を拡張するために必要な手順を簡素化することができる。ある実施形態では、第１及び／または第２のガス透過性容器内の細胞培地は、β－メルカプトエタノール（ＢＭＥまたはβＭＥ、２－メルカプトエタノールとしても知られる、ＣＡＳ６０－２４－２）を欠いている。
ある実施形態では、急速な第２の拡張（ＲＥＰと称される拡張を含む）が行われ、優れた腫瘍反応性のためにＴＩＬが選択されるステップをさらに含む。当該技術分野で知られている任意の選択方法が使用され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１００５８Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法が、優れた腫瘍反応性のためのＴＩＬの選択に使用され得る。
任意選択で、細胞生存率アッセイは、当該技術分野で知られている標準のアッセイを使用して、急速な第２の拡張（ＲＥＰ拡張と称される拡張を含む）後に行われ得る。例えば、死細胞を選択的に標識し、生存率の評価を可能にするトリパンブルー排除アッセイが、バルクＴＩＬの試料上で行われ得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ試料は、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２自動セルカウンター（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＭＡ）を使用して計数され、生存率が決定され得る。いくつかの実施形態では、生存率は、標準のＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２ Ｉｍａｇｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒプロトコルに従って決定される。
Ｔリンパ球及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られた数であるが、多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメント：Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（接合）、及びＣ（一定）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリー多様性を示し、かつ増加させるＴＩＬを生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法によって取得されたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、第２の拡張において取得されたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、多様性の増加は、免疫グロブリン多様性及び／またはＴ細胞受容体多様性の増加である。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリンにあり、免疫グロブリン重鎖にある。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリンにあり、免疫グロブリン軽鎖にある。いくつかの実施形態では、多様性は、Ｔ細胞受容体にある。いくつかの実施形態では、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体のうちの１つにある。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／またはベータの発現が増加する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲａｂ（すなわち、ＴＣＲα／β）の発現が増加する。
いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張培養培地（例えば、ＣＭ２または第２の細胞培養培地とも称される）は、以下でさらに詳細に論じられるように、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、ならびに抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張培養培地（例えば、ＣＭ２または第２の細胞培養培地とも称される）は、以下でさらに詳細に論じられるように、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｕｇ／フラスコのＯＫＴ－３、ならびに７．５×１０８の抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張培養培地（例えば、ＣＭ２または第２の細胞培養培地とも称される）は、以下でさらに詳細に論じられるように、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、ならびに抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張培養培地（例えば、ＣＭ２または第２の細胞培養培地とも称される）は、以下でさらに詳細に論じられるように、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｕｇ／フラスコのＯＫＴ－３、ならびに５×１０８の抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。
いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張、例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）によるステップＤは、閉鎖系バイオリアクターにおいて行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、バイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、バイオリアクターが容器として用いられる。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ－１００またはＧ－Ｒｅｘ－５００である。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、Ｇ－Ｒｅｘ－１００である。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、Ｇ－Ｒｅｘ－５００である。
１．フィーダー細胞及び抗原提示細胞
ある実施形態では、本明細書に記載される急速な第２の拡張手順（例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）のステップＤに記載されるような拡張、ならびにＲＥＰと称されるものを含む）は、ＲＥＰ ＴＩＬ拡張中及び／または急速な第２の拡張中に過剰のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態では、フィーダー細胞は、健康な献血者由来の標準の全血単位から得られる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配分離などの標準の方法を使用して取得される。
一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射または熱処理のいずれかによって不活性化され、実施例に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用され、これは、照射された同種異系ＰＢＭＣの複製無能力を評価するための例示的なプロトコルを提供する。
いくつかの実施形態では、７日目または１４日目の総生細胞数が、ＲＥＰの０日目及び／または第２の拡張の０日目（すなわち、第２の拡張の開始日）に培養された初期の生細胞数よりも少ない場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。
いくつかの実施形態では、７日目及び１４日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された総生細胞数が、ＲＥＰの０日目及び／または第２の拡張の０日目（すなわち、第２の拡張の開始日）に培養された初期の生細胞数から増加しなかった場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。
いくつかの実施形態では、７日目及び１４日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された総生細胞数が、ＲＥＰの０日目及び／または第２の拡張の０日目（すなわち、第２の拡張の開始日）に培養された初期の生細胞数から増加しなかった場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び１０００～６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～４０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２５００～３５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。
いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、ＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、人工抗原提示フィーダー細胞である。ある実施形態では、第２の拡張におけるＴＩＬの抗原提示フィーダー細胞に対する比率は、約１：１０、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００、または約１：５００である。ある実施形態では、第２の拡張におけるＴＩＬの抗原提示フィーダー細胞に対する比率は、１：５０～１：３００である。ある実施形態では、第２の拡張におけるＴＩＬの抗原提示フィーダー細胞に対する比率は、１：１００～１：２００である。
ある実施形態では、本明細書に記載の第２の急速拡張手順は、約５×１０８フィーダー細胞：約１００×１０６ＴＩＬの比率を必要とする。ある実施形態では、本明細書に記載の第２の急速拡張手順は、約７．５×１０８フィーダー細胞：約１００×１０６ＴＩＬの比率を必要とする。別の実施形態では、本明細書に記載の第２の急速拡張手順は、約５×１０８フィーダー細胞：約５０×１０６ＴＩＬの比率を必要とする。別の実施形態では、本明細書に記載の第２の急速拡張手順は、約７．５×１０８フィーダー細胞：約５０×１０６ＴＩＬの比率を必要とする。さらに別の実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、約５×１０８フィーダー細胞：約２５×１０６ＴＩＬを必要とする。さらに別の実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、約７．５×１０８フィーダー細胞：約２５×１０６ＴＩＬを必要とする。さらに別の実施形態では、急速な第２の拡張は、急速な第２の拡張の２倍の数のフィーダー細胞を必要とする。さらに別の実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張が約２．５×１０８フィーダー細胞を必要とする場合、急速な第２の拡張は、約５×１０８フィーダー細胞を必要とする。さらに別の実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張が約２．５×１０８フィーダー細胞を必要とする場合、急速な第２の拡張は、約７．５×１０８フィーダー細胞を必要とする。さらに別の実施形態では、急速な第２の拡張は、プライミングによる第１の拡張の２倍（２．０×）、２．５×、３．０×、３．５×、または４．０×の数のフィーダー細胞を必要とする。
ある実施形態では、本明細書に記載の急速な第２の拡張手順は、急速な第２の拡張中に過剰のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態では、フィーダー細胞は、同種異系の健康な献血者由来の標準の全血単位から取得される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配分離などの標準の方法を使用して取得される。ある実施形態では、人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞がＰＢＭＣの代わりに使用される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、プライミングによる第１の拡張に追加されたＰＢＭＣの２倍の濃度で、急速な第２の拡張に追加される。
一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射または熱処理のいずれかによって不活性化され、図及び実施例に記載される例示的な手順を含む、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順で使用される。
ある実施形態では、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替物として、またはＰＢＭＣと組み合わせて、急速な第２の拡張において使用される。
ある実施形態では、Ｇｅｎ３プロセスの急速な第２の拡張で使用される抗原提示細胞は、単球細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｂ細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｂ細胞リンパ芽細胞またはＢ－リンパ芽細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、バーキットリンパ腫細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、骨髄系細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、単球である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、ＨＬＡ－Ａ－０２陽性単球である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、急性単球性白血病細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｍ５サブタイプの急性単球性白血病細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｒａｊｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｔｈｐ１細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｒａｍｏｓ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｕ９３７細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｄａｕｄｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、メラノサイト細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、ＨＬＡ－Ａ－０２陽性メラノサイト細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、黒色腫細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、ＨＬＡ－Ａ－０２陽性黒色腫細胞である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、Ｓｋ－ＭＥＬ－５、Ｍａｌｍｅ－３Ｍ、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、ＳＫ－ＭＥＬ－３、ＳＨ－４、ＳＫ－ＭＥＬ－２４、ＲＰＭＩ－７９５１、ＳＫ－ＭＥＬ－１、Ａ３７５、Ｇ－３６１、及びそれらの組み合わせ、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫からなる群から選択される。前述の実施形態のうちのいずれにおいても、抗原提示細胞は、本明細書の他の箇所に記載されるように照射され得るか、または照射されなくてもよい。
ある実施形態では、ａＡＰＣは、Ｇｅｎ３プロセスの急速な第２の拡張で使用される。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾単球細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｂ細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｂ細胞リンパ芽細胞またはＢ－リンパ芽細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾バーキットリンパ腫細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾骨髄系譜細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾単球である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾ＨＬＡ－Ａ－０２陽性単球細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾急性単球性白血病細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｍ５サブタイプ急性単球性白血病細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｒａｊｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｔｈｐ１細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｒａｍｏｓ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｕ９３７細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾Ｄａｕｄｉ細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾メラノサイト細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾ＨＬＡ－Ａ－０２陽性メラノサイト細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾黒色腫細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、遺伝子修飾ＨＬＡ－Ａ－０２陽性黒色腫細胞である。ある実施形態では、ａＡＰＣは、Ｓｋ－ＭＥＬ－５、Ｍａｌｍｅ－３Ｍ、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、ＳＫ－ＭＥＬ－３、ＳＨ－４、ＳＫ－ＭＥＬ－２４、ＲＰＭＩ－７９５１、ＳＫ－ＭＥＬ－１、Ａ３７５、Ｇ－３６１、及びそれらの組み合わせ、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫からなる群から選択される遺伝子修飾抗原提示細胞である。ある実施形態では、遺伝子修飾細胞は、米国特許第１０，４１５，０１５号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＯＸ－４０アゴニスト抗体、４－１ＢＢアゴニスト抗体、ＯＫＴ－３のＦｃ鎖に結合可能な抗体、及び／またはＩＣＯＳ－Ｌを発現するように修飾される。前述の実施形態のうちのいずれにおいても、遺伝子修飾ａＡＰＣは、本明細書の他の箇所に記載されるように照射され得るか、または照射されなくてもよい。
２．サイトカイン
本明細書に記載の急速な第２の拡張方法は、一般に、当該技術分野で知られているように、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培養培地を使用する。
あるいは、ＷＯ２０１５／１８９３５６及びＷＯ２０１５／１８９３５７（参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれる）に一般に概説されているように、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１のうちの２つ以上の組み合わせで、ＴＩＬの急速な第２の拡張のためにサイトカインの組み合わせを使用することもさらに可能である。したがって、可能な組み合わせには、ＩＬ－２及びＩＬ－１５、ＩＬ－２及びＩＬ－２１、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１、ならびにＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１が含まれ、後者は多くの実施形態で特に有用である。サイトカインの組み合わせの使用は、リンパ球、特にそこに記載されているようにＴ細胞の生成に特に有利に働く。
Ｅ．ステップＥ：ＴＩＬを採取する
急速な第２の拡張ステップ後、細胞が採取され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に提供されるように、１、２、３、４、またはそれ以上の拡張ステップ後に採取される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に提供されるように、２つの拡張ステップ後に採取される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、２つの拡張ステップ、例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に提供されるように、１回のプライミングによる第１の拡張及び１回の急速な第２の拡張の後に採取される。
ＴＩＬは、任意の適切な滅菌様式で、例えば、遠心分離によって採取され得る。ＴＩＬを採取するための方法は、当該技術分野で周知であり、任意のかかる既知の方法が本プロセスとともに用いられ得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、自動化システムを使用して採取される。
細胞採取機及び／または細胞処理システムは、例えば、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ、Ｔｏｍｔｅｃ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、及びＩｎｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃを含む、様々な供給源から市販されている。任意の細胞ベースの採取機が本方法とともに用いられ得る。いくつかの実施形態では、細胞採取機及び／または細胞処理システムは、膜ベースの細胞採取機である。いくつかの実施形態では、細胞採取は、ＬＯＶＯシステム（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉによって製造されたもの）などの細胞処理システムによるものである。「ＬＯＶＯ細胞処理システム」という用語は、細胞を含む溶液を、滅菌及び／または閉鎖系環境で回転膜または回転フィルターなどの膜またはフィルターをとおしてポンプ輸送し、連続フローを可能にし、細胞を処理して、ペレット化せずに上清または細胞培養培地を除去する、任意のベンダーによって製造された任意の機器または装置も指す。いくつかの実施形態では、細胞採取機及び／または細胞処理システムは、滅菌閉鎖系内で、細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮、及び／または他の細胞処理ステップを行うことができる。
いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張、例えば、図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）によるステップＤは、閉鎖系バイオリアクター内で行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、バイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、バイオリアクターが容器として用いられる。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ－１００またはＧ－Ｒｅｘ－５００である。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、Ｇ－Ｒｅｘ－１００である。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、Ｇ－Ｒｅｘ－５００である。
いくつかの実施形態では、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）によるステップＥは、本明細書に記載のプロセスに従って行われる。いくつかの実施形態では、閉鎖系は、閉鎖系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような閉鎖系が用いられる。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、本明細書に記載の方法に従って採取される。いくつかの実施形態では、１４～１６日目のＴＩＬが本明細書に記載の方法を使用して採取される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、本明細書に記載の方法を使用して１４日目に採取される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、本明細書に記載の方法を使用して１５日目に採取される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、本明細書に記載の方法を使用して１６日目に採取される。
Ｆ．ステップＦ：拡張ＴＩＬのアッセイ
いくつかの実施形態では、上記で提供されるステップからの拡張ＴＩＬの効力及び／または機能性は、本明細書に記載のアッセイ方法のうちの１つを使用して調べられる。
ある実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるＧｅｎ３ ＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．Ｇｅｎ３ ＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）Ｇｅｎ３ ＴＩＬ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）Ｇｅｎ３ ＴＩＬ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、Ｇｅｎ３ ＴＩＬ細胞製品の効力を決定するステップと、を含む。
あるいは、いくつかの実施形態では、拡張ＴＩＬを、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、パーフォリン、及びＴＮＦ－αからなる群から選択される少なくとも２つの分析物の、ＥＬＩＳＡまたは自動ＥＬＩＳＡ（例えば、ＥＬＬＡ）検出によるＣＤ３またはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズベースの刺激を含む複合アッセイを使用して分析する。ある実施形態では、かかる複合アッセイの製品放出仕様は、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも６００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも７００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも８００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも９００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも１１００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも１２００ｐｇ／ｍＬであり、被験試料の各ｍＬは、１×１０５ＴＩＬ、２×１０５ＴＩＬ、３×１０５ＴＩＬ、４×１０５ＴＩＬ、５×１０５ＴＩＬ、６×１０５ＴＩＬ、７×１０５ＴＩＬ、８×１０５ＴＩＬ、９×１０５ＴＩＬ、または１０×１０５ＴＩＬを含有する。
Ｇ．ステップＧ：最終製剤及び輸液容器への移行
図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に例示的な順序で提供され、かつ上及び本明細書で詳細に概説されるステップＡ～Ｅが完了した後、細胞は、患者への投与に使用するために、注入バッグまたは無菌バイアルなどの容器に移される。いくつかの実施形態では、治療的に十分な数のＴＩＬが上記の拡張方法を使用して取得されると、それらは、本明細書に記載の薬学的組成物を含む薬学的組成物として患者に投与する際に使用するために、注入バッグまたは無菌バイアルを含み得る容器に移される。ＴＩＬは、かかる容器への移送後に効力について評価されてもよく、これは、安定性試験のためなど、移送直後または容器が一定期間保管された直後に起こり得る。
ある実施形態では、本開示の方法を使用して拡張されたＴＩＬは、薬学的組成物として患者に投与される。ある実施形態では、薬学的組成物は、滅菌緩衝液中のＴＩＬ懸濁液である。本明細書に開示されるように拡張されたＴＩＬは、当該技術分野で知られている任意の好適な経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、単回の動脈内または静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、およそ３０～６０分続く。他の好適な投与経路には、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内投与が含まれる。
ＶＩ．さらなるＧｅｎ２、Ｇｅｎ３、及び他のＴＩＬ製造プロセスの実施形態
Ａ．ＰＢＭＣフィーダー細胞比
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の拡張方法で使用される培地（例えば、図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）を参照）は、抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ－３を含む。ＩＬ－２と組み合わせた抗ＣＤ３抗体は、ＴＩＬ集団におけるＴ細胞活性化及び細胞分裂を誘導する。この効果は、全長抗体、ならびにＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片で見ることができ、前者が一般に好まれ、例えば、Ｔｓｏｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８５，１３５，１７１９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
ある実施形態では、ＰＢＭＣフィーダー層の数は、以下のように計算される。
Ａ．Ｔ細胞の体積（１０μｍ直径）：Ｖ＝（４／３）πｒ３＝５２３．６μｍ３
Ｂ．４０μｍ（４細胞）の高さを有するＧ－Ｒｅｘ １００（Ｍ）のカラム：Ｖ＝（４／３）πｒ３＝４×１０１２μｍ３
Ｃ．カラムＢを充填するために必要な細胞数：４×１０１２μｍ３／５２３．６μｍ３＝７．６×１０８μｍ３＊０．６４＝４．８６×１０８
Ｄ．四次元空間で最適に活性化され得る細胞の数：４．８６×１０８／２４＝２０．２５×１０６
Ｅ．Ｇ－Ｒｅｘ ５００に外挿されるフィーダー及びＴＩＬの数：ＴＩＬ：１００×１０６及びフィーダー：２．５×１０９
この計算では、１００ｃｍ２の底部を有するシリンジ中でのＴＩＬの活性化のために二十面体形状を提供するのに必要な単核細胞の数の近似値が使用される。この計算は、Ｊｉｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１２，３５，２８３－２９２に記載されているように、ＮＣＩ実験データを密接に反映するＴ細胞の閾値活性化について、約５×１０８の実験結果を導き出す。（Ｃ）では、乗数（０．６４）は、Ｊａｅｇｅｒ ａｎｄ Ｎａｇｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５５，１５２３－３によって計算された等価球のランダム充填密度である。（Ｄ）において、除数２４は、Ｍｕｓｉｎ，Ｒｕｓｓ．Ｍａｔｈ．Ｓｕｒｖ．２００３，５８，７９４－７９５に記載されているように、四次元空間において同様の物体に接触し得る等価球の数、または「ニュートン数」である。
ある実施形態では、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給される抗原提示フィーダー細胞の数は、急速な第２の拡張中に外因的に供給される抗原提示フィーダー細胞の数のおよそ半分である。ある特定の実施形態では、この方法は、急速な第２の拡張の細胞培養培地と比較しておよそ５０％少ない抗原提示細胞を含む細胞培養培地中でプライミングによる第１の拡張を行うことを含む。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給される抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）の数は、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数よりも多い。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２０：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約１０：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約９：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約８：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約７：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約６：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約５：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約４：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約３：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．９：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．８：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．７：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．６：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．５：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．４：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．３：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．２：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．１：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約１０：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約５：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約４：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約３：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．９：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．８：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．７：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．６：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．５：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．４：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．３：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．２：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．１：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約２：１である。
別の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数と、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、３：１、３．１：１、３．２：１、３．３：１、３．４：１、３．５：１、３．６：１、３．７：１、３．８：１、３．９：１、４：１、４．１：１、４．２：１、４．３：１、４．４：１、４．５：１、４．６：１、４．７：１、４．８：１、４．９：１、または５：１である。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数は、正確にまたは約１×１０８、１．１×１０８、１．２×１０８、１．３×１０８、１．４×１０８、１．５×１０８、１．６×１０８、１．７×１０８、１．８×１０８、１．９×１０８、２×１０８、２．１×１０８、２．２×１０８、２．３×１０８、２．４×１０８、２．５×１０８、２．６×１０８、２．７×１０８、２．８×１０８、２．９×１０８、３×１０８、３．１×１０８、３．２×１０８、３．３×１０８、３．４×１０８、または３．５×１０８ＡＰＣであり、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数は、正確にまたは約３．５×１０８、３．６×１０８、３．７×１０８、３．８×１０８、３．９×１０８、４×１０８、４．１×１０８、４．２×１０８、４．３×１０８、４．４×１０８、４．５×１０８、４．６×１０８、４．７×１０８、４．８×１０８、４．９×１０８、５×１０８、５．１×１０８、５．２×１０８、５．３×１０８、５．４×１０８、５．５×１０８、５．６×１０８、５．７×１０８、５．８×１０８、５．９×１０８、６×１０８、６．１×１０８、６．２×１０８、６．３×１０８、６．４×１０８、６．５×１０８、６．６×１０８、６．７×１０８、６．８×１０８、６．９×１０８、７×１０８、７．１×１０８、７．２×１０８、７．３×１０８、７．４×１０８、７．５×１０８、７．６×１０８、７．７×１０８、７．８×１０８、７．９×１０８、８×１０８、８．１×１０８、８．２×１０８、８．３×１０８、８．４×１０８、８．５×１０８、８．６×１０８、８．７×１０８、８．８×１０８、８．９×１０８、９×１０８、９．１×１０８、９．２×１０８、９．３×１０８、９．４×１０８、９．５×１０８、９．６×１０８、９．７×１０８、９．８×１０８、９．９×１０８、または１×１０９ＡＰＣである。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数は、正確にまたは約１．５×１０８ＡＰＣ～正確にまたは約３×１０８ＡＰＣの範囲から選択され、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数は、正確にまたは約４×１０８ＡＰＣ～正確にまたは約７．５×１０８ＡＰＣの範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数は、正確にまたは約２×１０８ＡＰＣ～正確にまたは約２．５×１０８ＡＰＣの範囲から選択され、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数は、正確にまたは約４．５×１０８ＡＰＣ～正確にまたは約５．５×１０８ＡＰＣの範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数は、正確にまたは約２．５×１０８ＡＰＣであり、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数は、正確にまたは約５×１０８ＡＰＣである。
ある実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目に添加されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、プライミングによる第１の拡張の７日目（例えば、この方法の７日目）に添加されるＰＢＭＣの数のおよそ半分である。ある特定の実施形態では、方法は、プライミングによる第１の拡張の０日目に抗原提示細胞を第１のＴＩＬ集団に追加することと、７日目に抗原提示細胞を第２のＴＩＬ集団に追加することとを含み、０日目に追加される抗原提示細胞の数は、プライミングによる第１の拡張の７日目（例えば、方法の７日目）に追加される抗原提示細胞の数のおよそ５０％である。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＰＢＭＣの数よりも多い。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約１．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約４．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約１．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約２×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約３×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約２×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の密度で培養フラスコに播種される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約１．０×１０６、１．１×１０６、１．２×１０６、１．３×１０６、１．４×１０６、１．５×１０６、１．６×１０６、１．７×１０６、１．８×１０６、１．９×１０６、２×１０６、２．１×１０６、２．２×１０６、２．３×１０６、２．４×１０６、２．５×１０６、２．６×１０６、２．７×１０６、２．８×１０６、２．９×１０６、３×１０６、３．１×１０６、３．２×１０６、３．３×１０６、３．４×１０６、３．５×１０６、３．６×１０６、３．７×１０６、３．８×１０６、３．９×１０６、４×１０６、４．１×１０６、４．２×１０６、４．３×１０６、４．４×１０６、または４．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の密度で培養フラスコに播種される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約２．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約７．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～約６．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～約５．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約２．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２、２．６×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２、２．７×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２、２．８×１０６、２．９×１０６、３×１０６、３．１×１０６、３．２×１０６、３．３×１０６、３．４×１０６、３．５×１０６、３．６×１０６、３．７×１０６、３．８×１０６、３．９×１０６、４×１０６、４．１×１０６、４．２×１０６、４．３×１０６、４．４×１０６、４．５×１０６、４．６×１０６、４．７×１０６、４．８×１０６、４．９×１０６、５×１０６、５．１×１０６、５．２×１０６、５．３×１０６、５．４×１０６、５．５×１０６、５．６×１０６、５．７×１０６、５．８×１０６、５．９×１０６、６×１０６、６．１×１０６、６．２×１０６、６．３×１０６、６．４×１０６、６．５×１０６、６．６×１０６、６．７×１０６、６．８×１０６、６．９×１０６、７×１０６、７．１×１０６、７．２×１０６、７．３×１０６、７．４×１０６、または７．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の密度で培養フラスコに播種される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約１．０×１０６、１．１×１０６、１．２×１０６、１．３×１０６、１．４×１０６、１．５×１０６、１．６×１０６、１．７×１０６、１．８×１０６、１．９×１０６、２×１０６、２．１×１０６、２．２×１０６、２．３×１０６、２．４×１０６、２．５×１０６、２．６×１０６、２．７×１０６、２．８×１０６、２．９×１０６、３×１０６、３．１×１０６、３．２×１０６、３．３×１０６、３．４×１０６、３．５×１０６、３．６×１０６、３．７×１０６、３．８×１０６、３．９×１０６、４×１０６、４．１×１０６、４．２×１０６、４．３×１０６、４．４×１０６、または４．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の密度で培養フラスコに播種され、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約２．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２、２．６×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２、２．７×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２、２．８×１０６、２．９×１０６、３×１０６、３．１×１０６、３．２×１０６、３．３×１０６、３．４×１０６、３．５×１０６、３．６×１０６、３．７×１０６、３．８×１０６、３．９×１０６、４×１０６、４．１×１０６、４．２×１０６、４．３×１０６、４．４×１０６、４．５×１０６、４．６×１０６、４．７×１０６、４．８×１０６、４．９×１０６、５×１０６、５．１×１０６、５．２×１０６、５．３×１０６、５．４×１０６、５．５×１０６、５．６×１０６、５．７×１０６、５．８×１０６、５．９×１０６、６×１０６、６．１×１０６、６．２×１０６、６．３×１０６、６．４×１０６、６．５×１０６、６．６×１０６、６．７×１０６、６．８×１０６、６．９×１０６、７×１０６、７．１×１０６、７．２×１０６、７．３×１０６、７．４×１０６、または７．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の密度で培養フラスコに播種される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約１．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約４．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種され、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約２．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約７．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約１．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種され、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約６×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約２×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約３×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種され、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約４×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約５．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約２×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の密度で培養フラスコに播種され、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約４×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の密度で培養フラスコに播種される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＰＢＭＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２０：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＰＢＭＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約１０：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＰＢＭＣの数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約９：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約８：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約７：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約６：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約５：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約４：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約３：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．９：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．８：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．７：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．６：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．５：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．４：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．３：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．２：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．１：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約１０：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約５：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約４：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約３：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．９：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．８：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．７：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．６：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．５：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．４：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．３：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．２：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．１：１の範囲から選択される。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約２：１である。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比率は、正確にまたは約１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、３：１、３．１：１、３．２：１、３．３：１、３．４：１、３．５：１、３．６：１、３．７：１、３．８：１、３．９：１、４：１、４．１：１、４．２：１、４．３：１、４．４：１、４．５：１、４．６：１、４．７：１、４．８：１、４．９：１、または５：１である。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約１×１０８、１．１×１０８、１．２×１０８、１．３×１０８、１．４×１０８、１．５×１０８、１．６×１０８、１．７×１０８、１．８×１０８、１．９×１０８、２×１０８、２．１×１０８、２．２×１０８、２．３×１０８、２．４×１０８、２．５×１０８、２．６×１０８、２．７×１０８、２．８×１０８、２．９×１０８、３×１０８、３．１×１０８、３．２×１０８、３．３×１０８、３．４×１０８、または３．５×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）であり、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約３．５×１０８、３．６×１０８、３．７×１０８、３．８×１０８、３．９×１０８、４×１０８、４．１×１０８、４．２×１０８、４．３×１０８、４．４×１０８、４．５×１０８、４．６×１０８、４．７×１０８、４．８×１０８、４．９×１０８、５×１０８、５．１×１０８、５．２×１０８、５．３×１０８、５．４×１０８、５．５×１０８、５．６×１０８、５．７×１０８、５．８×１０８、５．９×１０８、６×１０８、６．１×１０８、６．２×１０８、６．３×１０８、６．４×１０８、６．５×１０８、６．６×１０８、６．７×１０８、６．８×１０８、６．９×１０８、７×１０８、７．１×１０８、７．２×１０８、７．３×１０８、７．４×１０８、７．５×１０８、７．６×１０８、７．７×１０８、７．８×１０８、７．９×１０８、８×１０８、８．１×１０８、８．２×１０８、８．３×１０８、８．４×１０８、８．５×１０８、８．６×１０８、８．７×１０８、８．８×１０８、８．９×１０８、９×１０８、９．１×１０８、９．２×１０８、９．３×１０８、９．４×１０８、９．５×１０８、９．６×１０８、９．７×１０８、９．８×１０８、９．９×１０８、または１×１０９ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）である。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約１×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～正確にまたは約３．５×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲から選択され、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約３．５×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～正確にまたは約１×１０９ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約１．５×１０８ＡＰＣ～正確にまたは約３×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲から選択され、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約４×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～正確にまたは約７．５×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約２×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～正確にまたは約２．５×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲から選択され、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約４．５×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～正確にまたは約５．５×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約２．５×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）であり、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約５×１０８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）である。
ある実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目に添加されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）層の数は、急速な第２の拡張の７日目に添加されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）層の数のおよそ半分である。ある特定の実施形態では、方法は、プライミングによる第１の拡張の０日目に抗原提示細胞層を第１のＴＩＬ集団に追加することと、７日目に抗原提示細胞を第２のＴＩＬ集団に追加することとを含み、０日目に追加される抗原提示細胞層の数は、７日目に追加される抗原提示細胞層の数のおよそ５０％である。
別の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）層の数は、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）層の数よりも多い。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、正確にまたは約２細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、正確にまたは約４細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こる。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、正確にまたは約１細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、第３の急速拡張の７日目は、正確にまたは約２細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こる。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、正確にまたは約１．５細胞層～正確にまたは約２．５細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、正確にまたは約３細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こる。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、正確にまたは約１細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、正確にまたは約２細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こる。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、正確にまたは約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、正確にまたは約３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こる。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、正確にまたは約１細胞層～正確にまたは約２細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、正確にまたは約３細胞層～正確にまたは約１０細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こる。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、正確にまたは約２細胞層～正確にまたは約３細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、正確にまたは約４細胞層～正確にまたは約８細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こる。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、正確にまたは約２細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、正確にまたは約４細胞層～正確にまたは約８細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こる。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、正確にまたは約１、２、または３細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、正確にまたは約３、４、５、６、７、８、９、または１０細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こる。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数とＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数との比率は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：１０の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数とＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数との比率は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：８の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数とＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数との比率は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：７の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数とＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数との比率は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：６の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数とＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数との比率は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：５の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数とＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数との比率は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：４の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数とＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数との比率は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：３の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数とＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数との比率は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：２の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数とＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数との比率は、正確にまたは約１：１．２～正確にまたは約１：８の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数とＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数との比率は、正確にまたは約１：１．３～正確にまたは約１：７の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数とＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数との比率は、正確にまたは約１：１．４～正確にまたは約１：６の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数とＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数との比率は、正確にまたは約１：１．５～正確にまたは約１：５の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数とＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数との比率は、正確にまたは約１：１．６～正確にまたは約１：４の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数とＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数との比率は、正確にまたは約１：１．７～正確にまたは約１：３．５の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数とＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数との比率は、正確にまたは約１：１．８～正確にまたは約１：３の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数とＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数との比率は、正確にまたは約１：１．９～正確にまたは約１：２．５の範囲から選択される。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数の、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に対する比は、正確にまたは約１：２である。
別の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数とＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数との比率は、正確にまたは約１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、１：３、１：３．１、１：３．２、１：３．３、１：３．４、１：３．５、１：３．６、１：３．７、１：３．８、１：３．９、１：４、１：４．１、１：４．２、１：４．３、１：４．４、１：４．５、１：４．６、１：４．７、１：４．８、１：４．９、１：５、１：５．１、１：５．２、１：５．３、１：５．４、１：５．５、１：５．６、１：５．７、１：５．８、１：５．９、１：６、１：６．１、１：６．２、１：６．３、１：６．４、１：６．５、１：６．６、１：６．７、１：６．８、１：６．９、１：７、１：７．１、１：７．２、１：７．３、１：７．４、１：７．５、１：７．６、１：７．７、１：７．８、１：７．９、１：８、１：８．１、１：８．２、１：８．３、１：８．４、１：８．５、１：８．６、１：８．７、１：８．８、１：８．９、１：９、１：９．１、１：９．２、１：９．３、１：９．４、１：９．５、１：９．６、１：９．７、１：９．８、１：９．９、または１：１０から選択される。
いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張におけるＡＰＣの数は、約１．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～約４．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択され、急速な第２の拡張におけるＡＰＣの数は、約２．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～約７．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される。
いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張におけるＡＰＣの数は、約１．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択され、急速な第２の拡張におけるＡＰＣの数は、約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～約６．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される。
いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張におけるＡＰＣの数は、約２．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～約３．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択され、急速な第２の拡張におけるＡＰＣの数は、約４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～約５．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される。
Ｂ．任意選択の細胞培地成分
１．抗ＣＤ３抗体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の拡張方法で使用される培養培地（ＲＥＰと称されるものを含む、例えば、図１及び８（特に、例えば図８Ｂ）を参照）は、抗ＣＤ３抗体を含む。ＩＬ－２と組み合わせた抗ＣＤ３抗体は、ＴＩＬ集団におけるＴ細胞活性化及び細胞分裂を誘導する。この効果は、全長抗体、ならびにＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片で見ることができ、前者が一般に好まれ、例えば、Ｔｓｏｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８５，１３５，１７１９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
当業者によって理解されるように、マウス、ヒト、霊長類、ラット、及びイヌ抗体を含むが、これらに限定されない、様々な哺乳動物由来の抗ヒトＣＤ３ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含む、本発明での使用が見出されるいくつかの好適な抗ヒトＣＤ３抗体が存在する。特定の実施形態では、抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３が使用される（Ｏｒｔｈｏ－ＭｃＮｅｉｌ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪまたはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡから市販されている）。
２．４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト
ある実施形態では、プライミングによる第１の拡張及び／または急速な第２の拡張の細胞培養培地は、ＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。ある実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストである。４－１ＢＢアゴニストは、当該技術分野で知られている任意の４－１ＢＢ結合分子であり得る。４－１ＢＢ結合分子は、ヒトまたは哺乳動物４－１ＢＢに結合することができるモノクローナル抗体または融合タンパク質であり得る。４－１ＢＢアゴニストまたは４－１ＢＢ結合分子は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子の免疫グロブリン重鎖を含み得る。４－１ＢＢアゴニストまたは４－１ＢＢ結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語は、抗体（全長抗体を含む）、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、及び抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生された断片、上記のうちのいずれかのエピトープ結合断片、ならびに４－１ＢＢに結合する抗体の操作された形態、例えば、ｓｃＦｖ分子も含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物に使用するための４－１ＢＢアゴニストには、抗４－１ＢＢ抗体、ヒト抗４－１ＢＢ抗体、マウス抗４－１ＢＢ抗体、哺乳動物抗４－１ＢＢ抗体、モノクローナル抗４－１ＢＢ抗体、ポリクローナル抗４－１ＢＢ抗体、キメラ抗４－１ＢＢ抗体、抗４－１ＢＢアドネクチン、抗４－１ＢＢドメイン抗体、一本鎖抗４－１ＢＢ断片、重鎖抗４－１ＢＢ断片、軽鎖抗４－１ＢＢ断片、抗４－１ＢＢ融合タンパク質、及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、バリアント、またはバイオシミラーが含まれる。アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体は、強力な免疫応答を誘導することが知られている。Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ２０１３，８，ｅ６９６７７。好ましい実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、アゴニスト、抗４－１ＢＢヒト化、または完全ヒトモノクローナル抗体（すなわち、単一の細胞株に由来する抗体）である。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ＥＵ－１０１（Ｅｕｔｉｌｅｘ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）、ウトミルマブ、もしくはウレルマブ、またはそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、バリアント、もしくはバイオシミラーである。好ましい実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブもしくはウレルマブ、またはそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、バリアント、もしくはバイオシミラーである。
好ましい実施形態では、４－１ＢＢアゴニストまたは４－１ＢＢ結合分子は、融合タンパク質である場合もある。好ましい実施形態では、三量体または六量体４－１ＢＢアゴニスト（３つまたは６つのリガンド結合ドメインを有する）などの多量体４－１ＢＢアゴニストは、典型的に２つのリガンド結合ドメインを有するアゴニストモノクローナル抗体と比較して、優れた受容体（４－１ＢＢＬ）クラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。３つのＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン及びＩｇＧ１－Ｆｃを含み、かつ任意選択でこれらの融合タンパク質のうちの２つ以上をさらに結合する三量体（三価）または六量体（もしくは六価）またはそれ以上の融合タンパク質は、例えば、Ｇｉｅｆｆｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１３，１２，２７３５－４７に記載されている。
アゴニスト４－１ＢＢ抗体及び融合タンパク質は、強い免疫応答を誘導することが知られている。好ましい実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、毒性を低減するのに十分な様式で４－１ＢＢ抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体または融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、抗体依存性細胞毒性（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）、例えば、ＮＫ細胞細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を抑制するアゴニスト４－１ＢＢモノクローナル抗体または融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を抑制するアゴニスト４－１ＢＢモノクローナル抗体または融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を抑制するアゴニスト４－１ＢＢモノクローナル抗体または融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ領域機能性を抑制するアゴニスト４－１ＢＢモノクローナル抗体または融合タンパク質である。
いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、高い親和性及びアゴニスト活性でヒト４－１ＢＢ（配列番号４０）に結合することを特徴とする。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ヒト４－１ＢＢ（配列番号４０）に結合する結合分子である。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、マウス４－１ＢＢ（配列番号４１）に結合する結合分子である。４－１ＢＢアゴニストまたは結合分子が結合する４－１ＢＢ抗原のアミノ酸配列を表５に要約する。

Figure 2024512029000008
いくつかの実施形態では、記載される組成物、プロセス、及び方法は、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約１００ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約９０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約８０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約７０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約６０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約５０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約４０ｐＭ以下のＫＤで結合する、またはヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約３０ｐＭ以下のＫＤで結合する４－１ＢＢアゴニストを含む。
いくつかの実施形態では、記載される組成物、プロセス、及び方法は、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約７．５×１０５１／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約７．５×１０５１／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約８×１０５１／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約８．５×１０５１／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約９×１０５１／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約９．５×１０５１／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、またはヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約１×１０６１／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する４－１ＢＢアゴニストを含む。
いくつかの実施形態では、記載される組成物、プロセス、及び方法は、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２．１×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２．２×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２．３×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２．４×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２．５×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２．６×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、またはヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２．７×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２．８×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２．９×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、またはヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約３×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する４－１ＢＢアゴニストを含む。
いくつかの実施形態では、記載される組成物、プロセス及び方法は、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約１０ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約９ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約８ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約７ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約６ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約５ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約４ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約３ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約１ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、４－１ＢＢアゴニストを含む。
好ましい実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ＰＦ－０５０８２５６６もしくはＭＯＲ－７４８０としても知られるウトミルマブ、またはその断片、誘導体、バリアント、もしくはバイオシミラーである。ウトミルマブは、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．から入手可能である。ウトミルマブは、免疫グロブリンＧ２－ガンマ、抗［ホモサピエンスＴＮＦＲＳＦ９（腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー９、４－１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＩＬＡ、ＣＤ１３７）］、ホモサピエンス（完全ヒト）モノクローナル抗体である。ウトミルマブのアミノ酸配列を表６に示す。ウトミルマブは、Ａｓｎ５９及びＡｓｎ２９２にグリコシル化部位、２２－９６位（ＶＨ－ＶＬ）、１４３－１９９位（ＣＨ１－ＣＬ）、２５６－３１６位（ＣＨ２）、及び３６２－４２０位（ＣＨ３）に重鎖鎖内ジスルフィド架橋、２２’－８７’位（ＶＨ－ＶＬ）及び１３６’－１９５’位（ＣＨ１－ＣＬ）に軽鎖鎖内ジスルフィド架橋、ＩｇＧ２Ａアイソフォーム２１８－２１８、２１９－２１９、２２２－２２２、及び２２５－２２５位、ＩｇＧ２Ａ／Ｂアイソフォーム２１８－１３０、２１９－２１９、２２２－２２２、及び２２５－２２５位、ならびにＩｇＧ２Ｂアイソフォーム２１９－１３０（２）、２２２－２２２、及び２２５－２２５位に鎖間重鎖－重鎖ジスルフィド架橋、ならびにＩｇＧ２Ａアイソフォーム１３０－２１３’（２）位、ＩｇＧ２Ａ／Ｂアイソフォーム２１８－２１３’位、及び１３０－２１３’位、ならびにＩｇＧ２Ｂアイソフォーム２１８－２１３’（２）位に鎖間重鎖－軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウトミルマブならびにそのバリアント及び断片の調製及び特性は、米国特許第８，８２１，８６７号、同第８，３３７，８５０号、及び同第９，４６８，６７８号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０３２４３３Ａ１（これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ウトミルマブの前臨床特徴は、Ｆｉｓｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．＆Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１２，６１，１７２１－３３に記載されている。様々な血液学的及び固形腫瘍適応症におけるウトミルマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所のｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子ＮＣＴ０２４４４７９３、ＮＣＴ０１３０７２６７、ＮＣＴ０２３１５０６６、及びＮＣＴ０２５５４８１２が含まれる。
ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、配列番号４２によって示される重鎖及び配列番号４３によって示される軽鎖を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ、配列番号４２及び配列番号４３に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、バリアント、もしくはコンジュゲートを含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４２及び配列番号４３に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４２及び配列番号４３に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４２及び配列番号４３に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４２及び配列番号４３に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４２及び配列番号４３に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号４４に示される配列を含み、４－１ＢＢアゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号４５に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４４及び配列番号４５に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４４及び配列番号４５に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４４及び配列番号４５に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４４及び配列番号４５に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４４及び配列番号４５に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、配列番号４４及び配列番号４５に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。
ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ、配列番号４６、配列番号４７、及び配列番号４８に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。
ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブに関して薬物規制当局によって承認された４－１ＢＢアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。ある実施形態では、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品または参照生物学的製品のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ参照医薬品または参照生物学的製品と比較して１つ以上の翻訳後修飾を含む４－１ＢＢ抗体を含み、参照医薬品または参照生物学的製品は、ウトミルマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可されたまたは認可を得るために提出された４－１ＢＢアゴニスト抗体であり、４－１ＢＢアゴニスト抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、ウトミルマブである。４－１ＢＢアゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合ＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ウトミルマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ウトミルマブである。
Figure 2024512029000009
好ましい実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ＢＭＳ－６６３５１３及び２０Ｈ４．９．ｈ４ａとしても知られるモノクローナル抗体ウレルマブ、またはそれらの断片、誘導体、バリアント、もしくはバイオシミラーである。ウレルマブは、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，Ｉｎｃ．及びＣｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から入手可能である。ウレルマブは、免疫グロブリンＧ４－カッパ、抗［ホモサピエンスＴＮＦＲＳＦ９（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９、４－１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＩＬＡ、ＣＤ１３７）］、ホモサピエンス（完全ヒト）モノクローナル抗体である。ウレルマブのアミノ酸配列を表７に示す。ウレルマブは、２９８位（及び２９８’’）にＮ－グリコシル化部位、２２－９５位（ＶＨ－ＶＬ）、１４８－２０４位（ＣＨ１－ＣＬ）、２６２－３２２位（ＣＨ２）、及び３６８－４２６位（ＣＨ３）（２２’’－９５’’、１４８’’－２０４’’、２６２’’－３２２’’、及び３６８’’－４２６’’位）に重鎖鎖内ジスルフィド架橋、２３’－８８’位（ＶＨ－ＶＬ）及び１３６’－１９６’位（ＣＨ１－ＣＬ）（２３’’’－８８’’’及び１３６’’’－１９６’’’位）に軽鎖鎖内ジスルフィド架橋、２２７－２２７’’位及び２３０－２３０’’位に鎖間重鎖－重鎖ジスルフィド架橋ならびに１３５－２１６’及び１３５’’－２１６’’’に鎖間重鎖－軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウレルマブならびにそのバリアント及び断片の調製及び特性は、米国特許第７，２８８，６３８号及び同第８，９６２，８０４号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。ウレルマブの前臨床及び臨床特徴は、Ｓｅｇａｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６に記載されており、ｈｔｔｐ：／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１６－１２７２で入手可能である。様々な血液学的及び固形腫瘍適応症におけるウレルマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所のｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子ＮＣＴ０１７７５６３１、ＮＣＴ０２１１００８２、ＮＣＴ０２２５３９９２、及びＮＣＴ０１４７１２１０が含まれる。
ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、配列番号５２によって示される重鎖及び配列番号５３によって示される軽鎖を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ、配列番号５２及び配列番号５３に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、バリアント、もしくはコンジュゲートを含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５２及び配列番号５３に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５２及び配列番号５３に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５２及び配列番号５３に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５２及び配列番号５３に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５２及び配列番号５３に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号５４に示される配列を含み、４－１ＢＢアゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号５５に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５４及び配列番号５５に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５４及び配列番号５５に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５４及び配列番号５５に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５４及び配列番号５５に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５４及び配列番号５５に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、配列番号５４及び配列番号５５に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。
ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。
ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブに関して薬物規制当局によって承認された４－１ＢＢアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。ある実施形態では、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品または参照生物学的製品のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ参照医薬品または参照生物学的製品と比較して１つ以上の翻訳後修飾を含む４－１ＢＢ抗体を含み、参照医薬品または参照生物学的製品は、ウレルマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可されたまたは認可を得るために提出された４－１ＢＢアゴニスト抗体であり、４－１ＢＢアゴニスト抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、ウレルマブである。４－１ＢＢアゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合ＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ウレルマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ウレルマブである。
Figure 2024512029000010
ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、１Ｄ８、３Ｅｌｏｒ、４Ｂ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３０９８０９）、Ｈ４－１ＢＢ－Ｍ１２７（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５５２５３２）、ＢＢＫ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＭＳ６２１ＰＡＢＸ）、１４５５０１（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｂ５９１）、ＡＴＣＣ番号ＨＢ－１１２４８として寄託された細胞株によって産生され、米国特許第６，９７４，８６３号に開示される抗体、５Ｆ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３１ １５０３）、Ｃ６５－４８５（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５５９４４６）、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００９５２４４号に開示される抗体、米国特許第７，２８８，６３８号に開示される抗体（例えば、２０Ｈ４．９－ＩｇＧｌ（ＢＭＳ－６６３０３１））、米国特許第６，８８７，６７３号に開示される抗体（例えば、４Ｅ９もしくはＢＭＳ－５５４２７１）、米国特許第７，２１４，４９３号に開示される抗体、米国特許第６，３０３，１２１号に開示される抗体、米国特許第６，５６９，９９７号に開示される抗体、米国特許第６，９０５，６８５号に開示される抗体（例えば、４Ｅ９もしくはＢＭＳ－５５４２７１）、米国特許第６，３６２，３２５号に開示される抗体（例えば、１Ｄ８もしくはＢＭＳ－４６９４９２、３Ｈ３もしくはＢＭＳ－４６９４９７、または３Ｅｌ）、米国特許第６，９７４，８６３号に開示される抗体（例えば、５３Ａ２）、米国特許第６，２１０，６６９号に開示される抗体（例えば、１Ｄ８、３Ｂ８、もしくは３Ｅｌ）、米国特許第５，９２８，８９３号に開示される抗体、米国特許第６，３０３，１２１号に開示される抗体、米国特許第６，５６９，９９７号に開示される抗体、国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／１７７７８８号、同第ＷＯ２０１５／１１９９２３号、及び同第ＷＯ２０１０／０４２４３３号に開示される抗体、ならびにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、バリアント、またはバイオシミラーからなる群から選択され、前述の特許または特許出願公開の各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０２５５１６Ａ１号、同第ＷＯ２００９／００７１２０Ａ１号、同第ＷＯ２０１０／００３７６６Ａ１号、同第ＷＯ２０１０／０１００５１Ａ１号、及び同第ＷＯ２０１０／０７８９６６Ａ１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／００２７２１８Ａ１号、同第ＵＳ２０１５／０１２６７０９Ａ１号、同第ＵＳ２０１１／０１１１４９４Ａ１号、同第ＵＳ２０１５／０１１０７３４Ａ１号、及び同第ＵＳ２０１５／０１２６７１０Ａ１号、ならびに米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号、及び同第８，４５０，４６０号に記載される４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質であり、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、構造Ｉ－Ａ（Ｃ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）もしくは構造Ｉ－Ｂ（Ｎ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）に示されるような４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質、またはそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、多様体、もしくはバイオシミラーである（図１８を参照）。構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂにおいて、円筒は、個々のポリペプチド結合ドメインを指す。構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂは、例えば、４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢリガンド、ＣＤ１３７リガンド（ＣＤ１３７Ｌ）、もしくは腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＳＦ９））または４－１ＢＢに結合する抗体に由来する３つの直線的に連結されたＴＮＦＲＳＦ結合ドメインを含み、これらが折り重なって三価タンパク質を形成し、その後、これがＩｇＧ１－Ｆｃ（ＣＨ３及びＣＨ２ドメインを含む）によって第２の三価タンパク質に連結され、その後、これを使用して、三価タンパク質のうちの２つをジスルフィド結合（小さく長細い楕円）によって一緒に連結し、構造を安定化し、６つの受容体及びシグナル伝達タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインを一緒にして、シグナル伝達複合体を形成することができるアゴニストを提供する。円筒として示されるＴＮＦＲＳＦ結合ドメインは、例えば、親水性残基及び柔軟性のためのＧｌｙ及びＳｅｒ配列、ならびに溶解性のためのＧｌｕ及びＬｙｓを含み得るリンカーによって結合されたＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む、ｓｃＦｖドメインであり得る。ｄｅ Ｍａｒｃｏ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，２０１１，１０，４４、Ａｈｍａｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．＆Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２，９８０２５０、Ｍｏｎｎｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０１３，２，１９３－２０８、または本明細書の他の場所に組み込まれている参照文献に記載されるものなどの任意のｓｃＦｖドメイン設計が使用され得る。この形態の融合タンパク質構造は、米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号、及び同第８，４５０，４６０号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
図１８に示される構造Ｉ－Ａの他のポリペプチドドメインのアミノ酸配列は、表８に見出される。Ｆｃドメインは、好ましくは、完全な定常ドメイン（配列番号６２のアミノ酸１７～２３０）、完全なヒンジドメイン（配列番号６２のアミノ酸１～１６）、またはヒンジドメインの一部（例えば、配列番号６２のアミノ酸４～１６）を含む。Ｃ末端Ｆｃ抗体を結合するための好ましいリンカーは、追加のポリペプチドの融合に好適なリンカーを含む、配列番号６３～配列番号７２に示される実施形態から選択され得る。
Figure 2024512029000011
図１８に示される構造Ｉ－Ｂの他のポリペプチドドメインのアミノ酸配列は、表９に見出される。Ｆｃ抗体断片が構造Ｉ－ＢにあるようなＴＮＲＦＳＦ融合タンパク質のＮ末端に融合される場合、Ｆｃモジュールの配列は、好ましくは、配列番号７３に示されるものであり、リンカー配列は、好ましくは、配列番号７４～配列番号７６に示される実施形態から選択される。
Figure 2024512029000012
ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウレルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、表１０に記載の可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、前述の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ、ならびにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、バリアント、及びバイオシミラーからなる群から選択される１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。
ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、４－１ＢＢＬ配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、配列番号７７による配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、可溶性４－１ＢＢＬ配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、配列番号７８による配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。
ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、各々が、それぞれ、配列番号４３及び配列番号４４に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含み、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、リンカーによって結合されている。ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、各々が、それぞれ、配列番号５４及び配列番号５５に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含み、ＶＨドメインとＶＬドメインはリンカーによって結合されている。ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、各々が表１０に示されるＶＨ配列及びＶＬ配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含み、ＶＨドメインとＶＬドメインはリンカーによって結合されている。
Figure 2024512029000013
ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性４－１ＢＢ結合ドメインを含む４－１ＢＢアゴニスト一本鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／またはＣ末端に追加のドメインをさらに含み、追加のドメインは、ＦａｂまたはＦｃ断片ドメインである。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性４－１ＢＢ結合ドメインを含む４－１ＢＢアゴニスト一本鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／またはＣ末端に追加のドメインをさらに含み、追加のドメインは、ＦａｂまたはＦｃ断片ドメインであり、可溶性４－１ＢＢドメインは各々、茎領域（三量体化に寄与し、細胞膜まである特定の距離を提供するが、４－１ＢＢ結合ドメインの一部ではない）を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは独立して、３～８アミノ酸長を有する。
ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインを含む４－１ＢＢアゴニスト一本鎖融合ポリペプチドであり、可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインは各々、茎領域を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは独立して、３～８アミノ酸長であり、各ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインは、４－１ＢＢ結合ドメインである。
ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、前述のＶＬドメインのうちのいずれかに連結された前述のＶＨドメインのうちのいずれかを含む４－１ＢＢアゴニストｓｃＦｖ抗体である。
ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から市販されているＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ４－１ＢＢアゴニスト抗体カタログ番号７９０９７－２である。ある実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）から市販されているＣｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ ４－１ＢＢアゴニスト抗体カタログ番号ＭＯＭ－１８１７９である。
３．ＯＸ４０（ＣＤ１３４）アゴニスト
ある実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）アゴニストである。ＯＸ４０アゴニストは、当該技術分野で知られている任意のＯＸ４０結合分子であり得る。ＯＸ４０結合分子は、ヒトまたは哺乳動物ＯＸ４０に結合することができるモノクローナル抗体または融合タンパク質であり得る。ＯＸ４０アゴニストまたはＯＸ４０結合分子は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子の免疫グロブリン重鎖を含み得る。ＯＸ４０アゴニストまたはＯＸ４０結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語は、抗体（全長抗体を含む）、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、及び抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生された断片、上記のうちのいずれかのエピトープ結合断片、ならびにＯＸ４０に結合する抗体の操作された形態、例えば、ｓｃＦｖ分子も含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物に使用するためのＯＸ４０アゴニストには、抗ＯＸ４０抗体、ヒト抗ＯＸ４０抗体、マウス抗ＯＸ４０抗体、哺乳動物抗ＯＸ４０抗体、モノクローナル抗ＯＸ４０抗体、ポリクローナル抗ＯＸ４０抗体、キメラ抗ＯＸ４０抗体、抗ＯＸ４０アドネクチン、抗ＯＸ４０ドメイン抗体、一本鎖抗ＯＸ４０断片、重鎖抗ＯＸ４０断片、軽鎖抗ＯＸ４０断片、抗ＯＸ４０融合タンパク質、及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、バリアント、またはバイオシミラーが含まれる。好ましい実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、アゴニスト、抗ＯＸ４０ヒト化、または完全ヒトモノクローナル抗体（すなわち、単一の細胞株に由来する抗体）である。
好ましい実施形態では、ＯＸ４０アゴニストまたはＯＸ４０結合分子は、融合タンパク質である場合もある。ＯＸ４０Ｌに融合されたＦｃドメインを含むＯＸ４０融合タンパク質は、例えば、Ｓａｄｕｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９，１８２，１４８１－８９に記載されている。好ましい実施形態では、三量体または六量体ＯＸ４０アゴニスト（３つまたは６つのリガンド結合ドメインを有する）などの多量体ＯＸ４０アゴニストは、典型的に２つのリガンド結合ドメインを有するアゴニストモノクローナル抗体と比較して、優れた受容体（ＯＸ４０Ｌ）クラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。３つのＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン及びＩｇＧ１－Ｆｃを含み、かつ任意選択でこれらの融合タンパク質のうちの２つ以上をさらに結合する三量体（三価）または六量体（もしくは六価）またはそれ以上の融合タンパク質は、例えば、Ｇｉｅｆｆｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１３，１２，２７３５－４７に記載されている。
アゴニストＯＸ４０抗体及び融合タンパク質は、強い免疫応答を誘導することが知られている。Ｃｕｒｔｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１３，７３，７１８９－９８。好ましい実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、毒性を低減するのに十分な様式でＯＸ４０抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体または融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、抗体依存性細胞毒性（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）、例えば、ＮＫ細胞細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を抑制するアゴニストＯＸ４０モノクローナル抗体または融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を抑制するアゴニストＯＸ４０モノクローナル抗体または融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を抑制するアゴニストＯＸ４０モノクローナル抗体または融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｆｃ領域機能性を抑制するアゴニストＯＸ４０モノクローナル抗体または融合タンパク質である。
いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、高い親和性及びアゴニスト活性でヒトＯＸ４０（配列番号８５）に結合することを特徴とする。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ヒトＯＸ４０（配列番号８５）に結合する結合分子である。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、マウスＯＸ４０（配列番号８６）に結合する結合分子である。ＯＸ４０アゴニストまたは結合分子が結合するＯＸ４０抗原のアミノ酸配列を表１１に要約する。
Figure 2024512029000014
いくつかの実施形態では、記載される組成物、プロセス、及び方法は、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約１００ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約９０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約８０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約７０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約６０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約５０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約４０ｐＭ以下のＫＤで結合する、またはヒトもしくはマウスＯＸ４０に約３０ｐＭ以下のＫＤで結合するＯＸ４０アゴニストを含む。
いくつかの実施形態では、記載される組成物、プロセス、及び方法は、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約７．５×１０５１／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約７．５×１０５１／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約８×１０５１／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約８．５×１０５１／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約９×１０５１／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約９．５×１０５１／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、またはヒトもしくはマウスＯＸ４０に約１×１０６１／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合するＯＸ４０アゴニストを含む。
いくつかの実施形態では、記載される組成物、プロセス、及び方法は、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２．１×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２．２×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２．３×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２．４×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２．５×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２．６×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、またはヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２．７×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２．８×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２．９×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、またはヒトもしくはマウスＯＸ４０に約３×１０－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合するＯＸ４０アゴニストを含む。
いくつかの実施形態では、記載される組成物、プロセス、及び方法は、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約１０ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約９ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約８ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約７ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約６ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約５ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約４ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約３ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約１ｎＭ以下のＩＣ５０で結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。
いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ＭＥＤＩ０５６２またはＭＥＤＩ－０５６２としても知られるタボリキシズマブである。タボリキシズマブは、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ，Ｉｎｃ．の子会社であるＭｅｄＩｍｍｕｎｅから入手可能である。タボリキシズマブは、免疫グロブリンＧ１－カッパ、抗［ホモサピエンスＴＮＦＲＳＦ４（腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー４、ＯＸ４０、ＣＤ１３４）］、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体である。タボリキシズマブのアミノ酸配列を表１２に示す。タボリキシズマブは、３０１及び３０１’’位にＮ－グリコシル化部位（フコシル化複合二分岐ＣＨＯ型グリカンを有する）、２２－９５位（ＶＨ－ＶＬ）、１４８－２０４位（ＣＨ１－ＣＬ）、２６５－３２５位（ＣＨ２）、及び３７１－４２９位（ＣＨ３）（及び２２’’－９５’’、１４８’’－２０４’’、２６５’’－３２５’’、及び３７１’’－４２９’’位）に重鎖鎖内ジスルフィド架橋、２３’－８８’位（ＶＨ－ＶＬ）及び１３４’－１９４’位（ＣＨ１－ＣＬ）（及び２３’’’－８８’’’及び１３４’’’－１９４’’’位）に軽鎖鎖内ジスルフィド架橋、２３０－２３０”及び２３３－２３３”位に鎖間重鎖－重鎖ジスルフィド架橋、ならびに２２４－２１４’及び２２４’’－２１４’’’に鎖間重鎖－軽鎖ジスルフィド架橋を含む。様々な固形腫瘍適応症におけるタボリキシズマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所のｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子ＮＣＴ０２３１８３９４及びＮＣＴ０２７０５４８２が含まれる。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号８７によって示される重鎖及び配列番号８８によって示される軽鎖を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ、配列番号８７及び配列番号８８に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、バリアント、もしくはコンジュゲートを含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８７及び配列番号８８に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８７及び配列番号８８に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８７及び配列番号８８に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８７及び配列番号８８に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８７及び配列番号８８に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、タボリキシズマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号８９に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号９０に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８９及び配列番号９０に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８９及び配列番号９０に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８９及び配列番号９０に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８９及び配列番号９０に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８９及び配列番号９０に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、配列番号８９及び配列番号９０に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ、配列番号９１、配列番号９２、及び配列番号９３に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号９４、配列番号９５、及び配列番号９６に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、タボリキシズマブに関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。ある実施形態では、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品または参照生物学的製品のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ参照医薬品または参照生物学的製品と比較して１つ以上の翻訳後修飾を含むＯＸ４０抗体を含み、参照医薬品または参照生物学的製品は、タボリキシズマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可されたまたは認可を得るために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、タボリキシズマブである。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合ＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、タボリキシズマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、タボリキシズマブである。
Figure 2024512029000015
いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．から入手可能な完全ヒト抗体である１１Ｄ４である。１１Ｄ４の調製及び特性は、米国特許第７，９６０，５１５号、同第８，２３６，９３０号、及び同第９，０２８，８２４号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。１１Ｄ４のアミノ酸配列を表１３に示す。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号９７によって示される重鎖及び配列番号９８によって示される軽鎖を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ、配列番号９７及び配列番号９８に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、バリアント、もしくはコンジュゲートを含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９７及び配列番号９８に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９７及び配列番号９８に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９７及び配列番号９８に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９７及び配列番号９８に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９７及び配列番号９８に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、１１Ｄ４の重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号９９に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号１００に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９９及び配列番号１００に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９９及び配列番号１００に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９９及び配列番号１００に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９９及び配列番号１００に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９９及び配列番号１００に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ、配列番号１０１、配列番号１０２、及び配列番号１０３に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号１０４、配列番号１０５、及び配列番号１０６に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、１１Ｄ４に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。ある実施形態では、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品または参照生物学的製品のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ参照医薬品または参照生物学的製品と比較して１つ以上の翻訳後修飾を含むＯＸ４０抗体を含み、参照医薬品または参照生物学的製品は、１１Ｄ４である。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可されたまたは認可を得るために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、１１Ｄ４である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合ＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、１１Ｄ４である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、１１Ｄ４である。
Figure 2024512029000016
いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．から入手可能な完全ヒト抗体である１８Ｄ８である。１８Ｄ８の調製及び特性は、米国特許第７，９６０，５１５号、同第８，２３６，９３０号、及び同第９，０２８，８２４号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。１８Ｄ８のアミノ酸配列を表１４に示す。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号１０７によって示される重鎖及び配列番号１０８によって示される軽鎖を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ、配列番号１０７及び配列番号１０８に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、バリアント、もしくはコンジュゲートを含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１０７及び配列番号１０８に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１０７及び配列番号１０８に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１０７及び配列番号１０８に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１０７及び配列番号１０８に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１０７及び配列番号１０８に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、１８Ｄ８の重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１０９に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号１１０に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１０９及び配列番号１１０に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１０９及び配列番号１１０に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１０９及び配列番号１１０に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１０９及び配列番号１１０に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１０９及び配列番号１１０に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ、配列番号１１１、配列番号１１２、及び配列番号１１３に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号１１４、配列番号１１５、及び配列番号１１６に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、１８Ｄ８に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。ある実施形態では、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品または参照生物学的製品のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ参照医薬品または参照生物学的製品と比較して１つ以上の翻訳後修飾を含むＯＸ４０抗体を含み、参照医薬品または参照生物学的製品は、１８Ｄ８である。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可されたまたは認可を得るために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、１８Ｄ８である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合ＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、１８Ｄ８である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、１８Ｄ８である。
Figure 2024512029000017
いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ｐｌｃ．から入手可能なヒト化抗体であるＨｕ１１９－１２２である。Ｈｕ１１９－１２２の調製及び特性は、米国特許第９，００６，３９９号及び同第９，１６３，０８５号、ならびに国際特許公開第ＷＯ２０１２／０２７３２８号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。Ｈｕ１１９－１２２のアミノ酸配列を表１５に示す。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１１９－１２２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１１７に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号１１８に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１１７及び配列番号１１８に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１１７及び配列番号１１８に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１１７及び配列番号１１８に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１１７及び配列番号１１８に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１１７及び配列番号１１８に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ、配列番号１１９、配列番号１２０、及び配列番号１２１に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号１２２、配列番号１２３、及び配列番号１２４に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１１９－１２２に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。ある実施形態では、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品または参照生物学的製品のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ参照医薬品または参照生物学的製品と比較して１つ以上の翻訳後修飾を含むＯＸ４０抗体を含み、参照医薬品または参照生物学的製品は、Ｈｕ１１９－１２２である。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可されたまたは認可を得るために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、Ｈｕ１１９－１２２である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合ＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、Ｈｕ１１９－１２２である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、Ｈｕ１１９－１２２である。

Figure 2024512029000018
いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ｐｌｃ．から入手可能なヒト化抗体であるＨｕ１０６－２２２である。Ｈｕ１０６－２２２の調製及び特性は、米国特許第９，００６，３９９号及び同第９，１６３，０８５号、ならびに国際特許公開第ＷＯ２０１２／０２７３２８号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。Ｈｕ１０６－２２２のアミノ酸配列を表１６に示す。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１０６－２２２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１２５に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号１２６に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１２５及び配列番号１２６に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１２５及び配列番号１２６に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１２５及び配列番号１２６に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１２５及び配列番号１２６に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１２５及び配列番号１２６に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ、配列番号１２７、配列番号１２８、及び配列番号１２９に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号１３０、配列番号１３１、及び配列番号１３２に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１０６－２２２に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。ある実施形態では、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品または参照生物学的製品のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ参照医薬品または参照生物学的製品と比較して１つ以上の翻訳後修飾を含むＯＸ４０抗体を含み、参照医薬品または参照生物学的製品は、Ｈｕ１０６－２２２である。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可されたまたは認可を得るために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、Ｈｕ１０６－２２２である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合ＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、Ｈｕ１０６－２２２である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、Ｈｕ１０６－２２２である。
Figure 2024512029000019
いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＭＥＤＩ６４６９（９Ｂ１２とも称される）である。ＭＥＤＩ６４６９は、マウスモノクローナル抗体である。Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００６，２９，５７５－５８５。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００６，２９，５７５－５８５に記載されているように、Ｂｉｏｖｅｓｔ Ｉｎｃ．（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）に寄託された９Ｂ１２ハイブリドーマによって産生された抗体であり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、抗体は、ＭＥＤＩ６４６９のＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＭＥＤＩ６４６９の重鎖可変領域配列及び／または軽鎖可変領域配列を含む。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｌ１０６ ＢＤ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製品番号３４０４２０）である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、抗体Ｌ１０６（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製品番号３４０４２０）のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、抗体Ｌ１０６（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製品番号３４０４２０）の重鎖可変領域配列及び／または軽鎖可変領域配列を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ＡＣＴ３５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号２００７３）である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、抗体ＡＣＴ３５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号２００７３）のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、抗体ＡＣＴ３５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号２００７３）の重鎖可変領域配列及び／または軽鎖可変領域配列を含む。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ、ＢｉｏＸｃｅｌｌ Ｉｎｃ（Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）から市販されているマウスモノクローナル抗体抗ｍＣＤ１３４／ｍＯＸ４０（クローンＯＸ８６）である。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、国際特許出願公開第ＷＯ９５／１２６７３号、同第ＷＯ９５／２１９２５号、同第ＷＯ２００６／１２１８１０号、同第ＷＯ２０１２／０２７３２８号、同第ＷＯ２０１３／０２８２３１号、同第ＷＯ２０１３／０３８１９１号、及び同第ＷＯ２０１４／１４８８９５号、欧州特許出願第ＥＰ０６７２１４１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１０／１３６０３０号、同第ＵＳ２０１４／３７７２８４号、同第ＵＳ２０１５／１９０５０６号、及び同第ＵＳ２０１５／１３２２８８号（クローン２０Ｅ５及び１２Ｈ３を含む）、ならびに米国特許第７，５０４，１０１号、同第７，５５０，１４０号、同第７，６２２，４４４号、同第７，６９６，１７５号、同第７，９６０，５１５号、同第７，９６１，５１５号、同第８，１３３，９８３号、同第９，００６，３９９号、及び同第９，１６３，０８５号（各々の開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるＯＸ４０アゴニストから選択される。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、構造Ｉ－Ａ（Ｃ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）もしくは構造Ｉ－Ｂ（Ｎ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）に示されるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質、またはそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、バリアント、もしくはバイオシミラーである。構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂの特性は、上記及び米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号、及び同第８，４５０，４６０号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。図１８に示される構造Ｉ－Ａのポリペプチドドメインのアミノ酸配列は、表９に見出される。Ｆｃドメインは、好ましくは、完全な定常ドメイン（配列番号６２のアミノ酸１７～２３０）、完全なヒンジドメイン（配列番号６２のアミノ酸１～１６）、またはヒンジドメインの一部（例えば、配列番号６２のアミノ酸４～１６）を含む。Ｃ末端Ｆｃ抗体を結合するための好ましいリンカーは、追加のポリペプチドの融合に好適なリンカーを含む、配列番号６３～配列番号７２に示される実施形態から選択され得る。同様に、図１８に示される構造Ｉ－Ｂのポリペプチドドメインのアミノ酸配列は、表１０に見出される。Ｆｃ抗体断片が構造Ｉ－ＢにあるようなＴＮＲＦＳＦ融合タンパク質のＮ末端に融合される場合、Ｆｃモジュールの配列は、好ましくは、配列番号７３に示されるものであり、リンカー配列は、好ましくは、配列番号７４～配列番号７６に示される実施形態から選択される。
ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、タボリキシズマブの可変重鎖及び可変軽鎖、１１Ｄ４の可変重鎖及び可変軽鎖、１８Ｄ８の可変重鎖及び可変軽鎖、Ｈｕ１１９－１２２の可変重鎖及び可変軽鎖、Ｈｕ１０６－２２２の可変重鎖及び可変軽鎖、表１７に記載の可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、前述の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ、ならびにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、バリアント、及びバイオシミラーからなる群から選択される１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。
ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、ＯＸ４０Ｌ配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１３３による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、可溶性ＯＸ４０Ｌ配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１３４による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１３５による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。
ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、各々が、それぞれ、配列番号８９及び配列番号９０に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ＶＨドメインとＶＬドメインはリンカーによって結合されている。ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、各々が、それぞれ、配列番号９９及び配列番号１００に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ＶＨドメインとＶＬドメインはリンカーによって結合されている。ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、各々が、それぞれ、配列番号１０９及び配列番号１１０に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ＶＨドメインとＶＬドメインはリンカーによって結合されている。ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、各々が、それぞれ、配列番号１２７及び配列番号１２８に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ＶＨドメインとＶＬドメインはリンカーによって結合されている。ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、各々が、それぞれ、配列番号１２５及び配列番号１２６に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ＶＨドメインとＶＬドメインはリンカーによって結合されている。ある実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、各々が表１７に示されるＶＨ配列及びＶＬ配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ＶＨドメインとＶＬドメインはリンカーによって結合されている。
Figure 2024512029000020
Figure 2024512029000021
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＯＸ４０結合ドメインを含むＯＸ４０アゴニスト一本鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／またはＣ末端に追加のドメインをさらに含み、追加のドメインは、ＦａｂまたはＦｃ断片ドメインである。ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＯＸ４０結合ドメインを含むＯＸ４０アゴニスト一本鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／またはＣ末端に追加のドメインをさらに含み、追加のドメインは、ＦａｂまたはＦｃ断片ドメインであり、可溶性ＯＸ４０ドメインは各々、茎領域（三量体化に寄与し、細胞膜まである特定の距離を提供するが、ＯＸ４０結合ドメインの一部分ではない）を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは独立して、３～８アミノ酸長を有する。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインを含むＯＸ４０アゴニスト一本鎖融合ポリペプチドであり、可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインは各々、茎領域を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは独立して、３～８アミノ酸長であり、ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインは、ＯＸ４０結合ドメインである。
いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ＭＥＤＩ６３８３である。ＭＥＤＩ６３８３は、ＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質であり、米国特許第６，３１２，７００号に記載されているように調製することができ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、前述のＶＬドメインのうちのいずれかに連結された前述のＶＨドメインのうちのいずれかを含むＯＸ４０アゴニストｓｃＦｖ抗体である。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）から市販されているＣｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体ＭＯＭ－１８４５５である。
ある実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から市販されているＯＸ４０アゴニスト抗体クローンＢｅｒ－ＡＣＴ３５である。
Ｃ．任意選択の細胞生存率分析
任意選択で、細胞生存率アッセイは、当該技術分野で知られている標準のアッセイを使用して、プライミングによる第１の拡張（初期バルク拡張と称されることもある）後に行われ得る。したがって、ある特定の実施形態では、方法は、プライミングによる第１の拡張後に細胞生存率アッセイを行うことを含む。例えば、死細胞を選択的に標識し、生存率の評価を可能にするトリパンブルー排除アッセイが、バルクＴＩＬの試料上で行われ得る。生存率の試験に使用する他のアッセイには、アラマーブルーアッセイ及びＭＴＴアッセイが含まれるが、これらに限定されない。
１．細胞計数、生存率、フローサイトメトリー
いくつかの実施形態では、細胞数及び／または生存率が測定される。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ５６などであるが、これらに限定されないマーカー、ならびに本明細書に開示または記載される任意の他のマーカーの発現は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用し、例えばＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から市販されているものであるが、これらに限定されない抗体を用いたフローサイトメトリーによって測定され得る。細胞は、使い捨てのｃチップ血球計数器（ＶＷＲ，Ｂａｔａｖｉａ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して手動で計数することができ、生存率は、トリパンブルー染色を含むが、これに限定されない、当該技術分野で知られている任意の方法を使用して評価することができる。細胞生存率は、米国特許出願公開第２０１８／０２８２６９４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に基づいてアッセイされ得る。細胞生存率は、米国特許公開第２０１８／０２８０４３６号または国際特許公開第ＷＯ／２０１８／０８１４７３号（いずれもあらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に基づいてアッセイすることもできる。
いくつかの事例では、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察されるプロトコルを使用して直ちに凍結保存され得る。あるいは、以下で論じられるように、バルクＴＩＬ集団がＲＥＰに供されて、凍結保存され得る。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬが療法に使用される場合、バルクまたはＲＥＰ ＴＩＬ集団が好適な治療のために遺伝子修飾に供され得る。
２．細胞培養
ある実施形態では、上で考察され、図１及び図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に例示されたものを含む、ＴＩＬを拡張するための方法は、約５，０００ｍＬ～約２５，０００ｍＬの細胞培地、約５，０００ｍＬ～約１０，０００ｍＬの細胞培地、または約５，８００ｍＬ～約８，７００ｍＬの細胞培地を使用することを含み得る。いくつかの実施形態では、培地は、無血清培地である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張における培地は、無血清である。いくつかの実施形態では、第２の拡張における培地は、無血清である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張及び第２の拡張（急速な第２の拡張とも称される）における培地は、両方とも無血清である。ある実施形態では、ＴＩＬの数を拡張することは、わずか１種類の細胞培養培地を使用する。任意の好適な細胞培養培地、例えば、ＡＩＭ Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡから市販されている）とも称される、ＡＩＭ－Ｖ細胞培地（Ｌ－グルタミン、５０μＭの硫酸ストレプトマイシン、及び１０μＭの硫酸ゲンタマイシン）が使用され得る。これに関して、本発明の方法は、ＴＩＬの数を拡張するために必要な培地の量及び培地の種類の数を有利に減少させる。ある実施形態では、ＴＩＬの数を拡張することは、３日または４日に１回以下の頻度で細胞にフィードすることを含み得る。ガス透過性容器内で細胞の数を拡張することは、細胞を拡張するために必要なフィード頻度を減少させることによって、細胞の数を拡張するために必要な手順を簡素化する。
ある実施形態では、第１及び／または第２のガス透過性容器内の細胞培養培地は、ろ過されていない。濾過されていない細胞培地の使用は、細胞の数を拡張するために必要な手順を簡素化することができる。ある実施形態では、第１及び／または第２のガス透過性容器内の細胞培地は、β－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を欠いている。
ある実施形態では、哺乳動物から腫瘍組織試料を取得することと、プライミングによる第１の拡張として約１～８日間、例えば約７日間、またはプライミングによる第１の拡張として約８日間にわたってＩＬ－２、１Ｘ抗原提示フィーダー細胞、及びＯＫＴ－３を含む細胞培地を含有する第１のガス透過性容器内で腫瘍組織試料を培養することと、ＴＩＬを第２のガス透過性容器に移し、ＩＬ－２、２Ｘ抗原提示フィーダー細胞、及びＯＫＴ－３を含む細胞培地を含有する第２のガス透過性容器内でＴＩＬの数を約７～９日間、例えば、約７日間、約８日間、または約９日間にわたって拡張することと、を含む方法の期間。
ある実施形態では、哺乳動物から腫瘍組織試料を取得することと、プライミングによる第１の拡張として約１～７日間、例えば約７日間にわたってＩＬ－２、１Ｘ抗原提示フィーダー細胞、及びＯＫＴ－３を含む細胞培地を含有する第１のガス透過性容器内で腫瘍組織試料を培養することと、ＴＩＬを第２のガス透過性容器に移し、ＩＬ－２、２Ｘ抗原提示フィーダー細胞、及びＯＫＴ－３を含む細胞培地を含有する第２のガス透過性容器内でＴＩＬの数を約７～１４日間、または約７～９日間、例えば、約７日間、約８日間、または約９日間、約１０日間、または約１１日間にわたって拡張することと、を含む方法の期間。
ある実施形態では、哺乳動物から腫瘍組織試料を取得することと、プライミングによる第１の拡張として約１～７日間、例えば約７日間にわたってＩＬ－２、１×抗原提示フィーダー細胞、及びＯＫＴ－３を含む細胞培地を含有する第１のガス透過性容器内で腫瘍組織試料を培養することと、ＴＩＬを第２のガス透過性容器に移し、ＩＬ－２、２×抗原提示フィーダー細胞、及びＯＫＴ－３を含む細胞培地を含有する第２のガス透過性容器内でＴＩＬの数を約７～１１日間、例えば約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、または約１１日間にわたって拡張することと、を含む方法の期間。
ある実施形態では、ＴＩＬは、ガス透過性容器内で拡張される。ガス透過性容器は、米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７Ａ１号に記載されるものを含む、当該技術分野で知られている方法、組成物、及びデバイスを使用して、ＰＢＭＣを使用してＴＩＬを拡張するために使用されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、ＴＩＬは、ガス透過性バッグ内で拡張される。ある実施形態では、ＴＩＬは、Ｘｕｒｉ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｗ２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などのガス透過性バッグ内のＴＩＬを拡張する細胞拡張システムを使用して拡張される。ある実施形態では、ＴＩＬは、Ｘｕｒｉ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｗ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）としても知られるＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍなどのガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡張する細胞拡張システムを使用して拡張される。ある実施形態では、細胞拡張システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、及び約１０Ｌからなる群から選択される体積を有するガス透過性細胞バッグを含む。
ある実施形態では、ＴＩＬは、Ｇ－Ｒｅｘフラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇから市販されている）内で拡張され得る。かかる実施形態は、細胞集団が約５×１０５細胞／ｃｍ２～１０×１０６及び３０×１０６細胞／ｃｍ２まで拡張するのを可能にする。ある実施形態では、これは、フィードなしである。ある実施形態では、これは、培地がＧ－Ｒｅｘフラスコ内の約１０ｃｍの高さに存在する限り、フィードなしである。ある実施形態では、これは、フィードなしであるが、１つ以上のサイトカインの添加を伴う。ある実施形態では、サイトカインを培地と混合する必要なしに、サイトカインがボーラスとして添加され得る。かかる容器、装置、及び方法は、当該技術分野で知られており、ＴＩＬを拡張するために使用されており、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第ＷＯ２０１４／２１００３６Ａ１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０１１５６１７Ａ１号、国際公開第ＷＯ２０１３／１８８４２７Ａ１、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０１３６２２８Ａ１、米国特許第ＵＳ８，８０９，０５０Ｂ２号、国際公開第ＷＯ２０１１／０７２０８８Ａ２号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１６／０２０８２１６Ａ１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１２／０２４４１３３Ａ１号、国際公開第ＷＯ２０１２／１２９２０１Ａ１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０１０２０７５Ａ１号、米国特許第ＵＳ８，９５６，８６０Ｂ２号、国際公開第ＷＯ２０１３／１７３８３５Ａ１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０１７５９６６Ａ１号に記載されるものを含み、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。かかるプロセスも、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１２，３５：２８３－２９２に記載されている。
Ｄ．ＴＩＬの任意選択の遺伝子操作
いくつかの実施形態では、本発明の拡張ＴＩＬは、タンパク質発現を一過的に変化させるために、各々本明細書で提供されるように、閉鎖滅菌製造プロセス中を含む、拡張ステップ前、拡張ステップ中、または拡張ステップ後にさらに操作される。いくつかの実施形態では、一過的に変化したタンパク質発現は、一過性の遺伝子編集によるものである。いくつかの実施形態では、本発明の拡張ＴＩＬは、ＴＩＬにおけるタンパク質発現を一過的に変化させることができる転写因子（ＴＦ）及び／または他の分子で処理される。いくつかの実施形態では、タンパク質発現を一過的に変化させることができるＴＦ及び／または他の分子は、腫瘍抗原の発現の変化及び／またはＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を提供する。
ある特定の実施形態では、方法は、ＴＩＬ集団を遺伝子編集することを含む。ある特定の実施形態では、この方法は、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、及び／または第３のＴＩＬ集団を遺伝子編集することを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のタンパク質の発現の促進または１つ以上のタンパク質の発現の阻害、ならびに一組のタンパク質の促進及び別の組のタンパク質の阻害の両方の組み合わせの同時発生のために、リボ核酸（ＲＮＡ）挿入、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または低分子（もしくは短）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のＴＩＬ集団への挿入などのヌクレオチド挿入による遺伝子編集を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の拡張ＴＩＬは、タンパク質発現の一過性の変化を受ける。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、図８（特に図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に示されるようなステップＡから得られたＴＩＬ集団を含む、第１の拡張前のバルクＴＩＬ集団において起こる。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、図８（例えば、図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に示されるように、例えば、ステップＢで拡張されたＴＩＬ集団におけるものを含む、第１の拡張中に起こる。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、図８に示されるように、ステップＢから取得され、ステップＣに含まれるＴＩＬ集団である、例えば、第１の拡張と第２の拡張との間の移行中のＴＩＬ集団（例えば、本明細書に記載の第２のＴＩＬ集団）におけるものを含む、第１の拡張後に起こる。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、図８に示されるように、例えば、ステップＣから取得され、ステップＤでのその拡張前のＴＩＬ集団を含む、第２の拡張前のバルクＴＩＬ集団において起こる。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、図８に示されるように、例えば、ステップＤで拡張されたＴＩＬ集団（例えば、第３のＴＩＬ集団）を含む、第２の拡張中に起こる。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、図８に示されるように、例えば、ステップＤでの拡張から取得されたＴＩＬ集団を含む、第２の拡張後に起こる。
ある実施形態では、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過的に変化させる方法は、エレクトロポレーションステップを含む。エレクトロポレーション法は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｔｓｏｎｇ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９１，６０，２９７－３０６及び米国特許出願公開第２０１４／０２２７２３７Ａ１号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過的に変化させる方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションステップを含む。リン酸カルシウムトランスフェクション法（リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿、細胞表面コーティング、及びエンドサイトーシス）は、当該技術分野で知られており、Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７３，５２，４５６－４６７、Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９７９，７６，１３７３－１３７６、及びＣｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｒｅａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７，７，２７４５－２７５２、ならびに米国特許第５，５９３，８７５号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過的に変化させる方法は、リポソームトランスフェクションステップを含む。リポソームトランスフェクション法、例えば、カチオン性脂質Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－ｎ，ｎ，ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びジオレオイルホスホチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤を用いる方法は、当該技術分野において既知であり、Ｒｏｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９１，１０，５２０－５２５及びＦｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４，７４１３－７４１７、ならびに米国特許第５，２７９，８３３号、同第５，９０８，６３５号、同第６，０５６，９３８号、同第６，１１０，４９０号、同第６，５３４，４８４号、及び同第７，６８７，０７０号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過的に変化させる方法は、米国特許第５，７６６，９０２号、同第６，０２５，３３７号、同第６，４１０，５１７号、同第６，４７５，９９４号、及び同第７，１８９，７０５号に記載されている方法を使用するトランスフェクションステップを含み、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の増加をもたらす。ＴＳＣＭは、抗原を経験したセントラルメモリーＴ細胞の初期前駆細胞である。ＴＳＣＭは、一般に、幹細胞を定義する長期生存、自己再生、及び多分化能を示し、一般に、効果的なＴＩＬ製品の生成に望ましいものである。ＴＳＣＭは、養子細胞移植のマウスモデルにおいて他のＴ細胞サブセットと比較して増強された抗腫瘍活性を示している（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００９，２０１１、Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２０１２、Ｃｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０１３）。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、高い割合のＴＳＣＭを含む組成を有するＴＩＬ集団をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＳＣＭパーセンテージの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＬ集団中のＴＳＣＭの少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＴＳＣＭを有するＴＩＬ集団をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＴＳＣＭを有する治療的ＴＩＬ集団をもたらす。
いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、抗原を経験したＴ細胞の幼若化をもたらす。いくつかの実施形態では、幼若化には、例えば、増加した増殖、増加したＴ細胞活性化、及び／または増加した抗原認識が含まれる。
いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを保存するために、Ｔ細胞の大部分における発現を変化させる。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを変化させない。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを維持する。
いくつかの実施形態では、タンパク質の一過性の変化は、特定の遺伝子の発現の変化をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１（ＰＤＣＤ１またはＣＣ２７９とも称される）、ＴＧＦＢＲ２、ＣＣＲ４／５、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ－Ｂ）、ＣＩＳＨ、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＳＣＲ３、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１－β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＶＨＬ、ＣＤ４４、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＯＣＳ１、及び／またはｃＡＭＰタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）を含むが、これらに限定されない遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＣＲ４／５、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ－Ｂ）、ＣＩＳＨ、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＳＣＲ３、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１－β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＶＨＬ、ＣＤ４４、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＯＣＳ１、及び／またはｃＡＭＰタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）からなる群から選択される遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＧＦＢＲ２を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ４／５を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性変化は、ＣＢＬＢを標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性変化は、ＣＩＳＨを標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－２を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－１２を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－１５を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－２１を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＮＯＴＣＨ１／２ ＩＣＤを標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性変化は、ＴＩＧＩＴを標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＧＦβを標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ１を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ２を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ４を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ５を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＲ１を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＲ２を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＳＣＲ３を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１－β）を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＬ１を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＬ８を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ２２を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ１７を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性変化は、ＶＨＬを標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＤ４４を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＩＫ３ＣＤを標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＳＯＣＳ１を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ｃＡＭＰタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）を標的とする。
いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ケモカイン受容体の発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、一過性タンパク質発現によって過剰発現されるケモカイン受容体は、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１－β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、及び／またはＣＣＬ１７を含むが、これらに限定されないリガンドを有する受容体を含む。
いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲ２、及び／またはＴＧＦβの発現の低下及び／または減少をもたらす（例えば、ＴＧＦβ経路の遮断をもたらすことを含む）。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ－Ｂ）の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨの発現の低下及び／または減少をもたらす。
いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、腫瘍部位へのＴＩＬの輸送または移動を改善するために、ケモカイン受容体の発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）の発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、及び／またはＣＳＣＲ３からなる群から選択されるケモカイン受容体の発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。
いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、インターロイキンの発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１からなる群から選択されるインターロイキンの発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。
いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＮＯＴＣＨ１／２ ＩＣＤの発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＶＨＬの発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＤ４４の発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＩＫ３ＣＤの発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＳＯＣＳ１の発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。
いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ｃＡＭＰタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の発現の低下及び／または減少をもたらす。
いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される２つの分子の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ならびにＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つの分子の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３、及びそれらの組み合わせの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ならびにＬＡＧ３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３、及びそれらの組み合わせのうちの１つの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１及びＬＡＧ３の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１及びＣＩＳＨの発現の減少及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１及びＣＢＬＢの発現の減少及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３及びＣＩＳＨの発現の減少及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３及びＣＢＬＢの発現の減少及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＰＤ－１の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＬＡＧ３の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＣＩＳＨの発現の減少及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＣＢＬＢの発現の減少及び／または減少をもたらす。
いくつかの実施形態では、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルスまたはレンチウイルス法によって、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、または採取されたＴＩＬ集団に挿入される（例えば、接着分子の発現が増加する）。
いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現の低下及び／または減少、ならびにＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、及びそれらの組み合わせの発現の増加及び／または増強をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現の低下及び／または減少、ならびにＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、及びそれらの組み合わせの発現の増加及び／または増強をもたらす。
いくつかの実施形態では、発現が約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８０％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約９０％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約９９％減少する。
いくつかの実施形態では、発現が約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％増加する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％増加する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％増加する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％増加する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８５％、約９０％、または約９５％増加する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８０％増加する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８５％増加する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約９０％増加する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約９５％増加する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約９９％増加する。
いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＬにおけるタンパク質発現を一過的に変化させることができる転写因子（ＴＦ）及び／または他の分子でのＴＩＬの処理によって誘導される。いくつかの実施形態では、ＳＱＺベクターを含まないマイクロ流体プラットフォームが、タンパク質発現を一過的に変化させることができる転写因子（ＴＦ）及び／または他の分子の細胞内送達のために用いられる。転写因子を含むタンパク質を、Ｔ細胞を含む様々な初代ヒト細胞に送達する能力を実証する方法（Ｓｈａｒｅｉ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１３、ならびにＳｈａｒｅｉ ｅｔ ａｌ．ＰＬＯＳ ＯＮＥ ２０１５及びＧｒｅｉｓｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１９５，２０１５）が説明されており、例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１３／０５９３４３Ａ１号、同第ＷＯ２０１７／００８０６３Ａ１号、及び同第ＷＯ２０１７／１２３６６３Ａ１号（これらはすべて参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。かかる方法は、国際特許公開第ＷＯ２０１３／０５９３４３Ａ１号、同第ＷＯ２０１７／００８０６３Ａ１号、及び同第ＷＯ２０１７／１２３６６３Ａ１号に記載されており、ＴＩＬ集団を、転写因子（ＴＦ）及び／または一過性タンパク質発現を誘導することができる他の分子に曝露するために本発明で用いることができ、上述のＴＦ、及び／または一過性タンパク質発現を誘導することができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現、及び／またはＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の増加を提供し、したがって、ＴＩＬ集団の再プログラミングをもたらし、再プログラミングされていないＴＩＬ集団と比較して、再プログラミングされたＴＩＬ集団の治療的有効性の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、再プログラミングは、本明細書に記載されるように、ＴＩＬ開始集団またはＴＩＬ前集団（すなわち、再プログラミング前の）集団と比較して、エフェクターＴ細胞及び／またはセントラルメモリーＴ細胞の亜集団の増加をもたらす。
いくつかの実施形態では、転写因子（ＴＦ）には、ＴＣＦ－１、ＮＯＴＣＨ１／２ ＩＣＤ、及び／またはＭＹＢが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、転写因子（ＴＦ）は、ＴＣＦ－１である。いくつかの実施形態では、転写因子（ＴＦ）は、ＮＯＴＣＨ１／２ ＩＣＤである。いくつかの実施形態では、転写因子（ＴＦ）は、ＭＹＢである。いくつかの実施形態では、転写因子（ＴＦ）は、さらなるＴＩＬ再プログラミングを誘導するために、市販のＫＮＯＣＫＯＵＴ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）などの誘導多能性幹細胞培養物（ｉＰＳＣ）とともに投与される。いくつかの実施形態では、転写因子（ＴＦ）は、さらなるＴＩＬ再プログラミングを誘導するために、ｉＰＳＣカクテルとともに投与される。いくつかの実施形態では、転写因子（ＴＦ）は、ｉＰＳＣカクテルなしで投与される。いくつかの実施形態では、再プログラミングは、ＴＳＣＭのパーセンテージの増加をもたらす。いくつかの実施形態では、再プログラミングは、ＴＳＣＭのパーセンテージの約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％ＴＳＣＭの増加をもたらす。
いくつかの実施形態では、上記のようにタンパク質発現を一過的に変化させる方法は、ＴＩＬの集団を遺伝子修飾する方法と組み合わせられてもよく、１つ以上のタンパク質の産生のための遺伝子の安定した組み込みステップを含む。ある特定の実施形態では、この方法は、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾するステップを含む。ある特定の実施形態では、この方法は、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、及び／または第３のＴＩＬ集団を遺伝子修飾することを含む。ある実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、レトロウイルス形質導入ステップを含む。ある実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、レンチウイルス形質導入ステップを含む。レンチウイルス形質導入系は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｌｅｖｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００６，１０３，１７３７２－７７、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７，１５，８７１－７５、Ｄｕｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９８，７２，８４６３－７１、及び米国特許第６，６２７，４４２号（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ある実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、ガンマレトロウイルス形質導入ステップを含む。ガンマレトロウイルス形質導入系は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｃｅｐｋｏ ａｎｄ Ｐｅａｒ，Ｃｕｒ．Ｐｒｏｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９６，９．９．１－９．９．１６に記載されており、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、トランスポゾン媒介遺伝子導入ステップを含む。トランスポゾン媒介遺伝子導入系は、当該技術分野で知られており、トランスポザーゼが、ＤＮＡ発現ベクターとしてまたは発現可能なＲＮＡもしくはタンパク質として提供される系を含み、これにより、トランスポザーゼ、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、キャップ及びポリＡ尾部を含むｍＲＮＡ）として提供されるトランスポザーゼの長期発現がトランスジェニック細胞で起こらないようになる。ＳＢ１０、ＳＢ１１、及びＳＢ１００ｘなどのサケ科型Ｔｅｌ様トランスポザーゼ（ＳＢまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ）を含む好適なトランスポゾン媒介遺伝子導入系、ならびに増加した酵素活性を有する操作された酵素は、例えば、Ｈａｃｋｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１０，１８，６７４－８３及び米国特許第６，４８９，４５８号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、高パーセンテージの２’－ＯＨ置換（典型的にはフッ素または－ＯＣＨ３）を有する化学的に合成された非対称ｓｉＲＮＡ二重鎖である自己送達ＲＮＡ干渉（ｓｄＲＮＡ）によって誘導される発現の減少であり、これはテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカーを使用してその３’末端でコレステロールに複合された、２０ヌクレオチドアンチセンス（ガイド）鎖及び１３～１５塩基センス（パッセンジャー）鎖を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現の一過性の変化を含み、これは、高パーセンテージの２’－ＯＨ置換（典型的にはフッ素または－ＯＣＨ３）を有する化学的に合成された非対称ｓｉＲＮＡ二重鎖である自己送達ＲＮＡ干渉（ｓｄＲＮＡ）の使用を含み、これはテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカーを使用してその３’末端でコレステロールにコンジュゲートされた、２０ヌクレオチドアンチセンス（ガイド）鎖及び１３～１５塩基センス（パッセンジャー）鎖を含む。ｓｄＲＮＡを使用する方法は、Ｋｈｖｏｒｏｖａ ａｎｄ Ｗａｔｔｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７，３５，２３８－２４８、Ｂｙｒｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｃｕｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１３，２９，８５５－８６４、及びＬｉｇｔｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１８（印刷中）に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、エレクトロポレーション、ＳＱＺ、または他の方法を使用せず、代わりに、ＴＩＬ集団が培地中１μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される１～３日の期間を使用して達成される。ある特定の実施形態では、この方法は、ＴＩＬ集団を培地中１μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で１～３日の期間にわたってｓｄＲＮＡに曝露することを含む、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達を含む。ある実施形態では、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中１０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される１～３日の期間を使用して達成される。ある実施形態では、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中５０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される１～３日の期間を使用して達成される。ある実施形態では、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中０．１μＭ／１０，０００ＴＩＬ～５０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される１～３日の期間を使用して達成される。ある実施形態では、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中０．１μＭ／１０，０００ＴＩＬ～５０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される１～３日の期間を使用して達成され、ｓｄＲＮＡへの曝露は、培地に新鮮なｓｄＲＮＡを添加することによって２、３、４、または５回行われる。他の好適なプロセスは、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／００３９９１４Ａ１号、同第ＵＳ２０１３／０１３１１４１Ａ１号、及び同第ＵＳ２０１３／０１３１１４２Ａ１号、ならびに米国特許第９，０８０，１７１号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡは、製造中にＴＩＬ集団に挿入される。いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡは、ＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４ ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＴＧＦＢＲ２、ｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、ＢＡＦＦ ＢＲ３、ＣＩＳＨ、及び／またはＣＢＬＢに干渉するＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、発現の減少は、例えば、フローサイトメトリー及び／またはｑＰＣＲによって評価される、遺伝子サイレンシングのパーセンテージに基づいて決定される。いくつかの実施形態では、発現が約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８０％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約９０％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約９９％減少する。
ｓｉＲＮＡの化学修飾に基づく自己送達可能なＲＮＡｉ技術を本発明の方法とともに用いて、本明細書に記載されるように、ｓｄＲＮＡをＴＩＬに首尾よく送達することができる。非対称ｓｉＲＮＡ構造の骨格修飾と疎水性リガンドとの組み合わせ（例えば、Ｌｉｇｔｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１８及びＵＳ２０１６０３０４８７３を参照）により、ｓｄＲＮＡは、ｓｄＲＮＡのヌクレアーゼ安定性を利用する培養培地への単純な添加によって、追加の製剤及び方法なしで、培養された哺乳動物細胞に浸透することができる。この安定性により、単に培地中のｓｄＲＮＡの活性濃度を維持することによって、標的遺伝子活性の一定レベルのＲＮＡｉを介した減少を支援することができる。理論に拘束されることはないが、ｓｄＲＮＡの骨格安定化は、非分裂細胞で数ヶ月間続く可能性のある遺伝子発現効果の延長された低減を提供する。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの９５％を超えるトランスフェクション効率及び様々な特定のｓｄＲＮＡによる標的の発現の減少が起こる。いくつかの実施形態では、いくつかの未修飾リボース残基を含むｓｄＲＮＡは、ＲＮＡｉ効果の効力及び／または寿命を増加させるために、完全に修飾された配列で置き換えられた。いくつかの実施形態では、発現効果の減少は、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、５日間、６日間、７日間、または８日間以上維持される。いくつかの実施形態では、発現効果の減少は、ＴＩＬのｓｄＲＮＡ処理後１０日以上で減少する。いくつかの実施形態では、標的発現の発現の７０％を超える減少が維持される。いくつかの実施形態では、標的発現の発現の７０％を超える減少が維持されるＴＩＬ。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路における発現の減少により、ＴＩＬがより強力なインビボ効果を示すことが可能になり、これは、いくつかの実施形態では、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路の抑制効果の回避に起因する。いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡによるＰＤ－１の発現の減少は、ＴＩＬ増殖の増加をもたらす。
短干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとして知られることもある、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、一般に１９～２５塩基対長の二本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）において使用され、相補的なヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現に干渉する。
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、一般に、ＲＮＡの相補鎖の対、一般にセンス（パッセンジャー）鎖及びアンチセンス（ガイド）鎖を含む任意の分子を定義するために使用することができ、一本鎖オーバーハング領域を含み得る。ｓｉＲＮＡとは対照的に、ｄｓＲＮＡという用語は、一般に、ダイサーを含む切断酵素系の作用によりより大きいｄｓＲＮＡ分子から放出されるｓｉＲＮＡ分子の配列を含む前駆体分子を指す。
ｓｄＲＮＡ（自己送達可能なＲＮＡ）は、共有結合的に修飾された新たなクラスのＲＮＡｉ化合物であり、細胞に侵入するために送達媒体を必要とせず、従来のｓｉＲＮＡと比較して改善された薬理学的性質を有する。「自己送達可能なＲＮＡ」または「ｓｄＲＮＡ」は、疎水的に修飾されたＲＮＡ干渉－アンチセンスハイブリッドであり、初代細胞においてインビトロで、及び局所投与時にインビボで非常に有効であることが実証されている。毒性のない強力な取り込み及び／またはサイレンシングが実証されている。ｓｄＲＮＡは、一般に、最小限の二本鎖領域を有する非対称の化学修飾された核酸分子である。ｓｄＲＮＡ分子は、典型的に一本鎖領域及び二本鎖領域を含み、分子の一本鎖領域及び二本鎖領域の両方に様々な化学修飾を含み得る。加えて、ｓｄＲＮＡ分子は、本明細書に記載されているように、従来の高度なステロール型分子などの疎水性コンジュゲートに結合することができる。ｓｄＲＮＡ及びかかるｓｄＲＮＡを作製するための関連方法は、例えば、ＵＳ２０１６０３０４８７３、ＷＯ２０１００３３２４６、ＷＯ２０１７０７０１５１、ＷＯ２００９１０２４２７、ＷＯ２０１１１１９８８７、ＷＯ２０１００３３２４７Ａ２、ＷＯ２００９０４５４５７、ＷＯ２０１１１１９８５２にも広く記載されており、これらはすべて、参照によりそれらの全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる。ｓｄＲＮＡ構造、化学的性質、標的位置、配列優先性などを最適化するために、独自のアルゴリズムが開発され、ｓｄＲＮＡの効力予測に利用されている（例えば、ＵＳ２０１６０３０４８７３を参照のこと）。これらの分析に基づいて、機能的なｓｄＲＮＡ配列は、一般に、１μＭの濃度で７０％を超える発現の減少を有すると定義されており、確率は４０％を超える。
いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の７０％の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の７５％の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の８０％の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の８５％の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の９０％の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の９５％の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の９９％の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ～約４μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、治療剤の安定性及び／または効力を増加させ、かつ治療される細胞または組織へのオリゴヌクレオチドの効率的な送達をもたらすための１つ以上の修飾を含む。かかる修飾には、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－Ｏ－フルロ修飾、ジホスホロチオエート修飾、２’Ｆ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾、及び／または２’デオキシヌクレオチドが含まれ得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、ステロール、コレステロール、ビタミンＤ、ナフチル、イソブチル、ベンジル、インドール、トリプトファン、及び／またはフェニルを含む１つ以上の疎水性修飾を含むように修飾される。追加の特定の実施形態では、化学修飾されたヌクレオチドは、ホスホロチオエート、２’－Ｏ－メチル、２’デオキシ、疎水性修飾、及びホスホロチオエートの組み合わせである。いくつかの実施形態では、糖が修飾され得、修飾された糖には、Ｄ－リボース、２’－Ｏ－アルキル（２’－Ｏ－メチル及び２’－０－エチルを含む）、すなわち、２’－アルコキシ、２’－アミノ、２’－Ｓ－アルキル、２’－ハロ（２’－フルオロを含む）、Ｔ－メトキシエトキシ、２’－アリルオキシ（－ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’－プロパルギル、２’－プロピル、エチニル、エテニル、プロペニル、及びシアノなどが含まれ得るが、これらに限定されない。一実施形態では、糖部分は、ヘキソースであり得、Ａｕｇｕｓｔｙｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９２，１８，４７１１に記載されているように、オリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。
いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖であり、すなわち、分子のいずれかの末端にも一本鎖配列が突出しておらず、すなわち、平滑末端である。いくつかの実施形態では、個々の核酸分子は、異なる長さであり得る。言い換えれば、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖ではない。例えば、２つの別個の核酸分子が使用される場合、アンチセンス配列を含むそれらの分子の一方、例えば、第１の分子は、それにハイブリダイズする（分子の一部分を一本鎖のままにする）第２の分子よりも長い可能性がある。いくつかの実施形態では、単一の核酸分子が使用される場合、いずれかの末端の分子の一部分は、一本鎖のままであり得る。
いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、ミスマッチ及び／またはループもしくはバルジを含むが、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約７０％にわたって二本鎖である。いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約８０％にわたって二本鎖である。別の実施形態では、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９０％～９５％にわたって二本鎖である。いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９６％～９８％にわたって二本鎖である。いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくともまたは最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のミスマッチを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、３’または５’結合を修飾することによって、ヌクレアーゼから実質的に保護され得る（例えば、米国特許第５，８４９，９０２号及びＷＯ９８／１３５２６）。例えば、オリゴヌクレオチドは、「ブロッキング基」を含めることによって耐性にすることができる。本明細書で使用される場合、「ブロッキング基」という用語は、合成のための保護基またはカップリング基のいずれかとして（例えば、ＦＩＴＣ、プロピル（ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ３）、グリコール（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）ホスフェート（ＰＯ３ ２’’）、リン酸水素、もしくはホスホロアミダイト）、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオモノマーに結合され得る置換基（例えば、ＯＨ基以外）を指す。「ブロッキング基」は、修飾ヌクレオチド及び非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ耐性構造を含む、オリゴヌクレオチドの５’及び３’末端を保護する「末端ブロッキング基」または「エキソヌクレアーゼブロッキング基」も含み得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡ内の隣接するポリヌクレオチドの少なくとも一部分は、代替の結合、例えば、ホスホロチオエート結合によって結合されている。
いくつかの実施形態では、化学修飾は、細胞取り込みの少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００増強をもたらし得る。いくつかの実施形態では、Ｃ残基またはＵ残基の少なくとも一方が疎水性修飾を含む。いくつかの実施形態では、複数のＣ及びＵが疎水性修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ及びＵの少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％が疎水性修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃ及びＵのすべてが疎水性修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡまたはｓｄ－ｒｘＲＮＡは、プロトン化可能なアミンの組み込みを介したｓｄ－ｒｘＲＮＡ分子のエンドソーム放出の増強を示す。いくつかの実施形態では、プロトン化可能なアミンは、センス鎖（ＲＩＳＣ負荷後に廃棄される分子の一部分）に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明のｓｄＲＮＡ化合物は、二重鎖領域（１０～１５塩基長の効率的なＲＩＳＣ侵入に必要）及び４～１２ヌクレオチド長の一本鎖領域を１３ヌクレオチド二重鎖とともに含む非対称化合物を含む。いくつかの実施形態では、６ヌクレオチドの一本鎖領域が用いられる。いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡの一本鎖領域は、２～１２個のホスホロチオエートインテムクレオチド結合（ホスホロチオエート修飾と称される）を含む。いくつかの実施形態では、６～８個のホスホロチオエートインテムクレオチド結合が用いられる。いくつかの実施形態では、本発明のｓｄＲＮＡ化合物は、安定性を提供し、かつＲＩＳＣ侵入と互換性がある固有の化学修飾パターンを含む。
ガイド鎖は、例えば、ＲＩＳＣ侵入に干渉することなく安定性を確証する任意の化学修飾によって修飾することもできる。いくつかの実施形態では、ガイド鎖における化学修飾パターンは、２’Ｆが修飾され、かつ５’末端がリン酸化されたＣ及びＵヌクレオチドの大部分を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡまたはｓｄ－ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも３０％が修飾されている。いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡまたはｓｄ－ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が修飾されている。いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡまたはｓｄ－ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの１００％が修飾されている。
いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡ分子は、最小の二本鎖領域を有する。いくつかの実施形態では、二本鎖である分子の領域は、８～１５ヌクレオチド長の範囲である。いくつかの実施形態では、二本鎖である分子の領域は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、１３ヌクレオチド長である。ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間に１００％の相補性が存在する場合もあれば、ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間に１つ以上の不一致が存在する場合もある。いくつかの実施形態では、二本鎖分子の一端で、分子は、平滑末端であるか、または１ヌクレオチドのオーバーハングを有するかのいずれかである。分子の一本鎖領域は、いくつかの実施形態では、４～１２ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、一本鎖領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、一本鎖領域は、４ヌクレオチド長未満または１２ヌクレオチド長超であることもできる。ある特定の実施形態では、一本鎖領域は、６または７ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡ分子は、増加した安定性を有する。いくつかの事例では、化学修飾されたｓｄＲＮＡまたはｓｄ－ｒｘＲＮＡ分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間以上、または２４時間超（任意の中間値を含む）の培地中での半減期を有する。いくつかの実施形態では、ｓｄ－ｒｘＲＮＡは、１２時間以上の培地中での半減期を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡは、効力の増加及び／または毒性の低減のために最適化されている。いくつかの実施形態では、ガイド鎖及び／またはパッセンジャー鎖のヌクレオチド長、及び／またはガイド鎖及び／またはパッセンジャー鎖におけるホスホロチオエート修飾の数が、いくつかの態様では、ＲＮＡ分子の効力に影響を与え得る一方で、２’－フルオロ（２’Ｆ）修飾の２’－０－メチル（２’ＯＭｅ）修飾での置き換えは、いくつかの態様では、分子の毒性に影響を与え得る。いくつかの実施形態では、分子の２’Ｆ含有量の減少は、分子の毒性を低減すると予測される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子におけるホスホロチオエート修飾の数は、細胞への分子の取り込み、例えば、細胞への分子の受動的取り込みの効率に影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡは、２’Ｆ修飾を有しないが、それにもかかわらず、細胞取り込み及び組織浸透における同等の有効性を特徴とする。
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、およそ１８～１９ヌクレオチド長であり、およそ２～１４個のリン酸修飾を有する。例えば、ガイド鎖は、リン酸修飾された２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個、または１４個超のヌクレオチドを含み得る。ガイド鎖は、ＲＩＳＣの侵入に干渉することなく増加した安定性を付与する１つ以上の修飾を含み得る。ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドなどのリン酸修飾ヌクレオチドは、３’末端にあるか、５’末端にあるか、またはガイド鎖全体に広がっている可能性がある。いくつかの実施形態では、ガイド鎖の３’末端１０ヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含む。ガイド鎖は、分子全体に位置し得る２’Ｆ及び／または２’ＯＭｅ修飾も含み得る。いくつかの実施形態では、ガイド鎖の１位のヌクレオチド（ガイド鎖の最も５’側のヌクレオチド）は、２’ＯＭｅ修飾及び／またはリン酸化されている。ガイド鎖内のＣ及びＵヌクレオチドは、２’Ｆ修飾されていてもよい。例えば、１９ｎｔガイド鎖の２～１０位（または異なる長さのガイド鎖における対応する位置）のＣ及びＵヌクレオチドは、２’Ｆ修飾されていてもよい。ガイド鎖内のＣ及びＵヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾されている場合もある。例えば、１９ｎｔガイド鎖の１１～１８位（または異なる長さのガイド鎖における対応する位置）のＣ及びＵヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾されていてもよい。いくつかの実施形態では、ガイド鎖の最も３’側の末端のヌクレオチドは修飾されていない。ある特定の実施形態では、ガイド鎖内のＣ及びＵの大部分は２’Ｆ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されている。他の実施形態では、１位及び１１～１８位のＣまたはＵは２’ＯＭｅ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されている。他の実施形態では、位置１及び位置１１～１８のＣｓまたはＵｓは２’ＯＭｅ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されており、２～１０位のＣまたはＵは２’Ｆ修飾されている。
自己送達可能なＲＮＡｉ技術は、追加の製剤または技法を必要とすることなくＲＮＡｉ剤で細胞を直接トランスフェクトする方法を提供する。トランスフェクションが困難な細胞株をトランスフェクトする能力、高いインビボ活性、及び使用の単純さは、従来のｓｉＲＮＡベースの技法に優る重大な機能的利点を提示する組成物及び方法の特徴であり、したがって、ｓｄＲＮＡ法は、本発明のＴＩＬにおける標的遺伝子の発現を減少させる方法に関連するいくつかの実施形態で用いられる。ｓｄＲＮＡｉ法により、化学合成された化合物をエクスビボ及びインビボの両方で広範囲の一次細胞及び組織に直接送達することが可能になる。本明細書における本発明のいくつかの実施形態に記載のｓｄＲＮＡは、Ａｄｖｉｒｎａ ＬＬＣ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）から市販されている。
ｓｄＲＮＡは、疎水的に修飾されたｓｉＲＮＡ－アンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリッド構造として形成され、例えば、Ｂｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１３，Ｊ．Ｏｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２９（１０）：８５５－８６４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。
いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドは、滅菌エレクトロポレーションを使用して本明細書に記載のＴＩＬに送達され得る。ある特定の実施形態では、この方法は、ｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドを送達するためにＴＩＬ集団の滅菌エレクトロポレーションを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、膜貫通送達システムと組み合わせて細胞に送達され得る。いくつかの実施形態では、この膜貫通送達システムは、脂質、ウイルスベクターなどを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、自己送達ＲＮＡｉ剤であり、いかなる送達剤も必要としない。ある特定の実施形態では、この方法は、ｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドをＴＩＬ集団に送達するために膜貫通送達システムの使用を含む。
オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド組成物は、本明細書に記載のＴＩＬと接触し（例えば、接触させられ、本明細書では投与または送達されるとも称される）、ＴＩＬによって取り込まれる（ＴＩＬによる受動的取り込みを含む）。ｓｄＲＮＡは、第１の拡張中（例えば、ステップＢ）、第１の拡張後（例えば、ステップＣ中）、第２の拡張前または拡張中（例えば、ステップＤの前またはステップＤ中）、ステップＥにおける採取前、ステップＦにおける採取中または採取後、ステップＦにおける最終製剤化及び／または注入バッグへの移行前または移行中、ならびにステップＦにおける任意選択の凍結保存ステップ前に、本明細書に記載のＴＩＬに添加され得る。さらに、ｓｄＲＮＡは、ステップＦにおける任意の凍結保存ステップから解凍した後に添加され得る。ある実施形態では、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の１つ以上のｓｄＲＮＡ標的遺伝子が、１００ｎＭ～２０ｍＭ、２００ｎＭ～１０ｍＭ、５００ｎｍ～１ｍＭ、１μＭ～１００μＭ、及び１μＭ～１００μＭからなる群から選択される濃度でＴＩＬ及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。ある実施形態では、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の１つ以上のｓｄＲＮＡ標的遺伝子は、０．１μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．５μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．７５μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．２５μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．５μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、２μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、５μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、または１０μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地からなる群から選択される量でＴＩＬ及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。ある実施形態では、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の１つ以上のｓｄＲＮＡ標的遺伝子は、ＲＥＰ前段階またはＲＥＰ段階中に１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、または７日毎にＴＩＬ培養物に添加され得る。
ｓｄＲＮＡを含む本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、例えば、細胞培養培地にｓｄＲＮＡを高濃度で溶解し、かつ受動的取り込みが起こるのに十分な時間を許容することによって、拡張プロセス中に本明細書に記載のＴＩＬと接触することができる。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、ＴＩＬ集団を、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド組成物と接触させることを含む。ある特定の実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオチド、例えば、ｓｄＲＮＡを細胞培養培地に溶解することと、細胞培養培地をＴＩＬ集団と接触させることとを含む。ＴＩＬは、本明細書に記載の第１の集団、第２の集団、及び／または第３の集団であり得る。
いくつかの実施形態では、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達は、リン酸カルシウム、ＤＭＳＯ、グリセロールもしくはデキストラン、エレクトロポレーションを含む好適な当該技術分野で認められている方法によって、またはトランスフェクションによって、例えば、当該技術分野で知られている方法を使用してカチオン性、アニオン性、もしくは中性脂質組成物またはリポソームを使用して増強され得る（例えば、ＷＯ９０／１４０７４、ＷＯ９１／１６０２４、ＷＯ９１／１７４２４、米国特許第４，８９７，３５５号、Ｂｅｒｇａｎ ｅｔ ａ １９９３．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２１：３５６７を参照）。
いくつかの実施形態では、２つ以上のｓｄＲＮＡが、標的遺伝子の発現を減少させるために使用される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３、及び／またはＣＩＳＨを標的とするｓｄＲＮＡのうちの１つ以上が一緒に使用される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ ｓｄＲＮＡは、２つ以上の遺伝子標的の発現を減少させるために、ＴＩＭ３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３、及び／またはＣＩＳＨのうちの１つ以上とともに使用される。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ３ ｓｄＲＮＡは、両方の標的の遺伝子発現を減少させるために、ＣＩＳＨを標的とするｓｄＲＮＡと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、本明細書におけるＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３、及び／またはＣＩＳＨのうちの１つ以上を標的とするｓｄＲＮＡは、Ａｄｖｉｒｎａ ＬＬＣ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）から市販されている。
いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１を標的とし、別のｓｄＲＮＡは、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３、及びそれらの組み合わせから選択される遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１、ならびにＬＡＧ３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３のうちの１つ、及びそれらの組み合わせから選択される遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｄＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、１つのｓｄＲＮＡがＬＡＧ３を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｄＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、１つのｓｄＲＮＡがＣＩＳＨを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｄＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、１つのｓｄＲＮＡがＣＢＬＢを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｄＲＮＡがＬＡＧ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡがＣＩＳＨを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｄＲＮＡがＬＡＧ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡがＣＢＬＢを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｄＲＮＡがＣＩＳＨを標的とし、１つのｓｄＲＮＡがＣＢＬＢを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｄＲＮＡがＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡがＰＤ－１を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｄＲＮＡがＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡがＬＡＧ３を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｄＲＮＡがＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡがＣＩＳＨを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｄＲＮＡがＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡがＣＢＬＢを標的とする。
上で考察されたように、本発明の実施形態は、それらの治療効果を増強するために遺伝子編集を介して遺伝子修飾されたものを提供する。本発明の実施形態は、１つ以上のタンパク質の発現の促進及び１つ以上のタンパク質の発現の阻害の両方、ならびにそれらの組み合わせのために、ＴＩＬ集団へのヌクレオチド挿入（ＲＮＡまたはＤＮＡ）による遺伝子編集を包含する。本発明の実施形態は、ＴＩＬを治療用集団に拡張するための方法も提供し、方法は、ＴＩＬを遺伝子編集することを含む。ＴＩＬ集団を遺伝子修飾するために使用され得るいくつかの遺伝子編集技術が存在し、それらは本発明による使用に好適である。
いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上のタンパク質の産生のための遺伝子の安定な組み込みのステップを含む、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法を含む。ある実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、レトロウイルス形質導入ステップを含む。ある実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、レンチウイルス形質導入ステップを含む。レンチウイルス形質導入系は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｌｅｖｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００６，１０３，１７３７２－７７、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７，１５，８７１－７５、Ｄｕｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９８，７２，８４６３－７１、及び米国特許第６，６２７，４４２号（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ある実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、ガンマレトロウイルス形質導入ステップを含む。ガンマレトロウイルス形質導入系は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｃｅｐｋｏ ａｎｄ Ｐｅａｒ，Ｃｕｒ．Ｐｒｏｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９６，９．９．１－９．９．１６に記載されており、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、トランスポゾン媒介遺伝子導入ステップを含む。トランスポゾン媒介遺伝子導入系は、当該技術分野で知られており、トランスポザーゼが、ＤＮＡ発現ベクターとしてまたは発現可能なＲＮＡもしくはタンパク質として提供される系を含み、これにより、トランスポザーゼ、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、キャップ及びポリＡ尾部を含むｍＲＮＡ）として提供されるトランスポザーゼの長期発現がトランスジェニック細胞で起こらないようになる。ＳＢ１０、ＳＢ１１、及びＳＢ１００ｘなどのサケ科型Ｔｅｌ様トランスポザーゼ（ＳＢまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ）を含む好適なトランスポゾン媒介遺伝子導入系、ならびに増加した酵素活性を有する操作された酵素は、例えば、Ｈａｃｋｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１０，１８，６７４－８３及び米国特許第６，４８９，４５８号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
ある実施形態では、この方法は、ＴＩＬ集団、例えば、本明細書に記載の第１の集団、第２の集団、及び／または第３の集団を遺伝子改変する方法を含む。ある実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子改変する方法は、１つ以上のタンパク質の産生または阻害（例えば、サイレンシング）のために遺伝子の安定した組み込みステップを含む。ある実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子改変する方法は、エレクトロポレーションステップを含む。エレクトロポレーション法は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｔｓｏｎｇ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９１，６０，２９７－３０６及び米国特許出願公開第２０１４／０２２７２３７Ａ１号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第５，０１９，０３４号、同第５，１２８，２５７号、同第５，１３７，８１７号、同第５，１７３，１５８号、同第５，２３２，８５６号、同第５，２７３，５２５号、同第５，３０４，１２０号、同第５，３１８，５１４号、同第６，０１０，６１３号、及び同第６，０７８，４９０号（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどの当該技術分野で知られている他のエレクトロポレーション法が使用され得る。ある実施形態では、エレクトロポレーション法は、滅菌エレクトロポレーション法である。ある実施形態では、エレクトロポレーション法は、パルスエレクトロポレーション法である。ある実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬの定義及び制御された永続的または一時的変更を変える、操作する、または引き起こすステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つの単一オペレーターが制御する、独立してプログラムされたＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのＤＣ電気パルス列は、以下の特徴のうちの１つ、２つ、または３つを有する：（１）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス振幅が互いに異なる、（２）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス幅が互いに異なる、及び（３）少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１のセットの第１のパルス間隔が、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２のセットの第２のパルス間隔とは異なる。ある実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬの定義及び制御された永続的または一時的変更を変える、操作する、または引き起こすステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つの単一オペレーターが制御する、独立してプログラムされたＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス振幅が互いに異なる。ある実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬの定義及び制御された永続的または一時的変更を変える、操作する、または引き起こすステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つの単一オペレーターが制御する、独立してプログラムされたＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス幅が互いに異なる。ある実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬの定義及び制御された永続的または一時的変更を変える、操作する、または引き起こすステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つの単一オペレーターが制御する、独立してプログラムされたＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つの第１のセットの第１のパルス間隔が、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２のセットの第２のパルス間隔とは異なる。ある実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬにおける細孔形成を誘導するステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つのＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのＤＣ電気パルス列は、以下の特徴のうちの１つ、２つ、または３つを有する：（１）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス振幅が互いに異なる、（２）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス幅が互いに異なる、及び（３）少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１のセットの第１のパルス間隔が、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２のセットの第２のパルス間隔とは異なり、これにより、誘導された細孔が比較的長期間にわたって持続され、ＴＩＬの生存率が維持される。ある実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子改変する方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションステップを含む。リン酸カルシウムトランスフェクション法（リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿、細胞表面コーティング、及びエンドサイトーシス）は、当該技術分野で知られており、Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７３，５２，４５６－４６７、Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９７９，７６，１３７３－１３７６、及びＣｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｒｅａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７，７，２７４５－２７５２、ならびに米国特許第５，５９３，８７５号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子改変する方法は、リポソームトランスフェクションステップを含む。リポソームトランスフェクション法、例えば、カチオン性脂質Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－ｎ，ｎ，ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びジオレオイルホスホチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤を用いる方法は、当該技術分野において既知であり、Ｒｏｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９１，１０，５２０－５２５及びＦｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４，７４１３－７４１７、ならびに米国特許第５，２７９，８３３号、同第５，９０８，６３５号、同第６，０５６，９３８号、同第６，１１０，４９０号、同第６，５３４，４８４号、及び同第７，６８７，０７０号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子改変する方法は、米国特許第５，７６６，９０２号、同第６，０２５，３３７号、同第６，４１０，５１７号、同第６，４７５，９９４号、及び同第７，１８９，７０５号に記載の方法を使用するトランスフェクションステップを含み、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＴＩＬは、本明細書に記載のＴＩＬの第１の集団、第２の集団、及び／または第３の集団であり得る。
ある実施形態によれば、遺伝子編集プロセスは、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子での二本鎖または一本鎖切断の生成を媒介するプログラム可能なヌクレアーゼの使用を含み得る。かかるプログラム可能なヌクレアーゼは、特定のゲノム遺伝子座に切断を導入することによって正確なゲノム編集を可能にし、すなわち、ゲノム内の特定のＤＮＡ配列の認識に依存して、ヌクレアーゼドメインをこの位置に標的し、標的配列での二本鎖切断の生成を媒介する。ＤＮＡの二本鎖切断は、その後、内因性修復機構を切断部位に動員して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同指向修復（ＨＤＲ）のいずれかによるゲノム編集を媒介する。したがって、切断の修復は、標的遺伝子産物を破壊する（例えば、サイレンス、抑制、または増強する）挿入／欠失変異の導入をもたらす可能性がある。
部位特異的ゲノム編集を可能にするために開発されたヌクレアーゼの主要なクラスには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が含まれる。これらのヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡ認識のモードに基づいて大きく２つのカテゴリーに分類され得、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮは、タンパク質－ＤＮＡ相互作用を介して特定のＤＮＡ結合を達成するが、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲシステムは、標的ＤＮＡと直接塩基対を形成する短いＲＮＡガイド分子によって、かつタンパク質－ＤＮＡ相互作用によって特定のＤＮＡ配列を標的とする。例えば、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２を参照されたい。
本発明のＴＩＬ拡張法に従って使用され得る遺伝子編集法の非限定的な例には、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法、及びＺＦＮ法が含まれ、これらは以下でより詳細に説明される。ある実施形態によれば、ＴＩＬを治療用集団に拡張するための方法は、本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態（例えば、ＧＥＮ３プロセス）に従って、またはＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５８６１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６０５、もしくはＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６３３に記載されるように実行することができ、方法は、増強された治療効果を提供することができるＴＩＬを生成するために、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法、またはＺＦＮ法のうちの１つ以上によって、ＴＩＬの少なくとも一部を遺伝子編集することをさらに含む。ある実施形態によれば、遺伝子編集されたＴＩＬは、インビトロでそれらを修飾されていないＴＩＬと比較することによって、例えば、修飾されていないＴＩＬと比較してインビトロでのエフェクター機能、サイトカインプロファイルなどを評価することによって、治療効果の改善について評価され得る。ある特定の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法、及び／またはＺＦＮ法を使用してＴＩＬ集団を遺伝子編集することを含む。
本発明のいくつかの実施形態では、エレクトロポレーションは、ＣＲＩＳＰＲシステム、ＴＡＬＥＮシステム、及びＺＦＮシステムなどの遺伝子編集システムの送達のために使用される。本発明のいくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、フローエレクトロポレーションシステムである。本発明のいくつかの実施形態との使用に好適な、好適なフローエレクトロポレーションシステムの例は、市販のＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸシステムである。本発明との使用に好適であり得る、ＢＴＸ－Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓから入手可能なＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅシステムもしくはＥＣＭ８３０、Ｃｅｌｌａｘｅｓｓ Ｅｌｅｋｔｒａ（Ｃｅｌｌｅｃｔｒｉｃｏｎ）、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ／Ａｍａｘａ）、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ ＭＸｃｅｌｌ（ＢＩＯＲＡＤ）、ｉＰｏｒａｔｏｒ－９６（Ｐｒｉｍａｘ）、またはｓｉＰＯＲＴｅｒ９６（Ａｍｂｉｏｎ）などのいくつかの代替の市販エレクトロポレーション機器が存在する。本発明のいくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、ＴＩＬ拡張法の残りとともに、滅菌閉鎖系を形成する。本発明のいくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、本明細書に記載のパルスエレクトロポレーションシステムであり、ＴＩＬ拡張法の残りとともに、滅菌閉鎖系を形成する。
ＴＩＬを治療的集団に拡張するための方法は、本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態（例えば、ＧＥＮ３プロセス）に従って、またはＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５８６１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６０５、もしくはＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６３３に記載されるように実行することができ、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１）によって、ＴＩＬの少なくとも一部を遺伝子編集することをさらに含む。特定の実施形態によれば、ＴＩＬ拡張プロセス中のＣＲＩＳＰＲ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、治療的ＴＩＬ集団の少なくとも一部分においてサイレンスまたは減少させる。あるいは、ＴＩＬ拡張プロセス中のＣＲＩＳＰＲ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、治療的ＴＩＬ集団の少なくとも一部分において増強させる。
ＣＲＩＳＰＲは、「Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリンドロミックリピート）」の略語である。遺伝子編集のためにＣＲＩＳＰＲシステムを使用する方法は、本明細書ではＣＲＩＳＰＲ法とも称される。ＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を組み込み、かつ本発明に従って使用され得るＣＲＩＳＰＲシステムには、３つの型：Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型がある。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ（Ｃａｓ９によって例示される）は、最もよく特徴付けられているシステムのうちの１つである。
ＣＲＩＳＰＲ技術は、細菌及び古細菌（単細胞微生物のドメイン）の自然防御機構から適合された。これらの生物は、ＣＲＩＳＰＲ由来のＲＮＡ及びＣａｓ９を含む様々なＣａｓタンパク質を使用して、外来侵入物のＤＮＡを切り刻んで破壊することによって、ウイルス及び他の異物による攻撃を阻止する。ＣＲＩＳＰＲは、ヌクレオチド反復配列及びスペーサーの存在という２つの異なる特徴を有するＤＮＡの特殊な領域である。ヌクレオチドの反復配列は、ＣＲＩＳＰＲ領域全体に分布しており、外来ＤＮＡ（スペーサー）の短いセグメントが反復配列の間に散在している。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサーは、ＣＲＩＳＰＲゲノム遺伝子座内に組み込まれ、転写され、短いＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に処理される。これらのｃｒＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にアニーリングし、Ｃａｓタンパク質による病原性ＤＮＡの配列特異的切断及びサイレンシングを指示する。Ｃａｓ９タンパク質による標的認識には、ｃｒＲＮＡ内の「シード」配列、及びｃｒＲＮＡ結合領域の上流にある保存されたジヌクレオチドを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が必要である。これにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが再標的されて、ｃｒＲＮＡを再設計することにより、実質的にいずれのＤＮＡ配列も切断することができる。天然システムにおけるｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、遺伝子操作で使用するために、およそ１００ヌクレオチドの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に簡略化され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを発現するプラスミドと必要なｃｒＲＮＡ成分を同時送達することにより、ヒト細胞に直接運搬可能である。Ｃａｓタンパク質の異なるバリアント（例えば、Ｃｐｆ１などのＣａｓ９のオルソログ）を使用して、標的の制限を低減することができる。
ＣＲＩＳＰＲ法によりＴＩＬを永久に遺伝子編集することによってサイレンスまたは阻害され得る遺伝子の非限定的な例には、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３）、Ｃｉｓｈ、ＴＧＦβ、ＰＫＡ、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、及びＧＵＣＹ１Ｂ３が含まれる。
ＣＲＩＳＰＲ法によりＴＩＬを永久に遺伝子編集することによって増強され得る遺伝子の非限定的な例には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１が含まれる。
ＣＲＩＳＰＲ法によって標的遺伝子配列の発現を変化させるための、本発明の実施形態に従って使用され得るシステム、方法、及び組成物の例は、米国特許第８，６９７，３５９号、同第８，９９３，２３３号、同第８，７９５，９６５号、同第８，７７１，９４５号、同第８，８８９，３５６号、同第８，８６５，４０６号、同第８，９９９，６４１号、同第８，９４５，８３９号、同第８，９３２，８１４号、同第８，８７１，４４５号、同第８，９０６，６１６号、及び同第８，８９５，３０８号に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１を発現するためのプラスミドなどのＣＲＩＳＰＲ法を行うための資源は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔなどの企業から市販されている。
ある実施形態では、本明細書に記載のＴＩＬ集団の遺伝子改変は、米国特許第ＵＳ９７９０４９０号に記載されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを使用して行うことができ、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
ＴＩＬを治療的集団に拡張するための方法は、本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態（例えば、Ｇｅｎ２）に従って、またはＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５８６１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６０５、もしくはＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６３３に記載されるように実行することができ、この方法は、ＴＡＬＥ法によってＴＩＬの少なくとも一部を遺伝子編集することをさらに含む。特定の実施形態によれば、ＴＩＬ拡張プロセス中のＴＡＬＥ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、治療的ＴＩＬ集団の少なくとも一部分においてサイレンスまたは減少させる。あるいは、ＴＩＬ拡張プロセス中のＴＡＬＥ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、治療的ＴＩＬ集団の少なくとも一部分において増強させる。
ＴＡＬＥは、ＴＡＬＥＮ（「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」）を含む、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ（転写活性化因子様エフェクター）」タンパク質の略語である。遺伝子編集のためにＴＡＬＥシステムを使用する方法は、本明細書ではＴＡＬＥ法とも称され得る。ＴＡＬＥは、植物病原菌Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属由来の天然に存在するタンパク質であり、各々単一の塩基対を認識する一連の３３～３５アミノ酸反復ドメインで構成されるＤＮＡ結合ドメインを含む。ＴＡＬＥ特異性は、反復可変二残基（ＲＶＤ）として知られる２つの超可変アミノ酸によって決定される。モジュラーＴＡＬＥ反復配列は、隣接するＤＮＡ配列を認識するために一緒に結合される。ＤＮＡ結合ドメイン内の特定のＲＶＤは、標的遺伝子座内の塩基を認識し、予測可能なＤＮＡ結合ドメインを組み立てるための構造的特徴を提供する。ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインは、ＩＩＳ型ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合して、標的可能なＴＡＬＥヌクレアーゼを作製する。部位特異的変異を誘導するために、１４～２０塩基対のスペーサー領域によって分離された２つの個々のＴＡＬＥＮアームがＦｏｋＩモノマーを密接に接近させて二量体化し、標的とされる二本鎖切断を産生する。
様々な組み立て方法を利用したいくつかの大規模な系統的研究により、ＴＡＬＥ反復配列を組み合わせて、実質的にすべてのユーザ定義配列を認識することができることが示されている。カスタム設計されたＴＡＬＥアレイも、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ，ＵＳＡ）、及びＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）から市販されている。本発明での使用に好適なＴＡＬＥ法及びＴＡＬＥＮ法は、米国特許公開第ＵＳ２０１１／０２０１１１８Ａ１、ＵＳ２０１３／０１１７８６９Ａ１、ＵＳ２０１３／０３１５８８４Ａ１、ＵＳ２０１５／０２０３８７１Ａ１、及びＵＳ２０１６／０１２０９０６Ａ１に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
ＴＡＬＥ法によりＴＩＬを永久に遺伝子編集することによってサイレンスまたは阻害され得る遺伝子の非限定的な例には、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３）、Ｃｉｓｈ、ＴＧＦβ、ＰＫＡ、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、及びＧＵＣＹ１Ｂ３が含まれる。
ＴＡＬＥ法によりＴＩＬを永久に遺伝子編集することによって増強され得る遺伝子の非限定的な例には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１が含まれる。
ＴＡＬＥ法によって標的遺伝子配列の発現を変化させるための、本発明の実施形態に従って使用され得るシステム、方法、及び組成物の例は、米国特許第８，５８６，５２６号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
ＴＩＬを治療的集団に拡張するための方法は、本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態（例えば、ＧＥＮ３プロセス）に従って、またはＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５８６１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６０５、もしくはＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６３３に記載されるように実行することができ、この方法は、ジンクフィンガーまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ法によって、ＴＩＬの少なくとも一部を遺伝子編集することをさらに含む。特定の実施形態によれば、ＴＩＬ拡張プロセス中のジンクフィンガー法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、治療的ＴＩＬ集団の少なくとも一部においてサイレンスまたは減少させる。あるいは、ＴＩＬ拡張プロセス中のジンクフィンガー法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、治療的ＴＩＬ集団の少なくとも一部において増強させる。
個々のジンクフィンガーは、保存されたββα立体配置でおよそ３０個のアミノ酸を含む。αらせんの表面上のいくつかのアミノ酸は、典型的には、異なる選択性レベルでＤＮＡの主溝の３ｂｐと接触する。ジンクフィンガーは、２つのタンパク質ドメインを有する。第１のドメインは、ＤＮＡ結合ドメインであり、真核生物転写因子を含み、ジンクフィンガーを含む。第２のドメインは、ヌクレアーゼドメインであり、ＦｏｋＩ制限酵素を含み、ＤＮＡの触媒的切断を担っている。
個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、３～６個の個々のジンクフィンガー反復配列を含み、各々９～１８塩基対を認識することができる。ジンクフィンガードメインが目的の標的部位に特異的である場合、合計１８塩基対を認識する３フィンガーＺＦＮの対でさえ、理論的には、哺乳動物ゲノムの単一遺伝子座を標的とすることができる。新たなジンクフィンガーアレイを生成するための１つの方法は、既知の特異性を有するより小さいジンクフィンガー「モジュール」を組み合わせることである。最も一般的なモジュラーアセンブリプロセスは、各々３塩基対のＤＮＡ配列を認識することができる３つの別個のジンクフィンガーを組み合わせて、９塩基対の標的部位を認識することができる３フィンガーアレイを生成することを含む。あるいは、オリゴマー化プールエンジニアリング（ＯＰＥＮ）などの選択ベースのアプローチを使用して、隣接するフィンガー間のコンテキスト依存的相互作用を考慮したランダム化ライブラリーから新たなジンクフィンガーアレイを選択することができる。設計されたジンクフィンガーは市販されており、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と協同して、ジンクフィンガー構築のための独自のプラットフォーム（ＣｏｍｐｏＺｒ（登録商標））を開発した。
ジンクフィンガー法によりＴＩＬを永久に遺伝子編集することによってサイレンスまたは阻害され得る遺伝子の非限定的な例には、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３）、Ｃｉｓｈ、ＴＧＦβ、ＰＫＡ、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、及びＧＵＣＹ１Ｂ３が挙げられる。
ジンクフィンガー法によりＴＩＬを永久に遺伝子編集することによって増強され得る遺伝子の非限定的な例には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１が含まれる。
ジンクフィンガー法によって標的遺伝子配列の発現を変化させるための、本発明の実施形態に従って使用され得るシステム、方法、及び組成物の例は、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，７４６，８３８号、同第６，７９４，１３６号、同第６，８２４，９７８号、同第６，８６６，９９７号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、同第７，０３０，２１５号、同第７，２２０，７１９号、同第７，２４１，５７３号、同第７，２４１，５７４号、同第７，５８５，８４９号、同第７，５９５，３７６号、同第６，９０３，１８５号、及び同第６，４７９，６２６号に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
ジンクフィンガー法によって標的遺伝子配列の発現を変化させるための、本発明の実施形態に従って使用され得るシステム、方法、及び組成物の他の例は、Ｂｅａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５，２３ １３８０－１３９０に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＨＥＲ２、もしくはＮＹ－ＥＳＯ－１などの腫瘍関連抗原で標的とされるＴＣＲ、または腫瘍関連細胞表面分子（例えば、メソセリン）もしくは系統制限細胞表面分子（例えば、ＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むが、これらに限定されない追加の機能を含むように任意選択で遺伝子操作される。いくつかの実施形態では、国際特許公開第ＷＯ２０１９／１６０８２９Ａ１号（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている遺伝子操作方法を用いて、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４をコードする遺伝子などの特定の標的遺伝子のノックアウトを含むＴＩＬを遺伝子編集することができる。ある特定の実施形態では、この方法は、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＨＥＲ２、もしくはＮＹ－ＥＳＯ－１などの腫瘍関連抗原で標的とされるＴＣＲ、または腫瘍関連細胞表面分子（例えば、メソセリン）もしくは系統制限細胞表面分子（例えば、ＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むようにＴＩＬ集団を遺伝子操作することを含む。適切には、ＴＩＬ集団は、本明細書に記載の第１の集団、第２の集団及び／または第３の集団であり得る。
Ｅ．ＴＩＬ製造のための閉鎖系
本発明は、ＴＩＬ培養プロセス中に閉鎖系の使用を提供する。かかる閉鎖系は、微生物汚染の防止及び／または低減を可能にし、より少数のフラスコの使用を可能にし、コスト削減を可能にする。いくつかの実施形態では、閉鎖系は、２つの容器を使用する。
かかる閉鎖系は当該技術分野でよく知られており、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｂｅｒ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．ｈｔｍ及びｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ＢｉｏｌｏｇｉｃｓＢｌｏｏｄＶａｃｃｉｎｅｓ／ＧｕｉｄａｎｃｅＣｏｍｐｌｉａｎｃｅＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／Ｇｕｉｄａｎｃｅｓ／Ｂｌｏｏｄ／ｕｃｍ０７６７７９．ｈｔｍで見つけることができる。
滅菌接続装置（ＳＴＣＤ）は、互換性のある２本の管間の滅菌溶接をもたらす。この手順により、様々な容器と管径との滅菌接続が可能になる。いくつかの実施形態では、閉鎖系には、例えば、実施例１４に記載のルアーロック系及びヒートシール系が含まれる。いくつかの実施形態では、閉鎖系は、閉鎖系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。いくつかの実施形態では、実施例１４に記載の閉鎖系が用いられる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、実施例１４の「最終製剤及び充填」の節に記載の方法に従って、最終製品製剤容器に製剤化される。
いくつかの実施形態では、閉鎖系は、腫瘍断片が得られてから、ＴＩＬを患者に投与するかまたは凍結保存する準備が整うまで、１つの容器を使用する。いくつかの実施形態では、２つの容器が使用される場合、第１の容器は密閉Ｇ容器であり、ＴＩＬ集団が遠心分離され、第１の密閉Ｇ容器を開かずに注入バッグに移される。いくつかの実施形態では、２つの容器が使用される場合、注入バッグは、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌを含有する注入バッグである。閉鎖系または閉鎖ＴＩＬ細胞培養系は、腫瘍試料及び／または腫瘍断片が追加されると、系が外部からしっかりと密閉され、細菌、真菌、及び／またはいずれの他の微生物汚染も侵入しない閉鎖環境を形成することを特徴とする。
いくつかの実施形態では、微生物汚染の低減は、約５％～約１００％である。いくつかの実施形態では、微生物汚染の低減は、約５％～約９５％である。いくつかの実施形態では、微生物汚染の低減は、約５％～約９０％である。いくつかの実施形態では、微生物汚染の低減は、約１０％～約９０％である。いくつかの実施形態では、微生物汚染の低減は、約１５％～約８５％である。いくつかの実施形態では、微生物汚染の低減は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％である。
閉鎖系は、微生物汚染の不在下で及び／または微生物汚染が大幅に低減された状態で、ＴＩＬの成長を可能にする。
さらに、ＴＩＬ細胞培養環境のｐＨ、二酸化炭素分圧、及び酸素分圧は各々、細胞が培養されるにつれて変化する。したがって、細胞培養に適切な培地を循環させても、ＴＩＬ増殖に最適な環境として閉鎖環境を常に一定に維持する必要がある。この目的のために、閉鎖環境の培養液中のｐＨ、二酸化炭素分圧、及び酸素分圧の物理的要因がセンサーによって監視されること、そのシグナルが培養環境の入口に設置されたガス交換器を制御するために使用されること、及び閉鎖環境のガス分圧が細胞培養環境を最適化するように培養液の変化に応じてリアルタイムで調整されることが望ましい。いくつかの実施形態では、本発明は、閉鎖環境のｐＨ、二酸化炭素分圧、及び酸素分圧を測定する監視装置を備えたガス交換器を閉鎖環境の入口に組み込み、かつ監視装置からのシグナルに基づいてガス濃度を自動的に調整することによって細胞培養環境を最適化する閉鎖細胞培養系を提供する。
いくつかの実施形態では、閉鎖環境内の圧力は、連続的または断続的に制御される。すなわち、閉鎖環境内の圧力を、例えば、圧力維持装置によって変化させることができ、それ故に、空間が正圧状態でＴＩＬの成長に好適であることを確実にするか、または負圧状態で流体の浸出を促進し、ひいては細胞増殖を促進する。さらに、負圧を断続的に加えることにより、閉鎖環境内の体積の一時的な収縮によって、閉鎖環境内の循環液体を均一かつ効率的に置き換えることが可能である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの増殖に最適な培養成分を置換または追加することができ、ＩＬ－２及び／またはＯＫＴ３などの因子、ならびに組み合わせを追加することができる。
Ｆ．ＴＩＬの任意選択の凍結保存
バルクＴＩＬ集団（例えば、第２のＴＩＬ集団）または拡張されたＴＩＬ集団（例えば、第３のＴＩＬ集団）のいずれかが任意選択で凍結保存され得る。いくつかの実施形態では、凍結保存は、治療的ＴＩＬ集団に起こる。いくつかの実施形態では、凍結保存は、第２の拡張後に採取されたＴＩＬに起こる。いくつかの実施形態では、凍結保存は、図１及び／または８の例示的なステップＦ（特に、例えば、図８Ｂ及び／または図８Ｃ）においてＴＩＬ上で起こる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、注入バッグ内で凍結保存される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、注入バッグに入れる前に凍結保存される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、凍結保存され、注入バッグに入っていない。いくつかの実施形態では、凍結保存は、凍結保存培地を使用して行われる。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する。これは、一般に、ＴＩＬ集団を凍結溶液、例えば、８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に入れることによって達成される。溶液中の細胞が極低温バイアルに入れられ、－８０℃で２４時間保存され、任意選択で凍結保存のためにガス状窒素冷凍庫に移される。Ｓａｄｅｇｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａ ２０１３，５２，９７８－９８６を参照されたい。
適切な場合、細胞が冷凍庫から取り出され、溶液のおよそ５分の４が解凍されるまで３７℃の水浴中で解凍される。細胞は、一般に、完全培地中に再懸濁され、任意で１回以上洗浄される。いくつかの実施形態では、解凍されたＴＩＬは、当該技術分野で知られているように計数され、生存率について評価され得る。
好ましい実施形態では、ＴＩＬ集団は、ＣＳ１０凍結保存培地（ＣｒｙｏＳｔｏｒ １０、ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を使用して凍結保存される。好ましい実施形態では、ＴＩＬ集団は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する凍結保存培地を使用して凍結保存される。好ましい実施形態では、ＴＩＬ集団は、１：１（体積：体積）比のＣＳ１０及び細胞培養培地を使用して凍結保存される。好ましい実施形態では、ＴＩＬ集団は、約１：１（体積：体積）比のＣＳ１０及び細胞培養培地を使用して凍結保存され、追加のＩＬ－２をさらに含む。
上で考察されたように、また図１及び／または８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に示されるステップＡ～Ｅで例示されるように、凍結保存は、ＴＩＬ拡張プロセス全体の様々な時点で起こり得る。いくつかの実施形態では、第１の拡張後のＴＩＬの拡張集団（例えば、ステップＢに従って提供される、または図１もしくは８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）のステップＤによる１回以上の第２の拡張後のＴＩＬの拡張集団を凍結保存することができる。凍結保存は、一般に、ＴＩＬ集団を凍結溶液、例えば、８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に入れることによって達成され得る。溶液中の細胞が極低温バイアルに入れられ、－８０℃で２４時間保存され、任意選択で凍結保存のためにガス状窒素冷凍庫に移される。Ｓａｄｅｇｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａ ２０１３，５２，９７８－９８６を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、５％ ＤＭＳＯ中で凍結保存される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、５％ ＤＭＳＯを加えた細胞培養培地中で凍結保存される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、実施例６に提供される方法に従って凍結保存される。
適切な場合、細胞が冷凍庫から取り出され、溶液のおよそ５分の４が解凍されるまで３７℃の水浴中で解凍される。細胞は、一般に、完全培地中に再懸濁され、任意で１回以上洗浄される。いくつかの実施形態では、解凍されたＴＩＬは、当該技術分野で知られているように計数され、生存率について評価され得る。
いくつかの事例では、以下で考察されるプロトコルを使用して、ステップＢのＴＩＬ集団が直ちに凍結保存され得る。あるいは、バルクＴＩＬ集団がステップＣ及びステップＤに供され、ステップＤの後に凍結保存され得る。同様に、遺伝子修飾されたＴＩＬが治療に使用される場合、ステップＢまたはステップＤのＴＩＬ集団が好適な治療のために遺伝子修飾に供され得る。
Ｇ．拡張ＴＩＬのアッセイ及び表現型特徴
いくつかの実施形態では、上記のプロセス由来のＴＩＬの効力及び／または機能性は、本明細書に記載のアッセイ方法のうちの１つを使用して調べられる。
ある実施形態では、本発明は、遺伝子操作されたＴＩＬ製品及びＣＤ１３４（ＯＸ４０）及び／またはＣＤ１３７（４－１ＢＢ）アゴニストを使用して産生されたＴＩＬ製品を含む、上記のＴＩＬ製品の効力を決定する方法を含み、この方法は、
ａ．ＴＩＬ製品との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
ｂ．共培養から採取物を取得するステップと、
ｃ．採取物を、（１）ＴＩＬ細胞製品細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）ＴＩＬ細胞製品細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、ＴＩＬ細胞製品の効力を決定するステップと、を含む。
あるいは、いくつかの実施形態では、上記のプロセスからのＴＩＬを、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、パーフォリン、及びＴＮＦ－αからなる群から選択される少なくとも２つの分析物の、ＥＬＩＳＡまたは自動ＥＬＩＳＡ（例えば、ＥＬＬＡ）検出によるＣＤ３またはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズベースの刺激を含む複合アッセイを使用して分析する。ある実施形態では、かかる複合アッセイの製品放出仕様は、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも６００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも７００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも８００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも９００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも１１００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも２つの選択された分析物について少なくとも１２００ｐｇ／ｍＬであり、被験試料の各ｍＬは、１×１０５ＴＩＬ、２×１０５ＴＩＬ、３×１０５ＴＩＬ、４×１０５ＴＩＬ、５×１０５ＴＩＬ、６×１０５ＴＩＬ、７×１０５ＴＩＬ、８×１０５ＴＩＬ、９×１０５ＴＩＬ、または１０×１０５ＴＩＬを含有する。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、本明細書及び実施例に記載されているものを含む、拡張後の多数の表現型マーカーの発現について分析される。ある実施形態では、１つ以上の表現型マーカーの発現が調べられる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＢにおける第１の拡張後に分析される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＣにおける移行中に分析される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＣによる移行中及び凍結保存後に分析される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＤによる第２の拡張後に分析される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＤによる２回以上の拡張後に分析される。
いくつかの実施形態では、マーカーは、ＣＤ８及びＣＤ２８からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ８の発現が調べられる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８の発現が調べられる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８及び／またはＣＤ２８の発現は、他のプロセス（例えば、例えば図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に提供されるＧｅｎ３プロセス）と比較して、例えば図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に提供される２Ａプロセスと比較して、本発明のプロセスに従って産生されたＴＩＬ上でより高い。いくつかの実施形態では、ＣＤ８の発現は、他のプロセス（例えば、例えば図８（特に、例えば図８Ｂ）に提供されるＧｅｎ３プロセス）と比較して、例えば図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に提供される２Ａプロセスと比較して、本発明のプロセスに従って産生されたＴＩＬ上でより高い。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８の発現は、他のプロセス（例えば、例えば図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に提供されるＧｅｎ３プロセス）と比較して、例えば図８（特に、例えば図８Ａ）に提供される２Ａプロセスと比較して、本発明のプロセスに従って産生されたＴＩＬ上でより高い。いくつかの実施形態では、高いＣＤ２８発現は、より若く、より持続的なＴＩＬ表現型を示す。ある実施形態では、１つ以上の調節マーカーの発現が測定される。
ある実施形態では、ＣＤ８及び／またはＣＤ２８に基づく第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩＬ集団、または採取されたＴＩＬ集団の選択は、本明細書に記載の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡張するための方法のいずれのステップ中にも行われない。
いくつかの実施形態では、セントラルメモリー細胞のパーセンテージは、他のプロセス（例えば、例えば図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に提供されるＧｅｎ３プロセス）と比較して、例えば図８（特に、例えば図８Ａ）に提供される２Ａプロセスと比較して、本発明のプロセスに従って産生されたＴＩＬ上でより高い。いくつかの実施形態では、セントラルメモリー細胞のメモリーマーカーは、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋ＴＩＬメモリーサブセットは、異なるメモリーサブセットに分類され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋ＴＩＬは、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）ＴＩＬを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋ＴＩＬは、セントラルメモリー（ＣＭ、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋）ＴＩＬを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋ＴＩＬは、エフェクターメモリー（ＥＭ、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ－）ＴＩＬを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋ＴＩＬは、ＲＡ＋エフェクターメモリー／エフェクター（ＴＥＭＲＡ／ＴＥＦＦ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）ＴＩＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、グランザイムＢ、パーフォリン、及びグラニュライシンからなる群から選択されるもう１つのマーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、グランザイムＢを発現する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、パーフォリンを発現する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、グラニュライシンを発現する。
ある実施形態では、再刺激されたＴＩＬは、サイトカイン放出アッセイを使用して、サイトカイン放出についても評価され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）分泌について評価され得る。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、例えば、図８（特に、例えば、図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に提供されるように、ステップＤの後の急速な第２の拡張ステップの後のＥＬＩＳＡアッセイによって測定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの健康は、ＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）分泌によって測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、活性なＴＩＬを示す。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ－γ産生は、細胞傷害能の別の尺度である。ＩＦＮ－γ産生は、ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ１３７／４－１ＢＢに対する抗体で刺激されたＴＩＬの培地中のサイトカインＩＦＮ－γのレベルを決定することによって測定され得る。これらの刺激されたＴＩＬからの培地中のＩＦＮ－γレベルは、ＩＦＮ－γ放出を測定することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、例えば図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）ＴＩＬに提供されるようなＧｅｎ３プロセスのステップＤにおけるＩＦＮ－γ産生の増加は、例えば、図８（特に、例えば図８Ａ）に提供される２ＡプロセスのステップＤと比較して、ステップＤ ＴＩＬの細胞傷害能の増加を示している。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、１倍、２倍、３倍、４倍、または５倍以上増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、１倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、２倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、３倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、４倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、５倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットを使用して測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、エクスビボでのＴＩＬ中で測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、例えば図８Ｂの方法を含む、本発明の方法によって産生されたＴＩＬを含む、ＴＩＬにおいてエクスビボで測定される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、または５倍以上のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも１倍多くのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２倍多くのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３倍多くのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４倍多くのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも５倍多くのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ～約１０００ｐｇ／ｍＬ以上のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９５０ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ以上のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも６００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも７００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも８００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも９００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも６０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも７０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも８０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも９０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも１５，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２５，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３５，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４５，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞～約１０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞以上のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄに示される方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞、少なくとも２５０ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞、少なくとも３００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞、少なくとも３５０ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞、少なくとも４００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞、少なくとも４５０ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞、少なくとも５５０ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞、少なくとも６００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞、少なくとも６５０ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞、少なくとも７００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞、少なくとも７５０ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞、少なくとも８００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞、少なくとも８５０ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞、少なくとも９００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞、少なくとも９５０ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞、または少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞以上のＩＦＮ－γ分泌は、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも６００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも７００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも８００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも９００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄに示される方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも６０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも７０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも８０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも９０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも１５，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２０，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２５，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３０，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３５，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４０，０００ｐｇ／ｍＬ／×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４５，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。
Ｔリンパ球及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られた数であるが、多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメント：Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（接合）、及びＣ（一定）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリー多様性を示し、かつ増加させるＴＩＬを生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法によって取得されたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、本方法によって取得されたＴＩＬは、新たに採取されたＴＩＬ及び／または例えば、図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、本方法によって取得されたＴＩＬは、新たに採取されたＴＩＬ及び／または図８（特に、例えば図８Ａ）に例示されるようにＧｅｎ２と称される方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、第１の拡張で取得されたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、多様性の増加は、免疫グロブリン多様性及び／またはＴ細胞受容体多様性の増加である。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリンにあり、免疫グロブリン重鎖にある。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリンにあり、免疫グロブリン軽鎖にある。いくつかの実施形態では、多様性は、Ｔ細胞受容体にある。いくつかの実施形態では、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体のうちの１つにある。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／またはベータの発現が増加する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲαβ（すなわち、ＴＣＲα／β）の発現が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプロセス（例えば、Ｇｅｎ３プロセス）は、他のプロセス、例えば、試料内の固有のペプチドＣＤＲの数に基づくＧｅｎ２と称されるプロセスと比較して、より高いクローン多様性を示す（例えば、図１２～１４を参照）。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの活性化及び疲弊は、１つ以上のマーカーを調べることによって決定され得る。いくつかの実施形態では、活性化及び疲弊は、多色フローサイトメトリーを使用して決定され得る。いくつかの実施形態では、活性化及び疲弊のマーカーには、ＣＤ３、ＰＤ－１、２Ｂ４／ＣＤ２４４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＢＴＬＡ、ＫＬＲＧ、ＴＩＭ３、ＣＤ１９４／ＣＣＲ４、ＣＤ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１８３、ＣＤ６９、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、ＣＤ１０３、及び／またはＬＡＧ３）からなる群から選択される１つ以上のマーカーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、活性化及び疲弊のマーカーには、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、及び／またはＴＩＭ３からなる群から選択される１つ以上のマーカーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、活性化及び疲弊のマーカーには、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ３、ＣＤ１０３＋／ＣＤ６９＋、ＣＤ１０３＋／ＣＤ６９－、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ及び／またはＴＩＭ３からなる群から選択される１つ以上のマーカーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞マーカー（活性化及び疲弊マーカーを含む）は、Ｔ細胞の活性化、阻害、または機能を調べるために決定及び／または分析され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞マーカーには、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ３、ＦｏｘＰ３、ＴＩＭ３、ＰＤ－１、ＣＤ１０３、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４５、ＣＤ４、及び／またはＣＤ５９からなる群から選択される１つ以上のマーカーが含まれ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、３０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ～３０００００ｐｇ／１０６以上のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、５０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、７０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、９０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１１０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１３０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１５０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１７０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１９０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、２００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、４００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、６００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、８００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１０００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１２００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１４００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１６００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１８００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、２０００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、２２００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、２４００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、２６００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、２８００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、３０００００ｐｇ／１０６以上のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、５０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、７０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、９０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１１０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１３０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１５０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１７０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１９０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、４００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、６００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、８００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１０００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１２００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１４００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１６００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１８００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２０００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２２００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２４００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２６００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２８００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３０００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ～３０００００ｐｇ／１０６以上のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、５０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、７０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、９０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１１０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１３０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１５０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１７０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１９０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、２００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、４００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、６００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、８００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１０００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１２００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１４００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１６００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、１８００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、２０００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、２２００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、２４００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、２６００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、２８００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬ、３０００００ｐｇ／１０６以上のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、５０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、７０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、９０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１１０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１３０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１５０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１７０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または








図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１９０００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、４００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、６００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、８００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１０００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１２００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１４００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１６００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１８００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２０００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２２００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２４００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２６００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２８００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３０００００ｐｇ／１０６超のＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。
いくつかの実施形態では、１０００ｐｇ／ｍＬ超～３０００００ｐｇ／ｍＬ以上のグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１０００ｐｇ／ｍＬ超、２０００ｐｇ／ｍＬ超、３０００ｐｇ／ｍＬ超、４０００ｐｇ／ｍＬ超、５０００ｐｇ／ｍＬ超、６０００ｐｇ／ｍＬ超、７０００ｐｇ／ｍＬ超、８０００ｐｇ／ｍＬ超、９０００ｐｇ／ｍＬ超、１００００ｐｇ／ｍＬ超、２００００ｐｇ／ｍＬ超、３００００ｐｇ／ｍＬ超、４００００ｐｇ／ｍＬ超、５００００ｐｇ／ｍＬ超、６００００ｐｇ／ｍＬ超、７００００ｐｇ／ｍＬ超、８００００ｐｇ／ｍＬ超、９００００ｐｇ／ｍＬ超、１０００００ｐｇ／ｍＬ超またはそれ以上のグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１０００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２０００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３０００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、４０００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、５０００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、６０００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、７０００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、８０００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、９０００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、４００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、５００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、６００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、７００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、８００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、９００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１０００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１２００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１４００００ｐｇ／ｍＬ超のＴＩＬグランザイムＢを示すＴＩＬは、ＴＩＬグランザイムＢは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１６００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１８００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２０００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２２００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２４００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２６００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２８００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３０００００ｐｇ／ｍＬ超のグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。
いくつかの実施形態では、本発明の拡張方法は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄに提供されるようなＴＩＬを含む、インビトロで増加したグランザイムＢ分泌を示す拡張されたＴＩＬ集団を産生する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも１倍～５０倍以上増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍以上増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも１倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも２倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも３倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも４倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも５倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも６倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも７倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも８倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも９倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも１０倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも２０倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも３０倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも４０倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも５０倍増加する。
いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、または５倍以上低いレベルのＴＮＦ－α（すなわち、ＴＮＦ－アルファ）分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌と比較して、少なくとも１倍低いレベルのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌と比較して、少なくとも２倍低いレベルのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌と比較して、少なくとも３倍低いレベルのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌と比較して、少なくとも４倍低いレベルのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌と比較して、少なくとも５倍低いレベルのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。
いくつかの実施形態では、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞以上のＴＮＦ－α（すなわち、ＴＮＦ－アルファ）分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞以上のＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞以上のＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞以上のＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞以上のＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞以上のＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞以上のＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも６０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞以上のＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも７０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞以上のＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも８０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞以上のＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも９０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５×１０５細胞以上のＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬである。
いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ及びグランザイムＢのレベルを測定して、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬの表現型特徴を決定する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αのレベルを測定して、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬの表現型特徴を決定する。いくつかの実施形態では、グランザイムＢ及びＴＮＦ－αのレベルを測定して、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬの表現型特徴を決定する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ及びＴＮＦ－αのレベルを測定して、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されたＴＩＬの表現型特徴を決定する。
いくつかの実施形態では、表現型特徴付けは、凍結保存後に行われる。
Ｈ．追加のプロセスの実施形態
いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、（ａ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによってプライミングによる第１の拡張を行うことであって、プライミングによる第１の拡張を約１～７日間または約１～８日間行って第２のＴＩＬ集団を取得し、第２のＴＩＬ集団が、第１のＴＩＬ集団よりも数が多い、プライミングによる第１の拡張を行うことと、（ｃ）第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び外因性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地と接触させて急速な第２の拡張を行って第３のＴＩＬ集団を産生することであって、急速な第２の拡張を約１～１１日間または約１～１０日間行って第３のＴＩＬ集団を取得し、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団である、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）ステップ（ｃ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間、または約２～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）小規模培養由来の第２のＴＩＬ集団を、第１の容器よりも大きい第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移すこととによって、培養のスケールアップを達成し、第２の容器内で、小規模培養由来の第２のＴＩＬ集団が、より大規模な培養で約４～７日間、または約４～８日間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での第１の小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）第１の小規模培養由来の第２のＴＩＬ集団を、第１の容器とサイズが等しい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウトを達成し、各第２の容器内で、第１の小規模培養由来のかかる第２の容器に移された第２のＴＩＬ集団の一部が、第２の小規模培養で約４～７日間、または約４～８日間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間、または約２～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）第１の小規模培養由来の第２のＴＩＬ集団を、第１の容器よりもサイズが大きい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養由来のかかる第２の容器に移された第２のＴＩＬ集団の一部が、より大規模な培養で約４～７日間、または約４～８日間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）第１の小規模培養由来の第２のＴＩＬ集団を、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養由来のかかる第２の容器に移された第２のＴＩＬ集団の一部が、より大規模な培養で約５～７日間培養される。
いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、（ａ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによってプライミングによる第１の拡張を行うことであって、プライミングによる第１の拡張が約１～８日間行われて第２のＴＩＬ集団が取得され、第２のＴＩＬ集団は第１のＴＩＬ集団よりも数が多い、プライミングによる第１の拡張を行うことと、（ｃ）第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び外因性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地と接触させることによって急速な第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、急速な第２の拡張が約１～８日間行われて第３のＴＩＬ集団が取得され、第３のＴＩＬ集団が治療的ＴＩＬ集団である、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）ステップ（ｃ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約２～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）小規模培養由来の第２のＴＩＬ集団を、第１の容器よりも大きい第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移すこととによって、培養のスケールアップを達成し、第２の容器内で、小規模培養由来の第２のＴＩＬ集団が、より大規模な培養で約４～８日間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での第１の小規模培養で約２～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）第１の小規模培養由来の第２のＴＩＬ集団を、第１の容器とサイズが等しい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウトを達成し、各第２の容器内で、第１の小規模培養由来のかかる第２の容器に移された第２のＴＩＬ集団の一部が、第２の小規模培養で約４～６日間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約２～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）第１の小規模培養由来の第２のＴＩＬ集団を、第１の容器よりもサイズが大きい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養由来のかかる第２の容器に移された第２のＴＩＬ集団の一部が、より大規模な培養で約４～６日間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）第１の小規模培養由来の第２のＴＩＬ集団を、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養由来のかかる第２の容器に移された第２のＴＩＬ集団の一部が、より大規模な培養で約４～５日間培養される。
いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、（ａ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによってプライミングによる第１の拡張を行うことであって、プライミングによる第１の拡張が約１～７日間行われて第２のＴＩＬ集団が取得され、第２のＴＩＬ集団は第１のＴＩＬ集団よりも数が多い、プライミングによる第１の拡張を行うことと、（ｃ）第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び外因性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地と接触させることによって急速な第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、急速な第２の拡張が約１～１１日間行われて第３のＴＩＬ集団が取得され、第３のＴＩＬ集団が治療的ＴＩＬ集団である、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）ステップ（ｃ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）小規模培養由来の第２のＴＩＬ集団を、第１の容器よりも大きい第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移すこととによって、培養のスケールアップを達成し、第２の容器内で、小規模培養由来の第２のＴＩＬ集団が、より大規模な培養で約４～７日間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での第１の小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）第１の小規模培養由来の第２のＴＩＬ集団を、第１の容器とサイズが等しい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウトを達成し、各第２の容器内で、第１の小規模培養由来のかかる第２の容器に移された第２のＴＩＬ集団の一部が、第２の小規模培養で約４～７日間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）第１の小規模培養由来の第２のＴＩＬ集団を、第１の容器よりもサイズが大きい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養由来のかかる第２の容器に移された第２のＴＩＬ集団の一部が、より大規模な培養で約４～７日間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）第１の小規模培養由来の第２のＴＩＬ集団を、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養由来のかかる第２の容器に移された第２のＴＩＬ集団の一部が、より大規模な培養で約５日間培養される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の初期拡張が、第１のＴＩＬ集団を、外因性抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含む培養培地と接触させることによって行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法であって、ステップ（ｃ）における培養培地中のＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）における培養培地中のＡＰＣの数よりも多い、方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において培養培地に追加の外因性ＡＰＣが補充されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２０：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約１０：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約９：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約８：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約７：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約６：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約５：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約４：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約３：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．９：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．８：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．７：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．６：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．５：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．４：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．３：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．２：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．１：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約１０：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約５：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約４：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約３：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．９：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．８：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．７：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．６：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．５：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．４：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．３：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．２：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．１：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約２：１になるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数とステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数との比率が、正確にまたは約１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、３：１、３．１：１、３．２：１、３．３：１、３．４：１、３．５：１、３．６：１、３．７：１、３．８：１、３．９：１、４：１、４．１：１、４．２：１、４．３：１、４．４：１、４．５：１、４．６：１、４．７：１、４．８：１、４．９：１、または５：１になるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１の初期拡張において添加されるＡＰＣの数が、正確にまたは約１×１０８、１．１×１０８、１．２×１０８、１．３×１０８、１．４×１０８、１．５×１０８、１．６×１０８、１．７×１０８、１．８×１０８、１．９×１０８、２×１０８、２．１×１０８、２．２×１０８、２．３×１０８、２．４×１０８、２．５×１０８、２．６×１０８、２．７×１０８、２．８×１０８、２．９×１０８、３×１０８、３．１×１０８、３．２×１０８、３．３×１０８、３．４×１０８、または３．５×１０８ＡＰＣになるように、かつ急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、正確にまたは約３．５×１０８、３．６×１０８、３．７×１０８、３．８×１０８、３．９×１０８、４×１０８、４．１×１０８、４．２×１０８、４．３×１０８、４．４×１０８、４．５×１０８、４．６×１０８、４．７×１０８、４．８×１０８、４．９×１０８、５×１０８、５．１×１０８、５．２×１０８、５．３×１０８、５．４×１０８、５．５×１０８、５．６×１０８、５．７×１０８、５．８×１０８、５．９×１０８、６×１０８、６．１×１０８、６．２×１０８、６．３×１０８、６．４×１０８、６．５×１０８、６．６×１０８、６．７×１０８、６．８×１０８、６．９×１０８、７×１０８、７．１×１０８、７．２×１０８、７．３×１０８、７．４×１０８、７．５×１０８、７．６×１０８、７．７×１０８、７．８×１０８、７．９×１０８、８×１０８、８．１×１０８、８．２×１０８、８．３×１０８、８．４×１０８、８．５×１０８、８．６×１０８、８．７×１０８、８．８×１０８、８．９×１０８、９×１０８、９．１×１０８、９．２×１０８、９．３×１０８、９．４×１０８、９．５×１０８、９．６×１０８、９．７×１０８、９．８×１０８、９．９×１０８、または１×１０９ＡＰＣになるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、一次の第１の拡張において添加されたＡＰＣの数が、正確にまたは約１×１０８ＡＰＣ～正確にまたは約３．５×１０８ＡＰＣの範囲から選択され、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数が、正確にまたは約３．５×１０８ＡＰＣ～正確にまたは約１×１０９ＡＰＣの範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、一次の第１の拡張において添加されたＡＰＣの数が、正確にまたは約１．５×１０８ＡＰＣ～正確にまたは約３×１０８ＡＰＣの範囲から選択され、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数が、正確にまたは約４×１０８ＡＰＣ～正確にまたは約７．５×１０８ＡＰＣの範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、一次の第１の拡張において添加されたＡＰＣの数が、正確にまたは約２×１０８ＡＰＣ～正確にまたは約２．５×１０８ＡＰＣの範囲から選択され、急速な第２の拡張において添加されたＡＰＣの数が、正確にまたは約４．５×１０８ＡＰＣ～正確にまたは約５．５×１０８ＡＰＣの範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、正確にまたは約２．５×１０８ＡＰＣが第１の初期拡張に添加され、かつ正確にまたは約５×１０８ＡＰＣが急速な第２の拡張に添加されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、抗原提示細胞が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、複数の腫瘍断片が複数の別個の容器に分配され、それらの別個の容器の各々内で、第１のＴＩＬ集団がステップ（ａ）において得られ、第２のＴＩＬ集団がステップ（ｂ）において得られ、第３のＴＩＬ集団がステップ（ｃ）において得られ、ステップ（ｃ）における複数の容器からの治療的ＴＩＬ集団が組み合わせられて、ステップ（ｄ）から採取されたＴＩＬ集団を産生するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、複数の腫瘍が複数の別個の容器に均一に分配されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、複数の別個の容器が少なくとも２個の別個の容器を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、複数の別個の容器が２～２０個の別個の容器を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、複数の別個の容器が２～１５個の別個の容器を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、複数の別個の容器が２～１０個の別個の容器を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、複数の別個の容器が２～５個の別個の容器を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、複数の別個の容器が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の別個の容器を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張がステップ（ｂ）において第１のＴＩＬ集団で行われる各容器の場合、ステップ（ｃ）における急速な第２の拡張が、同じ容器内でかかる第１のＴＩＬ集団から産生された第２のＴＩＬ集団で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、別個の容器の各々が第１のガス透過性表面積を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、複数の腫瘍断片が単一の容器に分配されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、単一の容器が第１のガス透過性表面積を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、ステップ（ｂ）において、第１の初期拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法であって、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約１細胞層～正確にまたは約３細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化される、方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約１．５細胞層～正確にまたは約２．５細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約２細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約３細胞層～正確にまたは約１０細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約４細胞層～正確にまたは約８細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約３、４、５、６、７、８、９、または１０細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、プライミングによる第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を含む第１の容器内で行われ、ステップ（ｃ）において、急速な第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を含む第２の容器内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第２の容器が第１の容器よりも大きいように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、ステップ（ｂ）において、第１の初期拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法であって、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約１細胞層～正確にまたは約３細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化される、方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約１．５細胞層～正確にまたは約２．５細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約２細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約３細胞層～正確にまたは約１０細胞層の平均厚さで第２のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約４細胞層～正確にまたは約８細胞層の平均厚さで第２のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約３、４、５、６、７、８、９、または１０細胞層の平均厚さで第２のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、約４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８細胞層の平均厚さで第２のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、プライミングによる第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を含む第１の容器内で行われ、ステップ（ｃ）において、急速な第２の拡張が、第１の容器内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、ステップ（ｂ）において、第１の初期拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法であって、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約１細胞層～正確にまたは約３細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化される、方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約１．５細胞層～正確にまたは約２．５細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約２細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約３細胞層～正確にまたは約１０細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約４細胞層～正確にまたは約８細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約３、４、５、６、７、８、９、または１０細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補足することにより一次の第１の拡張が行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、ステップ（ｃ）において添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの平均層数とステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの平均層数との比率は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：１０の範囲から選択される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補足することにより一次の第１の拡張が行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、ステップ（ｃ）において添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの平均層数とステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの平均層数との比率は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：９の範囲から選択される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補足することにより一次の第１の拡張が行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、ステップ（ｃ）において添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの平均層数とステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの平均層数との比率は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：８の範囲から選択される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補足することにより一次の第１の拡張が行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、ステップ（ｃ）において添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの平均層数とステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの平均層数との比率は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：７の範囲から選択される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補足することにより一次の第１の拡張が行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、ステップ（ｃ）において添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの平均層数とステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの平均層数との比率は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：６の範囲から選択される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補足することにより一次の第１の拡張が行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、ステップ（ｃ）において添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの平均層数とステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの平均層数との比率は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：５の範囲から選択される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補足することにより一次の第１の拡張が行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、ステップ（ｃ）において添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの平均層数とステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの平均層数との比率は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：４の範囲から選択される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補足することにより一次の第１の拡張が行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、ステップ（ｃ）において添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの平均層数とステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの平均層数との比率は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：３の範囲から選択される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補足することにより一次の第１の拡張が行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、ステップ（ｃ）において添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの平均層数とステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの平均層数との比率は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：２の範囲から選択される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補足することにより一次の第１の拡張が行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、ステップ（ｃ）において添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの平均層数とステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの平均層数との比率は、正確にまたは約１：１．２～正確にまたは約１：８の範囲から選択される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補足することにより一次の第１の拡張が行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、ステップ（ｃ）において添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの平均層数とステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの平均層数との比率は、正確にまたは約１：１．３～正確にまたは約１：７の範囲から選択される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補足することにより一次の第１の拡張が行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、ステップ（ｃ）において添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの平均層数とステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの平均層数との比率は、正確にまたは約１：１．４～正確にまたは約１：６の範囲から選択される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補足することにより一次の第１の拡張が行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、ステップ（ｃ）において添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの平均層数とステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの平均層数との比率は、正確にまたは約１：１．５～正確にまたは約１：５の範囲から選択される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補足することにより一次の第１の拡張が行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、ステップ（ｃ）において添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの平均層数とステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの平均層数との比率は、正確にまたは約１：１．６～正確にまたは約１：４の範囲から選択される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補足することにより一次の第１の拡張が行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、ステップ（ｃ）において添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの平均層数とステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの平均層数との比率は、正確にまたは約１：１．７～正確にまたは約１：３．５の範囲から選択される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補足することにより一次の第１の拡張が行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、ステップ（ｃ）において添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの平均層数とステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの平均層数との比率は、正確にまたは約１：１．８～正確にまたは約１：３の範囲から選択される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補足することにより一次の第１の拡張が行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、ステップ（ｃ）において添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの平均層数とステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの平均層数との比率は、正確にまたは約１：１．９～正確にまたは約１：２．５の範囲から選択される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補足することにより一次の第１の拡張が行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、ステップ（ｃ）において添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）において添加されたＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの平均層数とステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの平均層数との比率は、正確にまたは約１：２の範囲から選択される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の初期拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法であって、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されるＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されるＡＰＣの層の平均数に対する比率が、正確にまたは約１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、１：３、１：３．１、１：３．２、１：３．３、１：３．４、１：３．５、１：３．６、１：３．７、１：３．８、１：３．９、１：４、１：４．１、１：４．２、１：４．３、１：４．４、１：４．５、１：４．６、１：４．７、１：４．８、１：４．９、１：５、１：５．１、１：５．２、１：５．３、１：５．４、１：５．５、１：５．６、１：５．７、１：５．８、１：５．９、１：６、１：６．１、１：６．２、１：６．３、１：６．４、１：６．５、１：６．６、１：６．７、１：６．８、１：６．９、１：７、１：７．１、１：７．２、１：７．３、１：７．４、１：７．５、１：７．６、１：７．７、１：７．８、１：７．９、１：８、１：８．１、１：８．２、１：８．３、１：８．４、１：８．５、１：８．６、１：８．７、１：８．８、１：８．９、１：９、１：９．１、１：９．２、１：９．３、１：９．４、１：９．５、１：９．６、１：９．７、１：９．８、１：９．９、または１：１０から選択される、方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数の第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数に対する比率が、正確にまたは約１．５：１～正確にまたは約１００：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数の第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数に対する比率が、正確にまたは約５０：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数の第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数に対する比率が、正確にまたは約２５：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数の第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数に対する比率が、正確にまたは約２０：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数の第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数に対する比率が、正確にまたは約１０：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団の数が、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも正確にまたは約５０倍多いように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団の数が、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも正確にまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０倍多いように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）における第２の期間の開始の正確にまたは約２日または正確にまたは約３日後に、細胞培養培地に追加のＩＬ－２が補充されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｄ）において採取されたＴＩＬ集団を凍結保存するステップをさらに含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｄ）の後に、ステップ（ｄ）から採取されたＴＩＬ集団を、任意選択でＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌを含有する注入バッグに移す追加のステップ（ｅ）を行うことを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｅ）において採取されたＴＩＬ集団を含む注入バッグを凍結保存するステップを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、凍結保存プロセスが、１：１の採取されたＴＩＬ集団の凍結保存培地に対する比率を使用して行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、抗原提示細胞が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ＰＢＭＣが照射され、かつ同種異系であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において細胞培養に添加されるＡＰＣの総数が２．５×１０８であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において細胞培養に添加されるＡＰＣの総数が５×１０８であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ＡＰＣがＰＢＭＣであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ＰＢＭＣが照射され、かつ同種異系であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、抗原提示細胞が人工抗原提示細胞であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｄ）での採取が膜ベースの細胞処理システムを使用して行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｄ）での採取がＬＯＶＯ細胞処理システムを使用して行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約５～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約１０～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約１５～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約２０～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約２５～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約３０～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約３５～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約４０～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約４５～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約５０～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０個の断片（複数可）を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２７ｍｍ３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２０ｍｍ３～正確にまたは約５０ｍｍ３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２１ｍｍ３～正確にまたは約３０ｍｍ３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２２ｍｍ３～正確にまたは約２９．５ｍｍ３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２３ｍｍ３～正確にまたは約２９ｍｍ３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２４ｍｍ３～正確にまたは約２８．５ｍｍ３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２５ｍｍ３～正確にまたは約２８ｍｍ３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２６．５ｍｍ３～正確にまたは約２７．５ｍｍ３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ｍｍ３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、複数の断片が正確にまたは約３０～正確にまたは約６０個の断片を含み、正確にまたは約１３００ｍｍ３～正確にまたは約１５００ｍｍ３の総体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、複数の断片が正確にまたは約５０個の断片を含み、正確にまたは約１３５０ｍｍ３の総体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、複数の断片が正確にまたは約５０個の断片を含み、正確にまたは約１グラム～正確にまたは約１．５グラムの総質量を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、細胞培養培地がＧ容器またはＸｕｒｉセルバッグである容器内に提供されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、細胞培養培地中のＩＬ－２濃度が約１０，０００ＩＵ／ｍＬ～約５０００ＩＵ／ｍＬであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、細胞培養培地中のＩＬ－２濃度が約６，０００ＩＵ／ｍＬであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、凍結保存培地がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、凍結保存培地が７％～１０％ＤＭＳＯを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）における第１の期間が正確にまたは約１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日の期間内に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）における第２の期間が正確にまたは約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、または１１日の期間内に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）における第１の期間及びステップ（ｃ）における第２の期間が各々、正確にまたは約１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日の期間内に個別に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）における第１の期間及びステップ（ｃ）における第２の期間が各々、正確にまたは約５日、６日、または７日の期間内に個別に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）における第１の期間及びステップ（ｃ）における第２の期間が各々、正確にまたは約７日の期間内に個別に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１４日～正確にまたは約１８日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１５日～正確にまたは約１８日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１６日～正確にまたは約１８日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１７日～正確にまたは約１８日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１４日～正確にまたは約１７日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１５日～正確にまたは約１７日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１６日～正確にまたは約１７日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１４日～正確にまたは約１６日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１５日～正確にまたは約１６日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１４日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１５日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１６日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１７日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１８日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１４日以内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１５日以内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１６日以内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１８日以内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｄ）で採取された治療的ＴＩＬ集団が、ＴＩＬの治療上有効な投与量に十分なＴＩＬを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量に十分なＴＩＬの数が、正確にまたは約２．３×１０１０～正確にまたは約１３．７×１０１０であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）における第３のＴＩＬ集団が、増加した有効性、増加したインターフェロンγ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）における第３のＴＩＬ集団が、１６日以上のプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍～５倍以上のインターフェロンγ産生を提供するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）における第３のＴＩＬ集団が、１７日以上のプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍～５倍以上のインターフェロンγ産生を提供するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）における第３のＴＩＬ集団が、１８日以上のプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍～５倍以上のインターフェロンγ産生を提供するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）の第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクターＴ細胞及び／またはセントラルメモリーＴ細胞が、ステップ（ｂ）の第２の細胞集団から得られたエフェクターＴ細胞及び／またはセントラルメモリーＴ細胞と比較して増加したＣＤ８及びＣＤ２８発現を示すように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、方法に列挙された各容器が密閉容器であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、方法に列挙された各容器がＧ容器であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、方法に列挙された各容器がＧＲＥＸ－１０であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、方法に列挙された各容器がＧＲＥＸ－１００であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、方法に列挙された各容器がＧＲＥＸ－５００であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法によって作製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療用集団を提供する。
別の実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供し、この治療的ＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ拡張が抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはＯＫＴ３を添加せずに行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、増加した有効性、増加したインターフェロンγ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する。
別の実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供し、この治療的ＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ拡張が抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加せずに行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、増加した有効性、増加したインターフェロンγ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する。
別の実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供し、この治療的ＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ拡張がＯＫＴ３を添加せずに行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、増加した有効性、増加したインターフェロンγ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する。
別の実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供し、この治療的ＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ拡張が抗原提示細胞（ＡＰＣ）もＯＫＴ３も添加せずに行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、増加した有効性、増加したインターフェロンγ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する。
別の実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供し、この治療的ＴＩＬ集団は、１６日以上のプロセスによってプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、増加した有効性、増加したインターフェロンγ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する。
別の実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供し、この治療的ＴＩＬ集団は、１７日以上のプロセスによってプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、増加した有効性、増加したインターフェロンγ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する。
別の実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供し、この治療的ＴＩＬ集団は、１８日以上のプロセスによってプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、増加した有効性、増加したインターフェロンγ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する。
別の実施形態では、本発明は、増加したインターフェロンγ産生を提供する、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。
別の実施形態では、本発明は、増加したポリクローン性を提供する、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載された治療的ＴＩＬ集団を提供する。
別の実施形態では、本発明は、増加した有効性を提供する、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。
別の実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１６日以上のプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンγ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１７日以上のプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンγ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１８日以上のプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンγ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に示されているように）、本明細書に記載される拡張プロセスに起因する少なくとも１倍多いインターフェロンγ産生が可能になる。
別の実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１６日以上のプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンγ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１７日以上のプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンγ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１８日以上のプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンγ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に示されているように）、本明細書に記載される拡張プロセスに起因する少なくとも２倍多いインターフェロンγ産生が可能になる。
別の実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１６日以上のプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンγ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１７日以上のプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンγ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１８日以上のプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンγ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に示されているように）、本明細書に記載される拡張プロセスに起因する少なくとも３倍多いインターフェロンγ産生が可能になる。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ拡張が抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加せずに行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンγ産生が可能である腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に示されているように）、本明細書に記載される拡張プロセスに起因する少なくとも１倍多いインターフェロンγ産生が可能になる。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ拡張がＯＫＴ３を添加せずに行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンγ産生が可能である腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に示されているように）、本明細書に記載される拡張プロセスに起因する少なくとも１倍多いインターフェロンγ産生が可能になる。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ拡張がＡＰＣを添加せずに行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンγ産生が可能であるＴＩＬの治療的集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に示されているように）、本明細書に記載される拡張プロセスに起因する少なくとも２倍多いインターフェロンγ産生が可能になる。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ拡張がＯＫＴ３を添加せずに行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンγ産生が可能である治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に示されているように）、本明細書に記載される拡張プロセスに起因する少なくとも２倍多いインターフェロンγ産生が可能になる。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ拡張がＡＰＣを添加せずに行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンγ産生が可能である治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に示されているように）、本明細書に記載される拡張プロセスに起因する少なくとも１倍多いインターフェロンγ産生が可能になる。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ拡張がＯＫＴ３を添加せずに行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンγ産生が可能である治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図８（特に、例えば図８Ｂ及び／または図８Ｃ）に示されているように）、本明細書に記載される拡張プロセスに起因する少なくとも３倍多いインターフェロンγ産生が可能になる。
別の実施形態では、本発明は、腫瘍断片が、小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物であるように修正された、上記の該当する前の段落のいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、腫瘍断片がコア生検であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、腫瘍断片が細針吸引物であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、腫瘍断片が小生検（例えば、パンチ生検を含む）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、腫瘍断片がコア針生検であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）方法が、対象由来の腫瘍組織の１つ以上の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から第１のＴＩＬ集団を取得することを含み、（ｉｉ）方法が、プライミングによる第１の拡張ステップを行う前に、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を約３日間培養するステップを行うことを含み、（ｉｉｉ）方法が、プライミングによる第１の拡張を約８日間行うことを含み、及び（ｉｖ）方法が、急速な第２の拡張を約１１日間行うことを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。前述の実施形態のうちのいくつかでは、方法のこれらのステップは、約２２日で完了する。
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）方法が、対象由来の腫瘍組織の１つ以上の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から第１のＴＩＬ集団を取得することを含み、（ｉｉ）方法が、プライミングによる第１の拡張ステップを行う前に、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を約３日間培養するステップを行うことを含み、（ｉｉｉ）方法が、プライミングによる第１の拡張を約８日間行うことを含み、かつ（ｉｖ）方法が、第２のＴＩＬ集団の培養物を約５日間培養し、培養物を最大５つの継代培養物に分割し、かつ継代培養物を約６日間培養することによって、急速な第２の拡張を行うことを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。前述の実施形態のうちのいくつかでは、最大５つの継代培養物が各々、第２のＴＩＬ集団の培養が急速な第２の拡張で開始される容器と同じサイズのまたはそれよりも大きい容器内で培養される。前述の実施形態のうちのいくつかでは、第２のＴＩＬ集団の培養物は、最大５つの継代培養物間で均等に分けられる。前述の実施形態のうちのいくつかでは、方法のこれらのステップは、約２２日で完了する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１～約２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１～約１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１～約２０個のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１～約１０個のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１～約２０個の細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１～約１０個の細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１～約２０個のコア針生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１～約１０個のコア針生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のコア針生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のコア針生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１～約２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１～約１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）方法が、対象由来の腫瘍組織の１～約１０個のコア生検から第１のＴＩＬ集団を得ることを含み、（ｉｉ）方法が、第１のプライミング拡張ステップを行う前に、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を約３日間培養するステップを行うことを含み、（ｉｉｉ）方法が、第１のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む培養培地中で約８日間培養することによって第１のプライミング拡張ステップを行い、第２のＴＩＬ集団を得ることを含み、かつ（ｉｖ）方法が、第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＡＰＣを含む培養培地中で約１１日間培養することによって第２の急速拡張ステップを行うことを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。前述の実施形態のうちのいくつかでは、方法のこれらのステップは、約２２日で完了する。
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）方法が、対象由来の腫瘍組織の１～約１０個のコア生検から第１のＴＩＬ集団を得ることを含み、（ｉｉ）方法が、第１のプライミング拡張ステップを行う前に、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を約３日間培養するステップを行うことを含み、（ｉｉｉ）方法が、第１のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む培養培地中で約８日間培養することによって第１のプライミング拡張ステップを行い、第２のＴＩＬ集団を得ることを含み、かつ（ｉｖ）方法が、第２のＴＩＬ集団の培養物を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＡＰＣを含む培養培地中で約５日間培養し、培養物を最大５つの継代培養物に分割し、かつ継代培養物の各々を、ＩＬ－２を含む培養培地中で約６日間培養することによって、第２の急速拡張を行うことを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。前述の実施形態のうちのいくつかでは、最大５つの継代培養物が各々、第２のＴＩＬ集団の培養が急速な第２の拡張で開始される容器と同じサイズのまたはそれよりも大きい容器内で培養される。前述の実施形態のうちのいくつかでは、第２のＴＩＬ集団の培養物は、最大５つの継代培養物間で均等に分けられる。前述の実施形態のうちのいくつかでは、方法のこれらのステップは、約２２日で完了する。
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）方法が、対象由来の腫瘍組織の１～約１０個のコア生検から第１のＴＩＬ集団を取得することを含み、（ｉｉ）方法が、プライミングによる第１の拡張ステップを行う前に、Ｇ－Ｒｅｘ １００Ｍフラスコ内の０．５ＬのＣＭ１培養培地中６０００ＩＵ ＩＬ－２／ｍＬを含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を約３日間培養するステップを行うことを含み、（ｉｉｉ）方法が、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３、及び約１０８個のフィーダー細胞を含有する０．５ＬのＣＭ１培養培地を添加し、約８日間培養することによって、プライミングによる第１の拡張を行うことを含み、かつ（ｉｖ）方法が、（ａ）第２のＴＩＬ集団を、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３、及び５×１０９個のフィーダー細胞を有する５ＬのＣＭ２培養培地を含有するＧ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳフラスコに移し、約５日間培養することと、（ｂ）１０９個のＴＩＬを、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を有する５ＬのＡＩＭ－Ｖ培地を含有する最大５つのＧ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳフラスコの各々に移すことによって培養物を最大５つの継代培養物に分割し、継代培養物を約６日間培養することとによって、急速な第２の拡張を行うことを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。前述の実施形態のうちのいくつかでは、方法のこれらのステップは、約２２日で完了する。
別の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞を拡張する方法であって、（ａ）第１のＴ細胞集団を培養することによってドナーから取得された第１のＴ細胞集団のプライミングによる第１の拡張を行って成長をもたらし、第１のＴ細胞集団の活性化をプライミングすることと、（ｂ）ステップ（ａ）においてプライミングされた第１のＴ細胞集団の活性化が減衰し始めた後、第１のＴ細胞集団を培養することによって第１のＴ細胞集団の急速な第２の拡張を行って成長をもたらし、第１のＴ細胞集団の活性化を促進して第２のＴ細胞集団を取得することと、（ｃ）第２のＴ細胞集団を採取することと、を含む、Ｔ細胞を拡張する方法を提供する。別の実施形態では、急速な第２の拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養での第１のＴ細胞集団を、第１の容器よりも大きい第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移し、小規模培養由来の第１のＴ細胞集団を、第２の容器内でのより大規模な培養で約４～７日間培養することとによって、培養のスケールアップを達成する。別の実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での第１の小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）第１の小規模培養由来の第１のＴ細胞集団を、第１の容器とサイズが等しい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウトを達成し、各第２の容器内で、第１の小規模培養由来のかかる第２の容器に移された第１のＴ細胞集団の一部が、第２の小規模培養で約４～７日間培養される。別の実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養由来の第１のＴ細胞集団を、第１の容器よりもサイズが大きい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養由来のかかる第２の容器に移された第１のＴ細胞集団の一部が、より大規模な培養で約４～７日間培養される。別の実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養由来の第１のＴ細胞集団を、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養由来のかかる第２の容器に移された第１のＴ細胞集団の一部が、より大規模な培養で約５日間培養される。
別の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張のステップが、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約２～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養での第１のＴ細胞集団を、第１の容器よりも大きい第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移し、小規模培養由来の第１のＴ細胞集団を、第２の容器内でのより大規模な培養で約５～７日間培養することとによって、培養のスケールアップを達成する。
別の実施形態では、本発明は、急速拡張のステップが、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での第１の小規模培養で約２～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）第１の小規模培養由来の第１のＴ細胞集団を、第１の容器とサイズが等しい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウトを達成し、各第２の容器内で、第１の小規模培養由来のかかる第２の容器に移された第１のＴ細胞集団の一部が、第２の小規模培養で約５～７日間培養される。
別の実施形態では、本発明は、急速拡張のステップが、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約２～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養由来の第１のＴ細胞集団を、第１の容器よりもサイズが大きい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養由来のかかる第２の容器に移された第１のＴ細胞集団の一部が、より大規模な培養で約５～７日間培養される。
別の実施形態では、本発明は、急速拡張のステップが、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養由来の第１のＴ細胞集団を、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養由来のかかる第２の容器に移された第１のＴ細胞集団の一部が、より大規模な培養で約５～６日間培養される。
別の実施形態では、本発明は、急速拡張のステップが、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養由来の第１のＴ細胞集団を、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養由来のかかる第２の容器に移された第１のＴ細胞集団の一部が、より大規模な培養で約５日間培養される。
別の実施形態では、本発明は、急速拡張のステップが、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養由来の第１のＴ細胞集団を、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養由来のかかる第２の容器に移された第１のＴ細胞集団の一部が、より大規模な培養で約６日間培養される。
別の実施形態では、本発明は、急速拡張のステップが、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養由来の第１のＴ細胞集団を、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳ容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養由来のかかる第２の容器に移された第１のＴ細胞集団の一部が、より大規模な培養で約７日間培養される。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）のプライミングによる第１の拡張が最大７日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大８日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大９日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大１０日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大１１日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）におけるプライミングによる第１の拡張が７日の期間中に行われ、かつステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大９日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）におけるプライミングによる第１の拡張が７日の期間中に行われ、かつステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大１０日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）におけるプライミングによる第１の拡張が７日または８日の期間中に行われ、かつステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大９日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）におけるプライミングによる第１の拡張が７日または８日の期間中に行われ、かつステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大１０日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）におけるプライミングによる第１の拡張が８日の期間中に行われ、かつステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大９日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）におけるプライミングによる第１の拡張が８日の期間中に行われ、かつステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大８日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＴ細胞集団がＯＫＴ－３及びＩＬ－２を含む第１の培養培地中で培養されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１の培養培地が４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、及びＩＬ－２を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１の培養培地がＯＫＴ－３、ＩＬ－２、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１の培養培地が４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴ細胞集団がＯＫＴ－３、ＩＬ－２、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む第２の培養培地中で培養されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第２の培養培地が４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＴ細胞集団が、第１のガス透過性表面を含む容器内の第１の培養培地中で培養され（ここで、第１の培養培地が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２、及び第１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を含み、第１のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第１のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化される）、ステップ（ｂ）において、第１のＴ細胞集団が、容器内の第２の培養培地中で培養される（ここで、第２の培養培地が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２、及び第２のＡＰＣ集団を含み、第２のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第２のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化され、第２のＡＰＣ集団が、第１のＡＰＣ集団よりも多い）ように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＴ細胞集団が、第１のガス透過性表面を含む容器内の第１の培養培地中で培養され（ここで、第１の培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２、及び第１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を含み、第１のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第１のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化される）、ステップ（ｂ）において、第１のＴ細胞集団が、容器内の第２の培養培地中で培養される（ここで、第２の培養培地が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２、及び第２のＡＰＣ集団を含み、第２のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第２のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化され、第２のＡＰＣ集団が、第１のＡＰＣ集団よりも多い）ように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＴ細胞集団が、第１のガス透過性表面を含む容器内の第１の培養培地中で培養され（ここで、第１の培養培地が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２、及び第１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を含み、第１のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第１のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化される）、ステップ（ｂ）において、第１のＴ細胞集団が、容器内の第２の培養培地中で培養される（ここで、第２の培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２、及び第２のＡＰＣ集団を含み、第２のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第２のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化され、第２のＡＰＣ集団が、第１のＡＰＣ集団よりも多い）ように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＴ細胞集団が、第１のガス透過性表面を含む容器内の第１の培養培地中で培養され（ここで、第１の培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２、及び第１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を含み、第１のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第１のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化される）、ステップ（ｂ）において、第１のＴ細胞集団が、容器内の第２の培養培地中で培養される（ここで、第２の培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２、及び第２のＡＰＣ集団を含み、第２のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第２のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化され、第２のＡＰＣ集団が、第１のＡＰＣ集団よりも多い）ように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第２のＡＰＣ集団中のＡＰＣの数の第１のＡＰＣ集団中のＡＰＣの数に対する比率が約２：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＡＰＣ集団中のＡＰＣの数が約２．５×１０８あり、第２のＡＰＣ集団中のＡＰＣの数が約５×１０８であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が、２層のＡＰＣの平均厚さで第１のガス透過性表面上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が、４～８層のＡＰＣから選択される平均厚さで第１のガス透過性表面上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において第１のガス透過性表面上に層状化されたＡＰＣの平均層数の、ステップ（ａ）において第１のガス透過性表面上に層状化されたＡＰＣの平均層数に対する比率は、２：１である。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が正確にまたは約１．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約４．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が正確にまたは約１．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が正確にまたは約２．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約３．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が正確にまたは約２．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が正確にまたは約２．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約７．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が正確にまたは約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約６．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が正確にまたは約４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約５．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が正確にまたは約４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が正確にまたは約１．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約４．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種され、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が、正確にまたは約２．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約７．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が正確にまたは約１．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種され、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が、正確にまたは約３．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約６．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が正確にまたは約２．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約３．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種され、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が、正確にまたは約４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２～正確にまたは約５．５×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が正確にまたは約２．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の密度で第１のガス透過性表面に播種され、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が正確にまたは約４．０×１０６ＡＰＣ／ｃｍ２の密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ＡＰＣが末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ＰＢＭＣが照射され、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞が腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞が骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞が末梢血リンパ球（ＰＢＬ）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団がドナーの全血からの分離によって得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団がドナーのアフェレーシス産物からの分離によって得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、Ｔ細胞表現型の正または負の選択によってドナーの全血またはアフェレーシス産物から分離されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞表現型がＣＤ３＋及びＣＤ４５＋であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団のプライミングによる第１の拡張を行う前に、Ｔ細胞がＮＫ細胞から分離されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。別の実施形態では、Ｔ細胞は、第１のＴ細胞集団からのＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞の除去によって、第１のＴ細胞集団中のＮＫ細胞から分離される。別の実施形態では、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞画分を除去し、かつ陰性画分を回収するゲーティング戦略を使用して、第１のＴ細胞集団を細胞選別に供することによって、第１のＴ細胞集団から除去される。別の実施形態では、前述の方法は、高いＮＫ細胞パーセンテージを特徴とする第１のＴ細胞集団におけるＴ細胞の拡張のために利用される。別の実施形態では、前述の方法は、高いＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞パーセンテージを特徴とする第１のＴ細胞集団におけるＴ細胞の拡張のために利用される。別の実施形態では、前述の方法は、多数のＮＫ細胞の存在を特徴とする腫瘍組織におけるＴ細胞の拡張のために利用される。別の実施形態では、前述の方法は、多数のＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞を特徴とする腫瘍組織におけるＴ細胞の拡張のために利用される。別の実施形態では、前述の方法は、多数のＮＫ細胞の存在を特徴とする腫瘍に罹患している患者から得られた腫瘍組織におけるＴ細胞の拡張のために利用される。別の実施形態では、前述の方法は、多数のＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞の存在を特徴とする腫瘍に罹患している患者から得られた腫瘍組織におけるＴ細胞の拡張のために利用される。別の実施形態では、前述の方法は、卵巣癌に罹患している患者から得られた腫瘍組織におけるＴ細胞の拡張のために利用される。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団由来の正確にまたは約１×１０７Ｔ細胞が容器内に播種されて、かかる容器内で主要な第１の拡張を開始するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が複数の容器に分配され、各容器内で、第１のＴ細胞集団由来の正確にまたは約１×１０７Ｔ細胞が播種されて、かかる容器内で主要な第１の拡張を開始するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において採取された第２のＴ細胞集団が治療的ＴＩＬ集団であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１つ以上の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１～２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１～１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１つ以上のコア生検から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１～２０個のコア生検から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１～１０個のコア生検から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のコア生検から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のコア生検から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１つ以上の細針吸引物から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１～２０個の細針吸引物から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１～１０個の細針吸引物から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の細針吸引物から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の細針吸引物から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１つ以上の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１～２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１～１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１つ以上のコア針生検から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１～２０個のコア針生検から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１～１０個のコア針生検から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のコア針生検から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナー由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のコア針生検から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、ｉ）ＩＬ－２を含む第１の細胞培養倍地中で腫瘍試料を約３日間培養することによって対象における腫瘍の１つ以上の小生検、コア生検、または針生検から得られた腫瘍試料から第１のＴＩＬ集団を得る及び／または受容することと、（ｉｉ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む第２の細胞培養倍地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１のプライミング拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１のプライミング拡張が第１のガス透過性表面積を含む容器内で行われ、第１のプライミング拡張が約７日または８日間の第１の期間行われて、第２のＴＩＬ集団が得られ、第２のＴＩＬ集団は第１のＴＩＬ集団よりも数が多い、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の第２の細胞培養倍地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＡＰＣを補充することによって第２の急速拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の急速拡張において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｉｉ）において添加されるＡＰＣの数の少なくとも２倍であり、第２の急速拡張が約１１日間の第２の期間行われて、第３のＴＩＬ集団が得られ、第３のＴＩＬ集団が治療的ＴＩＬ集団であり、第２の急速拡張が第２のガス透過性表面積を含む容器内で行われる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）から得られた治療的ＴＩＬ集団を採取することと、（ｖ）ステップ（ｉｖ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、（ｉ）ＩＬ－２を含む第１の細胞培養倍地中で腫瘍試料を約３日間培養することによって対象における腫瘍の１つ以上の小生検、コア生検、または針生検から取得された腫瘍試料から第１のＴＩＬ集団を取得及び／または受容することと、（ｉｉ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む第２の細胞培養倍地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによってプライミングによる第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、プライミングによる第１の拡張が約７日または８日間の第１の期間行われて、第２のＴＩＬ集団が取得され、第２のＴＩＬ集団は第１のＴＩＬ集団よりも数が多い、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＡＰＣを含む第３の細胞培養培地と接触させることによって急速な第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、急速な第２の拡張が約１１日間の第２の期間行われて、第３のＴＩＬ集団が取得され、第３のＴＩＬ集団が治療的ＴＩＬ集団である、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することと、を含む、方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第２の期間の５日目の後に、培養物が２つ以上の継代培養物に分割され、各継代培養物に追加量の第３の培養培地が補充され、約６日間培養されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第２の期間の５日目の後に、培養物が２つ以上の継代培養物に分割され、各継代培養物にＩＬ－２を含む第４の培養培地が補充され、約６日間培養されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第２の期間の５日目の後に、培養物が最大５つの継代培養物に分割されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、方法におけるすべてのステップが約２２日で完了するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞を拡張する方法であって、（ｉ）第１のＴ細胞集団を培養することによって、ドナーにおける腫瘍の１つ以上の小生検、コア生検、または針生検から取得された腫瘍細胞由来の第１のＴ細胞集団のプライミングによる第１の拡張を行って成長をもたらし、第１のＴ細胞集団の活性化をプライミングすることと、（ｉｉ）ステップ（ａ）においてプライミングされた第１のＴ細胞集団の活性化が減衰し始めた後に、第１のＴ細胞集団を培養することによって第１のＴ細胞集団の急速な第２の拡張を行って成長をもたらし、第１のＴ細胞集団の活性化を促進して第２のＴ細胞集団を取得することと、（ｉｖ）第２のＴ細胞集団を採取することと、を含む、Ｔ細胞を拡張する方法を提供する。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、複数のコア生検から得られる。いくつかの実施形態では、複数のコア生検は、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０個のコア生検からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞またはＴＩＬが腫瘍消化物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載される方法。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、例えば、ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅ、及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼであるが、これらに限定されない酵素培地中で腫瘍をインキュベートすること、続いて、機械的解離（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）によって生成される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ（任意のブレンドまたはタイプのコラゲナーゼを含む）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）、ヒアルロニダーゼ、中性プロテアーゼ（ディスパーゼ）、キモトリプシン、キモパパイン、トリプシン、カゼイナーゼ、エラスターゼ、パパイン、プロテアーゼタイプＸＩＶ（プロナーゼ）、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ）、トリプシン阻害剤、任意の他の解離酵素またはタンパク質分解酵素、及びこれらの任意の組み合わせ等の１つ以上の解離（消化）酵素を含むが、これらに限定されない腫瘍解離酵素混合物の中に配置される。他の実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ（任意のブレンドまたはタイプのコラゲナーゼを含む）、中性プロテアーゼ（ディスパーゼ）及びデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ）を含む腫瘍解離酵素混合物中に配置される。
薬学的組成物、投与量、及び投薬レジメン
ある実施形態では、本開示の方法を使用して拡張されたＴＩＬは、薬学的組成物として患者に投与される。ある実施形態では、薬学的組成物は、滅菌緩衝液中のＴＩＬ懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡張されたＴＩＬは、当該技術分野で知られている任意の好適な経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、単回の動脈内または静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、およそ３０～６０分続く。他の好適な投与経路には、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内投与が含まれる。
任意の好適な用量のＴＩＬが投与され得る。いくつかの実施形態では、特にがんが黒色腫である場合、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０のＴＩＬが投与され、平均約７．８×１０１０ＴＩＬである。ある実施形態では、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約３×１０１０～約１２×１０１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約４×１０１０～約１０×１０１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約５×１０１０～約８×１０１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約６×１０１０～約８×１０１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約７×１０１０～約８×１０１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０である。いくつかの実施形態では、特にがんが黒色腫である場合、治療上有効な投与量は、約７．８×１０１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約３×１０１０～約１２×１０１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約４×１０１０～約１０×１０１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約５×１０１０～約８×１０１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約６×１０１０～約８×１０１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約７×１０１０～約８×１０１０のＴＩＬである。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物で提供されるＴＩＬの数は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３である。ある実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの数は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２、及び５×１０１２～１×１０１３の範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、例えば、薬学的組成物の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％、または０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖ未満である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、薬学的組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％、１９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％、１８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％、１７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％、１６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％、１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％、１４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％、１３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％、１２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％、１１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％、１０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％、９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％、８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％、７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％、６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％、５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％、または０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖ超である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、薬学的組成物の約０．０００１％～約５０％、約０．００１％～約４０％、約０．０１％～約３０％、約０．０２％～約２９％、約０．０３％～約２８％、約０．０４％～約２７％、約０．０５％～約２６％、約０．０６％～約２５％、約０．０７％～約２４％、約０．０８％～約２３％、約０．０９％～約２２％、約０．１％～約２１％、約０．２％～約２０％、約０．３％～約１９％、約０．４％～約１８％、約０．５％～約１７％、約０．６％～約１６％、約０．７％～約１５％、約０．８％～約１４％、約０．９％～約１２％、または約１％～約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖの範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、薬学的組成物の約０．００１％～約１０％、約０．０１％～約５％、約０．０２％～約４．５％、約０．０３％～約４％、約０．０４％～約３．５％、約０．０５％～約３％、約０．０６％～約２．５％、約０．０７％～約２％、約０．０８％～約１．５％、約０．０９％～約１％、約０．１％～約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖの範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの量は、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ、または０．０００１ｇ以下である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ、または１０ｇ超である。
本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬは、広い投与量範囲にわたって有効である。正確な投与量は、投与経路、化合物が投与される形態、治療される対象の性別及び年齢、治療される対象の体重、ならびに主治医の選好及び経験に依存するであろう。適切な場合、ＴＩＬの臨床的に確立された投与量が使用される場合もある。ＴＩＬの投与量などの本明細書の方法を使用して投与される薬学的組成物の量は、治療されるヒトまたは哺乳動物、障害または状態の重症度、投与速度、医薬品有効成分の性質、及び処方医師の裁量に依存するであろう。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、単回用量で投与され得る。かかる投与は、注射、例えば、静脈内注射によるものであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、複数回用量で投与され得る。投薬は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回、または６回超であり得る。投薬は、月１回、２週間に１回、週１回、または隔日に１回であり得る。ＴＩＬの投与は、必要な限り継続することができる。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効な投与量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効な投与量は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２、及び５×１０１２～１×１０１３の範囲内である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効な投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ～約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ～約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇ～約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ～約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ～約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、または約２．８５ｍｇ／ｋｇ～約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効な投与量は、約１ｍｇ～約５００ｍｇ、約１０ｍｇ～約３００ｍｇ、約２０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ～約２００ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約５ｍｇ～約４５ｍｇ、約１０ｍｇ～約４０ｍｇ、約１５ｍｇ～約３５ｍｇ、約２０ｍｇ～約３０ｍｇ、約２３ｍｇ～約２８ｍｇ、約５０ｍｇ～約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ～約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ～約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ～約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ～約１１０ｍｇ、または約９５ｍｇ～約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ～約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ～約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ～約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ～約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ～約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ～約２０５ｍｇ、または約１９８～約２０７ｍｇの範囲内である。
ＴＩＬの有効量は、鼻腔内経路及び経皮経路を含む、同様の有用性を有する薬剤の認められた投与様式のうちのいずれかによって、動脈内注射によって、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、局所、移植によって、または吸入によって、単回用量または複数回用量のいずれかで投与され得る。
別の実施形態では、本発明は、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を含む注入バッグを提供する。
別の実施形態では、本発明は、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団及び薬学的に許容される担体を含む腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、上記の前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を含む注入バッグを提供する。
別の実施形態では、本発明は、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団の凍結保存された調製物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団及び凍結保存された培地を含む腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、凍結保存培地がＤＭＳＯを含むように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、凍結保存培地が７～１０％のＤＭＳＯを含むように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、上記の前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物の凍結保存された調製物を提供する。
ある実施形態では、本開示の方法を使用して拡張されたＴＩＬは、薬学的組成物として患者に投与される。ある実施形態では、薬学的組成物は、滅菌緩衝液中のＴＩＬ懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡張されたＴＩＬは、当該技術分野で知られている任意の好適な経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、単回の動脈内または静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、およそ３０～６０分続く。他の好適な投与経路には、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内投与が含まれる。
任意の好適な用量のＴＩＬが投与され得る。いくつかの実施形態では、特にがんが黒色腫である場合、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０のＴＩＬが投与され、平均約７．８×１０１０ＴＩＬである。ある実施形態では、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約３×１０１０～約１２×１０１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約４×１０１０～約１０×１０１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約５×１０１０～約８×１０１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約６×１０１０～約８×１０１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約７×１０１０～約８×１０１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０である。いくつかの実施形態では、特にがんが黒色腫である場合、治療上有効な投与量は、約７．８×１０１０ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約３×１０１０～約１２×１０１０ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約４×１０１０～約１０×１０１０ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約５×１０１０～約８×１０１０ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約６×１０１０～約８×１０１０ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約７×１０１０～約８×１０１０ＴＩＬである。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物で提供されるＴＩＬの数は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３である。ある実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの数は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２、及び５×１０１２～１×１０１３の範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、例えば、薬学的組成物の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％、または０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖ未満である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、薬学的組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％、１９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％、１８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％、１７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％、１６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％、１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％、１４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％、１３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％、１２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％、１１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％、１０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％、９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％、８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％、７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％、６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％、５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％、または０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖ超である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、薬学的組成物の約０．０００１％～約５０％、約０．００１％～約４０％、約０．０１％～約３０％、約０．０２％～約２９％、約０．０３％～約２８％、約０．０４％～約２７％、約０．０５％～約２６％、約０．０６％～約２５％、約０．０７％～約２４％、約０．０８％～約２３％、約０．０９％～約２２％、約０．１％～約２１％、約０．２％～約２０％、約０．３％～約１９％、約０．４％～約１８％、約０．５％～約１７％、約０．６％～約１６％、約０．７％～約１５％、約０．８％～約１４％、約０．９％～約１２％、または約１％～約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖの範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、薬学的組成物の約０．００１％～約１０％、約０．０１％～約５％、約０．０２％～約４．５％、約０．０３％～約４％、約０．０４％～約３．５％、約０．０５％～約３％、約０．０６％～約２．５％、約０．０７％～約２％、約０．０８％～約１．５％、約０．０９％～約１％、約０．１％～約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖの範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの量は、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ、または０．０００１ｇ以下である。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ、または１０ｇ超である。
本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬは、広い投与量範囲にわたって有効である。正確な投与量は、投与経路、化合物が投与される形態、治療される対象の性別及び年齢、治療される対象の体重、ならびに主治医の選好及び経験に依存するであろう。適切な場合、ＴＩＬの臨床的に確立された投与量が使用される場合もある。ＴＩＬの投与量などの本明細書の方法を使用して投与される薬学的組成物の量は、治療されるヒトまたは哺乳動物、障害または状態の重症度、投与速度、医薬品有効成分の性質、及び処方医師の裁量に依存するであろう。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、単回用量で投与され得る。かかる投与は、注射、例えば、静脈内注射によるものであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、複数回用量で投与され得る。投薬は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回、または６回超であり得る。投薬は、月１回、２週間に１回、週１回、または隔日に１回であり得る。ＴＩＬの投与は、必要な限り継続することができる。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効な投与量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効な投与量は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２、及び５×１０１２～１×１０１３の範囲内である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効な投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ～約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ～約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇ～約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ～約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ～約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、または約２．８５ｍｇ／ｋｇ～約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効な投与量は、約１ｍｇ～約５００ｍｇ、約１０ｍｇ～約３００ｍｇ、約２０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ～約２００ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約５ｍｇ～約４５ｍｇ、約１０ｍｇ～約４０ｍｇ、約１５ｍｇ～約３５ｍｇ、約２０ｍｇ～約３０ｍｇ、約２３ｍｇ～約２８ｍｇ、約５０ｍｇ～約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ～約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ～約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ～約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ～約１１０ｍｇ、または約９５ｍｇ～約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ～約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ～約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ～約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ～約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ～約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ～約２０５ｍｇ、または約１９８～約２０７ｍｇの範囲内である。
ＴＩＬの有効量は、鼻腔内経路及び経皮経路を含む、同様の有用性を有する薬剤の認められた投与様式のうちのいずれかによって、動脈内注射によって、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、局所、移植によって、または吸入によって、単回用量または複数回用量のいずれかで投与され得る。
Ｉ．改良された人工抗原提示細胞プロセスの実施形態
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｒａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｕ９３７細胞、Ｔｈｐ１細胞、及びそれらの誘導体、バリアント、修飾、または子孫からなる群から選択されるＡＰＣを使用して、ＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬを拡張するための方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＰＣを使用してＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬを拡張するための方法を含み、ＡＰＣは、Ｕ９３７またはＴｈｐ１細胞などの照射された単球系細胞もしくは照射されていない単球系細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、または子孫である。いくつかの実施形態では、ＡＰＣは、人工ＡＰＣである。いくつかの実施形態では、ＡＰＣは、本明細書の他の箇所に記載されるように、例えば、４－１ＢＢＬまたはＯＸ４０Ｌを発現するように遺伝子修飾される。ある実施形態では、遺伝子修飾細胞は、米国特許第１０，４１５，０１５号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＯＸ－４０アゴニスト抗体、４－１ＢＢアゴニスト抗体、ＯＫＴ－３のＦｃ鎖に結合可能な抗体、及び／またはＩＣＯＳ－Ｌを発現するように修飾される。前述の実施形態のうちのいずれにおいても、遺伝子修飾ａＡＰＣは、本明細書の他の箇所に記載されるように照射され得るか、または照射されなくてもよい。前述のＧｅｎ２、Ｇｅｎ３、及び細胞表面マーカーの選択に基づくプロセスを含む他のＴＩＬ製造プロセスを用いてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する対象を治療するための方法であって、
（ａ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に付加することと、
（ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１１日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、第２のＴＩＬ集団が、第１のＴＩＬ集団よりも数が少なくとも１０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１１日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行が、系を開くことなく起こる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、系を開くことなく起こる、採取することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行が、系を開くことなく起こる、移すことと、
（ｇ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの採取されたＴＩＬ集団を含む注入バッグを凍結保存することと、
（ｈ）治療上有効な投与量の第３のＴＩＬ集団を、ステップ（ｇ）における注入バッグから対象に投与することと、を含む、拡張された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含み、
ＡＰＣが、Ｒａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｕ９３７細胞、Ｔｈｐ１細胞、及びそれらの誘導体、バリアント、修飾、または子孫からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する対象を治療するための方法であって、
（ａ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に付加することと、
（ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１１日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、第２のＴＩＬ集団が、第１のＴＩＬ集団よりも数が少なくとも１０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１１日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行が、系を開くことなく起こる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、系を開くことなく起こる、採取することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行が、系を開くことなく起こる、移すことと、
（ｇ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの採取されたＴＩＬ集団を含む注入バッグを凍結保存することと、
（ｈ）治療上有効な投与量の第３のＴＩＬ集団を、ステップ（ｇ）における注入バッグから対象に投与することと、を含む、拡張された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含み、
ＡＰＣが、Ｕ９３７もしくはＴｈｐ１細胞などの照射された単球系細胞もしくは照射されていない単球系細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。
いくつかの実施形態では、本発明は、拡張された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を含み、拡張ＴＩＬ集団は、
（ａ）患者から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に付加することと、
（ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１１日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１１日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行が、系を開くことなく起こる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、系を開くことなく起こる、採取することと、
を含む方法によって取得可能な第３のＴＩＬ集団であり、ＡＰＣが、Ｒａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｕ９３７細胞、Ｔｈｐ１細胞、及びそれらの誘導体、バリアント、修飾、または子孫からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、拡張された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を含み、拡張ＴＩＬ集団は、
（ａ）患者から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に付加することと、
（ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１１日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１１日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行が、系を開くことなく起こる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、系を開くことなく起こる、採取することと、
を含む方法によって取得可能な第３のＴＩＬ集団であり、ＡＰＣが、Ｕ９３７もしくはＴｈｐ１細胞などの照射された単球系細胞もしくは照射されていない単球系細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。
いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を含む凍結保存された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を含み、凍結保存されたＴＩＬ組成物は、
（ａ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に付加することと、
（ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約７～１１日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、第２のＴＩＬ集団が、第１のＴＩＬ集団よりも数が少なくとも１０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１１日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行が、系を開くことなく起こる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、系を開くことなく起こる、採取することと、
（ｅ）ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行が、系を開くことなく起こる、移すことと、
（ｆ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの採取されたＴＩＬ集団を含む注入バッグを凍結保存して、凍結保存されたＴＩＬ組成物を取得することと、を含む方法によって産生され、
ＡＰＣが、Ｒａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｕ９３７細胞、Ｔｈｐ１細胞、及びそれらの誘導体、バリアント、修飾、または子孫からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を含む凍結保存された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を含み、凍結保存されたＴＩＬ組成物は、
（ａ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に付加することと、
（ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約７～１１日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、第２のＴＩＬ集団が、第１のＴＩＬ集団よりも数が少なくとも１０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１１日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行が、系を開くことなく起こる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、系を開くことなく起こる、採取することと、
（ｅ）ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行が、系を開くことなく起こる、移すことと、
（ｆ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの採取されたＴＩＬ集団を含む注入バッグを凍結保存して、凍結保存されたＴＩＬ組成物を取得することと、を含む方法によって産生され、
ＡＰＣが、Ｕ９３７もしくはＴｈｐ１細胞などの照射された単球系細胞もしくは照射されていない単球系細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。
いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する対象を治療するための方法であって、この方法は、
（ａ）対象から取得された腫瘍試料を腫瘍消化物に処理することによって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、
（ｂ）腫瘍消化物を閉鎖系に付加することと、
（ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１１日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１１日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行が、系を開くことなく起こる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された第３のＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、系を開くことなく起こる、採取することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）からの採取された第３のＴＩＬ集団を注入バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行が、系を開くことなく起こる、移すことと、
（ｇ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの採取されたＴＩＬ集団を含む注入バッグを凍結保存することと、
（ｈ）治療上有効な投与量の第３のＴＩＬ集団を、ステップ（ｇ）における注入バッグから対象に投与することと、を含む、拡張された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含み、
ＡＰＣが、Ｒａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｕ９３７細胞、Ｔｈｐ１細胞、及びそれらの誘導体、バリアント、修飾、または子孫からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する対象を治療するための方法であって、この方法は、
（ａ）対象から取得された腫瘍試料を腫瘍消化物に処理することによって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、
（ｂ）腫瘍消化物を閉鎖系に付加することと、
（ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１１日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１１日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行が、系を開くことなく起こる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された第３のＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、系を開くことなく起こる、採取することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）からの採取された第３のＴＩＬ集団を注入バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行が、系を開くことなく起こる、移すことと、
（ｇ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの採取されたＴＩＬ集団を含む注入バッグを凍結保存することと、
（ｈ）治療上有効な投与量の第３のＴＩＬ集団を、ステップ（ｇ）における注入バッグから対象に投与することと、を含む、拡張された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含み、
ＡＰＣが、Ｕ９３７もしくはＴｈｐ１細胞などの照射された単球系細胞もしくは照射されていない単球系細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。
いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する対象を治療するための方法であって、この方法は、
（ａ）患者から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に付加することと、
（ｃ）ＩＬ－２及び任意選択でＯＫＴ－３、ならびに任意選択で抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１４日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＡＰＣで補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約４～６日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行が、系を開くことなく起こる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｅ）第３のＴＩＬ集団を、ＴＩＬの第１の複数の２～５亜集団に分割することであって、少なくとも１．０×１０９個のＴＩＬが各亜集団に存在し、ステップ（ｄ）から（ｅ）への移行が、系を開くことなく起こる、分割することと、
（ｆ）任意選択で、各ＴＩＬ亜集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＡＰＣで補充することによって第１の複数のＴＩＬ亜集団の第３の拡張を行い、第２の複数のＴＩＬ亜集団を産生することであって、第３の拡張が、約５～７日間行われ、各亜集団の第３の拡張が、第３のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２の複数のＴＩＬ亜集団を産生することと、
（ｇ）ステップ（ｆ）から取得された第２の複数のＴＩＬ亜集団を採取することであって、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行が、系を開くことなく起こる、採取することと、
（ｈ）ステップ（ｇ）からの採取されたＴＩＬ亜集団を１つ以上の注入バッグに移すことであって、ステップ（ｇ）から（ｈ）への移行が、系を開くことなく起こる、移すことと、
（ｉ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｈ）からのＴＩＬの採取された亜集団を含む１つ以上の注入バッグを凍結保存することと、
（ｊ）治療上有効な投与量の採取されたＴＩＬ亜集団を、ステップ（ｉ）における１つ以上の注入バッグから対象に投与するステップと、を含む、拡張された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含み、
ＡＰＣが、Ｒａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｕ９３７細胞、Ｔｈｐ１細胞、及びそれらの誘導体、バリアント、修飾、または子孫からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する対象を治療するための方法であって、この方法は、
（ａ）患者から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に付加することと、
（ｃ）ＩＬ－２及び任意選択でＯＫＴ－３、ならびに任意選択で抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１４日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＡＰＣで補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約４～６日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行が、系を開くことなく起こる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、
（ｅ）第３のＴＩＬ集団を、ＴＩＬの第１の複数の２～５亜集団に分割することであって、少なくとも１．０×１０９個のＴＩＬが各亜集団に存在し、ステップ（ｄ）から（ｅ）への移行が、系を開くことなく起こる、分割することと、
（ｆ）任意選択で、各ＴＩＬ亜集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＡＰＣで補充することによって第１の複数のＴＩＬ亜集団の第３の拡張を行い、第２の複数のＴＩＬ亜集団を産生することであって、第３の拡張が、約５～７日間行われ、各亜集団の第３の拡張が、第３のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２の複数のＴＩＬ亜集団を産生することと、
（ｇ）ステップ（ｆ）から取得された第２の複数のＴＩＬ亜集団を採取することであって、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行が、系を開くことなく起こる、採取することと、
（ｈ）ステップ（ｇ）からの採取されたＴＩＬ亜集団を１つ以上の注入バッグに移すことであって、ステップ（ｇ）から（ｈ）への移行が、系を開くことなく起こる、移すことと、
（ｉ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｈ）からのＴＩＬの採取された亜集団を含む１つ以上の注入バッグを凍結保存することと、
（ｊ）治療上有効な投与量の採取されたＴＩＬ亜集団を、ステップ（ｉ）における１つ以上の注入バッグから対象に投与するステップと、を含む、拡張された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含み、
ＡＰＣが、Ｕ９３７もしくはＴｈｐ１細胞などの照射された単球系細胞もしくは照射されていない単球系細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫である。
ＶＩＩ．患者を治療する方法
治療方法は、最初のＴＩＬ収集及びＴＩＬの培養から始まる。かかる方法は両方とも、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２０１２，３５（３），２８３－２９２によって当該技術分野で説明されている。治療方法の実施形態は、実施例を含む以下の節全体に記載されている。
本明細書に記載の方法に従って、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また例えば、図１及びまたは図８に示されるように）産生された拡張ＴＩＬは、がんを有する患者の治療における特定の用途を見出す（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１６，３４（２０），２３８９－２３９、及び補足内容に記載される）。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、以前に記載されたように、転移性黒色腫の切除された沈着物から増殖された（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２００３，２６，３３２－３４２を参照）。新鮮な腫瘍は、滅菌条件下で解剖され得る。代表的な試料は、正式な病理学的分析のために収集され得る。２ｍｍ３～３ｍｍ３の単一断片が使用され得る。いくつかの実施形態では、患者当たり５、１０、１５、２０、２５、または３０個の試料が取得される。いくつかの実施形態では、患者当たり２０、２５、または３０個の試料が取得される。いくつかの実施形態では、患者当たり２０、２２、２４、２６、または２８個の試料が取得される。いくつかの実施形態では、患者当たり２４個の試料が取得される。試料は、２４ウェルプレートの個々のウェル内に配置され、高用量ＩＬ－２（６，０００ＩＵ／ｍＬ）を含む成長培地中で維持され、腫瘍の破壊及び／またはＴＩＬの増殖について監視され得る。処理後に生細胞が残っている腫瘍は、本明細書に記載されるように、単一細胞懸濁液中に酵素的に消化され、凍結保存され得る。
いくつかの実施形態では、成功裏に成長したＴＩＬは、表現型分析（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ５６）のためにサンプリングされ、利用可能な場合、自己腫瘍に対して試験され得る。一晩の共培養によりインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）レベルが２００ｐｇ／ｍＬを超え、バックグラウンドの２倍になった場合、ＴＩＬは反応性があるとみなされ得る。（Ｇｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２０１０，３３，８４０－８４７、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、自己反応性または十分な成長パターンの証拠を有する培養物は、急速拡張（ＲＥＰ）と称されることもある第２の拡張を含む、第２の拡張（例えば、図１及び／または図８のステップＤに従って提供される第２の拡張）のために選択され得る。いくつかの実施形態では、高い自己反応性（例えば、第２の拡張中の高い増殖）を有する拡張ＴＩＬが、追加の第２の拡張のために選択される。いくつかの実施形態では、高い自己反応性（例えば、図１及び／または図８のステップＤで提供されるような第２の拡張中の高い増殖）を有するＴＩＬが、図１及び／または図８のステップＤに従って、追加の第２の拡張のために選択される。
注入バッグＴＩＬの凍結保存試料の細胞表現型は、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７、及びＣＤ４５ＲＡ（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）のフローサイトメトリー（例えば、ＦｌｏｗＪｏ）、ならびに本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって分析され得る。血清サイトカインは、標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ技術を使用することにより測定された。血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、１００ｐｇ／ｍＬ超及び４ ３ベースラインレベルを超えると定義された。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法、例えば図１及び／または図８に例示される方法によって産生されるＴＩＬは、ＴＩＬの臨床効果の驚くべき改善を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法、例えば図１及び／または図８に例示される方法によって産生されるＴＩＬは、例えば、図１及び／または図８に例示されるもの以外の方法を含む、本明細書に記載されるもの以外の方法によって産生されるＴＩＬと比較して、増加した臨床効果を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるもの以外の方法は、プロセス１Ｃ及び／または第１世代（Ｇｅｎ１）と称される方法を含む。いくつかの実施形態では、増加した有効性は、ＤＣＲ、ＯＲＲ、及び／または他の臨床応答によって測定される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法、例えば図１に例示される方法によって産生されたＴＩＬは、例えば、図１及び／または図８に例示されるもの以外の方法、例えば、Ｇｅｎ１プロセスを含む、本明細書に記載されるもの以外の方法によって産生されたＴＩＬと比較して、同様の応答時間及び安全性プロファイルを示す。
いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）は、治療有効性及び／または増加した臨床的有効性を示す。いくつかの実施形態では、ＴＩＬで治療された対象の血液中のＩＦＮ－γは、活性なＴＩＬを示す。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ－γ産生は、細胞傷害能の別の尺度である。ＩＦＮ－γ産生は、例えば、図１及び／または図８に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬで治療された対象のエクスビボでの血液、血清、またはＴＩＬ中のサイトカインＩＦＮ－γのレベルを決定することによって測定することができる。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γの増加は、本発明の方法によって産生されたＴＩＬで治療された患者における治療有効性を示す。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図８に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、ＩＦＮ－γが１倍、２倍、３倍、４倍、または５倍以上増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図８に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図８に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、２倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図８に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、３倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図８に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、４倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図８に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、５倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットを使用して測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、例えば、図１及び／または図８に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬで治療された対象のエクスビボでのＴＩＬにおいて測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、例えば図１及び／または図８に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬで治療された対象の血液において測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、例えば、図１及び／または図８に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬで治療された対象の血清由来のＴＩＬにおいて測定される。
いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）は、治療有効性及び／または増加した臨床的有効性を示す。いくつかの実施形態では、ＴＩＬで治療された対象の血液中のＩＦＮ－γは、活性なＴＩＬを示す。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ－γ産生は、細胞傷害能の別の尺度である。ＩＦＮ－γ産生は、例えば、図１及び／または図８に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬで治療された対象の血液、血清、または他の組織中のサイトカインＩＦＮ－γのレベルを決定することによって測定することができる。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γの増加は、本発明の方法によって産生されたＴＩＬで治療された患者における治療有効性を示す。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図８に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、ＩＦＮ－γが１倍、２倍、３倍、４倍、または５倍以上増加する。
いくつかの実施形態では、例えば図１及び／または図８に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されるＴＩＬは、例えばプロセス１Ｃ法と称される方法を含む、図１及び／または図８に例示されていないものを含む他の方法によって産生されるＴＩＬと比較して、増加したポリクローン性を示す。いくつかの実施形態では、有意に改善されたポリクローン性及び／または増加したポリクローン性は、治療有効性及び／または増加した臨床的有効性を示す。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を指す。いくつかの実施形態では、ポリクローン性の増加は、本発明の方法によって産生されたＴＩＬの投与に関する治療有効性を示すことができる。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、例えば、図１及び／または図８に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、１倍、２倍、１０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図８に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図８に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、２倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図８に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１０倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図８に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１００倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図８に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、５００倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図８に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１０００倍増加する。
有効性の尺度には、当該技術分野で知られており、本明細書にも記載されている、疾患制御率（ＤＣＲ）ならびに全応答率（ＯＲＲ）が含まれ得る。
１．がん及び他の疾患を治療する方法
本明細書に記載の組成物及び方法は、疾患を治療するための方法で使用され得る。ある実施形態では、それらは、過剰増殖性障害の治療に使用するためのものである。それらは、本明細書及び以下の段落に記載される他の障害の治療にも使用され得る。
いくつかの実施形態では、過剰増殖性障害は、がんである。いくつかの実施形態では、過剰増殖性障害は、固形腫瘍がんである。いくつかの実施形態では、固形腫瘍がんは、肉腫、膵臓癌、肝臓癌、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、胃腸癌、黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、食道癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌、前立腺癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、過剰増殖性障害は、血液学的悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、固形腫瘍がんは、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、固形腫瘍癌は、肛門癌、膀胱癌、乳癌（トリプルネガティブ乳癌を含む）、骨癌、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって引き起こされるがん、中枢神経系関連癌（上衣腫、髄芽腫、神経芽腫、松果体芽腫、及び未分化神経外胚葉性腫瘍を含む）、子宮頸癌（扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、及び子宮頸部腺癌）、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、食道胃接合癌、胃癌、消火器癌、消化管間質腫瘍、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、下咽頭癌、喉頭癌、鼻咽頭癌、中咽頭癌、及び咽頭癌）、腎臓癌、肝臓癌、肺癌（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺癌）、黒色腫（ブドウ膜黒色腫、脈絡膜黒色腫、毛様体黒色腫、または虹彩黒色腫を含む）、中皮腫（悪性胸膜中皮腫を含む）、卵巣癌、膵臓癌（膵管腺癌を含む）、陰茎癌、直腸癌、腎癌、腎細胞癌、肉腫（ユーイング肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、ならびに他の骨及び軟部組織肉腫を含む）、甲状腺癌（未分化甲状腺癌を含む）、子宮癌、ならびに膣癌からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫である。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫ステージＩＩＢ～ＩＶである。
いくつかの実施形態では、本発明は、がんが黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌、または腎細胞癌である、がんを有する対象を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、及び胃腸癌である、がんを有する対象を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫である、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がんがＨＮＳＣＣである、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がんが子宮頸癌である、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がんがＮＳＣＬＣである、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がんが神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）である、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がんが胃腸癌である、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がんが高頻度変異癌である、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がんが小児高頻度変異癌である、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
いくつかの実施形態では、過剰増殖性障害は、血液学的悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、血液学的悪性腫瘍は、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明は、がん患者を治療する方法を含み、がんは、血液学的悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のＣＣＲを発現するように修飾されたＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬを使用して、がんを有する患者を治療する方法を含み、がんは、血液学的悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のＣＣＲを発現するように修飾されたＭＩＬまたはＰＢＬを使用して、がんを有する患者を治療する方法を含み、がんは、血液学的悪性腫瘍である。
いくつかの実施形態では、がんは、高頻度変異癌または高頻度変異癌の表現型である。高頻度変異癌は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２０１７，１７１，１０４２－１０５６（すべての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる）に広く記載されている。いくつかの実施形態では、高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり９～１０個の変異を含む。いくつかの実施形態では、小児高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり９．９１個の変異を含む。いくつかの実施形態では、成人高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり９個の変異を含む。いくつかの実施形態では、増強された高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり１０～１００個の変異を含む。いくつかの実施形態では、増強された小児高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり１０～１００個の変異を含む。いくつかの実施形態では、増強された成人高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり１０～１００個の変異を含む。いくつかの実施形態では、超高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり１００個を超える変異を含む。いくつかの実施形態では、小児超高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり１００個を超える変異を含む。いくつかの実施形態では、成人超高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり１００個を超える変異を含む。
いくつかの実施形態では、超変異腫瘍は、複製修復経路に変異を有する。いくつかの実施形態では、高頻度変異腫瘍は、複製修復関連ＤＮＡポリメラーゼに変異を有する。いくつかの実施形態では、高頻度変異腫瘍は、マイクロサテライト不安定性を有する。いくつかの実施形態では、超高頻度変異腫瘍は、複製修復関連ＤＮＡポリメラーゼに変異を有し、マイクロサテライト不安定性を有する。いくつかの実施形態では、腫瘍における高頻度変異は、免疫チェックポイント阻害剤への応答と相関している。いくつかの実施形態では、高頻度変異腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤での治療に対して耐性である。いくつかの実施形態では、高頻度変異腫瘍は、本発明のＴＩＬを使用して治療され得る。いくつかの実施形態では、腫瘍における高頻度変異は、環境要因（外因性曝露）によって引き起こされる。例えば、紫外線光は、悪性黒色腫における多数の変異の主な原因になる可能性がある（例えば、Ｐｆｅｉｆｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２００５，５７１，１９－３１、Ｓａｇｅ，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．１９９３，５７，１６３－１７４を参照）。いくつかの実施形態では、腫瘍における高頻度変異は、直接変異原曝露に起因する、肺腫瘍及び喉頭腫瘍、ならびに他の腫瘍の場合、タバコの煙中の６０を超える発がん物質によって引き起こされ得る（例えば、Ｐｌｅａｓａｎｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１０，４６３，１８４－１９０を参照）。いくつかの実施形態では、腫瘍における高頻度変異は、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーメンバーの調節不全によって引き起こされ、これは、広範囲のがんにおいてＣからＴへの移行のレベルの増加をもたらすことが示されている（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０１３，４５，９７０－９７６を参照）。いくつかの実施形態では、腫瘍における高頻度変異は、主要な複製酵素Ｐｏｌ３及びＰｏｌｄ１によって行われる校正を損なう変異によるＤＮＡ複製修復欠陥によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、腫瘍における高頻度変異は、結腸直腸癌、子宮内膜癌、及び他のがんにおける高頻度変異に関連するＤＮＡミスマッチ修復の欠陥によって引き起こされる（例えば、Ｋａｎｄｏｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１３，４９７，６７－７３、Ｍｕｚｎｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１２，４８７，３３０－３３７を参照）。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ複製修復変異は、構成的または二対立遺伝子ミスマッチ修復欠損症（ＣＭＭＲＤ）、リンチ症候群、及びポリメラーゼ校正関連ポリポーシス（ＰＰＡＰ）などのがん好発症候群にも見られる。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ集団でがんを治療する方法を含み、がんは、高頻度変異癌である。ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ集団でがんを治療する方法を含み、がんは、増強された高頻度変異癌である。ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ集団でがんを治療する方法を含み、がんは、超高頻度変異癌である。
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ集団でがんを治療する方法を含み、患者は、本開示によるＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前治療される。ある実施形態では、骨髄非破壊的化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）、ならびにフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日で５日間（ＴＩＬ注入の２７日前～２３日前）である。いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）、ならびにフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日で３日間（ＴＩＬ注入の２７日前～２５日前）である。いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）、続いてフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日で３日間（ＴＩＬ注入の２５日前～２３日前）である。ある実施形態では、本開示による骨髄非破壊的化学療法及びＴＩＬ注入（０日目）後、患者は、生理学的許容範囲まで８時間毎に７２０，０００ＩＵ／ｋｇでＩＬ－２の静脈内注入を受ける。
示される疾患または障害の治療、予防、及び／または管理における本明細書に記載の化合物及び化合物の組み合わせの有効性は、ヒト疾患の治療のためのガイダンスを提供する当技術分野で知られている様々なモデルを使用して試験され得る。例えば、卵巣癌の治療の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Ｍｕｌｌａｎｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２０１２，１５３，１５８５－９２、及びＦｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｖａｒｉａｎ Ｒｅｓ．２００９，２，１２に記載されている。膵臓癌の治療の有効性を決定するためのモデルは、Ｈｅｒｒｅｒｏｓ－Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１２，１８，１２８６－１２９４に記載されている。乳癌の治療の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Ｆａｎｔｏｚｚｉ，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６，８，２１２に記載されている。黒色腫の治療の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Ｄａｍｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ ＆ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ．２０１０，２３，８５３－８５９に記載されている。例えば、肺癌の治療の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Ｍｅｕｗｉｓｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００５，１９，６４３－６６４に記載されている。肺癌の治療の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Ｋｉｍ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ．２００９，２，５５－６０、及びＳａｎｏ，Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｏｎｃｏｌ．２００９，１，３２に記載されている。
いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）は、過剰増殖性障害治療の治療有効性を示す。いくつかの実施形態では、ＴＩＬで治療された対象の血液中のＩＦＮ－γは、活性なＴＩＬを示す。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ－γ産生は、細胞傷害能の別の尺度である。ＩＦＮ－γ産生は、例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に記載される方法を含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬで治療された対象の血液中のサイトカインＩＦＮ－γのレベルを決定することによって測定され得る。いくつかの実施形態では、本方法によって取得されたＴＩＬは、例示された図８（特に、例えば、図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）及び本明細書全体に例示されるようにＧｅｎ ３プロセスと呼ばれる方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された対象と比較して、本方法のＴＩＬで治療された対象の血液中のＩＦＮ－γの増加を提供する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γの増加は、本発明の方法によって産生されたＴＩＬで治療された患者における治療有効性を示す。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍、または５倍以上増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、２倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、３倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、４倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、５倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットを使用して測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットを使用して測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、本発明の方法によって産生されたＴＩＬで治療された患者由来のエクスビボでのＴＩＬ中で測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、本発明の方法によって産生されたＴＩＬで治療された患者由来の血液中で測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、本発明の方法によって産生されたＴＩＬで治療された患者由来の血清中で測定される。
いくつかの実施形態では、例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に記載される方法を含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬは、例えば、プロセス１Ｃ法と称される方法などの、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に例示されていないものを含む他の方法によって産生されたＴＩＬと比較して、増加したポリクローン性を示す。いくつかの実施形態では、有意に改善されたポリクローン性及び／または増加したポリクローン性は、がん治療に対する治療有効性及び／または増加した臨床的有効性を示す。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を指す。いくつかの実施形態では、ポリクローン性の増加は、本発明の方法によって産生されたＴＩＬの投与に関する治療有効性を示すことができる。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、１倍、２倍、１０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、２倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１０倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１００倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、５００倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図８（特に、例えば図８Ａ及び／または図８Ｂ及び／または図８Ｃ及び／または図８Ｄ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１０００倍増加する。
２．ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１阻害剤との併用
いくつかの実施形態では、がんを有する患者に提供されるＴＩＬ療法は、治療的ＴＩＬ集合単独による治療を含んでもよく、またはＴＩＬならびに１つ以上のＰＤ－１及び／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤を含む併用治療を含んでもよい。例えば、ＰＤ－１を標的とし、本発明のＴＩＬとともに同時投与され得る抗体としては、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、ペムブロリズマブ（ラムブロリズマブ、ＭＫ０３４７５またはＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ＪＳ００１（ＳｈａｎｇＨａｉ ＪｕｎＳｈｉ）、モノクローナル抗ＰＤ－１抗体ＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ，Ｉｎｃ．）、ピジリズマブ（抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＣＴ－０１１、Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体ＢＧＢ－Ａ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ）、及び／または抗ＰＤ－１抗体ＳＨＲ－１２１０（ＳｈａｎｇＨａｉ ＨｅｎｇＲｕｉ）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ－１１０６（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、及び／またはヒト化抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１抗体は、クローン：ＲＭＰ１－１４（ラットＩｇＧ）－ＢｉｏＸｃｅｌｌカタログ番号ＢＰ０１４６である。本明細書に記載のステップＡ～Ｆに従って産生されたＴＩＬとの同時投与方法における使用に好適な他の好適な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，００８，４４９号に開示される抗ＰＤ－１抗体である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ－１との相互作用を阻害し、それにより、免疫活性を増加させる。ＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を破壊し、かつ抗腫瘍免疫応答を刺激する当該技術分野で知られているいずれの抗体も、本明細書に記載のステップＡ～Ｆに従って産生されたＴＩＬとの同時投与方法における使用に好適である。例えば、ＰＤ－Ｌ１を標的とし、かつ臨床試験中である抗体には、ＢＭＳ－９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）及びＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が含まれる。ＰＤ－Ｌ１を標的とする他の好適な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，９４３，７４３号に開示されている。ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を破壊し、かつ抗腫瘍免疫応答を刺激するいずれの抗体も、本明細書に記載のステップＡ～Ｆに従って産生されたＴＩＬとの同時投与方法における使用に好適であることが当業者に理解されるであろう。いくつかの実施形態では、ステップＡ～Ｆに従って産生されたＴＩＬの組み合わせを投与された対象は、患者が抗ＰＤ－１抗体単独の投与に不応性であるがん型を有する場合、抗ＰＤ－１抗体と同時投与される。いくつかの実施形態では、患者が不応性黒色腫を有する場合、患者は、ＴＩＬを抗ＰＤ－１と組み合わせて投与される。
プログラム死１（ＰＤ－１）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、活性化単球、及び樹状細胞によって発現される２８８アミノ酸の膜貫通免疫チェックポイント受容体タンパク質である。ＣＤ２７９としても知られるＰＤ－１は、ＣＤ２８ファミリーに属し、ヒトでは第２染色体上のＰｄｃｄ１遺伝子によってコードされる。ＰＤ－１は、１つの免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリードメイン、膜貫通領域、ならびに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む細胞内ドメインからなる。ＰＤ－１とそのリガンド（ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２）は、Ｋｅｉｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，２６，６７７－７０４に記載されるように、免疫寛容において重要な役割を果たすことが知られている。ＰＤ－１は、Ｔ細胞の免疫応答を負に調節する阻害シグナルを提供する。ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１またはＣＤ２７４としても知られる）及びＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣまたはＣＤ２７３としても知られる）は、腫瘍細胞及び間質細胞上に発現され、ＰＤ－１を発現する活性化Ｔ細胞が遭遇する可能性があり、Ｔ細胞の免疫抑制につながる。ＰＤ－Ｌ１は、ヒト第９染色体上のＣｄ２７４遺伝子によってコードされる２９０アミノ酸の膜貫通タンパク質である。例えば、Ｔｏｐａｌｉａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１２，３６６，２４４３－５４に記載される最近の臨床研究で実証されているように、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、及び／またはＰＤ－Ｌ２阻害剤の使用による、ＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２との間の相互作用をブロックすることで、免疫抵抗を克服することができる。ＰＤ－Ｌ１は、多くの腫瘍細胞株上で発現されるが、ＰＤ－Ｌ２は、主に樹状細胞及びいくつかの腫瘍株上で発現される発現される。Ｔ細胞（活性化後にＰＤ－１を誘導的に発現する）に加えて、ＰＤ－１は、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、活性化単球、樹状細胞上でも発現される。
実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、当該技術分野で知られている任意のＰＤ－１阻害剤またはＰＤ－１遮断薬であり得る。特に、次の段落でより詳細に記載されるＰＤ－１阻害剤または遮断剤のうちの１つである。「阻害剤」、「アンタゴニスト」、及び「遮断剤」という用語は、本明細書では、ＰＤ－１阻害剤に関して互換的に使用される。誤解を避けるために、抗体であるＰＤ－１阻害剤への本明細書での言及は、化合物またはその抗原結合断片、バリアント、コンジュゲート、もしくはバイオシミラーを指し得る。誤解を避けるために、ＰＤ－１阻害剤への本明細書での言及はまた、小分子化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物、水和物、共結晶、もしくはプロドラッグを指し得る。
好ましい実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、抗体（すなわち、抗ＰＤ－１抗体）、Ｆａｂ断片を含むその断片、またはその一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ポリクローナル抗体である。好ましい実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１との結合について競合し、及び／またはＰＤ－１上のエピトープに結合する。ある実施形態では、抗体は、ＰＤ－１との結合について競合し、かつ／またはＰＤ－１上のエピトープに結合する。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ヒトＰＤ－１に約１００ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に約９０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に約８０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に約７０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に約６０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に約５０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に約４０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に約３０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に約２０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に約１０ｐＭ以下のＫＤで結合する、またはヒトＰＤ－１に約１ｐＭ以下のＫＤで結合するものである。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ヒトＰＤ－１に約７．５×１０５ｌ／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約７．５×１０５ｌ／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約８×１０５ｌ／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約８．５×１０５ｌ／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約９×１０５ｌ／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約９．５×１０５ｌ／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、またはヒトＰＤ－１に約１×１０６ｌ／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合するものである。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ヒトＰＤ－１に約２×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約２．１×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約２．２×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約２．３×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約２．４×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約２．５×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約２．６×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、またはヒトＰＤ－１に約２．７×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約２．８×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約２．９×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、またはヒトＰＤ－１に約３×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合するものである。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、約１０ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約９ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約８ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約７ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約６ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約５ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約４ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約３ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約２ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、または約１ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害するものである。
ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ．からＯＰＤＩＶＯとして市販されている）、またはそれらのバイオシミラー、抗原結合断片、コンジュゲート、もしくは多様体である。ニボルマブは、ＰＤ－１受容体を遮断する完全ヒトＩｇＧ４抗体である。ある実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、免疫グロブリンＧ４κ、抗（ヒトＣＤ２７４）抗体である。ニボルマブには、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＡＳ）登録番号９４６４１４－９４－４が割り当てられており、５Ｃ４、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、及びＯＮＯ－４５３８としても知られている。ニボルマブの調製及び特性は、米国特許第８，００８，４４９号及び国際特許公開第ＷＯ２００６／１２１１６８号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。様々な形態のがんにおけるニボルマブの臨床的安全性及び有効性は、Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２０１４，２，８４６－５６、Ｐａｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，２０１４，６５，１８５－２０２、及びＷｅｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１３，３１，４３１１－４３１８に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。ニボルマブのアミノ酸配列を表１８に示す。ニボルマブは、２２－９６、１４０－１９６、２５４－３１４、３６０－４１８、２２’’－９６’’、１４０’’－１９６’’、２５４’’－３１４’’、及び３６０’’－４１８’’における重鎖内ジスルフィド結合；２３’－８８’、１３４’－１９４’、２３’’’－８８’’’、及び１３４’’’－１９４’’’における軽鎖内ジスルフィド結合；１２７－２１４’、１２７’’－２１４’’’における重鎖－軽鎖間ジスルフィド結合；２１９－２１９’’及び２２２－２２２’’における重鎖－重鎖間ジスルフィド結合；ならびに２９０、２９０’’におけるＮ－グリコシル化部位（Ｈ ＣＨ２ ８４．４）を有する。
ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、配列番号１５８によって与えられる重鎖及び配列番号１５９によって与えられる軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ、配列番号１５８及び配列番号１５９に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、多様体、もしくはコンジュゲートを含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１５８及び配列番号１５９に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１５８及び配列番号１５９に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１５８及び配列番号１５９に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１５８及び配列番号１５９に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号４６３及び配列番号１５９に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１６０に示される配列を含み、ＰＤ－１阻害剤軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号１６１に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６０及び配列番号１６１に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６０及び配列番号１６１に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６０及び配列番号１６１に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６０及び配列番号１６１に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６０及び配列番号１６１に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ、配列番号１６２、配列番号１６３、及び配列番号１６４に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号１６５、配列番号１６６、及び配列番号１６７に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。ある実施形態では、抗体は、前述の抗体のうちのいずれかと結合するために競合し、かつ／またはＰＤ－１上の同じエピトープに結合する。
ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブに関して薬物規制当局によって承認された抗ＰＤ－１バイオシミラーモノクローナル抗体である。ある実施形態では、バイオシミラーは、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照医薬品または参照バイオ製品と比較して、１つ以上の翻訳後修飾を含む、ＰＤ－１抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、ニボルマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可された、または認可のために提出された抗ＰＤ－１抗体であり、抗ＰＤ－１抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、ニボルマブである。抗ＰＤ－１抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ニボルマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ニボルマブである。
Figure 2024512029000022
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブまたはそのバイオシミラーであり、ニボルマブは、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブまたはそのバイオシミラーであり、ニボルマブは、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブまたはそのバイオシミラーであり、ニボルマブは、約２００ｍｇ～約５００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブまたはそのバイオシミラーであり、ニボルマブは、約２００ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４８０ｍｇ、または約５００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブまたはそのバイオシミラーであり、ニボルマブは、２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎、または６週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ニボルマブは、切除不能または転移性黒色腫を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、切除不能または転移性黒色腫を治療するために投与され、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、切除不能または転移性黒色腫を治療するために投与され、４週間毎に約４８０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、切除不能または転移性黒色腫を治療するために、約１ｍｇ／ｋｇで投与され、続いて同じ日にイピリムマブ３ｍｇ／ｋｇを３週間毎に４用量、次いで２４０ｍｇを２週間毎、または４８０ｍｇを４週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ニボルマブは、黒色腫のアジュバント治療のために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、黒色腫のアジュバント治療のために、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、黒色腫のアジュバント治療のために、４週間毎に約４８０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ニボルマブは、転移性非小細胞肺癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、転移性非小細胞肺癌を治療するために、２週間毎に約３ｍｇ／ｋｇで、６週間毎に１ｍｇ／ｋｇのイピリムマブとともに投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、転移性非小細胞肺癌を治療するために、３週間毎に約３６０ｍｇで、６週間毎に１ｍｇ／ｋｇのイピリムマブ及び２サイクルのプラチナダブレット化学療法とともに投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、転移性非小細胞肺癌を治療するために、２週間毎に約２４０ｍｇまたは４週間毎に４８０ｍｇ投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ニボルマブは、小細胞肺癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、小細胞肺癌を治療するために、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ニボルマブは、悪性胸膜中皮腫を治療するために、３週間毎に約３６０ｍｇで、６週間毎に１ｍｇ／ｋｇのイピリムマブとともに投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ニボルマブは、進行性腎細胞癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、進行性腎細胞癌を治療するために、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、進行性腎細胞癌を治療するために、４週間毎に約４８０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、進行性腎細胞癌を治療するために、約３ｍｇ／ｋｇで投与され、続いて同じ日にイピリムマブ約１ｍｇ／ｋｇを３週間毎に４用量、次いで２４０ｍｇを２週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、進行性腎細胞癌を治療するために、約３ｍｇ／ｋｇで投与され、続いて同じ日にイピリムマブ約１ｍｇ／ｋｇを３週間毎に４用量、次いで２４０ｍｇを２週間毎、４８０ｍｇを４週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ニボルマブは、古典的ホジキンリンパ腫を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、古典的ホジキンリンパ腫を治療するために、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、古典的ホジキンリンパ腫を治療するために、４週間毎に約４８０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ニボルマブは、頭頸部の再発性または転移性扁平上皮癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、頭頸部の再発性または転移性扁平上皮癌を治療するために、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、頭頸部の再発性または転移性扁平上皮癌を治療するために、４週間毎に約４８０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ニボルマブは、局所進行性または転移性尿路上皮癌を治療するために、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、局所進行性または転移性尿路上皮癌を治療するために、４週間毎に約４８０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ニボルマブは、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、成人及び小児患者における高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、４０ｋｇ以上の成人及び小児患者における高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌を治療するために、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、４０ｋｇ以上の成人及び小児患者における高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌を治療するために、４週間毎に約４８０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ニボルマブは、４０ｋｇ未満の小児患者における高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌を治療するために、２週間毎に約３ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、４０ｋｇ以上の成人及び小児患者における高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌を治療するために、約３ｍｇ／ｋｇで投与され、続いて同じ日にイピリムマブ１ｍｇ／ｋｇを３週間毎に４用量、次いで２４０ｍｇを２週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、４０ｋｇ以上の成人及び小児患者における高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌を治療するために、約３ｍｇ／ｋｇで投与され、続いて同じ日にイピリムマブ１ｍｇ／ｋｇを３週間毎に４用量、次いで４８０ｍｇを４週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ニボルマブは、肝細胞癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、肝細胞癌を治療するために、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、肝細胞癌を治療するために、４週間毎に約４８０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、肝細胞癌を治療するために、約１ｍｇ／ｋｇで投与され、続いて同じ日にイピリムマブ３ｍｇ／ｋｇを３週間毎に４用量、次いで２４０ｍｇを２週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、肝細胞癌を治療するために、約１ｍｇ／ｋｇで投与され、続いて同じ日にイピリムマブ３ｍｇ／ｋｇを３週間毎に４用量、次いで４８０ｍｇを４週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ニボルマブは、食道扁平上皮癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、食道扁平上皮癌を治療するために、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、食道扁平上皮癌を治療するために、４週間毎に約４８０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
別の実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ，ＵＳＡ）からＫＥＹＴＲＵＤＡとして市販されている）、またはそれらの抗原結合断片、コンジュゲート、もしくは多様体を含む。ペムブロリズマブには、ＣＡＳ登録番号１３７４８５３－９１－４が割り当てられており、ラムブロリズマブ、ＭＫ－３４７５、及びＳＣＨ－９００４７５としても知られている。ペムブロリズマブは、免疫グロブリンＧ４、抗（ヒトタンパク質ＰＤＣＤ１（プログラム細胞死１））（ヒト－ハツカネズミモノクローナル重鎖）、ヒト－ハツカネズミモノクローナル軽鎖、二量体構造を有するジスルフィドを有する。ペムブロリズマブの構造は、免疫グロブリンＧ４、抗（ヒトプログラム細胞死１）；ヒト化マウスモノクローナルκ軽鎖二量体（２２６－２２６’’：２２９－２２９’’）－ビスジスルフィドを有するヒト化マウスモノクローナル［２２８－Ｌ－プロリン（Ｈ１０－Ｓ＞Ｐ）］γ４重鎖（１３４－２１８’）－ジスルフィドとしても記載され得る。ペムブロリズマブの特性、使用、及び調製は、国際特許公開第ＷＯ２００８／１５６７１２Ａ１号、米国特許第８，３５４，５０９号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１０／０２６６６１７Ａ１号、同第ＵＳ２０１３／０１０８６５１Ａ１号、及び同第ＵＳ２０１３／０１０９８４３Ａ２に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。様々な形態のがんにおけるペムブロリズマブの臨床的安全性及び有効性は、Ｆｕｅｒｓｔ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｔｉｍｅｓ，２０１４，３６，３５－３６、Ｒｏｂｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２０１４，３８４，１１０９－１７、及びＴｈｏｍａｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０１４，１４，１０６１－１０６４に記載されている。ペムブロリズマブのアミノ酸配列を表１９に示す。ペムブロリズマブは、ジスルフィド架橋：２２－９６、２２’’－９６’’、２３’－９２’、２３’’’－９２’’’、１３４－２１８’、１３４’’－２１８’’’、１３８’－１９８’、１３８’’’－１９８’’’、１４７－２０３、１４７’’－２０３’’、２２６－２２６’’、２２９－２２９’’、２６１－３２１、２６１’’－３２１’’、３６７－４２５、及び３６７’’－４２５’’、ならびにグリコシル化部位（Ｎ）：Ａｓｎ－２９７及びＡｓｎ－２９７’’を含む。ペムブロリズマブは、Ｆｃ領域に安定化Ｓ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４／カッパアイソタイプであり、この変異をＩｇＧ４ヒンジ領域に挿入すると、ＩｇＧ４抗体で典型的に観察される半分子の形成が防止される。ペムブロリズマブは、各重鎖のＦｃドメイン内のＡｓｎ２９７で不均一にグリコシル化されており、無傷の抗体の分子量はおよそ１４９ｋＤａになる。ペムブロリズマブの優性グリコフォームは、フコシル化アガラクト二分性グリカンフォーム（Ｇ０Ｆ）である。
ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、配列番号１６８によって与えられる重鎖及び配列番号１６９によって与えられる軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ、配列番号１６８及び配列番号１６９に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、多様体、もしくはコンジュゲートを含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６８及び配列番号１６９に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６８及び配列番号１６９に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６８及び配列番号１６９に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６８及び配列番号１６９に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６８及び配列番号１６９に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１７０に示される配列を含み、ＰＤ－１阻害剤軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号１７１に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７０及び配列番号１７１に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７０及び配列番号１７１に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７０及び配列番号１７１に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７０及び配列番号１７１に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７０及び配列番号１７１に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ、配列番号１７２、配列番号１７３、及び配列番号１７４に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号１７５、配列番号１７６、及び配列番号１７７に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。ある実施形態では、抗体は、前述の抗体のうちのいずれかと結合するために競合し、かつ／またはＰＤ－１上の同じエピトープに結合する。
ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブに関して薬物規制当局によって承認された抗ＰＤ－１バイオシミラーモノクローナル抗体である。ある実施形態では、バイオシミラーは、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照医薬品または参照バイオ製品と比較して、１つ以上の翻訳後修飾を含む、ＰＤ－１抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、ペムブロリズマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可された、または認可のために提出された抗ＰＤ－１抗体であり、抗ＰＤ－１抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、ペムブロリズマブである。抗ＰＤ－１抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ペムブロリズマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ペムブロリズマブである。
Figure 2024512029000023
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブまたはそのバイオシミラーであり、ペムブロリズマブは、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブまたはそのバイオシミラーであり、ペムブロリズマブは、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブまたはそのバイオシミラーであり、ペムブロリズマブは、約２００ｍｇ～約５００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブまたはそのバイオシミラーであり、ニボルマブは、約２００ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４８０ｍｇ、または約５００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブまたはそのバイオシミラーであり、ペムブロリズマブは、２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎、または６週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、黒色腫を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、黒色腫を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、黒色腫を治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＮＳＣＬＣを治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＮＳＣＬＣを治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＮＳＣＬＣを治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＳＣＬＣを治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＳＣＬＣを治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＨＮＳＣＣを治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＨＮＳＣＣを治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）または縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）または縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）を治療するために、成人に対して６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）または縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）を治療するために、小児に対して３週間毎に約２ｍｇ／ｋｇ（最大２００ｍｇ）で投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、尿路上皮癌を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、尿路上皮癌を治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）癌を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＭＳＩ－ＨまたはｄＭＭＲ癌を治療するために、成人の場合、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＭＳＩ－ＨまたはｄＭＭＲ癌を治療するために、小児の場合、３週間毎に約２ｍｇ／ｋｇ（最大２００ｍｇ）で投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復欠損結腸直腸癌（ｄＭＭＲ ＣＲＣを治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＭＳＩ－ＨまたはｄＭＭＲ ＣＲＣを治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、胃癌を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、胃癌を治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、食道癌を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、食道癌を治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、子宮頸癌を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、子宮頸癌を治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、肝細胞癌（ＨＣＣ）を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＨＣＣを治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）を治療するために、成人の場合、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＭＣＣを治療するために、成人の場合、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＭＣＣを治療するために、小児の場合、３週間毎に約２ｍｇ／ｋｇ（最大２００ｍｇ）で投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、腎細胞癌（ＲＣＣ）を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＲＣＣを治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで、経口で１日２回のアキシチニブ５ｍｇとともに投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、子宮内膜癌を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、子宮内膜癌を治療するために、ＭＳＩ－ＨまたはｄＭＭＲではない腫瘍に対して、６週間毎に約４００ｍｇで、２０ｍｇのレンバチニブとともに１日１回で経口投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、高遺伝子変異量（ＴＭＢ－Ｈ）癌を治療するために、成人の場合、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＴＭＢ－Ｈ癌を治療するために、成人の場合、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＴＭＢ－Ｈ癌を治療するために、小児の場合、３週間毎に約２ｍｇ／ｋｇ（最大２００ｍｇ）で投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、皮膚扁平上皮癌（ｃＳＣＣ）を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ｃＳＣＣを治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＴＮＢＣを治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
ある実施形態では、患者または対象が成人である場合、すなわち、成人適応症の治療、及び６週間毎の４００ｍｇの追加の投薬レジメンが用いられ得る。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。
ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤または抗ＰＤ－１抗体は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．から市販されている、セミプリマブ、またはその断片、バリアント、コンジュゲート、もしくはバイオシミラーである。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤または抗ＰＤ－１抗体は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＧ ａｎｄ Ｂｅｉｇｅｎｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から市販されている、チスレリズマブ、またはその断片、バリアント、コンジュゲート、もしくはバイオシミラーである。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤または抗ＰＤ－１抗体は、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．から市販されている、シンチリマブ、またはその断片、バリアント、コンジュゲート、もしくはバイオシミラーである。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤または抗ＰＤ－１抗体は、Ｊｕｎｓｈｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．及びＣｏｈｅｒｕｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から市販されている、トリパリマブ、またはその断片、バリアント、コンジュゲート、もしくはバイオシミラーである。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤または抗ＰＤ－１抗体は、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ｐｌｃ．から市販されている、ドスタルリマブ、またはその断片、バリアント、コンジュゲート、もしくはバイオシミラーである。
ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、抗ｍ－ＰＤ－１クローンＪ４３（カタログ番号ＢＥ００３３－２）及びＲＭＰ１－１４（カタログ番号ＢＥ０１４６）（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ，ＵＳＡ）などの市販の抗ＰＤ－１モノクローナル抗体である。いくつかの市販の抗ＰＤ－１抗体が、当業者に知られている。
ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、米国特許第８，３５４，５０９号または米国特許出願公開第２０１０／０２６６６１７Ａ１号、同第２０１３／０１０８６５１Ａ１号、同第２０１３／０１０９８４３Ａ２号に開示されている抗体であり、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、米国特許第８，２８７，８５６号、同第８，５８０，２４７号、及び同第８，１６８，７５７号、ならびに米国特許出願公開第２００９／００２８８５７Ａ１号、同第２０１０／０２８５０１３Ａ１号、同第２０１３／００２２６００Ａ１号、及び同第２０１１／０００８３６９Ａ１号に記載されている抗ＰＤ－１抗体であり、それらの教示は参照により本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、米国特許第８，７３５，５５３Ｂ１号に開示されている抗ＰＤ－１抗体であり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ＣＴ－０１１としても知られるピジリズマブであり、これは米国特許第８，６８６，１１９号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、米国特許第８，９０７，０５３号、同第９，０９６，６４２号、及び同第９，０４４，４４２号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／００８７５８１号に記載されるものなどの小分子またはペプチドもしくはペプチド誘導体；米国特許出願公開第２０１５／００７３０２４号に記載されるものなどの１，２，４－オキサジアゾール化合物及び誘導体；米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／００７３０４２号に記載されるものなどの環状ペプチド模倣化合物及び誘導体；米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０１２５４９１号に記載されるものなどの環状化合物及び誘導体；国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／０３３３０１号に記載されるものなどの１，３，４－オキサジアゾール及び１，３，４－チアジアゾール化合物ならびに誘導体；国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／０３６９２７号及びＷＯ２０１５／０４４９０号に記載されるものなどのペプチド系化合物及び誘導体、または米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０２９４８９８号に記載されるものなどの大環状ペプチド系化合物及び誘導体であり得、各々の開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．から市販されている、セミプリマブである。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＧ及びＢｅｉｇｅｎｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能である、チスレリズマブである。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．から入手可能である、シンチリマブである。ある実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、Ｊｕｎｓｈｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．及びＣｏｈｅｒｕｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能である、トリパリマブである。
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、当該技術分野で知られている任意のＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２阻害剤、アンタゴニスト、または遮断薬であり得る。特に、次の段落でより詳細に記載されるＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２阻害剤、アンタゴニスト、または遮断剤のうちの１つである。「阻害剤」、「アンタゴニスト」、及び「遮断剤」という用語は、本明細書では、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２阻害剤に関して交換可能に使用される。誤解を避けるために、抗体であるＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２阻害剤への本明細書での言及は、化合物またはその抗原結合断片、バリアント、コンジュゲート、もしくはバイオシミラーを指し得る。誤解を避けるために、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２阻害剤への本明細書での言及は、化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物、水和物、共結晶、もしくはプロドラッグを指し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物、プロセス、及び方法は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、小分子である。好ましい実施形態では、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、抗体（すなわち、抗ＰＤ－１抗体）、Ｆａｂ断片を含むその断片、またはその一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ポリクローナル抗体である。好ましい実施形態では、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２との結合について競合し、及び／またはＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２上のエピトープに結合する。ある実施形態では、抗体は、ＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２との結合について競合し、かつ／またはＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２上のエピトープに結合する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＰＤ－Ｌ１阻害剤は、化合物が、ＰＤ－Ｌ２受容体を含む他の受容体と結合または相互作用するよりも実質的に低い濃度でＰＤ－Ｌ１と結合または相互作用するという点で、ＰＤ－Ｌ１に対して選択的である。特定の実施形態では、化合物は、ＰＤ－Ｌ２受容体に対するより少なくとも約２倍高い濃度、約３倍高い濃度、約５倍高い濃度、約１０倍高い濃度、約２０倍高い濃度、約３０倍高い濃度、約５０倍高い濃度、約１００倍高い濃度、約２００倍高い濃度、約３００倍高い濃度、または約５００倍高い濃度である結合定数でＰＤ－Ｌ１受容体に結合する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＰＤ－Ｌ２阻害剤は、化合物が、ＰＤ－Ｌ１受容体を含む他の受容体と結合または相互作用するよりも実質的に低い濃度でＰＤ－Ｌ２と結合または相互作用するという点で、ＰＤ－Ｌ２に対して選択的である。特定の実施形態では、化合物は、ＰＤ－Ｌ１受容体に対するより少なくとも約２倍高い濃度、約３倍高い濃度、約５倍高い濃度、約１０倍高い濃度、約２０倍高い濃度、約３０倍高い濃度、約５０倍高い濃度、約１００倍高い濃度、約２００倍高い濃度、約３００倍高い濃度、または約５００倍高い濃度である結合定数でＰＤ－Ｌ２受容体に結合する。
いかなる理論にも縛られることなく、腫瘍細胞はＰＤ－Ｌ１を発現し、Ｔ細胞はＰＤ－１を発現すると考えられている。しかしながら、腫瘍細胞によるＰＤ－Ｌ１の発現は、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１の阻害剤または遮断剤の有効性には必要とされない。ある実施形態では、腫瘍細胞は、ＰＤ－Ｌ１を発現する。別の実施形態では、腫瘍細胞は、ＰＤ－Ｌ１を発現しない。いくつかの実施形態では、方法は、ＴＩＬと組み合わせて、本明細書に記載されるものなどのＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１抗体の組み合わせを含むことができる。ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１抗体とＴＩＬとの組み合わせの投与は、同時または連続的であり得る。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約１００ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約９０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約８０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約７０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約６０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約５０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約４０ｐＭ以下のＫＤで結合する、またはヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約３０ｐＭ以下のＫＤで結合するものである。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約７．５×１０５ｌ／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約８×１０５ｌ／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約８．５×１０５ｌ／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約９×１０５ｌ／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約９．５×１０５ｌ／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合する、またはヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約１×１０６ｌ／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃで結合するものである。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ヒトＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２に約２×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約２．１×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約２．２×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約２．３×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約２．４×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約２．５×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約２．６×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ１に約２．７×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、またはヒトＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２に約３×１０－５ｌ／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合するものである。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、約１０ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約９ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約８ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約７ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約６ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約５ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約４ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約３ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約２ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、または約１ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断するものである。
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＭＥＤＩ４７３６としても知られるデュルバルマブ（これは、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ｐｌｃ．の子会社であるＭｅｄｉｍｍｕｎｅ，ＬＬＣ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から市販されている）、またはその抗原結合断片、コンジュゲート、もしくは多様体である。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、米国特許第８，７７９，１０８号または米国特許出願公開第２０１３／００３４５５９号に開示されている抗体であり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。デュルバルマブの臨床的有効性は、Ｐａｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，２０１４，６５，１８５－２０２、Ｂｒａｈｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１４，３２，５ｓ（補足、要約８０２１）、及びＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｖ．，２０１４，４０，１０５６－６４に記載されている。デュルバルマブの調製及び特性は、米国特許第８，７７９，１０８号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。デュルバルマブのアミノ酸配列を表２０に示す。デュルバルマブモノクローナル抗体は、２２－９６、２２’’－９６’’、２３’－８９’、２３’’’－８９’’’、１３５’－１９５’、１３５’’’－１９５’’’、１４８－２０４、１４８’’－２０４’’、２１５’－２２４、２１５’’’－２２４’’’、２３０－２３０’’、２３３－２３３’’、２６５－３２５、２６５’’－３２５’’、３７１－４２９、及び３７１’’－４２９’におけるジスルフィド結合、ならびにＡｓｎ－３０１及びＡｓｎ－３０１’’におけるＮ－グリコシル化部位を含む。
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、配列番号１７８によって与えられる重鎖及び配列番号１７９によって与えられる軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ、配列番号１７８及び配列番号１７９に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、多様体、もしくはコンジュゲートを含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７８及び配列番号１７９に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７８及び配列番号１７９に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７８及び配列番号１７９に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７８及び配列番号１７９に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７８及び配列番号１７９に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、デュルバルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１８０に示される配列を含み、ＰＤ－Ｌ１阻害剤軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号１８１に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８０及び配列番号１８１に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８０及び配列番号１８１に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８０及び配列番号１８１に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８０及び配列番号１８１に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８０及び配列番号１８１に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ、配列番号１８２、配列番号１８３、及び配列番号１８４に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号１８５、配列番号１８６、及び配列番号１８７に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。ある実施形態では、抗体は、前述の抗体のうちのいずれかと結合するために競合し、かつ／またはＰＤ－Ｌ１上の同じエピトープに結合する。
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ペムブロリズマブに関して薬物規制当局によって承認された抗ＰＤ－Ｌ１バイオシミラーモノクローナル抗体である。ある実施形態では、バイオシミラーは、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照医薬品または参照バイオ製品と比較して、１つ以上の翻訳後修飾を含む、ＰＤ－Ｌ１抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、デュルバルマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可された、または認可のために提出された抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、デュルバルマブである。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、デュルバルマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、デュルバルマブである。
Figure 2024512029000024
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ／ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏから市販されている）としても知られるアベルマブ、またはその抗原結合断片、コンジュゲート、もしくは多様体である。アベルマブの調製及び特性は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０３４１９１７Ａ１号に記載されており、その開示は参照により本明細書に具体的に組み込まれる。アベルマブのアミノ酸配列を表２１に示す。アベルマブは、２２－９６、１４７－２０３、２６４－３２４、３７０－４２８、２２’’－９６’’、１４７’’－２０３’’、２６４’’－３２４’’、及び３７０’’－４２８’’における重鎖内ジスルフィド結合（Ｃ２３－Ｃ１０４）；２２’－９０’、１３８’－１９７’、２２’’’－９０’’’、及び１３８’’’－１９７’’’における軽鎖内ジスルフィド結合（Ｃ２３－Ｃ１０４）；２２３－２１５’及び２２３’’－２１５’’’における重鎖－軽鎖内ジスルフィド結合（ｈ５－ＣＬ１２６）；２２９－２２９’’及び２３２－２３２’’における重鎖－重鎖内ジスルフィド結合（ｈ１１、ｈ１４）；３００、３００’’におけるＮ－グリコシル化部位（Ｈ ＣＨ２ Ｎ８４．４）；フコシル化複合体二分性ＣＨＯ型グリカン；ならびに４５０及び４５０’におけるＨ ＣＨＳ Ｋ２ Ｃ末端リジンクリッピングを有する。
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、配列番号１８８によって与えられる重鎖及び配列番号１８９によって与えられる軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ、配列番号１８８及び配列番号１８９に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、多様体、もしくはコンジュゲートを含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８８及び配列番号１８９に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８８及び配列番号１８９に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８８及び配列番号１８９に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８８及び配列番号１８９に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８８及び配列番号１８９に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、アベルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１９０に示される配列を含み、ＰＤ－Ｌ１阻害剤軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号１９１に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９０及び配列番号１９１に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９０及び配列番号１９１に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９０及び配列番号１９１に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９０及び配列番号１９１に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９０及び配列番号１９１に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ、配列番号１９２、配列番号１９３、及び配列番号１９４に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号１９５、配列番号１９６、及び配列番号１９７に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。ある実施形態では、抗体は、前述の抗体のうちのいずれかと結合するために競合し、かつ／またはＰＤ－Ｌ１上の同じエピトープに結合する。
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、アベルマブに関して薬物規制当局によって承認された抗ＰＤ－Ｌ１バイオシミラーモノクローナル抗体である。ある実施形態では、バイオシミラーは、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照医薬品または参照バイオ製品と比較して、１つ以上の翻訳後修飾を含む、ＰＤ－Ｌ１抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、アベルマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可された、または認可のために提出された抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、アベルマブである。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、アベルマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、アベルマブである。
Figure 2024512029000025
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＭＰＤＬ３２８０ＡまたはＲＧ７４４６としても知られるアテゾリズマブ（Ｒｏｃｈｅ Ｈｏｌｄｉｎｇ ＡＧ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の子会社であるＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．からＴＥＣＥＮＴＲＩＱとして市販されている）、またはその抗原結合断片、コンジュゲート、もしくは多様体である。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、米国特許第８，２１７，１４９号に開示されている抗体であり、その開示は参照により本明細書に具体的に組み込まれる。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、米国特許出願公開第２０１０／０２０３０５６Ａ１号、同第２０１３／００４５２００Ａ１号、同第２０１３／００４５２０１Ａ１号、同第２０１３／００４５２０２Ａ１号、または同第２０１４／００６５１３５Ａ１号に開示されている抗体であり、その開示は参照により本明細書に具体的に組み込まれる。アテゾリズマブの調製及び特性は、米国特許第８，２１７，１４９号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。アテゾリズマブのアミノ酸配列を表２２に示す。アテゾリズマブは、２２－９６、１４５－２０１、２６２－３２２、３６８－４２６、２２’’－９６’’、１４５’’－２０１’’、２６２’’－３２２’’、及び３６８’’－４２６’’における重鎖内ジスルフィド結合（Ｃ２３－Ｃ１０４）；２３’－８８’、１３４’－１９４’、２３’’’－８８’’’、及び１３４’’’－１９４’’’における軽鎖内ジスルフィド結合（Ｃ２３－Ｃ１０４）；２２１－２１４’及び２２１’’－２１４’’’における重鎖－軽鎖内ジスルフィド結合（ｈ５－ＣＬ１２６）；２２７－２２７’’及び２３０－２３０’’における重鎖－重鎖内ジスルフィド結合（ｈ１１、ｈ１４）；ならびに２９８及び２９８’におけるＮ－グリコシル化部位（Ｈ ＣＨ２ Ｎ８４．４＞Ａ）を有する。
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、配列番号１９８によって与えられる重鎖及び配列番号１９９によって与えられる軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ、配列番号１９８及び配列番号１９９に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、多様体、もしくはコンジュゲートを含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９８及び配列番号１９９に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９８及び配列番号１９９に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９８及び配列番号１９９に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９８及び配列番号１９９に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９８及び配列番号１９９に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、アテゾリズマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号２００に示される配列を含み、ＰＤ－Ｌ１阻害剤軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号２０１に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２００及び配列番号２０１に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２００及び配列番号２０１に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２００及び配列番号２０１に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２００及び配列番号２０１に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２００及び配列番号２０１に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ、配列番号２０２、配列番号２０３、及び配列番号２０４に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号２０５、配列番号２０６、及び配列番号２０７に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。ある実施形態では、抗体は、前述の抗体のうちのいずれかと結合するために競合し、かつ／またはＰＤ－Ｌ１上の同じエピトープに結合する。
ある実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブに関して薬物規制当局によって承認された抗ＰＤ－Ｌ１バイオシミラーモノクローナル抗体である。ある実施形態では、バイオシミラーは、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照医薬品または参照バイオ製品と比較して、１つ以上の翻訳後修飾を含む、ＰＤ－Ｌ１抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、アテゾリズマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可された、または認可のために提出された抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、アテゾリズマブである。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、アテゾリズマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、アテゾリズマブである。
Figure 2024512029000026
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤または抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、Ｉｎｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．から入手可能である、レチファンリマブ、またはその断片、バリアント、コンジュゲート、もしくはバイオシミラーである。
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０３４１９１７Ａ１号に記載されている抗体を含み、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１への結合についてこれらの抗体のうちのいずれかと競合する抗体も含まれる。ある実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＢＭＳ－９３５５５９としても知られるＭＤＸ－１１０５であり、これは米国特許第ＵＳ７，９４３，７４３号に開示されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第ＵＳ７，９４３，７４３号に開示されている抗ＰＤ－Ｌ１抗体から選択される。
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＩＮＶＩＶＯＭＡＢ抗ｍ－ＰＤ－Ｌ１クローン１０Ｆ．９Ｇ２（カタログ番号ＢＥ０１０１、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ，ＵＳＡ）などの市販のモノクローナル抗体である。ある実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（ＭＩＨ１）などの市販のモノクローナル抗体である。いくつかの市販の抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、当業者に知られている。
ある実施形態では、ＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ ２４Ｆ．１０Ｃ１２マウスＩｇＧ２ａ、κアイソタイプ（カタログ番号３２９６０２ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＩＧＭＡ抗ＰＤ－Ｌ２抗体（カタログ番号ＳＡＢ３５００３９５，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、または当業者に知られている他の市販のＰＤ－Ｌ２抗体などの市販のモノクローナル抗体である。
３．ＣＴＬＡ－４阻害剤との併用
いくつかの実施形態では、がんを有する患者に提供されるＴＩＬ療法は、治療的ＴＩＬ集合単独による治療を含んでもよく、またはＴＩＬ及び１つ以上のＣＴＬＡ－４阻害剤を含む併用治療を含んでもよい。
細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、ヘルパーＴ細胞の表面で発現する。ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ２８依存性Ｔ細胞活性化の負の制御因子であり、適応免疫応答のチェックポイントとして機能する。Ｔ細胞共刺激タンパク質ＣＤ２８と同様に、ＣＴＬＡ－４結合抗原は、細胞上でＣＤ８０及びＣＤ８６を提示する。ＣＴＬＡ－４は抑制シグナルをＴ細胞に伝達し、ＣＤ２８は刺激シグナルを伝達する。ヒトＣＴＬＡ－４に対するヒト抗体は、ウイルス感染及び細菌感染を治療または予防すること、ならびにがんを治療するためのものなど、多くの疾患状態における免疫刺激調節因子として記載されている（ＷＯ０１／１４４２４及びＷＯ００／３７５０４）。イピリムマブ（ＭＤＸ－０１０）及びトレメリムマブ（ＣＰ－６７５，２０６）を含むが、これらに限定されない、様々な種類の固形腫瘍の治療のためのいくつかの完全ヒト抗ヒトＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、臨床試験で研究されている。
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、当技術分野で知られている任意のＣＴＬＡ－４阻害剤またはＣＴＬＡ－４遮断剤であり得る。特に、次の段落でより詳細に記載されるＣＴＬＡ－４阻害剤または遮断剤のうちの１つである。「阻害剤」、「アンタゴニスト」、及び「遮断剤」という用語は、本明細書では、ＣＴＬＡ－４阻害剤に関して互換的に使用される。誤解を避けるために、抗体であるＣＴＬＡ－４阻害剤への本明細書での言及は、化合物またはその抗原結合断片、バリアント、コンジュゲート、もしくはバイオシミラーを指し得る。誤解を避けるために、ＣＴＬＡ－４阻害剤への本明細書での言及はまた、小分子化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物、水和物、共結晶、もしくはプロドラッグを指し得る。
本発明の方法で使用するための好適なＣＴＬＡ－４阻害剤には、抗ＣＴＬＡ－４抗体、ヒト抗ＣＴＬＡ－４抗体、マウス抗ＣＴＬＡ－４抗体、哺乳動物抗ＣＴＬＡ－４抗体、ヒト化抗ＣＴＬＡ－４抗体、モノクローナル抗ＣＴＬＡ－４抗体、ポリクローナル抗ＣＴＬＡ－４抗体、キメラ抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＭＤＸ－０１０（イピリムマブ）、トレメリムマブ、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＴＬＡ－４アドネクチン、抗ＣＴＬＡ－４ドメイン抗体、一本鎖抗ＣＴＬＡ－４断片、重鎖抗ＣＴＬＡ－４断片、軽鎖抗ＣＴＬＡ－４断片、共刺激経路を刺激するＣＴＬＡ－４の阻害剤、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００１／０１４４２４号に開示される抗体、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０３５６０７号に開示される抗体、米国特許出願公開第２００５／０２０１９９４号に開示される抗体、ならびに付与された欧州特許第ＥＰ １２１２４２２ Ｂ１号に開示された抗体が含まれるが、これらに限定されず、各々の開示が参照により本明細書に組み込まれる。さらなるＣＴＬＡ－４抗体は、米国特許第５，８１１，０９７号、同第５，８５５，８８７号、同第６，０５１，２２７号、及び同第６，９８４，７２０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１４４２４号及び同第ＷＯ００／３７５０４号、ならびに米国公開第２００２／００３９５８１号及び同第２００２／０８６０１４号に記載されており、各々の開示が参照により本明細書に組み込まれる。本発明の方法で使用することができる他の抗ＣＴＬＡ－４抗体には、例えば、ＷＯ９８／４２７５２、米国特許第６，６８２，７３６号及び同第６，２０７，１５６号、Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（１７）：１００６７－１００７１（１９９８）、Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２５０５（２００４）（抗体ＣＰ－６７５２０６）、Ｍｏｋｙｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５８：５３０１－５３０４（１９９８）、ならびに米国特許第５，９７７，３１８号、同第６，６８２，７３６号、同第７，１０９，００３号、及び同第７，１３２，２８１号に開示されるものが含まれ、これらの各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
さらなるＣＴＬＡ－４阻害剤には、ＣＤ２８抗原がその同族リガンドと結合する能力を妨害すること、ＣＴＬＡ－４がその同族リガンドと結合する能力を阻害すること、共刺激経路を介してＴ細胞応答を増強すること、Ｂ７がＣＤ２８及び／またはＣＴＬＡ－４と結合する能力を破壊すること、Ｂ７が共刺激経路を活性化する能力を破壊すること、ＣＤ８０がＣＤ２８及び／またはＣＴＬＡ－４と結合する能力を破壊すること、ＣＤ８０が共刺激経路を活性化する能力を破壊すること、ＣＤ８６がＣＤ２８及び／またはＣＴＬＡ－４と結合する能力を破壊すること、ＣＤ８６が共刺激経路を活性化する能力を破壊すること、及び共刺激経路を一般に活性化されることから破壊することが可能である任意の阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。これには、共刺激経路の他のメンバーのなかでもＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ－４の小分子阻害剤、共刺激経路の他のメンバーのなかでもＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ－４に対する抗体、共刺激経路の他のメンバーのなかでもＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ－４に指向するアンチセンス分子、共刺激経路の他のメンバーのなかでもＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ－４に指向するアドネクチン、他のＣＴＬＡ－４阻害剤のなかでも共刺激経路の他のメンバーのなかでもＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ－４のＲＮＡｉ阻害剤（一本鎖及び二本鎖の両方）が必ず含まれる。
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、約１０－６Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、１０－１０Ｍ以下、１０－１１Ｍ以下、１０－１２Ｍ以下、例えば、１０－１３Ｍ～１０－１６Ｍ、またはエンドポイントとして前述の値のうちのいずれか２つを有する任意の範囲内のＫｄでＣＴＬＡ－４と結合する。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、同じアッセイを使用して比較した場合、イピリムマブのＫｄの１０倍以下のＫｄでＣＴＬＡ－４と結合する。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、同じアッセイを使用して比較した場合、イピリムマブとほぼ同じかまたはそれ以下（例えば、最大１０倍低いか、または最大１００倍低い）のＫｄでＣＴＬＡ－４と結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０またはＣＤ８６とのＣＴＬＡ－４結合のＣＴＬＡ－４阻害剤による阻害のＩＣ５０値は、同じアッセイを使用して比較した場合、それぞれＣＤ８０またはＣＤ８６とのＣＴＬＡ－４結合のイピリムマブ媒介阻害より１０倍以下で大きい。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０またはＣＤ８６とのＣＴＬＡ－４結合のＣＴＬＡ－４阻害剤による阻害のＩＣ５０値は、同じアッセイを使用して比較した場合、それぞれＣＤ８０またはＣＤ８６とのＣＴＬＡ－４結合のイピリムマブ媒介性阻害とほぼ同じかまたはそれ以下（例えば、最大１０倍低い、または最大１００倍低い）である。
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、好適な対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％、例えば、５０％～７５％、７５％～９０％、または９０％～１００％の間でＣＴＬＡ－４の発現を阻害する、及び／または生物学的活性を減少させるのに十分な量で使用される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４経路阻害剤は、好適な対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％、例えば、５０％～７５％、７５％～９０％、または９０％～１００％の間でＣＴＬＡ－４のＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方との結合を減少させることにより、ＣＴＬＡ－４の生物学的活性を減少させるのに十分な量で使用される。対象となる薬剤の効果を評価または定量化する状況下における好適な対照は、典型的には、対象となる薬剤、例えば、ＣＴＬＡ－４経路阻害剤に曝露されていないか、または治療されていない（または僅かな量に曝露されているか、または治療されている）同等の生物学的システム（例えば、細胞または対象）である。いくつかの実施形態では、生物学的システムは、それ自体の対照として機能し得る（例えば、生物学的システムは、薬剤への曝露または治療の前に評価され得、曝露または治療が開始または終了した後の状態と比較され得る。いくつかの実施形態では、歴史的対照が使用され得る。
ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ．からＹｅｒｖｏｙとして市販されている）、またはそのバイオシミラー、抗原結合断片、コンジュゲート、もしくはバリアントである。当該技術分野で知られているように、イピリムマブは、機能的ヒトレパートリーを生成するための重鎖及び軽鎖をコードするヒト遺伝子を有するトランスジェニックマウスに由来する完全ヒトＩｇＧ １κ抗体である、抗ＣＴＬＡ－４抗体を指す。イピリムマブは、そのＣＡＳ登録番号４７７２０２－００－９及びＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１４４２４号で参照することもでき、その全体がすべての目的で参照により本明細書に組み込まれる。それは抗体１０ＤＩとして開示されている。具体的には、イピリムマブは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（配列番号２１１を含む軽鎖可変領域を有し、配列番号２１０を含む重鎖可変領域を有する）を含む。イピリムマブの薬学的組成物は、イピリムマブ及び１つ以上の希釈剤、ビヒクル、または賦形剤を含有するすべての薬学的に許容される組成物を含む。イピリムマブを含有する薬学的組成物の例は、国際特許出願公開第ＷＯ２００７／６７９５９号に記載されている。イピリムマブは、静脈内（ＩＶ）投与され得る。
ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、配列番号２０８によって与えられる重鎖及び配列番号２０９によって与えられる軽鎖を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、それぞれ、配列番号２０８及び配列番号２０９に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、多様体、もしくはコンジュゲートを含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２０８及び配列番号２０９に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２０８及び配列番号２０９に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２０８及び配列番号２０９に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２０８及び配列番号２０９に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２０８及び配列番号２０９に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号２１０に示される配列を含み、ＣＴＬＡ－４阻害剤軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号２１１に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１０及び配列番号２１１に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１０及び配列番号２１１に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１０及び配列番号２１１に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１０及び配列番号２１１に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１０及び配列番号２１１に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、それぞれ、配列番号２１２、配列番号２１３、及び配列番号２１４に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号２１５、配列番号２１６、及び配列番号２１７に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。ある実施形態では、抗体は、前述の抗体のうちのいずれかと結合するために競合し、かつ／またはＣＴＬＡ－４上の同じエピトープに結合する。
ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブに関して薬物規制当局によって承認されたＣＴＬＡ－４バイオシミラーモノクローナル抗体である。ある実施形態では、バイオシミラーは、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照医薬品または参照バイオ製品と比較して、１つ以上の翻訳後修飾を含む、抗ＣＴＬＡ－４抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、イピリムマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。イピリムマブのアミノ酸配列を表２３に示す。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可された、または認可のために提出された抗ＣＴＬＡ－４抗体であり、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、イピリムマブである。抗ＣＴＬＡ－４抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、イピリムマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、イピリムマブである。
Figure 2024512029000027
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブまたはそのバイオシミラーであり、イピリムマブは、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブまたはそのバイオシミラーであり、イピリムマブは、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブまたはそのバイオシミラーであり、イピリムマブは、約２００ｍｇ～約５００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブまたはそのバイオシミラーであり、イピリムマブは、約２００ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４８０ｍｇ、または約５００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブまたはそのバイオシミラーであり、イピリムマブは、２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎、または６週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。
いくつかの実施形態では、イピリムマブは、切除不能または転移性黒色腫を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブは、切除不能または転移性黒色腫を治療するために、３週間毎に約ｍｇ／ｋｇで最大４用量投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。
いくつかの実施形態では、イピリムマブは、黒色腫のアジュバント治療のために投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブは、黒色腫のアジュバント治療のために、約１０ｍｇ／ｋｇで３週間毎に４用量、続いて１０ｍｇ／ｋｇで１２週間毎に最大３年間投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。
いくつかの実施形態では、イピリムマブは、進行性腎細胞癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブは、進行性腎細胞癌を治療するために、約１ｍｇ／ｋｇで投与され、直後に同じ日にニボルマブ３ｍｇ／ｋｇを３週間毎に４用量投与される。いくつかの実施形態では、４用量の組み合わせを完了した後、ニボルマブは、進行性腎細胞癌及び／または腎細胞癌の標準的な投薬レジメンに従って単剤として投与され得る。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。
いくつかの実施形態では、イピリムマブは、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブは、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌を治療するために、約１ｍｇ／ｋｇで静脈内に３０分間にわたって投与され、直後に同じ日にイピリムマブ３ｍｇ／ｋｇを静脈内に３０分間にわたって３週間毎に４用量投与される。いくつかの実施形態では、４用量の組み合わせを完了した後、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌の標準的な投薬レジメンに従って推奨されるように単剤としてニボルマブを投与する。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。
いくつかの実施形態では、イピリムマブは、肝細胞癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブは、肝細胞癌を治療するために、約３ｍｇ／ｋｇで静脈内に３０分間にわたって投与され、直後に同じ日にニボルマブ１ｍｇ／ｋｇを静脈内に３０分間にわたって３週間毎に４用量投与される。いくつかの実施形態では、４用量の組み合わせを完了した後、肝細胞癌のための標準的な投薬レジメンに従って単剤としてニボルマブを投与する。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。
いくつかの実施形態では、イピリムマブは、転移性非小細胞肺癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブは、転移性非小細胞肺癌を治療するために、６週間毎に約１ｍｇ／ｋｇで、２週間毎に３ｍｇ／ｋｇのニボルマブとともに投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブは、転移性非小細胞肺癌を治療するために、６週間毎に約１ｍｇ／ｋｇで、３週間毎に３６０ｍｇのニボルマブ及び２サイクルのプラチナダブレット化学療法とともに投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。
いくつかの実施形態では、イピリムマブは、悪性胸膜中皮腫を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブは、悪性胸膜中皮腫を治療するために、６週間毎に約１ｍｇ／ｋｇで、３週間毎に３６０ｍｇのニボルマブとともに投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。
トレメリムマブ（ＣＰ－６７５，２０６としても知られる）は、完全ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体であり、ＣＡＳ番号７４５０１３－５９－６を有する。トレメリムマブは、米国特許第６，６８２，７３６号（参照により本明細書に組み込まれる）において抗体１１．２．１として開示されている。トレメリムマブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２１８及び２１９に示す。トレメリムマブは、黒色腫及び乳癌を含む種々の腫瘍の治療のための臨床試験において研究されており、トレメリムマブは、０．０１及び１５ｍｇ／ｋｇの用量範囲で４週間または１２週間毎に単回用量または複数回用量として静脈内投与される。本発明によって提供されるレジメンでは、トレメリムマブは、局所的に、特に皮内または皮下に投与される。皮内または皮下投与されるトレメリムマブの有効量は、典型的には、人当たり５～２００ｍｇ／用量の範囲である。いくつかの実施形態では、トレメリムマブの有効量は、用量当たり人当たり１０～１５０ｍｇ／用量の範囲である。いくつかの特定の実施形態では、トレメリムマブの有効量は、人当たり約１０、２５、３７．５、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ｍｇ／用量である。
ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、配列番号２１８によって与えられる重鎖及び配列番号２１９によって与えられる軽鎖を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、それぞれ、配列番号２１８及び配列番号２１９に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、多様体、もしくはコンジュゲートを含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１８及び配列番号２１９に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１８及び配列番号２１９に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１８及び配列番号２１９に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１８及び配列番号２１９に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１８及び配列番号２１９に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、トレメリムマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号２２０に示される配列を含み、ＣＴＬＡ－４阻害剤軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号２２１に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２０及び配列番号２２１に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２０及び配列番号２２１に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２０及び配列番号２２１に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２０及び配列番号２２１に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２０及び配列番号２２１に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、それぞれ、配列番号２２２、配列番号２２３、及び配列番号２２４に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号２２５、配列番号２２６、及び配列番号２２７に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。ある実施形態では、抗体は、前述の抗体のうちのいずれかと結合するために競合し、かつ／またはＣＴＬＡ－４上の同じエピトープに結合する。
ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、トレメリムマブに関して薬物規制当局によって承認された抗ＣＴＬＡ－４バイオシミラーモノクローナル抗体である。ある実施形態では、バイオシミラーは、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照医薬品または参照バイオ製品と比較して、１つ以上の翻訳後修飾を含む、抗ＣＴＬＡ－４抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、トレメリムマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。トレメリムマブのアミノ酸配列を表２４に示す。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可された、または認可のために提出された抗ＣＴＬＡ－４抗体であり、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、トレメリムマブである。抗ＣＴＬＡ－４抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、トレメリムマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、トレメリムマブである。
Figure 2024512029000028
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、トレメリムマブまたはそのバイオシミラーであり、トレメリムマブは、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、トレメリムマブまたはそのバイオシミラーであり、トレメリムマブは、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、トレメリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、トレメリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、トレメリムマブまたはそのバイオシミラーであり、トレメリムマブは、約２００ｍｇ～約５００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、トレメリムマブまたはそのバイオシミラーであり、トレメリムマブは、約２００ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４８０ｍｇ、または約５００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、トレメリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、トレメリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、トレメリムマブまたはそのバイオシミラーであり、トレメリムマブは、２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎、または６週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、トレメリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、トレメリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。
ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、Ａｇｅｎｕｓからのザリフレリマブ、またはそのバイオシミラー、抗原結合断片、コンジュゲート、もしくはバリアントである。ザリフレリマブは、完全ヒトモノクローナル抗体である。ザリフレリマブには、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＡＳ）登録番号２１４８３２１－６９－９が割り当てられており、ＡＧＥＮ１８８４としても知られている。ザリフレリマブの調製及び特性は、米国特許第１０，１４４，７７９号及び米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／００２４３５０Ａ１号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、配列番号２２８によって与えられる重鎖及び配列番号２２９によって与えられる軽鎖を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、それぞれ、配列番号２２８及び配列番号２２９に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、多様体、もしくはコンジュゲートを含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２８及び配列番号２２９に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２８及び配列番号２２９に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２８及び配列番号２２９に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２８及び配列番号２２９に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２８及び配列番号２２９に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、ザリフレリマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号２３０に示される配列を含み、ＣＴＬＡ－４阻害剤軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号２３１に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２３０及び配列番号２３１に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２３０及び配列番号２３１に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２３０及び配列番号２３１に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２３０及び配列番号２３１に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２３０及び配列番号２３１に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、それぞれ、配列番号２３１、配列番号２３３、及び配列番号２３４に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号２３５、配列番号２３６、及び配列番号２３７に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。ある実施形態では、抗体は、前述の抗体のうちのいずれかと結合するために競合し、かつ／またはＣＴＬＡ－４上の同じエピトープに結合する。
ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、ザリフレリマブに関して薬物規制当局によって承認されたＣＴＬＡ－４バイオシミラーモノクローナル抗体である。ある実施形態では、バイオシミラーは、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照医薬品または参照バイオ製品と比較して、１つ以上の翻訳後修飾を含む、抗ＣＴＬＡ－４抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、ザリフレリマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。ザリフレリマブのアミノ酸配列を表２５に示す。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可された、または認可のために提出された抗ＣＴＬＡ－４抗体であり、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、ザリフレリマブである。抗ＣＴＬＡ－４抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ザリフレリマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ザリフレリマブである。
Figure 2024512029000029
さらなる抗ＣＴＬＡ－４抗体の例には、ＡＧＥＮ１１８１、ＢＭＳ－９８６２１８、ＢＣＤ－１４５、ＯＮＣ－３９２、ＣＳ１００２、ＲＥＧＮ４６５９、及びＡＤＧ１１６が含まれるが、これらに限定されず、これらは当業者に即知である。
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、以下の特許公開（参照により本明細書に組み込まれる）のうちのいずれかに開示される抗ＣＴＬＡ－４抗体である：ＵＳ２０１９／００４８０９６Ａ１、ＵＳ２０２０／０２２３９０７、ＵＳ２０１９／０２０１３３４、ＵＳ２０１９／０２０１３３４、ＵＳ２００５／０２０１９９４、ＥＰ１２１２４２２Ｂ１、ＷＯ２０１８／２０４７６０、ＷＯ２０１８／２０４７６０、ＷＯ２００１／０１４４２４、ＷＯ２００４／０３５６０７、ＷＯ２００３／０８６４５９、ＷＯ２０１２／１２０１２５、ＷＯ２０００／０３７５０４、ＷＯ２００９／１００１４０、ＷＯ２００６／０９６４９、ＷＯ２００５／０９２３８０、ＷＯ２００７／１２３７３７、ＷＯ２００６／０２９２１９、ＷＯ２０１０／０９７９５９７、ＷＯ２００６／１２１６８、及びＷＯ１９９７／０２０５７４。さらなるＣＴＬＡ－４抗体は、米国特許第５，８１１，０９７号、同第５，８５５，８８７号、同第６，０５１，２２７号、及び同第６，９８４，７２０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１４４２４号及び同第ＷＯ００／３７５０４号、ならびに米国公開第２００２／００３９５８１号及び同第２００２／０８６０１４号、及び／または米国特許第５，９７７，３１８号、同第６，６８２，７３６号、同第７，１０９，００３号、及び同第７，１３２，２８１号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、例えば、ＷＯ９８／４２７５２、米国特許第６，６８２，７３６号及び同第６，２０７，１５６号、Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（１７）：１００６７－１００７１（１９９８）、Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２５０５（２００４）（抗体ＣＰ－６７５２０６）、Ｍｏｋｙｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５８：５３０１－５３０４（１９９８）（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものである。
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、ＷＯ１９９６／０４０９１５（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるＣＴＬＡ－４リガンドである。
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、ＣＴＬＡ－４発現の核酸阻害剤である。例えば、抗ＣＴＬＡ－４ ＲＮＡｉ分子は、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９９／０３２６１９及びＷＯ２００１／０２９０５８、米国公開第２００３／００５１２６３号、同第２００３／００５５０２０号、同第２００３／００５６２３５号、同第２００４／２６５８３９号、同第２００５／０１００９１３号、同第２００６／００２４７９８号、同第２００８／００５０３４２号、同第２００８／００８１３７３号、同第２００８／０２４８５７６号、同第２００８／０５５４４３号、及び／または米国特許第６，５０６，５５９号、同第７，２８２，５６４号、同第７，５３８，０９５号、及び同第７，５６０，４３８号（参照により本明細書に組み込まれる）においてＭｅｌｌｏ及びＦｉｒｅによって記載された分子の形態を取り得る。いくつかの事例では、抗ＣＴＬＡ－４ ＲＮＡｉ分子は、欧州特許第ＥＰ１３０９７２６号（参照により本明細書に組み込まれる）においてＴｕｓｃｈｌによって記載された二本鎖ＲＮＡｉ分子の形態を取る。いくつかの事例では、抗ＣＴＬＡ－４ ＲＮＡｉ分子は、米国特許第７，０５６，７０４号及び同第７，０７８，１９６号（参照により本明細書に組み込まれる）においてＴｕｓｃｈｌによって記載された二本鎖ＲＮＡｉ分子の形態を取る。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０８１０２１（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたアプタマーである。
他の実施形態では、本発明の抗ＣＴＬＡ－４ ＲＮＡｉ分子は、米国特許第５，８９８，０３１号、同第６，１０７，０９４号、同第７，４３２，２４９号、及び同第７，４３２，２５０号、ならびに欧州出願第ＥＰ０９２８２９０号（参照により本明細書に組み込まれる）においてＣｒｏｏｋｅによって記載されたＲＮＡ分子である。
４．患者の任意のリンパ球枯渇プレコンディショニング
ある実施形態では、本発明は、ＴＩＬ集団でがんを治療する方法を含み、患者は、本開示によるＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前治療される。ある実施形態では、本発明は、骨髄非破壊的化学療法で前治療された患者のがんの治療に使用するためのＴＩＬ集団を含む。ある実施形態では、ＴＩＬ集団は、注入による投与用である。ある実施形態では、骨髄非破壊的化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）、ならびにフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日で５日間（ＴＩＬ注入の２７日前～２３日前）である。いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）、ならびにフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日で３日間（ＴＩＬ注入の２７日前～２５日前）である。いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）、続いてフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日で３日間（ＴＩＬ注入の２５日前～２３日前）である。ある実施形態では、本開示による骨髄非破壊的化学療法及びＴＩＬ注入（０日目）後、患者は、生理学的許容範囲まで８時間毎に７２０，０００ＩＵ／ｋｇで静脈内的にＩＬ－２（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮとして市販されている、アルデスロイキン）の静脈内注入を受ける。ある特定の実施形態では、ＴＩＬ集団は、ＩＬ－２と組み合わせてがんを治療する際に使用するためのものであり、ＩＬ－２は、ＴＩＬ集団の後に投与される。
実験結果は、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞及び免疫系の競合要素（「サイトカインシンク」）を排除することによって治療有効性を増強する上で重要な役割を果たすことを示している。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、本発明のＴＩＬを導入する前に、患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」と称されることもある）を利用する。
一般に、リンパ球枯渇は、フルダラビンまたはシクロホスファミド（マホスファミドと称される活性形態）及びそれらの組み合わせの投与を使用して達成される。かかる方法は、Ｇａｓｓｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１１，６０，７５－８５、Ｍｕｒａｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．Ｏｎｃｏｌ．，２００６，３，６６８－６８１、Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００８，２６，５２３３－５２３９、及びＤｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００５，２３，２３４６－２３５７に記載されており、これらはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、フルダラビンは、０．５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬのフルダラビン濃度で投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビンは、１μｇ／ｍＬのフルダラビン濃度で投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビン治療は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日以上投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビンは、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、３５ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日、または４５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビン治療は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２～７日間投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビン治療は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で４～５日間投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビン治療は、２５ｍｇ／ｋｇ／日で４～５日間投与される。
いくつかの実施形態では、シクロホスファミドの活性形態であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により、０．５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの濃度で得られる。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドの活性形態であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により、１μｇ／ｍＬの濃度で取得される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド治療は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日以上投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、１００ｍｇ／ｍ２／日、１５０ｍｇ／ｍ２／日、１７５ｍｇ／ｍ２／日、２００ｍｇ／ｍ２／日、２２５ｍｇ／ｍ２／日、２５０ｍｇ／ｍ２／日、２７５ｍｇ／ｍ２／日、または３００ｍｇ／ｍ２／日の投与量で投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、静脈内（すなわち、ｉ．ｖ．）投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド治療は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２～７日間投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド治療は、２５０ｍｇ／ｍ２／日で４～５日間ｉ．ｖ．投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド治療は、２５０ｍｇ／ｍ２／日で４日間ｉ．ｖ．投与される。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、患者にフルダラビンとシクロホスファミドを一緒に投与することによって行われる。いくつかの実施形態では、フルダラビンは、２５ｍｇ／ｍ２／日でｉ．ｖ．投与され、シクロホスファミドは、２５０ｍｇ／ｍ２／日で４日間にわたってｉ．ｖ投与される。
ある実施形態では、リンパ球枯渇は、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与することによって行われる。
ある実施形態では、リンパ球枯渇が、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。
ある実施形態では、リンパ球枯渇が、シクロホスファミドを約５０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを約２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。
ある実施形態では、リンパ球枯渇が、シクロホスファミドを約５０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを約２０ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。
ある実施形態では、リンパ球枯渇が、シクロホスファミドを約４０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを約２０ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。
ある実施形態では、リンパ球枯渇が、シクロホスファミドを約４０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを約１５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。
ある実施形態では、リンパ球枯渇が、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与することによって行われる。
ある実施形態では、シクロホスファミドは、メスナとともに投与される。ある実施形態では、メスナは、１５ｍｇ／ｋｇで投与される。メスナが注入されるある実施形態では、連続的に注入される場合、メスナは、およそ２時間にわたってシクロホスファミドとともに注入することができ（－５日目及び／または－４日目）、次いで残りの２２時間は３ｍｇ／ｋｇ／時間の速度で、各シクロホスファミド用量と同時に開始して２４時間にわたって注入することができる。
ある実施形態では、リンパ球枯渇は、第３のＴＩＬ集団を患者に投与した翌日から開始するＩＬ－２レジメンで患者を治療するステップをさらに含む。
ある実施形態では、リンパ球枯渇は、第３のＴＩＬ集団を患者に投与したのと同じ日に開始するＩＬ－２レジメンで患者を治療するステップを含む。
いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、５日間のプレコンディショニング治療を含む。いくつかの実施形態では、該日は、－５日から－１日、または０日から４日として示される。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目及び－４日目（すなわち、０日目及び１日目）にシクロホスファミドを含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目及び－４日目（すなわち、０日目及び１日目）に静脈内シクロホスファミドを含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目及び－４日目（すなわち、０日目及び１日目）に６０ｍｇ／ｋｇの静脈内シクロホスファミドを含む。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、メスナとともに投与される。いくつかの実施形態では、レジメンは、フルダラビンをさらに含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、静脈内フルダラビンをさらに含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、２５ｍｇ／ｍ２の静脈内フルダラビンをさらに含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目及び－１日目（すなわち、０～４日目）に２５ｍｇ／ｍ２の静脈内フルダラビンをさらに含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目及び－１日目（すなわち、０～４日目）に２５ｍｇ／ｍ２の静脈内フルダラビンをさらに含む。
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で、及びフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与するとともに、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で１日間投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で、及びフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与するとともに、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で、及びフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与するとともに、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、５日間のプレコンディショニング治療を含む。いくつかの実施形態では、該日は、－５日から－１日、または０日から４日として示される。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目及び－４日目（すなわち、０日目及び１日目）にシクロホスファミドを含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目及び－４日目（すなわち、０日目及び１日目）に静脈内シクロホスファミドを含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目及び－４日目（すなわち、０日目及び１日目）に３００ｍｇ／ｋｇの静脈内シクロホスファミドを含む。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、メスナとともに投与される。いくつかの実施形態では、レジメンは、フルダラビンをさらに含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、静脈内フルダラビンをさらに含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、３０ｍｇ／ｍ２の静脈内フルダラビンをさらに含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目及び－１日目（すなわち、０～４日目）に３０ｍｇ／ｍ２の静脈内フルダラビンをさらに含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目及び－１日目（すなわち、０～４日目）に３０ｍｇ／ｍ２の静脈内フルダラビンをさらに含む。
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、シクロホスファミドを３００ｍｇ／ｍ２／日の用量で、及びフルダラビンを３０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを３０ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で、及びフルダラビンを３０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを３０ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で、及びフルダラビンを３０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与するとともに、フルダラビンを３０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間、続いてフルダラビンを３０ｍｇ／ｍ２／日の用量で１日間投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを３００ｍｇ／ｍ２／日の用量で、及びフルダラビンを３０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与するとともに、フルダラビンを３０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間、続いてフルダラビンを３０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを３００ｍｇ／ｍ２／日の用量で、及びフルダラビンを３０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与するとともに、フルダラビンを３０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間、続いてフルダラビンを３０ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、表２６に従って投与される。
Figure 2024512029000030
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、表２７に従って投与される。
Figure 2024512029000031
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、表２８に従って投与される。
Figure 2024512029000032
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、表２９に従って投与される。
Figure 2024512029000033
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、表３０に従って投与される。
Figure 2024512029000034
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、表３１に従って投与される。
Figure 2024512029000035
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、表３２に従って投与される。
Figure 2024512029000036
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、表３３に従って投与される。
Figure 2024512029000037
いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、ＴＩＬ注入日の１日前、２日前、または３日前の経過にわたって１００ｍｇ／ｍ２の総用量まで投与されるメルファランを含む。いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、ＴＩＬ注入日の１日前、２日前、または３日前の経過にわたって２００ｍｇ／ｍ２の総用量まで投与されるメルファランを含む。いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、ＴＩＬ注入日の１日前、２日前、または３日前の経過にわたって１００ｍｇ／ｍ２の総用量まで投与されるメルファラン、及び３０ｍｇ／ｍ２／日の用量で投与されるフルダラビンを含む。いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、ＴＩＬ注入日の１日前、２日前、または３日前の経過にわたって２００ｍｇ／ｍ２の総用量まで投与されるメルファラン、及び３０ｍｇ／ｍ２／日の用量で投与されるフルダラビンを含む。
いくつかの実施形態では、骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンの前述の実施形態で使用されるＴＩＬ注入は、本明細書に記載の任意のＴＩＬ組成物であり得、また、ＴＩＬ注入の代わりにＭＩＬ及びＰＢＬの注入、ならびに本明細書に記載のＩＬ－２レジメンの追加及び併用療法（ＰＤ－１及び／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤など）の投与を含み得る。
５．ＩＬ－２レジメン
ある実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、高用量ＩＬ－２レジメンを含み、高用量ＩＬ－２レジメンは、治療的ＴＩＬ集団の治療有効部分を投与した翌日から静脈内投与されるアルデスロイキン、またはそのバイオシミラーもしくは多様体を含み、アルデスロイキンまたはそのバイオシミラーもしくは多様体が、０．０３７ｍｇ／ｋｇまたは０．０４４ｍｇ／ｋｇＩＵ／ｋｇ（患者の体重）の用量で、耐性まで８時間毎に最大１４用量にわたって１５分のボーラス静脈内注入を使用して投与される。９日間の休止後、このスケジュールは、さらに１４用量、合計最大２８用量にわたって繰り返され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、１、２、３、４、５、または６用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、最大６用量の最大投与量で投与される。いくつかの実施形態では、高用量ＩＬ－２レジメンは、小児の使用に適合される。いくつかの実施形態では、最大６用量まで、８～１２時間毎に６００，０００国際単位（ＩＵ）／ｋｇのアルデスロイキンの用量が使用される。いくつかの実施形態では、最大６用量まで、８～１２時間毎に５００，０００国際単位（ＩＵ）／ｋｇのアルデスロイキンの用量が使用される。いくつかの実施形態では、最大６用量まで、８～１２時間毎に４００，０００国際単位（ＩＵ）／ｋｇのアルデスロイキンの用量が使用される。いくつかの実施形態では、最大６用量まで、８～１２時間毎に５００，０００国際単位（ＩＵ）／ｋｇのアルデスロイキンの用量が使用される。いくつかの実施形態では、最大６用量まで、８～１２時間毎に３００，０００国際単位（ＩＵ）／ｋｇのアルデスロイキンの用量が使用される。いくつかの実施形態では、最大６用量まで、８～１２時間毎に２００，０００国際単位（ＩＵ）／ｋｇのアルデスロイキンの用量が使用される。いくつかの実施形態では、最大６用量まで、８～１２時間毎に１００，０００国際単位（ＩＵ）／ｋｇのアルデスロイキンの用量が使用される。
ある実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、デクレッシェンドＩＬ－２レジメンを含む。デクレッシェンドＩＬ－２レジメンは、Ｏ’Ｄａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９９９，１７，２７５２－６１、及びＥｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ２０００，８８，１７０３－９に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、デクレッシェンドＩＬ－２レジメンは、６時間にわたって静脈内投与される１８×１０６ＩＵ／ｍ２、続いて１２時間にわたって静脈内投与される１８×１０６ＩＵ／ｍ２、続いて２４時間にわたって静脈内投与される１８×１０６ＩＵ／ｍ２、続いて７２時間かけて静脈内投与される４．５×１０６ＩＵ／ｍ２を含む。この治療サイクルは、２８日毎に最大４サイクル繰り返され得る。ある実施形態では、デクレッシェンドＩＬ－２レジメンは、１日目の１８，０００，０００ＩＵ／ｍ２、２日目の９，０００，０００ＩＵ／ｍ２、３日目及び４日目の４，５００，０００ＩＵ／ｍ２を含む。
ある実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、０．１０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の用量で、１、２、４、６、７、１４、または２１日毎にペグ化ＩＬ－２を投与することを含む。
ある実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、抗体骨格に移植されたＩＬ－２断片の投与を含む。ある実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、ＩＬ－２低親和性受容体に結合する抗体－サイトカイン移植タンパク質の投与を含む。ある実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、ＩＬ－２Ｒα受容体への結合に影響を及ぼすことなく、アルデスロイキンと比較して、ＩＬ－２Ｒβ及び／またはＩＬ－２Ｒγ受容体への結合が強化された抗体－サイトカイン移植タンパク質の投与を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体サイトカイン移植タンパク質は、アルデスロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））または同等の分子などであるがこれらに限定されない野生型ＩＬ－２分子よりも長い血清半減期を有する。
６．追加の治療方法
別の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を対象に投与することを含む、がんを有する対象を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の、上記の前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を対象に投与することを含む、がんを有する対象を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、それぞれ、治療上有効な投与量の治療的ＴＩＬ集団及び上記の前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に投与されるように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与するステップを含むように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、対象にＴＩＬ細胞を投与した翌日に開始する、高用量のＩＬ－２レジメンで対象を治療するステップをさらに含むように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、高用量ＩＬ－２レジメンが、許容範囲まで８時間毎に１５分間のボーラス静脈内注入として投与される６００，０００または７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含むように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がんが固形腫瘍であるように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫であるように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がんが小児の高頻度変異癌であるように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の治療的ＴＩＬ集団を対象に投与することを含む、がんを有する対象を治療するための方法で使用するための、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。
別の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量のＴＩＬ組成物を対象に投与することを含む、がんを有する対象を治療するための方法で使用するための、上記の前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団または上記の前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を対象に投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に投与されるように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団または上記の前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与するステップを含むように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ＴＩＬ細胞を患者に投与した翌日から開始する、高用量ＩＬ－２レジメンで患者を治療するステップをさらに含むように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、高用量ＩＬ－２レジメンが、許容範囲まで８時間毎に１５分間のボーラス静脈内注入として投与される６００，０００または７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含むように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がんが固形腫瘍であるように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫であるように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がんが高頻度変異癌であるように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、がんが小児の高頻度変異癌であるように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の治療的ＴＩＬ集団を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法における上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団の使用を提供する。
別の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量のＴＩＬ組成物を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法における上記の前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物の使用を提供する。
別の実施形態では、本発明は、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンを対象に投与すること、次いで治療上有効な投与量の、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団または上記の前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を対象に投与することと、を含む、対象におけるがんを治療する方法における、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団または上記の前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物の使用を提供する。
本明細書に包含される実施形態は、これから以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、本明細書に包含される本開示は、決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
実施例１：ＲＥＰ前プロセス及びＲＥＰプロセス用の培地の調製
この実施例は、黒色腫を含む様々な腫瘍タイプに由来するＴＩＬの培養を含むプロトコルで使用するための組織培養培地の調製手順を説明する。この培地を、本出願及び実施例に記載のＴＩＬのうちのいずれかの調製に使用することができる。
ＣＭ１の調製。以下の試薬を冷蔵から取り出し、３７℃の水浴中で温めた。（ＲＰＭＩ１６４０、ヒトＡＢ血清、２００ｍＭ Ｌ－グルタミン）。濾過される体積に適した０．２ｕｍフィルターユニットの上部に成分の各々を追加することによって、以下の表３４に従ってＣＭ１培地を調製した。４℃で保存する。

Figure 2024512029000038
使用日に、３７℃の水浴中で必要量のＣＭ１を事前に温め、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を追加した。
表３５に従って必要に応じて追加の補充を行った。
Figure 2024512029000039
ＣＭ２の調製。調製したＣＭ１を冷蔵庫から取り出すか、または新鮮なＣＭ１を調製した。ＡＩＭ－Ｖ（登録商標）を冷蔵庫から取り出し、調製したＣＭ１を滅菌培地ボトル内で同等体積のＡＩＭ－Ｖ（登録商標）と混合することによって、必要な量のＣＭ２を調製した。使用日に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をＣＭ２培地に追加した。使用日に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む十分な量のＣＭ２を作製した。ＣＭ２培地ボトルにその名前、調製者のイニシャル、濾過／調製日、２週間の有効期限をラベル付けし、組織培養に必要になるまで４℃で保存した。
ＣＭ３の調製。使用が必要になった日にＣＭ３を調製した。ＣＭ３は、ＡＩＭ－Ｖ（登録商標）培地と同じであり、使用日に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した。ＩＬ－２ストック溶液をＡＩＭ－Ｖのボトルまたはバッグに直接追加することによって、実験のニーズに十分な量のＣＭ３を調製した。穏やかに振盪することによって十分に混合した。ボトルに、ＡＩＭ－Ｖに追加した直後に「３０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２」とラベル付けする。過剰なＣＭ３が存在する場合は、培地名、調製者のイニシャル、培地を調製した日、及びその有効期限（調製後７日）をラベル付けしたボトル内で４℃で保管した。４℃で７日間保管した後、ＩＬ－２を補充した培地を廃棄した。
ＣＭ４の調製。ＣＭ４は、ＣＭ３と同じであり、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（最終濃度）を追加で補充した。１ＬのＣＭ３毎に、１０ｍｌの２００ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を追加した。ＩＬ－２ストック溶液及びＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）ストック溶液をＡＩＭ－Ｖのボトルまたはバッグに直接追加することによって、実験のニーズに十分な量のＣＭ４を調製した。穏やかに振盪することによって十分に混合した。ボトルに、ＡＩＭ－Ｖに追加した直後に「３０００ＩＬ／ｎｉｌ ＩＬ－２及びＧｌｕｔａＭＡＸ」とラベル付けした。過剰なＣＭ４が存在する場合、培地名、「ＧｌｕｔａＭＡＸ」、及びその有効期限（調製後７日）をラベル付けしたボトル内で４℃で保管した。４℃で７日間保管した後、ＩＬ－２を補充した培地を廃棄した。
実施例２：ガンマ線照射末梢単核細胞の個々のロットを適格性確認する
この実施例は、本明細書に記載の例示的な方法において同種異系フィーダー細胞として使用するためのガンマ線照射末梢単核細胞（ＰＢＭＣ、単核細胞またはＭＮＣとしても知られる）の個々のロットを適格性確認するための簡略化された手順を説明する。
照射された各ＭＮＣフィーダーロットは、個々のドナーから調製した。各ロットまたはドナーは、精製された抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体及びインターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下でＲＥＰ内のＴＩＬを拡張する能力について個々にスクリーニングした。さらに、フィーダー細胞の各ロットを、ＴＩＬを添加せずに試験し、受けたガンマ線の線量がそれらを複製不全にするのに十分であることを確認した。
ＴＩＬのＲＥＰには、ガンマ線を照射し、成長を停止させたＭＮＣフィーダー細胞が必要である。フィーダーＭＮＣの膜受容体は、抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体に結合し、ＲＥＰフラスコ内のＴＩＬに架橋し、ＴＩＬを刺激して拡張させる。フィーダーロットは、個々のドナーから採取した全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ上で遠心分離し、洗浄し、照射し、ＧＭＰ条件下で凍結保存した。
ＴＩＬ療法を受けた患者には、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こす可能性があるため、生存可能なフィーダー細胞を注入しないことが重要である。したがって、フィーダー細胞は、細胞にガンマ線を照射することによって成長を停止させ、再培養時に二本鎖ＤＮＡ切断が起こり、ＭＮＣ細胞の細胞生存性が喪失する。
フィーダーロットを、２つの基準：１）共培養でＴＩＬを１００倍超拡張する能力、及び２）複製不全で評価した。
フィーダーロットを、直立したＴ２５組織培養フラスコ内で培養された２つの主要なＲＥＰ前ＴＩＬ株を利用して、ｍｉｎｉ－ＲＥＰ形式で試験した。各ＴＩＬ株は、ＲＥＰでの活性化に応答して増殖する能力が独特であるため、フィーダーロットを、２つの異なるＴＩＬ株に対して試験した。対照として、上記の基準を満たすことが歴史的に示されている多くの照射されたＭＮＣフィーダー細胞を、試験ロットと並行して実行した。
１回の実験で試験されたすべてのロットが同等の試験を受けることを保証するために、すべての条件及びすべてのフィーダーロットを試験するために、同じＲＥＰ前ＴＩＬ株の十分なストックが利用可能であった。
試験したフィーダー細胞の各ロットに、合計６つのＴ２５フラスコがあった：ＲＥＰ前ＴＩＬ株＃１（２フラスコ）、ＲＥＰ前ＴＩＬ株＃２（２フラスコ）、及びフィーダー対照（２フラスコ）。ＴＩＬ株番号１及び番号２を含むフラスコは、フィーダーロットがＴＩＬを拡張する能力を評価した。フィーダー対照フラスコは、フィーダーロットの複製不全を評価した。
Ａ．実験プロトコル
－２／３日目、ＴＩＬ株の解凍。ＣＭ２培地を調製し、ＣＭ２を３７℃の水浴中で温める。３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した４０ｍＬのＣＭ２を調製する。使用まで保温する。ＩＬ－２を含まない２０ｍＬの予熱したＣＭ２を、使用したＴＩＬ株の名前がラベル付けされた２本の５０ｍＬコニカルチューブの各々に入れる。ＬＮ２ストレージから２つの指定されたＲＥＰ前ＴＩＬ株を取り出し、バイアルを組織培養室に移した。少量の氷が残るまで、３７℃の水浴内の密封されたジッパーストレージバッグ内にバイアルを入れて解凍した。
無菌トランスファーピペットを使用して、各バイアルの内容物を、調製した、ラベル付けされた５０ｍＬのコニカルチューブ中の２０ｍＬのＣＭ２に直ちに移した。細胞を洗浄し、４００×ＣＦで５分間遠心分離するために、ＩＬ－２なしのＣＭ２を使用して４０ｍＬにＱＳ。上清を吸引し、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２で補充された５ｍＬの温かいＣＭ２に再懸濁した。
自動セルカウンターを使用して細胞を計数するために、少量のアリコート（２０μＬ）を重複して取り出した。計数を記録した。計数しながら、ＴＩＬ細胞を含む５０ｍＬのコニカルチューブを、加湿した３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターに入れ、ガス交換を可能にするためにキャップを緩めた。細胞濃度を決定し、ＴＩＬを、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充したＣＭ２中で１×１０６細胞／ｍＬに希釈した。
ｍｉｎｉ－ＲＥＰの０日目まで、加湿した３７℃のインキュベーターで必要な数のウェルにおいて、２４ウェル組織培養プレートの１ウェル当たり２ｍＬで培養した。混乱及び潜在的な相互汚染を避けるために、別個の２４ウェル組織培養プレートで異なるＴＩＬ株を培養した。
０日目、Ｍｉｎｉ－ＲＥＰを開始する。試験されるフィーダーロットの数に十分なＣＭ２培地を調製した。（例えば、一度に４つのフィーダーロットを試験するために、８００ｍＬのＣＭ２培地を調製した）。上記で調製したＣＭ２の一部を分注し、それを細胞の培養のために３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２で補充した。（例えば、一度に４つのフィーダーロットを試験するために、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む５００ｍＬのＣＭ２培地を調製する）。
相互汚染を防ぐために各ＴＩＬ株を別々に操作し、ＴＩＬ培養物を入れた２４ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、ＢＳＣに移した。
無菌トランスファーピペットまたは１００～１０００μＬピペッター及びチップを使用して、約１ｍＬの培地を、使用されるＴＩＬの各ウェルから取り出し、２４ウェル組織培養プレートの未使用のウェルに入れる。
新鮮な無菌トランスファーピペットまたは１００～１０００μＬピペッター及びチップを使用して、残りの培地をウェル内のＴＩＬと混合して細胞を再懸濁し、次いで細胞懸濁液を、ＴＩＬロット名のラベルが付いた５０ｍＬコニカルチューブに移し、容量を記録した。
予備の培地でウェルを洗浄し、その容量を同じ５０ｍＬコニカルチューブに移した。細胞を４００×ＣＦで回転させて、細胞ペレットを収集する。培地上清を吸引除去し、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含有する２～５ｍＬのＣＭ２培地に細胞ペレットを再懸濁し（採取したウェルの数及びペレットのサイズに基づいて使用される容量）、容量は、１．３×１０６細胞／ｍＬを超える濃度を保証するのに十分である必要がある。
血清学的ピペットを使用して、細胞懸濁液を十分に混合し、容量を記録した。自動セルカウンターを使用して細胞を計数するために、２００μＬを取り出した。計数しながら、ＴＩＬ細胞を含む５０ｍＬのコニカルチューブを、加湿した５％ ＣＯ２、３７℃インキュベーターに入れ、ガス交換を可能にするためにキャップを緩めた。計数を記録した。
ＴＩＬ細胞を含有する５０ｍＬのコニカルチューブをインキュベーターから取り出し、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２で補充された温かいＣＭ２中、１．３×１０６細胞／ｍＬの濃度でそれらの細胞を再懸濁した。キャップを緩めた状態で、５０ｍＬのコニカルチューブをインキュベーターに戻した。
第２のＴＩＬ株について、上記のステップを繰り返した。
ＴＩＬを実験用のＴ２５フラスコに入れる直前に、ＴＩＬを、以下の通り１：１０に希釈して１．３×１０５細胞／ｍＬの最終濃度にした。
ＭＡＣＳ ＧＭＰ ＣＤ３ピュア（ＯＫＴ３）作用溶液を調製する。ＯＫＴ３のストック溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を４℃の冷蔵庫から取り出し、ＢＳＣに入れた。ｍｉｎｉ－ＲＥＰの培地では、最終濃度３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３を使用した。
実験の各Ｔ２５フラスコ内の２０ｍＬに対して６００ｎｇのＯＫＴ３が必要であり、これは、２０ｍＬ毎に６０μＬの１０μｇ／ｍＬ溶液、または各フィーダーロットについて試験した６つのフラスコすべてで３６０μＬに相当する。
試験した各フィーダーロットについて、４００μＬの１：１００希釈の１ｍｇ／ｍＬ ＯＫＴ３を、１０μｇ／ｍＬの作業濃度で作製した（例えば、４つのフィーダーロットを一度に試験する場合、１６００μＬの１：１００希釈の１ｍｇ／ｍＬ ＯＫＴ３：１６μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＯＫＴ３＋３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１．５８４ｍＬのＣＭ２培地を作製する）。
Ｔ２５フラスコを調製する。フィーダー細胞を調製する前に、各フラスコにラベルを付け、フラスコにＣＭ２培地を充填した。フラスコを３７℃の加湿した５％ ＣＯ２インキュベーターに入れ、残りの成分を添加するのを待つ間、培地を保温した。一旦フィーダー細胞が調製されると、各フラスコ内のＣＭ２に成分が添加される。
Figure 2024512029000040
フィーダー細胞を調製する。このプロトコルについて試験されたロット当たり７８×１０６フィーダー細胞の最小値が必要であった。ＳＤＢＢによって凍結された各１ｍＬバイアルは、凍結時に１００×１０６個の生細胞を有していた。液体Ｎ２ストレージからの解凍時の５０％の回収率を仮定すると、ロット当たり少なくとも２つの１ｍＬバイアルのフィーダー細胞を解凍して、各ＲＥＰに推定１００×１０６個の生細胞を与えることが推奨された。あるいは、１．８ｍＬバイアルで供給された場合、１つのバイアルだけで十分なフィーダー細胞が提供された。
フィーダー細胞を解凍する前に、試験される各フィーダーロットにＩＬ－２を含まないおよそ５０ｍＬのＣＭ２を予熱した。指定されたフィーダーロットバイアルをＬＮ２ストレージから取り出し、ジッパーストレージバッグに入れ、氷上に置いた。３７℃の水浴に浸すことによって、閉じたジッパーストレージバッグ内のバイアルを解凍した。バイアルをジッパーバッグから取り出し、７０％ ＥｔＯＨでスプレーまたはワイプし、ＢＳＣに移した。
トランスファーピペットを使用して、フィーダーバイアルの内容物を、５０ｍＬのコニカルチューブ中の３０ｍＬの温かいＣＭ２に直ちに移した。バイアルを少量のＣＭ２で洗浄して、バイアル内のいかなる残留細胞も除去し、４００×ＣＦで５分間遠心分離した。上清を吸引し、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を加えた４ｍＬの温かいＣＭ２に再懸濁した。自動セルカウンターを使用して細胞を計数するために、２００μＬを取り出した。計数を記録した。
３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を加えた温かいＣＭ２中、１．３×１０７細胞／ｍＬで細胞を再懸濁した。ＴＩＬ細胞を１．３×１０６細胞／ｍＬから１．３×１０５細胞／ｍＬに希釈した。
共培養物を準備する。ＴＩＬ細胞を１．３×１０６細胞／ｍＬから１．３×１０５細胞／ｍＬに希釈した。４．５ｍＬのＣＭ２培地を１５ｍＬのコニカルチューブに添加した。インキュベーターからＴＩＬ細胞を取り出し、１０ｍＬの血清ピペットを使用して十分に再懸濁した。１．３×１０６細胞／ｍＬのＴＩＬ懸濁液から０．５ｍＬの細胞を取り出し、１５ｍＬのコニカルチューブ中の４．５ｍＬの培地に添加した。ＴＩＬストックバイアルをインキュベーターに戻した。よく混ぜた。第２のＴＩＬ株に対して繰り返した。
単一フィーダーロット用に予熱した培地を入れたフラスコを、インキュベーターからＢＳＣに移した。１ｍＬのピペットチップで数回上下にピペッティングすることによってフィーダー細胞を混合し、そのフィーダーロットの各フラスコに１ｍＬ（１．３×１０７細胞）を移した。６０μＬのＯＫＴ３作用ストック（１０μｇ／ｍＬ）を各フラスコに追加した。２つの対照フラスコをインキュベーターに戻した。
各ＴＩＬロットの１ｍＬ（１．３×１０５）を、対応するラベルの付いたＴ２５フラスコに移した。フラスコをインキュベーターに戻し、直立させてインキュベートした。５日目まで乱さなかった。試験したすべてのフィーダーロットについて、この手順を繰り返した。
５日目、培地変更。３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含むＣＭ２を調製した。各フラスコに１０ｍＬが必要である。１０ｍＬピペットを使用して、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１０ｍＬの温かいＣＭ２を各フラスコに移した。フラスコをインキュベーターに戻し、７日目まで直立させてインキュベートした。試験したすべてのフィーダーロットについて繰り返した。
７日目、採取。インキュベーターからフラスコを取り出し、ＢＳＣに移し、フラスコの底部の細胞層を乱さないように注意する。フラスコの底部で成長する細胞を乱すことなく、各試験フラスコから１０ｍＬの培地を取り出し、対照フラスコの各々から１５ｍＬの培地を取り出した。
１０ｍＬの血清ピペットを使用して、残りの培地に細胞を再懸濁し、よく混合して細胞の塊をすべて破壊した。ピペッティングすることによって細胞懸濁液を完全に混合した後、細胞計数のために２００μＬを取り出した。自動セルカウンター装置とともに適切な標準操作手順を使用して、ＴＩＬを計数した。７日目に計数を記録した。試験したすべてのフィーダーロットについて、この手順を繰り返した。
フィーダー対照フラスコは、複製不全について評価し、ＴＩＬを含有するフラスコは、０日目からの倍率拡張について評価した。
７日目、フィーダー対照フラスコの１４日目までの継続。フィーダー対照フラスコの７日目の計数を完了した後、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５ｍＬの新鮮なＣＭ２培地を対照フラスコの各々に追加した。対照フラスコをインキュベーターに戻し、１４日目まで直立位置でインキュベートした。
１４日目、フィーダー対照フラスコの長期非増殖。インキュベーターからフラスコを取り出し、ＢＳＣに移し、フラスコの底部の細胞層を乱さないように注意した。フラスコの底部で成長する細胞を乱すことなく、各対照フラスコからおよそ１７ｍＬの培地を取り出した。５ｍＬの血清ピペットを使用して、残りの培地に細胞を再懸濁し、よく混合して細胞の塊をすべて破壊した。各フラスコについて、容量を記録した。
ピペッティングすることによって細胞懸濁液を完全に混合した後、細胞計数のために２００μＬを取り出した。ＴＩＬは、自動セルカウンター装置と併せて適切な標準操作手順を使用して計数し、計数を記録した。試験したすべてのフィーダーロットについて、この手順を繰り返した。
Ｂ．結果及び承認基準プロトコル
結果。ガンマ線照射の線量は、フィーダー細胞を複製不全にするのに十分であった。すべてのロットは、評価基準を満たすことが予想され、また０日目と比較して、ＲＥＰ培養の７日目に残っているフィーダー細胞の総有効数の低減を示した。すべてのフィーダーロットは、ＲＥＰ培養の７日目までのＴＩＬ成長の１００倍拡張の評価基準を満たすことが予想された。フィーダー対照フラスコの１４日目の計数は、７日目に見られた非増殖傾向を継続すると予想された。
承認基準。フィーダー細胞の各ロットについて試験された各複製ＴＩＬ株について、以下の承認基準が満たされた。承認基準は、以下の表３７に示されるように、２倍であり、これは、本明細書に記載の方法を使用して、効力アッセイ承認基準と組み合わせてもよい。
Figure 2024512029000041
３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養した場合に、ＭＮＣフィーダー細胞の複製を不全にするのに十分な放射線量を評価した。複製不全は、ＲＥＰの７日目及び１４日目の自動細胞計数によって決定された総生細胞数（ＴＶＣ）によって評価した。
承認基準は、「成長なし」であり、これは、ＲＥＰの０日目に培養された最初の生細胞数から７日目及び１４日目に総生細胞数が増加していないことを意味する。
フィーダー細胞がＴＩＬ拡張をサポートする能力を評価した。ＴＩＬ成長は、ＲＥＰの０日目の培養開始からＲＥＰの７日目までの生細胞の倍率拡張の観点から測定された。自動細胞計数によって評価されるように、７日目に、ＴＩＬ培養物は最低１００倍の拡張を達成した（すなわち、ＲＥＰの０日目に培養された生ＴＩＬ細胞の総数の１００倍超）。
承認基準を満たさないＭＮＣフィーダーロットの偶発性試験。ＭＮＣフィーダーロットが上で概説された承認基準のうちのいずれかを満たさなかった場合は、以下のステップを実行してロットを再試験し、単純な実験者エラーを原因として除外する。
ロットの衛星試験バイアルが２つ以上残っている場合は、ロットを再試験した。ロットの衛星試験バイアルが１つ残っているか、まったく残っていない場合、上記の承認基準に従ってロットは失敗であった。
適格となるには、問題のロット及び対照ロットが、上記の承認基準を達成する必要があった。これらの基準を満たすと、ロットは使用のために放出される。
実施例３：ガンマ線照射末梢単核細胞の個々のロットを適格性確認する
この実施例は、本明細書に記載の例示的な方法において同種異系フィーダー細胞として使用するためのガンマ線照射末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）の個々のロットを適格性確認するための新規の簡略化された手順を説明する。この実施例は、ＴＩＬの臨床ロットの産生に使用するための照射されたＰＢＭＣ細胞ロットの評価のためのプロトコルを提供する。照射された各ＰＢＭＣロットは、個々のドナーから調製した。１００以上の適格性確認プロトコルの過程で、すべての場合において、ＳＤＢＢ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ）からの照射されたＰＢＭＣロットは、ＲＥＰの７日目にＴＩＬを１００倍より多く拡張することが示された。この修正された適格性確認プロトコルは、ＳＤＢＢから照射されたドナーＰＢＭＣロットに適用することを意図しており、これをさらに試験して、受け取ったガンマ線の線量がそれらを複製不全にするのに十分であることを検証した。１４日間にわたって複製不全が維持されたことが実証されると、ドナーＰＢＭＣロットは、ＴＩＬの臨床ロットを産生するための使用に「適格」であるとみなされた。
ＴＩＬの現在の標準ＲＥＰには、γ線を照射し、成長を停止させたＰＢＭＣが必要であった。ＰＢＭＣの膜受容体は、抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体に結合し、培養中のＴＩＬに架橋し、ＴＩＬを刺激して拡張させる。ＰＢＭＣロットは、個々のドナーから採取した全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ上で遠心分離し、洗浄し、照射し、ＧＭＰ条件下で凍結保存した。
ＴＩＬ療法を受けた患者には、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こす可能性があるため、生きたＰＢＭＣを注入しないことが重要である。したがって、ドナーＰＢＭＣは、細胞にγ線を照射することによって成長を停止させ、再培養時に二本鎖ＤＮＡ切断が起こり、ＰＢＭＣの細胞生存性が喪失する。
照射されたＰＢＭＣロットの評価基準は、それらの複製不全であった。
フィーダーロットは、直立したＴ２５組織培養フラスコを使用して、ＴＩＬと共培養するかのようにｍｉｎｉ－ＲＥＰ形式で試験した。対照ロットは、評価基準を満たすことが歴史的に示されている照射されたＰＢＭＣの１ロットであり、対照として実験ロットと並行して実行した。試験した照射ドナーＰＢＭＣの各ロットについて、複製したフラスコを実行した。
実験プロトコル－０日目。試験されるドナーＰＢＭＣの各ロットに対して約９０ｍＬのＣＭ２培地を調製した。ＣＭ２を３７℃の水浴中で保温した。６×１０６ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２のアリコートを解凍した。ＣＭ２培地をＢＳＣに戻し、フードに入れる前に７０％ ＥｔＯＨで拭いた。試験したＰＢＭＣの各ロットについて、約６０ｍＬのＣＭ２を別個の滅菌ボトルに取り出した。解凍した６×１０６ＩＵ／ｍＬストック溶液からのＩＬ－２をこの培地に添加し、最終濃度を３０００ＩＵ／ｍＬにした。このボトルに「ＣＭ２／ＩＬ２」（または同様のもの）のラベルを付けて、補足されていないＣＭ２と区別した。
ＯＫＴ３を調製する。抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）のストック溶液を４℃の冷蔵庫から取り出し、ＢＳＣに入れた。ｍｉｎｉ－ＲＥＰの培地では、最終濃度３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３を使用した。１ｍｇ／ｍＬのストック溶液から抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）の１０μｇ／ｍＬの作用溶液を調製した。必要になるまで冷蔵庫に入れた。
試験した各ＰＢＭＣロットについて、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）ストックの１：１００希釈液１５０μＬを調製する。例えば、一度に４つのＰＢＭＣロットを試験するために、６μＬの１ｍｇ／ｍＬストック溶液を３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２で補足された５９４μｌのＣＭ２に添加することによって、６００μｌの１０μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を調製する。
フラスコを調製する。フラスコ当たり１９ｍＬのＣＭ２／ＩＬ－２をラベル付けされたＴ２５フラスコに添加し、細胞を調製しながら３７℃の加湿した５％ ＣＯ２インキュベーターにフラスコを入れた。
照射されたＰＢＭＣを調製する。ＬＮ２ストレージから試験されるＰＢＭＣロットのバイアルを取得した。これらを－８０℃に置くか、または解凍する前にドライアイス上で保持した。解凍される各ロットについて、３０ｍＬのＣＭ２（ＩＬ－２補充なし）を、５０ｍＬのコニカルチューブに入れた。解凍されるＰＢＭＣの異なるロット番号で各管にラベルを付けた。管にキャップをしっかりと閉め、使用する前に３７℃の水浴に入れた。必要に応じて、５０ｍＬのコニカルチューブをＢＳＣに戻し、フードに入れる前に７０％ ＥｔＯＨで拭いた。
バイアルＰＢＭＣを冷蔵から取り出し、３７℃の水浴中のフローティングチューブラックに入れて解凍する。少量の氷がバイアルに残るまで解凍を進めた。滅菌トランスファーピペットを使用して、バイアルの内容物を、５０ｍＬのコニカルチューブ内の３０ｍＬのＣＭ２にすぐに移した。約１ｍＬの培地を管から取り出してバイアルをすすぎ、すすぎ液を５０ｍＬのコニカルチューブに戻した。キャップをしっかりと閉め、穏やかに回転させて細胞を洗浄した。
４００×ｇで５分間、室温で遠心分離した。上清を吸引し、１０００μＬのピペットチップを使用して、細胞ペレットを１ｍＬの温かいＣＭ２／ＩＬ－２に再懸濁した。代替的に、培地を添加する前に、キャップをした管を空のチューブラックに沿って引きずることにより、細胞ペレットを再懸濁した。細胞ペレットを再懸濁した後、ＣＭ２／ＩＬ－２培地を使用して体積を４ｍＬにした。体積を記録した。
自動セルカウンターを使用して細胞を計数するために、少量のアリコート（例えば、１００μＬ）を取り出した。特定の自動セルカウンターＳＯＰに従って、重複して計数を行った。細胞の計数を行う前に、ＰＢＭＣの希釈を行う必要があった可能性が最も高い。推奨される開始希釈は１：１０であったが、これは使用するセルカウンターのタイプによって異なっていた。計数を記録した。
ＣＭ２／ＩＬ－２培地を使用して、ＰＢＭＣの濃度を１．３×１０７細胞／ｍＬに調整した。穏やかに回転させるか、または血清ピペットを使用して上下に穏やかに吸引することによってよく混ぜた。
培養フラスコを準備する。２つのラベル付きＴ２５フラスコを、組織培養インキュベーターからＢＳＣに戻した。抗ＣＤ３／ＯＫＴ３の１０μｇ／ｍＬバイアルをＢＳＣに戻した。各フラスコに１ｍＬの１．３×１０７ＰＢＭＣ細胞懸濁液を添加した。各フラスコに６０μＬの１０μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３／ＯＫＴ３を添加した。キャップをしたフラスコを組織培養インキュベーターに戻し、乱すことなく１４日間成長させた。次のロットで必要になるまで、抗ＣＤ３／ＯＫＴ３バイアルを冷蔵庫に戻した。評価されるＰＢＭＣの各ロットについて繰り返した。
１４日目、ＰＢＭＣの非増殖の測定。複製したＴ２５フラスコをＢＳＣに戻した。各フラスコについて、新鮮な１０ｍＬの血清ピペットを使用して、各フラスコから約１７ｍＬを取り出し、残りの培地を注意深く引き上げて、フラスコに残っている体積を測定した。体積を記録した。
同じ血清ピペットを使用して上下にピペッティングすることによって、試料をよく混ぜた。
計数するために各フラスコから２００μＬの試料を取り出した。自動セルカウンターを使用して細胞を計数した。各ステップを、評価されるＰＢＭＣの各ロットについて繰り返した。
結果。γ線照射の線量は、フィーダー細胞を複製不全にするのに十分であると予想された。すべてのロットは、評価基準を満たすことが予想され、０日目と比較して、ＲＥＰ培養の１４日目に残っているフィーダー細胞の総有効数の低減を示した。
承認基準。試験した各照射ドナーＰＢＭＣロットについて、以下の承認基準が満たされた：「成長なし」－１４日目の生細胞の総数が、ＲＥＰの０日目に培養された最初の生細胞数よりも少なかったことを意味する。
承認基準を満たさないＭＮＣフィーダーロットの偶発性試験。照射ドナーＰＢＭＣロットが上記の承認基準を満たさなかった場合は、以下のステップを実行してロットを再試験し、単純な実験者エラーを失敗の原因として除外した。ロットの衛星試験バイアルが２つ以上残っている場合は、ロットを再試験した。ロットの衛星バイアルが１つ残っているか、まったく残っていない場合は、上記の承認基準に従ってロットが失敗した。
適格となるために、偶発性試験を通過するＰＢＭＣロットは、対照ロット及び問題のロットの両方の複製がともに承認基準を達成した。この基準を満たすと、ロットは使用のために放出された。
実施例４：ＩＬ－２ストック溶液の調製
この実施例は、精製されて凍結乾燥された組換えヒトインターロイキン－２を、ｒｈＩＬ－２の使用を含むものを含む、本出願及び実施例に記載されるものすべてを含む、さらなる組織培養プロトコルでの使用に好適なストック試料に溶解するプロセスを説明する。
手順。０．２％酢酸溶液（ＨＡｃ）を調製した。２９ｍＬの滅菌水を、５０ｍＬのコニカルチューブに移した。１ｍＬの１Ｎ酢酸を、５０ｍＬのコニカルチューブに追加した。チューブを２～３回反転させながら十分に混合した。Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルターを使用した濾過によってＨＡｃ溶液を滅菌した。
ＰＢＳ中の１％ ＨＳＡを調製する。４ｍＬの２５％ ＨＳＡストック溶液を、１５０ｍＬの滅菌フィルターユニット内の９６ｍＬのＰＢＳに追加した。溶液を濾過した。４℃で保管した。調製したｒｈＩＬ－２の各バイアルについて、フォームに記入する。
ｒｈＩＬ－２ストック溶液を調製した（最終濃度６×１０６ＩＵ／ｍＬ）。ｒｈＩＬ－２の各ロットは異なり、必要な情報は、以下のような製造業者の分析証明書（ＣＯＡ）に見出された：１）バイアル当たりのｒｈＩＬ－２の質量（ｍｇ）、２）ｒｈＩＬ－２の比活性（ＩＵ／ｍｇ）、及び３）推奨０．２％ ＨＡｃ再構成体積（ｍＬ）。
以下の等式を使用して、ｒｈＩＬ－２ロットに必要な１％ＨＳＡの体積を計算した。
Figure 2024512029000042
例えば、ｒｈＩＬ－２ロット１０２００１２１（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）のＣＯＡによると、１ｍｇバイアルの比活性は、２５×１０６ＩＵ／ｍｇである。ｒｈＩＬ－２を２ｍＬの０．２％ＨＡｃ中で再構成することが推奨される。
Figure 2024512029000043
ＩＬ－２バイアルのゴム栓をアルコールワイプで拭いた。３ｍＬシリンジに取り付けた１６Ｇ針を使用して、推奨体積の０．２％ ＨＡｃをバイアルに注入した。針を抜くときに栓が外れないように注意した。バイアルを３回反転させ、すべての粉末が溶解するまで回転させた。栓を慎重に取り外し、アルコールワイプ上に置いた。計算された容量の１％ ＨＳＡをバイアルに添加した。
ｒｈＩＬ－２の保管：短期保管（７２時間未満）の場合、４℃でバイアルを保管した。長期保管（７２時間超）の場合、バイアルをより小さい体積に等分し、使用の準備が整うまで－２０℃でクライオバイアル内で保管した。凍結／解凍サイクルを回避した。調製日から６ヶ月後に有効期限が切れた。ＲｈＩＬ－２ラベルには、ベンダー及びカタログ番号、ロット番号、有効期限、オペレーターのイニシャル、濃度、ならびにアリコートの体積が含まれた。
実施例５：凍結保存プロセス
この実施例では、ＣｒｙｏＭｅｄ制御速度冷凍庫、モデル７４５４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、本明細書に記載の手順で調製したＴＩＬの凍結保存プロセス方法について説明する。
使用した機器は以下の通りであった：アルミニウムカセットホルダーラック（ＣＳ７５０フリーザーバッグに対応）、７５０ｍＬバッグ用凍結保存カセット、低圧（２２ｐｓｉ）液体窒素タンク、冷蔵庫、熱電対センサー（バッグ用リボンタイプ）、及びＣｒｙｏＳｔｏｒｅ ＣＳ７５０冷凍バッグ（ＯｒｉＧｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
凍結プロセスは、核形成から－２０℃まで０．５℃の速度、及び－８０℃の終了温度まで毎分１℃の冷却速度を提供する。プログラムパラメータは、以下の通りである：ステップ１－４℃で待つ、ステップ２：－４℃まで１．０℃／分（試料温度）、ステップ３：－４５℃まで２０．０℃／分（チャンバ温度）、ステップ４：－１０．０℃まで１０．０℃／分（チャンバ温度）、ステップ５：－２０℃まで０．５℃／分（チャンバ温度）、及びステップ６：－８０℃まで１．０℃／分（試料温度）。
実施例６：ＧＥＮ２及びＧＥＮ３の例示的なプロセス
この実施例は、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３のプロセスを示す。Ｇｅｎ２プロセス及びＧｅｎ３プロセスのＴＩＬは、一般に腫瘍の外科的切除によって個々の患者から得られ、その後、エクスビボで拡張された自己ＴＩＬで構成されている。Ｇｅｎ３プロセスのプライミングによる第１の拡張ステップは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）及びモノクローナル抗体ＯＫＴ３の存在下での細胞培養であり、照射された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の足場上のＴ細胞共受容体ＣＤ３を標的とする。例示的なＧｅｎ２プロセスは、米国特許第１１，０８３，７５２号及び同第１１，１６８，３０４号に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれ、これらの開示は、ＰＢＭＣをａＡＰＣまたはＴｈｐ１細胞もしくはＵ９３７細胞などの本明細書の他の箇所に記載される抗原提示細胞と置き換えるように修飾されてもよく、任意選択で遺伝子修飾されてもよく、任意選択で照射されてもよい。
Ｇｅｎ２ ＴＩＬ製品の製造は、２つの相からなる：１）急速拡張前（ＲＥＰ前）及び２）急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）。ＲＥＰ前中に、切除腫瘍を、各寸法２～３ｍｍの５０個以下の断片に切断し、血清含有培養培地（１０％ ＨｕＳＡＢを補充したＲＰＭＩ１６４０培地）及び６，０００ＩＵ／ｍＬのインターロイキン－２（ＩＬ－２）で１１日間培養した。１１日目にＴＩＬを採取し、大規模二次ＲＥＰ拡張に導入した。ＲＥＰは、５日間の３０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を補充した５Ｌ体積のＣＭ２中の１５０μｇのモノクローナル抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を装填した５×１０９個の照射された同種異系ＰＢＭＣフィーダー細胞（または任意選択で遺伝子修飾され、任意選択で照射されたＴｈｐ１細胞もしくはＵ９３７細胞などの、ａＡＰＣもしくは本明細書の他の箇所に記載される抗原提示細胞）の共培養におけるＲＥＰ前由来の２００×１０６個以下の生細胞の活性化からなる。１６日目に、培養物を９０％減容し、細胞画分を１フラスコ当たり１×１０９以上の生リンパ球で複数のＧ－Ｒｅｘ－５００フラスコに分割し、ＣＭ４で５ＬにＱＳする。ＴＩＬをさらに６日間インキュベートする。ＲＥＰを２２日目に採取し、洗浄し、製剤化し、凍結保存した後に、注入のために臨床現場に－１５０℃で発送する。
Ｇｅｎ３ ＴＩＬ製品の製造は、３つの相からなる：１）プライミングによる第１の拡張プロトコル、２）急速な第２の拡張プロトコル（急速拡張相またはＲＥＰとも称される）、及び３）継代培養分割。プライミングによる第１の拡張ＴＩＬ増殖を行うために、切除した腫瘍を各寸法２～３ｍｍ以下の１２０個以下の断片に切断した。プライミングによる第１の拡張の０日目に、ＯＫＴ－３を装填したおよそ２．５×１０８個の照射された同種異系ＰＢＭＣフィーダー細胞のフィーダー層を、３つの１００ＭＣＳ容器の各々内のおよそ１００ｃｍ２の表面積上に確立した。腫瘍断片を、各々が５００ｍＬの血清含有ＣＭ１培養培地及び６，０００ＩＵ／ｍＬのインターロイキン－２（ＩＬ－２）及び１５ｕｇのＯＫＴ－３を含む３つの１００ＭＣＳ容器に分布し、その中で７日間培養した。７日目に、ＯＫＴ－３を装填したおよそ５×１０８個の照射された同種異系ＰＢＭＣフィーダー細胞の追加のフィーダー細胞層を、３つの１００ＭＣＳ容器の各々内の腫瘍断片化培養相に組み込み、５００ｍＬのＣＭ２培養培地及び６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０μｇのＯＫＴ－３で培養することによって、ＲＥＰを開始した。ＲＥＰの開始を、１００ＭＣＳ容器へのＯＫＴ３を装填したフィーダー細胞の閉鎖系流体移送を使用して、同じ容器内のプライミングによる第１の拡張培養物全体を活性化することによって増強した。Ｇｅｎ３の場合、ＴＩＬのスケールアップまたは分割に、細胞培養物全体を閉鎖系流体移送によってより大きい容器にスケーリングし、移し（１００Ｍフラスコから５００Ｍフラスコに）、追加の４ＬのＣＭ４培地を添加するプロセスステップを含めた。１６日目にＲＥＰ細胞を採取し、洗浄し、製剤化し、凍結保存した後に、注入のために臨床現場に－１５０℃で発送する。ＰＢＭＣの代わりに、任意選択で遺伝子修飾され、任意選択で照射されたＴｈｐ１またはＵ９３７細胞などの、ａＡＰＣまたは本明細書の他の箇所に記載される抗原提示細胞を用いてもよい。
全体として、Ｇｅｎ３プロセスは、より短く、よりスケーラブルであり、かつ簡単に修正可能な拡張プラットフォームであり、堅牢な製造及びプロセス比較可能性に適するように適応する。
Figure 2024512029000044
０日目に、両方のプロセスについて、腫瘍を３回洗浄し、断片をランダム化し、２つのプールに分けた（プロセス毎に１つのプール）。Ｇｅｎ２プロセスの場合、断片を、６，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を含有する１ＬのＣＭ１培地を含む１つのＧＲＥＸ １００ＭＣＳフラスコに移した。Ｇｅｎ３プロセスでは、断片を、６，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２、１５ｕｇのＯＫＴ－３及び２．５×１０８個のフィーダー細胞を含有する５００ｍＬのＣＭ１を含む１つのＧ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコに移した。Ｒｅｐ開始日のＴＩＬの播種は、各プロセスに従って異なる日に起こった。Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコを９０％減容したＧｅｎ２プロセスの場合、収集した細胞懸濁液を新たなＧ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳに移して、ＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）＋５×１０９フィーダー細胞及びＯＫＴ－３（３０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＣＭ２培地中で１１日目にＲＥＰを開始した。細胞を拡張し、プロトコルに従って１６日目にＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を含有するＣＭ４培地を含む複数のＧ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳフラスコに分割した。その後、培養物を採取し、プロトコルに従って２２日目に凍結保存した。Ｇｅｎ３プロセスの場合、ＲＥＰの開始は７日目に起こり、同じＧ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳをＲＥＰの開始に使用した。簡潔には、ＩＬ－２（６０００ＩＵ／ｍＬ）及び５×１０８個のフィーダー細胞を３０ｕｇのＯＫＴ－３とともに含有する５００ｍＬのＣＭ２培地を各フラスコに添加した。９～１１日目に、培養をスケールアップした。Ｇ－Ｒｅｘ １００Ｍの全体積（１Ｌ）をＧ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳに移し、ＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を含有する４ＬのＣＭ４を添加した。フラスコを５日間インキュベートした。培養物を採取し、１６日目に凍結保存した。
比較には、２つの肺腫瘍（Ｌ４０５４及びＬ４０５５）と１つの黒色腫腫瘍（Ｍ１０８５Ｔ）の３つの異なる腫瘍を含めた。
Ｌ４０５４及びＬ４０５５の場合、ＣＭ１培地（培養培地１）、ＣＭ２培地（培養培地２）、及びＣＭ４培地（培養培地４）を事前に調製し、４℃で保持した。ＣＭ１培地及びＣＭ２培地を、培地を濾過した場合の細胞増殖と培地を濾過しなかった場合の細胞増殖を比較するために、濾過せずに調製した。
Ｌ４０５５腫瘍の場合、ＲＥＰの開始及びスケールアップ時に、培地を事前に３７℃で最大２４時間温めた。
結果。達成された生細胞の総数について、Ｇｅｎ３の結果はＧｅｎ２の３０％以内であった。Ｇｅｎ３最終製品は、再刺激後により高いＩＮＦ－γ産生を示した。Ｇｅｎ３最終製品は、存在する固有の全ＣＤＲ３配列によって測定される、増加したクローンの多様性を示した。Ｇｅｎ３最終製品は、より長い平均テロメア長を示した。
Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスでのＲＥＰ前及びＲＥＰ拡張は、上記の手順に従った。各腫瘍について、２つのプールに同数の断片を含めた。腫瘍のサイズが小さいため、１フラスコ当たりの最大断片数は達成されなかった。総ＲＥＰ前細胞（ＴＶＣ）を採取し、Ｇｅｎ２プロセスの場合は１１日目に、Ｇｅｎ３プロセスの場合は７日目に計数した。２つのＲＥＰ前群を比較するために、細胞計数を培養物中に提供された断片の数で割り、１断片当たりの平均生細胞を計算した。以下の表３９に示されるように、Ｇｅｎ２プロセスは、Ｇｅｎ３プロセスと比較して、１断片当たりより多くの細胞を一貫して成長させた。ＲＥＰ前ＴＶＣを７で割り、その後、１１を掛けて計算した、１１日目にＧｅｎ３プロセスで予想されるＴＶＣ数の外挿計算。
Figure 2024512029000045
Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスの場合、ＴＶＣをプロセス条件毎に計数し、生細胞パーセントをプロセス日毎に生成した。採取時に、２２日目（Ｇｅｎ２）及び１６日目（Ｇｅｎ３）の細胞を収集し、ＴＶＣ数を確立した。その後、ＴＶＣを０日目に提供された断片の数で割り、１断片当たりの平均生細胞を計算した。倍率拡張を、採取したＴＶＣをＲＥＰ開始ＴＶＣで割ることによって計算した。表４０に示されるように、Ｇｅｎ２とＧｅｎ３を比較すると、倍率拡張はＬ４０５４の場合では同様であり、Ｌ４０５５の場合、倍率拡張はＧｅｎ２プロセスの方が高かった。具体的には、この場合、培地をＲＥＰ開始日の前に２４温めた。Ｍ１０８５Ｔの場合のＧｅｎ３でもより高い倍率拡張が観察された。ＲＥＰ ＴＶＣを１６で割り、その後、２２を掛けて計算した、２２日目にＧｅｎ３プロセスで予想されるＴＶＣ数の外挿計算。
Figure 2024512029000046
採取時に、最終ＴＩＬ ＲＥＰ製品を生存率％の放出基準と比較した。Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスのすべての条件は、７０％の生存率基準を超えており、プロセス及び腫瘍間で同等であった。
Figure 2024512029000047
１フラスコ当たりの断片の数が最大必要数未満であったため、採取日の推定細胞計数を腫瘍毎に計算した。推定は、臨床腫瘍が０日目に２つまたは３つのフラスコに播種するのに十分な大きさであるという予想に基づいた。

Figure 2024512029000048
免疫表現型決定－ＴＩＬ最終製品の表現型マーカー比較。３つの腫瘍Ｌ４０５４、Ｌ４０５５、及びＭ１０８５Ｔは、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスの両方でＴＩＬ拡張を受けた。採取時に、ＲＥＰ ＴＩＬ最終製品をフローサイトメトリー分析にかけ、純度、分化、及びメモリーマーカーを試験した。すべての条件で、ＴＣＲ ａ／ｂ＋細胞パーセンテージは９０％超であった。
Ｇｅｎ３プロセスから採取したＴＩＬは、Ｇｅｎ２プロセスから採取したＴＩＬと比較して、より高いＣＤ８及びＣＤ２８発現を示した。Ｇｅｎ２プロセスは、より高いＣＤ４＋パーセンテージを示した。
Ｇｅｎ３プロセスから採取したＴＩＬは、Ｇｅｎ２プロセス由来のＴＩＬと比較して、セントラルメモリー区画でより高い発現を示した。
活性化及び疲弊マーカーを２つの腫瘍Ｌ４０５４及びＬ４０５５由来のＴＩＬで分析して、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３ ＴＩＬ拡張プロセス由来の最終ＴＩＬ製品を比較した。活性化及び疲弊マーカーは、Ｇｅｎ２プロセスとＧｅｎ３プロセスとの間で同等であった。
再刺激時のインターフェロンγ分泌。採取日、Ｇｅｎ２の場合は２２日目、Ｇｅｎ３の場合は１６日目に、ＴＩＬは、Ｌ４０５４及びＬ４０５５の場合、コーティングした抗ＣＤ３プレートで一晩再刺激を受けた。Ｍ１０８５Ｔでの再刺激は、抗ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ１３７ビーズを使用して行った。すべての条件で再刺激の２４時間後に上清を収集し、上清を凍結させた。ＥＬＩＳＡによるＩＦＮ－γ分析を、同じＥＬＩＳＡプレートを使用して両方のプロセス由来の上清で同時に評価した。分析した３つの腫瘍で、Ｇｅｎ３プロセスからのＩＦＮ－γのより高い産生が観察された。
培養培地中のＩＬ－２レベルの測定。Ｇｅｎ２プロセスとＧｅｎ３プロセスとの間のＩＬ－２消費量を比較するために、腫瘍Ｌ４０５４及びＬ４０５５で、ＲＥＰの開始時、スケールアップ時、及び採取日に細胞上清を収集した。細胞培養上清中のＩＬ－２の量を、Ｒ＆Ｄ製の定量化ＥＬＩＳＡキットによって測定した。一般的な傾向は、Ｇｅｎ２プロセスと比較して、Ｇｅｎ３プロセスではＩＬ－２濃度が高いままであることを示す。これは、プロセス全体を通して培地のキャリーオーバーと相まってＧｅｎ３のＲＥＰ開始時のＩＬ－２濃度がより高い（６０００ＩＵ／ｍＬ）ことに起因する可能性がある。
代謝基質及び代謝物分析。Ｄ－グルコース及びＬ－グルタミンなどの代謝基質のレベルを、全培地消費量の代わりに測定した。乳酸及びアンモニアなどのそれらの相互代謝物を測定した。グルコースは、ＡＴＰの形態でエネルギーを産生するためにミトコンドリアによって利用される培地中の単糖である。グルコースが酸化されると、乳酸が産生される（乳酸塩は乳酸のエステルである）。乳酸塩は、細胞の指数関数的成長期中に強く産生される。高レベルの乳酸塩は、細胞培養プロセスに悪影響を及ぼす。
Ｌ４０５４及びＬ４０５５の使用済み培地を、Ｇｅｎ２プロセス及びＧｅｎ３プロセスの両方で、ＲＥＰ開始時、スケールアップ時、及び採取日に収集した。使用済み培地の収集は、Ｇｅｎ２の場合は１１日目、１６日目、及び２２日目、Ｇｅｎ３の場合は７日目、１１日目、及び１６日目であった。上清を、グルコース、乳酸、グルタミン、ＧｌｕｔａＭａｘ、及びアンモニアの濃度についてＣＥＤＥＸバイオアナライザーで分析した。
Ｌ－グルタミンは、細胞培養培地製剤に必要な不安定な必須アミノ酸である。グルタミンにはアミンが含まれており、このアミド構造基は、窒素を細胞に輸送して送達することができる。Ｌ－グルタミンが酸化すると、細胞によって有毒なアンモニア副産物が産生される。Ｌ－グルタミンの分解に対抗するために、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスの培地に、水溶液中でより安定しており、かつ自発的に分解しないＧｌｕｔａｍａｘを補充した。２つの腫瘍株では、Ｇｅｎ３アームは、プロセス中のＬ－グルタミン及びＧｌｕｔａｍａｘの減少、ならびにＲＥＰ全体でアンモニアの増加を示した。Ｇｅｎ２アームでは、Ｌ－グルタミン及びＧｌｕｔａｍａｘの濃度が一定であり、アンモニア産生のわずかな増加が観察された。Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３のプロセスは、アンモニアについて採取日に同等であり、Ｌ－グルタミン分解にわずかな違いが見られた。
テロメアは、Ｆｌｏｗ－ＦＩＳＨによって繰り返される。Ｆｌｏｗ－ＦＩＳＨ技術を使用して、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスでのＬ４０５４及びＬ４０５５のテロメア反復の平均長を測定した。相対テロメア長（ＲＴＬ）の決定を、ＤＡＫＯ製のフローサイトメトリー分析用Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ＰＮＡキット／ＦＩＴＣを使用して計算した。Ｇｅｎ３は、Ｇｅｎ２と同等のテロメア長を示した。
ＣＤ３分析。各プロセスで生成された細胞製品のクローン多様性を決定するために、Ｌ４０５４及びＬ４０５５の採取したＴＩＬ最終製品をサンプリングし、Ｔ細胞受容体のＣＤＲ３部分の配列決定によるクローン多様性分析のためにアッセイした。
表４３は、採取したＴＩＬ細胞製品のＬ４０５４における共有される固有のＣＤＲ３配列パーセンテージに関するＧｅｎ２とＧｅｎ３との比較を示す。１９９個の配列がＧｅｎ３最終製品とＧｅｎ２最終製品との間で共有され、Ｇｅｎ３最終製品と共有されるＧｅｎ２由来の固有のＣＤＲ３配列の上位８０％の９７．０７％に相当する。

Figure 2024512029000049
表４４は、採取したＴＩＬ細胞製品のＬ４０５５における共有される固有のＣＤＲ３配列パーセンテージに関するＧｅｎ２とＧｅｎ３との比較を示す。１８３３個の配列がＧｅｎ３最終製品とＧｅｎ２最終製品との間で共有され、Ｇｅｎ３最終製品と共有されるＧｅｎ２由来の固有のＣＤＲ３配列の上位８０％の９９．４５％に相当する。
Figure 2024512029000050
ＣＭ１及びＣＭ２培地は、濾過せずに事前に調製し、腫瘍Ｌ４０５５の場合、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスで使用するまで４℃で保持した。
Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスのＲＥＰ開始日に、腫瘍Ｌ４０５５の場合、培地を３７℃で事前に２４時間温めた。
これらのプロセスで収集した上清中にＬＤＨは測定されなかった。
Ｍ１０８５Ｔ ＴＩＬ細胞計数を、Ｋ２ ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒセルカウンターを使用して実行した。
腫瘍Ｍ１０８５Ｔでは、代謝分析用の上清、活性化及び疲弊マーカー分析用のＴＩＬ製品、テロメア長、及びＣＤ３－ＴＣＲｖｂ分析などの試料は入手できなかった。
結論。この実施例では、３つの独立したドナー腫瘍組織を、機能的品質属性に加えて、拡張された表現型特徴付け、ならびにＧｅｎ２プロセス及びＧｅｎ３プロセス間の培地消費に関して比較する。
Ｇｅｎ２とＧｅｎ３のＲＥＰ前及びＲＥＰ拡張比較を、生成された総生細胞及び全有核細胞集団の生存率に関して評価した。採取日のＴＶＣ細胞用量は、Ｇｅｎ２（２２日）とＧｅｎ３（１６日）との間で同等ではなかった。Ｇｅｎ３細胞用量は、採取時に収集した総生細胞の約４０％であり、Ｇｅｎ２よりも低かった。
ＲＥＰ前採取は、７日目ではなく１１日目に起こり、ＲＥＰ採取は、１６日目ではなく２２日目に起こると仮定して、Ｇｅｎ３プロセスの外挿細胞数を計算した。どちらの場合も、Ｇｅｎ３は、Ｇｅｎ２プロセスと比較してＴＶＣの数値が近いことを示し、これは初期の活性化により、ＴＩＬの成長に対する全体的な性能が向上する可能性があることを示す。
Ｇｅｎ３プロセスでの追加フラスコ（２つまたは３つ）の外挿値の場合、処理される腫瘍サイズがより大きいと仮定し、記載されるようにプロセス毎に必要な最大断片数に到達する。２２日目のＧｅｎ２プロセスと比較して、Ｇｅｎ３プロセスの１６日目の採取時にＴＶＣで同様の用量に到達可能であり得ることが観察された。この観察は重要であり、培養物の初期活性化により、より短い処理時間でより良好なＴＩＬ性能が可能になり得ることを示す。
Ｇｅｎ２とＧｅｎ３のＲＥＰ前及びＲＥＰ拡張比較を、生成された総生細胞及び全有核細胞集団の生存率に関して評価した。採取日のＴＶＣ細胞用量は、Ｇｅｎ２（２２日）とＧｅｎ３（１６日）との間で同等ではなかった。Ｇｅｎ３細胞用量は、採取時に収集した総生細胞の約４０％であり、Ｇｅｎ２よりも低かった。
表現型特徴付けに関して、Ｇｅｎ２プロセスと比較してＧｅｎ３プロセスでの３つの腫瘍でより高いＣＤ８＋及びＣＤ２８＋発現が観察された。このデータは、Ｇｅｎ３プロセスがＧｅｎ２と比較して改善されたＴＩＬ最終製品の属性を有することを示す。
Ｇｅｎ３プロセスは、Ｇｅｎ２プロセスと比較してわずかに高いセントラルメモリー区画を示した。
Ｇｅｎ２プロセス及びＧｅｎ３プロセスは、Ｇｅｎ３プロセスの持続期間がより短いにもかかわらず、同等の活性化及び疲弊マーカーを示した。
ＩＦＮガンマ（ＩＦＮ－γ）産生は、分析した３つの腫瘍において、Ｇｅｎ２と比較してＧｅｎ３最終製品において３倍高かった。このデータは、Ｇｅｎ３プロセスがＧｅｎ２プロセスと比較して高機能でより強力なＴＩＬ製品を生成したことを示し、Ｇｅｎ３でのＣＤ８及びＣＤ２８発現がより高いことに起因する可能性がある。表現型特徴付けは、Ｇｅｎ２プロセスと比較して３つの腫瘍でＣＤ８＋、ＣＤ２８＋発現へのＧｅｎ３の肯定的な傾向を示唆した。
Ｇｅｎ２とＧｅｎ３との間のＴＩＬ最終製品のテロメア長は同等であった。
グルコース及び乳酸塩レベルは、Ｇｅｎ２最終製品とＧｅｎ３最終製品との間で同等であり、プロセス日毎に減容除去が実行されなかったこと、及びＧｅｎ２と比較してプロセスにおける培地全体の体積が少ないことに起因して、Ｇｅｎ３プロセスの培地の栄養素レベルが影響されなかったことを示唆する。
全体として、Ｇｅｎ３プロセスは、Ｇｅｎ２プロセスと比較してほぼ２倍の処理時間の短縮を示し、これにより、Ｇｅｎ３プロセスによって拡張されたＴＩＬ製品の売上原価（ＣＯＧ）の有意な削減がもたらされるであろう。
ＩＬ－２消費は、Ｇｅｎ２プロセスでのＩＬ－２消費の一般的な傾向を示しており、Ｇｅｎ３プロセスでは、古い培地が除去されなかったため、ＩＬ－２が高かった。
Ｇｅｎ３プロセスは、ＣＤＲ３ ＴＣＲａｂ配列分析によって測定されたより高いクローン多様性を示した。
Ｇｅｎ３プロセスを使用して、ＲＥＰ前の０日目のフィーダー及びＯＫＴ－３の添加により、ＴＩＬの初期活性化及びＴＩＬ成長における全体的により良好な性能が可能になった。
表４５は、現在のＧｅｎ２プロセスと比較したＧｅｎ３プロセスの様々な実施形態及び成果を説明する。

Figure 2024512029000051
実施例７：０日目のＧｅｎ３拡張プロセスの例示的な実施形態
腫瘍洗浄培地を調製した。培地を開始前に温めた。５ｍＬのゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）を５００ｍＬボトルのＨＢＳＳに添加した。５ｍＬの腫瘍洗浄培地を、ＯＫＴ３希釈に使用する１５ｍＬのコニカルに添加した。室温（ＲＴ）で保管する。
フィーダー細胞（ＰＢＭＣ）バッグを調製した。フィーダー細胞をフィーダー細胞バッグに無菌で移し、使用するまで３７℃で保管するか、または凍結させた。３７℃の場合、フィーダー細胞を計数した。凍結した場合は、解凍した後、フィーダー細胞を計数した。ＰＢＭＣの代わりに、任意選択で遺伝子修飾され、任意選択で照射されたＴｈｐ１またはＵ９３７細胞などの、ａＡＰＣまたは本明細書の他の箇所に記載される抗原提示細胞を用いてもよい。
フィーダー細胞濃度の最適範囲は、５×１０４～５×１０６細胞／ｍＬである。４．５ｍＬのＡＩＭ－Ｖを含む４つのコニカルチューブを準備した。各細胞計数について０．５ｍＬの細胞画分を追加した。
総生フィーダー細胞数が１×１０９細胞以上であった場合、次のステップに進んでフィーダー細胞濃度を調整した。フィーダー細胞の体積を計算し、第１のフィーダー細胞バッグから取り出して、１×１０９細胞を第２のフィーダー細胞バッグに添加した。
ｐ１０００マイクロピペットを使用して、９００μＬの腫瘍洗浄培地をＯＫＴ３アリコート（１００μＬ）に移した。シリンジ及び滅菌技法を使用して、０．６ｍＬのＯＫＴ３を吸引し、第２のフィーダー細胞バッグに添加した。培地体積を全体積２Ｌに調整した。第２のフィーダー細胞バッグをインキュベーターに移した。
ＯＫＴ３製剤の詳細：ＯＫＴ３は、１００μＬアリコート中のバイアル（１ｍｇ／ｍＬ）からの元のストック濃度でアリコートされ、凍結されてもよい。１ｍＬバイアル当たり約１０×アリコート。－８０℃で保管した。０日目：１５μｇ／フラスコ、すなわち５００ｍＬ中３０ｎｇ／ｍＬ～６０μＬ最大約１アリコート。
腫瘍試料を調製した。６ウェルプレート及び１００ｍｍペトリ皿（合計４枚）を入手した。６ウェルプレートに「過剰腫瘍片」とラベル付けした。４枚の１００ｍｍペトリ皿の各々に「洗浄＿０１」、「洗浄＿０２」、「洗浄＿０３」、「洗浄＿０４」、及び「保持」とラベル付けした。
５ｍＬの腫瘍洗浄培地を、過剰腫瘍片とラベル付けした６ウェルプレートのすべてのウェルに添加した。解剖中に腫瘍を水和状態に保持する際に、腫瘍洗浄培地をさらなる使用のために利用可能にした。
５０ｍＬの腫瘍洗浄培地を、洗浄＿０１、洗浄＿０２、洗浄＿０３、及び保持というラベルの付いた各１００ｍｍペトリ皿に添加した。マーカーを使用して、各ペトリ皿に解剖１～解剖４とラベル付けする。腫瘍を洗浄＿０１で３分間以上、周囲温度でインキュベートした。腫瘍を洗浄＿０２で３分間以上、周囲温度でインキュベートした。腫瘍を洗浄＿０３で３分間以上、周囲温度でインキュベートした。洗浄が完了した後、腫瘍を「保持」皿に移して、組織が水和したままであることを確認する。
腫瘍インキュベーションが進行中の間、１０ｍＬの腫瘍発送培地を腫瘍発送培地とラベル付けした管に移した。１０ｍＬの腫瘍発送培地をシリンジ内に引き込み、各嫌気性及び好気性滅菌ボトルに５ｍＬの腫瘍発送培地を接種した。
解剖プロセス全体を通して、ペトリ皿のふたの下に定規を置いた。腫瘍の長さ及び断片の数を測定し、記録した。腫瘍を４つの中間片に解剖するか、または同等の体積の４つの群に分類し、各中間片の腫瘍構造を保存した。腫瘍片を水和状態で保つ。
組織を水和状態で保つために、活発に解剖されていない中間腫瘍片を保持皿に移した。
解剖皿のふたの下の定規を参照として使用して、腫瘍を２７ｍｍ３断片（３×３×３ｍｍ）に解剖した。６０個の断片に達するまで中間断片を解剖した。生成した最終断片の数に応じて、最終断片の総数を計数し、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコを調製した（一般に、１フラスコ当たり６０個の断片）。
断片チューブ１～断片チューブ４とラベル付けしたコニカルチューブ内に好ましい組織断片を保持した。起源とする断片チューブの数に応じて、フィーダー細胞懸濁液を播種するＧ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコの数を計算した。
フィーダー細胞バッグをインキュベーターから取り出し、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳを播種する。Ｄ０（０日目）とラベル付けする。
Ｇ－Ｒｅｘ－１００ＭＣＳ中の培養物への腫瘍断片の追加。滅菌条件下で、腫瘍断片培養（Ｄ０）１とラベル付けしたＧ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ及び断片チューブとラベル付けした５０ｍＬのコニカルチューブのキャップを緩めた。開いた断片チューブ１を回転させ、同時にＧ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳのキャップをわずかに持ち上げた。断片を含む培地を、回転している間にＧ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳに添加した。Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳに移送された断片の数を記録した。
断片がＧＲＥＸフラスコの底に配置された時点で、７ｍＬの培地を吸引し、７つの１ｍＬアリコートを作製した（拡張された特徴付け用に５ｍＬ、滅菌試料用に２ｍＬ）。拡張された特徴付け用の５つのアリコート（最終断片培養上清）を、必要になるまで－２０℃で保管した。
１本の嫌気性ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔボトル及び１本の好気性ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔボトルに各々１ｍＬの最終断片培養上清を接種した。サンプリングしたフラスコ毎に繰り返す。
実施例８：７～８日目のＧｅｎ３拡張プロセスの例示的な実施形態
フィーダー細胞バッグを調製した。凍結時に３７℃の水浴中で３～５分間フィーダーバッグを解凍した。凍結している場合、フィーダー細胞を計数した。
フィーダー細胞濃度の最適範囲は、５×１０４～５×１０６細胞／ｍＬである。４．５ｍＬのＡＩＭ－Ｖを含む４つのコニカルチューブを準備した。各細胞計数について０．５ｍＬの細胞画分を新しいクライオバイアル管に追加した。試料を十分に混合し、細胞計数を続けた。
総生フィーダー細胞数が２×１０９細胞以上であった場合、次のステップに進んでフィーダー細胞濃度を調整した。フィーダー細胞の体積を計算し、第１のフィーダー細胞バッグから取り出して、２×１０９細胞を第２のフィーダー細胞バッグに追加した。
ｐ１０００マイクロピペットを使用して、９００μＬのＨＢＳＳを１００μＬのＯＫＴ３アリコートに移す。上下に３回ピペッティングして混合する。２つのアリコートを調製した。
ＯＫＴ３製剤の詳細：ＯＫＴ３は、１００μＬアリコート中のバイアル（１ｍｇ／ｍＬ）からの元のストック濃度でアリコートされ、凍結されてもよい。１ｍＬバイアル当たり約１０×アリコート。－８０℃で保管した。７日目／８日目：３０μｇ／フラスコ、すなわち５００ｍＬ中６０ｎｇ／ｍＬ～１２０μｌ最大約２アリコート。
シリンジ及び滅菌技法を使用して、０．６ｍＬのＯＫＴ３を吸引し、フィーダー細胞バッグに添加して、すべて添加されたことを確認した。培地量を合計２Ｌに調整した。第２のＯＫＴ３アリコートで繰り返し、フィーダー細胞バッグに追加した。第２のフィーダー細胞バッグをインキュベーターに移した。
フィーダー細胞懸濁液を含むＧ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコの調製。０日目に生成されたＧ－Ｒｅｘフラスコの数に従って処理するためにＧ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコの数を記録した。Ｇ－Ｒｅｘフラスコをインキュベーターから取り出し、第２のフィーダー細胞バッグをインキュベーターから取り出した。
フィーダー細胞懸濁液を添加する前の上清の除去。１本の１０ｍＬシリンジをＧ－Ｒｅｘ １００フラスコに接続し、５ｍＬの培地を吸引した。５つの１ｍＬアリコート（拡張された特徴付け用に５ｍＬ）を作製し、分析の要求があるまで、拡張された特徴付け用に５つのアリコート（最終断片培養上清）を－２０℃で保管した。Ｇ－Ｒｅｘ １００フラスコ毎にラベル付けし、繰り返した。
フラスコの数に応じて、特徴付け用の５～２０×１ｍＬ試料を調製する：
●５ｍＬ＝１フラスコ
●１０ｍＬ＝２フラスコ
●１５ｍＬ＝３フラスコ
●２０ｍＬ＝４フラスコ
フィーダー細胞をＧ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳに播種し続け、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコ毎に繰り返した。無菌移送法を使用して、各Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコに重量で５００ｍＬの第２のフィーダー細胞バッグを重力移送し（１ｇ＝１ｍＬと想定）、量を記録した。Ｇ－Ｒｅｘ １００フラスコ毎に７日目培養とラベル付けし、繰り返した。Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコをインキュベーターに移した。
実施例９：１０～１１日目のＧｅｎ３拡張プロセスの例示的な実施形態
第１のＧ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコを取り出し、滅菌条件を使用して、１０ｍＬシリンジを使用して７ｍＬの前処理培養上清を除去した。７つの１ｍＬアリコートを作製した（拡張された特徴付け用に５ｍＬ、滅菌試料用に２ｍＬ）。
フラスコを注意深く混合し、新たな１０ｍＬシリンジを使用して１０ｍＬの上清を取り出し、Ｄ１０／１１マイコプラズマ上清とラベル付けした１５ｍＬのチューブに移す。
フラスコを注意深く混合し、新しい注射器を使用して、処理されるフラスコの数に応じて以下の量を除去した。
●１フラスコ＝４０ｍＬ
●２フラスコ＝２０ｍＬ／フラスコ
●３フラスコ＝１３．３ｍＬ／フラスコ
●４フラスコ＝１０ｍＬ／フラスコ
合計４０ｍＬをすべてのフラスコから取り出し、「１０／１１日目ＱＣ試料」とラベル付けした５０ｍＬのコニカルチューブにプールし、必要になるまでインキュベーター内で保管すべきである。細胞計数を行い、細胞を割り当てた。
必要になるまで－２０℃以下で拡張された特徴付けのために５つのアリコート（前処理培養上清）を保管した。１本の嫌気性ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔボトル及び１本の好気性ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔボトルに各々１ｍＬの前処理培養上清を接種した。
細胞懸濁液をＧ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳに移し、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ毎に繰り返した。滅菌条件を使用して、各Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳの内容物をＧ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳに移し、一度に約１００ｍＬの液体移送を監視した。Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳの容量が５００ｍＬに低減したとき、移送を停止した。
移送ステップ中、１０ｍＬシリンジを使用し、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳからシリンジに１０ｍＬの細胞懸濁液を吸引した。培養中のフラスコの数に従って指示に従った。１つのフラスコのみの場合：２つのシリンジを使用して合計２０ｍＬを取り出した。フラスコが２つの場合：１フラスコ当たり１０ｍＬを取り出した。フラスコが３つの場合：１フラスコ当たり７ｍＬを取り出した。フラスコが４つの場合：１フラスコ当たり５ｍＬを取り出した。細胞懸濁液を１本の一般的な５０ｍＬのコニカルチューブに移した。細胞計数ステップ及びＱＣ試料までインキュベーター内で保管する。ＱＣに必要な細胞の総数は、約２０×１０６細胞：４×０．５ｍＬの細胞数であった（細胞数を最初に希釈しなかった）。
アッセイに必要な細胞の量は、以下の通りである。
●本明細書に記載されるものなどの効力アッセイ、またはＩＦＮ－γもしくはグランザイムＢアッセイの場合、最小１０×１０６細胞
●マイコプラズマの場合、１×１０６細胞
●ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋のフローサイトメトリーの場合、５×１０６細胞
Ｇ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳフラスコをインキュベーターに移した。
ＱＣ試料を調製した。この実施形態のアッセイには少なくとも１５×１０８細胞が必要であった。細胞数及び生存率、マイコプラズマ（１×１０６細胞／平均生存濃度）、フロー（５×１０６細胞／平均生存濃度）及びＩＦＮ－γアッセイ（５×１０６細胞～１×１０６細胞を含み、８～１０×１０６細胞が、ＩＦＮ－γアッセイに必要である。
１０×１０６細胞／ｍＬで凍結保存のための細胞画分の体積を計算し、調製するバイアルの数を計算した。
実施例１０：１６～１７日目のＧｅｎ３拡張プロセスの例示的な実施形態
洗浄緩衝液の調製（１％ ＨＳＡ Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ）。ＨＳＡ及びＰｌａｓｍａｌｙｔｅを５Ｌバッグに移して、ＬＯＶＯ洗浄緩衝液を作製した。滅菌条件を使用して、総体積１２５ｍＬの２５％ ＨＳＡを５Ｌバッグに移し、これを室温で保管した。
１０ｍＬまたは４０ｍＬの洗浄緩衝液を取り出し、「ＩＬ－２ ６×１０４ＩＵ／ｍＬ」チューブに移した（ＩＬ－２を事前に調製した場合は１０ｍＬ、ＩＬ－２を新たに調製した場合は４０ｍＬ）。
Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ＋１％ ＨＳＡに添加する再構成ＩＬ－２の量を計算した：再構成ＩＬ－２の量＝（ＩＬ－２の最終濃度×最終量）／ＩＬ－２の比活性（標準アッセイに基づく）。ＩＬ－２の最終濃度は、６×１０４ＩＵ／ｍＬであった。最終体積は、４０ｍＬであった。
再構成ＩＬ－２に必要なＩＬ－２の計算された初期体積を取り出し、「ＩＬ－２ ６×１０４ＩＵ／ｍＬ」チューブに移した。事前に調製したアリコートから１００μＬのＩＬ－２ ６×１０６ＩＵ／ｍＬを、１０ｍＬのＬＯＶＯ洗浄緩衝液を含有する「ＩＬ－２ ６×１０４ＩＵ／ｍＬ」とラベル付けしたチューブに追加した。
約４５００ｍＬの上清をＧ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳフラスコから取り出した。残りの上清を回転させ、細胞を細胞収集プールバッグに移した。すべてのＧ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳフラスコで繰り返した。
６０ｍＬの上清を除去し、マイコプラズマ検出を含む品質管理アッセイのために上清チューブに添加した。＋２～８℃で保管した。
細胞収集。細胞を計数した。４．５ｍＬのＡＩＭ－Ｖを含む４つの１５ｍＬコニカルチューブを準備する。これらは、事前に準備してもよい。最適な範囲は、５×１０４～５×１０６細胞／ｍＬである。（１：１０希釈が推奨された）。１：１０希釈の場合、事前に調製した４５００μＬのＡＩＭ Ｖに、５００μＬのＣＦを追加する。希釈倍率を記録した。
ＴＣ（総細胞）ＬＯＶＯ前（生＋死）を計算した＝
平均総細胞
濃度（ＴＣ濃度ＬＯＶＯ前）
（生＋死）
×
ソースバッグの体積
ＴＶＣ（総生細胞）ＬＯＶＯ前（生）を計算した＝
平均総生細胞
濃度（ＴＶＣ ＬＯＶＯ前）
（生）
×
ＬＯＶＯソースバッグの体積
総細胞（ＴＣ）数が５×１０９超であった場合、５×１０８細胞を取り出して、ＭＤＡ保持試料として凍結保存する。５×１０８÷平均ＴＣ濃度（ステップ１４．４４）＝取り出す体積
総細胞（ＴＣ）数が５×１０９以下であった場合、４×１０６細胞を取り出して、ＭＤＡ保持試料として凍結保存する。４×１０６÷平均ＴＣ濃度＝取り出す体積。
適切なサイズのシリンジを使用して、ＬＯＶＯソースバッグから必要な体積を取り出した。凍結保存ステップまでインキュベーター内で保持した。
総細胞数が決定された場合、取り出す細胞の数は、１５０×１０９生細胞の保持を可能にすべきである。ＴＶＣ ＬＯＶＯ前５×１０８もしくは４×１０６、または該当なしを確認する。取り出す細胞の体積量を計算した。
バッグに残っている残りの総細胞を計算する。ＴＣ（総細胞）ＬＯＶＯ前を［平均総細胞濃度×残りの体積＝残りのＴＣ ＬＯＶＯ前］として計算する。
残存する細胞の総数に従って、表４６の対応するプロセスを選択する。

Figure 2024512029000052
使用したプロセスに対応して添加するＩＬ－２の量を選択する。次のように計算された体積：保持量×２×３００ＩＵ／ｍＬ＝必要とされるＩＬ－２のＩＵ。必要なＩＬ－２のＩＵ／６×１０４ＩＵ／ｍＬ＝ＬＯＶＯ後バッグに追加するＩＬ－２の体積。添加したすべての体積を記録した。さらなる分析のために試料をクライオバイアル内に得た。
細胞製品を十分に混合した。該当する場合、凍結保存を含むさらなる処理のためにすべてのバッグを密封した。
得られたクライオバイアル試料に対して、内毒素、ＩＦＮ－γ、無菌性、及び必要に応じて他のアッセイを行った。
実施例１１：例示的なＧＥＮ３プロセス（ＧＥＮ３．１とも称される）
この実施例は、「ＴＩＬ拡張のためのＧｅｎ２プロセスとＧｅｎ３プロセスとの間の比較可能性」に関するさらなる研究について説明する。Ｇｅｎ３プロセスを、以前に見られたような表現型及び機能プロファイルを維持しながら、最終総生細胞（ＴＶＣ）出力をＧｅｎ２におけるものと同等（またはそれ以上）であるように増やすことを目的として、プロセスの初期に活性化ステップを含むように修正した。
この実施例の範囲は、０日目の培養腫瘍断片に対する活性化ステップを導入によるＴＶＣ出力の評価、２つの独立した患者腫瘍にわたってＧｅｎ３標準及び対照群での機能的かつ拡張された表現型特徴付けに関して比較可能性を実証すること、ならびに処理パラメータが生理学的条件で維持されたことを確認するための培地消費及び代謝物産生の分析を含む。
この実施例のすべての実行は、市販のドナー腫瘍組織を出発材料として使用して、フルスケールプラットフォームで行った。
Ｇｅｎ３実施形態をさらなる実施形態として修正し、本明細書ではこの実施例においてＧｅｎ３．１と称する。
ある実施形態では、Ｇｅｎ３．１ ＴＩＬ製造プロセスは、以下の４つのオペレーター介入を有する。
１．腫瘍断片の単離及び活性化：プロセスの０日目に腫瘍を解剖し、最終断片を各々約３×３ｍｍ（合計で最大２４０個の断片）を生成し、１～４つのＧ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコ内で培養した。各フラスコは、最大６０個の断片、５００ｍＬのＣＭ１またはＤＭ１培地を含有し、６，０００ＩＵのｒｈＩＬ－２、１５μｇのＯＫＴ３、及び２．５×１０８個の照射した同種異系単核細胞（ＰＢＭＣ）で補充された。培養物を３７℃で６～８日間インキュベートした。ＰＢＭＣの代わりに、任意選択で遺伝子修飾され、任意選択で照射されたＴｈｐ１またはＵ９３７細胞などの、ａＡＰＣまたは本明細書の他の箇所に記載される抗原提示細胞を用いてもよい。
２．ＴＩＬ培養再活性化：７～８日目に、いずれの場合も６，０００ＩＵのｒｈＩＬ－２、３０μｇのＯＫＴ３、及び５×１０８個の照射した同種異系単核細胞を補充したＣＭ２またはＤＭ１培地をゆっくり添加することによって、培養物を補充した。フラスコの底にある既存の細胞を乱さないように注意した。培養物を３７℃で３～４日間インキュベートした。
３．培養のスケールアップ：１０～１１日目に生じる。培養のスケールアップ中に、Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳの全内容物を、いずれの場合も３，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した４ＬのＣＭ４またはＤＭ２を含むＧ－Ｒｅｘ ５００ＭＣＳフラスコに移した。採取するまでフラスコを３７℃で５～６日間インキュベートした。
４．採取／洗浄／製剤化：１６～１７日目に、フラスコを減容させ、プールする。細胞を濃縮し、１％ＨＳＡを含有するＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ ｐＨ７．４で洗浄した。洗浄した細胞懸濁液を、ＣｒｙｏＳｔｏｒ１０と１：１の比で配合し、３００ＩＵ／ｍＬの最終濃度までｒｈＩＬ－２を補充した。
ＤＰを制御された速度の凍結で凍結保存し、気相液体窒素中で保管した。完全標準ＴＩＬ培地１、２、または４（ＣＭ１、ＣＭ２、ＣＭ４）は、上記のように、合成培地（ＤＭ１またはＤＭ２）と称されるＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ細胞無血清拡張培地の代用となり得る。
プロセスの説明。０日目に、腫瘍を３回洗浄し、その後、３×３×３の最終断片に断片化した。全腫瘍を断片化した時点で、最終断片を均等にランダム化し、３つのプールに分割した。１つのランダム化断片プールを各群に導入し、３つの実験マトリックス毎に同じ数の断片を添加した。
全ＴＩＬ拡張プロセスにわたって、腫瘍Ｌ４０６３拡張を標準培地で行い、腫瘍Ｌ４０６４拡張を合成培地（ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ）で行った。培地の成分を本明細書に記載する。
ＣＭ１完全培地１：２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ヒトＡＢ血清、ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍＬ）、２－メルカプトエタノール（５５ｕＭ）を補充したＲＰＭＩ＋グルタミン。６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した最終培地製剤。
ＣＭ２完全培地２：５０％ ＣＭ１培地＋５０％ ＡＩＭ－Ｖ培地。６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した最終培地製剤。
ＣＭ４完全培地４：Ｇｌｕｔａｍａｘ（２ｍＭ）を補充したＡＩＭ－Ｖ。３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した最終培地製剤。
ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２６ｍＬ／Ｌ）を補充したＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ。
ＤＭ１：ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２６ｍＬ／Ｌ）、及びＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ（３％）をＧｌｕｔａｍａｘ（２ｍＭ）とともに補充したＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ。６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した最終製剤。
ＤＭ２：ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２６ｍＬ／Ｌ）、及びＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ（３％）をＧｌｕｔａｍａｘ（２ｍＭ）とともに補充したＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ。３，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した最終製剤。
使用したすべてのタイプの培地、すなわち、完全培地（ＣＭ）及び合成培地（ＤＭ）を事前に調製し、使用前日まで４℃で保持し、プロセス日前に事前に最長２４時間にわたってインキュベーター内で３７℃で温めた。
ＴＩＬ培養再活性化は、両方の腫瘍で７日目に起こった。スケールアップは、Ｌ４０６３では１０日目、Ｌ４０６４では１１日目に起こった。両方の培養物を採取し、１６日目に凍結保存した。
達成した結果。Ｇｅｎ３．０プロセス及びＧｅｎ３．１プロセスの細胞計数及び生存率％を決定した。すべての条件下での拡張は、この実施例に説明される詳細に従った。
腫瘍毎に、断片を同数の３つのプールに分割した。腫瘍のサイズが小さいため、１フラスコ当たりの断片の最大数は達成されなかった。３つの異なるプロセスについて、総生細胞及び細胞生存率を条件毎に評価した。細胞数を、７日目の再活性化のＴＶＣ、１０日目（Ｌ４０６４）または１１日目（Ｌ４０６３）のスケールアップのＴＶＣ、及び１６／１７日目の採取時のＴＶＣとして決定した。
７日目及び１０／１１日目の細胞計数をＦＩＯで測定した。倍率拡張を、１６／１７日目の採取時のＴＶＣを７日目の再活性化日のＴＶＣで割ることによって計算した。３つの群を比較するために、採取日のＴＶＣを、０日目の培養物中に添加した断片の数で割って、１断片当たりの生細胞の平均を計算した。
Ｌ４０６３及びＬ４０６４について、細胞計数及び生存率アッセイを行った。Ｇｅｎ３．１－試験プロセスは、両方の腫瘍でＧｅｎ３．０プロセスよりも多くの１断片当たりの細胞数をもたらした。
総生細胞数及び倍率拡張、プロセス中の生存率％。再活性化時に、スケールアップして採取し、すべての条件で生存率％を行った。１６／１７日目の採取日に、最終ＴＶＣを生存率％の放出基準と比較した。評価したすべての条件は、７０％の生存率基準を超え、プロセス及び腫瘍全体で同等であった。
免疫表現型決定－ＴＩＬ最終製品の表現型特徴付け。最終製品をフローサイトメトリー分析にかけ、純度、分化、及びメモリーマーカーを試験した。集団の割合は、すべての条件で、ＴＣＲα／β細胞、ＣＤ４＋細胞、及びＣＤ８＋細胞で一貫していた。
ＲＥＰ ＴＩＬの拡張表現型分析を行った。ＴＩＬ製品は、両方の腫瘍でＧｅｎ３．０と比較してＧｅｎ３．１条件でより高いＣＤ４＋細胞パーセンテージを示し、両方の条件でＧｅｎ３．１条件と比較してＧｅｎ３．０でより高いＣＤ８＋集団由来のＣＤ２８＋細胞パーセンテージを示した。
Ｇｅｎ３．０プロセス及びＧｅｎ３．１プロセスから採取したＴＩＬは、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞でのＣＤ２７及びＣＤ５６発現、ならびにＣＤ４＋ゲート細胞集団での同等のＣＤ２８発現と同等の表現型マーカーを示した。ＴＩＬ最終製品のメモリーマーカーの比較：
１６日目に採取したＴＩＬの凍結試料を分析のために染色した。ＴＩＬメモリーステータスは、Ｇｅｎ３．０プロセスとＧｅｎ３．１プロセスとの間で同等であった。ＴＩＬ最終製品の活性化及び疲弊マーカーの比較：
活性化及び疲弊マーカーは、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞上でゲートされたＧｅｎ３．０プロセスとＧｅｎ３．１プロセスとの間で同等であった。
再刺激時のインターフェロンγ分泌。採取したＴＩＬは、Ｌ４０６３及びＬ４０６４用のコーティングされた抗ＣＤ３プレートで一晩再刺激を受けた。Ｇｅｎ３．０プロセスと比較して、分析した２つの腫瘍で、より高いＧｅｎ３．１プロセスからのＩＦＮ－γ産生が観察された。
培養培地中のＩＬ－２レベルの測定。すべての条件及びプロセス間のＩＬ－２消費レベルを比較するために、細胞上清を、７日目の再活性化の開始時、１０日目（Ｌ４０６４）／１１日目（Ｌ４０６３）のスケールアップ時、及び１６／１７日目の採取及び凍結時に収集した。その後、上清を解凍し、分析した。細胞培養上清中のＩＬ－２の量を、製造業者のプロトコルによって測定した。
全体的なＧｅｎ３プロセス及びＧｅｎ３．１プロセスは、同じ培地条件で評価した全プロセス中のＩＬ－２消費に関して同等であった。Ｌ４０６３及びＬ４０６４用に収集した使用済み培地のＩＬ－２濃度（ｐｇ／ｍＬ）分析。
代謝物分析。使用済み培地の上清を、Ｌ４０６３及びＬ４０６４について、すべての条件で、７日目の再活性化の開始時、１０日目（Ｌ４０６４）または１１日目（Ｌ４０６３）のスケールアップ時、及び１６／１７日目の採取時に、Ｌ４０６３及びＬ４０６４から収集した。上清を、グルコース、塩乳酸、グルタミン、ＧｌｕｔａＭａｘ、及びアンモニアの濃度についてＣＥＤＥＸバイオアナライザーで分析した。
合成培地は、完全培地（２ｇ／Ｌ）と比較してより高いグルコース濃度４．５ｇ／Ｌを有する。全体として、グルコースの濃度及び消費量は、各培地タイプ内でＧｅｎ３．０プロセス及びＧｅｎ３．１プロセスにおいて同等であった。
すべての試験条件で、Ｌ４０６３及びＬ４０６４の両方の腫瘍に乳酸塩の増加が観察された。乳酸塩の増加は、Ｇｅｎ３．０条件とＧｅｎ３．１条件との間、及び再活性化拡張に使用した２つの培地（Ｌ４０６３の場合の完全培地とＬ４０６４の場合の合成培地）間で同等であった。
Ｌ４０６３の場合において、標準基礎培地は、２ｍＭのＬ－グルタミンを含有し、培養条件下でＬ－グルタミンのＬ－グルタミン酸塩及びアンモニアへの自然分解を補うために、２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘで補充された。
Ｌ４０６４腫瘍の場合、使用した合成（無血清）培地は、基礎培地にＬ－グルタミンを含有せず、最終濃度が２ｍＭになるまでＧｌｕｔａＭａｘのみで補充された。ＧｌｕｔａＭａｘは、Ｌ－アラニンとＬ－グルタミンのジペプチドであり、水溶液中でＬ－グルタミンよりも安定しており、グルタミン酸塩及びアンモニアに自発的に分解しない。代わりに、ジペプチドは、個々のアミノ酸に徐々に解離し、それにより、より低いが十分な濃度のＬ－グルタミンを維持して、強力な細胞成長を維持する。
Ｌ４０６３の場合、グルタミン濃度及びＧｌｕｔａＭａｘ濃度は、スケールアップ日にわずかに減少したが、採取日には再活性化日と比較して同様またはより近いレベルへの増加を示した。Ｌ４０６４の場合、グルタミン濃度及びＧｌｕｔａＭａｘ濃度は、全プロセス中、異なる条件間で同様の速度でわずかな分解を示した。
予想通り、アンモニア濃度は、Ｌ４０６４（２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘを含有する合成培地中で成長させた）よりも、Ｌ４０６３（２ｍＭのグルタミン＋２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘを含有する標準培地中で成長させた）について高かった。さらに、予想通り、培養の過程にわたってアンモニアの段階的増加または蓄積があった。３つの異なる試験条件間でアンモニア濃度に差はなかった。
Ｆｌｏｗ－ＦＩＳＨによるテロメア反復。Ｆｌｏｗ－ＦＩＳＨ技術を使用して、Ｇｅｎ３プロセス及びＧｅｎ３．１プロセス下でのＬ４０６３及びＬ４０６４のテロメア反復の平均長を測定した。相対テロメア長（ＲＴＬ）の決定を、ＤＡＫＯ製のフローサイトメトリー分析用Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ＰＮＡキット／ＦＩＴＣを使用して計算した。テロメアアッセイを行った。Ｌ４０６３及びＬ４０６４の試料のテロメア長を、対照細胞株（１３０１白血病）と比較した。対照細胞株は、長くて安定したテロメアを有する四倍体細胞株であり、相対テロメア長の計算を可能にする。両方の腫瘍で評価したＧｅｎ３プロセス及びＧｅｎ３．１プロセスは、同等のテロメア長を示した。ＴＣＲ Ｖβレパートリー分析
各プロセスで生成された細胞製品のクローン多様性を決定するために、ＴＩＬ最終製品をＴ細胞受容体のＣＤＲ３部分の配列決定によるクローン多様性分析のためにアッセイした。
３つのパラメータを３つの条件間で比較した。
●固有のＣＤＲ３（ｕＣＤＲ３）の多様性指数
●ｕＣＤＲ３共有％
●ｕＣＤＲ３の上位８０％の場合：
○共有されるｕＣＤＲ３コピーの％を比較する
○固有のクロノタイプの頻度を比較する
対照及びＧｅｎ３．１試験、ＴＩＬで採取した細胞製品のＬ４０６３で共有される固有のＣＤＲ３配列パーセンテージ：９７５個の配列がＧｅｎ３試験最終製品とＧｅｎ３．１試験最終製品との間で共有され、Ｇｅｎ３．１試験最終製品と共有されるＧｅｎ３由来の固有のＣＤＲ３配列の上位８０％の８８％に相当する。
対照及びＧｅｎ３．１試験、ＴＩＬで採取した細胞製品のＬ４０６４で共有される固有のＣＤＲ３配列パーセンテージ：２１６３個の配列がＧｅｎ３試験最終製品とＧｅｎ３．１試験最終製品との間で共有され、Ｇｅｎ３．１試験最終製品と共有されるＧｅｎ３由来の固有のＣＤＲ３配列の上位８０％の８７％に相当する。
異なるプロセスについて、１６日目の採取時に収集した１×１０６個の細胞から特定された固有のＣＤ３配列の数。Ｇｅｎ３．１試験条件は、試料内の固有のペプチドＣＤＲの数に基づいて、Ｇｅｎ３．０と比較してわずかに高いクローン多様性を示した。
シャノンエントロピー多様性指数は、比較のための信頼性の高い一般的なメトリックであり、これは両方の腫瘍に対するＧｅｎ３．１条件が、Ｇｅｎ３プロセスよりもわずかに高い多様性を示すためであり、Ｇｅｎ３．１試験条件のＴＣＲ ＶβレパートリーがＧｅｎ３．０プロセスよりもポリクローナルであることを示唆する。
加えて、Ｇｅｎ３．１試験条件のＴＣＲ Ｖβレパートリーは、腫瘍Ｌ４０６３及びＬ４０６４の両方でＧｅｎ３．０プロセスの対応するレパートリーと８７％を超える重複を示した。
再活性化日のＧｅｎ３．１試験Ｌ４０６４の使用済み培地のＩＬ－２濃度の値は、期待値を下回った（Ｇｅｎ３．１対照及びＧｅｎ３．０条件と同様であった）。
低い値はピペッティングエラーに起因した可能性があったが、最小限の試料しか採取できなかったため、アッセイを繰り返すことができなかった。
試料Ｌ４０６４の１０／１１日目のスケールアップから使用済み培地は収集されず、ＩＬ－２濃度の分析及び上清の代謝物分析には含めなかった。
結論。０日目のフィーダー及びＯＫＴ－３を含むＧｅｎ３．１試験条件は、Ｇｅｎ３．０及びＧｅｎ３．１対照と比較して、１６日目の採取時の細胞用量のＴＶＣがより高いことを示した。Ｇｅｎ３．１試験条件のＴＶＣ最終製品は、Ｇｅｎ３．０よりも約２．５倍高かった。
腫瘍Ｌ４０６３及びＬ４０６４の両方について、０日目にＯＫＴ－３及びフィーダーを添加したＧｅｎ３．１試験条件は、採取時にフラスコの最大容量に達した。これらの条件下で、０日目に最大４つのフラスコを開始した場合、最終細胞用量は、８０～１００×１０９ＴＩＬである可能性があった。
最終ＴＩＬ製品の純度、疲弊、活性化、及びメモリーマーカーを含む表現型特徴付けなどのすべての品質属性が、Ｇｅｎ３．１試験とＧｅｎ３．０プロセスとの間で維持され、同等であった。ＴＩＬ最終製品のテロメア長及び使用済み培地のＩＬ－２消費量は、Ｇｅｎ ３．０プロセスとＧｅｎ ３．１プロセスとの間で同等であった。
最終ＴＩＬ製品のＩＦＮ－γ産生は、分析した２つの腫瘍において、Ｇｅｎ３．０と比較して、０日目にフィーダー及びＯＫＴ－３を添加したＧｅｎ３．１で３倍高く、Ｇｅｎ３．１プロセスが強力なＴＩＬ製品を生成したことを示唆する。
試験条件にわたって、グルコースまたは乳酸塩レベルに差異は観察されなかった。培地条件にわたって、Ｇｅｎ３．０プロセスとＧｅｎ３．１プロセスとの間でグルタミン及びアンモニアに差異は観察されなかった。培地上の低レベルのグルタミンは、細胞増殖を制限しておらず、培地へのＧｌｕｔａＭａｘのみの添加が、細胞を増殖させるのに必要な栄養素を与えるのに十分であることを示唆する。
Ｌ４０６３及びＬ４０６４のスケールアップ日は、それぞれ１１日目及び１０日目であり、プロセスの採取日に到達した細胞数に関して大きな差異を示さず、代謝物の消費量は、全プロセスにわたって両方の場合で同等であった。この観察結果は、Ｇｅｎ３．０最適化プロセスが処理日に柔軟性を有し、それにより、製造スケジュールの柔軟性を促進することができることを示唆している。
０日目にフィーダー及びＯＫＴ－３を添加したＧｅｎ３．１プロセスは、Ｇｅｎ３．０と比較して、ＣＤＲ３ ＴＣＲａｂ配列分析によって測定されたより高いクローン多様性を示した。
図３２は、Ｇｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３最適化プロセス）の実施形態を説明する。標準培地及びＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ無血清培地を、Ｇｅｎ３最適化プロセスＴＩＬ拡張に使用することができる。ＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒの場合、培地のＧｌｕｔａＭａｘを最終濃度４ｍＭに増加させるために無血清培地が推奨される。
実現可能性を、すべての実験のすべての研究条件に対して確立した。すべての実験及び条件にわたって、かつドナー腫瘍組織間で、すべての実験を、ＩＬ－２、ヒト血清－ＡＢ、同種異系フィーダー細胞、ＯＫＴ－３などの同じロットの重要な原材料を利用して行った。
比較可能性を、凍結保存した２２日目のＴＩＬ製品の以前の仕様に従って、臨床製品の放出基準を満たす任意の研究群の能力によって決定した。
実施例１２：合成培地を用いた腫瘍拡張プロセス。
上記で開示されるプロセスは、ＣＭ１培地及びＣＭ２培地を、合成培地（例えば、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、例えば、ＤＭ１及びＤＭ２を含む）で置き換えることによって行われ得る。
実施例１３：凍結保存ＴＩＬ細胞療法の例示的生産
この実施例は、現在の適正組織基準及び現在の適正製造基準に従った、Ｇ－Ｒｅｘフラスコ内のＴＩＬ細胞療法プロセスの例示的なｃＧＭＰ製造を説明する。
Figure 2024512029000053
Figure 2024512029000054
０日目のＣＭ１培地の調製。ＢＳＣ内で、試薬をＲＰＭＩ１６４０培地ボトルに追加した。ボトル当たり追加された以下の試薬を追加した：不活化ヒトＡＢ血清（１００．０ｍＬ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（１０．０ｍＬ）、硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍＬ（１．０ｍＬ）、２－メルカプトエタノール（１．０ｍＬ）を加熱した。
ＢＳＣから不要な材料を取り出した。ＢＳＣから培地試薬を抜き取り、配合された洗浄培地の調製のために硫酸ゲンタマイシン及びＨＢＳＳをＢＳＣの中に残した。
ＩＬ－２アリコートを解凍した。すべての氷が融解するまで、１つの１．１ｍＬのＩＬ－２アリコート（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）（ＢＲ７１４２４）を解凍した。ＩＬ－２：ロット番号及び有効期限を記録した。
ＩＬ－２ストック溶液を培地に移した。ＢＳＣ内で、１．０ｍＬのＩＬ－２ストック溶液を、調製されたＣＭ１の０日目培地ボトルに移した。ＣＭ１の０日目培地１ボトル及びＩＬ－２（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）１．０ｍＬを追加した。
Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳをＢＳＣの中に通過させた。無菌的にＧ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ（Ｗ３０１３１３０）をＢＳＣの中に通過させた。
すべての完全なＣＭ１の０日目培地をＧ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコにポンプで注入した。組織断片コニカルまたはＧ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ。
０日目の腫瘍洗浄培地の調製。ＢＳＣ内で、５．０ｍＬのゲンタマイシン（Ｗ３００９８３２またはＷ３０１２７３５）を１本の５００ｍＬのＨＢＳＳ培地（Ｗ３０１３１２８）ボトルに追加した。ボトル当たりの追加：ＨＢＳＳ（５００．０ｍＬ）、硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍＬ（５．０ｍＬ）。１Ｌの０．２２ミクロンフィルターユニット（Ｗ１２１８８１０）をとおして調製されたゲンタマイシンを含有するＨＢＳＳを濾過した。
０日目の腫瘍処理。腫瘍検体を取得し、即時に処理のために２～８℃における部屋に移した。
腫瘍洗浄培地を等分した。腫瘍洗浄１は、８インチ鉗子（Ｗ３００９７７１）を使用して行う。腫瘍を検体ボトルから取り出し、調製した「洗浄１」皿に移す。この後、腫瘍洗浄２及び腫瘍洗浄３が続く。
腫瘍を測定し、評価した。腫瘍領域全体の３０％未満が壊死及び／または脂肪性組織であることが観察されたかどうかを評価した。該当する場合、クリーンアップ解剖を行う。腫瘍が大きく、外部の組織の３０％未満が壊死／脂肪性であることが観察された場合、メス及び／または鉗子の組み合わせを使用して、腫瘍の内側構造を温存しながら壊死／脂肪性組織を除去することによって、「クリーンアップ解剖」を行った。
腫瘍を切除した。メス及び／または鉗子の組み合わせを使用して、腫瘍検体を均等で適切なサイズの断片（最大６つの中間断片）に切断した。中間腫瘍断片を移した。腫瘍断片を、およそ３×３×３ｍｍのサイズの小片に切除した。乾燥を防止するために中間断片を保存した。
中間断片の解剖を繰り返した。収集された切片の数を決定した。望ましい組織が残っている場合、「好ましい中間断片」６ウェルプレートから追加の好ましい腫瘍片を選択し、最大５０片のために液滴を充填した。
コニカルチューブを準備した。腫瘍片を５０ｍＬのコニカルチューブに移した。Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳのＢＳＣを準備した。Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳをインキュベーターから取り出した。無菌的にＧ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコをＢＳＣの中に通過させた。腫瘍断片をＧ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳフラスコに追加した。切片を均等に分配した。
以下のパラメータでＧ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳをインキュベートした：Ｇ－Ｒｅｘフラスコをインキュベートした：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃、ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％ＣＯ２。計算：培養の時間、下限＝培養の時間＋２５２時間、上限＝培養の時間＋２７６時間。
プロセスが完了した後、いずれの残りの温められた培地も廃棄し、ＩＬ－２のアリコートを解凍した。
１１日目－培地の調製。インキュベーターを監視した。インキュベーターパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃、ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％ＣＯ２。
３本の１０００ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地（Ｗ３０１３１１２）ボトル及び３本の１０００ｍＬのＡＩＭ－Ｖ（Ｗ３００９５０１）ボトルを、インキュベーター内で３０分間以上温めた。インキュベーターからＲＰＭＩ１６４０培地を取り出した。ＲＰＭＩ１６４０培地を調製した。培地を濾過した。３つの１．１ｍＬアリコートのＩＬ－２（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）（ＢＲ７１４２４）を解凍した。インキュベーターからＡＩＭ－Ｖ培地を取り出した。ＩＬ－２をＡＩＭ－Ｖに追加した。１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒバッグ及びリピータポンプ移送セットを、ＢＳＣの中に無菌的に移した。
１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒ培地バッグを準備した。Ｂａｘａポンプを準備した。１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒ培地バッグを準備した。培地を１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒにポンプで注入した。Ｌａｂｔａｉｎｅｒバッグからポンプマティックを取り出した。
培地を混合した。バッグを穏やかにマッサージして混合した。試料計画に従って培地をサンプリングした。２０．０ｍＬの培地を取り出し、５０ｍＬのコニカルチューブに入れた。細胞計数希釈管を準備した。ＢＳＣに、「細胞計数希釈液用」及びロット番号でラベル付けされた４．５ｍＬのＡＩＭ－Ｖ培地を、４本の１５ｍＬコニカルチューブに追加した。試薬をＢＳＣから２～８℃に移した。１Ｌ移送パックを準備した。（プロセス注記５．１１に従って）ＢＳＣ溶接の外側で、「完全なＣＭ２の１１日目培地」バッグに取り付けられた移送セットへの１Ｌ移送パックを準備した。フィーダー細胞移送パックを準備した。完全なＣＭ２の１１日目培地をインキュベートした。
１１日目－ＴＩＬ採取。前処理表。インキュベーターパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃、ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％ＣＯ２。Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳをインキュベーターから取り出した。３００ｍＬ移送パックを準備した。移送パックをＧ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳに溶接した。
ＴＩＬ採取及びＴＩＬ採取の開始のためにフラスコを準備する。ＴＩＬが採取された。ＧａｔｈｅＲｅｘポンプを使用して、血液フィルターを介して細胞懸濁液を３００ｍＬの移送パックに移した。付着した細胞について膜を点検した。
フラスコ膜をすすいだ。Ｇ－Ｒｅｘ １００ＭＣＳ上のクランプを閉じた。すべてのクランプが閉じられていることを確実にした。ＴＩＬ及び「上清」移送パックを熱融着した。ＴＩＬ懸濁液の体積を計算した。サンプリングのために上清移送パックを準備した。
Ｂａｃ－Ｔ試料を引き出した。ＢＳＣ内で、１Ｌ「上清」移送パックからおよそ２０．０ｍＬの上清を引き上げ、滅菌５０ｍＬコニカルチューブに分注する。
試料計画に従ってＢａｃＴを接種した。適切なサイズのシリンジを使用して調製されたＢａｃＴとラベル付けされた５０ｍＬコニカルから１．０ｍＬの試料を取り出し、嫌気性ボトルに接種した。
ＴＩＬをインキュベートした。必要とされるまで、ＴＩＬ移送パックをインキュベーターに入れた。細胞計数及び計算を行った。行われた細胞計数の生細胞濃度及び生存率の平均を決定した。生存率÷２。生細胞濃度÷２。計数の上限及び下限を決定した。下限：生細胞濃度の平均×０．９。上限：生細胞濃度の平均×１．１。許容限界内の両方の計数を確認した。行われた４つすべての計数から平均生細胞濃度を決定した。
ＴＩＬ懸濁液の調整された体積：細胞計数試料を取り出した後のＴＩＬ懸濁液の調整された体積を計算する。総ＴＩＬ細胞体積（Ａ）。取り出された細胞計数試料の体積（４．０ｍＬ）（Ｂ）調整された総ＴＩＬ細胞体積Ｃ＝Ａ－Ｂ。
総生ＴＩＬ細胞を計算した。平均生細胞濃度：総体積、総生細胞：Ｃ＝Ａ×Ｂ
フローサイトメトリーのための計算：総生ＴＩＬ細胞数が、４．０×１０７以上であった場合、フローサイトメトリー試料のために１．０×１０７細胞を取得するための体積を計算した。
フローサイトメトリーに必要とされる総生細胞：１．０×１０７細胞。フローサイトメトリーに必要とされる細胞の体積：生細胞濃度を１．０×１０７細胞Ａで割ったもの。
２．０×１０８生細胞に等しいＴＩＬ懸濁液の体積を計算した。必要に応じて、取り出すＴＩＬ細胞の過剰体積を計算し、過剰なＴＩＬを取り出し、必要に応じてＴＩＬをインキュベーターに入れた。必要に応じて、取り出された全過剰ＴＩＬを計算した。
凍結のための標的細胞濃度が１．０×１０８細胞／ｍＬである過剰なＴＩＬ細胞に追加するＣＳ－１０培地の量を計算した。必要に応じて、過剰なＴＩＬを遠心分離した。コニカルチューブを観察し、ＣＳ－１０を追加した。
バイアルを充填した。１．０ｍＬの細胞懸濁液を、適切なサイズの凍結バイアルに等分した。残留体積を適切なサイズのクライオバイアルに等分した。体積が０．５ｍＬ以下である場合、体積が０．５ｍＬになるまでＣＳ１０をバイアルに追加する。
凍結保存のための１×１０７細胞を取得するために必要とされる細胞の体積を計算した。凍結保存のために試料を取り出した。ＴＩＬをインキュベーターに入れた。
試料の凍結保存。コニカルチューブを観察し、ＣＳ－１０をゆっくりと追加し、追加された０．５ｍＬのＣＳ１０の体積を記録した。
１１日目－フィーダー細胞。フィーダー細胞を取得した。ＬＮ２冷凍庫から少なくとも２つの異なるロット番号を伴うフィーダー細胞の３つのバッグを取得した。解凍する準備が整うまで、細胞をドライアイス上で保管した。水浴またはｃｒｙｏｔｈｅｒｍを準備した。３７．０±２．０℃の水浴またはｃｙｔｏｔｈｅｒｍにおいて約３～５分間、または氷が消滅するまで、フィーダー細胞を解凍した。インキュベーターから培地を取り出した。解凍されたフィーダー細胞をプールした。フィーダー細胞を移送パックに追加した。シリンジから移送パックにフィーダー細胞を分注した。プールされたフィーダー細胞を混合し、移送パックをラベル付けした。
移送パック内のフィーダー細胞懸濁液の総体積を計算した。細胞計数試料を取り出した。各試料に別個の３ｍＬシリンジを使用して、不要注入ポートを使用してフィーダー細胞懸濁液移送パックから４×１．０ｍＬの細胞計数試料を引き出した。各試料をラベル付けされたクライオバイアルに等分した。細胞計数を行い、増倍率を決定し、プロトコルを選択し、増倍率を入力した。行われた細胞計数の生細胞濃度及び生存率の平均を決定した。計数の上限及び下限を決定し、限界内で確認した。
フィーダー細胞懸濁液の調整された体積。細胞計数試料を取り出した後のフィーダー細胞懸濁液の調整された体積を計算した。総生フィーダー細胞を計算した。必要に応じて追加のフィーダー細胞を取得した。必要に応じて追加のフィーダー細胞を解凍した。第４のフィーダー細胞バッグをジップトップバッグに入れ、３７．０±２．０℃の水浴またはｃｙｔｏｔｈｅｒｍ内で約３～５分間解凍し、追加のフィーダー細胞をプールした。体積を測定した。シリンジ内のフィーダー細胞の体積を測定し、以下に記録した（Ｂ）。フィーダー細胞の新しい総体積を計算した。フィーダー細胞を移送パックに追加した。
必要に応じて希釈液を調製し、４．５ｍＬのＡＩＭ－Ｖ培地を４本の１５ｍＬコニカルチューブに追加した。細胞計数を準備した。各試料に対して別個の３ｍＬシリンジを使用して、不要注入ポートを使用して、フィーダー細胞懸濁液移送パックから４×１．０ｍＬの細胞計数試料を取り出した。細胞計数及び計算を行った。行われた４つすべての計数から平均生細胞濃度を決定した。フィーダー細胞懸濁液の体積を調整し、細胞計数試料を取り出した後のフィーダー細胞懸濁液の調整された体積を計算した。４．０ｍＬを差し引いた総フィーダー細胞体積を取り出した。５×１０９生フィーダー細胞を取得するために必要とされるフィーダー細胞懸濁液の体積を計算した。過剰なフィーダー細胞体積を計算した。取り出す過剰なフィーダー細胞の体積を計算した。過剰なフィーダー細胞を取り出した。
１．０ｍＬシリンジ及び１６Ｇ針を使用して、０．１５ｍＬのＯＫＴ３を引き上げ、ＯＫＴ３を追加した。フィーダー細胞懸濁液移送パックを熱融着した。
１１日目 Ｇ－Ｒｅｘ充填及び播種設定Ｇ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳ。「完全なＣＭ２の１１日目培地」をインキュベーターから取り出し、培地をＧ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳにポンプで注入した。４．５Ｌの培地をＧ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳにポンプで注入し、フラスコ上にマークされたラインまで充填した。必要に応じてフラスコを熱融着し、インキュベートした。フィーダー細胞の懸濁液移送パックを、Ｇ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳに溶接した。フィーダー細胞をＧ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳに追加した。熱融着した。ＴＩＬ懸濁液移送パックをフラスコに溶接した。ＴＩＬをＧ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳに追加した。熱融着した。Ｇ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳを３７．０±２．０℃でインキュベートした。ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％ＣＯ２。
インキュベーション時間帯を計算した。１６日目にインキュベーターからＧ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳを取り出すための適切な時間を決定するための計算を行った。下限：インキュベーションの時間＋１０８時間。上限：インキュベーションの時間１３２時間。
１１日目 過剰ＴＩＬ凍結保存。該当：過剰ＴＩＬバイアルを凍結させた。凍結前にＣＲＦが設定されていることを検証した。凍結保存を行った。バイアルを速度制御された冷凍庫から適切な保管場所に移した。凍結の完了時に、バイアルをＣＲＦから適切な保管容器に移した。バイアルを適切な保管場所に移した。ＬＮ２における保管場所を記録した。
１６日目 培地の調製。ＡＩＭ－Ｖ培地を事前に温めた。培地バッグ１、２、及び３について培地が温められた時間を計算した。すべてのバッグが１２～２４時間の持続時間にわたって温められていることを確実にした。上清用の１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒを設定した。ルアーコネクタを使用して、流体ポンプ移送セットのより大きな直径の端部を１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒバッグのメス型ポートのうちの１つに取り付けた。上清用の１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒを設定し、ラベル付けした。上清用の１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒを設定した。ＢＳＣから取り出す前に、すべてのクランプが閉じられていることを確実にした。注記：上清バッグは、培地調製と同時に行われ得るＴＩＬ採取中に使用された。
ＩＬ－２を解凍した。すべての氷が融解するまで、ＣＴＳ ＡＩＭ－Ｖ培地の１バッグ当たり５×１．１ｍＬアリコートのＩＬ－２（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）（ＢＲ７１４２４）を解凍した。１００．０ｍＬのＧｌｕｔａＭａｘを等分した。ＩＬ－２をＧｌｕｔａＭａｘに追加した。配合用のＣＴＳ ＡＩＭ－Ｖ培地バッグを準備した。配合用のＣＴＳ ＡＩＭ－Ｖ培地バッグを準備した。ステージＢａｘａポンプ。培地を配合することを準備した。ＧｌｕｔａＭａｘ＋ＩＬ－２をバッグにポンプで注入した。パラメータを監視した：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃、ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％ＣＯ２。完全なＣＭ４の１６日目培地を温めた。希釈液を調製した。
１６日目 ＲＥＰ分割。インキュベーターパラメータを監視した：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃、ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％ＣＯ２。インキュベーターからＧ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳを取り出した。１Ｌの移送パックを準備し、ＴＩＬ懸濁液としてラベル付けし、１Ｌの重量を量った。
Ｇ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳの減容。約４．５Ｌの培養上清をＧ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳから１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒに移した。
ＴＩＬ採取用のフラスコを準備した。上清を取り出した後に、赤色ラインへのすべてのクランプを閉じた。
ＴＩＬ採取の開始。フラスコを激しく叩き、培地を旋回させて細胞を解放し、すべての細胞が引き離されていることを確実にする。
ＴＩＬ採取。ＴＩＬ懸濁液移送パックにつながるすべてのクランプを解放した。ＧａｔｈｅＲｅｘを使用して、細胞懸濁液をＴＩＬ懸濁液移送パックの中に移した。注記：すべての細胞及び培地が収集されるまで、傾斜した縁を必ず維持すること。付着した細胞について膜を点検した。フラスコ膜をすすいだ。Ｇ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳ上のクランプを閉じた。ＴＩＬを含む移送パックを熱融着した。上清を含む１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒを熱融着した。細胞懸濁液を伴う移送パックの重量を記録し、細胞懸濁液を計算した。試料を取り出すための移送パックを準備した。細胞上清から試験試料を取り出した。
無菌性及びＢａｃＴ試験サンプリング。調製したＢａｃＴラベル付けされた１５ｍＬのコニカルから１．０ｍＬの試料を取り出した。細胞計数試料を取り出した。ＢＳＣ内で、各試料に別個の３ｍＬシリンジを使用して、「ＴＩＬ懸濁液」移送パックから４×１．０ｍＬの細胞計数試料を取り出した。
マイコプラズマ試料を取り出した。３ｍＬシリンジを使用して、ＴＩＬ懸濁液移送パックから１．０ｍＬを取り出し、調製された「マイコプラズマ希釈液」とラベル付けされた１５ｍＬコニカルチューブに入れた。
播種用の移送パックを準備した。ＴＩＬをインキュベーターに入れた。細胞懸濁液をＢＳＣから取り出し、必要とされるまでインキュベーターに入れた。細胞計数及び計算を行った。最初に、０．５ｍＬの細胞懸濁液を調製された４．５ｍＬのＡＩＭ－Ｖ培地に追加することによって、細胞計数試料を希釈し、１：１０希釈液を生じた。行われた細胞計数の生細胞濃度及び生存率の平均を決定した。計数の上限及び下限を決定した。注記：希釈は、細胞の期待濃度に基づいて調整され得る。行われた４つすべての計数から平均生細胞濃度を決定した。ＴＩＬ懸濁液の調整された体積。細胞計数試料を取り出した後のＴＩＬ懸濁液の調整された体積を計算した。５．０ｍＬを差し引いた総ＴＩＬ細胞体積が試験のために取り出された。
総生ＴＩＬ細胞を計算した。播種するフラスコの総数を計算した。注記：播種するＧ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳフラスコの最大数は５であった。播種するフラスコの計算された数が５つを超えた場合、５つのみが利用可能な細胞懸濁液の体積全体を使用して播種された。
二次培養用のフラスコの数を計算した。準備されたバッグに加えて必要とされる培地バッグの数を計算した。計算されたように必要とされる２つのＧ－Ｒｅｘ－５００Ｍフラスコ毎に「ＣＭ４の１６日目培地」の１つの１０Ｌバッグを準備した。追加の培地が調製され、温められている間に、続けて第１のＧＲＥＸ－５００Ｍフラスコ（複数可）を播種した。計算された数の決定された追加の培地バッグを調製し、温めた。Ｇ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳを充填した。培地をポンプで注入するように準備し、４．５Ｌの培地をＧ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳにポンプで注入した。熱融着した。充填を繰り返した。フラスコをインキュベートした。新しいＧ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳフラスコに追加するＴＩＬ懸濁液の標的体積を計算した。フラスコの計算された数が５つを超える場合、５つのみが細胞懸濁液の体積全体を使用して播種されるであろう。播種用のフラスコを準備した。インキュベーターからＧ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳを取り出した。ポンプで注入するためのＧ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳを準備した。大型フィルターラインを除くすべてのクランプを閉じた。インキュベーターからＴＩＬを取り出した。播種用の細胞懸濁液を調製した。（プロセス注記５．１１に従って）「ＴＩＬ懸濁液」移送パックをポンプ入口ラインに滅菌溶接した。ＴＩＬ懸濁液バッグを秤の上に置いた。
フラスコにＴＩＬ懸濁液を播種した。計算されたＴＩＬ懸濁液の体積をフラスコにポンプで注入した。熱融着した。残りのフラスコを充填した。
インキュベーターを監視した。インキュベーターパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃、ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％ＣＯ２。フラスコをインキュベートした。
２２日目にインキュベーターからＧ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳを取り出す時間範囲を決定した。
２２日目 洗浄緩衝液の調製。１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒバッグを準備した。ＢＳＣ内で、ルアー接続を介して４インチ血漿移送セットを１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒバッグに取り付けた。１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒバッグを準備した。ＢＳＣから外に移す前に、すべてのクランプを閉じた。注記：採取される２つのＧ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳフラスコ毎に、１つの１０Ｌ Ｌａｂｔａｉｎｅｒバッグを準備した。Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅを３０００ｍＬバッグにポンプで注入し、ポンプを反転させてバッグの位置を操作することによって、３０００ｍＬのＯｒｉｇｅｎバッグから空気を除去した。ヒトアルブミン２５％を３０００ｍＬのバッグに追加した。１２０．０ｍＬの最終体積のヒトアルブミン２５％を取得する。
ＩＬ－２希釈液を調製した。１０ｍＬシリンジを使用して、ＬＯＶＯ洗浄緩衝液バッグ上の無針注入ポートを使用して、５．０ｍＬのＬＯＶＯ洗浄緩衝液を取り出した。ＬＯＶＯ洗浄緩衝液を５０ｍＬのコニカルチューブに分注した。
等分されたＣＲＦブランクバッグＬＯＶＯ洗浄緩衝液。１００ｍＬのシリンジを使用して、無針注入ポートから７０．０ｍＬのＬＯＶＯ洗浄緩衝液を引き上げた。
すべての氷が融解するまで、１つの１．１ｍＬのＩＬ－２（６×１０６ＩＵ／ｍＬ））を解凍した。５０μＬのＩＬ－２ストック（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）を「ＩＬ－２希釈液」とラベル付けされた５０ｍＬのコニカルチューブに追加した。
凍結保存調製。５つのクライオカセットを２～８℃に置き、最終製品の凍結保存のためにそれらを前調整した。
細胞計数希釈液を調製した。ＢＳＣ内で、ロット番号及び「細胞計数希釈液用」でラベル付けされた４．５ｍＬのＡＩＭ－Ｖ培地を、４本の別個の１５ｍＬコニカルチューブに追加した。細胞計数を準備した。４つのクライオバイアルをバイアル番号（１～４）でラベル付けした。使用されるＢＳＣの下でバイアルを保存した。
２２日目 ＴＩＬ採取。インキュベーターを監視した。インキュベーターパラメータ温度ＬＥＤディスプレイ：３７±２．０℃、ＣＯ２パーセンテージ：５％±１．５％。インキュベーターからＧ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳフラスコを取り外した。ＴＩＬ収集バッグを準備し、ラベル付けした。余分な接続を密封した。減容：約４．５Ｌの上清をＧ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳから上清バッグに移した。
ＴＩＬ採取用のフラスコを準備した。ＴＩＬの収集を開始した。フラスコを激しく叩き、培地旋回させて細胞を解放した。すべての細胞が引き離されていることを確実にした。ＴＩＬの収集を開始した。ＴＩＬ懸濁液収集バッグにつながるすべてのクランプを解放した。ＴＩＬ採取。ＧａｔｈｅＲｅｘを使用して、ＴＩＬ懸濁液を３０００ｍＬの収集バッグに移した。付着した細胞について膜を点検した。フラスコ膜をすすいだ。Ｇ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳ上のクランプを閉じ、すべてのクランプが閉じていることを確実にした。細胞懸濁液をＬＯＶＯソースバッグの中に移した。すべてのクランプを閉じた。熱融着した。４×１．０ｍＬの細胞計数試料を取り出した。
細胞計数を行った。ＮＣ－２００及びプロセス注記５．１４を利用して、細胞計数及び計算を行った。最初に、０．５ｍＬの細胞懸濁液を調製された４．５ｍＬのＡＩＭ－Ｖ培地に追加することによって、細胞計数試料を希釈した。これは、１：１０希釈液を生じた。行われた細胞計数の平均生存率、生細胞濃度、及び総有核細胞濃度を決定した。計数の上限及び下限を決定した。行われた細胞計数の平均生存率、生細胞濃度、及び総有核細胞濃度を決定した。ＬＯＶＯソースバッグの重量を量った。総生ＴＩＬ細胞を計算した。総有核細胞を計算した。
マイコプラズマ希釈液を調製した。ルアー試料ポートを介して１つの上清バッグから１０．０ｍＬを取り出し、１５ｍＬコニカルに入れた。
「ＴＩＬ Ｇ－Ｒｅｘ採取」プロトコルを行い、最終製品の標的体積を決定した。使い捨てキットを装填した。濾液バッグを取り出した。濾液容量を入力した。濾液容器をベンチトップの上に置いた。ＰｌａｓｍａＬｙｔｅを取り付けた。ＰｌａｓｍａＬｙｔｅが取り付けられていることを検証し、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅが動いていることを観察した。ソース容器をチューブに取り付け、ソース容器が取り付けられていることを検証した。ＰｌａｓｍａＬｙｔｅが動いていることを確認した。
最終製剤及び充填。標的体積／バッグの計算。ブランクバッグを配合するためのＣＳ－１０及びＬＯＶＯ洗浄緩衝液の体積を計算した。ＣＲＦブランクを調製した。
最終製品に追加するＩＬ－２の体積を計算した。所望される最終ＩＬ－２濃度（ＩＵ／ｍＬ）－３００ＩＵ／ｍＬ。ＩＬ－２作業ストック：６×１０４ＩＵ／ｍＬ。接続装置を組み立てた。４Ｓ－４Ｍ６０をＣＣ２細胞接続に滅菌溶接した。ＣＳ７５０クライオバッグを準備したハーネスに滅菌溶接した。ＣＳ－１０バッグを４Ｓ－４Ｍ６０のスパイクに溶接した。ＩＬ－２とともにＴＩＬ調製した。適切なサイズのシリンジを使用して、「ＩＬ－２ ６×１０４」アリコートから決定されたＩＬ－２の量を取り出した。配合されたＴＩＬバッグをラベル付けした。配合されたＴＩＬバッグを装置に追加した。ＣＳ１０を追加した。シリンジを交換した。約１０ｍＬの空気を１００ｍＬのシリンジに引き込み、装置上の６０ｍＬシリンジを交換した。ＣＳ１０を追加した。ＣＳ－７５０バッグを準備した。細胞を分注した。
最終製品バッグから空気を除去し、保持液を得た。最後の最終製品バッグが充填されると、すべてのクランプを閉じた。１０ｍＬの空気を新しい１００ｍＬシリンジに引き込み、装置のシリンジを交換する。保持液を５０ｍＬコニカルチューブに分注し、管を「保持液」及びロット番号としてラベル付けした。各バッグについて空気除去ステップを繰り返した。
目視検査を含み、凍結保存のための最終製品を調製した。凍結保存までクライオバッグを低温パック上で、または２～８℃で保持した。
細胞計数試料を取り出した。適切なサイズのピペットを使用して、２．０ｍＬの保持液を取り出し、細胞計数に使用されるように１５ｍＬコニカルチューブに入れる。細胞計数及び計算を行った。注記：１つだけの試料を適切な希釈に希釈し、希釈が十分であることを検証した。追加の試料を適切な希釈倍率に希釈し、計数を進めた。行われた細胞計数の生細胞濃度及び生存率の平均を決定した。計数の上限及び下限を決定した。注記：希釈は、細胞の期待濃度に基づいて調整され得る。生細胞濃度及び生存率の平均を決定した。計数の上限及び下限を決定した。ＩＦＮ－γを計算した。最終製品バッグを熱融着した。
以下の例示的試料計画に従って試料をラベル付けし、収集した。
Figure 2024512029000055
無菌性及びＢａｃＴ試験。試験サンプリング。ＢＳＣ内で、適切なサイズのシリンジを使用して収集された保持細胞懸濁液から１．０ｍＬの試料を取り出し、嫌気性ボトルに接種する。好気性ボトルについて上記を繰り返す。
最終製品の凍結保存。制御速度冷凍庫（ＣＲＦ）を準備した。ＣＲＦが設定されていることを検証した。ＣＲＦプローブを設定した。最終製品及び試料をＣＲＦに入れた。４℃±１．５℃に達し、ＣＲＦ実行を進めるために必要な時間を決定した。ＣＲＦが完了し、保管された。実行の完了後にＣＲＦを停止させた。カセット及びバイアルをＣＲＦから取り出した。保存のためにカセット及びバイアルを蒸気相ＬＮ２に移した。保管場所を記録した。
最終医薬品の後処理及び分析には、以下の試験が含まれた：（２２日目）フローサイトメトリーによる２２日目ＲＥＰのＣＤ３＋細胞の決定、（２２日目）グラム染色法（ＧＭＰ）、（２２日目）ゲルクロットＬＡＬアッセイ（ＧＭＰ）による細菌内毒素試験、（１６日目）ＢａｃＴ滅菌アッセイ（ＧＭＰ）、（１６日目）ＴＤ－ＰＣＲによるマイコプラズマＤＮＡ検出（ＧＭＰ）、許容される外観属性、（２２日目）ＢａｃＴ滅菌アッセイ（ＧＭＰ）（２２日目）、（２２日目）ＩＦＮ－ガンマアッセイ。本明細書に記載の他の効力アッセイもまた、ＴＩＬ製品を分析するために用いられる。
実施例１４：ＴＩＬ効力アッセイパイロット研究
この実施例は、臨床ＴＩＬ製品ロットの特性評価のための効力アッセイについて説明する。この実施例に記載のプロトコルを、肺腫瘍（Ｌ４２２４）及び黒色腫腫瘍（Ｍ１１５４）から調製された、Ｇｅｎ２製造プロセスによって生成された２つのＴＩＬ試料に適用した。ＴＩＬを、照射されたＲａｊｉ細胞と共培養した。Ｋ５６２細胞及びＰＢＭＣビーズを、それぞれ陰性対照及び陽性対照として使用した。一般的な実験スキームを図３４に示す。ＴＩＬの機能性は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８／抗４－１ＢＢコーティングされたビーズで検証した。共刺激を提供するための抗ＣＤ２８抗体の添加もまた、それが何らかの利益をもたらすか、または効果がなかったかを決定するために試験した。異なる共培養期間を観察した。
Ｋ５６２細胞及びＲａｊｉ細胞を解凍し、計数し、６ウェルプレートまたはＴ２５フラスコ内で１０～１４日間拡張した。細胞数が＞１６０×１０６に達すると、細胞を３５Ｇｙで照射し、等分し、後で使用するために凍結した。Ｇｅｎ２の拡大ＴＩＬを解凍して計数し、共培養の前に４８～７２時間培養して回復させた。
照射されたＲａｊｉ細胞及び照射されたＫ５６２対照を解凍し、以下のＴＩＬ：標的比を使用してＴＩＬと共培養した：５０：１、２５：１、１２．５：１、６．２５：１、１：１、１：６．２５、１：１２．５、及び１：２５、＋／－抗ＣＤ２８抗体。ＴＩＬはまた、陽性活性化対照を提供するために、抗ＣＤ３／ＣＤ２８／４－１ＢＢでコーティングされた磁気ビーズで刺激した。ＴＩＬ及び腫瘍細胞株のみの対照も含まれた。
上清を、共培養の開始から６～２４時間後に採取し、－８０℃で凍結した。細胞を同じ時点で採取し、Ｔ細胞活性化の表面マーカーの発現について染色した。解凍した上清を、Ｅｌｌａプラットフォームを使用して、サイトカインについて評価した。染色された試料を、Ｚｅ５機器を使用して、フローサイトメトリーによって分析した。
３つの異なる細胞株を使用して、ＴＩＬと共培養した。野生型Ｒａｊｉ（カタログ番号ＣＣＬ－８６）及びＫ５６２（カタログ番号ＣＣＬ－２４３）細胞は、ＡＴＣＣから商業的に取得した。Ｒａｊｉ細胞は、バーキットリンパ腫を有する患者に由来するヒトＢリンパ芽球様細胞株であり、Ｋ５６２は、骨髄性白血病細胞株である。照射されたヒトＰＢＭＣは、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋから受領した。
２つのＧｅｎ２ ＴＩＬロットを、照射されたＲａｊｉ細胞、Ｋ５６２細胞、及びＰＢＭＣ細胞との共培養時の活性化について試験した。ＴＩＬ活性化は、Ｋ５６２細胞と比較して、Ｒａｊｉ細胞との共培養時に、マーカー陽性細胞のパーセンテージまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として発現される選択的表面マーカーの発現の増加として定義された。あるいは、Ｒａｊｉ細胞、Ｋ５６２及びＴＩＬを単独で培養してもよい。ＰＢＭＣを対照として使用した場合、ＣＤ３／ＣＤ２８を使用してもよい。ＴＩＬ活性化は、標的細胞とエフェクター細胞との間の異なるＭＨＣの発現に起因すると予想される。ＴＩＬ ＴＣＲ複合体と標的細胞ＨＬＡ－ペプチド複合体との同種異系相互作用は、ＭＨＣ優性認識と称される。Ｆｅｌｉｘ ａｎｄ Ａｌｌｅｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００７，７（１２），９４２－５３、Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｂｅｖａｎ，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７７，２９，１－５、及びＪａｎｅｗａｙ，Ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ．５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｄｉｔｏｒ．２００１，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ。
ＭＨＣ Ｉ及びＩＩ発現の欠如のために、Ｋ５６２細胞は、ＴＩＬとＲａｊｉ細胞との共培養を比較するベースライン活性化レベルを提供する。ＣＤ２８に対するマウスモノクローナル抗体を添加して、Ｔ細胞応答を増幅するための共刺激を提供した。ＰＢＭＣを、ＭＬＲ応答の陽性対照として各ＴＩＬロットと共培養した。
パイロット実験のために十分な細胞が利用可能であることを確実にするために、Ｒａｊｉ細胞を、照射前に、１６０×１０６を超えるまで拡張した。
腫瘍細胞試料の解凍及び培養。Ｋ５６２及びＲａｊｉ腫瘍細胞を解凍し、１０～１４日間培養して、細胞を解凍から回復させ、培地に適応させ、実験前に適切な数に拡張した。２００ｍＬの培地を３７℃の水浴内で１５±５分間温めた。腫瘍細胞試料の各々について、１０ｍＬの温かい培地を用いて５０ｍＬのコニカルチューブを調製し、腫瘍株の名前をラベル付けした。
小さな氷の塊のみが残るまで、２×１０６～１０×１０６細胞／１ｍＬバイアルを含有する細胞の単一バイアルを、３７℃の水浴中で解凍した。部分的に解凍されたバイアルをＢＳＣの中に移した。解凍した腫瘍細胞の内容物を、指定されたコニカルチューブに移した。０．５ｍＬの温かい培地をクライオバイアルにゆっくりと滴下添加し、バイアルを回転させながら培地を追加して混合する。上下に５～６回ゆっくりとピペッティングすることにより、クライオバイアルの内容物を混合した。バイアルの内容物を、５０ｍＬのコニカルチューブに移した。
コニカルチューブを４００×ｇで５分間、室温（ＲＴ）で一緒に遠心分離した。細胞ペレットを避けて、各チューブから上清を取り出した。チューブをチューブラックに軽くこすって、細胞ペレットを緩める。細胞を毎日チェックし、細胞が約７０～８０％コンフルエントである場合は１：４に分割する。
腫瘍細胞の採取。フラスコまたはプレートから懸濁液中の腫瘍細胞を取り出し、腫瘍培地を有する５０ｍＬのコニカルチューブに追加した。フラスコを１×ＰＢＳまたは腫瘍培地ですすぎ、内容物を５０ｍＬのコニカルチューブに追加する。
コニカルチューブを４００×ｇで５分間、ＲＴで一緒に遠心分離した。細胞ペレットを避けて、各チューブから上清を慎重に取り出した。チューブをチューブラックに軽くこすって、細胞ペレットを緩める。１ｍＬピペッターを使用して、ＴＩＬを１ｍＬ培地中に再懸濁し、上下にゆっくりとピペットしてペレットをさらに破砕した。血清学的ピペットを使用して、培地を用いて細胞懸濁液を５ｍＬにした。血清学的ピペットを用いて細胞懸濁液を上下にピペットして、完全に混合した。２つの２００μＬアリコートの細胞懸濁液を取り出して、Ｋ２セルカウンター上で計数した。
Ｋ５６２及びＲａｊｉ細胞の照射。腫瘍細胞を１６０×１０６細胞を超えて拡張した後、細胞を標準的な操作手順を使用して３５Ｇｙで照射した。
照射後、Ｋ２セルカウンターを使用して細胞を計数し、生存率について評価する。次いで、細胞を、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０ Ｆｒｅｅｚｅ Ｍｅｄｉａ（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、カタログ番号２１０３７３）中、１０×１０６細胞／ｍＬでデュワー内で凍結させる。
ＴＩＬの解凍及び回復。２００ｍＬのＴＩＬ培地（ＣＭ１）を３７℃の水浴中で１５±５分間温めた後、ＢＳＣに入れた。ＩＬ－２ストック溶液を調製した（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）。温かい培地及びＩＬ－２ストック溶液をＢＳＣに移した。１０μＬのＩＬ－２ストック溶液（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）を培地に添加することによって、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２で培地を補充する。
各ＴＩＬロットについて、１０ｍＬの温かい培地を有する５０ｍＬのコニカルチューブを準備した。チューブにＴＩＬ番号をラベル付けする。ＴＩＬ製品の利用可能性及び１バイアル当たりの細胞数に基づいて、ＴＩＬロット当たり合計６０×１０６細胞を取得するのに十分なバイアルを解凍する。
氷の小さな塊のみが残るまで、３７℃の水浴中で凍結したＴＩＬバイアルを解凍した。解凍したバイアルをＢＳＣの中に移す。解凍したＴＩＬバイアル及びＰＢＭＣの内容物を、指定されたコニカルチューブに移した。０．５ｍＬの温かい培地をＴＩＬバイアルにゆっくりと滴下添加し、バイアルを回転させながら培地を追加して混合した。上下に５～６回ゆっくりとピペッティングすることにより、ＴＩＬバイアルの内容物を混合した。ＴＩＬバイアルの内容物を、５０ｍＬのコニカルチューブに移した。
コニカルチューブを４００×ｇで５分間、ＲＴで一緒に遠心分離した。細胞ペレットを避けて、各チューブから上清を慎重に取り出した。チューブをチューブラックに軽くこすって、細胞ペレットを緩める。１ｍＬピペッターを使用して、ＴＩＬを１ｍＬのＴＩＬ培地中に再懸濁し、上下にゆっくりとピペットしてペレットをさらに破砕した。血清学的ピペットを使用して、培地を用いて細胞懸濁液を５ｍＬにした。
血清学的ピペットを用いて細胞懸濁液を上下にピペットして、完全に混合した。２つの２００μＬアリコートの細胞懸濁液を取り出して、Ｋ２セルカウンター上で計数した。ＴＩＬを、ＣＭ１培地及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２中で１．５×１０６／３×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁した。細胞を、Ｇ－Ｒｅｘ １０フラスコまたはＧ－Ｒｅｘ ６ウェルプレートのいずれかを使用して、４８～７２時間、３７℃／５％ ＣＯ２で回復させた。
共培養のためのＴＩＬ調製。２００ｍＬの培地を３７℃の水浴中で１５±５分間温めた後、ＢＳＣに入れた。１０ｍＬの温かい培地を有する５０ｍＬのコニカルチューブを準備した。Ｇ－Ｒｅｘ １０フラスコまたはＧ－Ｒｅｘ６ウェルプレートからＴＩＬを採取し、指定されたコニカルチューブに細胞を移す。コニカルチューブを４００×ｇで５分間、ＲＴで一緒に遠心分離した。
細胞ペレットを避けて、各チューブから上清を慎重に取り出した。チューブをチューブラックに軽くこすって、細胞ペレットを緩める。１ｍＬピペッターを使用して、ＴＩＬを１ｍＬ培地中に再懸濁し、上下にゆっくりとピペットしてペレットをさらに破砕する。血清学的ピペットを使用して、培地を用いて細胞懸濁液を２ｍＬにした。血清学的ピペットを用いて細胞懸濁液を上下にピペットして、完全に混合した。２つの２００μＬアリコートの細胞懸濁液を取り出して、Ｋ２セルカウンター上で計数した。
ＴＩＬ培地中で、ＴＩＬを５×１０５細胞／ｍＬに再懸濁した。共培養のために、照射されたＫ５６２細胞、Ｒａｊｉ細胞、及びＰＢＭＣを解凍した。２００ｍＬの培地を３７℃の水浴中で１５±５分間温めた。温かい培地をＢＳＣに移した。各細胞株について、１０ｍＬの温かい培地を有する５０ｍＬのコニカルチューブを準備した。
氷の小さな塊のみが残るまで、３７℃の水浴中で凍結した腫瘍細胞株を解凍した。解凍したサテライトバイアルをＢＳＣの中に移した。解凍した腫瘍細胞の内容物を、指定されたコニカルチューブに移した。０．５ｍＬの温かい培地をクライオバイアルにゆっくりと滴下添加し、バイアルを回転させながら培地を追加して混合した。上下に５～６回ゆっくりとピペッティングすることにより、バイアルの内容物を混合した。細胞内容物を、５０ｍＬのコニカルチューブに移した。
コニカルチューブを４００×ｇで５分間、室温（ＲＴ）で一緒に遠心分離した。細胞ペレットを避けて、各チューブから上清を慎重に取り出した。チューブをチューブラックに軽くこすって、細胞ペレットを緩める。１ｍＬピペッターを使用して、ＴＩＬを１ｍＬ培地中に再懸濁し、上下にゆっくりとピペットしてペレットをさらに破砕した。血清学的ピペットを使用して、培地を用いて細胞懸濁液を５ｍＬにした。血清学的ピペットを用いて細胞懸濁液を上下にピペットして、完全に混合した。２つの２００μＬアリコートの細胞懸濁液を取り出して、Ｋ２セルカウンター上で計数した。ＴＩＬが調製されると、細胞を腫瘍培地中で５×１０５細胞／ｍＬの濃度に再懸濁し、共培養のためにインキュベーターに入れた。
ＴＩＬ及び腫瘍細胞共培養の設定。各ＴＩＬロットを、ＴＩＬ：標的比及び以下に示される細胞数＋／－抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍＬ）抗体を使用して、照射されたＫ５６２細胞、Ｒａｊｉ細胞、及びＰＢＭＣ（３～４人のドナー）またはビーズ刺激とは別個に共培養した。１×１０６個の総細胞を、４８ウェルプレートの１ウェル中の１ｍＬにプレートする。実験的設定は、パイロット及び主研究に対して同じである。図４７で見ることができるように、ＴＩＬロット当たり１つのプレートが必要であり、追加の対照ウェルを追加のプレートで実行する。
●５０：１（９．８×１０５ＴＩＬ：２×１０４標的細胞）
●２５：１（９．６×１０５ＴＩＬ：４×１０４標的細胞）
●１２．５：１（９．２×１０５ＴＩＬ：８×１０４標的細胞）
●６．２５：１（８．４×１０５ＴＩＬ：１．５×１０５標的細胞）
●１：１（５×１０５ＴＩＬ：５×１０５標的細胞）
●１：６．２５（１．５×１０５ＴＩＬ：８．４×１０５標的細胞）
●１：１２．５（８×１０４ＴＩＬ：９．２×１０５標的細胞）
●１：２５（４×１０４ＴＩＬ：９．６×１０５標的細胞）
５ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８を示されたウェルに追加した。ＴＩＬ培地でウェルの容量を１０００μＬにした。αＣＤ３／αＣＤ２８／α４－１ＢＢビーズを含有するウェルについては、製造業者の指示に従って洗浄、調製し、ビーズを追加した。ＴＩＬロット当たりおよそ２７．０×１０６ＴＩＬ及び９×１０６標的細胞が必要である。
プレートをインキュベーター（５％ ＣＯ２、３７℃）内で、選択した培養期間インキュベートした。２つのＧｅｎ２研究試料を用いたパイロット研究の場合、プレートを、様々な時点（すなわち、６、１２、１８、及び２４時間）でインキュベートしる。最適共培養期間は、最も高いＲａｊｉ／Ｋ５６２活性化値をもたらすものとして定義され、６つのＧｅｎ２ ＴＩＬ臨床試料に適用された。
活性化マーカーの発現を評価するための細胞の収集。細胞懸濁液を４８ウェルプレートから取り出し、事前にラベル付けされたＦＡＣＳチューブに入れた。およそ３ｍＬの１×ＰＢＳを各チューブに追加した。チューブを、室温で５分間、４００×ｇ、高加速及びブレーキで回転させた。上清をデカントした。細胞を、表５０に示される例示的な抗体パネルで染色した。

Figure 2024512029000056
染色の完了時に、フローサイトメーター上で収集する準備が整うまで、試料を暗所で４０℃で保管し、２４時間以内にＺｅ５上でデータを取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して、フローサイトメトリーデータを分析した。結果を、生体ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞及びＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞のマーカー陽性細胞パーセントとして表した。
上清の収集及びサイトカインの評価。インキュベーターからプレートを取り出した。プレートの底部にある細胞を乱さないこと。各ウェルの上部から８０μＬの上清を取り出し、８０μＬの試料を９６ウェルＵプレートに移した。さらに２つの９６ウェルプレートでこのステップを繰り返して、２つのバックアッププレートを作成した。各９６ウェルプレートを接着シールで密封し、プレートを－８０℃の冷凍庫で保管する。結果を図３５～図３８に示す。
次いで、上清をＥＬＬＡプラットフォームを使用して、ＩＦＮ－γ、ＣＣＬ４、グランザイムＢ、ＴＮＦ－α、及びＭＩＰ－１β分泌について評価した。ＩＦＮ－γの結果を図３９に示す。ＣＣＬ４の結果を図４０に示す。グランザイムＢの結果を図４１に示す。プレートレイアウトを図４２に示す。
実施例１５：６つのＴＩＬ試料のＴＩＬ効力評価
実施例１４に記載されるようなＲａｊｉ細胞ベースの共培養システムを使用して、合計６つのＧｅｎ２黒色腫ＴＩＬロットを評価した。Ｋ５６２細胞を、ＨＬＡ陰性対照として使用した。ＴＩＬ試料を、活性化及び分泌されたサイトカインの表現型マーカーについて分析した。複数の追加のサイトカインまたは他の分泌タンパク質は、ＥＬＩＳＡまたは自動ＥＬＩＳＡ方法を使用して監視することができる。一般的な実験スキームを図４２に示す。
図４３～図５４は、このＴＩＬ試料のセットでの共培養効力アッセイを用いた実験の結果を示す。臨床応答を有する患者は、付随する研究で使用される基準によって分離され、応答しなかった患者から分離されるが、患者の応答状態は、アッセイの使用またはデータの分析を制限するものではない。実験は、アッセイが、Ｒａｊｉ細胞との共培養時に、ＩＦＮ－γ及びグランザイムＢ分泌を検出する能力を実証した。６つのＧｅｎ２ ＴＩＬ試料にわたって、ＴＩＬ－Ｒａｊｉ細胞共培養アッセイによって決定されたＩＦＮ－γの範囲は、４２．１ｐｇ／ｍＬ（３０１－００１）～３７０８ｐｇ／ｍＬであった（患者００８－００２）。ＴＩＬ－Ｒａｊｉ細胞共培養アッセイによって決定されたグランザイムＢの範囲は、５６８．３ｐｇ／ｍＬ（３０１－００１）～８７２１．３３ｐｇ／ｍＬ（００８－００２）であった。
実施例１６：２２個のＴＩＬ試料の多機能ＴＩＬ効力評価
この実施例では、多機能性ＴＩＬ効力アッセイの様々な実施形態は、ＴＩＬロットの効力を評価するために、Ｋ５６２細胞ベースの陰性対照共培養システムと併せて使用されるＲａｊｉ細胞ベースの共培養システムを使用して実証される。Ｋ５６２細胞及びＲａｊｉ細胞を解凍し、計数し、６ウェルプレートまたはＴ２５フラスコ内で１０～１４日間拡張した。細胞数が＞１６０×１０６に達すると、細胞を３５Ｇｙで照射し、等分し、後で使用するために凍結した。Ｇｅｎ２ ＴＩＬロットを解凍して計数し、共培養の前に４８～７２時間培養して回復させた。照射されたＫ５６２及びＲａｊｉ細胞を解凍し、一定数のＴＩＬ（５００，０００細胞）とともに、３つのＴＩＬ：標的比（３：１、１：１、１：３）を使用してＴＩＬと共培養した。ＴＩＬロットはまた、任意選択の陽性活性化対照を提供するために、抗ＣＤ３／ＣＤ２８／４１ＢＢでコーティングされた磁気ビーズで刺激される。ＴＩＬ及び腫瘍細胞株のみの対照も含まれる。共培養の開始後１２及び１８時間で上清を採取する。上清を、ＥＬＬＡ自動ＥＬＩＳＡベースのプラットフォームを使用して、サイトカインについて評価する。２つの細胞株をＴＩＬと共培養する。野生型Ｒａｊｉ（カタログ番号ＣＣＬ－８６）及びＫ５６２（カタログ番号ＣＣＬ－２４３）細胞を、ＡＴＣＣから商業的に取得した。Ｒａｊｉ細胞は、バーキットリンパ腫を有する患者に由来するヒトＢリンパ芽球様細胞株である。Ｋ５６２は、骨髄性白血病細胞株である。Ｒａｊｉ細胞のＨＬＡ型を使用前に検証した。
当業者に知られている一般に利用可能な実験室材料に加えて、以下の材料をこの実施例に使用した。ＲＰＭＩ １６４０培地（ＡＴＣＣ，ＶＡ，ＵＳＡ、カタログ番号ＡＴＣＣ ３０－２００１）、グルタミン酸塩（Ｇｉｂｃｏ，ＭＡ，ＵＳＡ、カタログ番号３００５０－０６１）、β－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ，ＭＡ，ＵＳＡ、カタログ番号２１９８５－０２３）、ＴＩＬ用のヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ，ＣＡ，ＵＳＡ、カタログ番号１００－５１２）、腫瘍細胞株用のウシ胎児血清（ＡＴＣＣ，ＶＡ，ＵＳＡ、カタログ番号ＡＴＣＣ ３０－２０２０）、ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ，ＭＡ，ＵＳＡ、カタログ番号１５７５０－０６０）、ＧＭＰ組換えＩＬ－２（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号１０２０－１０００）、ハンクス平衡塩溶液、またはＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ，ＭＡ，ＵＳＡ、カタログ番号１４１７５－０９５）、ＣＥＬＬＳＴＡＲ Ｔ２５フラスコ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ、カタログ番号０７－０００－２２５）、Ｇ－Ｒｅｘ６、２４ウェルプレート、及び１０フラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ，ＭＮ，ＵＳＡ、カタログ番号Ｐ／Ｎ８０２４０Ｍ、Ｐ／Ｎ８０１９２Ｍ；番号８００４０Ｓ）、ＩＦＮ－γ（第３世代）、グランザイムＢ、ＴＮＦ－α（第２世代）、及びＭＩＰ－１α（ＢｉｏＡｇｉｌｙｔｉｘ，ＮＣ，ＵＳＡ、キットＩＤ１２７７２５）用のＥＬＬＡヒトマルチアナライトカートリッジ、ヒトサイトカイン凍結乾燥対照（ＢｉｏＡｇｉｌｙｔｉｘ，ＮＣ，ＵＳＡ、カタログ番号８９０７７）、及びＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０凍結培地（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＷＡ，ＵＳＡ、カタログ番号２１０３７３）。
当業者に知られている一般に利用可能な実験室装置に加えて、以下の装置をこの実施例に使用した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ ＥＬＬＡ（ＢｉｏＡｇｉｌｙｔｉｘ，ＮＣ，ＵＳＡ、カタログ番号５００－１４０）、Ｋ２セルカウンター（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、Ｋ２ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒｓ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ，ＭＡ，ＵＳＡ、カタログ番号ＳＤ１００）、ＪＵＮ－ＡＩＲ、モデル８４Ｒ－ＲＰ真空ポンプ（Ｓｏｎｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）、及びＳｔｅｒｉ－Ｃｙｃｌｅ ｉ１６０ ＣＯ２インキュベーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ、カタログ番号５１０３０３０１）。
２２個の無作為に選択された黒色腫Ｇｅｎ２ ＴＩＬロットを、照射されたＲａｊｉ細胞及びＫ５６２細胞との共培養時の活性化について試験した。
理論に拘束されることなく、本発明のある実施形態では、ＴＩＬ ＴＣＲ複合体と標的細胞ＨＬＡ－ペプチド複合体との同種異系相互作用は、図５６に示され、本明細書の他の箇所にも記載されるように、ＭＨＣ優性認識としてのものである。ＭＨＣ Ｉ及びＩＩ発現の欠如のために、Ｋ５６２細胞は、ＴＩＬとＲａｊｉ細胞との共培養を比較することができるベースライン活性化レベルを提供すると予想される。ＴＩＬ単独の培養物をベースラインとして使用することもできる。
腫瘍細胞試料の解凍及び培養。Ｋ５６２及びＲａｊｉ腫瘍細胞を解凍し、１０～１４日間培養して、細胞を解凍から回復させ、培地に適応させ、研究前に適切な数に拡張した。培地（２００ｍＬ）を３７℃の水浴中で１５±５分間温めた後、ＢＳＣに入れた。腫瘍細胞試料の各々について、１０ｍＬの温かい培地を有する５０ｍＬのコニカルチューブを準備した。チューブには、腫瘍株名をラベル付けする。小さな氷の塊のみが残るまで、２×１０６～１０×１０６細胞／１ｍＬバイアルを含有する細胞の単一バイアルを、３７℃の水浴中で解凍した。部分的に解凍されたバイアルを、生物学的安全キャビネットに移した。解凍した腫瘍細胞の内容物を指定されたコニカルチューブに移し、０．５ｍＬの温かい培地をクライオバイアルにゆっくりと滴下添加し、バイアルを回転させながら培地を追加して混合した。次いで、上下に５～６回ゆっくりとピペッティングすることにより、クライオバイアルの内容物を混合した。バイアルの内容物を、５０ｍＬのコニカルチューブに移した。コニカルチューブを４００×ｇで５分間、室温（ＲＴ）で遠心分離した。細胞ペレットを避けて、各チューブから上清を慎重に取り出した。チューブをチューブラックに軽くこすって、細胞ペレットを緩めた。細胞を毎日チェックし、細胞が約７０～８０％コンフルエントである場合は１：４に分割した。
腫瘍細胞の採取。フラスコまたはプレートから懸濁液中の腫瘍細胞を取り出し、腫瘍培地を有する５０ｍＬのコニカルチューブに追加した。フラスコを１×ＰＢＳまたは腫瘍培地ですすぎ、内容物を５０ｍＬのコニカルチューブに追加した。コニカルチューブを４００×ｇで５分間、ＲＴで一緒に遠心分離した。細胞ペレットを避けて、各チューブから上清を慎重に取り出した。チューブをチューブラックに軽くこすって、細胞ペレットを緩めた。１ｍＬピペッターを使用して、ＴＩＬを１ｍＬ培地中に再懸濁し、上下にゆっくりとピペットしてペレットをさらに破砕した。血清学的ピペットを使用して、細胞懸濁液を培地を用いて５ｍＬにした。血清学的ピペットを用いて細胞懸濁液を上下にピペットして、完全に混合した。次いで、２つの２００μＬアリコートの細胞懸濁液を取り出して、Ｋ２セルカウンター上で計数した。
Ｋ５６２及びＲａｊｉ細胞の照射。Ｒａｊｉ細胞及びＫ５６２細胞を＞１６０×１０６細胞に拡張した後、細胞を３５Ｇｙで照射した。照射後、Ｋ２セルカウンターを使用して細胞を計数し、生存率について評価した。細胞を、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０中１０×１０６細胞／ｍＬで凍結した。
ＴＩＬの解凍及び回復。２００ｍＬのＴＩＬ培地（ＣＭ１）を３７℃の水浴内で１５±５分間温めた後、生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）に入れる。ＩＬ－２ストック溶液（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）を調製し、温かい培地を有するＢＳＣに移す。１０μＬのＩＬ－２ストック溶液（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）を培地に添加することによって、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２で培地を補充する。各ＴＩＬロットについて、５０ｍＬのコニカルチューブを１０ｍＬの温かい培地とともに調製し、ＴＩＬロット番号をラベル付けする。ＴＩＬ製品の利用可能性及び１バイアル当たりの細胞数に基づいて、ＴＩＬロット当たり合計６０×１０６細胞を取得するのに十分なバイアルを解凍する。氷の小さな塊のみが残るまで、凍結したＴＩＬバイアルを３７℃の水浴中で解凍した。解凍されたバイアルをＢＳＣの中に移す。次いで、解凍されたＴＩＬバイアル及びＰＢＭＣ（後者は、ＭＬＲ陽性対照として使用される）の内容物を、指定されたコニカルチューブに移す。温かい培地（０．５ｍＬ）をＴＩＬバイアルにゆっくりと滴下添加しながら、バイアルを回転させ、培地を追加して混合する。上下に５～６回ゆっくりとピペッティングすることにより、ＴＩＬバイアルの内容物を混合する。ＴＩＬバイアルの内容物を、５０ｍＬのコニカルチューブに移す。コニカルチューブを４００×ｇで５分間、ＲＴで一緒に遠心分離する。細胞ペレットを避けて、各チューブから上清を慎重に取り出す。チューブをチューブラックに軽くこすって、細胞ペレットを緩める。１ｍＬピペッターを使用して、ＴＩＬロットを１ｍＬ ＴＩＬ培地中に再懸濁し、上下にゆっくりとピペットしてペレットをさらに破砕した。血清学的ピペットを使用して、細胞懸濁液を培地で５ｍＬにし、懸濁液を上下にピペットして完全に混合する。２つの２００μＬアリコートの細胞懸濁液を取り出して、Ｋ２セルカウンター上で計数する。ＴＩＬロットを、ＣＭ１培地及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２中で１．５×１０６／３×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁する。細胞を、Ｇ－Ｒｅｘ １０フラスコまたはＧ－Ｒｅｘ ６ウェルプレートのいずれかを使用して、４８～７２時間、３７℃／５％ ＣＯ２で回復させる。
共培養のためのＴＩＬ調製。２００ｍＬの培地を３７℃の水浴中で１５±５分間温めた後、ＢＳＣに入れる。５０ｍＬのコニカルチューブを、１０ｍＬの温かい培地で準備する。Ｇ－Ｒｅｘ １０フラスコまたはＧ－Ｒｅｘ６ウェルプレートからＴＩＬ試料を採取し、指定されたコニカルチューブに移す。コニカルチューブを４００×ｇで５分間、ＲＴで一緒に遠心分離する。細胞ペレットを避けて、各チューブから上清を慎重に。チューブをチューブラックに軽くこすって、細胞ペレットを緩める。１ｍＬピペッターを使用して、ＴＩＬロットを１ｍＬ培地中に再懸濁し、上下にゆっくりとピペットしてペレットをさらに破砕する。血清学的ピペットを使用して、細胞懸濁液を培地で２ｍＬにし、上下にピペットして完全に混合する。２つの２００μＬアリコートの細胞懸濁液を取り出して、Ｋ２セルカウンター上で計数する。ＴＩＬロットを、ＴＩＬ培地中５×１０５細胞／ｍＬで再懸濁する。
共培養のために照射されたＫ５６２細胞、Ｒａｊｉ細胞、及びＰＢＭＣを解凍する。２００ｍＬの培地を３７℃の水浴中で１５±５分間温めた後、ＢＳＣに入れる。温かい培地をＢＳＣに移す。各細胞株について、５０ｍＬのコニカルチューブを１０ｍＬの温かい培地で準備し、適切にラベル付けする。氷の小さな塊のみが残るまで、凍結したＫ５６２及びＲａｊｉ細胞を３７℃の水浴中で解凍する。解凍されたサテライトバイアルをＢＳＣの中に移す。解凍したＫ５６２及びＲａｊｉ細胞の内容物を指定されたコニカルチューブに移し、０．５ｍＬの温かい培地をクライオバイアルにゆっくりと滴下添加し、バイアルを回転させながら培地を追加して混合する。上下に５～６回ゆっくりとピペッティングすることにより、バイアルの内容物を混合する。細胞内容物を、５０ｍＬのコニカルチューブに移す。コニカルチューブを４００×ｇで５分間、ＲＴで一緒に遠心分離する。細胞ペレットを避けて、各チューブから上清を慎重に取り出す。チューブをチューブラックに軽くこすって、細胞ペレットを緩める。１ｍＬピペッターを使用して、ＴＩＬを１ｍＬ培地中に再懸濁し、上下にゆっくりとピペットしてペレットをさらに破砕する。血清学的ピペットを使用して、細胞懸濁液を培地で５ｍＬにし、血清学的ピペットで上下にピペットして完全に混合する。２つの２００μＬアリコートの細胞懸濁液を取り出して、Ｋ２セルカウンター上で計数する。ＴＩＬ試料が調製されると、細胞を腫瘍培地中で５×１０５細胞／ｍＬの濃度に再懸濁し、共培養のためにインキュベーターに入れる。
ＴＩＬ及び腫瘍細胞共培養の設定。各ＴＩＬロットは、以下のＴＩＬ：標的比を使用して、照射されたＫ５６２細胞及びＲａｊｉ細胞と別個に共培養される：３：１（５．０×１０５：１．６７×１０５）、１：１（５．０×１０５：５．０×１０５）、及び１：３（５．０×１０５：１．５×１０６）。共培養のためのＴＩＬ試料は、以下に見ることができるように、合計２４条件について、３回、４８ウェルプレートの１ウェル中の１ｍＬに、すべての条件で５００，０００個の細胞でプレートされる。プレート当たり２つのＧｅｎ２ ＴＩＬ株を実行することができる。一度に最大３つのプレートを設定する。１ｍＬの培地を追加して、１ウェル当たり合計２ｍＬにする。αＣＤ３／αＣＤ２８／α４１ＢＢビーズ（本明細書の他の箇所に記載される任意選択の対照として使用される）を含有するウェルについて、製造業者の指示に従ってビーズを洗浄し、調製し、追加する。プレートを、選択した培養期間インキュベートする（５％ ＣＯ２、３７℃）。プレートレイアウトを図５７に示し、一般的な実験スキームを図５８に示す。
上清の収集及びサイトカインの評価。プレートの底部の細胞を乱すことなく、インキュベーターからプレートを取り出す。１２時間及び１８時間の共培養で、５０μＬの上清を取り出し、エッペンドルフチューブまたは９６ウェルＵプレートのいずれかに移す。さらに２つの９６ウェルプレートでこのステップを繰り返して、２つのバックアッププレートを作成する。プレートには、試料を識別するためにラベル付けする。バックアッププレートを、－８０℃で保管する。各９６ウェルプレートを接着シールで密封し、使用するまで４℃で保管する。上清を、ＥＬＬＡプラットフォームを使用して、ＩＦＮ－γ及びグランザイムＢについて評価する。追加のフローサイトメトリー実験を行って、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５０などの本明細書に記載される関心対象のマーカーを評価してもよい。
結果。２２個のＴＩＬ試料の結果を図５９～図９７に示す。すべての実験は、試料００７－０１６（２回行ったＲａｊｉ細胞及びＫ５６２細胞を用いた１：３の比条件を除いて、１回行った）、試料０１９－００６（すべての条件で２回行った）、及び０２２－００１（すべての条件で１回行った）を除き、３回行った。ＩＦＮ－γ及びグランザイムＢの結果については、１２時間及び１８時間の共培養期間の両方を示し、ＴＮＦ－αの結果については、１８時間の共培養期間を示す。結果は、ＩＦＮ－γ及びグランザイムの産生の倍率増加を示すためにＫ５６２陰性対照細胞株とともに使用された場合を含む、様々なＴＩＬ試料に対するアッセイの驚くほど良好な性能を示し、共培養システムを使用して、同種異系ＭＨＣ－ＴＣＲエンゲージメントを介してＴＩＬを活性化し、Ｇｅｎ２の製造、凍結保存及び解凍後のＴＩＬ製品の効力の尺度を提供したことを実証する。アッセイは、本質的に多官能性であり、１つの分析物または分析物の組み合わせを効率的に選択することを可能にする。一般に、ＩＦＮ－γ及びグランザイムＢの両方を考慮する場合、１８時間の共培養時点は、より堅牢な時点であった。ＴＮＦ－αもまた、１２時間の時点で評価され、好適であれば利用され得る。１：３（ＴＩＬ：標的）比は、この実施例で最大のサイトカイン分泌をもたらした。ＴＩＬ：標的比の範囲にわたる用量反応は、ＴＮＦ－αについて驚くほど顕著であった。ＴＩＬ：標的比は、例えば、１：５、１：１０、または１：２０に増加され得る。
実施例１７：回復時間の評価
この実施例では、冷凍ＴＩＬ製品の解凍後の回復時間を調べる。実験スキーム（これもまた本発明の実施形態である）を図９８に示す。Ｇｅｎ２プロセスを使用して調製した５つの研究ＴＩＬロットを解凍し、解凍後７２時間、４８時間、または２４時間のいずれかで回復させ、実施例１６に記載の方法を使用して、Ｒａｊｉ細胞及びＫ５６２細胞と１：３のＴＩＬ：標的比で共培養したときにＩＦＮ－γ及びグランザイムＢについて評価した。結果を、ロットＭ１１７３については図９９、ロットＭ１１５２については図１００、ロットＭ１１８７については図１０１、ロットＭ１１７９については図１０２、及びロットＭ１１８３については図１０３に示す。ＩＦＮ－γの結果を図１０４及び１０５に要約し、グランザイムＢの結果を図１０６及び１０７に要約する。ＩＦＮ－γの３つの読み出し（絶対値、ＴＩＬに対する倍率、及びＴＩＬ＋Ｋ５６２細胞に対する倍率）はすべて、回収条件にわたって類似していた。７２時間のＴＩＬ回収は、グランザイムＢ分泌について、ＴＩＬ＋Ｋ５６２よりも大きなＴＩＬ＋Ｒａｊｉの倍率誘導をもたらした。２４時間の回収試料で、低減した細胞収率及び生存率が観察された。
実施例１８：マスターセルバンクの調製
この実施例では、マスターセルバンクを、Ｒａｊｉ細胞株及びＫ５６２細胞株に対して調製する。かかるマスターセルバンクは、ヒト使用のためのＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品の放出及び／または安定性試験のためのアッセイでの使用に好適であり、かかる製品は、米国食品医薬品局などの保健当局によって規制されている。パイロット研究は、まず、２５本のバイアルを使用して行い、次いで、本発明の１つ以上の効力アッセイにおける性能について評価する。次いで、Ｒａｊｉ細胞株及びＫ５６２細胞株のマスターセルバンクを、バイアル当たり１ｍＬの体積で、１ｍＬ当たり５×１０６～５×１０６細胞を含有する５００バイアルを使用して調製する。必要に応じて細胞培養拡張を行う。次いで、直接接種による方法適合性試験、直接接種による無菌性、ＤＮＡ増幅による急速なマイコプラズマ検出のための干渉試験、ＤＮＡ増幅による急速なマイコプラズマ検出、インビトロ不定期ウイルスアッセイ検出（細胞株ＭＲＣ－５、Ｖｅｒｏ、及びＨｅＬａ、ウイルスＰＩＶ－５）、ならびにシトクロムＣオキシダーゼサブユニット１による同定を含む、特性評価及び放出を行う。分析証明書及びバッチ記録を作成する。次いで、Ｒａｊｉ細胞株及びＫ５６２細胞株は、方法の検証及び試験手順での使用に好適に適格性確認される。Ｒａｍｏｓ、Ｕ９３７、Ｔｈｐ１、及びＤａｕｄｉ細胞のマスターセルバンクも同様に調製され得る。
実施例１９：ＴＨＰ１細胞を用いたアロ反応性共培養アッセイ
この実施例では、ＴＩＬとＴｈｐ１（ＴＨＰ－１としても知られる）標的細胞株、ヒト単球性白血病細胞株との共培養を使用したアロ反応性共培養アッセイの実施形態が実証される。理論に拘束されることなく、ＴＩＬ活性化は、図１０８に示されるように、Ｔｈｐ１細胞の表面でのマッチしないペプチド－ＭＨＣ複合体（ＭＨＣｐ）のＴＣＲによる同種認識時に誘導されると考えられる。このアッセイで読み出されるのは、標的細胞の死滅であり、これは、レポーター化学発光タンパク質の放出によって検出され得る。このアッセイは、例えば、本明細書の他の箇所に記載されるように、マスターセルバンク及びワーキングセルバンクを作製するために、ＧＭＰ条件下で産生される標的細胞株の使用を必要とする。標的細胞は、β－ｇａｌ酵素断片であるＰｒｏＬａｂｅｌ（登録商標）（ｅＰＬ）でタグ付けされたハウスキーピングタンパク質を安定的に発現するように操作される。ＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬを含むＴ細胞との共培養時、及び細胞傷害性媒介性膜破壊後に、ｅＰＬ β－ｇａｌ断片が培地に放出される。共培養に続いて、β－ｇａｌ酵素の酵素アクセプター断片を追加し、追加された基質を加水分解する活性β－ｇａｌ酵素を形成し、死滅した標的細胞の数に比例する化学発光シグナルを産生する。読み出しは、標的細胞死、例えば、Ｔｈｐ１またはＲａｊｉ細胞の細胞死に特異的であり、それを直接測定する。前述のプロセスを図１０９に示す。このアッセイの作用機序は、ペプチド同種ＭＨＣ複合体を認識するＴ細胞の能力などの同種異系応答（例えば、混合リンパ球反応、またはＭＬＲ）である。
遺伝子修飾されたＴｈｐ１細胞株を、２つのＴＩＬ融解後条件（凍結ＴＩＬロットから開始）を使用して試験した。（１）解凍後１８～２４時間一晩静置、及び（２）解凍後の静置なし。試験したエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比は、第１の条件で３５：１～２．５：１、第２の条件で１０：１～１：１０であった。両方の条件は、１ウェル当たり１０，０００個の標的細胞を使用した。試験した共培養持続時間は、第１の条件では４時間、８時間、１６時間、及び３６時間であり、第２の条件では一晩（１６～２４時間）であった。第１の条件では用量依存性応答及び時間依存性応答、ならびに第２の条件では用量依存性応答によって、細胞傷害性を観察した。図１１０は、第１の条件からの結果を示す。示されるデータは、３つの実験からの平均である。図１１１は、第２の条件からの結果を示す。両方の条件について、０％の細胞傷害性シグナルは、エフェクター細胞なしに対応し、１００％の細胞傷害性シグナルは、完全に溶解された標的細胞に対応する。
実施例２０：共培養中にＩＬ－２を使用したＴＩＬ効力方法
この実施例では、本発明の効力方法は、共培養中に連続的に添加される３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を有するＡＩＭ－Ｖ培地（図１１２に実施形態Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥとして例示されるように）を使用して、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を最初に添加したＣＭ１培地と比較して、上記及び図１１２に実施形態Ａとして例示されるようにさらに評価される。実施形態Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥは、共培養中に添加されるＡＩＭ－Ｖ中の３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含み、これは最終的なＧｅｎ２及びＧｅｎ３製品製剤の実施形態と一致し、より良いシステム適合性を提供する。ＡＩＭ－Ｖ培地は、最終的な細胞拡張に合わせて血清を含まず、より良いシステム適合性も提供する。共培養中にＩＬ－２を添加して、サイトカイン濃度を増加させる。解凍直後（すなわち、ＴＩＬ回復のための静置期間なし）の共培養の開始もまた、投与時にＴＩＬ医薬品をより密接に表すため、利点を提供し得る。静置期間が長くなると、ＴＩＬの回復が促進され、安定性を示すものではなく、製造プロセスの失敗を隠すこともある。
図１１３は、ＴＩＬ細胞株の解凍後の静置期間の関数として、異なる共培地条件下での、２つの異なるＴＩＬ細胞株、Ｍ１１７９及びＭ１１８３についての総生細胞数（ＴＶＣ）及び生存率パーセントの評価の結果を示す。生存率パーセントの減少は、最初の２４時間の期間で観察され、２４時間超静置したＴＩＬでは、ＴＶＣの増加及び増殖が観察された（約１倍化／日）。これらの結果は、２４時間の静置後に回復したＴＩＬが、医薬品の同じ細胞集団を表さない可能性があることを示唆する。両方のＴＩＬ細胞株について、解凍後にわずかな減少が観察され、その後に回復が始まる。
３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の有無にかかわらず、Ｒａｊｉ細胞及びＫ５６２細胞との共培養の比較の結果を、表５１、図１１４、及び図１１５に示す。ＴＩＬ株Ｍ１１７９及びＭ１１８３の解凍直後（すなわち、静置期間なしで）、ＡＩＭ－Ｖ培地中で実験を行った。結果は、ＩＬ－２の添加がＩＦＮ－γ分泌を増強することを実証する。ＩＦＮ－γの絶対濃度値及び倍率変化は、ＩＬ－２を添加すると増加する。ＩＬ－２は、ＴＩＬ単独を使用して行った対照のベースラインを増加させることが観察された。反復性を、これらの実験中に共培養複製物にわたって評価した。１１％の単一バイアル変動係数（ＣＶ）％を取得した。

Figure 2024512029000057
異なる培養条件及び静置期間も調査し、結果を表５２、図１１６、及び図１１７に示す。結果は、ＡＩＭ－Ｖ及びＩＬ－２が共培養培地で使用される場合、良好なＩＦＮ－γ分泌に７２時間の回復は必要ないことを示している。

Figure 2024512029000058
解凍後の回復期間が延長されるにつれてサイトカイン分泌効果を決定する実験も行い、結果を表５３、図１１８、及び図１１９に要約した。これらの実験では、静置時培地は、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を有するＣＭ１であり、共培養培地は、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を有するＡＩＭ－Ｖであった。Ｒａｊｉ細胞との共培養についてのすべての条件にわたって、絶対ＩＦＮ－γ分泌を検出した。ＴＩＬ単独に対するＩＦＮ－γの倍率変化は、すべての静置条件にわたって一貫していた。ＴＩＬ単独とＫ５６２陰性対照の使用との間の倍率変化の差は、２４時間を超える時点で観察され、細胞集団の変化を示し得る。
Figure 2024512029000059
７２時間にわたる細胞集団の特徴を決定するために、フローサイトメトリー分析を行った。表５４及び表５５に提供されるように、時間研究を２つの実験で行った。
Figure 2024512029000060

Figure 2024512029000061
これらの設計に続いて、細胞を２４ウェルプレート中に１×１０６／ｍＬの濃度で播種し、５％ ＣＯ２で３７℃で静置した。細胞を、各特定の時点＋／－１時間で採取した。生存率及びＴＶＣを各時点で行った。細胞を、ＦＭＯ対照を用いた適格性確認された残留フローアッセイを用いて染色し、同日取得を用いるＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）で取得した。結果を表５６及び表５７に要約し、実験１及び実験２からのＡＩＭ－Ｖ＋ＩＬ２結果を平均した。
Figure 2024512029000062
結果は、全集団のＣＤ４５＋細胞集団％及びＣＤ３＋細胞集団％が、すべての培地においてＩＬ－２で７２時間にわたって一貫していたことを示す。しかしながら、生集団のＣＤ４５＋及びＣＤ３＋集団％は、すべての条件で２４時間の静置後に約５０％減少する。結果は、２４時間を超える静置を伴う培地条件（ＩＬ－２、血清）にわたって変化する。
Figure 2024512029000063
残留細胞集団は、解凍後のより長い静置で増加することが観察される。例えば、Ｂ細胞集団は、ＩＬ－２なしで７２時間の静置で約２０％増加するが、ＮＫ細胞は、２４時間の静置後に４～５％増加する。医薬品の平均残留細胞集団は、典型的には、＜１％である。
図１２０は、ＴＩＬ株Ｍ１１７９の親生集団の残留細胞集団のフローサイトメトリー分析を示す。図１２１及び１２２は、それぞれ、Ｒａｊｉ細胞株及びＫ５６２細胞株の増殖プロファイルを示す。
結論として、共培養における３００ＩＵ／ｍＬでのＩＬ－２の添加は、ＩＬ－２を含まない培地上でのＩＦＮ－γのサイトカインシグナル及び倍率変化を増加させる。共培養における細胞集団は、静置の２４時間後（増殖、分化、及び不均一性を含む）にＣＭ１培地において変化することが観察され、その結果、解凍後及び共培養アッセイを開始する前のＴＩＬについての７２時間の静置は、製品が回復期間中に回復及び拡張するための可用性を与えられるため、このバージョンのアッセイを製造プロセスの失敗に対する感受性を低くする。ＡＩＭ－Ｖ及びＩＬ－２は、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３ ＴＩＬ製品とのマトリックス適合性についてより好適である。干渉のため、リガンド結合アッセイでは血清は推奨されない。
実施例２１：黒色腫ＴＩＬ株及びＲＡＪＩ、ＴＨＰ１、ＲＡＭＯＳ、及びＵ９３７標的細胞を用いたアロ反応性共培養アッセイ
この実施例は、Ｋ５６２細胞株陰性対照を含む本発明の効力アッセイにおける、Ｒａｊｉ、Ｔｈｐ１、Ｒａｍｏｓ、及びＵ９３７標的細胞株を含む複数の標的細胞株の使用を探求する。実験プロトコルを図１２３に要約する。
共培養システムを使用して、同種異系ＭＨＣ－ＴＣＲエンゲージメントを介してＴＩＬを活性化した。Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｔｈｐ１、及びＵ９３７細胞、ならびにＫ５６２細胞との共培養時に、４つの研究黒色腫Ｇｅｎ２ ＴＩＬ製品を、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αについて３：１、１：１、及び１：３（ＴＩＬ対腫瘍細胞）の比で評価した。結果を図１２４～図１２９に示す。ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γの両方についてのサイトカイン分泌及び倍率誘導は、評価された腫瘍細胞にわたって可変であった。一般に、ここで選択された４つのＴＩＬ細胞株にわたる腫瘍株への応答性は、最大から最小まで、以下のとおりであった：Ｔｈｐ１、Ｕ９３７、Ｒａｊｉ、及びＲａｍｏｓ。ＴＩＬ単独またはＫ５６２細胞と比較して、Ｒａｊｉ細胞に応答して同様のレベルのＩＦＮ－γを分泌した４つの評価されたＧｅｎ２ ＴＩＬ株のうちの２つは、Ｕ９３７またはＴｈｐ１のいずれかの存在下で共培養したときにより多くのサイトカインを分泌した。ＴＮＦ－αは、ＴＩＬなしで共培養したとき、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｔｈｐ１、及びＵ９３７細胞によって分泌されたが、Ｋ５６２細胞によっては分泌されなかったことが観察された。腫瘍株によって分泌されたＴＮＦ－αの量は、異なる株にわたって変化し、腫瘍細胞の数が増加するにつれて増加し、この実施例では、１：３で最も著しい効果が観察された。
本発明の効力アッセイとともに使用するための例示的な標的細胞株のＨＬＡ特性を表５８に提供する。ＨＬＡ多様性及び／または免疫原性の可変度は、これらの細胞株及び当該技術分野で知られている他の好適な標的細胞株の使用から入手可能である。

Figure 2024512029000064
図１３４は、４つの試験した黒色腫ＴＩＬ株についての異なる標的細胞株及び細胞株の組み合わせのＩＦＮ－γ性能を要約する。
図１３５は、黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１５２、Ｍ１１８７、Ｍ１１９８、及びＭ１２００についての、組み合わせ標的細胞株を含む、試験した標的及び陰性対照細胞株のＴＮＦ－α分泌（ｐｇ／ｍＬ）を示す。図１３６は、（ＴＩＬ＋腫瘍細胞株または組み合わせ）／ＴＩＬ単独の倍率変化としてのＴＮＦ－α分泌を示し、図１３７は、同じ４つの黒色腫ＴＩＬ株についての（ＴＩＬ＋腫瘍細胞株または組み合わせ）／（ＴＩＬ＋Ｋ５６２）の倍率変化としてのＴＮＦ－α分泌を示す。
図１３８は、黒色腫ＴＩＬ株Ｍ１１５２、Ｍ１１８７、Ｍ１１９８、及びＭ１２００についての、組み合わせ標的細胞株を含む、試験した標的及び陰性対照細胞株のグランザイムＢ分泌（ｐｇ／ｍＬ）を示す。図１３９は、（ＴＩＬ＋腫瘍細胞株または組み合わせ）／ＴＩＬ単独の倍率変化としてのグランザイムＢ分泌を示し、図１４０は、同じ４つの黒色腫ＴＩＬ株についての（ＴＩＬ＋腫瘍細胞株または組み合わせ）／（ＴＩＬ＋Ｋ５６２）の倍率変化としてのグランザイムＢ分泌を示す。
結果は、ＴＩＬ効力の評価における異なる標的細胞株及びそれらの組み合わせの有効性を実証する。
実施例２２：非小細胞肺癌ＴＩＬ株及びＲＡＪＩ、ＴＨＰ１、ＲＡＭＯＳ、及びＵ９３７標的細胞とのアロ反応性共培養アッセイ
図１４１の実験プロトコルを使用して、異なる標的細胞株及び標的細胞株の組み合わせを使用して、１０個の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ＴＩＬ株を評価した。
１０個のＮＳＣＬＣ ＴＩＬ株のうち４個は、市販のドナー腫瘍から増殖した研究細胞株であった。これらの４つのＴＩＬ株からの結果を図１４２～１４４に示す。
１０個のＮＳＣＬＣ ＴＩＬ株のうちの他の６個は、Ｉｏｖａｎｃｅ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．によってスポンサーされた抗ＰＤ－１抗体による治療後のＮＳＣＬＣ患者におけるＴＩＬ療法の非登録研究における臨床試験参加者から取得された臨床細胞株であった。これら６個のＴＩＬ株からの結果を図１４５～１４７に示す。
ＴＩＬ単独に対する倍率としてのＩＦＮ－γ分泌の臨床ＮＳＣＬＣ結果の要約を図１４８に示し、Ｋ５６２陰性対照細胞と共培養したＴＩＬに対する倍率としてのＩＦＮ－γ分泌の臨床ＮＳＣＬＣ結果の要約を図１４９として示す。
この実施例の１０個のＮＳＣＬＣロット及び９個の黒色腫ロットを含む１９個のロットの要約を、ＴＩＬ単独に対する倍率として図１５０に示し、ＩＦＮ－γ分泌について、Ｋ５６２陰性対照細胞と共培養したＴＩＬに対する倍率として図１５１に示す。
実施例２３：照射された標的細胞と照射されていない標的細胞との比較
照射されたＲａｊｉ細胞及びＫ５６２細胞の使用を、増殖（総生細胞）、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及びＡＩＭ－Ｖ培地を用いた実施例２０に記載の共培養方法を使用したＩＦＮ－γ分泌、ならびにアポトーシスについての散乱及び細胞表面マーカーによる形態及びアネキシンＶ染色を含むフローサイトメトリー特性を観察することによって、照射されていないＲａｊｉ細胞及びＫ５６２細胞と比較した。照射は、Ｘ－Ｒａｄ １６０照射器（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘ－ｒａｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ，ＵＳＡ）を使用して、３０ｃｍ及び４２０ｒａｄｓ／分で５０００ｒａｄｓの条件で行った。
図１５２は、Ｒａｊｉ細胞及びＫ５６２細胞の照射が、一般に、２４時間の共培養時間中に増殖に対して最小限の影響を及ぼしたことを示す。２４時間の培養において、照射されたＲａｊｉ細胞は、濃度にわたって増殖を１８～２７％増加させた。２４時間の培養において、照射されていないＲａｊｉ細胞は、濃度にわたって増殖を２～１４％増加させた。２４時間の培養において、照射されたＫ５６２細胞は、濃度にわたって１５％減少～８％増加まで変化した。２４時間の培養において、照射されていないＫ５６２細胞は、濃度にわたって増殖を１４～３４％増加させた。
図１５３は、試験した２つの子宮頸癌ＴＩＬロットを使用して、照射されていないＲａｊｉ細胞対照射されたＲａｊｉ細胞で刺激した場合、ＴＩＬ株が、より高い濃度のＩＦＮ－γを分泌することが見出されたことを示す。
表５９及び図１５４のフローサイトメトリー結果は、照射が、２つの監視された細胞表面マーカーならびにＨＬＡクラスＩ発現を減少させることが観察されたことを実証する。

Figure 2024512029000065
結果は、照射されていないＲａｊｉ細胞及びＫ５６２細胞の増殖が、２４時間、効力アッセイの実施に好適な共培養期間中わずかであったことを示した。２４時間にわたる照射されていないＲａｊｉ細胞の増殖（１４％未満）は、照射されたＲａｊｉ細胞の増殖（２７％未満）よりも小さく、したがって、照射は、ここで使用されるＴＩＬ株を有するＲａｊｉ細胞の２４時間培養期間中の増殖の増加にほとんど影響を及ぼさなかった。ＩＦＮ－γ分泌は、非照射条件に対して照射条件において減少し、これは一般に、照射されたＲａｊｉ細胞におけるＨＬＡ－ＡＢＣの下方調節（ＭＦＩによって－２６％）と相関していた。また、フローサイトメトリーによる前方対側方散乱観察を使用して、照射がＫ５６２及びＲａｊｉの両方で形態学的変化を誘導することが観察された。最後に、アネキシンＶ染色によって観察されるように非照射条件と比較して、Ｒａｊｉ細胞の照射条件を使用して後期アポトーシスを増加させ、Ｋ５６２のアポトーシスのすべての段階にわたって増加させた。
要約すると、結果は、非照射Ｒａｊｉ及びＫ５６２細胞が本発明の効力アッセイとともに使用され得ること、または代替的に、Ｒａｊｉ（または他の標的細胞）のみが照射され得ること、またはＫ５６２細胞のみが照射され得ることを実証した。
実施例２４：共培養条件の評価
照射されていないＲａｊｉ標的細胞、１ウェル当たり１×１０６～２×１０６ＴＩＬの範囲内の密度で播種されたＴＩＬ、及び１：１及び３：１の比の中間点に特異的な濃度範囲のＲａｊｉ細胞（５００，０００細胞）を有する、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及びＡＩＭ－Ｖ培地を用いた実施例２０に記載の共培養方法を使用する。ＩＦＮ－γの放出を、１８、２４、及び３０時間の３つの共培養期間にわたって３回評価した。結果を表６０及び図１５５に示す。

Figure 2024512029000066
結果は、３０時間でのシグナル飽和の証拠を示さず、ＴＩＬ値にわたる倍率変化は、時点に対して比較的非感受性であった。ＴＩＬ単独からのＩＦＮ－γシグナルは、３０時間で最小の増加を示した。
実施例２５：腫瘍標的細胞株の比較
実施例２０に一般的に記載されている３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及びＡＩＭ－Ｖ培地との共培養方法を使用して、この実施例では、腫瘍標的細胞株の追加の比較を行った。照射されていないＴｈｐ１、Ｕ９３７、及びＲａｊｉ細胞株を使用した。同様の比較は、本明細書で提供される教示に基づいて、他の方法、腫瘍標的細胞株、及び陰性対照を使用して行うことができる。図１５６は、１２個の黒色腫ＴＩＬ株の研究のための実験設計を示す。表６１は、各実験のＴＩＬ及び標的細胞の数をまとめたものである。
Figure 2024512029000067
（対照としてのＴＩＬ単独に対する）１．０×１０６ＴＶＣ／ウェルの結果を図１５７に要約し、（対照としてのＴＩＬ単独に対する）２．０×１０６ＴＶＣ／ウェルの結果を図１５８に要約し、（対照としてのＫ５６２細胞に対する）１．０×１０６ＴＶＣ／ウェルの結果を図１５９に要約し、（対照としてのＫ５６２に対する）２．０×１０６ＴＶＣ／ウェルの結果を図１６０に要約する。一般に、１ウェル当たりの総ＴＩＬを増加させることは、ＩＦＮ－γシグナルを増強した。試験したＴＩＬロットの大部分について、３：１の比は、試験した３つの腫瘍細胞株すべてについて、ＩＦＮ－γについて最大のシグナルを実証した。この研究における最適な播種密度は、およそ２×１０６（ＴＶＣ／ウェルまたは１ウェル当たりの総細胞）であることが見出された。一般に、Ｔｈｐ１は、驚くべきことに、頑強なＩＦＮ－γシグナルを誘導するために、より少ないＴＩＬ細胞及びより低いＴＶＣを必要とする。
野生型と遺伝子修飾Ｔｈｐ１（ＴＨＰ－１とも称される）細胞との比較も行った。遺伝子修飾Ｔｈｐ１細胞は、実施例１９に記載されるように、殺傷アッセイに使用されてもよい。図１６１に示される実験手順を行った。結果は、７つのＴＩＬ株について、ＩＦＮ－γの絶対値（ｐｇ／ｍＬ）については図１６２に示され、ＴＩＬ単独に対する倍率変化については図１６３に示される。結果は、野生型及び遺伝子修飾Ｔｈｐ１が、共培養方法を使用して同様に機能し、ＩＦＮ－γもしくは他のサイトカインを測定するかどうか、または発光による細胞死を測定するかどうかに応じて（本明細書の他の箇所に記載されているか、または当該技術分野で知られている遺伝子修飾を使用して）、ＴＩＬ試料の分析に使用され得ることを示す。
実施例２６：ＨＬＡ遮断抗体を使用した陰性対照
本発明の共培養アッセイはまた、Ｋ５６２細胞の使用、標的細胞の遺伝子ノックアウト、または他の細胞ベースの陰性対照の使用の代わりに、またはそれに加えて、ＨＬＡ遮断抗体を使用する陰性対照によって補充または支持され得る。この実施例は、ＨＬＡ遮断抗体の使用を示す。理論に拘束されることなく、本発明のアッセイにおけるＨＬＡの提案された遮断を図１６４に示す。
この実施例で使用したＨＬＡ－Ｉ遮断抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から取得されたクローンＷ６／３２（抗ＨＬＡ－ＡＢＣ）であり、ｕｌｔｒａ－ｌｅａｆ精製フォーマットである。この実施例で使用したＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）から取得されたクローンＴＵ３９（ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ）であり、アジ化物及び低エンドトキシン（０．０１ＥＵ／μｇ以下（０．００１ｎｇ／μｇ以下））を伴わない機能グレードのフォーマットであり、保存剤を含まない緩衝水溶液中で供給され、０．２μｍ滅菌濾過された。
一般的な実験手順は、以下の通りであった。標的細胞を、ＨＬＡクラスＩ及び／またはクラスＩＩ抗体を加えてプレーティングし、ＴＩＬを添加する前に、少なくとも１～２時間インキュベートした。ＴＩＬ：標的比は、３：１（１．５×１０６ＴＩＬ～５×１０５標的細胞）であるが、初期実験は１：１のＴＩＬ：標的比で行った。各条件は、一般に３回行った。標的細胞を解凍し、ＡＩＭ－Ｖに再懸濁し、ＮＣ２００またはＫ２セルカウンターで計数した。細胞を、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１ｍＬのＡＩＭ－Ｖ培地中、１×１０６で４８ウェル培養プレートに播種した。ＨＬＡ遮断抗体を、以下の段落に記載の濃度（１～２０μｇ／ｍＬの範囲；ストック濃度は１ｍｇ／ｍＬであった）で直ちに添加した。細胞を、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、細胞を収集し、非結合抗体をリン酸緩衝生理食塩水で洗い流した。以下に示すＨＬＡ抗体結合またはアポトーシスについて細胞を染色し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）で分析した。
アッセイ標的細胞の生存率に対するＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体の効果を最初に評価した。固定可能な生／死生存能染料で細胞を染色する追加のステップを用いて、上記のＴｈｐ１及びＵ９３７細胞の培養物に添加したＨＬＡ－Ｉ遮断抗体の結果を図１６５に示す。結果は、生存能の損失がないことを示す。同様に、固定可能な生／死生存能染料で細胞を染色する追加のステップを用いて、上記のＴｈｐ１及びＵ９３７細胞の培養物に添加したＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体の結果を図１６６に示し、生存能の損失がないことも示す。図１６７では、Ｒａｊｉ野生型細胞は、抗ＨＬＡ－ＩＩ抗体の添加及び生／死生存能染色時に生存能の損失を示すことが観察された。しかしながら、ＨＬＡ－Ｉを発現しないＲａｊｉ Ｂ２Ｍ（ベータ－２マイクログロブリン）ノックアウト細胞株（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）は、抗ＨＬＡ－ＩＩ抗体を添加し、生／死生存能染料で染色した場合に同じ効果を示さなかった。
次いで、前述の一般的な手順を使用して、ＴＩＬの生存能に対するＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体の効果を評価した。細胞アポトーシスは、７ＡＡＤ及びアネキシンＶを染色した後、フローサイトメトリーによって検出し、壊死細胞は、７ＡＡＤ＋アネキシンＶ－を介して検出し、後期アポトーシス細胞は、７ＡＡＤ＋アネキシンＶ＋を介して検出し、早期アポトーシス細胞は、７ＡＡＤ－アネキシンＶ＋を介して検出し、生細胞は、７ＡＡＤ－アネキシンＶ－によって検出した。結果を図１６８、１６９、及び１７０に示す。３つの異なるＴＩＬ株について、ＨＬＡクラスＩ及びＩＩ遮断抗体で共培養したＴＩＬにおいて、毒性は観察されなかった。
ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ抗体の濃度を評価するための滴定実験を、１ｍＬ当たり１×１０６ＴＩＬの標的細胞濃度に対して、０～２０μｇ／ｍＬの濃度でＴｈｐ１及びＵ９３７細胞株に対して行った。ＨＬＡ抗体の結合を、表６２の薬剤を使用して、ブロック抗体と同じクローンの蛍光団コンジュゲート抗体で細胞を染色することによって分析した。
Figure 2024512029000068
結果を図１７１に示す。フロー抗体の結合の喪失（平均蛍光強度またはＭＦＩによって報告されるように）は、遮断抗体によって占有される結合部位の量を示す。図１７１の赤い破線は、蛍光から１レベル差し引いたものを示す。
ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体を有するＴＩＬ培養物のＩＦＮ－γ ＥＬＬＡ結果を図１７２に示す。図１７２の上部プロットは、インキュベーションの１８時間後の１×１０６ＴＩＬを有する培養物からの結果を示すが、下部プロットは、インキュベーションの２４時間後の１．５×１０６ＴＩＬからの結果を示す。結果はまた、ＴＩＬ株に対するＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体効果が、５μｇ／ｍＬでより顕著でなかったことを示した。
陰性対照としてＨＬＡ－Ｉ、ＨＬＡ－ＩＩ、または両方の遮断抗体を使用する本発明の効力アッセイのある特定の実施形態を図１７３に示し、このアプローチの結果を、ＩＦＮ－γの絶対値について図１７４～図１７８、及びＴＩＬ単独に対する倍率増強について図１７９～図１８３に示す。陰性対照としてＨＬＡ－Ｉ、ＨＬＡ－ＩＩ、または両方の遮断抗体を使用する本発明の効力アッセイのさらなる実施形態を図１８４に提供し、このアプローチの結果を、ＩＦＮ－γの絶対値について図１８５～図１８９、及びＴＩＬ単独に対する倍率増強について図１９０～図１９４に示す。結果は、陰性対照としてのＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ遮断抗体の有効性を示す。抗ＨＬＡ－Ｉ（Ａ、Ｂ、Ｃ）による遮断は、ＴＩＬ単独＋抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃ抗体対照と同様に、ＴＩＬとＴＨＰ－１またはＵ９３７標的細胞との共培養時にＩＦＮ－γ分泌を停止させ、効力アッセイのための生陰性対照を実証した。抗ＨＬＡ－ＩＩ（ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ）での処理もまた、Ｕ９３７及びＴＨＰ－１標的細胞からのＩＦＮ－γ分泌の低減をもたらした。抗ＨＬＡ－Ｉ処理単独（１０μｇ／ｍＬで）は、Ｕ９３７及びＴＨＰ－１標的細胞によるＴＩＬの誘導活性化を下方調節するのに十分であるが、抗ＨＬＡ－ＩＩの添加もまた、陰性対照として良好に機能する。ＣＤ４＋／ＣＤ８＋比は、評価されたＴＩＬ株において可変であった（図１８５～図１９４の図の説明を参照）。ＴＩＬに対するＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ遮断の効果は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＩＬの比率とは無関係であった。ＨＬＡ遮断抗体の添加は、ＴＩＬ試料に対してわずかな毒性を有し、培養物中でＴＩＬ単独の有害な活性化を引き起こさなかった。Ｒａｊｉ Ｂ２Ｍ細胞は、単独で、またはＨＬＡ－ＩＩ抗体遮断剤と組み合わせても、有用な陰性対照として機能する。
陰性対照としてのＨＬＡ遮断（クラスＩ及びＩＩ）の効力、ならびにＴＣＲ複合体を介したＴＩＬのＭＨＣ－ペプチド活性化に対する本明細書に記載の効力アッセイの驚くべき特異性を、１５個の黒色腫ＴＩＬ細胞株においてさらに評価した。図１９５は、抗ＨＬＡ－Ｉ、抗ＨＬＡ－ＩＩ、または両方の遮断抗体を陰性対照として使用する、本発明の効力アッセイのさらなる実施形態を示す。腫瘍細胞株を、＋／－１０μｇ／ｍＬのＨＬＡクラスＩ（抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃ）及び／または＋／－５μｇ／ｍＬのＨＬＡクラスＩＩ（抗ＨＬＡ ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ）遮断抗体で１～２時間前処理した。Ｇｅｎ２プロセスを使用して産生された１５個の黒色腫ＴＩＬ株をすべて、２×１０６ＴＶＣで３：１のＴＩＬ：標的比で非照射Ｒａｊｉ、Ｒａｊｉ β２Ｍ ＫＯ、ＴＨＰ－１、及びＵ９３７腫瘍細胞と２４時間共培養した。
結果を、Ｕ９３７については図１９６に、Ｔｈｐ１については図１９７に要約する。抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃ抗体による遮断は、（ＴＩＬ単独＋抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃ抗体対照と同様に）ＴＩＬとＴＨＰ－１またはＵ９３７との共培養時にＩＦＮ－γ分泌を停止させた。抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃでの処理単独（１０μｇ／ｍＬで）は、Ｕ９３７及びＴＨＰ－１により誘導されるＴＩＬの活性化を停止するのに十分であることが見出された。抗ＨＬＡ ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ抗体（５μｇ／ｍＬ）での処理は、抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃによる遮断の程度ではないが、ＴＨＰ－１細胞におけるＩＦＮ－γ分泌の低減；及び抗ＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃによる遮断と同様の、Ｕ９３７細胞におけるＩＦＮ－γ分泌の完全な遮断をもたらした。ＣＤ４＋／ＣＤ８＋比は、評価されたＴＩＬ株において可変であった。ＨＬＡクラスＩ及びＩＩ遮断の効果は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞の比とは無関係であり、同種異系腫瘍細胞株との共培養時のＴＩＬの活性化がＨＬＡ制限されていないことを示している。ＨＬＡ遮断によるＩＦＮγ分泌の停止は、ＴＩＬの非自己腫瘍細胞株誘導活性化が、ＴＣＲ－ＨＬＡエンゲージメントを介して直接媒介されることを実証した。
実施例２７：単球細胞株アッセイデータの平行線分析
この実施例では、平行線分析の使用は、本発明の実施形態であるいくつかのアッセイ及びアッセイ条件について実証される。この研究では、６つの黒色腫ＴＩＬロットを使用した：Ｍ１１５０Ａ、Ｍ１１６４、Ｍ１１７４、Ｍ１１６３、Ｍ１１６９、及びＭ１２１８。各ＴＩＬロットの７つの濃度（２×１０６または２ｅ６、１．５×１０６または１．５ｅ６、１×１０６または１ｅ６、５×１０５または５ｅ５、２．５×１０５または２．５ｅ５、１．２５×１０５または１．２５ｅ５、及び６．２５×１０４または６．２５ｅ４）を、２つの標的（Ｕ９３７及びＴｈｐ１細胞）の各々について、７つの標的濃度（１ｅ６、５ｅ５、２．５ｅ５、１．２５ｅ５、６．２５ｅ４、３．１３×１０４または３．１３ｅ４、１．５６×１０４または１．５６ｅ４）に対して試験した。アッセイ方法のための最良のＴＩＬ濃度を決定するために統計分析を行った。４つのパラメータロジスティック（４ＰＬ）分析を使用して、Ｈｉｌｌｓ勾配、範囲、及びＥＣ５０を決定した。平行線分析（ＰＬＡ）を回帰（線形性）に使用した。
ＰＬＡ方法の詳細は、ＵＳＰ Ｃｈａｐｔｅｒ＜１０３２＞Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ．ＵＳＰ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ：Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０１３、ＵＳＰ Ｃｈａｐｔｅｒ＜１１１＞Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ．ＵＳ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ：Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０１４、ＵＳＰ Ｃｈａｐｔｅｒ＜１０３３＞Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．ＵＳＰ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ：Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０１３、ＵＳＰ Ｃｈａｐｔｅｒ＜１０３４＞Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ．ＵＳ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ：Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０１３、Ｈａｕｃｋ，ｅｔ ａｌ．，ＰＤＡ Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，５９（２），１２７－１３７、Ｃａｌｌａｈａｎ ａｎｄ Ｓａｊｊａｄｉ，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｊ．２００３，２（２），７１－７７、Ｆｉｎｄｌａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．２０００，２１，１２４９－１２７３、及びＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ ａｎｄ Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．Ｓｔａｔ．２００５，１５（３），４３７－４６３を含む文献に見出すことができ、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
２つの標的細胞株（Ｕ９３７及びＴｈｐ１）のＴＩＬ製品の刺激のための条件を決定するために、２つの非限定的な因子を考慮した。（ｉ）用量曲線の線形部分上の最大数の濃度での再現性及び直線性、ならびに（ｉｉ）潜在的に、最良のシグナル対ノイズをもたらし得る、ＩＦＮ－γの最大シグナル。Ｔｈｐ１（図１９８）及びＵ９３７（図１９９）の有効ＴＩＬ濃度の関数として、ＩＦＮ－γを測定した。標的濃度と相関するシグナルの顕著な低下が、６つのＴＩＬロットすべてについて見られた。１．５×１０６及び２．０×１０６ＴＩＬ濃度のみが、線形範囲内の標的細胞濃度の４つの（４）濃度を超える用量反応を示した。Ｕ９３７は、Ｔｈｐ１よりも高いＩＦＮ－γシグナル及びより大きなシグナル対ノイズを示した。
図２００及び図２０１は、アッセイを使用した６つの黒色腫ＴＩＬ株の用量反応曲線を示す。１．５×１０６または２．０×１０６のＴＩＬ濃度は、アッセイ方法で使用するための許容できる結果を提供する。これにより、シグナルが増加し、シグナル対ノイズが改善され、線形線量曲線上の標的濃度が増加する。図２０２は、１．５×１０６細胞のＴＩＬ濃度でＵ９３７標的細胞を使用した６つのＴＩＬロットの平行線分析を示す。６つのＴＩＬはすべて、この標的細胞株で明確な用量反応を示すことが見られる。図２０３では、ＴＩＬ Ｍ１１７３及びＴＩＬ Ｍ１２１３のみが明確な用量反応を示す、同じ条件下での同じ６つのＴＩＬロットの平行線分析を、Ｔｈｐ１標的細胞を使用して示す。図２０４及び２０５は、遮断抗体が、抗ＨＬＡ－Ｉ（１０μｇ／ｍＬ）及び抗ＨＬＡ－ＩＩ（５μｇ／ｍＬ）による６つのＴＩＬロットにわたるＵ９３７細胞とのアッセイ特異性を実証することを示す。驚くべきことに、Ｕ９３７細胞株は、Ｔｈｐ１細胞株よりも優れた性能を示した。所与の標的濃度について、Ｕ９３７細胞は、アッセイ方法のこの実施形態において、Ｔｈｐ１細胞よりも大きなＩＦＮ－γシグナルを提供する。Ｕ９３７細胞はまた、用量反応曲線の線形部分でより多くの濃度を提供した。４点用量曲線は、曲線ごとに１つの外れ値を除去するオプション及び曲線飽和のためのマスク（これは、最終分析に必要な曲線上の少なくとも３つの点を提供する）を伴う線形適合で使用されてもよい。外れ値のスクリーニング及び除去ならびに曲線飽和度のマスキングは、ＵＳＰ Ｃｈａｐｔｅｒ＜１０３２＞Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ，ＵＳ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ：Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０１３（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載の通り行われるように行うことができる。さらに、Ｔｈｐ１細胞で試験したＴＩＬロットは、ほとんどのＴＩＬロットで線形であるために、より低い濃度でのマスキングを必要としたが、Ｕ９３７細胞はこの要件を有していなかった。上部漸近線は、必ずしもＴｈｐ１細胞で解消されたわけではなく、したがって、Ｔｈｐ１細胞で試験したＴＩＬロットにわたって上限範囲が定義されない場合がある。
実施例２８：効力及び同一性アッセイマトリックス
この実施例では、効力及び同一性アッセイマトリックスの使用が実証される。効力及び同一性アッセイマトリックスは、ＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、及びＰＢＬ製品の放出及び安定性試験に使用され得、マトリックスの構成要素として本明細書に記載の効力アッセイを含むことができる。例示的かつ非限定的なアッセイマトリックスが表６３に示され、これはまた、本発明の実施形態であり、マトリックスのメンバーを除去または追加するように修飾され得る。アッセイは、適切な場合及び／または必要に応じて、精度、正確性、特異性及び線形性について適格性確認される。
Figure 2024512029000069
Figure 2024512029000070
本明細書に記載される、例えば、実施例１４～２７に記載される同種異系共培養アッセイは、ＴＣＲ－ＨＬＡ相互作用を評価するために使用される。表６３に示されるマトリックスは、Ｕ９３７またはＴｈｐ１細胞を、陽性対照に対する相対効力及び本明細書の実施例２７及び他の箇所に記載される平行線分析方法と併せて使用する一例を提示する。ＨＬＡ遮断抗体を使用する陰性対照を使用して、適格性確認中のＴＣＲ－ＨＬＡ相互作用に対する特異性を実証し、本明細書に記載される陽性対照参照標準に対する相対効力尺度の代替としてルーチン試験中に使用してもよい。この目的のためにバンクされ、特徴付けられた既知のＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬ細胞株（複数可）を使用して、陽性対照を調製する。
例えば、Ｕ９３７共培養アッセイを使用して、以下の手順を使用した。Ｕ９３７細胞をＡＴＣＣから調達し、２層のＧＭＰセルバンク（ＭＣＢ、２５０バイアル、及びＷＣＢ、５００バイアル）を作製するために使用した。ＷＣＢは、バイオアッセイのための使用準備済みの（ＲＴＵ）ＧＭＰ非産生バンクとして製造され、バイアルから直接解凍された細胞がアッセイで使用され、それによって、細胞拡張の必要性及び汚染または変動の関連するリスクを排除した。ＭＣＢを、生細胞数、生存率％、同一性、無菌性、マイコプラズマ、及びインビトロでの不定の作用物質について試験した。ＷＣＢを、生細胞数、生存率％、無菌性、マイコプラズマ、及びインビトロでの不定の作用物質について試験した。ＭＣＢ及びＷＣＢを、堅牢性の適格性確認パラメータ内の共培養効力アッセイへの継代依存的な影響について評価したところ、著しい差はないことが判明した。陽性対照ＴＩＬロットは、臨床ＴＩＬ製品に使用されるのと同じＧｅｎ２製造プロセスを使用してＧＭＰの下で製造され、参照標準としても使用される。製剤化後、参照標準のための医薬品の全体がバイアルに充填され、次いで、臨床ＴＩＬ医薬品製造に使用されるのと同じ装置及びプログラムを使用して、制御された速度で凍結される。バイアルを気相液体窒素中で凍結保存する。代表的なバイアルは、無菌性、マイコプラズマ、細胞計数、生存率、同一性、及び効力を含むいくつかの属性について試験され、参照標準として使用するためにＴＩＬロットを適格性確認する。適格性確認されると、参照標準の単回使用バイアル（複数可）を解凍し、各アッセイの被験試料とともに試験する。アッセイは、ＴＩＬ製品ロットを、１ウェル当たり１．５×１０６ＴＩＬの定義された設定値で参照標準ＴＩＬロットとの相対効力について評価して、Ｕ９３７細胞の４つの用量濃度（１ウェル当たり４×１０５、２×１０５、１×１０５、及び０．５×１０５細胞；各用量濃度で３回行う）で２４時間共培養することに信頼性があり、用量依存的に応答する。各Ｕ９３７用量濃度で各複製物から上清に放出されたＩＦＮ－γの濃度を測定する。ＥＬＬＡシステム（本明細書の他の箇所に記載される）を使用して、ＴＩＬ製品及びＵ９３７の共培養アッセイの活性化後のＩＦＮ－γ濃度を測定した。Ｓｉｍｐｌｅ Ｐｌｅｘ ７２ウェルＩＦＮ－γ ３ｒｄ Ｇｅｎ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５カートリッジ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｅ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手可能、カタログ番号＃ＳＰＣＫＢ－ＣＳ－００２６９７）を使用する。分泌ＩＦＮ－γの後続の測定のための培地の培養及び保管は、共培養の直前に行う。上清を３つの複製９６ウェルプレートに移し、６０℃未満で保管する。次いで、プレートを解凍し、ＩＦＮ－γについて測定する。共培養から収集された上清を、各７２ウェルの商業的に検証されたカートリッジでＩＦＮ－γ産生についてスクリーニングする。データ分析は、ＵＳＰ＜１０３２＞，ＵＳＰ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ：Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０１３に従って行う。データを、ＵＳＰ＜１０３２＞及びＵＳＰ＜１０３３＞Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，ＵＳＰ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ：Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０１３に従ってログ変換して、効力範囲にわたる測定値の対称性、正規分布、及び変動性の均質性の要件を満たす。外れ値は、ＵＳＰ＜１０３４＞Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ，ＵＳＰ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ：Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０１３に記載されるように評価し、分析から省く。線形回帰は、曲線の飽和に起因する最も高い濃度または最も低い濃度のいずれかのマスキング（必要であれば）を用いて、４点用量曲線にわたって行う。ＵＳＰ＜１０３２＞に従って、「少なくとも３つ、好ましくは４つの隣接する［用量－］濃度を使用し、線形セグメントの勾配が十分に急いでいることを要求し、標準試料及び試験試料に適合する線が直線であり、線が平行であることを要求する」ことが推奨される。平行線分析は、ＵＳＰ＜１０３２＞に従って、ＴＩＬ被験試料とＲＳの間で行う。平行度によって測定された参照標準とＴＩＬ被験試料との間の統計的類似性は、ＴＩＬ被験試料の参照標準に対する生物学的類似性を実証する。平行度勾配比、線形性比、回帰（Ｒ２）及び二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）を計算し、報告する。平行度及び線形性のアッセイの適合性及び妥当性は、ＵＳＰ＜１０３３＞による制限内で、妥当性基準を「合格」または「不合格」とするようにランク付けされ、決定される。耐性のパーセントの範囲としての９５％信頼区間内の相対効力は、「報告可能」または「決定的でない」として決定される。ＵＳＰ＜１０３２＞によれば、相対効力は、絶対値から導出される効力よりも好ましい場合があり、なぜなら、生体試料に固有の変動性及び細胞挙動の影響を時間の経過とともに無効にするキャリブレーターであるからである。最後に、予測されるＩＦＮ－γ濃度を、各Ｕ９３７細胞密度で報告する。Ｕ９３７細胞との共培養におけるＴＩＬによって産生された絶対ＩＦＮ－γ濃度の、ＴＩＬ単独（刺激されていない）に対する倍率増加を、各ＴＩＬロットの代替または追加の報告可能な値として使用するために評価する。分析は、ＪＭＰ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＬＬＣ（Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）のＪＭＰソフトウェアを使用して、好適な検証で行われる。本発明の追加のアッセイの詳細及び実施形態もまた、表６４に提供される。
Figure 2024512029000071
表６３に示されるマトリックスはまた、抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１３７抗体でコーティングされたビーズによる活性化に応答してＴＩＬによって分泌されたＩＦＮ－γの測定を使用した直交活性化アッセイを含む。ＴＩＬ製品がこれらのビーズに曝露されると、抗体は、ＣＤ３シグナル伝達複合体に含まれるＣＤ３εと、Ｔ細胞共刺激受容体、ＣＤ２８及びＣＤ１３７とに結合する。抗ＣＤ３分裂促進因子抗体ＯＫＴ３によるＴＩＬの刺激を使用して、Ｂｏｒｏｖｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７，２１５２９－３６（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ＴＩＬ製品の機能性を評価する。抗ＣＤ２８活性は、インビトロＴ細胞増殖及びサイトカイン産生を増強することが知られている。ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）は、腫瘍壊死因子ファミリーのメンバーである。アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体は、エフェクターＴ細胞及びメモリーＴ細胞にとって特に重要な活性化共刺激分子として機能し、Ｔリンパ球の生存及び増殖を促進する。したがって、ビーズベースのＩＦＮ－γアッセイの設計は、抗原特異的Ｔ細胞の生理学的再刺激及び拡張に関与する３つの活性化シグナルを利用することによって、専門抗原提示細胞によるインビボＴ細胞活性化に応答してＴＩＬ細胞の生物学的活性を模倣することを意図している。
総生細胞及び生細胞パーセンテージも表６３に含まれる。総生細胞数は、文献中のＴＩＬ製品注入に対する客観的腫瘍応答と相関するパラメータである。Ｓｅｉｔｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０２１，２７，５２８９－９８。細胞生存率は、総生細胞数に固有のパラメータである。生存能を維持または回復する細胞の能力は、ＴＩＬ機能のために必要な前提条件であり、したがって、細胞生存能の実証は、活性の追加の尺度として機能する。ＴＩＬ製品の性能に対するこれらのパラメータの重要性は、前臨床研究、ならびにこれまでに数百人の転移性黒色腫を有する患者を登録した研究におけるＴＩＬ療法の実質的な臨床経験によって支持されている。研究者らは、客観的腫瘍応答率と投与された総生細胞との間の統計的に有意な正の相関を報告しているが、これらの研究では、応答者と非応答者との間の総細胞数分布に実質的な重複が残っていた。Ｓｅｉｔｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０２１，２７，５２８９－９８、Ｇｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１６，３４，２３８９－９７。総生細胞数及び生存率パーセンテージの例示的な結果を表６５に示す。
Figure 2024512029000072
表６３のマトリックスにおける系統マーカーは、フローサイトメトリー及びセルカウンターによって測定される、生ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞集団の合計、ＣＤ４＋細胞のパーセンテージ、及びＣＤ８＋細胞のパーセンテージを含む。ＴＩＬは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含むリンパ球の混合物で構成される。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＴＩＬ製品中に可変の割合で存在し、両方の細胞系統が抗腫瘍免疫応答に寄与するように見える。Ｔｏｐａｌｉａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８７，１０２，１２７－４１、Ａｎｄｅｒｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６，２２，３７３４－４５、Ｇｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１６，３４，２３８９－９７。ＣＤ８＋Ｔ細胞は腫瘍退縮に関連しているが、ＣＤ４＋Ｔ細胞は免疫系の機能に重要であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及びＩＦＮ－γ分泌を増強することによってＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を増強する。Ｓｈｅｄｌｏｃｋ ａｎｄ Ｓｈｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，３００，３３７－９、Ｓｕｎ ａｎｄ Ｂｅｖａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，３００，３３９－４２。Ｓｅｉｔｔｅｒらは、これまでに数百人の転移性黒色腫を有する患者を登録したＴＩＬ療法の研究からの統合データを分析し、客観的腫瘍奏効率と投与された総生ＣＤ８＋細胞との間の統計的に有意な正の相関、ならびに応答者と非応答者との間の総細胞数分布における実質的な重複を示した。Ｓｅｉｔｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０２１，２７，５２８９－９８。理論に拘束されることなく、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を有するＴＩＬ製品は、養子細胞療法のための最も好ましい製品であり得、臨床的有効性を有する可能性が最も高いものであり得る。臨床黒色腫ＴＩＬロットのＣＤ４＋及びＣＤ８＋発現の例示的な結果を表６６に示す。
Figure 2024512029000073
表６３はまた、フローサイトメトリー及びセルカウンターによって測定される、いくつかのメモリーマーカー、生セントラルメモリー（ＴＣＭ）及びエフェクターメモリー（ＴＥＭ）細胞集団の合計、ＴＣＭ細胞のパーセンテージ、ならびにＴＥＭ細胞のパーセンテージを含む。メモリーＴ細胞は、トラフィックパターン、機能容量、及び系統関係によって異なる複数のサブセットとして存在する。Ｆａｒｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４，１４，２４－３５、Ｓａｌｌｕｓｔｏ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，２２，７４５－６３。主なサブセットには、リンパ組織への輸送能力を保持するＴＣＭ細胞、及び末梢組織部位に移行するＴＥＭ細胞が含まれる。両方のサブセットは、エフェクター容量を有する。ＴＥＭ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７－として定義され、ＴＣＭ細胞は、フローサイトメトリーによって、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７＋として定義される。ＴＩＬ製品中の細胞の大部分は、高レベルの機能性と一致するエフェクターメモリーＴ細胞表現型を有する。Ｇｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１６，３４，２３８９－９７。同様に、ＴＥＭ細胞は、２２日プロセス中の効率的な拡張のため、２２日目の試料でＧｅｎ２プロセスによって産生されたＴＩＬ試料中で優勢な集団であることが多い。臨床黒色腫ＴＩＬロット中のＴＥＭ及びＴＣＭ含有量の例示的な結果を表６７に示す。
Figure 2024512029000074
ＬＡＧ３発現を有する細胞のパーセンテージはまた、最終ＴＩＬ製品中の疲弊、したがって効力のマーカーとして表６３のマトリックスに含まれる。ＬＡＧ３発現は、フローサイトメトリーによって測定される。ＬＡＧ３レベルは、一般に、例えば、Ｇｅｎ２プロセスによって上方調節される。この上方調節は、Ｔ細胞活性化及びエフェクター機能に関連しており、ＬＡＧ３がモニタリングのための感受性及び代表的な疲弊マーカーである可能性が高いことを示している。Ａｎｎｕｎｚｉａｔｏ，ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９６，１０，７６９－７６。臨床黒色腫ＴＩＬロットの例示的な統計を表６８に示す。
Figure 2024512029000075
これらの臨床データセットにわたるＬＡＧ３発現のヒストグラムを図２０６に示す。
ＫＬＲＧ１発現を有する細胞のパーセンテージはまた、最終ｌｉｆｉｌｅｕｃｅｌ製品中の分化、したがって効力のマーカーとして表６３のマトリックスに含まれる。ＫＬＲＧ１発現は、フローサイトメトリーによって測定される。ＫＬＲＧ１は、Ｔ細胞の末端分化及び老化のマーカーであり、これは、メモリーＴ細胞の分化時に下方調節されることが示された。Ｈｅｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００９，１１３，６６１９－２８、Ｈｅｒｎｄｌｅｒ－Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１８，４８，７１６－７２９。臨床黒色腫ＴＩＬロットの例示的な統計を表６９に示す。
Figure 2024512029000076
臨床データセットにわたるＫＬＲＧ１発現のヒストグラムを図２０７に示す。
ＣＤ１４＋／ＣＤ１９＋／ＣＤ１６＋／ＣＤ５６＋フローサイトメトリーアッセイは、ＮＫ、ＮＫＴ、Ｂ細胞、及び単球を検出するために、表６３に示されるＣＤ１６＋／ＣＤ５６＋アッセイに置き換えてもよい。
本明細書に記載され、表６３のマトリックスに組み込まれるＵ９３７共培養は、上記のように臨床黒色腫ＴＩＬロットの相対効力を評価するために使用され得る。結果を表７０に示し、いくつかのロットが用量依存性反応を示さないことが観察され、潜在的な効力の損失を示す。
Figure 2024512029000077
表７０の結果を、対数正規分布が観察されるヒストグラムとして図２０８にプロットする。
ＣＤ１０１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ６９＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＳＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭＲＡ細胞含有量についてのアッセイ、Ｔｒｅｇ細胞含有量についてのアッセイ、ＰＤ－１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＭ３＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２５＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２７＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ５６＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＴＬＡ－４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＧＩＴ＋細胞含有量についてのアッセイ、及び／またはＣＤ５７＋細胞含有量についてのアッセイを含む、追加のマーカー及び対応するフローサイトメトリーアッセイを利用してもよい。Ｇｅｎ２製造プロセス中のＴＩＬ製品の再活性化におけるある特定のマーカーの統計的有意性は、Ｓｉｍｐｓｏｎ－Ａｂｅｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２０２０，３１，Ｓ７２０、及びＳｉｍｐｓｏｎ－Ａｂｅｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｏｖａｎｃｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ－２ Ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ（ＴＩＬ）Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｓ Ｒｅｉｎｖｉｇｏｒａｔｅｄ Ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓ ＥＳＭＯ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｓｅｐｔ．１９－２１，２０２０，ｐｏｓｔｅｒ １０５３Ｐ（各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
実施例２９：Ｕ９３７細胞を使用したＴＩＬ製品の拡張
照射されたＵ９３７細胞は、Ｇｅｎ２プロセスまたは同様のプロセスのＲＥＰ段階（またはＧｅｎ３もしくは同様のプロセスの活性化段階、または遺伝子編集されたＴＩＬプロセス及び選択されたＴＩＬプロセスにおける同様の段階）のための人工抗原プロセシング細胞（ａＡＰＣ）として使用され得る。３つの黒色腫ＲＥＰ前ＴＩＬロットを解凍し、本明細書の他の箇所（例えば、実施例６）に記載の手順を使用して、１１日間、照射されたＵ９３７細胞または抗ＣＤ３（ＯＫＴ－３）を有する同種異系ＰＢＭＣフィーダー細胞（３人のドナー）とインキュベートし、拡張について評価した。結果を、図２０９に示す。Ｕ９３７細胞は、ＴＩＬ細胞の拡張を誘導することができる。ＣＤ３及びＣＤ２８への刺激ビーズ後、ＴＩＬは、図２１０に示されるように、応答してＩＦＮ－γを分泌し、それらが活性化することができることを示した。Ｕ９３７細胞をａＡＰＣとして使用することは、ＴＣＲレパートリー分析によって（例えば、固有のＣＤＲ３ドメインについて）評価されるように、低頻度ＴＣＲクローンの成長または保存をサポートし得る。本発明のいくつかの実施形態では、Ｇｅｎ２、Ｇｅｎ３、または本明細書に記載の他のプロセスを使用してＵ９３７ ａＡＰＣ（遺伝子修飾されたＵ９３７ ａＡＰＣを含む）を使用することによって拡張されたＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬは、低頻度ＴＣＲクローンの増加した成長または保存を示し得る。
＊＊＊
上記の実施例は、当業者に対して、本発明の組成物、プロセス、アッセイ、システム及び方法の実施形態の作製方法及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために提示されており、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定することを意図しない。当業者に明らかな、本発明を実施するための上記のモードの修正は、添付の特許請求の範囲内にあることを意図している。本明細書で言及するすべての特許、特許出願、及び刊行物は、本発明が属する分野の当業者のスキルレベルを示す。
すべての見出し及びセクションの指定は、明確化及び参照の目的のみのために使用されており、いかなる方法でも限定するものとしてみなされない。例えば、当業者は、本明細書に記載の本発明の趣旨及び範囲に従って異なる見出し及びセクションから様々な態様を適宜組み合わせることの有用性を理解する。
本明細書で引用されたすべての参考文献は、各個々の刊行物または特許もしくは特許出願がすべての目的のためにその全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度にすべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
当業者に明らかであるように、本出願の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本出願の多くの修正及び変形が加えられてもよい。本明細書に記載の特定の実施形態及び実施例はほんの一例として提供されており、本出願は、特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲に加えて、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。

Claims (58)

  1. ＴＩＬの効力を決定する方法であって、
    ａ．ＴＩＬ細胞との標的細胞の共培養を、第１の期間行うステップと、
    ｂ．前記共培養から採取物を取得するか、または上清を抽出するステップと、
    ｃ．（１）前記採取物を、前記ＴＩＬ細胞上の１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）前記上清を、前記ＴＩＬ細胞から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得し、前記ＴＩＬの効力を決定するステップと、を含む、前記方法。
  2. 前記方法が、
    ｄ．（ｉ）前記標的細胞との陰性対照細胞、または（ｉｉ）前記ＴＩＬ細胞及び前記標的細胞とのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遮断抗体を含む、陰性対照の第２の共培養を、第２の期間（かかる第２の期間は、任意選択で、前記第１の期間と同時に起こる）行う追加のステップと、
    ｅ．前記第２の共培養から第２の採取物を取得するか、または第２の上清を抽出する追加のステップと、
    ｆ．（１）前記第２の採取物を、前記ＴＩＬ細胞上の前記１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）前記第２の上清を、前記ＴＩＬ細胞から分泌された前記１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得する追加のステップと、
    ｇ．ステップｃからの前記１つ以上の観測値をステップｆからの前記１つ以上の対照値と比較して、前記ＴＩＬの効力を決定する追加のステップであって、各観測値または観測値のセットが、対応する対照値または対照値のセットと比較される、前記ＴＩＬの前記効力を前記決定する追加のステップと、を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＴＩＬが、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）製品、骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）製品、または末梢血リンパ球（ＰＢＬ）製品からなる群から選択され、前記方法が、任意選択で、凍結保存されたＴＩＬ製品、ＭＩＬ製品、またはＰＢＬ製品を解凍するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ＴＩＬが、ヒト由来のＴＩＬ製品であり、前記ＴＩＬ製品が、腫瘍の切除または腫瘍の断片化もしくは消化によって取得され、急速な拡張プロトコルステップを含むＴＩＬ拡張プロセスによって製造される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. ヒト患者の治療に使用するための前記ＴＩＬを放出するステップをさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記標的細胞が、単球細胞、Ｂリンパ芽腫細胞、バーキットリンパ腫細胞、Ｒａｊｉ細胞、Ｔｈｐ１細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｕ９３７細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、及びそれらの誘導体、バリアント、修飾、または子孫、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され、かかる標的細胞またはそれらの組み合わせが、任意選択で照射され、前記標的細胞またはそれらの組み合わせが、任意選択で前記ＴＩＬ製品、前記ＭＩＬ製品、または前記ＰＢＬ製品に対してアロ反応性である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記陰性対照細胞が、ＭＨＣまたはＨＬＡクラスＩ及びＭＨＣまたはＨＬＡクラスＩＩ発現を欠いている、請求項２～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記陰性対照細胞が、Ｋ５６２細胞またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、かかる陰性対照細胞が、任意選択で照射される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ＴＩＬ製品細胞の数と前記標的細胞の数との間の比が、５：１～１：５であり、前記ＴＩＬ製品細胞の数と前記陰性対照細胞の数との間の比が、５：１～１：５である、請求項２～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記ＴＩＬ製品細胞の数と前記陰性対照細胞の数との間の比が、１：２～１：４であり、前記ＴＩＬ製品細胞の数と前記陰性対照細胞の数との間の比が、１：２～１：４である、請求項２～８のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記第１の期間が、約６時間～約４８時間である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記第２の期間が、約６時間～約４８時間である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記第１の期間が、約１２時間、約１８時間、及び約２４時間からなる群から選択される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記第２の期間が、約１２時間、約１８時間、及び約２４時間からなる群から選択される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記ＴＩＬ上の前記１つ以上のマーカーが、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０、ＫＬＲＧ１、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記ＴＩＬから分泌された前記１つ以上の分析物が、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、パーフォリン、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２２、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＭＩＰ－１β、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記ＴＩＬ製品から分泌された前記１つ以上の分析物が、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、パーフォリン、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２２、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＭＩＰ－１β、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記観測値の量が、前記１つ以上の分析物の各々について前記対照値の量に対して正規化され、前記１つ以上の分析物の各々について前記対照値を上回る観測値の増加が、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、及び少なくとも５倍からなる群から選択される、請求項４～１５のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記ＴＩＬ製品が、外科的切除、針生検、コア生検、小生検、またはヒト患者からの腫瘍細胞とＴＩＬ細胞との混合物を含有する試料を取得するための他の手段によって取得された腫瘍から製造される、請求項４～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. がんの治療を必要とする患者において腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団でそれを治療する方法であって、
    （ａ）外科的切除、針生検、コア生検、小生検、または前記患者から取得された腫瘍試料を（ｉ）複数の腫瘍断片もしくは（ｉｉ）腫瘍消化物に処理することによる他の手段によって前記患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得及び／または受容するステップと、
    （ｂ）前記第１のＴＩＬ集団を閉鎖系に付加するステップと、
    （ｃ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生するステップであって、前記第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、前記第１の拡張が、約３～１４日間行われて、前記第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、前記系を開くことなく起こる、前記第２のＴＩＬ集団を産生するステップと、
    （ｄ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地を追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生するステップであって、前記第２の拡張が、約７～１４日間行われて、前記第３のＴＩＬ集団を取得し、前記第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、前記第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行が、前記系を開くことなく起こる、前記第３のＴＩＬ集団を産生するステップと、
    （ｅ）ステップ（ｄ）から取得された前記治療的ＴＩＬ集団を採取するステップであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、前記系を開くことなく起こる、前記採取するステップと、
    （ｆ）ステップ（ｅ）からの前記治療的ＴＩＬ集団を注入バッグに移すステップであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行が、前記系を開くことなく起こる、前記移すステップと、
    （ｇ）任意選択で、ステップ（ｆ）からの前記治療的ＴＩＬ集団を含む前記注入バッグを凍結保存するステップと、
    （ｈ）前記治療的ＴＩＬ集団の効力を決定するステップであって、
    ｉ．前記治療的ＴＩＬ集団を含む前記注入バッグが、任意選択で、ステップ（ｇ）において凍結保存された場合、任意選択で、前記治療的ＴＩＬ集団を含む前記注入バッグを解凍することと、
    ｉｉ．前記治療的ＴＩＬ集団の部分との標的細胞の共培養を、第１の期間行うことと、
    ｉｉｉ．前記共培養から採取物または上清を取得することと、
    ｉｖ．（１）前記採取物を、前記治療的ＴＩＬ集団の前記部分上の１つ以上のマーカーの発現について、または（２）前記上清を、前記治療的ＴＩＬ集団の前記部分から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の観測値を取得して、前記治療的ＴＩＬ集団の前記効力を決定することと、
    ｖ．（ｉ）前記治療的ＴＩＬ集団の前記部分との陰性対照細胞、または（ｉｉ）前記治療的ＴＩＬ集団の第２の部分及び前記標的細胞とのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遮断抗体の、第２の共培養を、第２の期間行うことと、
    ｖｉ．前記第２の共培養から第２の採取物または第２の上清を取得することと、
    ｖｉｉ．（１）前記第２の採取物を、前記治療的ＴＩＬ集団の前記第２の部分上の前記１つ以上のマーカーの発現について評価するか、または（２）前記第２の上清を、前記治療的ＴＩＬ集団の前記第２の部分から分泌された１つ以上の分析物について評価して、１つ以上の対照値を取得することと、
    ｖｉｉｉ．前記１つ以上の観測値を前記１つ以上の対照値と比較して、前記治療的ＴＩＬ集団の前記効力を決定することであって、各観測値が、その対応する対照値と比較される、前記治療的ＴＩＬ集団の前記効力を前記決定することと、を含む、前記治療的ＴＩＬ集団の前記効力を前記決定するステップと、
    （ｉ）前記治療的ＴＩＬ集団が有効であると決定された場合、治療上有効な投与量の前記治療的ＴＩＬ集団を、ステップ（ｆ）または（ｇ）の前記注入バッグから前記患者に投与するステップと、を含む、前記方法。
  20. 採取された前記ＴＩＬの前記効力及び／または機能性を調べることが、凍結保存後に、または任意選択で凍結保存ステップの前後に行われる、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記患者が、切除不能、転移性、耐性、またはＣＴＬＡ－４阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、もしくはＰＤ－Ｌ１阻害剤に対して不応性である腫瘍を有し、任意選択で、前記患者が、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、またはＰＤ－Ｌ１阻害剤で以前に治療されている、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. ステップ（ｃ）における前記第２のＴＩＬ集団が、前記第１のＴＩＬ集団よりも数が少なくとも５０倍多い、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記第１の拡張が、約１０～約１２日の期間にわたって行われる、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記第２の拡張が、約１０～約１２日の期間にわたって行われる、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記第１の拡張が、約１１日の期間にわたって行われる、請求項１９～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記第２の拡張が、約１１日の期間にわたって行われる、請求項１９～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記ＩＬ－２が、前記第１の拡張において、前記細胞培養培地中に１０００ＩＵ／ｍＬ～６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在する、請求項１９～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記第２の拡張ステップにおいて、前記ＩＬ－２が、１０００ＩＵ／ｍＬ～６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、前記ＯＫＴ－３抗体が、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する、請求項１９～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記ＴＩＬを前記患者に投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンで前記患者を治療するステップをさらに含む、請求項１９～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与するステップを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で、及びフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で３日間投与するステップを含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記患者への前記治療的ＴＩＬ集団の投与の翌日に開始するＩＬ－２レジメンで前記患者を治療するステップをさらに含む、請求項１９～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記患者への前記治療的ＴＩＬ集団の投与と同日に開始するＩＬ－２レジメンで前記患者を治療するステップをさらに含む、請求項１９～３１のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記ＩＬ－２レジメンが、前記患者への前記治療的ＴＩＬ集団の投与の完了の約３～約２４時間後に投与される、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ＩＬ－２レジメンが、許容範囲まで８時間毎に１５分間のボーラス静脈内注入として投与される、６００，０００もしくは７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキン、またはそのバイオシミラーもしくはバリアントを含む高用量ＩＬ－２レジメンである、請求項３３～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. ステップ（ａ）において前記患者から取得された腫瘍試料を腫瘍消化物に処理することが、前記腫瘍試料を酵素培地中でインキュベートすることをさらに含む、請求項１９～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. ステップ（ａ）において前記患者から取得された腫瘍試料を腫瘍消化物に処理することが、前記腫瘍試料を機械的に破壊して前記腫瘍試料を解離することをさらに含む、請求項１９～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. ステップ（ａ）において、前記患者から取得された腫瘍試料を、腫瘍消化物に処理することが、密度勾配分離を使用して前記解離された腫瘍試料を精製することをさらに含む、請求項１９～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記酵素培地が、ＤＮａｓｅを含む、請求項３６に記載の方法。
  40. 前記酵素培地が、約３０単位／ｍＬのＤＮａｓｅを含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記酵素培地が、コラゲナーゼを含む、請求項３６に記載の方法。
  42. 前記酵素培地が、約１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼを含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記がんが、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌、神経膠芽細胞腫、胃腸癌、腎臓癌、肉腫、及び腎細胞癌からなる群から選択される、請求項１９～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、またはＣＴＬＡ－４阻害剤を前記患者に投与するステップをさらに含む、請求項１９～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. Ｔ細胞製品の効力を決定する方法であって、
    ｅ．Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で行うステップと、
    ｆ．Ｔ細胞参照標準細胞との標的細胞の少なくとも３つの共培養を、異なる標的細胞濃度で行うステップと、
    ｇ．前記共培養の各々から上清を抽出するステップと、
    ｈ．前記上清を、前記Ｔ細胞製品細胞及びＴ細胞参照標準細胞から分泌されたサイトカインについて評価して、前記Ｔ細胞製品の効力を決定するための用量濃度を取得するステップと、を含み、
    前記標的細胞が、単球細胞である、前記方法。
  46. 前記Ｔ細胞製品が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）製品、骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）製品、または末梢血リンパ球（ＰＢＬ）製品である、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記単球細胞が、Ｕ９３７もしくはＴｈｐ１細胞、またはその誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫であり、前記サイトカインが、インターフェロン－γである、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. 前記共培養が、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、及び約４８時間からなる群から選択される期間行われる、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記Ｔ細胞製品が、ＴＩＬ製品であり、１ウェル当たり約４×１０５、約２×１０５、約１×１０５、及び約０．５×１０５標的細胞の４つの標的細胞用量濃度、ならびに１ウェル当たり約１．５×１０６ＴＩＬの単一のＴＩＬ細胞濃度が使用される、請求項４８に記載の方法。
  50. Ｔ細胞製品細胞との標的細胞の少なくとも４つの共培養及びＴ細胞参照標準細胞との標的細胞の少なくとも４つの共培養を使用し、平行線分析を行い、１つの外れ値標的細胞用量濃度を破棄する、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記方法が、効力アッセイマトリックスの構成要素である、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記効力アッセイマトリックスが、ＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ１３７刺激及び報告インターフェロン－γ、グランザイムＢ、または腫瘍壊死因子－αを使用したビーズまたはプレートベースのアッセイ、総生細胞についてのアッセイ、生細胞パーセンテージについてのアッセイ、ＣＤ４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＬＡＧ３＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＫＬＲＧ１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ１０１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ６９＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＳＣＭ細胞含有量についてのアッセイ、ＴＥＭＲＡ細胞含有量についてのアッセイ、Ｔｒｅｇ細胞含有量についてのアッセイ、ＰＤ－１＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＭ３＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２５＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２７＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ２８＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＤ５６＋細胞含有量についてのアッセイ、ＣＴＬＡ－４＋細胞含有量についてのアッセイ、ＴＩＧＩＴ＋細胞含有量についてのアッセイ、及びＣＤ５７＋細胞含有量についてのアッセイからなる群から選択される１つ以上のアッセイを含む、請求項５１に記載の方法。
  53. がんを有する対象を治療するための方法であって、
    （ａ）腫瘍消化物または腫瘍断片を閉鎖系に追加することであって、前記腫瘍消化物または腫瘍断片が、第１のＴＩＬ集団を含み、前記対象から切除された腫瘍から取得される、前記追加することと、
    （ｂ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、前記第１の拡張が、約３～１１日間行われて、前記第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、前記系を開くことなく起こる、前記第２のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｃ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む追加の細胞培養培地を補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第２の拡張が、約７～１１日間行われて、前記第３のＴＩＬ集団を取得し、前記第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、前記系を開くことなく起こる、前記第３のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｄ）ステップ（ｃ）から取得された前記第３のＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行が、前記系を開くことなく起こる、前記採取することと、
    （ｅ）ステップ（ｄ）からの前記採取された第３のＴＩＬ集団を注入バッグに移すことであって、ステップ（ｄ）から（ｅ）への移行が、前記系を開くことなく起こる、前記移すことと、
    （ｆ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｅ）からの前記採取されたＴＩＬ集団を含む前記注入バッグを凍結保存することと、
    （ｇ）治療上有効な投与量の前記第３のＴＩＬ集団を、ステップ（ｆ）における前記注入バッグから前記対象に投与することと、を含む、拡張腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含み、
    前記ＡＰＣが、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７、もしくはＴｈｐ１細胞、またはそれらの誘導体、バリアント、修飾、もしくは子孫からなる群から選択される、前記方法。
  54. 前記がんが、黒色腫（転移性黒色腫及びブドウ膜黒色腫を含む）、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、食道癌、食道・胃接合部癌、胃癌、胃腸癌、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
  55. ステップ（ａ）における前記第１の拡張及びステップ（ｂ）における前記第２の拡張が、各々１１日間の期間内に個別に行われる、請求項５４に記載の方法。
  56. ステップ（ａ）～（ｄ）が、約１０日～約２２日で行われる、請求項５４に記載の方法。
  57. 前記ＴＩＬの効力が、請求項１～１８のいずれか１項または請求項４５～５２のいずれか１項に記載の方法を使用して決定されている、請求項５３～５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記ＴＩＬの効力が、請求項１～１８のいずれか１項または請求項４５～５２のいずれか１項に記載の方法を使用して決定されている、請求項１９～４４のいずれか１項に記載の方法。
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