RS61391B1 - Ligandi modifikovani primenom cirkularnog permutiranja kao agonisti i antagonisti - Google Patents

Ligandi modifikovani primenom cirkularnog permutiranja kao agonisti i antagonisti

Info

Publication number
RS61391B1
RS61391B1 RS20210004A RSP20210004A RS61391B1 RS 61391 B1 RS61391 B1 RS 61391B1 RS 20210004 A RS20210004 A RS 20210004A RS P20210004 A RSP20210004 A RS P20210004A RS 61391 B1 RS61391 B1 RS 61391B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
fusion
protein
receptor
ligand
native
Prior art date
Application number
RS20210004A
Other languages
English (en)
Inventor
Juan Alvarez
Jean Chamoun
Original Assignee
Alkermes Pharma Ireland Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alkermes Pharma Ireland Ltd filed Critical Alkermes Pharma Ireland Ltd
Publication of RS61391B1 publication Critical patent/RS61391B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5412—IL-6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4727—Mucins, e.g. human intestinal mucin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/545—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57563—Vasoactive intestinal peptide [VIP]; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/91—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Description

Opis
POZADINA PRONALASKA
[0001] Interakcije ligand-receptor su važne za brojne ćelijske signalne puteve. Faktori rasta, citokini i druge regulacione belančevine koriste ove interakcije kako bi posredovale ćelijske odgovore. Belančevine koje inhibiraju ili olakšavaju pomenute procese imaju potencijal kao terapeutici.
[0002] Uzimajući u obzir neke nedostatke pristupa sa monoklonskim antitelima sa ciljem inhibiranja funkcija ligand-receptor poput skupe proizvodnje, glomaznosti, ograničene penetracije u tkiva i neželjenih nus-pojava, istraživači su se fokusirali na primenu belančevina koje nisu antitela kao terapeutske agense. Nadalje, terapeutske antitelo-strategije su generalno ograničene na inhibiranje, ili antagoniziranje, nekog puta signaliziranja i nisu kompetentne sa strategijama koje potiču, ili agonizuju, neki put. Stoga se istražuju novi pristupi konstruiranja belančevina sa ciljem razvijanja liganada i receptora koji bi bili agonisti i antagonisti klinički važnih meta kao alternativa strategijama sa antitelima.
[0003] Cirkularno permutiranje podrazumeva spajanje nativnih amino- i karboksi-krajeva neke belančevine, generalno sa nekim linkerom, pri čemu se kreiraju novi amino- i karboksiterminusi uz pomoć cepanja novo-nastalog mesta u sekvenci belančevine, generalno neka omča; pri tome se primarna sekvenca novo-nastale belančevine preuređuje, dok je sekundarna struktura (i aktivnost) očuvana. Tako, proizvodnja novih terminusa može da obezbedi bolje lokacije za pripajanje nekog fuzionog partnera u odnosu na nativne terminuse.
[0004] Cirkularno permutiranje proteinskog liganda obezbeđuje sredstva (načine) uz pomoć kojih neka belančevina može da se promeni kako bi se kreirali novi karboksil- i amino-terminusi bez umanjivanja specifičnosti i veznog afiniteta promenjenog proteinskog liganda prema svojoj meti u odnosu na njegovu nativnu formu. Osim toga, ovi novi terminusi mogu da se preferirano premeste na izabranu lokaciju kako bi se ovako cirkularno-permutirani ligand ugradio u fuzioni polipeptid, čime se ostvaruje bolja aktivnost u odnosu na neki fuzioni polipeptid koji sadrži nativni ligand koji nije cirkularno permutiran.
[0005] Cirkularno permutirani ligandi su opisani u dokumentu WO 95/27732. Fuzione belančevine koje sadrže interleukin i vezni domen nekog interleukinskog receptora su opisani u dokumentu WO 2010/020766. Ovaj pronalazak obezbeđuje fuzione polipeptide koji sadrže ligande koji su bili modifikovani primenom cirkularne permutacije i koji funkcionišu kao agonisti, super-agonisti ili antagonisti nekog signalnog puta. Takvi fuzioni polipeptidi su korisni u tretmanu mnogih poremećaja, stanja, i bolesti koje zavise o interakciji ligand-receptor i o prenosu signala. Na primer, takvi fuzioni polipeptidi koji deluju kao antagonisti ciljanog receptora imaju potencijal kao terapeutici namenjeni protiv raka i autoimunih poremećaja. Takvi fuzioni polipeptidi koji deluju kao agonisti ili super-agonisti nekog signalnog puta imaju potencijal, na primer, za primenu u tretmanu raka ili u regenerativnoj medicini.
SAŽETAK PRONALASKA
[0006] U prvom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje fuzioni polipeptid koji sadrži aminokiseline 1-303 iz sekvence SEQ ID NO: 26.
[0007] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje fuzioni polipeptid iz prvog aspekta koji se sastoji od amino-kiselina 1-303 iz sekvence SEQ ID NO: 26.
[0008] U trećem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži fuzioni polipeptid iz prvog ili drugog aspekta i neki farmaceutski prihvatljivi ekscipijent.
[0009] U četvrtom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovanu ili rekombinantnu nukleinsku kiselinu koja kodira fuzioni polipeptid iz prvog ili drugog aspekta.
[0010] U petom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje neki rekombinantni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu iz četvrtog aspekta.
[0011] U šestom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ćeliju-domaćina koja sadrži vektor iz petog aspekta.
[0012] U sedmom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje fuzioni polipeptid iz prvog ili drugog aspekta ili farmaceutsku kompoziciju iz trećeg aspekta namenjeni za primenu u medicini.
[0013] U osmom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje fuzioni polipeptid iz prvog ili drugog aspekta ili farmaceutsku kompoziciju iz trećeg aspekta namenjeni za primenu u nekom terapeutskom postupku za selektivno agoniziranje IL-2Rβγ u nekoj ćeliji, pri čemu pomenuti postupak podrazumeva kontaktiranje pomenute ćelija sa pomenutim fuzionim polipeptidom iz prvog ili drugog aspekta ili sa farmaceutskom kompozicijom iz trećeg aspekta.
[0014] U devetom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje fuzioni polipeptid ili farmaceutsku kompoziciju namenjeni za primenu u skladu sa osmim aspektom, pri čemu pomenuti fuzioni polipeptid ili pomenuta farmaceutska kompozicija dolaze u kontakt sa pomenutom ćelijom vantelesno.
[0015] U desetom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje fuzioni polipeptid iz prvog ili drugog aspekta ili farmaceutsku kompoziciju iz trećeg aspekta namenjeni za primenu u tretiranju raka.
[0016] Ovde su opisani fuzioni polipeptidi koji sadrže polipeptidne ligande koji su modifikovani primenom cirkularnog permutiranja pa su fuzionisani na barem jedan polipeptidni fuzioni partner pri čemu takvi fuzioni polipeptidi poseduju nove, poboljšane ili pojačane biološke funkcije ili aktivnosti u odnosu na analogne fuzione belančevina sa nativnim ligandom koji nije bio cirkularno permutiran. Takva poboljšanja uključuju, ali bez ograničenja, povećani vezni afinitet, povećanu aktivnost, povećanu agonističku aktivnost (super-agonist), povećanu antagonističku aktivnost, povećanu pristupačnost, povećanu fleksibilnost aktivnog mesta, povećanu stabilnost, širu i/ili promenjenu specifičnost prema supstratu, pojačano tkivno ciljanje, pojačano vezanje belančevine, pojačano ciljanje membrane, poboljšane farmakokinetičke parametre, poboljšane fizičke karakteristike, i kombinacije spomenutih poboljšanja.
[0017] Pomenuti cirkularno-permutirani ligandi mogu da sadrže sve ili bilo koji deo svojih nativnih polipeptidnih lanaca, i mogu opciono da uključuju i linkere. Pomenuti cirkularnopermutirani ligandi su dizajnirani da budu optimalno orijentisani tako da mogu da se fuzionišu na barem jedan željeni polipeptidni fuzioni partner bez da kompromitiraju svoju aktivnost, poput veznog afiniteta modifikovanog liganda prema njegovoj meti. Pomenuti cirkularnopermutirani (modifikovani) ligandi iz fuzionih polipeptida mogu da budu aktivni barem, a preferirano su aktivniji, kao i odgovarajuće nativne belančevine. Ovde su opisane fuzione belančevine koje poseduju veći vezni afinitet prema svojim ciljanim belančevinama. Pomenuti vezni afinitet ovih fuzionih belančevina prema njihovim ciljanim belančevinama može da bude barem 5-puta, preferirano barem 10-puta, preferirano barem 20 puta ili više u odnosu na afinitet nativnog liganda prema svojoj ciljanoj belančevini. Pomenuti fuzioni polipeptid može da poseduje barem 10-puta veći vezni afinitet prema svojem receptoru.
[0018] Pomenuti ligandi mogu da budu izabrani iz grupe koja obuhvata, ali bez ograničenja, citokine, limfokine, hemokine, adipokine, faktore rasta, hormone, molekule za ćelijsku adheziju i neurotransmitere. Polipeptidni fuzioni partner može da bude bilo koji polipeptid koji omogućava poboljšanje u odnosu na nativnu belančevinu. Na primer, fuzioni partneri mogu da se izaberu iz grupe koja obuhvata, ali bez ograničenja, sve ili neke sledećih: glikobelančevine, proteoglikane, ćelijske signalne molekule, pomoćne belančevine, rastvorljive receptore, receptore vezane na membranu, transmembranske receptore, antitela, encime, ciljane polipeptide (na primer, nanotela), mucine ili mucinu-slične peptide, sintetičke polipeptide ili bilo koje njihove kombinacije. Poboljšanje uključuje, ali bez ograničenja, poboljšanje afiniteta, agonizma, antagonizma, dodavanje aktivnosti sinergističkog delovanja, tkivno ciljanje, proteinsko ciljanje, membransko ciljanje, farmakokinetičke parametre (na primer, polu-život), ili fizičke karakteristike (na primer, rastvorljivost).
[0019] Kao šta je ovde opisano, barem jedan polipeptidni fuzioni partner sadrži sve ili deo neke podjedinice ciljanog receptora ili drugog molekula koji je uključen u svojem prirodnom putu prenosa signala. Podrazumeva se da neki polipeptidni fuzioni partner može da sadrži neki polipeptid koji je barem 60%, barem 70%, barem 80% ili barem 90% homologan sa celom ili sa delom neke podjedinice ciljanog receptora ili drugog molekula koji je uključen u nekom putu prenosa signala.
[0020] Ovde su pisani fuzioni polipeptidi koji sadrže neki modifikovani ligand i neki polipeptidni fuzioni partner koji su dodatno spojeni na neki drugi fuzioni partner. Primeri za ove druge fuzione partnere uključuju celo ili delove nekog antitela (na primer, Fc-region nekog antitela) i bilo koje tipove polipeptida koji su prikladni kao prvi fuzioni partner koji je ovde opisan.
[0021] Ovde su opisani fuzioni polipeptidi koji deluju kao novi i poboljšani agonisti (superagonisti), ili antagonisti nekog receptora poput ćelijskog receptora koji učestvuje u prenosu signala u nekom ćelijskom signalnom putu. Pomenuti fuzioni polipeptidi mogu da se vežu na monomerne, dimerne, ili multimerne ciljane receptore i mogu da inhibiraju ili potiču dimerizaciju, trimerizaciju ili multimerizaciju pomenutog receptora i/ili da inhibiraju ili potiču prenos signala i nizvodno signaliziranje u nekom ćelijskom putu.
[0022] Ovde je opisan fuzioni polipeptid koji sadrži prvi polipeptidni fuzioni partner koji je spojeni na neki modifikovani ligand koji odgovara nativnom ligandu koji je specifičan za ciljani receptor, pri čemu pomenuti modifikovani ligand je cirkularno-permutiran kako bi se kreirao novi N-terminus i novi C-terminus u odnosu na pomenuti nativni ligand, i pri čemu pomenuti novi N-terminus ili novi C-terminus iz modifikovanog liganda je spojen na prvi polipeptidni fuzioni partner kako bi se formirao fuzioni polipeptid koji opciono poseduje povećani afinitet za ciljani receptor u odnosu na nativni ligand tog receptora, i pri čemu nakon povezivanja pomenutog fuzionog polipeptida sa ciljanim receptorom, pomenuti fuzioni polipeptid superagonizuje ili antagonizuje aktivnost ciljanog receptora. Pomenuti novi C-terminus i novi N-terminus iz modifikovanog liganda ne smeju da poremete bilo koji vezni domen u modifikovanom ligandu za ciljani receptor.
[0023] Ciljani receptor može da funkcionira preko postepenog formiranja multimernog aktivacionog kompleksa kako bi potaknuo prenos signala u nekom ćelijskom signalnom putu pri čemu nakon vezanja fuzionog polipeptida na receptor, pomenuti signalni prenos je superagonizovan ili antagonizovan.
[0024] Pomenuti fuzioni polipeptid može da se veže na receptor da ga potakne na postepeno formiranje multimernog aktivacionog kompleksa pri čemu na taj način super-agonizuje prenos signala preko ciljnog receptora.
[0025] Pomenuti fuzioni polipeptid može da se veže na receptor kako bi sterički ometao postepeno formiranje multimernog kompleksa čime antagoniziranje prenos signala preko ciljnog receptora.
[0026] Ovde je opisan fuzioni polipeptid koji sadrži modifikovani ligand i prvi fuzioni partner pri čemu je pomenuti prvi fuzioni partner modifikovanog liganda izveden iz cele ili dela belančevine sa kojom bi nativni ligand iz ciljnog receptora bio povezan u prvom koraku postepenog formiranja receptorskog multimernog aktivacionog kompleksa. Pomenuti fuzioni polipeptid može da sadrži modifikovanu belančevinu i neki fuzioni partner pri čemu pomenuti fuzioni partner iz modifikovane belančevine je izveden iz cele ili dela belančevine sa kojom bi nativna belančevina iz ciljnog receptora bila povezana u nizvodnim koracima postepenog formiranja receptorskog multimernog aktivacionog kompleksa.
[0027] Pomenuti fuzioni partner iz heterodimera može da bude fuzionisan na pomenuti modifikovani ligand na poziciji gde je orijentiran da potiče pomenuto postepeno formiranje receptorskog multimernog aktivacionog kompleksa.
[0028] Pomenuti prvi fuzioni partner iz heterodimera može da bude fuzionisan na modifikovani ligand na poziciji gde je orijentisan da sterički ometa formiranje receptorskog multimernog aktivacionog kompleksa.
[0029] Pomenuti fuzioni polipeptid može da bude neki homodimer koji sadrži modifikovanu belančevinu i neki fuzioni partner pri čemu je pomenuti fuzioni partner iz modifikovanog liganda izveden iz celog ili dela istog liganda kada je homodimerizacija potrebna za formiranje receptorskog multimernog aktivacionog kompleksa.
[0030] Ovde je opisani postupak za super-agoniziranje ciljnog receptora koji podrazumeva postojanje koraka kontaktiranja receptora sa fuzionim polipeptidom iz ovoga pronalaska.
[0031] Ovde je opisan postupak za antagoniziranje ciljnog receptora koji obuhvata korak kontaktiranja pomenutog receptora sa nekim fuzionim polipeptidom iz ovoga pronalaska.
[0032] Ovde je opisan postupak za pripremu fuzionog polipeptida iz ovoga pronalaska koji obuhvata korake: a) izbor nativnog liganda koji veže neki receptor pri čemu pomenuti receptor funkcioniše preko postepenog formiranja multimernog aktivacionog kompleksa koji potiče prenos signala u nekom ćelijskom signalnom putu; b) kreiranje modifikovanog liganda uz pomoć cirkularnog permutiranja sa ciljem obezbeđivanja modifikovanog liganda koji poseduje novi N-terminus i novi C-terminus u odnosu na nativni ligand iz koraka (a); i c) spajanje prvog polipeptidnog fuzionog partnera na pomenuti N- ili C- terminus iz modifikovanog liganda iz koraka (b) kako bi se proizveo fuzioni polipeptid, pri čemu su pomenuti novi N- ili C-terminusi iz modifikovanog liganda locirani tako da omogućavaju da prvi fuzioni partner bude spojen na modifikovani ligand u orijentaciji koja antagonizuje ili super-agonizuje funkciju ciljnog receptora nakon vezanja pomenutog fuzionog polipeptida na ciljani receptor. Ovaj postupak može dodatno da obuhvata fuzionisanje drugog fuzionog partnera na modifikovani ligand iz koraka (b) pri čemu ovaj drugi fuzioni partner obezbeđuje dodatno poboljšanje belančevine, poput produživanja polu-života fuzionog polipeptida in vivo. Drugo poboljšanje koje može da se ostvari preko koraka (c) uključuje, ali bez ograničenja, dodavanje sinergijske funkcionalne aktivnosti, ciljanje organa, ciljanje tkiva, ciljanje belančevina, ciljanje membrane, ciljanje biološke matrice, farmakokinetičke (na primer, procenat biodostupnosti) ili fizičke karakteristike (na primer, rastvorljivost).
KRATAK OPIUS SLIKA
[0033]
Sl. 1. Struktura ljudskog IL6 heksamernog signalnog kompleksa (PDB: 1P9M). Bočni pogled (gore) i pogled odozgora (dole) heksamernog kompleksa koji se sastoji od dva IL-6 molekula (tamno-sivo), dva rastvorljiva IL-6Rα molekula (D2-D3 iz IL6 receptorske podjedinice α su označeni crnim), a dva rastvorljiva gp130 molekula (D1-D2-D3, svetlo-sivo).
Sl. 2. Ilustracija procesa cirkularnog permutiranja uz korišćenje belančevine 4-heliksni svežanj (4-helix bundle protein), IL-6. Traka(ribbon)-prikaz kristalne strukture IL-6 (PDB 1P9M, gore levo) i modelovana struktura cirkularno-permutiranog IL-6 (RDB1503, gore desno). N- i C-terminusi su označeni kao zavojnice A, B, C, D u skladu sa standardnom IL-6-nomenklaturom. Pomenuta cirkularno-permutirana belančevina je pripremljena uz pomoć spajanja nativnih terminusa i kreiranih novih terminusa između zavojnice C i D u nativnom IL-6. Krajnji rezultat takve cirkularne permutacije je premeštaj terminusa u naličje IL-6. Amino-kiselinske sekvence za IL-6 (ostaci 47-212 iz SEQ ID NO: 3) i RDB1503 (SEQ ID NO: 1) (sredina i dole) označavaju reorganizovanu sekvencu. Novi N-terminus RDB1503 neposredno prethodi zavojnici D. Osenčena površina u traka-prikazu i proteinska sekvenca RDB1503 označavaju linker koji je kreiran da spaja nativne N- i C-terminuse u IL-6.
Sl. 3. Molekularni model koji ilustruje relativnu orijentaciju D1 (domen 1 iz gp130) kada je fuzionisan na IL-6 (SL. 3A) i RDB1503 (Sl. 3B), koje rezultuje u fuzione belančevine RDB1529 i RDB1527. D1-domen je osenčen radi naglašavanja. Delovi gp130 i IL-6Rα u aktivnom heksamernom kompleksu su uključeni radi reference. D1-domen RDB1529 je usmeren od gp130 veznog interfejsa u pomenutom heksamernom aktivnom kompleksu pa je predviđeno da neće moći da efektivo antagonizuje signal (Sl. 3A). Suprotno, D1-domen RDB1527 učestvuje u vezanju na IL-6Rα i zauzima prostor koji je zauzet sa drugim gp130 molekulom u heksamernom kompleksu, čime efektivno antagoniziranje signal (Sl.3B).
Sl. 4. Krive odgovora na dozu za IL-6 (▲) i RDB1503 ( ) u ćelijskom testu HEK-Blue™. EC50je procenjen na 1 pM i 0.6 pM, za IL-6 i RDB1503.
Sl. 5. Inhibicija IL6-signaliziranja uz pomoć RDB1527 u ćelijskom testu HEK-Blue™. Aktivnost IL6 ( ) kao funkcija njegove koncentracije u odsutnosti inhibicije. Inhibicija uz pomoć RDB1527( ), i RDB1529 ( ) je izmerena u prisutnosti 12.5 pM IL6. Sva merenja su duplirana. Procenjena vrednost IC50za RDB1527 je 0.22 nM. RDB1529 ne pokazuje robusnu inhibitornu aktivnost.
Sl. 6. Merenje primenom površinske plazmonske rezonance (surface plasmon resonance, SPR) rastvorljivog IL-6Rα veznog na imobilizirani IL-6 (Sl.6A), RDB1529 (Sl.6B), i RDB1527 (Sl.
6C). Senzogrami i podešene krive su označeni sivo i crno. Kinetički parametri izračunati iz podataka su u ugrađenim tabelama.
Sl. 7. Struktura ljudskog IL-1β signalnog kompleksa (PDB: 4DEP; Sl. 7A) i model (prikaz) formiranja potencijalnog kompleksa posredovanjem RDB1538 (CP_IL-1β_IL-1RI (D1-D2); Sl. 7B). IL-1β (označen sa strelicom u strukturi) veže receptore IL-1RI (crno, izlazi iz ravnine) i IL-1RAcP (svetlo-sivo, udaljava se po ravnine). Nativni N- i C-terminusi IL-1β nisu blizu do C-terminusa D1-D2-domena IL-1RI. Terminusi proizvedenog cirkularno-permutiranog IL-1β sada se nalaze proksimalno od C-terminusa D1-D2-domena IL-1RI, koje ubrzava generiranje fuzione belančevine. Osenčena površina označava linker koji spaja cirkularno-permutiranu varijantu IL-1β sa IL-1RI receptorom.
SlL. 8. Struktura ljudskog IL2 signalnog kompleksa (PDB: 2ERJ; Sl. 8A) i model signalnog kompleksa posredstvom RDB1405 (CP_IL-2_IL-2Rα; Sl. 8B). IL2 (označen sa strelicom u strukturi) veže receptore IL2Rα (sivo, gore levo u kompleksu), IL2Rβ (svetlo-sivo, dole levo u kompleksu) i γc(crno, dole-desno u kompleksu). IL-2Rα stabilizuje konformaciju IL-2 kako bi se pojačao vezni afinitet za IL-2Rβ. Nativni N- i C-terminusi IL-2 se nalaze distalno od IL2/IL-2Rα interfejsa. Terminusi proizvedenog cirkularno-permutiranog IL-2 se sada nalaze proksimalno od IL-2/IL-2Rα interfejsa, tako olakšavajući generisanje fuzione belančevine. Osenčena površina označava linker koji spaja cirkularno-permutiranu varijantu IL-2 sa IL-2Rα receptorom.
Sl. 9. Predstavlja dijagram koji pokazuje reprezentativne signalne komplekse za citokine i faktore rasta koje ilustruje multimerno sklapanje koje vodi ka aktivaciji.
Sl. 10. Predstavlja dijagram koji pokazuje mehanizam antagonizma uz pomoć Picasso3_D1. Vezne determinante iz IL-6 i D1 (domen gp130) su prisutne u hibridnoj fuzionoj belančevini koje rezultuje sa visoko-afinitetnim vezanjem na IL-6Rα. Jednom kada se Picasso3_D1_Fc veže na IL-6Rα, sklapanje signalnog kompleksa IL-6 ne može da nastupi, koje dovodi do antagonizma.
Sl. 11A i 11B. Odgovor HH-ćelija (levo) i CTLL-2-ćelija (desno) prema IL-2 divljeg-tipa (proleukin) i izmenjenim varijantama IL-2.
Sl. 12A i 12B. Odgovor HH-ćelija (levo) i CTLL-2-ćelijas (desno) prema IL-15 divljeg-tipa i izmenjenim varijantama IL-15.
Sl. 13. Struktura modela IL-15 signalnog kompleksa za CP-IL-15-IL-15Rα fuzionom belančevinom generisanom uz pomoć superpozicije IL-15/IL-15Ra kompleksa (2Z3Q.pdb na IL-Rβ i IL-2Rγ lancima iz strukture IL-2 trostrukog signalnog kompleksa, 2ERJ.pdb). 'Linker' koji spaja nativne terminuse IL-15 kako bi se kreirala cirkularno-permutirana varijanta IL-15 i 'spejser' kako bi se kreiralo fuzioni CP-IL-15-IL-15Rα su označeni sa strelicama. Primetite da su nativni terminusi IL-15 (originalno locirani na mestu 'linkera') orijentisani udaljeno distalno od IL-15Rα veznog interfejsa, koje dovodi do potrebe za cirkularnim permutiranjem liganda.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0034] Sledi opis preferiranih izvedaba pronalazaka. Ovde je opisana polipeptidna fuziona belančevina koja obuhvata cirkularno-permutirani IL-6 ligand koji je fuzionisan na jedan deo gp130. Podrazumeva se da su biološke funkcije, aktivnosti i druge karakteristike opisanih izvedaba generalno primenjive na drugim fuzionim polipeptidima koji sadrže ligande, modifikovane uz pomoć cirkularnog permutiranja, fuzionisane na polipeptidne fuzione partnere.
[0035] Kao šta se ovde koristi u samoj specifikaciji i pridodanim zahtevima, jednina takođe uključuje množinu osim ako kontekst ukazuje na suprotno. Tako, na primer, pojam
1
"polipeptidni fuzioni partner" uključe množinu tj. polipeptidne fuzione partnere. U ovoj specifikaciji i u zahtevima ispod, pominjati će se brojni termini koji imaju sledeća značenja osim ako kontekst ukazuje na suprotno.
Definicije
[0036] Termin "cirkularna permutacija" i "cirkularno-permutirani" "(CP)" kao šta se ovde koristi, se odnosi na konceptualan proces koji kreće od linearne belančevine, ili od sekvence njene odgovarajuće nukleinske kiseline, fuzioniše nativne N- i C- terminuse (direktno ili preko nekog linkera, uz korišćenje proteinske metodologije i tehnologije rekombinantne DNA) kako bi se formirao cirkularni molekul, cepa (otvara) pomenuti cirkularni molekul na različitim lokacijama kako bi se formirala nova linearna belančevina, ili sekvenca njene odgovarajuće nukleinske kiseline, sa terminusima koji su različiti od terminusa u originalnom molekulu. Cirkularna-permutacija očuva sekvencu, strukturu, i funkciju belančevine (osim opcionog linkera), dok istovremeno generiše nove C- i N-terminuse na različitim lokacijama koje, u skladu sa jedim aspektom ovoga pronalaska, rezultuje poboljšanom orijentacijom za fuzionisanje željenog polipeptidnog fuzionog partnera u odnosu na originalni ligand. Cirkularna permutacija takođe uključuje bilo koji proces koji rezultuje cirkularno-permutiranim ravnolančanim molekulom, kao šta je ovde definisano. Opšte uzeto, cirkularno-permutirani molekul je de novo eksprimiran kao linearni molekul i formalno ne prolazi kroz korake cirkularizacije i otvaranja krajeva. Određena cirkularna permutacija nekog molekula, ovde je označena sa zagradama koji sadrže, u slučaju cirkularno-permutirane belančevine, amino-kiselinske ostatke između kojih je eliminirana peptidna veza. Na primer, oznaka IL6(Q182/Q180) opisuje cirkularno-permutirani IL6 faktor rasta u kojem se mesto otvaranja (pozicija u kojoj je peptidna veza eliminirana) nalazilo između ostataka Q182 i Q180 ne-permutiranog ili ne-modifikovanog nativnog IL6, a tako novo-nastali N-terminus je glutamin koji je prethodno bio ostatak 182, a novo-nastali C-terminus je glutamin koji je prethodno bio ostatak 180.
[0037] "Spejser", kao šta se ovde koristi, se odnosi na peptid koji spaja belančevine koji sadrže neku fuzionu belančevinu. Generalno, spejser nema specifičnu biološku aktivnost, a njegova svrha je samo spajanje belančevina ili očuvanje iste minimalne distance ili neki drugi prostorni odnos između njih. Međutim, amino-kiseline koje čine spejser mogu da se izaberu na osnovu istih karakteristika linkera ili rezultujućeg molekula poput fleksibilnosti, hidrofilnosti, ukupnog naboja, ili proteolitičke prijemčivosti ili njenog odsustva, i odsustva imunogenosti.
[0038] Termini "ne-permutirani", "nativni", "divlji-tip", ili "ne-modifikovani" ligand, polipeptid, belančevina, citokin, ili faktor rasta, ovde se koriste kako bi se označio ligand, citokin, faktor rasta ili belančevina pre njenog rearanžmana u cirkularno-permutirani molekul, kao šta je opisano iznad. Tipično, ne-modifikovani ligand, faktor rasta ili belančevina imaju amino- i karboksi-terminuse i amino-kiselinsku sekvencu koja dostatno odgovara onim aminoi karboksi-terminusima i amino-kiselinskoj sekvenci liganda, faktora rasta, ili belančevine, ili nekom domenu koji je nezavisan o belančevini, kao šta se generalno pojavljuje in vivo. Nemodifikovani ligand, faktor rasta, ili belančevina mogu da budu u potpuno zreloj formi ili u formi nekog prekursora zreloj formi (poput pro-belančevine).
[0039] Termin "ligand" ovde se generalno koristi kako bi se opisao bilo koji polipeptid (nativni, endogeni, ili modifikovani u skladu sa ovim pronalaskom) koji se veže na neku drugu belančevinu ili receptor i je komponenta nekog biohemijskog puta. Ligand, direktno ili indirektno, može da utiče na (na primer, indukuje, inhibira) aktivnost receptora (na primer, signaliziranje, adhezija).
[0040] Termin "modifikovani ligand" ovde se koristi kako bi se označio neki ligand koji je bio modifikovan primenom cirkularne permutacije u odnosu na odgovarajući nativni ligand.
[0041] "Aktivnost" ili "biološka aktivnost" se odnosi na in vitro ili in vivo biološku funkciju ili efekt, uključujući, ali bez ograničenja, vezanje receptora, antagonističku aktivnost, agonističku aktivnost, ili ćelijski ili fiziološki odgovor.
[0042] "Agonist" je fuzioni polipeptid, ovde opisan, koji je sposoban da se veže na neki željeni receptor koje bi rezultovalo pojavom aktivisanog receptorskog kompleksa. "Super-agonist" je fuzioni polipeptid, ovde opisan, koji je sposoban da se veže na ciljni receptor obezbeđujući pojačanu aktivaciju receptorskog kompleksa u odnosu na nativni ligand za isti ciljani receptor. Aktivacija uz pomoć fuzionog polipeptidnog super-agonista iz ovoga pronalaska može da bude pojačana za barem dva-puta, a preferirano barem 5-puta, preferirano barem 10-puta ili preferirano barem 20-puta ili više ako se uporedi sa aktivacijom ciljnog receptora uz pomoć nativnog liganda. Fuzioni polipeptid iz ovoga pronalaska "koji poseduje agonističku aktivnost" se odnosi na to da su pomenuti fuzioni polipeptidi sposobni da se vežu na i da aktivišu ili superagonizuju barem jedan receptor.
[0043] "Antagonist" je fuzioni polipeptid, ovde opisan, koji je sposoban da se veže na neki željeni receptor, ali nije sposoban da posreduje tačne konformacijske ili molekularne promene u skapanju receptorskih molekula koje su neophodne za pojavu aktivisanog kompleksa, pri čemu je nativna ligandom-posredovana aktivacija receptora dostatno inhibirana. Aktivacija receptora nakon vezanja nekog prikladnog liganda generalno podrazumeva konformacijsku promenu u receptoru ili razliku stanjima vezanja receptora, na primer, oligomerizacija receptorskih podjedinica ili nakupljanje dodatnih belančevina ili receptora.
[0044] Termin "receptor" razumljivo ukazuje na belančevinu koja je prisutna na površini ćelije (ili se radi o rastvorljivom receptoru koji nije prisutan na površini ćelije, već je ili je povezan sa nekim delom nekog ćelijskog površinskog receptora) s kojim se veže ligand. Receptori sa površine ćelije su tipično sastavljeni od različitih domena ili podjedinica sa različitim funkcijama, poput spoljnog ćelijskog domena (ili više njih) koji sadrži region sa kojim reaguje ligand, transmembranski domen ili domeni (ili ponekad usidreni lipid) koji sidri receptor u samoj ćelijskoj membrani. U nekim slučajevima je takođe prisutan intraćelijski efektorski domen, koji inicira ćelijski signal kao odgovor na vezanje liganda (prenos signala). Rastvorljivi receptori su tipično sastavljeni od jednog ili više spoljno-ćelijskih domena koje omogućava protolitičko cepanje sa membranskog regiona za sidrenje.
[0045] "Ciljani receptori" ili "ciljani ligandi", u skladu sa ovim pronalaskom, su molekuli na koje su fuzioni-polipeptidi iz ovoga pronalaska dizajnirani da se direktno vežu. U jednoj izvedbi, "ciljani receptori", u skladu sa ovim pronalaskom, su sposobni da se ultimativno vežu, ili da ostvare neke druge interakcije sa, signalnim molekulima (na primer, ligandima) tokom poticanja prenosa signala u nekom ćelijskom signalnom putu.
[0046] Receptor koji je aktivisan uz pomoć "postepenog formiranja multimernog aktivacionog kompleksa" je receptor koji, osim vezanja na jedan ili više liganda, zahteva interakciju jedne ili više dodatnih proteinskih podjedinica u procesu koji je poznat kao dimerizacija, trimerizacija, multimerizacija, kompleksacija, ili oligomerizacija (poznato stanju tehnike kao "klasteriranje") kako bi se potpuno ostvario prenos signala u nekom ćelijskom signalnom putu. Receptor već može da bude u formi dimera ili multimera pre vezanja liganda, a nakon vezanja liganda može da postepeno nakupi i druge rastvorljive ili membranski-usidrene belančevine kako bi izgradio potpuno funkcionalni multimerni aktivacioni kompleks.
1
[0047] "Hidrodinamički radijus" je prividan radijus (Rhu nm) nekog molekula u nekom rastvoru koji je izračunat iz difuzionih karakteristika. "Hidrodinamički radijus" neke belančevine utiče na stopu difuzije u vodi. Hidrodinamički radijus neke belančevine zavisi o njenoj molekularnoj masi kao i o njenoj strukturi, uključujući formu i kompaktnost, i stanju njene hidracije. Postupci za određivanje hidrodinamičkog radijusa su dobro poznati stanju tehnike, poput primene DLS i hromatografije na osnovu isključivanja veličina (size exclusion hromatografija). Najveći broj belančevina je globularno, koja je najkompaktnija tridimenzionalna struktura koju belančevina može da poseduje uz najmanji hidrodinamički radijus. Neke belančevina zauzimaju nasumičnu ili otvorenu, ne-strukturiranu, ili 'linearnu' konformaciju pa kao rezultat toga imaju značajno veće hidrodinamičke radijuse u odnosu na tipično globularne belančevine slične molekularne mase.
[0048] "Polipeptid sa mucinskim domenom" ovde je definisan kao bilo koja belančevina koji sadrži "mucinski domen". Mucinski domen je bogat sa potencijalnim mestima za glikozilaciju, a ima i najveći sadržaj serina i/ili treonina i prolina, koji mogu da čine više od 40% aminokiselina. Mucinski domen je bogato glikolizovan sa predominantno O-spojenim glikanima.
[0049] Termin "linker" ili "linkerska sekvenca", kao šta se ovde koristi, se odnosi na peptidnu sekvencu koja se koristi za spajanje amino- i karboksi-terminusa neke belančevine (ili sekvence njene odgovarajuće nukleinske kiseline koja kodira tu belančevinu) preko kovalentnih veza za oba terminusa, amino i karboksi. U nekim izvedbama, cirkularno-permutirana belančevina se proizvodi uz pomoć spajanja krajeva odgovarajuće DNA ili RNA sekvence, koje dovodi do pojave brojnih permutanata uz pomoć cepanja cirkularizovane sekvence nukleinske kiseline, nakon čega se takva sekvenca nukleinske kiseline translatira kako bi se formirala cirkularna permutirana belančevina(e).
[0050] Termin "ostatak", kao šta se ovde koristi, se odnosi na amino-kiselinu koja je ugrađena u neki peptid. Ova amino-kiselina može da bude prirodna amino-kiselina i, osim ako je drugačije navedeno, može da obuhvata poznate analoge prirodnih amino-kiselina koje funkcioniraju na sličan način kao i prirodne amino-kiseline.
[0051] Termin "mesto otvaranja", kao šta se ovde koristi kada se misli na cirkularnupermutaciju, se odnosi na poziciju u kojoj će peptidna veza biti eliminisana kako bi se formirali novi amino- i karboksi-terminusi, manipulacijom belančevine ili nukleinske-kiseline. Mesto otvaranja je označeno preko pozicija para amino-kiselina koje su locirane između amino- i karboksi-terminusa ne-permutirane (nativne) belančevine koji sada postaju novi amino- i karboksi-terminusi cirkularno-permutirane belančevine. Na primer, u IL6 (Q182/Q180), novokreirani N-terminus (nova početna tačka cirkularno-permutiranog IL-6) je ekvivalentan (strukturno) sa Q182 nativnog IL-6, a novo-kreirani C-terminus (poslednji ostatak cirkularnopermutiranog IL-6) je ekvivalentan (strukturno) sa Q180 nativnog IL-6. Ostatak 181 iz nativnog IL-6 je eliminisan tokom kreiranja pomenutog mesta otvaranja.
[0052] Termin "polipeptidi" i "belančevina" ovde su sinonimi, a uključuju belančevine i njihove fragmente. Polipeptidi su ovde opisani kao sekvence amino-kiselina. Sekvence su navedene u smeru levo-desno od amino- prema karboksi-terminusu. U skladu sa standardnom nomenklaturom, sekvence amino-kiselina su označene (kodirane) sa tri slova ili sa jednim slovom kako sledi: alanin (Ala, A), arginin (Arg, R), asparagin (Asn, N), asparaginska kiselina (Asp, D), cistein (Cys, C), glutamin (Gln, Q), glutaminska kiselina (Glu, E), glicin (Gly, G), histidin (His, H), izoleucin (Ile, I), leucin (Leu, L), lizin (Lys, K), metionin (Met, M), fenilalanin (Phe, F), prolin (Pro, P), serin (Ser, S), treonin (Thr, T), triptofan (Trp, W), tirozin (Tyr, Y), i valin (Val, V).
[0053] Sve ovde opisane pozicije amino-kiselina kao okvir koriste sekvence nativnih belančevina. Na primer, nativni IL-1β (SEQ ID NO: 19), nativni IL-6 (SEQ ID NO: 3), nativni IL-2 (SEQ ID NO: 20), nativni gp130 (SEQ ID NO: 21), nativni IL-1RI (SEQ ID NO: 22), i nativni IL-2Rα (SEQ ID NO: 23) kao šta je predstavljeno u Popisu sekvenca. Na primer, IL-6 molekul "koji sadrži amino-kiseline 47 do 212 " se odnosi na molekul koji ima amino-kiseline koje dostatno odgovaraju istim pozicijama u SEQ ID NO: 3. Ovde se koriste i druge uobičajene reference sa ciljem označavanja delecija ili supstitucija u sekvenci uz korišćenje referentnih sekvenca, odgovarajuće nativne sekvence u popisu sekvenca ili čiji je pristupni broj u GenBank ovde obezbeđen. Sekvence amino-kiselina mogu da se navode u zagradama, na primer "(Ser 287)" se odnosi nas molekul koji sadrži serin na poziciji 287. Cirkularno-permutirani molekuli su označeni sa nativnim molekulom nakon čega slede zagrade koje obuhvataju aminokiselinske pozicije koje sadrže mesto otvaranja. Tako, na primer, IL6 (182/180) označava cirkularno-permutirani IL6 u kojem se novi amino-terminus nalazi u amino-kiselinskom ostatku 182, a novi karboksi-terminus na amino-kiselinskom ostatku 180 u ne-permutiranom nativnom IL6. Podrazumeva se da se iste takve supstitucije, adicije, ili delecije mogu uvesti u
1
bilo koju sekvencu koja je ovde opisana bez da se menja biološka aktivnost regiona. Upravo tako, neke modifikacije mogu biti neophodne za ostvarivanje ekspresije neke određene belančevine. Tako, na primer, metionin može da se doda u sekvencu kako bi se obezbedio inicijator.
[0054] "Varijanta" se odnosi na polipeptid koji se razlikuje od referentnog polipeptida, ali zadržava svoje esencijalne karakteristike. Tipična varijanta nekog polipeptida se razlikuje u svojoj primarnoj amino-kiselinskoj sekvenci od nekog drugog, referentnog polipeptida. Generalno, razlike su ograničene tako da su sekvence referentnog polipeptida i varijante ukupno veoma slične, a u mnogim regionima, identične. Varijanta referentnog polipeptid može da se razlikuje u svojoj amino-kiselinskoj sekvenci za jednu ili više modifikacija (na primer, supstitucija, adicija, i/ili delecija). Supstituisani ili ugrađeni amino-kiselinski ostatak može, ali ne mora da bude takav koji kodira genetički kod. Varijanta nekog polipeptida može da bude prirodna poput neke alelne varijante, ili može da bude varijanta koja nije prirodna. Osim toga, termin "varijanta", kao šta se ovde koristi, uključuje cirkularne permutacije belančevina i peptida.
[0055] Termin "antitelo", kao šta se ovde koristi, uključuje razne forme modifikovanih ili promenjenih antitela, poput intaktnog imunoglobulina, Fc-fragmenta koji sadrži konstantni region teških lanaca, Fv-fragment koji sadrži samo varijabilne regione iz lakog i teškog lanca, Fv-fragment spojen sa disulfidnom vezom na Fab ili (Fab)'2-fragment koji sadrži varijabilne regione i delove konstantnih regiona, jedno-lančano antitelo i sl.
[0056] Kao šta se ovde koriste, "tretman" ili "tretiranje", ili "palijativno" ili "ublažavajuće" su sinonimi. Ovi termini se odnosi na pristup za ostvarivanje korisnih ili željenih rezultata uključujući, ali bez ograničenja, terapeutsku korist i/ili profilaktičku korist. Pod terapeutsku korist se misli na odstranjivanje ili olakšavanje uzročnog poremećaja koji se tretira. Takođe, terapeutska korist se ostvaruje uz pomoć odstranjivanja ili olakšavanja jednog ili više fizioloških simptoma povezanih sa uzročnim poremećajem poput primećenog poboljšanja u subjektu, bez da se previdi da subjekt još uvek može da bude zahvaćen sa uzročnim poremećajem. Za profilaktičku korist, kompozicije se mogu administrirati nekom subjektu kod kojeg postoji rizik da razvije neku naročitu bolest, ili subjektu koji ima jedan ili više fizioloških simptoma neke bolesti, čak i ako takva bolest još uvek nije dijagnosticirana.
1
[0057] "Terapeutski efekt", kao šta se ovde koristi, se odnosi na neki fiziološki efekt, uključujući, ali bez ograničenja, izlečenje, ublažavanje, olakšavanje, ili prevenciju bolesti kod ljudi i drugih životinja, ili na neko drugačije poticanje fizičke ili mentalne dobrobiti ljudi i životinja, uzrokovanih od strane neke fuzione belančevine iz ovoga pronalaska koja je različita od sposobnosti indukovanja proizvodnje antitela protiv antigenog epitopa kojeg poseduje aktivna belančevina. Određivanje terapeutski efektivne količine je dobro poznato stručnjacima, naročito u svetlu detaljnog opisa koji je ovde obezbeđen.
[0058] Termini "terapeutski efektivna količina" i "terapeutski efektivna doza", kao šta se ovde koristi, se odnosi na neku količinu aktivne belančevine, sama za sebe ili kao deo neke kompozicije sa fuzionom belančevinom, koja je sposobna da uspostavi bilo kakav primetljiv, koristan efekt prema bilo kojem simptomu, aspektu, mernom parametru ili karakteristikama nekog bolesnog stanja ili poremećaja kada se nekom subjektu administrira kao pojedinačna ili višestruka doza. Takav efekt ne mora da bude apsolutan da bi bio koristan.
[0059] Termin "terapeutski efektivan dozni režim", kao šta se ovde koristi, se odnosi na raspored za konsekutivno administriranje doza neke aktivne belančevine, kao sama za sebe ili kao deo kompozicije neke fuzione belančevine, pri čemu se pomenute doze daju u terapeutski efektivnim količinama kako bi se ostvario održivi korisni efekt prema bilo kojem simptomu, aspektu, mernom parametru ili karakteristikama nekog bolesnog stanja ili poremećaja.
[0060] Kao šta se ovde koristi, termin "doza" se odnosi na kvantitet fuzionog polipeptida iz ovoga pronalaska koji se administrira nekom subjektu odjednom (unitarna doza), ili kroz dva ili više administriranja tokom definisanog vremenskog intervala. Na primer, doza može da se odnosi na kvantitet fuzionog polipeptida koji se administrira nekom subjektu tokom perioda od jednog dana (24 h) (dnevna doza), dva dana, jedne sedmice, dve sedmice, tri sedmice ili jedan ili više meseci (na primer, uz pomoć pojedinačnog administriranja, ili kroz dva ili više administriranja). Interval između doza može da bude bilo koja poželjena količina vremena.
[0061] Fraza "polu-život", se odnosi na vreme koje je potrebno da serumska koncentracija in vivo fuzionog polipeptida padne na 50%, na primer usled degradacije liganda i/ili klirensa ili sekvestracije dvojno-specifičnog liganda uz pomoć prirodnih mehanizama. Polu-život nekog fuzionog polipeptida je povećan ako postoji in vivo prisutnost u biološkoj matrici (krv, serum,
1
plazma, tkivo) tokom dužeg perioda u odnosu na odgovarajuću kontrolu. Polu-život može da se poveća za 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ili više u odnosu na odgovarajuću kontrolu.
[0062] Sekvence koje su slične ili homologne (na primer, barem oko 70% identičnosti) sa sekvencama koje su ovde opisane su takođe deo ovoga pronalaska. U nekim izvedbama, identičnost sekvence na nivou amino-kiselina može da iznosi oko 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više. Na nivou nukleinske-kiseline, identičnost sekvence može da bude oko 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više. Alternativno, dostatna identičnost postoji kada segmenti nukleinskekiseline hibridizuju u selektivnim uslovima hibridizacije (na primer, veoma strogi uslovi hibridizacije) sa komplementarnim lancem. Pomenute nukleinske-kiseline mogu da budu prisutne u celim ćelijama, u ćelijskom lizatu, ili u delomično prečišćenoj ili dostatno čistoj formi.
[0063] Određivanje "homologije" ili "identičnosti sekvence" ili "sličnosti" između dve sekvence (termini se ovde koriste kao sinonimi) se provodi kako sledi. Sekvence su poravnane sa ciljem optimalne uporedbe (na primer, jazovi mogu da se uvedu u jednu ili obe prve i druge amino-kiselinske ili nukleinske sekvence za optimalno poravnanje, a ne-homologne sekvence mogu da se odbace za potrebu uporedbe). U jednoj preferiranoj izvedbi, dužina referentne sekvenca poravnane za uporedbu je barem 30%, preferirano barem 40%, bolje barem 50%, još bolje barem 60%, a najbolje barem 70%, 80%, 90%, 100% od dužine referentne sekvence. Amino-kiselinski ostaci ili nukleotidi na odgovarajućim amino-kiselinskim pozicijama ili nukleotidnim pozicijama se tada upoređene. Kada je pozicija u prvoj sekvenci okupirana sa istim amino-kiselinskim ostatkom ili nukleotidom kao i u odgovarajućoj poziciji u drugoj sekvenci, tada su molekuli identični na toj poziciji (kao šta se ovde koristi, amino-kiselinska ili nukleinska "homologija" je ekvivalentna sa amino-kiselinskom ili nukleinskom "identičnosti"). Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje dele upoređene sekvence, uzimajući u obzir broj jazova, i dužinu svakog jaza, koji moraju da budu uvedeni za optimalno poravnanje dve sekvence. U slučaju cirkularno sličnih belančevina, sekvenca jednog od partnera treba da se odgovarajuće podeli i poravnana u dve sekcije kako bi se ostvarilo optimalno poravnanje funkcionalno ekvivalentnih ostataka koje je neophodno za izračunavanje procenta identičnosti.
1
[0064] Poravnanja i homologije amino-kiselinskih i nukleotidnih sekvenca, sličnost ili identičnost, kao šta je ovde definisano se preferirano pripremaju i određuju primenom algoritma BLAST 2 Sequences, uz korišćenje uobičajenih parametara (Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999)). Alternativno, za poravnanje sekvenca je korišćen BLAST-algoritam (verzija 2.0), uz parametre sa uobičajenim vrednostima. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) je heuristički algoritam za pretragu kojeg koriste programi blastp, blastn, blastx, tblastn, i tblastx; ovi programi pripisuju značaj svojim nalazima primenom statističkih postupaka opisanih od autora Karlin & Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8.
[0065] Osim ako je drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju uobičajena značenja koja su poznata stručnjacima (na primer, u oblasti ćelijske kulture, molekularne genetike, hemije nukleinskih-kiselina, hibridizacijskih tehnika i biohemiji). Standardne tehnike se koriste za molekularne, genetičke i biohemijske postupke (vidi Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izd. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. i Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4. izd., John Wiley & Sons, Inc.) i hemijske postupke.
Cirkularno permutiranje referentnog liganda
[0066] Cirkularno permutiranje je funkcionalno ekvivalentno sa postupkom uzimanja ravnolančanog molekula, fuzonisanja njegovih krajeva da se formira cirkularni molekul, a nakon toga i cepanja pomenutog cirkularnog molekula na različitim lokacijama sa ciljem da se formira novi ravno-lančani molekul sa različitim terminusima. Cirkularno permutiranje tako poseduje efekt esencijalne očuvanosti sekvence i identičnosti amino-kiselina belančevine uz generisanje novih terminusa na različitim lokacijama.
[0067] Konstruirane fuzione belančevine predviđeno treba da kombinuju korisne karakteristike dva polipeptida u jednoj belančevini, međutim, konstrukcija pomenute fuzione belančevine nosi sa sobom razne izazove i rizike. Često, funkcionalna aktivnost fuzione belančevine je kompromitirana u odnosu na ne-modifikovanu belančevinu verovatno zbog negativnog efekta fuzionog partnera na integritet tercijarne strukture same belančevine ili na njenu sposobnost da veže srodne partnere (na primer, zbog steričkih smetnja) kako bi se potaknula njihova biološka funkcija. Nadalje, ugradnja spejsera između fuzionih partnera može da poveća potencijal za
1
prijemčivost proteolize ili, u slučaju terapeutskih belančevina, takođe može da poveća potencijal za imunogenost; duži spejser, veći rizik. Tako, tokom generisanja fuzionih belančevina, važni ciljevi dizajniranja su očuvanje strukturnog integriteta fuzionog peptida, održavanje neometanog pristupa za vezanje na neophodne srodne partnere, i minimiziranje dužine spejserskih sekvenca. Prateći te ciljeve, primena cirkularne permutacije nekog liganda, kao šta je ovde opisana, obezbeđuje preferirane lokacije za fuzionisanje na drugu belančevinu.
[0068] Preferirane lokacije za nove terminuse su geometrijski, strukturno, i funkcionalno favorizovane (u odnosu na nativne terminuse) za fuziju željenog polipeptidnog fuzionog partnera, a smanjuju dužinu potrebnog spejsera. U jednoj izvedbi, lokacija novih terminusa je više proksimalno u odnosu na nativnu poziciju potencijalnog fuzionog partnera na kojeg se ligand normalno spaja tokom postepenog formiranja ćelijskog receptorskog aktivacionog kompleksa. Orijentacija modifikovanog liganda i fuzionog partnera u fuzionom polipeptidu može da bude optimalna kako bi poticala agonističku aktivnost liganda prema receptorskom aktivacionom kompleksu, ili kako bi obezbedila steričku smetnju za postepeno formiranje aktivacionog kompleksa pri čemu se obezbeđuje antagonizam prema pomenutom aktivacionom kompleksu.
[0069] Proces cirkularnog permutiranja IL6 je shematski ilustrovan na SL.2. Sastavni aminokiselinski ostaci nativne IL6-belančevine su numerisani uzastopno od 47 do 212 od aminoprema karboksi-terminusu.
[0070] Sa ciljem da se cirkularno permutira IL6, rekombinantni konstrukti su proizvedeni tako da su nativni amino- i karboksi-terminusi IL6 spojeni u pomoć linkerske sekvence, a novi amino- i karboksi-terminusi su konstruirani na amino-kiselinskim ostacima 182 i 180. (Sl. 2). Tako, cirkularna permutacija proizvodi novu linearnu belančevinu (IL-6 (182/180), aka Picasso3) koja, započinjući sa amino- prema karboksi-terminusu, sadrži segment iz originalne belančevine koji odgovara ostacima 182 do 212 (sada, 1 do 31) nakon čega sledi linker, a nakon toga segment originalne belančevine koji odgovara ostacima 49 do 180 (sada 39 do 107) (Sl.
2).
[0071] Važno je da se kreira permutacija nativnog liganda koja će zadržati biološku aktivnost nativne forme liganda uz istovremeno obezbeđivanje optimalnih terminusa za fuzionisanja željenog polipeptidnog fuzionog partnera. Ako novi terminusi prekidaju neki kritični region u
2
nativnoj belančevini, aktivnost može biti izgubljena. Slično, ako povezivanje originalnih terminusa uništava aktivnost, tada permutacija neće zadržati spomenutu biološku aktivnost. Tako, postoje dva uslova za kreiranje neke aktivne cirkularno-permutirane belančevine: 1) terminusi u nativnoj belančevini mora da budu locirani tako da njihovo povezivanje ne uništi njenu biološku aktivnost; i 2) mora postojati "mesto otvaranja" u kojem novi terminusi mogu da se formiraju bez da se uništi neki region koji je kritičan za sklapanje belančevine i bez da se uništi željena biološka aktivnost.
[0072] Novi N-terminus i C-terminus u modifikovanom ligandu ne smeju da prekidaju bilo koji vezni domen u modifikovanom ligandu koji je važan za vezanje ciljnog receptora.
[0073] Pomenuti modifikovani ligandi mogu da budu potpuno aktivni kao i originalni ligandi. Modifikovani ligandi mogu da poseduju pojačanu aktivnost u odnosu na originalne ligande. Pojačana aktivnost može da bude takva da je povećan vezni afinitet prema ciljnom receptoru.
[0074] Tako, opšte uzeto, dobri kandidati za cirkularno permutiranje su belančevine u kojima su terminusi originalne belančevine blizu i u dobroj orijentaciji. Terminusi originalne belančevine mogu da budu odvojeni 20 Å ili manje. Kada su terminusi prirodno smešteni bliže jedan drugome, očekivano je da je njihovo direktno fuzionisanje moguće pa će uvođenje linkera imati relativno mali efekt. Međutim, zbog toga šta linker može da bude bilo koje dužine, bliskost nativnih terminusa nije apsolutni uslov.
[0075] Poželjno je da se u permutiranoj belančevini koristi linkerska sekvenca koja omogućava udaljenost amino- i karboksi-terminusa i koja je uporediva sa udaljenošću između amino- i karboksi-terminusa koji se nalaze u ne-permutiranom ili nativnom molekulu. Linkerska sekvenca, sama za sebe, može da bude duga između barem oko jedne amino-kiseline do barem oko 10 amino-kiselina. Mali broj amino-kiselina iz oba terminusa može da se premesti (uvuče tj. podreže) kako bi se terminusi međusobno približili. Na primer, u kristalnom kompleksu IL-6 sa IL-6R i gp130, terminusi citokina IL6 su udaljeni 16 Å (Brevnova et al. (2003) Science 300:2102). Odstranjivanje prva dva N-terminalna ostatka, koji nisu važni strukturno ili funkcionalno, smanjuje udaljenost između pomenutih terminusa na 10.2 Å. Spoj koji dostatno obezbeđuje takvu udaljenost je ostvaren sa peptidom sekvencom SGGSGGG (SEQ ID NO: 14). Slično, preferirani linkeri za cirkularno-permutirane IL-1β i IL-2 su GGSGGSG i GG (SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 16).
[0076] Izbor mesta za otvaranje može da se provede na osnovu nekoliko uslova. Tamo gde je tro-dimenzionalna konformacija belančevine poznata ili predviđena, preferirana mesta za otvaranje će biti locirana u spojnim omčama ili regionima koji ne pokazuju visoko-regularnu tro-dimenzionalnu strukturu. Tako, preferirano je da mesta za otvaranje budu izabrana u regionima belančevine koji ne sadrže definisane sekundarne strukture poput alfa-heliksi, β-niti, i slično. Postupci za identifikovanje regiona sa definisanom sekundarnom strukturom na bazi amino-kiselinske sekvence su široko-dostupni preko Interneta. Nadalje, dostupni su razni programi za predviđanje tro-dimenzionalne strukture belančevina, a nedavno su pregledno opisano kod autora Nayeem et al., Protein Science, 808-24 (2006).
[0077] Kada je u cirkularno-permutiranom molekulu potrebno očuvanje ili poboljšanje bioaktivnosti nativnog molekula, preferirano je da mesto otvaranja ne bude uključeno direktno ili indirektno u interakcijama sa njegovim proteinskim partnerima. Izbor novog mesta za otvaranje preferirano ne prekida neki vezni domen koji je prisutan u nativnom ligandu i koji je direktno ili indirektno vezan sa veznim afinitet nativnog liganda prema njegovom ciljanom receptoru.
[0078] Alternativno, kada supstitucija nekih amino-kiselina ili modifikacija bočnih lanaca nekih amino-kiselina ne menja aktivnost belančevine, očekivano je da pomenute amino-kiseline nisu kritične za njenu aktivnost. Tako, amino-kiseline koje mogu da se mutiraju (in vitro) ili su u stvari modifikovani in vivo, uz mali uticaj na aktivnost belančevine, su potencijalno dobri kandidati za mesta otvaranja. Preferirana mesta otvaranja u IL-6 se nalaze između ostataka 131 i 135 i između ostataka 180 i 182. Preferirano mesto otvaranja u IL-1β se nalazi između ostataka 179 i 180, a takođe između ostataka 223 i 224. Preferirano mesto otvaranja u IL-2 se nalazi između ostataka 94 i 95.
[0079] Kada je belančevina član neke porodice sličnih belančevina u nekoj vrsti, može se smatrati da su visoko-konzervisane sekvence kritične za biološku aktivnost, dok varijabilni regioni nisu. Slično, može se smatrati da visoko-konzervisane sekvence belančevine koja je funkcionalno-konzervisana u raznim vrstama sisara, naročito ako postoji inter-vrsna farmakološka aktivnost, su kritične za biološku aktivnost. Preferirana mesta otvaranja se tada biraju u regionima belančevine koji ne pokazuju visoko-konzervisanu sekvencnu identičnost između raznih članova proteinske porodice, unutar same porodice ili između raznih vrsta.
Alternativno, preferirana mesta otvaranja koja su identifikovana u nekoj belančevini obezbeđuju dobre pretpostavljene lokacije za mesta otvaranja u homolognim belančevinama. Postupci za određivanje identičnosti sekvenca su dobro poznati stručnjacima, a ovde su opisani iznad.
[0080] Stručnjacima je jasno da mogu da se uvedu i druge modifikacije. Tako, na primer, mogu da se uvedu amino-kiselinske supstitucije koje povećavaju specifičnost ili vezni afinitet liganda koji je modifikovani primenom cirkularnog permutiranja. Tako, kada postoje regioni u ligandu koji sami za sebe nisu uključeni u aktivnosti liganda, pomenuti regioni mogu da se eliminišu ili zamene sa kraćim segmentima koji služe samo za održavanje pravilnih prostornih odnosa između liganda i belančevina sa kojima pomenuti treba da reaguje.
[0081] Kod brojnih nativnih liganda (na primer, faktori rasta, citokini, i druge belančevine), karboksi- i amino-terminusi su smešteni tako da kada su fuzioni polipeptidi formirani spajanjem sa drugim polipeptidom ili molekulom preko bilo kojeg terminusa nativnog liganda, željena nizvodna aktivnost ovog drugog polipeptida je značajno smanjena ili ne postoji. Sklapanje ili steričke smetnje aberantne belančevine se često pripisuju smanjenoj ili nedostatku aktivnosti u ovom drugom polipeptidu. U drugim slučajevima, fuzionisanje drugog polipeptida na bilo koji terminus nativne belančevine je tolerisano (tj. funkcionalna aktivnost nativne belančevine nije značajno narušena), međutim orijentacija fuzionog polipeptida ne donosi željenu aktivnost fuzionoj belančevini, kao u slučaju kada je fuzioni polipeptid namenjen da interferiše (tj. antagonizuje) sa formiranjem signalnog kompleksa preko steričkih smetnji pri čemu lokacija fuzionog polipeptida zauzima prostor kojeg treba da zauzme nizvodni signalni molekul tokom sklapanja aktivnog signalnog kompleksa.
[0082] Suprotno, cirkularno permutiranje liganda, kao šta je ovde opisano, obezbeđuje načine za promenu liganda kako bi se proizveli novi karboksi- i amino-terminusi koji omogućavaju fuzionisanje na drugi molekul ili polipeptid bez umanjivanja specifičnosti i veznog afinitet promenjenog liganda u odnosu na njegovu nativnu formu, a to takođe omogućava da drugi fuzionisani molekul ili polipeptid obezbedi, na primer, super-agonizam ili antagonizam prema signalnom aktivacionom kompleksu. Fuzioni polipeptid može da pretvori neki nativni ligand, koji je agonist ciljnog signalnog aktivacionog kompleksa, u antagonistu pomenutog signalnog aktivacionog kompleksa. To je ilustrovano u kontekstu citokina, IL-6, na Sl.1-5.
2
[0083] Fuzioni polipeptidi koji se sastoje od cirkularno-permutiranog liganda fuzionisanog na nekom fuzionom partneru, mogu da pojačavaju vezni afinitet fuzionog polipeptida prema nativnom receptoru nativnog liganda u odnosu na vezni afinitet samog nativnog (nefuzionisanog, ne-modifikovanog, ne-permutiranog) liganda prema njegovom nativnom receptoru. Na primer, Primer 3 upoređuje vezni afinitet prema IL6-receptoru sa, 1) fuzionim polipeptidom koji se nalazi u cirkularno-permutiranom IL6 fuzionisanom na domen jednog od transmembranskih signalnih molekula gp130, sa 2) nativnim IL-6. Vezni afinitet fuzionog polipeptida je više od 200-puta veći od veznog afiniteta nativnog IL6 prema IL6-receptoru (Sl.
6A i 6C).
Fuzioni polipeptidi
[0084] Ovde su opisani novi fuzioni polipeptidi koji sadrže cirkularno-permutirane (modifikovani) ligande i barem jedan polipeptidni fuzioni partner, pri čemu pomenuti fuzioni polipeptid opciono poseduje specifičnost i vezni afinitet koji je veći od specifičnosti i veznog afiniteta nativnog (ne-permutiranog) liganda prema njegovom nativnom ciljanom receptoru. Osim toga, pomenuti fuzioni polipeptid može, na primer, da bude dodatno izmenjen da se generira antagonist puta u kojem pomenuti nativni ligand funkcionira kao agonist preko vezanja na ciljani receptor kao šta je ovde opisano.
[0085] Mnogi receptori vežu nativne ligande i klasteriraju, tj., formiraju dimere, trimere ili multimere, nakon vezanja svojih nativnih liganda (dimerni ili multimerni receptor). Na primer, IL-1 porodica citokina, faktori rasta fibroblasta, i citokini sa 4-heliksa formiraju multimerne signalne komplekse za ugrađivanje raznih i brojnih liganada i receptora (Sl. 9). Ligandindukovano klasteriranje (na primer, dimerizacija, multimerizacija) često dovodi do komplekasa sa višim afinitetom i potiče prenos signala. U skladu sa time, fuzioni polipeptidi mogu, na primer, da antagonizuju signaliziranje uz pomoć, nar primer, inhibiranja vezanja na nativni ligand, ili inhibiranja klasteriranja receptora (na primer, dimerizacija, trimerizacija, multimerizacija) sa ili bez istovremenog inhibiranja vezanja nativnog liganda (Sl. 10). Alternativno, fuzioni polipeptidi mogu da potaknu signaliziranje uz pomoć, na primer, ubrzavanja napredovanja procesa klasteriranja, preko generisanja liganada sa većim afinitetom za ciljane receptore ili pre-povezivanja komponenata koje vodi ka formiranju signalnog kompleksa. Fuzioni polipeptidi mogu da vežu monomerni ligand ili receptor, ili dimerni, ili multimerni kompleks i mogu da inhibiraju ili pojačaju jedan ili više koraka tokom sklapanja signalnih komplekasa čime inhibiraju ili pojačavaju prenos signala u nekom ćelijskom putu.
[0086] Na primer, u postepeno sklapanju viših komplekasa koji dovode do finalnog aktivnog kompleksa kao šta je prikazao u Shemi 1, koja shematski predstavlja put signaliziranja sa IL-2 pri čemu IL-2 je "A", IL-2Rα je "B", IL-2Rβ je "C", a yc je "D":
Shema 1:
A+B → AB (korak 1);
AB C → ABC (korak 2);
ABC D → ABCD (korak 3);
pri čemu ABCD je signalni kompleks, a signaliziranje je potaknuto dovođenjem C i D u poziciju proksimalno jedan prema drugom (signalni kompleks je ilustrovan na Sl.9, a struktura spoljnoćelijskih komponenta kompleksa u Sl.8).
[0087] Pre-sklopljeni, jednolančani 'AB' se očekuje da je super-agonist jer će posedovati viši afinitet prema C u odnosu na A ili B čime će tako olakšati sklapanje ABCD kod nižih koncentracija. U slučaju kada nativni terminusi "A" nisu u pozicijama da omoguće fuzionu belančevina, fuziona belančevina liganda "A", koja je bila modifikovana primenom cirkularnog permutiranja u skladu sa ovim pronalaskom kako bi bila optimalno orijentisana kako bi mogla da se fuzioniše sa "B", omogućava generisanje jednolančane 'AB' belančevine. Slika 8 ilustruje ovo za slučaj konstruisanog IL-2 super-agonistu (RDB1405; SEQ ID NO: 12 (belančevina) i SEQ ID NO: 13 (DNA)). Na aktivisane T-ćelije, IL-2 signalizuje preko 'visoko-afinitetnog' kvaternarnog kompleksa koji se sastoji od IL-2, IL-2Rα (takođe označen kao CD25), IL-2Rβ i yc (Sl.8A). Mada IL-2 može da se veže puno slabije na IL-2Rβ u odsutnosti IL-2Rα, vezanje IL-2Rα na IL-2 stabilizuje konformaciju IL-2 za prezentaciju IL-2Rβ sa puno većim afinitetom. γc je tada nanesen na kompozitnu površinu koja je formirana sa IL-2/IL-2Rβ kompleksom. Ekspresija fuzione belančevine nativnog IL-2 sa IL-2Rα je izazovna zbog toga šta se terminusi IL-2 nalaze na polarnoj suprotnoj strani sa kojom reaguje IL-2Ra, a to zahteva da spejser premosti više od 50Å i verovatno uništi sposobnost fuzione belančevine da se veže (Sl.8A, IL-
2
2 terminusi su na dnu udaljavajući se od IL-2Rα gore). U stvari, IL-2/IL-2Rα fuziona belančevina sa dužim spejserom je nedavno bila opisana, ali je nesposobna da prenosi signal u odsutnost proteazom-posredovanog cepanja linkera uz naknadno oslobađanje IL-2 (Puskas et al., Immunology, 133(2), 206-220 (2011)). Terminusi cirkularno-permutiranog IL-2(95/94) su konstruirani da se nalaze na licu, proksimalno od veznog interfejsa za IL-2Rα, koje značajno smanjuje dužinu spejsera koji je potreban da se generiše fuziona belančevina koja može da se sklopi u aktivisani kompleks i može da funkcionira kao super-agonist (Sl. 8B) (udaljenost između konstruiranog C-terminusa iz cirkularno-permutiranog IL-2 i N-terminusa iz IL-2Rα iznosi oko 11Å; dizajnirani fuzioni konstrukt, RDB1405 sadrži spejser od 6 amino-kiselina između IL-2 i IL-2Rα).
[0088] Alternativno, postepeno sklapanje multimernih aktivacionih kompleksa za prenos signala nudi mogućnost da se konstruišu potentni antagonisti. U ovom slučaju, ligand je modifikovan primenom cirkularne permutacije sa ciljem da se obezbedi N- ili C-terminus koji olakšavaju povezivanje fuzionog partnera u orijentaciji koja sterički ometa postepeno formiranje nekog multimernog aktivacionog kompleksa ciljanog receptora, a u nekim slučajevima pomenuti fuzioni partner može nadalje da poveća vezni afinitet prema ciljanom receptoru, ako je, na primer, pomenuti fuzioni partner neka belančevina ili domen koja u sebi sadrži vezne determinante prema ciljanom receptoru. Ovaj drugi slučaju je ilustrovan u kontekstu citokina, IL-6, u Sl. 1-5 i 10. U ovom primeru, fuzioni polipeptid obuhvata cirkularno-permutirani interleukin 6 (IL-6) fuzionisan na neki polipeptid koji sadrže D1-domen transmembranskog receptora gp130, koji je prirodna komponenta heksamernog IL-6 signalnog kompleksa. Pomenuti cirkularno-permutirani ligand (RDB1503) (Sl.2), u odsutnosti fuzionog partnera, zadržava identičnu agonističku aktivnost kao i divlji-tip IL-6 (Sl.4), pa tako zadržava i mogućnost neophodnih interakcija sa IL-6Rα i gp130. Pomenuti heksamerni signalni kompleks IL-6 je sastavljen od 2 molekula, svaki IL-6, IL-6Rα, i gp130 (Sl. 1). Signal je potaknut preko citoplazmatskog domena dva gp130 molekula kada se združe dva heterotrimera (svaki sa jednim molekulom od svakog IL-6, IL-6Rα, i gp130) (Sl.1). Pokretna snaga finalnog koraka u formiranju kompleksa su simetrične interakcije između D1-domena gp130 iz jednog heterotrimera sa IL-6 i IL-6Rα izu drugog heterotrimera. Fuzionisanje D1-domena gp130 na nativni IL-6 orijentira D1-domen od gp130-interfejsa (Sl. 3A) i rezultuje belančevinom (RDB1529) koja ne antagonizuje IL-6-posredovano signaliziranje (Sl. 5). Suprotno, fuzionisanje D1-domena na cirkularno-permutirani IL-6 (RDB1527) orijentira D1 tako da može da reaguje sa IL-6Rα na analogan način prema heksamernom kompleksu, i šta je važnije sterički
2
spreči vezanje D1-domena iz drugog heterotrimera (Sl. 3B), a to omogućava da je potentan antagonist IL-6-posredovanog signaliziranja (Sl. 5). Budući da CP_IL-6_D1 fuziona belančevina sada sadrži novo-kombinovane IL-6Rα vezne determinante ne-modifikovanog IL-6 i nativnog gp130-D1-domena u jednom polipeptidu, vezni afinitet fuzionog polipeptida je izmeren i iznosi 40 pM, više od 200-puta veći no veznog afiniteta nativnog IL6 prema IL-6Rα (Sl. 6A i 6C).
[0089] Ovde su opisani fuzioni polipeptidi koji sadrže modifikovani ligand i prvi fuzioni partner pri čemu je pomenuti prvi fuzioni partner modifikovanog liganda izveden iz cele ili dela neke belančevine sa dodatnim veznim determinantama prema ciljnom receptoru, na primer kao u slučaju belančevine ili domena koji je komponenta nekog prirodnog multimernog signalnog kompleksa, pri čemu pomenuti prvi fuzioni partner sterički sprečava sklapanje punog signalnog kompleksa, zbog čega deluje kao antagonist.
[0090] Pomenuti ligandi koji su modifikovani primenom cirkularnog permutiranja i koji sadrže fuzione polipeptide uključuju rastvorljive belančevine čije vezanje na receptore na površini ćelije potiče signalnu kaskadu ili služe kao prirodno-negativni regulatori neke signalne kaskade (na primer, antagonisti), uključujući, ali bez ograničenja, citokine, hemokine, adipokine, faktore rasta, hormone, rastvorljive receptore, belančevine koje vežu citokin (na primer, IL-18bp).
[0091] Preferirani ligandi i belančevine modifikovane primenom cirkularnog permutiranja koji sadrže fuzioni polipeptidi uključuju belančevine heliksni svežanj i citokine (uključujući, ali bez ograničenja, hormone rasta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-22, IL-23p19, IL-11, IL-13, IL-15, IL-12p35, IL-21, IL-30 (IL27p28), IL-34, IL-35, IL-35p35, IFN-β, IPNγ, LIF, CNTF, onkostatin M, CLCF-1, GCSF, GM-CSF, EPO, feritin, leptin, placentalni laktogen, prolaktin, apolipoprotein e), b-trefoil belančevine (uključujući, ali bez ograničenja, IL-1α, IL-1β, IL-1Ra, IL18, IL-33, IL-36Ra, IL-36a, IL-36b, IL-36g, IL-37, IL-38, ILIHy2, FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8a, FGF-8b, FGF-8e, FGF-8f, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14, FGF-16, FGF-17, FGF-18, FGF-19, FGF-20, FGF-21, FGF-22, FGF-23), α/β (TIM) barel-belančevine (uključujući, ali bez ograničenja, triosefosfat izomerazu), beta-sendvič belančevine (uključujući, ali bez ograničenja, galektin-1, galektin-3, TNF-beta, sedam β-propeler belančevine, α1α2-domen klase 1 MHC, I-domen iz integrina, GYF-domen, C1-domen, C2-domen (na primer, iz cPLA2, PKC, sinaptotagmin), PDZ-domeni, C3d, C5a.
2
[0092] Pomenuti ligand modifikovan primenom cirkularnog permutiranja koji sadrži pomenute fuzione polipeptide je preferirano izabran iz IL-6, IL-2, IL-15, IL-1α, IL-1β, IL-IRa, IL-18, FGF-19, FGF-21, FGF-23.
[0093] Ligandi modifikovani primenom cirkularnog permutiranja koji sadrže pomenute fuzione polipeptide mogu da poseduju veznu specifičnost za neki receptor, ili za receptor koji veže nativni ligand iz sledeće liste: ApoE, Apo-SAA, BDNF, kardiotrofin-1, EGF, EGF receptor, ENA-78, eotaksin, eotaksin-2, eksodus-2, FGF-kiseli, FGF-bazni, faktor-10 rasta fibroblasta, FLT3 ligand, fraktalkin (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, insulin, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), inhibin α, inhibin β, IP-10, faktor-2 rasta keratinocit (KGF-2), KGF, leptin, LIF, limfotaktin, antimilerijanski hormon, inhibitorni faktor monocitne kolonije, belančevina koja privlači monocite, M-CSF, MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, faktor-1 inhibitor mijeloidnih progenitor ćelija (MPIF-1), NAP-2, neurturin, faktor rasta živaca, β-NGF, NT-3, NT-4, onkostatin M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, faktor matičnih ćelija (SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, faktor nekroze tumora (TNF), TNF-α, TNF-β, TNF receptor I, TNF receptor II, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF receptor 1, VEGF receptor 2, VEGF receptor 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER1, HER2, HER3, i HER4.
[0094] Dodatni receptori koji pomenuti modifikovani ligand može da veže specifično uključuju receptore iz sledeće liste, ili neki receptor koji veže nativni ligand uključuje one u sledećoj listi: EpoR, TACE mesto prepoznavanja, TNF BP-I, TNF BP-II, IL-1R1, IL-6R, IL-10R, IL-18R, IL-1, IL-19, IL-20, IL-21, IL-23, IL-24, IL-25, IL-27, IFN-γ, IFN-α/β, CD4, CD89, CD19, HLA-DR, CD38, CD138, CD33, CD56, CEA, i VEGF-receptor.
[0095] Dodatni receptori koje pomenuti modifikovani ligandi iz fuzionih polipeptida mogu da specifično vežu uključuju receptor-peptid za oslobađanje gastrina, neurotenzinski receptor, adrenomedulinski receptor, H2 histaminski receptor, HCG-receptor, MET-receptor, svingozin 1-fosfatni receptor, CD126, CD213a1, i KDR, između ostalih.
2
[0096] Modifikovani ligand iz pomenute polipeptidne fuzione belančevine može da poseduje veznu specifičnost za receptor koji dimerizuje nakon vezanja na nativni ligand (dimerni receptor), ili receptor koji formira multimere, poput trimera, nakon vezanja na nativni ligand (multimeran receptor). Mnogi citokinski receptori i receptori za faktore rasta, poput članova superporodice TNF-receptora (na primer, TNFR1, TNFR2) i članova porodice receptora tirozin kinaze (na primer, EGFR, PDGFR, M-CSF-receptor (c-Fms)), formiraju dimere ili multimere nakon vezanja na njihove nativne ligande. Superporodica TNF-receptora je stanju tehnike poznata grupa belančevina koja uključuje TNFR1 (p55, CD120a, p60, član 1A superporodica TNF-receptora, TNFRSF1A), TNFR2 (p75, p80, CD120b, član 1B superporodice TNF-receptora, TNFRSF1B), CD (TNFRSF3, LTβR, TNFR2-RP, TNFR-RP, TNFCR, TNF-R-III), OX40 (TNFRSF4, ACT35, TXGP1L), CD40 (TNFRSF5, p50, Bp50), Fas (CD95, TNFRSF6, APO-1, APTI), DcR3 (TNFRSF6B), CD27 (TNFRSF7, Tp55, S152), CD30 (TNFRSF8, Ki-1, D1S166E), CD137 (TNFRSF9, 4-1BB, ILA), TRAILR-1 (TNFRSF10A, DR4, Apo2), TRAIL-R2 (TNFRSF10B, DR5, KILLER, TRICK2A, TRICKB), TRAILR3 (TNFRSF10C, DcR1, LIT, TRID), TRAILR4 (TNFRSF10D, DcR2, TRUNDD), RANK (TNFRSF11A), OPG (TNFRSF11B, OCIF, TR1), DR3 (TNFRSF12, TRAMP, WSL-1, LARD, WSL-LR, DDR3, TR3, APO-3), DR3L (TNFRSF12L), TAC1 (TNFRSF13B), BAFFR (TNFRSF13C), HVEM (TNFRSF14, ATAR, TR2, SVETLOR, HVEA), NGFR (TNFRSF16), BCMA (TNFRSF17, BCM), AITR (TNFRSF18, GITR), TNFRSF19, FLJ14993 (TNFRSF19L, RELT), DR6 (TNFRSF21), SOBa (TNFRSF22, Tnfrh2, 2810028K06Rik), i mSOB (THFRSF23, Tnfrh1). Pomenuta porodica receptora tirozin kinaze je stanju tehnike poznata grupa belančevina koja uključuje EGFR (ERBB1, HER1), PDGFR, c-Fms, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, insulinski receptor, i receptore faktora rasta sličnom insulinu (IGF1R, IGF2R). Vidi, Grassot et al., Nucleic Acids Research, 31(1):353-358 (2003).
[0097] Pomenuti prvi polipeptidni fuzioni partner može da obuhvata celi ili deo spoljnoćelijskih domena prirodnih receptora ili pomoćnih belančevina za hormon rasta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, IL-22, IL-23, IL-30 (IL27p28), IL-34, IL-35, IFN-β, IFNγ, LIF, CNTF, onkostatin M, CLCF-1, GCSF, GM-CSF, EPO, placentalni laktogen, prolaktin, apolipoprotein, IL-1α, IL-1β, IL-1Rα, IL18, IL-33, IL-36Ra, IL-36a, IL-36b, IL-36g, IL-37, IL1Hy2, FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8a, FGF-8b, FGF-8e, FGF-8f, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14, FGF-16, FGF-17, FGF-18, FGF-19, FGF-20, FGF-21, FGF-22, FGF-23, TNF-beta.
2
[0098] Pomenuti fuzioni partner je preferirano spoljno-ćelijski domen ili je njegov domen izabran iz gp130 (najbolje, D1-domen), IL-2Rα, IL-15Rα, IL-1RI, IL-1RII, IL-18Rα, IL-18Rβ, IL1RAcP, FGFR1b, FGFR1c, FGFR2b, FGFR2c, FGFR3b, FGFR3c, FGFR4, α-klotho, i βklotho.
[0099] Pomenuta belančevina modifikovana primenom cirkularnog permutiranja koja sadrži pomenute fuzione polipeptide i pomenuti fuzioni partner mogu da dolaze iz iste originalne belančevine tako da fuzioniranje generiše jednolančani "homodimer".
[0100] Pomenuti fuzioni partner cirkularno-permutiranom polipeptidu može takođe da zahteva cirkularno permutiranje kako bi se omogućilo fuzionisanje. Oba partnera pomenute fuzione belančevine iz ovoga pronalaska mogu da budu cirkularno permutirani, ako je potrebno.
[0101] Polipeptidni fuzioni partner može da obezbedi druge nove ili poboljšane/pojačane funkcije ili ponašanja samog fuzionog polipeptida. Osim toga, ili alternativno, fuzionom polipeptidu iz ovoga pronalaska može da se doda drugi fuzioni partner sa ciljem da se obezbede neke druge nove i poboljšane/pojačane funkcije ili ponašanje samom fuzionom polipeptidu iz ovoga pronalaska. Na primer, pomenuti fuzioni partneri mogu da obezbede produženi poluživot fuzionom polipeptidu iz ovoga pronalaska. Adicija fuzionih partnera sa ciljem produživanja in vivo polu-života je naročito korisna kada je fuzioni polipeptid iz ovoga pronalaska takve veličine da brzo nestaje iz tela, koje može da ograniči kliničku upotrebu.
[0102] Polipeptid iz ovoga pronalaska može da bude modifikovan tako da poseduje veću hidrodinamičku veličinu uz pomoć, na primer, kuplovanja na polimere ili ugljene hidrate (poput polietilenglikola (PEG), sijalinske kiseline, ili hidroksietil skroba), ugradnja mesta za N-glikozilaciju, ili preko rekombinantnih PEG-mimetika proizvedenih fuzijom dugih, fleksibilnih polipeptidnih sekvenca, poput onih opisanih u dokumentu U.S. 2010/0239554 A1, Hidrodinamička veličina polipeptidne fuzione belančevine iz ovoga pronalaska može da se odredi primenom postupaka koji su dobro poznati stanju tehnike. Na primer, gel-filtracijska hromatografija može da se koristi za određivanje pomenute hidrodinamičke veličine. Prikladne gel-filtracijske matrice za određivanje pomenutih hidrodinamički veličina liganada, poput unakrsno-spojenih agarozih matrica, su dobro poznate i lako dostupne.
[0103] U jednoj preferiranoj izvedbi, fuzioni polipeptid iz ovoga pronalaska je dizajniran da se ugradi u polipeptid sa mucinskim domenom kao šta je opisano u dokumentu USSN 61/657,264 pod naslovom "Fuzioni polipeptidi koji sadrže aktivnu belančevinu spojenu na polipeptid sa mucinskim domenom", koji je podnesen istovremeno kao i ovaj dokument, i koji ima pristupni (attorney docket) broj 4000.3058 US.
[0104] U jednoj izvedbi, fuzioni polipeptid iz ovoga pronalaska može da bude fuzionisan na belančevine, proteinske domene, ili peptide koji potiču serumski polu-život preko FcRnposredovanog recikliranja, uključujući imunoglobuline, Fc-domen imunoglobulina (najbolje, IgG1 i IgG2), serumske albumine, serumske albumin-domene (najbolje, DIII), peptide sa veznim afinitetom prema FcRn, ili belančevine ili peptide sa veznim afinitetom prema imunoglobulinima ili serumskom albuminu (poput nanotela).
[0105] Postupci za farmakokinetičku analizu i određivanje polu-života liganda su poznati stručnjacima. Detalji mogu da se pronađu kod autora Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists i kod autora Peters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996). Valjana referenca je takođe "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, objavljena od strane Marcel Dekker, 2. rev. ekstra-izdanje (1982), koji opisuju farmakokinetičke parametre poput t-alfa i t-beta polu-živote i površinu ispod krive (AUC).
[0106] U jednoj izvedbi, fuzioni polipeptid iz ovoga pronalaska može da se fuzioniše na belančevine, proteinske domene, ili peptide koji specifično ciljaju (tj. imaju afinitet prema) specifične organe, tkiva, ćelije, ili fiziološke matrice (poput kolagena), ugljene hidrate, ili lipide kao sredstva za lokalizovanje, distribuiranje, ili zadržavanje fuzionog polipeptida iz ovoga pronalaska u nekom naročitom regionu tela.
[0107] Dodatne sekvence takođe mogu da se uključe kao deo pomenutog fuzionog polipeptida poput afinitetne sekvence-privesci koji omogućavaju olakšano prečišćavanje ili izolaciju pomenutog fuzionog polipeptida poput onih koji su poznati stanju tehnike. Sekvence za stabilnost takođe mogu da se dodaju pomenutom fuzionom polipeptidu kako bi se zaštitio sam molekul od degradacije (na primer, uz pomoć proteaza). Prikladne sekvence za stabilnost uključuju, ali bez ograničenja, glicinske molekule ugrađene nakon inicijacijskog metionina (na primer, MG (SEQ ID NO: 17), ili MGG (SEQ ID NO: 18) sa ciljem zaštite samog fuzionog
1
molekula od ubikvitacije; dva prolina ugrađena na C-terminusu (koji donose zaštitu od delovanja karboksipeptidaze), i slično.
[0108] Sa ciljem testiranja biološke aktivnosti, vezne specifičnosti i veznog afiniteta nekog fuzionog polipeptida iz ovoga pronalaska, može da se primenjuje neki odgovarajući biološki test. Testovi za biološku aktivnost raznih tipova su dobro poznati stručnjacima. Određeni test zavisi o specifičnoj aktivnosti samog molekula.
Priprema cirkularno-permutiranih belančevina
[0109] Cirkularno-permutirane belančevine mogu da se pripreme primenom raznih načina koji su poznati stručnjacima. Pomenuti uključuju hemijsku sintezu, modifikaciju postojećih belančevina, i ekspresiju cirkularno-permutiranih belančevina uz pomoć metodologije rekombinantne DNA.
Kada je belančevina relativno kratka (tj., manja od oko 50 amino-kiselina), cirkularnopermutirana belančevina može da se sintetizuje primenom standardnih tehnika hemijske sinteze peptida. Ako je linker neki peptid, pomenuti može da se ugradi tokom sinteze. Ako linker nije peptid, pomenuti može da se kupluje sa peptidom nakon njegove sinteze. Sinteza na čvrstoj fazi u kojoj se C-terminalna amino-kiselina iz sekvence veže na ne-rastvorljivu podlogu nakon čega sledi uzastopna adicija preostalih amino-kiselina u sekvenci je preferirani postupak za hemijsku sintezu cirkularno-permutiranih liganada i fuzionih belančevina iz ovoga pronalaska. Tehnike za sintezu na čvrstoj fazi su opisane kod autora Barany & Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; str. 3-284 u The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. vol.2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963), i Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2. izd. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984).
[0110] Alternativno, cirkularno-permutirana belančevina može da se proizvede primenom hemijskog modifikovanja neke nativne belančevine. Generalno, ovo zahteva reagovanje pomenute nativne belančevine u prisutnosti linkera sa ciljem da se formiraju kovalentne veze između pomenutog linkera i karboksi- i amino-terminusa pomenute belančevine, pri čemu nastaje neka cirkularna belančevina. Novi terminusi su tada formirani uz pomoć otvaranja peptidne veze koja spaja amino-kiseline na nekoj drugoj lokaciji. Ovo može da se postigne hemijskim ili encimskim postupkom, na primer, uz pomoć neke peptidaze.
2
[0111] U jednoj preferiranoj izvedbi, cirkularno-permutirana belančevina, ili fuzioni polipeptidi koji sadrže cirkularno-permutiranu belančevinu fuzionisanu na barem jedan fuzioni partner, se sintetizuju primenom metodologije rekombinantne DNA. Generalno to podrazumeva kreiranje DNA sekvence koja kodira pomenuti cirkularno-permutirani ligand (ili celi fuzioni polipeptid koji sadrži pomenute cirkularno-permutirani ligand i fuzioni partner), stavljanje pomenute DNA u neki ekspresioni vektor pod kontrolom nekog promotora, eksprimiranje pomenute belančevine u nekom domaćinu, izolovanje pomenute eksprimirane belančevine i, ako treba, renaturiranje pomenute belančevina.
[0112] DNA koja kodira pomenuti cirkularno-permutirani ligand može da se proizvede uz pomoć sinteze gena, ili uz pomoć postupaka amplifikacije DNA, na primer lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i lančanom reakcijom polimeraze uz pomoć reverzne transkripcije (RT-PCR). Opciono može da se doda i DNA koja kodira signalnu sekvencu koja pravilno procesuiranoj cirkularno-permutiranoj fuzionoj belančevini omogućava izlučivanje iz ćelije.
[0113] Stručnjak razume da pomenuti cirkularno-permutirani ligand i drugi molekul koji čine fuzione polipeptide iz ovoga pronalaska mogu da budu međusobno spojeni u bilo kojem redosledu. Tako, pomenuti drugi molekul je preferirano spojen na amino- (N-terminalna fuzija) ili karboksi- (C-terminalna fuzija) terminus pomenutog cirkularno-permutiranog liganda.
[0114] Pomenuti cirkularno-permutirani ligandi druge fuzione belančevine mogu da se eksprimiraju u raznim ćelijama domaćinima, uključujući E. coli, druge bakterijske domaćine, kvasce, i razne više eukarotske ćelije poput as COS-, CHO- i HeLa-ćelijskih linija i linije ćelija mijeloma. Gen rekombinantne belančevine je operativno spojen na odgovarajuće sekvence za kontrolu ekspresije specifične za svakog domaćina. Za E. coli to podrazumeva promotor poput T7, trp, ili lambda-promotora, mesto za vezanje na ribosom i preferirano neki signal za zaustavljanje transkripcije. Za eukariotske ćelije, kontrolne sekvence uključuju promotor i preferirano pojačivač izveden iz imunoglobulinskih gena, SV40, citomegalovirusa, itd., i neku poliadenilacijsku sekvencu, a mogu da uključuju još donorske i akceptorske sekvence za splajsovanje.
[0115] Plazmidi iz ovoga pronalaska mogu da se prenesu (transfektuju) u izabrane ćelije domaćina uz pomoć dobro poznatih postupaka poput transformiranja sa kalcijum hloridom u slučaju E. coli i tretmana sa kalcijum fosfatom, elektroporacije, tretmana sa lipofektaminom, ili PEI-tretmana u slučaju ćelija sisara. Ćelije transformirane sa plazmidima mogu da se selekcioniraju uz pomoć rezistencije na antibiotike preko gena koji se nalaze u samim plazmidima, poput amp, gpt, neo i hyg gena.
[0116] Jednom kada se eksprimiraju, pomenute rekombinantne fuzione belančevine mogu da se prečiste primenom standardnih procedura poznatih stanju tehnike, uključujući precipitaciju sa amonijum sulfatom, afinitetnu hromatografiju, kolonsku hromatografiju sa jonskim ili hidrofobnim punjenjima, gel-elektroforezu i slično (vidi, R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology, vol.182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y. (1990)). Dostatno čiste kompozicije sa barem oko 90-95% čistoće su preferirane, a 98-99% ili veća čistoća je najbolja za farmaceutske primene. Jednom kada su prečišćeni, polipeptidi mogu da se testiraju na prekliničkim modelima, testiraju klinički, ili da se primenjuju terapeutski.
[0117] Stručnjaci znaju da se modifikacije mogu unositi u cirkularizovanu sekvencu belančevine bez umanjivanja njene biološke aktivnosti. Neke modifikacije mogu da se uvedu sa ciljem da se olakša kloniranje, ekspresija, ili ugradnja cirkularno-permutiranog liganda u neku fuzionu belančevinu. Takve modifikacije su dobro poznate stručnjacima i uključuju, dodavanje ostataka na primer, metionin dodan na amino-terminus kako bi se obezbedilo mesto za inicijaciju, ili dodatne amino-kiseline smeštene na bilo kojem terminusu kako bi zaštitile belančevinu od egzopeptidaza. Na primer, cirkularno-permutirani IL6 može opciono da sadrži jedan dodatan kodon za metionin (Met) na amino-terminusu kako bi se obezbedilo mesto za inicijaciju translacije.
[0118] Stručnjaci znaju da mogu da se uvode i druge modifikacije. Tako, na primer, aminokiselinske supstitucije mogu da se uvedu sa ciljem povećavanja specifičnosti ili veznog afiniteta cirkularno-permutirane belančevine, itd. Alternativno, ne-esencijalni regioni molekula mogu da se skrate ili potpuno eliminišu. Tako, kada postoje regioni u molekulu koji sami za sebe nisu uključeni u aktivnost molekula, pomenuti mogu da budu eliminisani ili zamenjeni sa kraćim segmentima koji služe za održavanje tačnih prostornih odnosa između aktivnih komponenata u molekulu.
4
[0119] Dve belančevine mogu da budu međusobno fuzionisane ili spojene uz pomoć peptidnog spejsera. Ovaj peptidni spejser može da bude dugačak od oko 1 do 40 ostataka. U jednoj preferiranoj izvedbi, ovaj peptidni spejser je dugačak 20 Å ili manje.
[0120] Generalno, pomenuti spejser nema biološku aktivnost sam za sebe, a njegova funkcija je da veže i obezbedi određenu distancu između dve aktivne belančevine koje čine pomenutu fuzionu belančevinu. Međutim, stručnjak razume da ostaci spejsera mogu da budu izabrani da optimizuju karakteristike same fuzione belančevine. Na primer, spejser koji sadrži polarne ili nabijene ostatake u sebi može da potiče rastvorljivost u vodenim rastvorima. Slično, ostaci spejsera mogu da se izaberu zbog njihovog efekta na sklapanje fuzione belančevine.
[0121] Podrazumeva se da ovaj pronalazak uključuje iznad-opisane nukleinske kiseline koje kodiraju pomenute fuzione polipeptide iz ovoga pronalaska poput rekombinantnih nukleinskih kiselina proizvedenih primenom metodologije rekombinantne DNA, kao i ekspresijske vektore koji sadrže pomenute nukleinske kiseline iz ovoga pronalaska i ćelije domaćine koji sadrže pomenute vektore iz ovoga pronalaska.
Terapeutske primene
[0122] Fuzioni polipeptidi iz ovoga pronalaska, ovde opisani, su naročito dobro prikladni za primenu kao terapeutski agensi za ciljanje ćelija od interesa u uslovima in vivo (tj., ciljne ćelije) zbog toga šta poseduju, osim ostalih karakteristika, veće vezne afinitete za nativne receptore od samih nativnih liganda, ali i super-agonističke i antagonističke aktivnosti. Tako, kompozicije i farmaceutske kompozicije koje sadrže pomenute fuzione polipeptide mogu da se administriraju nekom pacijentu koji ima potrebu od takvog terapeutskog tretmana. Kod terapeutskih primena, fuzioni polipeptidi iz ovoga pronalaska koji sadrže cirkularno-permutirane ligande, i razne kompozicije koje sadrže pomenute molekule se administriraju nekom pacijentu koji pati od neke bolesti ili poremećaja u nekoj terapeutski efektivnoj količini.
[0123] Ovaj pronalazak obezbeđuje kompozicije koje sadrže pomenute fuzione polipeptide iz ovoga pronalaska i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac, razblaživač ili ekscipijent, i terapeutske i dijagnostičke postupke koji primenjuju ligande ili kompozicije iz ovoga pronalaska.
[0124] Terapeutske i profilaktičke namene liganada iz ovoga pronalaska podrazumevaju administriranje pomenutih liganada u skladu sa ovim pronalaskom nekom sisaru recipijentu, poput čoveka. Fuzioni polipeptidi iz ovoga pronalaska se preferirano vežu na svoje mete visokim afinitetom i/ili aviditetom. Dostatno čisti ligandi od barem 90 do 95% homogenosti su preferirani za administriranje nekom sisaru, a 98 do 99% ili veća homogenost je još bolja kod farmaceutskih namena, naročito kada pomenuti sisar je čovek. Jednom prečišćeni, delomično ili do homogenosti kao šta je poželjeno, pomenuti fuzioni polipeptidi iz ovoga pronalaska mogu da se primenjuju dijagnostički ili terapeutski (uključujući vantelesno) ili kod razvijanja i izvođenja procedura za testiranje, imunofluorescentna bojanja i slično.
[0125] Na primer, pomenuti fuzioni polipeptidi iz ovoga pronalaska bi se tipično mogli primenjivati kod sprečavanja, zaustavljanja ili tretiranja bolesnih stanja. Na primer, fuzioni polipeptidi mogu da se administriraju sa ciljem da se tretira, zaustavi ili spreči neka bolest ili poremećaj koji je uzrokovan usled receptorske aktivnosti, ili karakterizovan sa ekspresijom ili prekomernom ekspresijom receptora, poput hronične upale ili hroničnih upalnih bolesti, kardiovaskularnih bolesti, metaboličkih bolesti (na primer, gojaznost, dijabetes tipa II, metabolički sindrom), respiratornih bolesti (na primer, astma, COPD), oftamoloških bolesti (na promer, AMD, glaukom), hematopoetskih poremećaja, imunosupresije, odbacivanja transplantiranog organa, bolesti kalem-naspram-domaćina, bolesti kosti i hrskavice (osteoporoza, osteoartritis), alergijske hiperosetljivost, raka, bakterijskih i viralnih infekcija, autoimunih poremećaja (koji uključuju, ali bez ograničenja, dijabetes tipa I, astmu, multiplu sklerozu, reumatoidni artritis, juvenilni (mladenački) reumatoidni artritis, psorijazni artritis, spondiloartropatiju (na primer, ankilozirajući spondilitis), autoupalne poremećaje, sistemski lupus erythematosus, upalnu bolest creva (na primer, Crohn-ova bolest, ulcerativni kolitis), miasteniju gravis i Behcet-ov sindrom), psorijazu, endometriozu, i abdominalne adhezije (na primer, nakon abdominalne kirurške operacije).
[0126] Jedna preferirana primena, uz pomoć korišćenja cirkularno-permutiranog IL-2 fuzionisanog na IL-2Rα koje generiše IL-2 super-agonist), je tretman raka, ili autoimunih stanja poput bolesti kalem-naspram-domaćina, odbacivanje transplantiranih organa.
[0127] Cirkularno-permutirani IL-6 fuzionisan na D1-domen iz gp130 (koje generiše veoma potentan antagonist IL-6) može da se primenjuje u tretmanu hroničnih upalnih bolesti, autoimunih bolesti (uključujući, ali bez ograničenja, reumatoidni artritis, psorijazu, psorijazni artritis, juvenilni reumatoidni artritis, Crohn-ovu bolest, upalni sindrom creva), rak (uključujući multipli mijelom), i Castleman-ovu bolest. Kao šta je opisano u referentnim primerima 2 i 3, pomenuta fuziona belančevina, cirkularno-permutirani ligand-gp130 (RDB1527), poseduje veći specifični vezni afinitet prema nativnom IL6 receptoru (Sl.6A naspram 6C) i sposobnost inhibiranja ciljanih ćelija (Sl.5) u odnosu na nativne ligande. Pomenuti povećani vezni afinitet i inhibicija rasta cirkularno-permutiranih IL6-gp130 fuzionih polipeptida može pomenutim fuzionim belančevinama da omogući administriranje u nižim dozama u odnosu na druge inhibitore IL6-signaliziranja, uz istovremeno ostvarivanje iste terapeutske efikasnosti. Alternativno, administriranje istom dozom rezultuje produženom terapeutskom efikasnosti jer fuzione belančevine najpre treba da budu očišćene iz cirkulacije do postizanja niže koncentracije pre no prestanu pokazivati značajnu efikasnost. Osim toga, povećana terapeutska efikasnost nije praćena sa porastom neželjenih nus-pojava zbog ne-specifičnog vezanja i citotoksičnosti.
[0128] Cirkularno-permutirani IL-1 fuzionisan na neki domen iz IL-1RI, IL-1RII, ili IL-1RAcP (koje generiše veoma potentnog antagonistu IL-1) može da se primenjuje u tretmanu autoupalnih bolesti, dijabetesa tipa I, hroničnih upalnih bolesti, autoimunih bolesti (uključujući, ali bez ograničenja, reumatoidni artritis, psorijazu, psorijazni artritis, juvenilni reumatoidni artritis, Crohn-ovu bolest, upalni sindrom creva), rak, giht, i osteoartritis.
[0129] Cirkularno-permutirani IL-15 fuzionisan na IL-15α (koje generiše super-agonist IL-15) može da se primenjuje u tretmanu raka, autoimunih stanja poput bolesti kalem-naspramdomaćina, odbacivanja transplantiranih organa, ili infekcije.
[0130] Pomenuti cirkularno-permutirani ligand koji je deo pomenutog fuzionog polipeptida je izabran u skladu sa zamišljenom primenom. Belančevine moje mogu da služe kao mete za pomenute cirkularno-permutirane ligande uključuju, ali bez ograničenja, signalne molekule poput faktora rasta ili biološki aktivnih fragmenata ili njihovih mutanata. Na primer, pomenuti faktor rasta može da bude citokin (na primer, interleukin ili hemokin). Dok stručnjak može lako da odredi da li je neki molekul signalni molekul (tj., da li se proizvodi i izlučuje iz neke ćelije i uspostavlja efekt na sebi (autokrino) ili na neki drugi tip ćelija (parakrino), uobičajeno preko specifičnog vezanja nekog receptora, razni posebni signalni molekuli mogu da se podele u dve ili više kategorija. Na primer, IL-1 može da se odnosi na neki citokin ili interleukin, eritropoetin može da odnosi na neki faktor rasta ili na neki hormon; itd.
[0131] Citokin uključuje, ali bez ograničenja, IL-1α, IL-1β, IL-IRa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-12p35, IL-13, IL-15, članove IL-17-porodice, IL18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-23p19, IL-30 (IL27p28), IL-33, IL-34, IL-35, IL-35p35, IL-36Ra, IL-36a, IL-36b, IL-36g, IL-37, IL-38, LIF, CNTF, onkostatin M, CLCF-1, GCSF, GM-CSF, feritin, placentalni laktogen, apolipoprotein e, interferon-alfa (IFNα), interferon-beta (IFNβ), ili interferon-gama (IFNy). Hemokin može da bude član α-pod-porodice i/ili može da veže CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, ili CXCR5 receptore; može da bude član β-pod-porodice i/ili može da veže CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, ili CCR11 molekule. Hemokin može, takođe, da bude limfotaktin ili drugi hemokin koji veže XCR1-receptor; hemokin može, takođe, da bude fraktalkin ili može da veže CX3CR1-receptor. Na primer, pomenuti hemokin može da bude CCL7, CCL23, CCL27, CCL28, CXCL12, CXCL14, ili CXCL15.
[0132] Faktori rasta uključuju, ali bez ograničenja, članove porodice faktora nekroze tumora (TNF), članove porodice faktora rasta živaca (NGF), članove porodice faktora transformirajućeg rasta (TGF), članove GDF-porodice, članove BMP-porodice, članove porodice faktora rasta fibroblasta (FGF) (uključujući FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8a, FGF-8b, FGF-8e, FGF-8f, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14, FGF-16, FGF-17, FGF-18, FGF-19, FGF-20, FGF-21, FGF-22, FGF-23, članove porodice faktora rasta koji su slični insulinu (IGF), članove porodice epidermalnih faktora rasta (EGF), ili članove porodice faktore rasta izvedenih iz krvnih pločica (PDGF). Na primer, pomenuti faktor rasta može da bude TNF, EGF, TGFα, TGFβ, FGF, NGF, eritropoetin, IGF-1, ili IGF-2.
[0133] Hormon može da bude neki hormon koji je proizveden u nadbubrežnoj žlezdi, paratirodinoj žlezdi, hipofizi, ili tiroidnoj žlezdi; takođe može da bude proizveden u hipotalamusu, jajniku, testisu, pankreasu, epifizi, ili u timusu. Na primer, pomenuti hormon može da bude hormon koji stimuliše štitastu žlezdu, hormon koji stimuliše folikul, luteinizujući hormon, prolaktin, hormon rasta, adrenokortikotropni hormon, antidiuretski hormon, oksitocin, hormon koji oslobađa tirotropin, hormon koji oslobađa gonadotropin, hormon koji oslobađa hormon rasta, hormon koji oslobađa kortikotropin, somatostatin, dopamin, melatonin, tiroksin, kalcitonin, paratiroidni hormon, glukokortikoid, mineralokortikoid, neki androgen, adrenalin, neki estrogen, progesteron, human horionski gonadotropin, insulin, razni glukagoni, somatostatin, eritropoetin, kalcitriol, atrial-natriuretski peptid, gastrin, sekretin, holecistokinin, somatostatin, neuropeptid Y, grelin, PYY3-36, faktor-1 rasta sličan insulinu, angiotenzinogen, trombopoietin, ili leptin.
[0134] Neurotransmiteri uključuju acetilholin, dopamin, norepinefrin, serotonin, histamin, ili epinefrin. Pomenuti neurotransmiter može, takođe, da bude neuroaktivni peptid (na primer, bradikinin, holecistokinin, gastrin, sekretin, oksitocin, peptid indukovanja delta sna, hormon koji oslobađa gonadotropin, beta-endorfin, enkefalin, supstanca P, somatostatin, prolaktin, galanin, hormon koji oslobađa hormon rasta, bombesin, dinorfin, neurotensin, motilin, tirotropin, neuropeptid Y, leuteinizujući hormon, kalcitonin, ili vazoaktivni crevni peptid). Prikladni ko-stimulatorni molekuli uključuju B7-1 i B7-2.
Farmaceutske kompozicije
[0135] Ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže fuzione belančevine iz ovoga pronalaska i barem jedan farmaceutski prihvatljivi nosilac. Fuzione belančevine iz ovoga pronalaska mogu da se formulišu u skladu sa poznatim postupcima za pripremu farmaceutski korisnih kompozicija, pri čemu pomenuti polipeptid je kombinovan sa nekim farmaceutski prihvatljivim nosiocem (prenosnik), poput vodenih rastvora ili pufera, farmaceutski prihvatljivi suspenzija i emulzija. Primeri ne-vodenih rastvarača uključuju propil etilen glikol, polietilen glikol i biljna ulja. Terapeutske formulacije se pripremaju za potrebe skladištenja tako da se pomeša aktivni sastojak koji ima željeni stepen čistoće sa (opciono) fiziološki prihvatljivim nosiocima, ekscipijentima ili konzervansima, kao šta je opisano u Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. ur. (1980), u formi liofilozovanih formulacija ili vodenih rastvora.
[0136] Naročito, pomenute farmaceutske kompozicije mogu da se administriraju za potrebe terapije preko bilo koje prikladne rute uključujući potkožnu, potkožnu ili intratekalnu uz pomoć infuzione pumpe, intramišićnu, intravenoznu, intradermalnu, intravitrealnu, nazalnu, i pulmonalnu rutu. Podrazumeva se da preferirana ruta varira u zavisnosti o samom terapeutiku, stanju i dobi recipijenta, i samoj bolesti koja se tretira.
[0137] U jednoj izvedbi, pomenuta farmaceutska kompozicija se administrira potkožno. U ovoj izvedbi, pomenuta kompozicija može da se dostavi u formi liofilozovanog praha koji treba da se obnovi pre administriranja. Pomenuta kompozicija može takođe da se dostavi u formi neke tečnosti, koja može da se administrira direktno pacijentu. U jednoj izvedbi, pomenuta kompozicija se dostavlja kao tečnost u prethodno-ispunjenom špricu tako da pacijent može jednostavno da se samo-dozira sa kompozicijom.
[0138] U drugoj izvedbi, pomenute kompozicije iz ovoga pronalaska su enkapsulirane u liposome, koji su pouzdani za dostavu korisnih aktivnih agenasa na kontrolisan način tokom dužih vremenskih perioda. Liposomi su zatvorene dvoslojne membrane koje imaju zarobljeni vodeni volumen. Liposomi mogu, takođe, da budu unilamelarne vezikule koje poseduju jednoslojni membranski dvosloj ili multilamelarne vezikule sa višestrukim membranskim dvoslojima, svaki odvojen od sledećeg sa vodenim slojem. Struktura rezultujućih membranskih dvosloja je takva da su hidrofobni (ne-polarni) repovi lipida orijentisani prema centru dvosloja dok su hidrofilne (polarne) glave orijentisane prema vodenoj fazi. U jednoj izvedbi, pomenuti liposom može da bude omotan sa fleksibilnim polimerom koji je rastvorljiv u vodi i koji sprečava unos od strane organa mononuklearnog fagocitnog sistema, primarno, jetra i slezina. Prikladni hidrofilni polimeri za prekrivanje liposoma uključuju, ali bez ograničenja, PEG, polivinilpirolidon, polivinilmetiletar, polimetiloksazolin, polietiloksazolin, polihidroksipropiloksazolin, olihidroksipropilmetakrilamid, polimetakrilamid, polidimetilakrilamid, polihidroksipropilmetakrilat, polihidroksetilakrilat, hidroksimetilceluloza hidroksietilceluloza, polietilenglikol, poliaspartamid i hidrofilne peptidne sekvence kao šta je opisano u U.S. pat. br. 6,316,024; 6,126,966; 6,056,973 i 6,043,094.
[0139] Liposomi mogu da se sastoje od bilo kojeg lipida ili lipidne kombinacije koja je poznata stanju tehnike. Na primer, lipidi koji formiraju vezikule mogu da budu prirodni ili sintetički lipidi, uključujući fosfolipide, poput fosfatidilholin, fosfatidiletanolamin, fosfatidinske kiseline, fosfatidilserin, fosfatidilglicerol, fosfatidilinozitol, i svingomijelin kao šta je opisano u U.S. pat. br. 6,056,973 i 5,874,104. Pomenuti lipidi koji formiraju vezikule mogu, takođe, da budu glikolipidi, cerebrozidi, ili katjonski lipidi, poput 1,2-dioleiloksi-3-(trimetilamino) propan (DOTAP); N-[1-(2,3,-ditetradeciloksi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroksietilamonijum bromid (DMRIE); N-[1-(2,3,-dioleiloksi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroksi etilamonijum bromid (DORIE); N-[1-(2,3-dioleiloksi)propil]-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTMA); 3 [N-(N',N'-dimetilaminoetan)karbamoil]holesterol (DC-Chol); ili dimetildioktadecilmonijum (DDAB) takođe as opisani in U.S. Pat. No. 6,056,973. Holesterol može, takođe, da bude
4
prisutan u odgovarajućem rasponu kako bi se obezbedila stabilnost vezikula kao šta je opisano u U.S. pat. br.5,916,588 i 5,874,104.
[0140] Za tečne formulacije, poželjno svojstvo je to da je formulacija dostavljena u formi koja može da prođe kroz iglu standarda 25, 28, 30, 31, 32 za potrebe intravenoznog, intramišićnog, intraartikularnog, ili potkožnog administriranja.
[0141] U drugim izvedbama, pomenuta kompozicija može da se dostavi intranazalno kako bi se omogućio prenos aktivnih agenasa kroz olfaktorne puteve u CNS i smanji sistemsko administriranje. Naprave koje se uobičajeno koriste za ovu rutu administriranja su opisane u U.S. pat. br. 6,715,485. Kompozicije koje se dostavljaju preko ove rute mogu da obezbede povećano CNS-doziranje ili smanjeno totalno telesno opterećenje koje smanjuje rizike od sistemske toksičnosti sa određenim lekovima. Priprema farmaceutske kompozicije za dostavu preko potkožne implantirane naprave može da se izvede primenom postupaka koji su poznati stanju tehnike, poput onih koji su opisani u, na primer, U.S. pat. br. 3,992,518; 5,660,848; i 5,756,115.
[0142] Tipična farmaceutska kompozicija za parenteralno administriranje obično sadrži oko 0.1 do 3 mg/kg po pacijentu po danu. Postupci za pripremu kompozicija koje mogu da se administriraju parenteralno su poznati ili očiti stručnjacima, a detaljno su opisani u publikacijama poput Remington's Pharmaceutical Science, 15. izd., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980).
[0143] Pojedinačna ili višestruka administriranja pomenutih kompozicija mogu da se provode u zavisnosti o dozi i frekvenciji koju pacijent zahteva ili može da podnese. U svakom slučaju, pomenuta kompozicija belančevina iz ovoga pronalaska treba da obezbedi dovoljan kvantitet za efektivno tretiranje pacijenta.
PRIMERI
[0144] Sledeći primeri služe za ilustraciju i ne ograničavaju pronalazak na bilo koji način.
Referentni Primer 1. Dizajn, priprema, ekspresija, i prečišćavanje Picasso-fuzionih konstrukata
1. Dizajniranje cirkularno-permutiranog IL-6 i fuzionisanje na domen D1 iz gp130-receptora
[0145] Kristalna struktura heksamernog IL-6-signalnog kompleksa (1P9M.pdb; Sl. 1) je korišćena za dizajniranje cirkularno-permutirane varijante ljudskog IL6, nazvane picasso3 (Sl.
2; RDB1503; SEQ ID NO: 1 (belančevina) i SEQ ID NO: 2 (nukleinska kiselina)), tako da konstruirani C-terminus može da se fuzioniše na N-terminus D1-domena iz gp130 u zajednički kompleks preko kratkog spejsera. Ukratko, konstruirani N- i C-terminusi u picasso3 odgovaraju ostacima 182 i 180 u divljem-tipu IL-6 (SEQ ID NO: 3), a nativni IL-6 terminusi su spojeni preko linkera od 7 amino-kiselina. Pomenuti D1-domen iz gp130 je izabran kao fuzioni partner zato da, osim šta sterički interferiše sa formiranjem heksamera, takođe pojača vezni afinitet prema IL-6R preko nativnih interakcija prisutnih u samom kompleksu (Sl. 3B). Konstruisani C-terminus picasso3 je fuzionisan sa D1-domenom preko spejsera od dve amino-kiseline koje daje RDB1527 (Sl.3B; SEQ ID NO: 4 (belančevina) i SEQ ID NO: 5 (nukleinska kiselina)). Kao kontrola je dizajnirana analogna fuziona belančevina koji se sastoji od nativnog IL6 fuzionisanog na D1 (RDB1529) (Sl. 3A; SEQ ID NO: 6 (belančevina) i SEQ ID NO: 7 (nukleinska kiselina)).
2. Sinteza gena
[0146] Sinteza gena za ekspresiju dizajniranih konstrukata je provedena primenom standardnih postupaka.
3. Subkloniranje sintetizovanog gena u ekspresioni vektor za ćelije sisara
A) Priprema ekspresionog vektora pcDNA™ (Invitrogen).
[0147] 5 µg pcDNA je pocepano sa BamH I i Hind III tokom dva h na 37° C. Digest je tretiran sa goveđom alkalnom fosfatazom kako bi se odstranili 5'-fosfati, koje sprečava samo-zatvaranje vektora. Pufer je izmenjen kako bi se odstranile soli nakon reakcije sa goveđom alkalnom fosfatazom. Komplet hemikalija PCR cleanup (Qiagen) je korišćen prema protokolu proizvođača. DNA je eluirana u 30 µl H2O.
B) Priprema gena od interesa.
[0148] Gen od interes je pocepan sa BamH I i Hind III tokom dva h 37° C. Reakcija digestije je provedena u aparatu E-Gel<®>CloneWell™ (Invitrogen) uz korišćenje 0.8% SYBR Green. Fragment koji odgovara genu od interesa je izolovan iz drugog reda komorica u gelu.
C) Ligiranje gena sa pcDNA.
[0149] Pripremljena pcDNA (korak A) je pomešana sa DNA iz koraka B u prisutnosti T4-ligaze, a smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 min. Nakon ligacije, produkti su transformirani u GORE10-ćelije (Invitrogen; hemijski kompetentan soj E. coli), a pravi klon je izdvojen i uskladišten na -80° C u glicerolu.
4. Ekspresija RDB1503, RDB1527, i RDB1529
[0150] Sve belančevine su eksprimirane u CHO-ćelijama uz korišćenje FreeStyle™ Max Reagent (Invitrogen) prema instrukcijama proizvođača. Ukratko, dan pre transfekcije ćelije su posejane u koncentraciji 0.5x10<6>ćelija/mL, a na dan transfekcije ta koncentracija je podešena do 1x10<6>ćelija/mL kao šta sugeriše proizvođač. Za 1 litar transfekcije su pripremljene dve tube (A i B) sa medijumom (OptiPRO™, Invitrogen) koje sadrže oko 19 ml, 1 mg DNA je dodano u tubu A, a 1 ml FreeStyle™ Max reagent je dodano u tubu B. Odmah nakon toga sadržaji tuba su pomešani, a smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 15 min. Nakon perioda inkubacije, smeša je polako dodana u 1 litar CHO-ćelija. Nakon transfekcije, ćelije su ostavljene tokom 6 do 7 dana, a tada je sakupljen supernatant.
5. Prečišćavanje RDB1527 i RDB1529
[0151] Eksprimirana belančevina u supernatantu je zarobljena na koloni sa belančevinom A koja veže Fc-deo same fuzione belančevine. Nakon vezanja na pomenutu belančevinu, kolona je isprana sa najviše 5 kolonskih volumena PBS. Belančevina je elirana iz kolone uz pomoć snižavanja pH radnog pufera i direktno je neutralizovana sa Tris-puferom (pH=7). Prečišćena belančevina je tada dijalizovana preko noći (PBS).
Referentni Primer 2. In Vitro aktivnost cirkularno-permutiranih IL6-fuzionih belančevina
4
[0152] Ćelije HEK-Blue™ IL-6 (Invivogen) su ljudske embrionske bubrežne ćelije specifično dizajnirane da detektuju bioaktivni IL-6 u uslovima in vitro uz pomoć praćenja IL-6-indukovane ekspresije reporter gena, STAT3-induciblna izlučivana embrionska alkalna fosfataza (SEAP). SEAP može lako da se prati kada se koristi SEAP-detekcioni medijum QUANTI-Blue™ (Invivogen). Ljudska ćelijska linija i detekcioni medijum su korišćeni za testiranje sposobnosti cirkularno-permutiranog IL6 i IL6-fuzionih proteinskih konstrukata RDB1503, RDB1527 i RDB1529 da agonizuju ili antagonizuju IL-6-indukovanu SEAP.
[0153] 100 µL medijuma koji sadrži HEK-Blue™ IL-6 ćelije je stavljeno u mikrotitarske pločice sa 96-komorica u finalnoj koncentraciji od 50000 ćelija/komorici. Za merenje agonističke aktivnosti, IL6 i RDB1503 su pripremljeni u inicijalnoj koncentraciji od 200 pM, a tada su odvojeno razblaženi i dodani u dupliranim test-primercima u suspenziju HEK-Blue™ IL-6 ćelija. Za merenje antagonističkog potencijala, RDB1527 i RDB1529 su pripremljeni u inicijalnoj koncentraciji od 3.3 nM, a tada su serijski razblaženi i dodani u dupliranim testprimercima u suspenziju HEK-Blue™ IL-6 ćelija u prisutnosti konstantne koncentracije IL6 od 12.5 pM. Pomenuti primerci su inkubirani na 37° C, uz 5% CO2tokom 20-24 h, a tada je 40 µL svakog primerka preneseno u nove pločice sa 96-komorica koje su sadržavale 160 µL QUANTI-Blue™ u svakoj komorici, a smeše su inkubirane na 37° C, uz 5% CO2. Očitanja absorbancije su provedena na 630 nm nakon 3 h inkubacije.
[0154] Cirkularno-permutirani IL-6 (RDB1503) su pokazali agonističku aktivnost koja je imala uporediv EC50sa onim od IL-6 (Sl.4). RDB1527 (CP_IL-6_D1_Fc) je bio sposoban da inhibira IL-6-indukovanu ekspresiju SEAP na dozno-zavisan način sa vrednosti IC50od 0.22 nM (Sl.
5). Suprotno, RDB1529 (ne-modifikovani IL-6_D1_Fc) je pokazao antagonistički efekt (Sl.5).
[0155] Sledeći zaključci su doneseni: 1) Cirkularna permutacija IL-6 ne uzrokuje gubitak veznog afiniteta; 2) fuzionisanje D1-domena iz gp130 na C-terminus divljeg-tipa IL-6 ne pretvara IL-6 u potentnog antagonistu, dok fuzionisanje D1-domena iz gp130 na C-terminus cirkularno-permutiranog IL-6 upravo ga pretvara u potentnog antagonistu IL-6-posredovanog signaliziranja.
Preferirani Primer 3. Merenje kinetike wtIL6, RDB1527 i RDB1529
[0156] Divlji-tip IL6-Fc (wtIL6), RDB1527 i RDB1529 su imobilizirani na senzorni čip Biacore™ primenom kompleta hemikalija za zarobljavanje ljudskog antitela (GE Healthcare) u skladu sa protokolom proizvođača. IL-6R je proveden preko površine čipa u skladu sa postepenom modelu. IL-6R je pripremljen u 5 koncentracija; 3.0 nM, 1.0 nM, 0.33 nM, 0.11 nM, i 0.03 nM. U Prvom ciklusu, IL-6R u koncentraciji od 0.03 nM je preliven preko vezanog liganda na površini pomenutog čipa tokom 180 s, nakon čega je dodan blank-rastvor (kontrola) preko pomenute površine kako bi se omogućila disocijacija IL-6R. Ista procedura je ponovljena tokom četiri dodatna puta uz korišćenje rastućih koncentracija od 0.03-3 nM 6R. Nastali senzogrami su analizirani sa softverom nativnog instrumenta kako bi se izračunali vezni afiniteti konstrukata.
[0157] Izračunato je da vezni afinitet RDB1527 prema IL-6R iznosi 40 pM (Sl. 6C), koje predstavlja povećanje od preko 200-puta u odnosu na afinitet kontrole wtIL6 (9 nM, Sl. 6A). Senzogram RDB1529 (Sl. 6B) je rezultovao slabim podešavanjem (poor fit), šta govori da izračunati vezni afinitet nije pouzdan. To može da bude rezultat izmešanog vezanja između IL-6 i IL-6R i nezavisno D1 i IL-6R.
[0158] Na osnovu rezultata je izračunato da vezni afinitet RDB1527 prema IL-6R iznosi 40 pM, ili više od 200-puta veći u odnosu na wtIL6. Ovi podaci, zajedno sa potentnom antagonističkom aktivnosti, snažno sugerišu da vezne determinante prema IL-6 i D1 istovremeno vežu i IL-6R, koje sprečava povezivanje signalnog kompleksa, kao šta je predviđeno.
Preferirani Primer 4. Dizajniranje cirkularno-permutiranog IL1β fuzionisanog na domene D1-D2 iz IL-1RI (RDB1538)
[0159] Kristalna struktura heterotrimernog IL-1β signalnog kompleksa (4DEP.pdb; Sl. 7A) je korišćena za dizajniranje cirkularno-permutirane varijante IL-1β (RDB1515; SEQ ID NO: 8 (belančevina) i SEQ ID NO: 9 (nukleinska kiselina)), tako da konstruirani N-terminus može da bude fuzionisan na C-terminus D1-D2 domena iz IL-1RI preko kratkog spejsera. Ukratko, konstruirani N- i C-terminusi odgovaraju ostacima 224 i 223 u divljem-tipu IL-1β, a nativni terminusi IL-1β su spojeni preko linkera od 7 amino-kiselina. Novo-kreirani N-terminus je fuzionisan na domen D1-D2 of RI uz pomoć spejsera od 5 amino-kiselina, a FLAG-privesak je dodan na N-terminus RI, koje rezultuje u RDB1538 (Sl. 7B; SEQ ID NO: 10 (belančevina) i
4
SEQ ID NO: 11 (nukleinska kiselina)). Nastala fuziona belančevina je dizajnirana da bude antagonist IL-1β-posredovanog signaliziranja preko vezanja na IL-1RAcP i sprečavanja da se puni signalni kompleks sklopi.
Preferirani Primer 5. Dizajniranje cirkularno-permutiranog IL-2 koji je fuzionisan na IL-2Rα (RDB1405)
[0160] Nakon vezanja IL-2Rα, vezna konformacija IL-2 se stabilizuje koje dozvoljava da se formira visoko-afinitetni kompleks sa IL-2Rβ i γc. RDB1405 je dizajniran da bude superagonist IL-2-posredovanog signaliziranja, naročito u ćelijama kojima nedostaje IL-2Rα, jer će moći da formiraju visoko-afinitetni kompleks bez da zahtevaju vezanje na IL-2Rα povezanog sa ćelijom. Kristalna struktura kvaternarnog signalnog kompleksa IL-2 (2B5I.pdb; Sl. 8A) je korišćena za dizajniranje cirkularno-permutirane varijante IL-2, tako da konstruirani C-terminus može da se fuzioniše na N-terminus IL-2Rα preko kratkog spejsera. Ukratko, pomenuti konstruirani N- i C-terminusi odgovara ostacima 95 i 94 u divljem-tipu IL-2. C-terminus nativnog IL-2 je spojen na ostatak 4 iz IL-2 preko linkera od 2 amino-kiseline. Finalno, novo-kreirani C-terminus je fuzionisan na N-terminus IL-2Rα preko spejsera od 6 aminokiselina, a C-terminus IL-2Rα je fuzionisan na ljudski IgG1 Fc koje daje RDB1405 (Sl. 8B; SEQ ID NO: 12 (belančevina) i SEQ ID NO: 13 (nukleinska kiselina)).
Primer 1. Dizajniranje cirkularno-permutiranih fuzionih belančevina
[0161] Dizajnirane su IL-2 ili IL-15 fuziona belančevina sa poboljšanom selektivnosti prema ćelijama koje eksprimiraju IL-2Rβy (ali ne i IL-2Rα) naspram ćelija koje eksprimiraju IL-2Rαβγ u odnosu na divlji-tip IL-2 (divlji-tip IL-2 preferira ćelije koje eksprimiraju IL-2Rαβγ). Fuzionisanjem IL-2Rα na IL-2 ili IL-15Rα na IL-15, nastala fuziona belančevina poseduje veću aktivnost prema ćelijama kojima nedostaje odgovarajući alfa-lanac (IL-2Rα ili IL-15Rα) ako se uporedi sa nativnim ligandom, a preferencija prema ćelijama koje eksprimiraju odgovarajući lanac se smanjuje. Tako, omer aktivnosti, EC50 (IL-2Rαβγ+)/EC50(IL-2Rα-IL-2Rβγ+) će se povećati za CP-IL-2-IL-2Rα fuzione belančevine pa će biti manji u odnosu na IL-2 divljeg-tipa. Analogni rezultati su očekivani i za CP-IL-15-IL-15Rα fuzione belančevine. Cirkularno permutiranje citokina je potrebno kako bi se terminusi orijetisali na odgovarajući način u optimalnoj lokaciji za fuzionisanje jer su nativni terminusi orijentisani distalno od alfa-lanaca u signalnom kompleksu.
4
[0162] Rezultati: u ćelijama kojima nedostaje IL-2Rα, ali eksprimiraju IL-2Rβγ (HH ćelijska linija)<i>, pripremljeni konstrukti su efektivni (u stvari, dva do pet-puta bolji) u odnosu na proleukin kod promovisanja STAT5-fosforilacije (Slika 11A, levi panel). Suprotno, u ćelijskoj liniji koja eksprimira heterotrimerni visoko-afinitetni receptorski kompleks, IL-2Rαβγ, (CTLL-2 ćelijska linija)<ii>, dva od pripremljenih konstrukata (RDB1411, RDB1413) su 100- do 300-puta manje aktivni u odnosu na proleukin kao šta je izmereno primenom ćelijske proliferacije. Sve u svemu, pripremljeni konstrukti pokazuju između 400 i 600-puta veću selektivnost prema ćelijama kojima nedostaje IL-2Rα, u odnosu na divlji-tip IL-2, pa tako poseduju potencijal da obezbede poboljšani terapeutski profil. Mada je povećanje omera aktivnosti bilo primećeno, kao šta je očekivano, bilo je iznenađujuće da je veći efekt pomenutog povećanja omera bio dramatičan gubitak aktivnosti (100- do 300-puta) u ćelijama koje sadrže IL-2Rα, pre no poboljšanje same aktivnosti (samo 2- do 5-puta) kod ćelija kojima nedostaje IL-2Rα.
[0163] U ćelijama kojima nedostaje IL-2Rα, ali eksprimiraju IL-2Rβγ (HH ćelijska linija)<i>, pripremljeni konstrukti su potentni aktivatori STAT5-fosforilacije, ali oko 10x manje potentni od divljeg-tipa IL-15 (Slika 12A, levi panel). U ćelijskoj liniji koja eksprimira pomenuti heterotrimerni visoko-afinitetni receptorski kompleks, IL-2Rαβγ, (CTLL-2 ćelijska linija)<ii>, pripremljeni konstrukti (RDB1408, RDB1416) su 2000- do 6000-puta manje aktivni u odnosu na divlji-tip IL-15 kao šta je izmereno primenom ćelijske proliferacije. Sve u svemu, pripremljeni konstrukti poseduju između 200 i 600-puta veću selektivnost prema ćelijama kojima nedostaje IL-2Rα, u odnosu na divlji-tip IL-15. Mada je pomenuto povećanje u omeru aktivnosti bilo primećeno, kao šta je bilo očekivano, bilo je iznenađujuće da je veći efekt u primećenom povećanju omera bio dramatičan gubitak aktivnost (2000- do 6000-puta) u ćelijama koje sadrže IL-2Rα, a da je gubitak aktivnosti od 10-puta bio primećen kod ćelija kojima nedostaje IL-2Rα.
Konstrukti:
[0164]
RDB1409: CP-IL-2(C145S)-FLAG; cirkularno-permutirani IL-2. C145S mutacija je analogna onoj u proleukinu (rhIL-2) sa ciljem poboljšanja fizičkih karakteristika same belančevine. FLAG-privesak je dodan za lakše prečišćavanje.
4
RDB1411: CP-IL-2(C145S)-IL-2Rα-Fc; Cirkularno-permutirani IL-2 fuzionisan na IL-2Rα. C145S mutacija je analogna onoj od proleukina (rhIL-2) sa ciljem poboljšanja fizičkih karakteristika same belančevine. Fc je dodan za lakše prečišćavanje.
RDB1413: CP-IL-2(C145S)-IL-2Rα-FLAG; Cirkularno-permutirani IL-2 fuzionisan na IL-2Rα. C145S mutacija je analogna onoj od proleukina (rhIL-2) sa ciljem poboljšanja fizičkih karakteristika same belančevine. FLAG-privesak je dodan za lakše prečišćavanje. Konstrukt je analogan sa RDB1411 uz zamenu Fc sa FLAG.
RDB1408: Fc-IL-15Rα(sushi)-CP-IL-15; Cirkularno-permutirani IL-15 fuzionisan na sushidomen iz IL-15Rα. Fc je dodan radi lakšeg prečišćavanja.
4
RDB1416: FLAG-IL-15Rα(sushi)-CP-IL-15; Cirkularno-permutirani IL-15 fuzionisan na sushi-domen iz IL-15Rα. FLAG-privesak je dodan radi lakšeg prečišćavanja. Konstrukt je analogan na RDB1408 uz zamenu Fc sa FLAG.
[0165] Dok je ovaj pronalazak do sada bio naročito prikazan i opisan u skladu sa preferiranima izvedbama, podrazumeva se da stručnjaci razumeju da mogu da se uvode razne promene u formi i detaljima bez da se izađe iz okvira samog pronalaska koji su obuhvaćeni sa pridodanim zahtevima. Takođe se podrazumeva da ovde opisane izvedbe nisu međusobno isključive i da karakteristike raznih izvedaba mogu da se kombinuju kao celine ili delomično u skladu sa principima samog pronalaska.
4
1
2
�
1
�
4
1
2
�
1
�
4

Claims (10)

Patentni zahtevi
1. Fuzioni polipeptid, naznačen time, što sadrži amino-kiseline 1-303 iz SEQ ID NO: 26.
2. Fuzioni polipeptidi iz zahteva 1, naznačeni time, što se sastoje od amino-kiselina 1-303 iz SEQ ID NO: 26.
3. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži fuzioni polipeptid iz zahteva 1 ili zahteva 2 i neki farmaceutski prihvatljivi ekscipijent.
4. Izolovana ili rekombinantna nukleinska kiselina, naznačena time, što kodira pomenuti fuzioni polipeptid iz zahteva 1 ili zahteva 2.
5. Rekombinantni vektor, naznačen time, što sadrži nukleinsku kiselinu iz zahteva 4.
6. Ćelija-domaćin, naznačena time, što sadrži pomenuti vektor iz zahteva 5.
7. Fuzioni polipeptid iz zahteva 1 ili zahteva 2 ili farmaceutska kompozicija iz zahteva 3, naznačeni time, što su namenjeni za primenu kao lek.
8. Fuzioni polipeptid iz zahteva 1 ili zahteva 2 ili farmaceutska kompozicija iz zahteva 3, naznačeni time, što su namenjeni za primenu u nekom terapeutskom postupku za selektivno agoniziranje IL-2Rβγ u nekoj ćeliji, pri čemu pomenuti postupak podrazumeva kontaktiranje pomenute ćelije sa pomenutim fuzionim polipeptidom iz zahteva 1 ili zahteva 2 ili sa pomenutom farmaceutskom kompozicijom iz zahteva 3.
9. Fuzioni polipeptid ili farmaceutska kompozicija za primenu u skladu sa zahtevom 8, naznačeni time, što pomenuti fuzioni polipeptid ili farmaceutska kompozicija dolaze u kontakt sa pomenutom ćelijom vantelesno.
10. Fuzioni polipeptid iz zahteva 1 ili zahteva 2 ili farmaceutska kompozicija iz zahteva 3, naznačeni time, što se namenjeni za primenu u tretmanu raka.
RS20210004A 2012-06-08 2013-06-06 Ligandi modifikovani primenom cirkularnog permutiranja kao agonisti i antagonisti RS61391B1 (sr)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261657378P 2012-06-08 2012-06-08
US201261657285P 2012-06-08 2012-06-08
US201261657264P 2012-06-08 2012-06-08
US201261723081P 2012-11-06 2012-11-06
US201361778575P 2013-03-13 2013-03-13
US201361778812P 2013-03-13 2013-03-13
EP18162555.9A EP3401402B1 (en) 2012-06-08 2013-06-06 Ligands modified by circular permutation as agonists and antagonists

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61391B1 true RS61391B1 (sr) 2021-02-26

Family

ID=49712642

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210004A RS61391B1 (sr) 2012-06-08 2013-06-06 Ligandi modifikovani primenom cirkularnog permutiranja kao agonisti i antagonisti
RS20180664A RS57369B1 (sr) 2012-06-08 2013-06-06 Ligandi modifikovani cirkularnom permutacijom kao agonisti i antagonisti

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180664A RS57369B1 (sr) 2012-06-08 2013-06-06 Ligandi modifikovani cirkularnom permutacijom kao agonisti i antagonisti

Country Status (20)

Country Link
US (8) US9296801B2 (sr)
EP (5) EP3401402B1 (sr)
JP (7) JP6234446B2 (sr)
AU (3) AU2013271541C1 (sr)
CA (3) CA2869787C (sr)
CY (2) CY1120522T1 (sr)
DK (2) DK3401402T3 (sr)
ES (4) ES2675568T3 (sr)
HR (2) HRP20180914T1 (sr)
HU (2) HUE052908T2 (sr)
LT (2) LT3401402T (sr)
ME (1) ME03079B (sr)
NZ (4) NZ715099A (sr)
PL (2) PL2859015T3 (sr)
PT (2) PT3401402T (sr)
RS (2) RS61391B1 (sr)
SI (2) SI2859015T1 (sr)
SM (2) SMT202100007T1 (sr)
TR (2) TR201808753T4 (sr)
WO (3) WO2013184938A2 (sr)

Families Citing this family (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS61391B1 (sr) * 2012-06-08 2021-02-26 Alkermes Pharma Ireland Ltd Ligandi modifikovani primenom cirkularnog permutiranja kao agonisti i antagonisti
MA40094B1 (fr) 2014-08-06 2022-05-31 Univ Miami Protéines de fusion de l'interleukine-2/récepteur alpha de l'interleukine-2 et procédés d'utilisation
AU2015364396B2 (en) 2014-12-19 2018-08-09 Alkermes, Inc. Single chain Fc fusion proteins
WO2017120589A1 (en) * 2016-01-08 2017-07-13 Washington University Compositions comprising chemerin and methods of use thereof
JP7084881B2 (ja) 2016-06-22 2022-06-15 アルカームス インコーポレーテッド Ｉｌ－１０の免疫刺激特性および抗炎症特性を調節するための組成物および方法
CN109689086A (zh) 2016-07-11 2019-04-26 国家生物技术研究所公司 具有延长的血清半衰期的融合蛋白
EP3600429B1 (en) * 2017-03-20 2023-10-25 Bio-Techne Corporation Il-37 fusion protein and methods of making and using same
KR101784288B1 (ko) * 2017-04-26 2017-10-11 (주)넥스젠바이오텍 피부 세포 증식 효과가 증가한 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물
KR101800200B1 (ko) 2017-05-26 2017-11-23 (주)넥스젠바이오텍 항산화 활성 및 피부 세포 증식 효과가 증가한 성장 분화 인자 11과 상피세포 성장인자의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물
US11643642B2 (en) 2017-06-27 2023-05-09 Codexis, Inc. Penicillin-g acylases
CN107362351B (zh) * 2017-09-04 2020-11-10 上海市儿童医院 Il-36r的拮抗剂在制备镇痛药物中的应用
US11319355B2 (en) 2017-12-19 2022-05-03 Xencor, Inc. Engineered IL-2 Fc fusion proteins
US11267863B2 (en) 2018-01-19 2022-03-08 Pepgene Inc. N-terminal fusion partner for producing recombinant polypeptide, and method for producing recombinant polypeptide using same
JP7464530B2 (ja) * 2018-03-28 2024-04-09 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー インターロイキン－２／インターロイキン－２受容体アルファ融合タンパク質および使用方法
JP7485368B2 (ja) * 2018-04-26 2024-05-16 グッド ティー セルズ、 インコーポレイテッド 新規な融合タンパク質およびこれを含む癌の予防または治療用薬学的組成物
CN108948178A (zh) * 2018-07-20 2018-12-07 安他杰（杭州）生物医药科技有限公司 一种改良的人il-37蛋白及其应用
CN109251896A (zh) * 2018-08-13 2019-01-22 中山大学 一株高表达hKLs-his蛋白的细胞株及其制备方法和应用
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
GB201820547D0 (en) 2018-12-17 2019-01-30 Oxford Univ Innovation Modified antibodies
US11246906B2 (en) * 2019-06-11 2022-02-15 Alkermes Pharma Ireland Limited Compositions and methods for subcutaneous administration of cancer immunotherapy
CA3147757A1 (en) 2019-07-26 2021-02-04 Visterra, Inc. Interleukin-2 agents and uses thereof
JP7355326B2 (ja) * 2019-08-05 2023-10-03 デンカ株式会社 経粘膜投与薬剤
MX2022004577A (es) * 2019-10-18 2022-05-10 Alkermes Pharma Ireland Ltd Agentes inmunomoduladores il-2 en combinacion con inhibidores de puntos de control inmune.
EP4065585B1 (en) 2019-11-25 2025-08-20 Alkermes, Inc. Substituted macrocyclic compounds and related methods of treatment
BR112022012112A2 (pt) 2019-12-20 2022-09-06 Regeneron Pharma Agonistas de il2 e métodos de uso dos mesmos
CN115260313B (zh) * 2019-12-31 2023-07-18 北京质肽生物医药科技有限公司 Glp-1和gdf15的融合蛋白以及其缀合物
KR20220143676A (ko) * 2020-01-24 2022-10-25 엘커메스 파마 아일랜드 리미티드 정제 방법
CN116057176A (zh) * 2020-03-21 2023-05-02 赖瑞克斯生物科技公司 Ace2和补体途径的双特异性和三特异性功能分子及其用途
KR20230016178A (ko) * 2020-04-15 2023-02-01 엘커메스 파마 아일랜드 리미티드 혈관신생 억제제와 조합된 면역자극제
MX2022012982A (es) * 2020-04-15 2023-03-06 Alkermes Pharma Ireland Ltd Agentes inmunoestimulantes en combinación con inhibidores de la angiogénesis.
US12159700B2 (en) 2020-04-22 2024-12-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for coordinating manufacturing of cells for patient-specific immunotherapy
TW202208616A (zh) 2020-05-04 2022-03-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 改良之腫瘤反應性ｔ細胞的選擇
EP4146794A1 (en) 2020-05-04 2023-03-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
MX2022014163A (es) * 2020-05-11 2023-02-22 Alkermes Pharma Ireland Ltd Composiciones de polipeptido de fusion il-2 y metodos para fabricarlas y usarlas.
AU2021270745A1 (en) * 2020-05-11 2022-12-15 Mural Oncology, Inc. IL-2 fusion polypeptide compositions and methods of making and using the same
CN111662973B (zh) * 2020-05-28 2023-08-25 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） 与慢性阻塞性肺疾病易感性辅助诊断相关的snp位点及其应用
US20230322882A1 (en) * 2020-07-08 2023-10-12 Nanjing Normal University Fusion Polypeptide and Polypeptide Dimer, and Use Thereof
CN111826400A (zh) * 2020-07-21 2020-10-27 中科宝承生物医学科技有限公司 一种双特异性抗体nk细胞制备方法及其细胞和应用
EP4188416A4 (en) * 2020-07-27 2024-08-21 Arizona Board of Regents on behalf of the University of Arizona MULTIFUNCTIONAL IMMUNOGLOBULIN-FOLDED POLYPEPTIDES FROM SUBSTITUTION TRANSLATIONAL INITIATION AND TERMINATION
US20230372397A1 (en) 2020-10-06 2023-11-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2022098954A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Nektar Therapeutics Tlr agonist compounds and related cancer immunotherapy methods
WO2022099695A1 (en) * 2020-11-16 2022-05-19 Jiangsu Cell Tech Medical Research Institute Co., Ltd. Cd164 fusion and uses thereof
EP4255466A1 (en) 2020-12-04 2023-10-11 Visterra, Inc. Methods of using interleukin-2 agents
TW202241468A (zh) 2020-12-11 2022-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用腫瘤浸潤性淋巴球療法與ｂｒａｆ抑制劑及／或ｍｅｋ抑制劑組合治療癌症患者
US20240123067A1 (en) 2020-12-17 2024-04-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocyte therapies
CA3202483A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Maria Fardis Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors
US11760747B2 (en) 2020-12-21 2023-09-19 Alkermes, Inc. Substituted piperidino compounds and related methods of treatment
TW202242085A (zh) 2020-12-31 2022-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 供自動生產腫瘤浸潤淋巴球的裝置和方法
TW202241508A (zh) 2021-01-29 2022-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 細胞介素相關之腫瘤浸潤性淋巴球組合物及方法
CA3207359A1 (en) 2021-02-05 2022-08-11 Cecile Chartier-Courtaud Adjuvant therapy for cancer
WO2022187741A2 (en) 2021-03-05 2022-09-09 Iovance Biotherapeutics, Inc. Tumor storage and cell culture compositions
WO2022198141A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd69 selection and gene knockout in tils
IL306074A (en) 2021-03-24 2023-11-01 Alkermes Inc UPAR antibodies and fusion proteins with them
AU2022246174A1 (en) 2021-03-25 2023-09-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for t-cell coculture potency assays and use with cell therapy products
MX2023011310A (es) 2021-03-26 2023-10-05 Innate Pharma Anclajes de citocina para proteinas de celulas nk de union a nkp46.
EP4326287A2 (en) 2021-04-19 2024-02-28 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
WO2022245754A1 (en) 2021-05-17 2022-11-24 Iovance Biotherapeutics, Inc. Pd-1 gene-edited tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
WO2022258691A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
BR112023025331A2 (pt) 2021-06-09 2024-02-27 Innate Pharma Proteína multiespecífica, composição farmacêutica, célula recombinante, ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, uso de uma proteína ou composição, métodos ou uso
WO2022258678A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
TW202317623A (zh) 2021-06-14 2023-05-01 美商再生元醫藥公司 基於il2之治療劑及其使用方法
US20240365776A1 (en) 2021-07-22 2024-11-07 Iovance Biotherapeutics, Inc Method for cryopreservation of solid tumor fragments
US20240342285A1 (en) 2021-07-28 2024-10-17 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors
CN113735980A (zh) * 2021-08-23 2021-12-03 中国医学科学院北京协和医院 一种自融合串联蛋白修饰方法及其应用
IL311333A (en) 2021-09-09 2024-05-01 Iovance Biotherapeutics Inc Processes for generating til products using pd-1 talen knockdown
EP4404969A1 (en) 2021-09-24 2024-07-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion processes and agents for tumor infiltrating lymphocytes
WO2023077015A2 (en) 2021-10-27 2023-05-04 Iovance Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for coordinating manufacturing of cells for patient-specific immunotherapy
EP4430167A1 (en) 2021-11-10 2024-09-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
US20230151095A1 (en) 2021-11-12 2023-05-18 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to b7h3 and nkg2d
US20250101380A1 (en) 2022-01-28 2025-03-27 Iovance Biotherapeutics, Inc. Tumor infiltrating lymphocytes engineered to express payloads
WO2023147488A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
EP4504220A1 (en) 2022-04-06 2025-02-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
CA3248034A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. METHODS FOR EXPANSION OF TIL CELLS BY MEANS OF SPECIFIC CYTOKINE COMBINATIONS AND/OR AKT INHIBITOR TREATMENT
KR102798377B1 (ko) * 2022-04-26 2025-04-22 전남대학교산학협력단 원형순열에 기반한 기능성 재조합 인간 섬유아세포 성장인자 7의 제조방법 및 그 용도
EP4522202A1 (en) 2022-05-10 2025-03-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist
WO2023235790A1 (en) * 2022-06-01 2023-12-07 University Of Miami Bifunctional il-2 and il-10 fusion proteins and uses thereof
US20260008990A1 (en) 2022-07-06 2026-01-08 Iovance Biotherapeutics, Inc. Devices and processes for automated production of tumor infiltrating lymphocytes
CN117003852B (zh) * 2022-07-07 2024-11-05 北京大学 白细胞介素-2的拓扑改造及其作为自身免疫病药物的应用
EP4565683A1 (en) 2022-08-01 2025-06-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
EP4583890A1 (en) 2022-09-09 2025-07-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products using pd-1/tigit talen double knockdown
EP4583889A1 (en) 2022-09-09 2025-07-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products using pd-1/tigit talen double knockdown
CN117106024B (zh) * 2022-10-21 2024-05-24 南京市妇幼保健院 一种人血清多肽agdmp1及其在改善胰岛素抵抗中的应用
WO2024098027A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd103 selection
WO2024102636A1 (en) 2022-11-07 2024-05-16 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to b7h3 and mica/b
EP4623072A2 (en) 2022-11-21 2025-10-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Two-dimensional processes for the expansion of tumor infiltrating lymphocytes and therapies therefrom
WO2024118836A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step
EP4431525A1 (en) 2023-03-16 2024-09-18 Anaveon AG Il-2 fusion protein
WO2024133823A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Anaveon AG Il-2 fusion protein
EP4562059A1 (en) * 2023-02-21 2025-06-04 RemeGen Co., Ltd. Il-15 agonists for cancer
AU2024296516A1 (en) 2023-07-13 2026-01-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine encoding lentiviral vectors and uses thereof for making tumor infiltrating lymphocytes
AU2024292473A1 (en) 2023-07-19 2026-01-29 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with trop-2 targeting adc
WO2025023967A1 (en) * 2023-07-25 2025-01-30 Zahav Bioscience Llc Cytokine compositions and methods of use thereof
WO2025054540A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of gene-editing using programmable nucleases
US20250243279A1 (en) 2023-10-17 2025-07-31 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to nkp46 and mica/b
WO2025101484A1 (en) 2023-11-06 2025-05-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of endometrial cancers with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2025171182A1 (en) 2024-02-08 2025-08-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with cancer vaccine
WO2026006784A1 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of making tumor reactive peripheral blood lymphocytes (trpbl)
WO2026035866A1 (en) 2024-08-07 2026-02-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with a lag-3 inhibitor and a pd-1 inhibitor
WO2026072794A2 (en) 2024-09-26 2026-04-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion processes for til product enriched with neoantigen- reactive t cells (narts)

Family Cites Families (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3992518A (en) 1974-10-24 1976-11-16 G. D. Searle & Co. Method for making a microsealed delivery device
US5916588A (en) 1984-04-12 1999-06-29 The Liposome Company, Inc. Peptide-containing liposomes, immunogenic liposomes and methods of preparation and use
IE60901B1 (en) 1986-08-21 1994-08-24 Vestar Inc Improved treatment of systemic fungal infections with phospholipid particles encapsulating polyene antifungal antibiotics
US5872095A (en) 1990-05-01 1999-02-16 Chiron Corporation IL-1 receptor antagonists medicaments
US5747444A (en) 1990-10-09 1998-05-05 Chiron Corporation Method of treating graft-versus-host disease
US5635599A (en) 1994-04-08 1997-06-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Fusion proteins comprising circularly permuted ligands
US5837495A (en) 1994-10-13 1998-11-17 Applied Research Systems Ars Holding N.V. DNA encoding interleukin-1 antagonist
IT1270662B (it) 1994-10-13 1997-05-07 Applied Research Systems Antagonista della interleuchina-1
US5660848A (en) 1994-11-02 1997-08-26 The Population Council, Center For Biomedical Research Subdermally implantable device
US5614191A (en) 1995-03-15 1997-03-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services IL-13 receptor specific chimeric proteins and uses thereof
US6518061B1 (en) 1995-03-15 2003-02-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services IL-13 receptor specific chimeric proteins and uses thereof
US6096728A (en) 1996-02-09 2000-08-01 Amgen Inc. Composition and method for treating inflammatory diseases
CA2263455C (en) 1996-08-23 2002-10-29 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Liposomes containing a cisplatin compound
EP0932390A1 (en) 1996-10-11 1999-08-04 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method
US6056973A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
BR9712675A (pt) 1996-10-25 1999-10-19 Searle & Co Agonistas do receptor de eritropoietina circularmente permutados.
US5969105A (en) 1996-10-25 1999-10-19 Feng; Yiqing Stem cell factor receptor agonists
US6294170B1 (en) 1997-08-08 2001-09-25 Amgen Inc. Composition and method for treating inflammatory diseases
ATE338768T1 (de) 1997-10-31 2006-09-15 Biomira Inc Muc-1 derivate und deren verwendung zur behandlung von krebsassoziierter muc-1 mucin induzierter immunosuppression
US6562347B1 (en) * 1998-03-12 2003-05-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Chemokine-tumor antigen fusion proteins as cancer vaccines
WO1999051632A1 (en) 1998-04-03 1999-10-14 University Of Washington Circularly permuted biotin binding proteins
NZ514442A (en) 1999-03-03 2003-08-29 Optinose As Nasal delivery device
EP1228214A2 (en) * 1999-11-12 2002-08-07 MERCK PATENT GmbH Erythropoietin forms with improved properties
US6808902B1 (en) * 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
US7544477B2 (en) 2000-01-13 2009-06-09 Kalobios, Inc. Circularly permutated, interaction-activated proteins
US6497870B1 (en) 2000-05-22 2002-12-24 Hyseq, Inc. Therapeutic uses of il-1 receptor antagonist
JP4660062B2 (ja) 2000-06-16 2011-03-30 アステリオン・リミテッド 結合剤
IL154777A0 (en) 2000-09-14 2003-10-31 Applied Research Systems Il-6 receptor/il-6 chimera in huntington's disease
BR0116024A (pt) * 2000-12-07 2005-12-13 Lilly Co Eli Proteìna de fusão heteróloga e uso da mesma
JP2004519230A (ja) 2001-02-06 2004-07-02 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング 低減された免疫原性を有する修飾されたインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ｉｌ−１ｒａ）
JP4421894B2 (ja) 2001-07-20 2010-02-24 アブソーバー アクチボラゲット 血液型抗原融合ポリペプチドおよびその使用方法
US7214660B2 (en) * 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
IL147412A0 (en) * 2001-12-31 2002-08-14 Yeda Res & Dev The use of il6r/il6 chimera in nerve cell regeneration
CA2482718C (en) * 2002-04-18 2014-08-19 Yeda Research And Development Co. Ltd. Derivatives of the il-2 receptor gamma chain, their production and use
JP2005530493A (ja) 2002-04-22 2005-10-13 レコファーマ アーベー ムチン融合ポリペプチドワクチン、組成物およびそれらの使用方法
US20080241166A1 (en) 2002-06-28 2008-10-02 Domantis Limited Ligands that bind a receptor
EP1534748A2 (en) 2002-08-09 2005-06-01 Recopharma AB Fusion proteins and methods of producing same
US20040175359A1 (en) 2002-11-12 2004-09-09 Desjarlais John Rudolph Novel proteins with antiviral, antineoplastic, and/or immunomodulatory activity
AU2003299971A1 (en) * 2002-12-30 2004-07-29 Amgen Inc. Combination therapy with co-stimulatory factors
GB0315182D0 (en) * 2003-06-28 2003-08-06 Asterion Ltd Cytokine variant polypeptides
WO2005034863A2 (en) * 2003-10-03 2005-04-21 Jarikuma Corporation Countermeasures against malaria
US8129506B2 (en) 2003-10-24 2012-03-06 Genzyme Corporation Modulation of the interaction of MUC1 with MUC1 ligands
US8454963B2 (en) * 2003-11-13 2013-06-04 Musc Foundation For Research Development Tissue targeted complement modulators
US7576183B2 (en) * 2003-12-24 2009-08-18 Los Alamos National Security, Llc Structure-based receptor MIMICS targeted against bacterial superantigen toxins
US8338138B2 (en) 2004-01-28 2012-12-25 The John Hopkins University Methods for making and using molecular switches involving circular permutation
PT1729810T (pt) 2004-04-02 2018-11-22 Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ Métodos de redução da agregação de il-ira
US7700318B2 (en) 2004-08-25 2010-04-20 Amprotein Corporation Chimeric polypeptide and use thereof
US20060110429A1 (en) * 2004-11-24 2006-05-25 Therakine Corporation Implant for intraocular drug delivery
WO2006086607A2 (en) 2005-02-10 2006-08-17 Emory University Novel proteins with enhanced functionality and methods of making novel proteins using circular permutation
WO2007020889A1 (ja) * 2005-08-12 2007-02-22 Riken 新規ムチン型糖タンパク質及びその用途
EP1777294A1 (en) * 2005-10-20 2007-04-25 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) IL-15Ralpha sushi domain as a selective and potent enhancer of IL-15 action through IL-15Rbeta/gamma, and hyperagonist (IL15Ralpha sushi -IL15) fusion proteins
JPWO2007063907A1 (ja) * 2005-11-30 2009-05-07 塩野義製薬株式会社 ペプチド糖鎖付加体およびそれを有効成分とする医薬
EP1792914B1 (en) * 2005-12-02 2009-07-29 Apceth GmbH & Co. KG Chemokine-mucin fusions linked to Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchors in tissue regeneration and as tumour immune adjuvants
GB0606946D0 (en) 2006-04-06 2006-05-17 Asterion Ltd Polypeptide antagonist
US20100063258A1 (en) 2006-06-28 2010-03-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fusion protein constructs
CN101622274A (zh) * 2006-12-12 2010-01-06 比奥雷克西斯药物公司 转铁蛋白融合蛋白库
WO2008112939A2 (en) 2007-03-13 2008-09-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Composition and method for making oligo-benzamide compounds
WO2008133928A2 (en) 2007-04-27 2008-11-06 The Gi Company, Inc. Mucin glycoproteins and their use for treatment of epithelial lesions and mucin dependent disorders
NZ582330A (en) * 2007-06-27 2012-05-25 Marinepolymer Tech Inc COMPLEXES OF IL-15 AND IL-15Ra (RECEPTOR ALPHA) AND USES THEREOF
US8933197B2 (en) * 2007-08-15 2015-01-13 Amunix Operating Inc. Compositions comprising modified biologically active polypeptides
DE102007049830A1 (de) 2007-10-16 2009-04-23 Henkel Ag & Co. Kgaa Neue Proteinvarianten durch zirkulare Permutation
EP2050759A1 (en) 2007-10-19 2009-04-22 CONARIS research institute AG Soluble gp 130 muteins with improved binding activity
US9687559B2 (en) 2008-03-19 2017-06-27 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Heparosan polymers and methods of making and using same for the enhancement of therapeutics
WO2009148946A2 (en) * 2008-05-29 2009-12-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cell line, system and method for optical control of secondary messengers
CA2727147A1 (en) * 2008-06-17 2009-12-23 Otsuka Chemical Co., Ltd. Glycosylated glp-1 peptide
GB0815216D0 (en) * 2008-08-21 2008-09-24 Asterion Ltd Interleukin
CA2748314C (en) 2009-02-03 2018-10-02 Amunix Operating Inc. Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
EP3028707A1 (en) * 2009-05-01 2016-06-08 Ophthotech Corporation Methods for treating or preventing ophthalmological diseases
WO2011103049A2 (en) * 2010-02-16 2011-08-25 Immune Disease Institute, Inc. Method for screening receptors/ligands interactions
EP2553101A4 (en) * 2010-04-02 2013-09-04 Univ Rochester PROTEASE-ACTIVATED CYTOKINES
US9119869B2 (en) 2010-04-29 2015-09-01 Ronald J. Shebuski Mucin derived polypeptides
CN103221422B (zh) * 2010-07-29 2017-03-29 十一生物治疗股份有限公司 嵌合il‑1受体i型激动剂和拮抗剂
CN107880136B (zh) * 2010-09-21 2021-11-12 阿尔托生物科学有限公司 多聚体il-15可溶性融合分子与其制造与使用方法
US9511151B2 (en) * 2010-11-12 2016-12-06 Uti Limited Partnership Compositions and methods for the prevention and treatment of cancer
WO2013170636A1 (zh) * 2012-05-18 2013-11-21 爱德迪安（北京）生物技术有限公司 用于糖尿病治疗的蛋白、蛋白缀合物及其应用
RS61391B1 (sr) * 2012-06-08 2021-02-26 Alkermes Pharma Ireland Ltd Ligandi modifikovani primenom cirkularnog permutiranja kao agonisti i antagonisti

Also Published As

Publication number Publication date
ES2675784T3 (es) 2018-07-12
EP3825405A1 (en) 2021-05-26
WO2013184939A2 (en) 2013-12-12
TR201808753T4 (tr) 2018-07-23
US20170044228A1 (en) 2017-02-16
PT3401402T (pt) 2020-11-11
US9428563B2 (en) 2016-08-30
US20200040053A1 (en) 2020-02-06
DK2859015T3 (en) 2018-06-18
PT2859015T (pt) 2018-06-26
HUE037849T2 (hu) 2018-09-28
EP3401402A1 (en) 2018-11-14
HRP20180914T1 (hr) 2018-07-27
JP2015525216A (ja) 2015-09-03
AU2013271542A1 (en) 2014-10-16
CY1124525T1 (el) 2022-07-22
WO2013184942A1 (en) 2013-12-12
AU2013271541B2 (en) 2016-03-17
EP2858672B1 (en) 2018-04-04
JP7048543B2 (ja) 2022-04-05
JP2022050391A (ja) 2022-03-30
CY1120522T1 (el) 2019-07-10
AU2013271542B2 (en) 2016-07-14
US10023623B2 (en) 2018-07-17
ES2675568T3 (es) 2018-07-11
AU2013271541C1 (en) 2018-01-18
US20160237132A1 (en) 2016-08-18
AU2013271545C1 (en) 2017-09-28
EP2859015B1 (en) 2018-03-21
EP2874639A4 (en) 2016-05-11
JP6545759B2 (ja) 2019-07-17
CA2869787C (en) 2021-11-23
LT2859015T (lt) 2018-07-10
ES2667558T3 (es) 2018-05-11
DK3401402T3 (da) 2021-01-11
SI2859015T1 (sl) 2018-12-31
AU2013271545B2 (en) 2016-03-03
NZ630851A (en) 2016-07-29
PL3401402T3 (pl) 2021-05-31
EP2874639A2 (en) 2015-05-27
EP2859015A1 (en) 2015-04-15
AU2013271545A1 (en) 2014-10-16
EP2859015A4 (en) 2015-11-18
WO2013184939A3 (en) 2014-01-30
US20160052983A1 (en) 2016-02-25
US10183979B2 (en) 2019-01-22
NZ630848A (en) 2016-07-29
CA2869786A1 (en) 2013-12-12
HUE052908T2 (hu) 2021-05-28
US9156897B2 (en) 2015-10-13
JP6234446B2 (ja) 2017-11-22
TR201809046T4 (tr) 2018-07-23
JP2019195332A (ja) 2019-11-14
PL2859015T3 (pl) 2018-08-31
HK1203969A1 (en) 2015-11-06
SMT202100007T1 (it) 2021-03-15
EP3401402B1 (en) 2020-10-14
WO2013184938A3 (en) 2014-01-30
WO2013184938A2 (en) 2013-12-12
JP7350041B2 (ja) 2023-09-25
EP2874639B1 (en) 2018-03-28
NZ715099A (en) 2018-12-21
JP6322626B2 (ja) 2018-05-09
US9296801B2 (en) 2016-03-29
CA2869674A1 (en) 2013-12-12
ME03079B (me) 2019-01-20
HK1210055A1 (en) 2016-04-15
HRP20201973T1 (hr) 2021-02-05
US9359415B2 (en) 2016-06-07
JP2015520193A (ja) 2015-07-16
HK1203820A1 (en) 2015-11-06
EP2858672A4 (en) 2016-02-10
US20130336924A1 (en) 2013-12-19
JP6388408B2 (ja) 2018-09-12
AU2013271541A1 (en) 2014-10-23
LT3401402T (lt) 2020-12-28
SI3401402T1 (sl) 2021-03-31
NZ630849A (en) 2016-04-29
US20140234962A1 (en) 2014-08-21
CA2869787A1 (en) 2013-12-12
US20130338067A1 (en) 2013-12-19
SMT201800363T1 (it) 2018-09-13
US20130336925A1 (en) 2013-12-19
RS57369B1 (sr) 2018-08-31
JP2023109948A (ja) 2023-08-08
JP2018038389A (ja) 2018-03-15
EP2858672A2 (en) 2015-04-15
ES2842677T3 (es) 2021-07-14
JP2015525217A (ja) 2015-09-03
US10407481B2 (en) 2019-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7350041B2 (ja) アゴニストおよびアンタゴニストとしての循環置換により修飾されるリガンド
EP2697257B1 (en) Fc fusion proteins comprising novel linkers or arrangements
US8927693B2 (en) Fibronectin based scaffold domain proteins that bind IL-23
CN103380143B (zh) 结合il-23的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白质
AU2018200597B2 (en) Ligands modified by circular permutation as agonists and antagonists
HK40053172A (en) Ligands modified by circular permutation as agonists and antagonists
HK1263216B (en) Ligands modified by circular permutation as agonists and antagonists
HK1263216A1 (en) Ligands modified by circular permutation as agonists and antagonists
HK1203969B (en) Ligands modified by circular permutation as agonists and antagonists