ES2675568T3

ES2675568T3 - Ligandos modificados mediante permutación circular como agonistas y antagonistas

Info

Publication number: ES2675568T3
Application number: ES13801437.8T
Authority: ES
Inventors: Juan Alvarez; Jean Chamoun
Original assignee: Alkermes Pharma Ireland Ltd
Current assignee: Alkermes Pharma Ireland Ltd
Priority date: 2012-06-08
Filing date: 2013-06-06
Publication date: 2018-07-11
Anticipated expiration: 2033-06-06
Also published as: AU2013271545B2; EP2874639B1; JP2015525217A; WO2013184938A2; HK1210055A1; HRP20201973T1; ME03079B; WO2013184942A1; US9156897B2; JP7350041B2; AU2013271542B2; JP6322626B2; US20160052983A1; EP2858672A2; EP3825405A1; EP2859015B1; LT2859015T; EP2874639A2; US20130336925A1; JP6388408B2

Abstract

Un polipéptido de fusión que comprende los aminoácidos 1 a 303 de la SEQ ID NO: 26, o una secuencia de aminoácidos homóloga a la misma con al menos el 70 % de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos que comprende una IL-2 permutada circularmente y tiene una 5 selectividad mejorada por IL-2Rßγ sobre IL-2Rαßγ en relación con la IL-2 de tipo silvestre.

Description

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DESCRIPCION

Ligandos modificados mediante permutación circular como agonistas y antagonistas Antecedentes de la invención

Las interacciones ligando-receptor son esenciales para una serie de vías de señalización celular. Los factores de crecimiento, las citocinas y otras proteínas reguladoras usan estas interacciones para mediar las respuestas celulares. Las proteínas que inhiben o facilitan estos procesos tienen potencial como agentes terapéuticos.

Dados algunos de los inconvenientes de las estrategias de anticuerpos monoclonales para inhibir las funciones ligando-receptor tales como la cara fabricación, el gran tamaño, la limitada penetración en tejidos y los efectos secundarios indeseables, los investigadores se han centrado en el uso de proteínas no de anticuerpos como agentes terapéuticos. Además, Las estrategias de anticuerpos terapéuticos generalmente se limitan a la inhibición o al antagonismo, y no son competentes para estrategias para potenciar o actuar como antagonista de una vía. Por tanto, se están explorando nuevas estrategias de ingeniería de proteínas para desarrollar ligandos y receptores como agonistas y antagonistas de dianas clínicamente importantes como una alternativa a estrategias de anticuerpos.

La permutación circular implica la unión de los extremos amino y carboxilo naturales de una proteína, generalmente con un enlazador, y la creación de nuevos extremos amino y carboxilo mediante la escisión en un nuevo sitio en la secuencia de la proteína, generalmente un bucle; de manera tal que la secuencia primaria de la proteína resultante se reorganiza, mientras que la estructura secundaria (y la actividad) se mantiene. Por tanto, la creación de los nuevos extremos puede proporcionar mejores localizaciones para la unión de un miembro de fusión en relación con los extremos naturales.

La permutación circular de un ligando de proteína proporciona un medio mediante el cual se puede alterar una proteína para producir nuevos extremos carboxilo y amino sin disminuir la especificidad y la afinidad de unión del ligando de proteína alterado por su diana en relación con su forma natural. Adicionalmente, los nuevos extremos se pueden mover preferentemente a una localización preferencial para incorporar el ligando permutado circularmente en un polipéptido de fusión, y demostrar una mejor actividad en comparación con un polipéptido de fusión que contiene el ligando natural (no permutado circularmente). Los ligandos permutados circularmente se desvelan en el documento WO 95/27732. Las proteínas de fusión que comprenden una interleucina y el dominio de unión de un receptor de interleucina se desvelan en el documento WO 2010/020766. La presente invención proporciona polipéptidos de fusión que comprenden ligandos modificados mediante permutación circular que funcionan como agonistas, superagonistas o antagonistas de una vía de señalización. Tales polipéptidos de fusión son beneficiosos en el tratamiento de muchos trastornos, afecciones y enfermedades que dependen de la interacción ligando-receptor y la transducción de señal. Por ejemplo, tales polipéptidos de fusión que actúan como antagonistas de un receptor diana tienen potencial como agentes terapéuticos para el cáncer y trastornos autoinmunes. Tales polipéptidos de fusión que actúan como agonistas o superagonistas de una vía de señalización tienen el potencial, por ejemplo, en cáncer o en medicina regenerativa.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende los aminoácidos 1 a 303 de la SEQ ID NO: 26, o una secuencia de aminoácidos homóloga a la misma con al menos el 70 % de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos que comprende una IL-2 permutada circularmente que tiene una selectividad mejorada por IL-2RpY sobre IL-2RapY en relación con la IL-2 de tipo silvestre.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de fusión del primer aspecto y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica el polipéptido de fusión del primer aspecto.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un vector recombinante que comprende el ácido nucleico del tercer aspecto.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una célula hospedadora que comprende el vector del cuarto aspecto.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona el polipéptido de fusión del primer aspecto para su uso en medicina.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona el polipéptido de fusión del primer aspecto para su uso en un método de tratamiento de cáncer o una afección autoinmune.

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En el presente documento se desvelan polipéptidos de fusión que comprenden ligandos de polipéptido que se modifican mediante permutación circular y se fusionan con al menos un miembro de fusión de polipéptido en donde tales polipéptidos de fusión tienen funciones o actividades biológicas nuevas, mejoradas o potenciadas en relación con la proteína de fusión análoga con el ligando natural (no permutado circularmente). Tales mejoras incluyen, pero sin limitación, mayor afinidad de unión, mayor actividad, mayor actividad agonista (superagonista), mayor actividad antagonista, mayor accesibilidad, mayor flexibilidad del sitio activo, mayor estabilidad, especificidad de sustrato más amplia y/o cambiada, mayor direccionamiento hacia el tejido, mayor unión de proteínas, mayor direccionamiento de membrana, parámetros farmacocinéticos potenciados, propiedades físicas potenciadas, y combinaciones de las mismas.

Los ligandos permutados circularmente pueden comprender todas o cualquier parte de sus cadenas de polipéptidos naturales, y pueden incluir opcionalmente enlazadores. Los ligandos permutados circularmente se diseñan para estar orientados de forma óptima, de manera que se puedan fusionar con al menos un miembro de fusión de polipéptido deseado sin comprometer la actividad, tal como la afinidad de unión del ligando modificado por su diana. Los ligandos permutados circularmente (modificados) de los polipéptidos de fusión pueden ser al menos tan activos, y preferentemente más activos, que en comparación con sus correspondientes proteínas naturales. En el presente documento se desvelan proteínas de fusión que tienen una mayor afinidad de unión por sus proteínas diana. La afinidad de unión de la proteína de fusión por su proteína diana puede ser al menos 5 veces, preferentemente al menos 10 veces, preferentemente al menos 20 veces, o más, mayor que la afinidad del ligando natural por la diana proteica. El polipéptido de fusión puede tener afinidad de unión por el receptor al menos 10 veces mayor.

Los ligandos se pueden seleccionar del grupo que incluye, pero sin limitación, citocinas, linfocinas, quimiocinas, adipocinas, factores de crecimiento, hormonas, moléculas de adhesión celular y neurotransmisores. Los miembros de fusión de polipéptidos pueden ser cualquier polipéptido que proporcione y que mejore la proteína natural. Por ejemplo, los miembros de fusión se pueden seleccionar del grupo que incluye, pero sin limitación, todo o una parte de: glucoproteínas, proteoglicanos, moléculas de señalización celular, proteínas accesorias, receptores solubles, receptores unidos a la membrana, receptores transmembrana, anticuerpos, enzimas, polipéptidos de direccionamiento (por ejemplo, nanocuerpos), mucinas o péptidos de tipo mucina, polipéptidos sintéticos o cualquier combinación de los mismos. Las mejoras incluyen, pero sin limitación, mejoras en la afinidad, agonismo, antagonismo, adición de actividad funcional sinérgica, direccionamiento hacia el tejido, direccionamiento de proteína, direccionamiento de membrana, parámetros farmacocinéticos (por ejemplo, la semivida), o propiedades físicas (por ejemplo, solubilidad).

Tal como se desvela en el presente documento, al menos un miembro de fusión de polipéptidos comprende toda o una parte de una subunidad del receptor diana u otra molécula implicada en su vía de transducción de señal natural. Se entiende que un miembro de fusión de polipéptidos puede comprender un polipéptido que es al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 % homólogo a toda o a una parte de una subunidad de un receptor diana u otra molécula implicada en una vía de transducción de señal.

En el presente documento se desvelan polipéptidos de fusión que comprenden un ligando modificado y un miembro de fusión de polipéptidos que están ligados adicionalmente a un segundo miembro de fusión. Los ejemplos de los segundos miembros de fusión incluyen todo o cualquier parte de un anticuerpo (por ejemplo, la región Fc de un anticuerpo) y cualquiera de los tipos de polipéptidos adecuados como un primer miembro de fusión descritos anteriormente.

En el presente documento se desvelan, los polipéptidos de fusión que funcionan como agonistas nuevos y mejorados (superagonistas) o antagonistas de un receptor tal como un receptor celular que está implicado en la transducción de señal de una vía de señalización celular. Los polipéptidos de fusión se pueden unir a un receptor de diana monomérico, dimérico o multimérico y pueden inhibir o potenciar la dimerización, la trimerización o la multimerización del receptor y/o inhibir o potenciar la transducción de señal y la señalización aguas abajo de una vía celular.

En el presente documento se desvela un polipéptido de fusión que comprende, un primer miembro de fusión de polipéptidos unido a un ligando modificado que se corresponde con un ligando natural específico para un receptor de diana, en donde el ligando modificado se ha permutado circularmente para crear un nuevo extremo N-terminal y un nuevo extremo C-terminal en comparación con el ligando natural, y en donde el nuevo extremo N-terminal o el nuevo extremo C-terminal del ligando modificado está unido a un primer miembro de fusión de polipéptidos para formar un polipéptido de fusión que opcionalmente tiene una mayor afinidad por el receptor de diana en comparación con el ligando natural por el receptor, y en donde tras la asociación del polipéptido de fusión con el receptor de diana, el polipéptido de fusión actúa como superagonista o como antagonista de la actividad del receptor de diana. El nuevo extremo C-terminal y el nuevo extremo N-terminal del ligando modificado puede no alterar cualquier dominio de unión del ligando modificado por el receptor diana.

El receptor diana puede funcionar mediante la formación por etapas de un complejo multimérico de activación para desencadenar una transducción de señal de una vía de señalización celular y en donde tras la unión del polipéptido de fusión al receptor, la transducción de señal tiene efecto superagonista o antagonista.

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El polipéptido de fusión se puede unir al receptor y mejorar la formación por etapas del complejo multimérico de activación actuando así como superagonista de la transducción de la señal mediante el receptor diana.

El polipéptido de fusión se puede unir al receptor e impedir de forma estérica la formación por etapas del complejo multimérico actuando así como antagonista de la transducción de señal mediante el receptor diana.

En el presente documento se desvela un polipéptido de fusión que comprende el ligando modificado y un primer miembro de fusión, en donde el primer miembro de fusión del ligando modificado proviene de toda o una parte de la proteína con la que se habría asociado el ligando natural del receptor diana en la primera etapa de la formación por etapas del complejo multimérico de activación del receptor. El polipéptido de fusión puede comprender la proteína modificada y un miembro de fusión en donde el miembro de fusión de la proteína modificada proviene de toda o una parte de la proteína con la que se habría asociado el receptor diana en etapas aguas abajo de la formación paso a paso del complejo multimérico de activación del receptor.

El primer miembro de fusión del heterodímero se puede fusionar al ligando modificado en una posición que está orientada para mejorar la formación paso a paso del complejo multimérico de activación del receptor.

El primer miembro de fusión del heterodímero se puede fusionar al ligando modificado en una posición que se orienta para impedir estéricamente la formación del complejo multimérico de activación del receptor.

El polipéptido de fusión puede ser un homodímero que comprende la proteína modificada y un miembro de fusión en donde el miembro de fusión del ligando modificado proviene de todo o una parte del mismo ligando en donde la homodimerización se requiere para la formación del complejo multimérico de activación del receptor.

En el presente documento se desvela un método de actuación como superagonista de un receptor diana que comprende la etapa de poner en contacto el receptor con el polipéptido de fusión de la invención.

En el presente documento se desvela un método de actuación como antagonista de un receptor diana que comprende la etapa de poner en contacto el receptor con un polipéptido de fusión de la invención.

En el presente documento se desvela un método para preparar un polipéptido de fusión que comprende las etapas de: a) seleccionar un ligando natural que se une a un receptor en donde el receptor funciona mediante una formación por etapas de un complejo multimérico de activación para desencadenar una transducción de señal de una vía de señalización celular; b) crear un ligando modificado mediante permutación circular para proporcionar un ligando modificado que tiene un nuevo extremo N-terminal y un nuevo extremo C-terminal en comparación con el ligando natural de la etapa (a); y c) unir un primer miembro de fusión de polipéptido al extremo N-terminal o C- terminal del ligando modificado de la etapa (b) para crear un polipéptido de fusión, en donde los nuevos extremos de N-terminal o C-terminal del ligando modificado se localizan para permitir que el primer miembro de fusión se una al ligando modificado en una posición orientada para actuar como antagonista o superagonista de la función del receptor diana tras la unión del polipéptido de fusión al receptor diana. El método puede comprender adicionalmente fusionar un segundo miembro de fusión al ligando modificado de la etapa (b) en donde el segundo miembro de fusión proporciona una mejora adicional a la proteína, tal como prolongar la semivida del polipéptido de fusión in vivo. Otras mejoras que se podrían hacer por ingeniería mediante la etapa (c) incluyen, pero sin limitación, adición de actividad funcional sinérgica, direccionamiento hacia el órgano, direccionamiento hacia el tejido, direccionamiento de proteína, direccionamiento de membrana, direccionamiento de matriz biológica, farmacocinética (por ejemplo, porcentaje de biodisponibilidad) o propiedades físicas (por ejemplo, solubilidad).

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1. Estructura del complejo hexamérico de señalización IL6 (PDB: 1P9M). Vista lateral (parte superior) y vista superior (parte inferior) del complejo hexamérico que consiste en dos moléculas de IL-6 (gris oscuro), dos moléculas solubles de IL-6Ra (D2-D3 de la subunidad a del receptor de IL6, negro) y dos moléculas solubles de gp130 (D1-D2-D3, gris claro).

FIG. 2. Ilustración del proceso de permutación circular que utiliza la proteína del conjunto de 4 hélices, IL-6. Representación en cinta de la estructura cristalina de IL-6 (PDB 1P9M, superior izquierda) y de la estructura modelada de una IL-6 permutada circularmente (RDB1503, superior derecha). Los extremos N-terminal y C- terminal se etiquetan como las hélices A, B, C, D según la nomenclatura estándar de IL-6. La proteína permutada circularmente se diseñó uniendo los extremos naturales y creando nuevos extremos entre las hélices C y D de la IL-6 natural. El resultado final de la permutación circular es la reubicación de los términos en la cara opuesta de IL-6. Las secuencias de aminoácidos para IL-6 (restos 47-212 de la SEQ ID NO: 3) y RDB1503 (SEQ ID NO: 1) (medio e inferior, respectivamente) resaltan la secuencia reordenada. El nuevo extremo N-terminal de RDB1503 precede de manera inmediata a la hélice D. El área sombreada en la representación en cintas y la secuencia proteica de RDV1503 resalta el enlazador creado para conectar los extremos N-terminal y C-terminal de la IL-6 natural.

FIG. 3. Modelo molecular que ilustra la orientación relativa del D1 (dominio 1 de gp130) cuando se fusiona a IL-6 (FIG. 3A) y RDB1503 (FIG. 3B), dando como resultado las proteínas de fusión RDB1529 y RDB1527,

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respectivamente. El dominio D1 está sombreado para resaltarlo. Las partes de gp130 y IL-6Ra en el complejo hexamérico activo se incluyen como referencia. El dominio D1 de RDB1529 apunta hacia fuera de la interfaz de unión a gp130 en el complejo activo hexamérico y, por lo tanto, se predice que no puede antagonizar eficazmente la señal (Figura 3A). En contraste, el dominio D1 de RDB1527 participa en la unión a IL-6Ra y ocupa el espacio ocupado por la segunda molécula de gp130 en el complejo hexamérico, antagonizando así eficazmente la señal (Figura 3B).

FIG. 4. Curvas de respuesta a la dosis para IL-6 (A) y RDB1503 ( : ) en el ensayo celular HEK-Blue™. La CEso se estima a 1 pM y a 0,6 pM, para IL-6 y RDB1503, respectivamente.

FIG. 5. Inhibición de la señalización de IL6 mediante RDB1527 en el ensayo celular HEK-Blue™. Actividad de IL6 ( y ) como una función de su concentración en ausencia de inhibición. La inhibición mediante

RDB1527(™1dfc™), y RDB1529 (..■■■: —) se midieron en presencia de 12,5 pM de IL6. Todas las mediciones se

hicieron por duplicado. El valor estimado de la Clso para RDB1527 es 0,22 nM. RDB1529 no presentó una fuerte actividad inhibidora.

FIG. 6. Medidas de resonancia de plasmón superficial (SPR) de IL-6Ra soluble que se une a IL-6 inmovilizada (FIG. 6A), RDB1529 (FIG. 6B) y RDB1527 (FIG. 6C). Los sensogramas y las curvas ajustadas están en gris y en negro, respectivamente. Los parámetros cinéticos calculados a partir de los datos están en las tablas insertadas. FIG. 7. Estructura del complejo de señalización IL-1p humano (PDB: 4DEP; FIG. 7A) y una representación modelo de la posible formación del complejo mediada por RDB1538 (CP_IL-1p_IL-1RI (D1-D2); FIG. 7B). IL-1p (resaltado con una flecha en la estructura) se une a los receptores IL-1RI (negro, que sale del plano) e IL-1RAcP (gris claro, que se aleja del plano). Los extremos naturales N-terminal y C-terminal de IL-1p no están en estrecha proximidad al extremo C-terminal del dominio D1-D2 de IL1RI. Los extremos de la IL-1p diseñada y permutada circularmente están ahora próximos al extremo C-terminal del dominio D1-D2 de IL-1RI, facilitando así la generación de la proteína de fusión. El área sombreada resalta el enlazador que conecta la variante IL-1p permutada circularmente al receptor IL-1RI.

FIG. 8. Estructura del complejo de señalización IL2 humano (PDB: 2ERJ; FIG. 8A) y el complejo de señalización modelado mediado por RDB1405 (CP_IL-2_IL-2Ra; FIG. 8B). IL2 (resaltado con una flecha en la estructura) se une a los receptores IL2Ra (gris, parte superior izquierda en el complejo), IL2Rp (gris claro, parte inferior izquierda en el complejo) y Yc (negro, parte inferior derecha en el complejo). IL-2Ra estabiliza la conformación de IL-2 para mejorar su afinidad de unión a IL-2Rp. Los extremos N-terminal y C-terminal naturales de IL-2 están en la cara distal a la interfaz IL-2/IL-2Ra. Los extremos de la IL-2 diseñada y permutada circularmente están ahora próximos a la interfaz IL-2/IL-2Ra, facilitando así la generación de la proteína de fusión. El área sombreada resalta el enlazador que conecta la variante de IL-2 permutada circularmente al receptor IL-2Ra.

FIG. 9. Es un diagrama que muestra los complejos de señalización representativos para citocinas, y factores de crecimiento que ilustran el ensamblaje multimérico que lleva a la activación.

FIG. 10. Es un diagrama que representa el mecanismo de antagonismo por Picasso3_D1. Los determinantes de unión tanto de IL-6 como de D1 (dominio de gp130) están presentes en la proteína de fusión híbrida dando como resultado una alta afinidad de unión a IL-6Ra. Una vez que Picasso3_D1_Fc está unido a IL-6Ra, el ensamblaje del complejo de señalización de IL-6 no puede proceder, dando como resultado el antagonismo.

FIGs. 11A y 11B. Respuesta de las células HH (izquierda) y de las células CTLL-2, (derecha) a la IL-2 de tipo silvestre (proleucina) y a variantes diseñadas de IL-2.

FIGs. 12A y 12B. Respuesta de las células HH (izquierda) y de las células CTLL-2, (derecha) a la IL-15 de tipo silvestre y a variantes diseñadas de IL-15.

FIG. 13. Estructura del complejo de señalización IL-15 modelado para las proteínas de fusión CP-IL-15-IL-15Ra generado mediante superposición del complejo IL-15/IL-15Ra (2Z3Q.pdb en las cadenas de IL-Rp e IL-2Ry de la estructura del complejo de señalización ternario IL-2, 2ERJ.pdb). El "enlazador" que une los extremos naturales de IL-15 para crear la variante de IL-15 permutada circularmente y el "espaciador" para crear la fusión CP-IL-15- IL-15Ra se resaltan con flechas. Nótese que los extremos naturales de IL-15 (originalmente localizados en el sitio del "enlazador") se orientan muy distalmente de la interfaz de unión de IL-15Ra, creando así la necesidad de la permutación circular del ligando.

Descripción detallada de la invención

A continuación, sigue una descripción de las realizaciones preferidas de la invención. En el presente documento se desvelan una proteína de fusión de polipéptidos que presenta un ligando IL-6 permutado circularmente fusionado a una parte de gp130. Se entiende que las funciones, las actividades biológicas y otras características de las realizaciones descritas se aplican generalmente a otros polipéptidos de fusión que comprenden ligandos modificados mediante permutación circular fusionados a miembros de fusión de polipéptidos.

Tal como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" o "la" incluyen referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un miembro de fusión de polipéptidos" incluye una pluralidad de miembros de fusión de polipéptidos. En la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones que se presentan a continuación, se hará referencia a una serie de términos que se definirán con los siguientes significados, a menos que una intención contraria sea evidente.

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Definiciones

Las expresiones "permutación circular" y "permutado circularmente" "(PC)" tal como se usan en el presente documento, se refieren al proceso conceptual de tomar una proteína lineal, o su secuencia de ácido nucleico afín y fusionar los extremos naturales N-terminal y C-terminal (directamente o a través de un enlazador, usando proteínas o metodologías del ADN recombinante) para formar una molécula circular, y después cortar (¿abrir?) la molécula circular en una localización diferente para formar una nueva proteína lineal o molécula de ácido nucleico afín, con extremos diferentes a los extremos de la molécula original. La permutación circular, mantiene por lo tanto la secuencia, estructura y función de una proteína (diferente al enlazador opcional), mientras que genera nuevos extremos C-terminal y N-terminal en diferentes localizaciones que, de acuerdo con un aspecto de la invención, da como resultado una orientación mejorada para fusionar un miembro de fusión de polipéptidos deseados en comparación con el ligando original. La permutación circular también incluye cualquier proceso que da como resultado una molécula de cadena lineal permutada circularmente, tal como se define en el presente documento. En general, una molécula permutada circularmente de novo se expresa como una molécula lineal y no se somete formalmente a las etapas de circularización y apertura. La permutación circular particular de una molécula, en el presente documento, se designa mediante corchetes que contienen, en el caso de una proteína permutada circularmente, los restos de aminoácidos entre los que se elimina el enlace peptídico. Por ejemplo, la designación IL6(Q182/Q180) designa un factor de crecimiento de IL6 permutado circularmente en el que el sitio de apertura (posición a la cual se elimina el enlace peptídico) tiene lugar entre los restos Q182 y Q180 de la IL-6 natural no permutada o no modificada y, por lo tanto, el extremo N-terminal recién creado es una glutamina que era anteriormente el resto 182 y el extremo C-terminal recién creado es una glutamina que anteriormente era el resto 180.

Un "espaciador", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un péptido que une las proteínas que comprenden una proteína de fusión. Generalmente, el espaciador no tiene una actividad biológica específica y su propósito es simplemente unir las proteínas para conservar alguna distancia mínima u otra relación espacial entre ellas. Sin embargo, los aminoácidos constitutivos de un espaciador se pueden seleccionar basándose en algunas propiedades del enlazador o de la molécula resultante tal como la flexibilidad, la hidrofilia, la carga neta, la susceptibilidad proteolítica o ausencia de la misma, y la ausencia de inmunogenicidad.

Las expresiones ligando, polipéptido, proteína, citocina o factor de crecimiento "no permutado", "natural", de "tipo silvestre" (wt como abreviatura, del inglés wild type a lo largo del texto), o "no modificado", se usan en el presente documento para proporcionar un punto de referencia para el ligando, la citocina, el factor de crecimiento o la proteína antes de su reordenamiento en una molécula permutada circularmente, tal como se describe anteriormente. Normalmente, el ligando, el factor de crecimiento o la proteína no modificados tienen los extremos amino y carboxilo y la secuencia de aminoácidos que sustancialmente se corresponden con los extremos amino y carboxilo y la secuencia de aminoácidos del ligando, factor de crecimiento o proteína o un dominio independiente de una proteína, tal como se dan de manera general in vivo. El ligando, factor de crecimiento o proteína no modificada puede ser una forma madura completa o un precursor de la forma madura (tal como una proproteína).

El término "ligando" se usa en el presente documento generalmente para denotar cualquier polipéptido (ya sea natural, endógeno o modificado de acuerdo con la invención) que se une a una segunda proteína o receptor y es un componente de una vía bioquímica. Un ligando directa o indirectamente puede afectar (por ejemplo, inducir, inhibir) a la actividad del receptor (por ejemplo, señalización, adhesión).

La expresión "ligando modificado" se usa en el presente documento para indicar un ligando que se ha modificado mediante permutación circular en comparación con el correspondiente ligando natural.

"Actividad" o "actividad biológica" se refiere a una función biológica o a un efecto in vitro o in vivo, que incluyen, pero sin limitación, la unión al receptor, la actividad antagonista, la actividad agonista, o una respuesta celular o fisiológica.

Un "agonista" es un polipéptido de fusión desvelado en el presente documento que es capaz de unirse a un receptor deseado para dar como resultado un complejo de receptor activado. Un "superagonista" es un polipéptido de fusión de la invención capaz de unirse al receptor diana y que proporciona una activación mejorada del complejo del receptor en comparación con el ligando natural para ese receptor diana. La activación mediante el superagonista de polipéptido de fusión de la invención se puede mejorar al menos dos veces, y preferentemente al menos 5 veces, preferentemente al menos 10 o preferentemente al menos 20 veces o más en comparación con la activación del receptor diana mediante el ligando natural. Un polipéptido de fusión de la invención "que tiene actividad agonista" se refiere al hecho de que los polipéptidos de fusión son capaces de unirse a y de activar o actuar como superagonista de al menos un receptor.

Un "antagonista" es un polipéptido de fusión desvelado en el presente documento que es capaz de unirse a un receptor deseado pero incapaz de mediar cambios conformacionales o ensamblajes moleculares correctos de las moléculas del receptor necesarias para dar como resultado un complejo activado, y mediante lo cual, se inhibe sustancialmente la activación del receptor mediada por ligando natural. La activación del receptor tras la unión de un

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ligando adecuado generalmente implica bien un cambio conformacional en el receptor o una diferencia en los estados de asociación del receptor, por ejemplo, oligomerización de las subunidades del receptor o reclutamiento de proteínas o receptores adicionales.

El término "receptor" se entiende que indica una proteína presente sobre una superficie celular (o un receptor soluble no presente sobre la superficie celular pero que tiene o se asocia con un receptor de superficie celular equivalente) con el que se une un ligando. Los receptores de superficie celular se componen típicamente de diferentes dominios o subunidades con diferentes funciones, tales como un dominio extracelular (o dominios) que contiene la región con la que interactúa el ligando, un dominio o dominios transmembrana (o en algunos casos, un lípido de anclaje) que ancla el receptor en la membrana celular. En algunos casos, también está presente un dominio efector intracelular que inicia una señal celular en respuesta a la unión del ligando (transducción de señal). Los receptores solubles típicamente se componen de uno o más de los dominios extracelulares que son resultado de la escisión proteolítica de la región de anclaje a la membrana.

"Receptores diana" o "ligandos diana" de acuerdo con la invención son las moléculas a las que se diseñan los polipéptidos de fusión de la invención para unirse directamente. En una realización, los "receptores diana" de acuerdo con la invención son capaces de unirse finalmente o de asociarse de otro modo con, moléculas de señalización (por ejemplo, ligandos) en la activación de una transducción de señal en de una vía de señalización celular.

Un receptor que se activa mediante "la formación por etapas de un complejo multimérico de activación" es un receptor que además de la unión de uno o más ligandos, requiere la interacción de una o más subunidades proteicas adicionales en un proceso conocido como dimerización, trimerización, multimerización, complejación u oligomerización (también denominado en la materia como "agrupación") para lograr por completo la transducción de señal de una vía de señalización celular. El receptor puede estar ya en la forma de un dímero o multímero antes de la unión del ligando y tras la unión del ligando puede reclutar proteínas solubles o ancladas a la membrana adicionales de manera sucesiva para construir el complejo multimérico de activación de funcionamiento completo.

El "radio hidrodinámico" es el radio aparente (Rh en nm) de una molécula en una solución calculada a partir de propiedades de difusión. El "radio hidrodinámico" de una proteína afecta a su tasa de difusión en forma acuosa. El radio hidrodinámico de una proteína está influenciado por su peso molecular así como por su estructura, incluyendo la forma y su compactación y su estado de hidratación. Los métodos para determinar el radio hidrodinámico son bien conocidos en la materia, tales como el uso de DLS y la cromatografía por exclusión de tamaño. La mayoría de las proteínas tiene estructura globular, que es la estructura tridimensional más compacta que puede tener una proteína con el radio hidrodinámico más pequeño. Algunas proteínas adoptan una conformación no estructurada aleatorizada y abierta o 'lineal' y como resultado tienen un radio hidrodinámico mucho mayor en comparación con las proteínas globulares típicas de peso molecular similar.

Un "polipéptido de dominio de mucina" se define en el presente documento como cualquier proteína que comprende un "dominio mucina". Un dominio mucina es rico en posibles sitios de glucosilación, y tiene un elevado contenido de serina y/o treonina y prolina, que puede constituir más del 40 % de los aminoácidos. Un dominio mucina está fuertemente glucosilado con glucanos predominantemente enlazados a O.

El término "enlazador" o "secuencia de enlazador" tal como se usa en el presente documento, se refiere a la secuencia peptídica que se usa para unir los extremos amino y carboxilo de una proteína (o su correspondiente secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína) a través de enlaces covalentes tanto para el extremo amino como para el extremo carboxilo. En algunas realizaciones, la proteína permutada circularmente se produce mediante la unión de los extremos de la correspondiente secuencia de ADN o de ARN, formando diversos permutantes mediante el corte de la secuencia de ácido nucleico circularizada, y posteriormente la traducción de las secuencias de ácido nucleico para formar la(s) proteína(s) permutadas circularmente.

El término "resto" tal y como se usa en el presente documento se refiere a un aminoácido que se incorpora en un péptido. El aminoácido puede ser un aminoácido de origen natural y, salvo que se limite de otro modo, puede abarcar análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden funcionar de una manera similar que los aminoácidos de origen natural.

La expresión "sitio de apertura", tal como se usa en el presente documento cuando se refiere a la permutación circular, se refiere a la posición en la que un enlace peptídico se eliminaría para formar nuevos extremos amino y carboxilo, bien mediante manipulación de proteínas o de ácido nucleico. El sitio de apertura se designa mediante las posiciones del par de aminoácidos, localizadas entre los extremos amino y carboxilo de la proteína no permutada (natural) que llegan a ser los nuevos extremos amino y carboxilo de la proteína permutada circularmente. Por ejemplo, en IL6(Q182/Q180), el extremo N-terminal recién creado (el nuevo punto de partida de la IL-6 permutada circularmente) es equivalente (estructuralmente) a Q182 de la IL-6 natural y el extremo C-terminal recién creado (el último resto de la IL-6 permutada circularmente) es equivalente (estructuralmente) a Q180 de la IL-6 natural. El resto 181 de la IL-6 natural se eliminó en la creación del sitio de apertura.

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Los términos "polipéptidos" y "proteína" se usan de manera intercambiable en el presente documento e incluyen proteínas y fragmentos de las mismas. En el presente documento se desvelan polipéptidos como secuencias de restos de aminoácidos. Estas secuencias se escriben de izquierda a derecha en la dirección desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo. De acuerdo con la nomenclatura convencional, las secuencias de restos de aminoácidos se denominan bien mediante un código de tres letras o de una única letra tal como se indica a continuación: Alanina (Ala,A), Arginina (Arg;R), Asparagina (Asn;N), Ácido aspártico (Asp,D), Cisteína (Cys;C), Glutamina (Gln;Q), Ácido glutámico (Glu,E), Glicina (Gly;G), Histidina (his, H), Isoleucina (Ile,I), Leucina (Leu;L), Lisina (Lys;K), Metionina (Met;M), Fenilalanina (Phe;F), Prolina (Pro;P), Serina (Ser;S), Treonina (Thr;T), Triptófano (Trp;W), Tirosina (Tyr,), y Valina (Val,V).

Todas las posiciones de aminoácidos descritas en el presente documento usan como marco de referencia secuencias para la proteína natural. Por ejemplo, IL-1p natural (SEQ ID NO:19), IL-6 natural (SEQ ID NO:3), IL-2 natural (SEQ ID NO:20), gp130 natural (SEQ ID NO:21), IL-1RI natural (SEQ ID NO:22), e IL-2Ra natural (SEQ ID NO:23) tal como se presentan en el Listado de secuencias. Por ejemplo, una molécula de IL-6 "que comprende los aminoácidos 47 a 212" se referiría a una molécula que tiene aminoácidos que sustancialmente se corresponden con esas posiciones en la SEQ ID NO:3. En el presente documento se usan otras referencias comunes para indicar deleciones o sustituciones para una secuencia usando como referencia secuencias, las respectivas secuencias naturales tal como se citan en el listado de secuencias o cuyo número de registro se proporciona en el presente documento. Las sustituciones de aminoácidos se pueden indicar mediante paréntesis, por ejemplo, "(Ser 287)" se refiere a una molécula que tiene serina en la posición del aminoácido 287. Las moléculas permutadas circularmente se designan mediante la molécula natural seguida entre corchetes que encierran las posiciones de aminoácidos que comprenden el sitio de apertura. Por tanto, por ejemplo, IL6 (182/180) designa una IL6 permutada circularmente en la que el nuevo extremo amino está en el resto de aminoácidos 182, y el nuevo extremo carboxilo está en el resto de aminoácidos 180 de la IL6 natural no permutada. Se reconoce que pueden realizarse algunas sustituciones, adiciones o deleciones a cualquiera de las secuencia descritas en este documento que no alteren la actividad biológica de la región. De hecho, se pueden requerir algunas de tales modificaciones para lograr la expresión de una proteína particular. Por tanto, por ejemplo, se puede añadir una metionina a una secuencia para proporcionar un iniciador.

"Variante" se refiere a un polipéptido que difiere de un polipéptido de referencia, pero mantiene sus propiedades esenciales. Una variante típica de un polipéptido difiere de otro polipéptido en su secuencia primaria de aminoácidos. En general, las diferencias son limitadas, de modo que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante sean muy similares en general y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia puede diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más modificaciones (por ejemplo, las sustituciones, adiciones y/o deleciones). Un resto de aminoácido sustituido o insertado puede o no estar codificado por el código genético. Una variante de un polipéptido puede ser de origen natural tal como una variante alélica o puede ser una variante que no es conocida por darse en la naturaleza. Además, el término "variante" tal como se usa en el presente documento incluye permutaciones circulares de proteínas y péptidos.

El término "anticuerpo", tal como se usa en el presente documento, incluye diversas formas de anticuerpos modificados o alterados, tales como una inmunoglobulina intacta, un fragmento de Fc que comprende la región constante de las cadenas pesadas, un fragmento de Fv que contiene solo las regiones variables de cadena ligera y pesada, un fragmento de Fv enlazado mediante un enlace disulfuro un fragmento Fab o (Fab)'2 que contiene las regiones variables y las partes de las regiones constantes, un anticuerpo de cadena única y similares.

Tal como se usa en el presente documento, "tratamiento" o "tratar", o "paliar" o "aliviar" se usan de manera intercambiable en el presente documento. Estos términos se refieren a una estrategia para obtener resultados beneficiosos o deseados que incluyen pero no se limitan a un beneficio terapéutico y/o a un beneficio profiláctico. Beneficio terapéutico significa la erradicación o mejora del trastorno subyacente que se está tratando. Además, un beneficio terapéutico se logra con la erradicación o la mejora de uno o más de los síntomas fisiológicos asociados con el trastorno subyacente de manera que se observa una mejora en el sujeto, a pesar de que el sujeto todavía puede estar afligido con el trastorno subyacente. Para el beneficio profiláctico, las composiciones se pueden administrar a un sujeto en riesgo de desarrollar una enfermedad particular, o a un sujeto que comunica uno o más de los síntomas fisiológicos de una enfermedad, incluso aunque no se haya hecho un diagnóstico de esta enfermedad.

Un "efecto terapéutico", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un efecto fisiológico, incluyendo pero sin limitación, mitigación, mejora o prevención de la enfermedad en seres humanos u otros animales o para mejorar el bienestar físico o mental de seres humanos o animales, causado por una proteína de fusión de la invención que no sea la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico poseído por la proteína activa. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.

Las expresiones "cantidad terapéuticamente eficaz" y "dosis terapéuticamente eficaz", tal como se usa en el presente documento, se refieren a una cantidad de una proteína activa, bien sola o como parte de una composición de proteína de fusión, que es capaz de tener cualquier efecto beneficioso detectable sobre cualquier síntoma,

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aspecto, parámetro de medida o características de un estado de enfermedad o afección cuando se administra en una dosis o en dosis repetidas a un sujeto. Dicho efecto no necesita ser absoluto para ser beneficioso.

La expresión "régimen de dosis terapéuticamente eficaz", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una pauta para administrar de manera consecutiva dosis de una proteína activa, bien sola o como parte de una composición de proteína de fusión, en donde las dosis se dan en cantidades terapéuticamente eficaces para dar como resultado un efecto beneficioso sostenido sobre cualquier síntoma, aspecto, parámetro medido o características de un estado de enfermedad o afección.

Tal como se usa en el presente documento, el término "dosis" se refiere a la cantidad de polipéptido de fusión de la invención administrado a un sujeto todo de una vez (dosis unitaria) o en dos o más administraciones durante un intervalo de tiempo definido. Por ejemplo, la dosis se puede referir a la cantidad de polipéptido de fusión administrado a un sujeto durante el trascurso de un día (24 horas) (dosis diaria), dos días, una semana, dos semanas, tres semanas o uno o más meses (por ejemplo, mediante una única administración o mediante dos o más administraciones). El intervalo entre dosis puede ser cualquier cantidad deseada de tiempo.

La frase, "semivida", se refiere al tiempo que lleva a que la concentración sérica del polipéptido de fusión se reduzca al 50 %, in vivo, por ejemplo, debido a la degradación del ligado y/o a la eliminación o el secuestro del ligando doblemente específico mediante mecanismos naturales. La semivida de un polipéptido de fusión aumenta si la presencia en una matriz biológica (sangre, suero, plasma, tejido) persiste, in vivo, durante un período más largo en comparación con un control apropiado. La semivida puede aumentar en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o más en comparación con un control apropiado.

Las secuencias similares u homólogas (por ejemplo, al menos aproximadamente el 70 % de identidad de secuencia) para las secuencias desveladas en el presente documento también son parte de la invención. En algunas realizaciones, la identidad de secuencia a nivel de aminoácidos puede ser de aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, el 99 % o más. A nivel de ácido nucleico, la identidad de secuencia puede ser de aproximadamente el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, el 99 % o más. Como alternativa, existe una identidad sustancial cuando los segmentos de ácido nucleico hibriden en condiciones de hibridación selectiva (por ejemplo, condiciones de hibridación de muy alta rigurosidad) con el complemento de la cadena. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura.

Los cálculos de "homología" o "identidad de secuencia" o "similitud" entre dos secuencias (los términos se usan de manera intercambiable en el presente documento) se efectúan del siguiente modo. Las secuencias se alinean para fines comparativos (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o en ambas de una primera y una segunda secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico para un alineamiento óptimo y pueden descartarse secuencias no homólogas con fines comparativos). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada con fines comparativos es al menos un 30 %, preferentemente al menos el 40 %, más preferentemente al menos 50 %, incluso más preferentemente al menos el 60 % e incluso más preferentemente al menos el 70 %, 80 %, 90 %, 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. Después se comparan los restos de aminoácido o nucleótidos en posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en el presente documento, "homología" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "identidad" de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que necesita introducirse para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. En el caso de proteínas relacionadas de manera circular, la secuencia de uno de los miembros necesita ser divida aproximadamente en dos y alineada en dos secciones para lograr un alineamiento óptimo de los restos funcionalmente equivalentes necesarios para calcular el porcentaje de identidad.

Los alineamientos y la homología, similitud o identidad de secuencias de aminoácidos y de nucleótidos, tal como se definen en el presente documento preferentemente se preparan y se determinan usando el algoritmo de secuencias BLAST 2, usando parámetros por defecto (Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999)). Como alternativa, el algoritmo BLAST (versión 2.0) se emplea para el alineamiento de secuencias, con parámetros establecidos a valores por defecto. BLAST (del inglés Basic Local Alignment Search Tool o herramienta básica de búsqueda de alineación local) es el algoritmo de búsqueda heurística empleado por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx; estos programas atribuyen importancia a sus hallazgos utilizando los métodos estadísticos de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87(6):2264-8.

Salvo que definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en el presente documento tienen el mismo significado que el normalmente entendido por alguien con una habilidad habitual en la técnica (por ejemplo, en cultivo celular, en genética molecular, en química de ácido nucleico, en técnicas de hibridación y en bioquímica). Las técnicas convencionales se usan para métodos moleculares, genéticos y bioquímicos (véase, de manera general, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. (1989) Cold Spring Harbor

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Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4a Ed, John Wiley & Sons, Inc.) y en métodos químicos.

Permutación circular de un ligando de referencia

La permutación circular es funcionalmente equivalente a tomar una molécula de cadena lineal, fusionar los extremos para formar una molécula circular, y después cortar la molécula circular en una localización diferente para formar una nueva molécula de cadena lineal con extremos diferentes. La permutación circular, por lo tanto, tiene el efecto de preservar de manera esencial la secuencia y la identidad de los aminoácidos de una proteína mientras se generan nuevos extremos en diferentes localizaciones.

Las proteínas de fusión diseñadas apuntan a combinar las propiedades beneficiosas de dos polipéptidos en una única proteína, sin embargo, la construcción de la proteína de fusión viene con diversos retos y riesgos. A menudo, la actividad funcional de la proteína de fusión se compromete en relación con la de la proteína no modificada posiblemente debido a un efecto negativo del miembro de fusión sobre la integridad de la estructura terciaria de la proteína o sobre la capacidad de las proteínas para unirse a miembros afines (por ejemplo, debido al impedimento estérico) para generar su función biológica. Además, la inclusión de espaciadores entre los miembros de fusión puede aumentar el potencial de susceptibilidad a la proteolisis o, en el caso de proteínas terapéuticas, también aumenta el potencial de inmunogenicidad; cuanto más largo es el espaciador, mayor es el riesgo. Por tanto, en la generación de proteínas de fusión, la preservación de la integridad estructural del péptido de fusión, el mantenimiento del acceso sin obstrucciones para la unión a los miembros afines necesarios y la minimización de la longitud de secuencias del espaciador son importantes metas del diseño. Hacia esos objetivos, la utilización de la permutación circular de un ligando tal como se describe en el presente documento proporciona localizaciones preferentes para la fusión a una segunda proteína.

Las localizaciones preferentes para los nuevos extremos se favorecen de manera geométrica, estructural y funcional (en relación con los extremos naturales) para la fusión de un miembro de fusión de polipéptidos deseado y reduce la longitud de un espaciador requerido. En una realización, la localización de los nuevos extremos es más próxima a la posición natural de un posible miembro de fusión con el que el ligando se puede asociar normalmente durante la formación por etapas de un complejo de activación de receptor celular. La orientación del ligando modificado y el miembro de fusión en el polipéptido de fusión puede ser óptima para bien potenciar la actividad agonista del ligando para el complejo de activación del receptor, o bien proporcionar impedimento estérico de la formación por etapas del complejo de activación, proporcionando de este modo antagonismo del complejo de activación.

El proceso de permutación circular para IL6 se representa de manera esquemática en la FIG 2. Los restos de aminoácidos constituyentes de la proteína IL6 natural se enumeran de manera secuencial del 47 a 212 desde el extremo amino al extremo carboxilo.

Para permutar circularmente la IL6, se diseñan construcciones recombinantes de manera que los extremos amino y carboxilo naturales de IL6 se unen mediante una secuencia de enlazador y los nuevos extremos amino y carboxilo se diseñan en los restos de aminoácidos 182 y 180, respectivamente. (FIG. 2). Por tanto, la permutación circular produce una nueva proteína lineal (IL-6 (182/180, también conocida como Picasso3) que, procediendo desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo, comprende el segmento de la proteína original que se corresponde con los restos 182 a 212 (ahora 1 a 31) seguido por el enlazador, seguido por un segmento de la proteína original que se corresponde con los restos 49 a 180 (ahora 39 a 107) (FIG. 2).

Es importante crear una permutación de un ligando natural que mantendrá la actividad biológica de la forma natural del ligando mientras proporciona unos extremos óptimos para fusionar un miembro de fusión de polipéptido deseado. Si los nuevos extremos interrumpen una región crítica de la proteína natura, se puede perder la actividad. Asimismo, si la unión de los términos originales destruye la actividad, entonces ninguna permutación mantendrá la actividad biológica. Por tanto, hay dos requisitos para la creación de una proteína activa permutada circularmente: 1) Los extremos en la proteína natural deben localizarse favorablemente para que la creación de un ligamiento no destruya la actividad biológica; y 2) Debe existir un "sitio de apertura" donde se puedan formar nuevos extremos sin alterar una región crítica para el plegamiento de la proteína y una actividad biológica deseada.

El nuevo extremo N-terminal y el nuevo C-terminal del ligando modificado puede no alterar cualquier dominio de unión del ligando modificado por el receptor diana.

Los ligandos modificados pueden ser tan activos como los ligandos originales. En una realización, los ligandos modificados tienen actividad mejorada en comparación con los ligandos originales. La actividad mejorada puede aumentar la afinidad de unión por el receptor diana.

Por tanto, en general, son buenos candidatos para la permutación circular las proteínas en las que los extremos de la proteína original están en estrecha proximidad y orientados de manera favorable. Los extremos de la proteína original pueden ser iguales a o menores de 20 A de diferencia. Cuando los extremos se sitúan de manera natural juntos, se espera que la fusión de los extremos entre sí sea posible y la introducción de un enlazador tenga un efecto

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relativamente pequeño. Sin embargo, dado que el enlazador puede ser de cualquier longitud, la estrecha proximidad de los extremos naturales no es un requisito absoluto.

Es deseable usar una secuencia enlazadora en la proteína permutada que preserve el espaciado entre los extremos amino y carboxilo que es comparable con el espaciado entre los extremos amino y carboxilo hallados en la molécula no permutada o natural. La secuencia enlazadora puede ser en sí misma entre al menos aproximadamente un aminoácido a al menos aproximadamente 10 aminoácidos. Se pueden eliminar (por recorte) un pequeño número de aminoácidos de cada extremo para aproximar los extremos. Por ejemplo, en el complejo cristalino de IL-6 con IL-6R y gp130, los extremos de la citocina IL6 tienen 1,6 nm (16 A) de diferencia (Brevnova et al. (2003) Science 300:2102). La eliminación de los dos primeros restos de N-terminal, que no se requieren estructuralmente o funcionalmente, reduce la distancia entre los extremos a 10,2 A. Un enlace que preserva esencialmente este espaciado se hace con la secuencia de péptido SGGSGGG (SEQ ID NO: 14). Asimismo, un enlazador preferido para permutar circularmente IL-1p e IL-2 son GGSGGSG y GG, respectivamente (SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, respectivamente).

La selección de un sitio de apertura se puede determinar mediante una serie de factores. Cuando la conformación tridimensional de la proteína se conoce o se predice, los sitios de apertura preferidos se localizarán en bucles de conexión o en regiones que no presentan una estructura tridimensional altamente regular. Por tanto, se prefiere que los sitios de apertura se seleccionen en regiones de la proteína que no contengan estructuras secundarias definidas tales como alfa hélices, cadenas p y similares. Los métodos de identificación de regiones de estructura secundaria definida basados en la secuencia de aminoácidos están ampliamente disponibles en la red mundial. Además, están disponibles diversos programas para predecir la estructura tridimensional de las proteínas, revisados recientemente en Nayeem et al., Protein Science, 808-24 (2006).

Cuando la retención o la mejora de la bioactividad de la molécula natural se desea en la molécula permutada circularmente, es preferible que el sitio de apertura no esté implicado directa o indirectamente en interacciones con sus miembros de proteína. La elección del nuevo sitio de apertura preferentemente no altera un dominio de unión presente en el ligando natural que está implicado directa o indirectamente en la afinidad de unión del ligando natural por si receptor diana.

Como alternativa, cuando la sustitución de determinados aminoácidos o la modificación de las cadenas laterales de determinados aminoácidos no cambia la actividad de una proteína, se espera que aquellos aminoácidos no sean críticos para la actividad de la proteína. Por tanto, los aminoácidos que se pueden mutar (in vivo) o que ya están modificados in vivo, con pequeño impacto sobre la actividad de la proteína, son candidatos potencialmente buenos para sitios de apertura. Los sitios de apertura preferidos en IL-6 están entre los restos 131 y 135 y entre los restos 180 y 182. Un sitio de apertura preferido en IL-1p está entre los restos 179 y 180 y también entre los restos 223 y 224. Un sitio de apertura preferido en IL-2 está entre los restos 94 y 95.

Cuando la proteína es un miembro de una familia de proteínas relacionadas en una especie, se puede inferir que las secuencias altamente conservadas son críticas para la actividad biológica, mientras que las regiones variables no lo son. Asimismo, se puede inferir que las secuencias altamente conservadas de una proteína que se conservan funcionalmente entre las especies de mamíferos, en particular si hay actividad farmacológica entre especies, son críticas para la actividad biológica. Los sitios de apertura preferidos se seleccionan en regiones de la proteína que no presentan identidad de secuencia altamente conservada entre diversos miembros de la familia de la proteína, bien en la especie o entre especies. Como alternativa, los sitios de apertura preferidos que se identifican en una proteína proporcionan buenas localizaciones candidatas para los sitios de apertura en proteínas homólogas. Los métodos de determinación de identidad de secuencia son bien conocidos para los expertos en la materia y se describen anteriormente.

Un experto en la materia reconocerá que se pueden hacer otras modificaciones. De este modo por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos que aumenten la especificidad o la afinidad de unión del ligando modificado mediante permutación circular. Por lo tanto, cuando hay regiones del ligando que no están implicadas en sí en la actividad del ligando, estas regiones se pueden eliminar o reemplazar con segmentos más cortos que simplemente sirven para mantener las correctas relaciones especiales entre el ligando y las proteínas con las que se pretenden asociar.

Para una serie de ligandos naturales (por ejemplo, factores de crecimiento, citocinas y otras proteínas), los extremos carboxilo y amino se sitúan de manera que cuando los polipéptidos de fusión se forman mediante la unión de un segundo polipéptido o molécula a cualquiera de los extremos del ligando natural, la actividad deseada aguas abajo del segundo polipéptido disminuye de manera significativa o está ausente. El plegamiento anómalo de la proteína o el impedimento estérico se atribuye a menudo para considerar la actividad reducida o ausente del segundo polipéptido. En otros casos, la fusión de un segundo polipéptido a cualquier término de la proteína natural se tolera (es decir, la actividad funcional de la proteína natural no se ve afectada de manera significativa), sin embargo, la orientación del polipéptido de fusión no imparte la actividad deseada a la proteína de fusión, tal como en el caso en el que el polipéptido de fusión pretende inferir (es decir, actuar como antagonista) con la formación de un complejo

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de señalización a través de la interferencia estérica cuando la localización del polipéptido de fusión ocupa el espacio que ocuparía una molécula de señalización de aguas abajo en el ensamblaje de un complejo de señalización activo.

En contraste, la permutación circular de un ligando tal como se describe en el presente documento proporciona un medio mediante el cual el ligando se puede alterar para producir nuevos extremos carboxilo y amino que permiten la fusión de la segunda molécula o polipéptido sin disminuir la especificidad y la afinidad de unión del ligando alterado en relación con su forma natural, y que también permite que la segunda molécula o polipéptido fusionado imparta, por ejemplo, superagonismo o antagonismo de un complejo de activación de señalización. El polipéptido de fusión puede convertir un ligando natural que es un agonista o un complejo de activación de señalización de diana a un antagonista del complejo de activación de señalización. Esto se ilustra en el contexto de la citocina, IL-6, en las Fig. 1-5.

Los polipéptidos de fusión comprendidos por un ligando permutado circularmente fusionado a un miembro de unión, pueden mejorar la afinidad de unión del polipéptido de fusión al receptor natural del ligando natural en relación con la afinidad de unión del ligando natural (no fusionado, no modificado, no permutado) por su receptor natural. Por ejemplo, el Ejemplo 3 compara la afinidad de unión al receptor de IL6 de, 1) un polipéptido de fusión comprendido por IL6 permutado circularmente fusionado al dominio uno de la molécula de señalización transmembrana gp130, con 2) iL-6 natural. Se ha visto que la afinidad de unión del polipéptido de fusión es más de 200 veces mayor que la afinidad de unión de la IL6 natural por el receptor de IL6 (Figs. 6A y 6C).

Polipéptidos de fusión

En el presente documento se desvelan nuevos polipéptidos de fusión que comprenden ligandos permutados circularmente (modificados) y al menos un miembro de fusión de polipéptido, en donde el polipéptido de fusión opcionalmente posee especificidad y afinidad de unión mayor que la especificidad y afinidad de unión del ligando natural (no permutado) por su receptor diana natural. Adicionalmente, el polipéptido de fusión puede, por ejemplo, diseñarse adicionalmente para generar un antagonista de una vía en donde el ligando funcione como un agonista a través de la unión a un receptor diana tal como se describe en el presente documento.

Muchos receptores se unen a ligandos naturales y se agrupan, es decir, forman dímeros, trímeros o multímeros, tras la unión de sus ligandos naturales (receptor dímero o multimérico). Por ejemplo, las citocinas de la familia de IL-1, los factores de crecimiento de fibroblastos, y las citocinas de 4 hélices forman complejos multiméricos de señalización que incorporan diversos números de ligandos y receptores (FIG. 9). La agrupación inducida por ligando (por ejemplo, dimerización, multimerización) a menudo lleva a complejos de mayor afinidad e inicia la transducción de la señal. Por consiguiente, los polipéptidos de fusión pueden, por ejemplo, antagonizar la señalización mediante, por ejemplo, la inhibición de la unión del ligando natural, o la inhibición de la agrupación del receptor (por ejemplo, dimerización, trimerización, multimerización) con o sin la inhibición también de la unión del ligando natural (FIG. 10). Como alternativa, los polipéptidos de fusión pueden mejorar la señalización mediante, por ejemplo, la facilitación de la progresión de la agrupación, a través de la generación de ligandos con mayor afinidad por receptores diana o la preasociación de componentes que llevan a un complejo de señalización. Los polipéptidos de fusión pueden unirse a un ligando o receptor monomérico, o a un complejo dímero o multimérico y pueden inhibir o potenciare una o más etapas en el ensamblaje de complejos de señalización e inhibir o potenciar de este modo la transducción de la señal de una vía celular.

Por ejemplo, en la construcción por etapas de complejos de orden superior que llevan a un complejo activo final tal como se establece en el Esquema 1, que es representativo de la vía que lleva a la señalización mediante IL-2 en donde IL-2 es "A", IL-2Ra es "B", IL-2Rp es "C" y yc es "D":

Esquema 1: A+B ^ AB (etapa 1); AB + C ^ ABC (etapa 2); ABC + D ^ ABCD (etapa 3);

en donde ABCD es el complejo de señalización y la señalización se inicia acercando C y D entre sí. (El complejo de señalización se representa en la FIG. 9 y la estructura de los componentes extracelulares del complejo están en la FIG. 8).

Se esperaría que una cadena simple 'AB' preensamblada fuese un superagonista ya que poseería una mayor afinidad para C que cualquiera de A o B y, por lo tanto, facilita el ensamblaje de ABCD a menores concentraciones. En el caso en el que los extremos naturales de "A" no se posicionen para permitir que la proteína de fusión, una proteína de fusión del ligando "A" que se ha modificado mediante permutación circular de acuerdo con la invención, se oriente de manera óptima para fusionarse con "B" permitiendo la generación de la proteína 'AB' de cadena sencilla. La Figura 8 representa esto para el caso de un superagonista de IL-2 diseñado (RDB1405; SEQ ID NO: 12 (proteína) y SEQ ID NO: 13 (ADN)). Sobre los linfocitos T activados, las señales de IL-2 a través del complejo cuaternario de 'alta afinidad' consiste en IL-2, IL-2Ra (también denominado CD25), IL-2Rp y yc (FIG. 8A). Aunque IL-2 se puede unir mucho más débilmente a IL-2Rp en ausencia de IL-2Ra, la unión de IL-2Ra a IL-2 estabiliza la conformación de IL-2 para la presentación a IL-2Rp con mucha mayor afinidad. yc se recluta después a la superficie compuesta formada por el complejo IL-2/IL-2Rp. La expresión de una proteína de fusión de IL-2 natural con IL-2Ra es un reto porque los extremos de IL-2 están en la cara opuesta polar con la que interactúa IL-2Ra, requiriendo un

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espaciador para abarcar más de 5 nm (50 angstroms) y alterar probablemente la capacidad de unión de la proteína de fusión (FIG. 8A, los extremos de IL-2 están en la parte inferior apuntando hacia fuera de IL-2Ra en la parte superior). De hecho, recientemente se ha descrito una proteína de fusión IL-2/IL-2Ra con un espaciador largo, y es capaz de promover una señal en ausencia de una escisión del enlazador mediada por proteasa con la posterior liberación de IL-2 (Puskas et al., Immunology, 133(2), 206-220 (2011)). Los extremos de IL-2(95/94) permutada circularmente se diseñan para estar en la cara proximal a la interfaz de unión con IL-2Ra, reduciendo de manera significativa la longitud del espaciador requerido para generar una proteína de fusión que se pueda ensamblar como un complejo activado y pueda funcionar como un superagonista (FIG. 8B). (La distancia entre el extremo C-terminal de la IL-2 permutada circularmente y el extremo N-terminal de IL-2Ra es de aproximadamente 1,1 nm (11 angstroms); el diseño de la construcción de fusión, RDB1405 contiene un espaciador de 6 aminoácidos entre IL-2 y IL-2Ra).

Como alternativa, la construcción por etapas de complejos multiméricos de activación para la transducción de la señal ofrece la oportunidad de crear potentes antagonistas. En este caso, se modifica el ligando mediante permutación circular para proporcionar un extremo N-terminal o C-terminal que facilita la unión de un miembro de fusión en una orientación que impide estéricamente la formación por etapas de un complejo multimérico de activación de un receptor diana, y en algunos casos, el miembro de fusión puede aumentar además la afinidad de unión al receptor diana, si, por ejemplo, el miembro de unión es una proteína o dominio que en sí contiene determinantes de unión al receptor diana. Esto último se representa en el contexto de la citocina, IL-6, en las Figs. 15 y 10. En este ejemplo, el polipéptido de fusión comprende interleucina 6 (IL-6) permutada circularmente fusionada a un polipéptido que comprende el dominio D1 del receptor transmembrana gp130, que es un componente natural del complejo hexamérico de señalización de IL-6. El ligando permutado circularmente (RDB1503) (FIG. 2), en ausencia de un miembro de fusión, mantiene la misma actividad agonista que la IL-6 de tipo silvestre (FIG. 4) y, por lo tanto, mantiene las interacciones necesarias con IL-6Ra y gp130. El complejo hexamérico de señalización de IL-6 se compone de 2 de cada de IL-6, IL-6Ra y gp130 (FIG. 1). La señal se inicia a través del dominio citoplasmático de las dos moléculas de gp130 cuando dos heterotrímeros (cada uno con una molécula de cada de iL-6, IL-6Ra, y gp130) se unen (FIG. 1). La fuerza conductora para la etapa final en la formación del complejo son las interacciones simétricas entre los dominios D1 de gp130 de un heterotrímero con IL-6 e IL-6Ra del otro heterotrímero. Una fusión del dominio D1 de gp130 a la IL-6 natural orienta el dominio D1 fuera de la interfaz de gp130 (FIG. 3A) y da como resultado una proteína (RDB1529) que no actúa como antagonista de la señalización mediada por IL-6 (FlG. 5). En contraste, una fusión del dominio D1 a la IL-6 permutada circularmente (RDB1527) orienta el D1 de manera que pueda interactuar con IL-6Ra de una manera análoga al complejo hexamérico, y de manera importante, impide estéricamente la unión del dominio D1 de un según heterotrímero (FlG. 3B) y, por lo tanto, es un potente antagonista de la señalización mediada por IL-6 (FlG. 5). Como la proteína de fusión CP_IL-6_D1 ahora lleva los determinantes de unión de IL-6Ra combinados de la IL-6 no modificada y el dominio D1 de go130 natural en un único polipéptido, la afinidad de unión del polipéptido de fusión se mide para ser 40 pM, más de 200 veces mayor que la afinidad de unión de IL6 natural para la lL-6Ra (Figs. 6A y 6C).

En el presente documento se desvelan polipéptidos de fusión que comprenden el ligando modificado y un primer miembro de fusión en donde el primer miembro de fusión del ligando modificado proviene de toda o de una parte de una proteína con determinantes de unión al receptor diana, por ejemplo, como en el caso de una proteína o dominio que es un componente del complejo multimérico de señalización natural, y el primer miembro de fusión impide estéricamente el ensamblaje del complejo de señalización completo, actuando de este modo como un antagonista.

Los ligandos modificados mediante permutación circular que comprenden los polipéptidos de fusión incluyen proteínas solubles cuya unión a los receptores de superficie celular inician una cascada de señalización o sirven como reguladores negativos naturales de una cascada de señalización (por ejemplo, antagonistas), que incluyen, pero sin limitación, citocinas, quimiocinas, adipocinas, factores de crecimiento, hormonas, receptores solubles, proteínas de unión a citocina (por ejemplo, IL-18bp).

Los ligandos preferidos y las proteínas modificadas mediante permutación circular que comprenden los polipéptidos de fusión incluyen proteínas del conjunto de hélices y citocinas (incluyendo, pero sin limitación, hormona de crecimiento, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-22, IL-23p19, IL-11, IL-13, IL-15, IL-12p35, IL-21, IL-30 (IL27p28), IL-34, IL-35, IL-35p35, IFN-p, IFNy, LIF, CNTF, oncostatina M, CLCF-1, GCSF, GM-CSF, EPO, ferritina, leptina, lactógeno placentario, prolactina, apolipoproteína e), proteínas b-trefoil (incluyendo, pero sin limitación, IL-1a, IL-1p, IL-IRa, IL18, IL-33, IL-36Ra, IL-36a, IL-36b, IL-36g, IL-37, IL-38, IL1Hy2, FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8a, FGF-8b, FGF-8e, FGF-8f, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14, FGF-16, FGF-17, FGF-18, FGF-19, FGF-20, FGF-21, FGF-22, FGF-23), proteínas de barril a/p (TIM) (incluyendo, pero sin limitación, triosafosfato isomerasa), proteínas beta tipo sándwich (incluyendo, pero sin limitación, galectina-1, galectina-3, TNF- beta, proteínas de siete hélices p, dominio a1a2 del MHC de clase 1, dominio I de integrina, dominio GYF, dominio C1, dominio C2 (por ejemplo, de cPLA2, PKC, sinaptotagmina), dominios de PDZ, C3d, C5a.

El ligando modificado mediante permutación circular que comprende los polipéptidos de fusión se selecciona lo más preferentemente de IL-6, IL-2, IL-15, IL-1a, IL-1 p, IL-IRa, IL-18, FGF-19, FGF-21, FGF-23.

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Los ligandos modificados mediante permutación circular que comprenden los polipéptidos de fusión pueden tener especificidad de unión por un receptor, o por un receptor que se une a un ligando natural en la siguiente lista: ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofina-1, EgF, receptor de EGF, EnA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, FGF-ácido, FgF- básico, factor de crecimiento de fibroblastos 10, ligando de FLT3, Fractalkina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF- p1, insulina, IFN-y, IGF-I, IGF-II, IL-1a, IL-ip, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inhibina a, Inhibina p, IP-10, factor de crecimiento de queratinocitos 2 (KGF-2), KGF, Leptina, LIF, Linfotactina, sustancia inhibidora mulleriana, factor inhibidor de colonias de monocitos, proteína atrayente de monocitos, M-CSF, MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1a, MIP-1p, MIP-3a, MIP-3p, MIP-4, factor inhibidor de progenitor mieloide 1 (MPIF-1), NAP-2, Neurturina, factor de crecimiento nervioso, p-NGF, NT-3, NT-4, oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-aB, PDGF- BB, PF-4, RANTES, SDF1a, SDF1p, SCF, SCGF, factor de células madre (SCF), TARC, TGF-a, TGF-p, TGF-P2, TGF-p3, factor de necrosis tumoral (TNF), TNF-a, TNF-p, receptor I de TNF, receptor II de TNF, TNIL-1, tPo, VEGF, receptor 1 de VEGF, receptor 2 de VEGF, receptor 3 de VEGF, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-p, GRO-y, HCC1, 1-309, HER1, HER2, HER3 y HER4.

Los receptores adicionales para los que el ligando modificado puede tener especificidad de unión incluyen los receptores en la siguiente lista, o un receptor que se une a un ligando natural incluido en la siguiente lista: EpoR, sitio de reconocimiento de TACE, TNF BP-I, TNF BP-II, IL-1R1, IL-6R, IL-10R, IL-18R, IL-1, IL-19, IL-20, IL-21, IL-23, IL-24, IL-25, IL-27, IFN-y, IFN-a/p, CD4, CD89, CD19, HLA-DR, CD38, CD138, CD33, CD56, CEA y receptor de VEGF.

Los receptores adicionales para los que los ligandos modificados de los polipéptidos de fusión pueden tener especificidad de unión incluyen receptor peptídico liberador de gastrina, el receptor de neurotensina, el receptor de adrenomedulina, el receptor de histamina H2, el receptor de HCG, el receptor de MET, el receptor esfingosina 1- fosfato, CD126, CD213a1 y KDR, entre otros.

El ligando modificado de la proteína de fusión de polipéptidos puede tener especificidad de unión por un receptor que dimeriza tras la unión a un ligando natural (un receptor dímero) o un receptor que forma multímeros, tales como trímeros, tras la unión a un ligando natural (un receptor multimérico). Muchos receptores de citocina y receptores de factor de crecimiento, tales como miembros de la superfamilia del receptor de TNF (por ejemplo, TNFR1, TNFR2) y miembros de la familia del receptor de la tirosina cinasa (por ejemplo, EGFR, PDGFR, receptor de M-CDF (c-Fms)) forman dímeros o multímeros tras la unión de sus ligandos naturales. La superfamilia del receptor de TNF es un grupo de proteínas reconocido en la materia que incluye TNFR1 (p55, CD120a, p60, el miembro 1A de la superfamilia del receptor de TNF, TNFRSF1A), TNFR2 (p75, p80, CD120b, el miembro 1B de la superfamilia del receptor de TNF, TNFRSF1B), CD (TNFRSF3, LTpR, TNFR2-RP, TNFR-RP, TNFCR, TNF-R-III), OX40 (TNFRSF4, ACT35, TXGP1L), CD40 (TNFRSF5, p50, Bp50), Fas (CD95, TNFRSF6, APO-1, APTI), DcR3 (TNFRSF6B), CD27 (TNFRSF7, Tp55, S152), CD30 (TNFRSF8, Ki-1, D1S166E), CD137 (TNFRSF9, 4-1BB, I LA), TRAILR-1 (TNFRSF10A, DR4, Apo2), TRAIL-R2 (TNFRSF10B, DR5, KILLER, TRICK2A, TRICKB), TRAILR3 (TNFRSF10C, DcR1, LIT, TRID), TRAILR4 (TNFRSF10D, DcR2, TRUNDD), RANK (TNFRSF11A), OPG (TNFRSF11B, OCIF, TR1), DR3 (TNFRSF12, TRAMP, WSL-1, LARD, WSL-LR, DDR3, TR3, APO-3), DR3L (TNFRSF12L), TAC1 (TNFRSF13B), BAFFR (TNFRSF13C), HVEM (TNFRSF14, ATAR, TR2, LIGHTR, HVEA), NGFR(TNFRSF16), BCMA(TNFRSF17, BCM), AITR(TNFRSF18, GITR), TNFRSF19, FLJ14993 (TNFRSF19L, RELT), DR6 (TNFRSF21), SOBa (TNFRSF22, Tnfrh2, 2810028K06Rik), y mSOB (THFRSF23, Tnfrh1). La familia del receptor de tirosina cinasa es un grupo de proteínas reconocido en la materia que incluye EGFR (ERBB1, HER1), PDGFR, c- Fms, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, receptor de insulina y receptores de factor de crecimiento de tipo insulina (IGF1R, IGF2R). Véase, Grassot et al., Nucleic Acids Research, 31(1):353-358 (2003).

El primer miembro de fusión de polipéptidos puede comprender todo o cualquier parte de los dominios extracelulares de los receptores naturales o proteínas accesorias para la hormona de crecimiento, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, IL-22, IL-23, IL-30 (IL27p28), IL-34, IL-35, IFN-p, IFNy, LIF, CNTF, oncostatina M, CLCF-1, GCSF, GM-CSF, EPO, lactógeno placentario, prolactina, apolipoproteína, IL-1a, IL-1p, IL-IRa, IL18, IL-33, IL-36Ra, IL-36a, IL-36b, IL-36g, IL-37, IL1Hy2, FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8a, FGF-8b, FGF- 8e, FGF-8f, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14, FGF-16, FGF-17, FGF-18, FGF-19, FGF-20, FGF- 21, FGF-22, FGF-23, TNF-beta.

El miembro de fusión es preferentemente el dominio extracelular o un dominio del mismo seleccionado de gp130 (lo más preferentemente el dominio D1), IL-2Ra, IL-15Ra, IL-1RI, IL-1RII, IL-18Ra, IL-18RP, IL1RAcP, FGFR1b, FGFR1c, FGFR2b, FGFR2c, FGFR3b, FGFR3c, FGFR4, a-Klotho, and p-Klotho.

La proteína modificada mediante permutación circular que comprende los polipéptidos de fusión y el miembro de fusión se puede originar a partir de la misma proteína original de manera que la fusión genera un "homodímero" de cadena simple.

El miembro de fusión para el polipéptido permutado circularmente también puede requerir permutación circular para permitir la fusión. Por lo tanto, ambos miembros de la proteína de fusión pueden estar permutados circularmente, según sea necesario.

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El miembro de fusión de polipéptidos puede proporcionar otras funciones o comportamientos nuevos o mejorados/potenciados para el polipéptido de fusión. Además, o como alternativa, se puede añadir un segundo miembro de fusión al polipéptido de fusión de la invención para proporcionar otras funciones o comportamientos nuevos y mejorados/potenciados al polipéptido de fusión de la invención. Por ejemplo, los miembros de fusión pueden proporcionar una semivida prolongada al polipéptido de fusión de la invención. La adición de miembros de fusión para prolongar in vivo la semivida es particularmente útil cuando el polipéptido de fusión de la invención es de un tamaño que se elimina rápidamente del cuerpo, lo que puede limitar el uso clínico.

Un polipéptido de la invención se puede modificar de tal manera que tenga un mayor tamaño hidrodinámico mediante, por ejemplo, el acoplamiento a polímeros o carbohidratos (tales como polietilenglicol (PEG), ácido colomínico o hidroxietilalmidón), la incorporación de sitios de N-glucosilación, o a través de miméticos de PEG recombinantes producidos mediante una secuencia larga y flexible de polipéptidos, tal como las descritas en el documento U.S. 2010/0239554 A1. El tamaño hidrodinámico de una proteína de fusión de polipéptidos de la invención se puede determinar usando métodos que son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, se puede usar cromatografía de filtración en gel para determinar el tamaño hidrodinámico. Las matrices de filtración en gel adecuadas para la determinación de los tamaños hidrodinámicos de los ligandos, tales como matrices de agarosa reticulada, son bien conocidos y están fácilmente disponibles.

En una realización preferida, se diseña un polipéptido de fusión de la invención para incorporar un polipéptido de dominio de mucina tal como se describe en el documento USSN 61/657.264, titulado "Fusion Polypeptides Comprising an Active Protein Linked to a Mucin-Domain Polypeptide" presentado en la misma fecha del presente documento y con expediente de mandatario número 4000.3058 US.

En una realización, un polipéptido de fusión de la invención se puede fusionar a proteínas, dominios de proteínas o péptidos que mejoran la semivida sérica a través del reciclaje mediado por FcRn, incluyendo inmunoglobulinas, el dominio Fc de inmunoglobulinas (más notablemente IgG1 e IgG2), albúmina sérica, dominios de albúmina sérica (más notablemente DIII), péptidos con afinidad de unión a FcRn o proteínas o péptidos con afinidad de unión a inmunoglobulinas o albúmina sérica (tales como nanocuerpos).

Los métodos para el análisis farmacocinético y la determinación de la semivida del ligando serán familiares para los expertos en la materia. Los detalles se pueden encontrar en Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a "Pharmacokinetics", M Gibaldi y D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2a Rev. ex edición (1982), que describe los parámetros farmacocinéticos tales como las semividas t alfa y t beta y el área bajo la curva (ABC).

En una realización, un polipéptido de fusión de la invención se puede fusionar a proteínas, dominios de proteína o polipéptidos que se dirigen a (es decir, tienen afinidad por) órganos específicos, tejidos, células o matrices fisiológicas (tales como colágeno), carbohidratos o lípidos como un medio para localizar, distribuir o mantener el polipéptido de fusión de la invención en una región particular del cuerpo.

También se pueden incluir secuencias adicionales como parte del polipéptido de fusión tales como secuencias de marcadores de afinidad que se pueden proporcionar para facilitar la purificación o el aislamiento del polipéptido de fusión tal como las conocidas en la materia. También se pueden añadir secuencias de estabilidad al polipéptido de fusión para proteger la molécula de la degradación (por ejemplo, mediante una proteasa). Las secuencias de estabilidad adecuadas incluyen, pero sin limitación, moléculas de glicina incorporadas tras la metionina de iniciación (por ejemplo, MG (SEQ ID NO: 17), o MGG (SEQ ID NO: 18) para proteger la molécula de fusión de la ubiquitinación; dos prolinas incorporadas en el extremo C-terminal (que confieren protección contra la acción carboxipeptidasa) y similares.

Para probar la actividad biológica, la especificidad de unión y la afinidad de unió de un polipéptido de la invención, se puede usar un ensayo biológico apropiado. Los ensayos para las actividades biológicas de diversos tipos son bien conocidos para los expertos en la materia. El ensayo particular depende de la actividad particular de la molécula.

Preparación de proteínas permutadas circularmente

Las proteínas permutadas circularmente se pueden preparar mediante una serie de medios conocidos para los expertos en la materia. Estos incluyen síntesis química, modificación de proteínas existentes y expresión de proteínas permutadas circularmente usando metodología del ADN recombinante.

Cuando la proteína es relativamente corta (es decir, menos de aproximadamente 50 aminoácidos) la proteína permutada circularmente se puede sintetizar usando técnicas convencionales de síntesis química de péptidos. Si el enlazador es un péptido, se puede incorporar durante la síntesis. Si el enlazador no es un péptido, se puede acoplar al péptido tras la síntesis. La síntesis de fase sólida en la que el aminoácido de C-terminal de la secuencia se une a un soporte insoluble seguido por la adición de los aminoácidos restantes en la secuencia es el método preferido para la síntesis química de los ligandos permutados circularmente y las proteínas de fusión de la presente invención. Las técnicas para la síntesis en fase sólida se describen por Barany y Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3284 en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield,

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et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963), y Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984).

Como alternativa, la proteína permutad circularmente se puede preparar mediante modificación química de una proteína natural. En general, esto requiere hacer reaccionar la proteína natural en presencia del enlazador para formar enlaces covalentes entre el enlazador y los extremos carboxilo y amino de la proteína, formando de este modo una proteína circular. Los nuevos extremos se forman entonces mediante la apertura del enlace peptídico que une los aminoácidos en otra localización. Esto se puede realizar por vía química o enzimática usando, por ejemplo, una peptidasa.

En una realización preferida, la proteína permutada circularmente o los polipéptidos de fusión que comprenden la proteína permutada circularmente fusionada a al menos un miembro de fusión, se sintetizará usando la metodología del ADN recombinante. Generalmente, esto implica la creación de una secuencia de ADN que codifica el ligando permutado circularmente (o el polipéptido de fusión completo que contiene el ligando permutado circularmente y el miembro de fusión), colocar el ADN en un vector de expresión bajo el control de un promotor particular, expresar la proteína en un hospedador, aislar la proteína expresada y, si es necesario, renaturalizar la proteína.

El ADN que codifica el ligando permutado circularmente se puede producir mediante síntesis génica, o usando métodos de amplificación de ADN, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). Se puede añadir opcionalmente ADN que codifica una secuencia señal de manera que la proteína de fusión permutada circularmente y procesada de manera apropiada se secrete a partir de la célula.

Un experto en la materia apreciará que el ligando permutado circularmente y la otra molécula que comprende los polipéptidos de fusión de la invención se pueden unir entre sí en cualquier orden. Por tanto, la segunda molécula se une preferentemente bien al extremo amino (fusión en N-terminal) o al extremo carboxilo (fusión en C-terminal) del ligando permutado circularmente.

Los ligandos permutados circularmente y sus proteínas de fusión se pueden expresar en una variedad de células hospedadoras, incluyendo E. coli, otros hospedadores bacterianos, levaduras y diversas células eucariotas mayores tales como las líneas celulares COS, CHO y HeLa y las líneas de las células de mieloma. El gen de proteína recombinante se unirá de manera operativa a las secuencias de control de expresión apropiadas para cada hospedador. Para E. coli, ésta incluye un promotor tal como los promotores T7, trp o lambda, un sitio de unión a ribosomas y preferentemente una señal de terminación de la transcripción. Para las células eucariotas, las secuencias de control incluirán un promotor y preferentemente un potenciador que proviene de genes de inmunoglobulina, SV40, citomegalovirus, etc., y una secuencia de poliadenilación, y puede incluir secuencias donadoras y aceptoras de empalmes.

Los plásmidos de la invención se pueden transferir (transfectar) a la célula hospedadora elegida mediante métodos bien conocidos tales como la transformación de cloruro de calcio para E. coli y el tratamiento de fosfato cálcico, electroporación, tratamiento de lipofectamina o tratamiento PEI para células de mamífero. Las células transformadas mediante los plásmidos se pueden seleccionar por resistencia a los antibióticos conferida por genes contenidos en los plásmidos, tales como los genes amp, gpt, neo y hyg.

Una vez expresadas, las proteínas de fusión recombinantes se pueden purificar de acuerdo con los procedimientos convencionales de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de afinidad, cromatografía en columna con resinas iónicas o hidrofóbicas, electroforesis en gel y similares (véase, en general, R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y. (1990)). Las composiciones sustancialmente puras de al menos aproximadamente el 90 al 95 % de pureza son preferidas, y una pureza del 98 al 99 % o mayor son las más preferidas para usos farmacéuticos. Una vez purificados, los polipéptidos se pueden ensayar en modelos preclínicos, ensayar clínicamente o usar terapéuticamente.

Un experto en la materia reconocería que se pueden hacer modificaciones a la secuencia de proteína circularizada sin reducir su actividad biológica. Se pueden hacer algunas modificaciones para facilitar la clonación, la expresión o la incorporación del ligando permutado circularmente en una proteína de fusión. Tales modificaciones son bien conocidas por los expertos en la materia e incluyen, la adición de restos, por ejemplo, una metionina añadida en el extremo amino para proporcionar un sitio de iniciación u aminoácidos adicionales colocados sobre cualquiera de los extremos para proteger la proteína de exopeptidasas. Por ejemplo, la IL6 permutada circularmente puede tener opcionalmente un codón de metionina adicional (Met) en el extremo amino para proporcionar un sitio de iniciación para la traducción.

Un experto en la materia reconocerá que se pueden hacer otras modificaciones. Por tanto, por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos que aumenten la especificidad o la afinidad de unión de la proteína permutada circularmente, etc. Como alternativa, las regiones no esenciales de la molécula se pueden acortar o eliminar por completo. Por tanto, cuando hay regiones de la molécula que no están implicadas en sí en la actividad de la

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molécula, se pueden eliminar o sustituir con segmentos más cortos que simplemente sirven para mantener las correctas relaciones espaciales entre los componentes activos de la molécula.

Las dos proteínas se pueden fusionar entre sí directamente o unirse por medio de un espaciador peptídico. El espaciador peptídico puede oscilar desde aproximadamente 1 a 40 restos de longitud. En una realización preferida, el espaciador peptídico es de 2 nm (20 A) o menos de longitud.

En general, el espaciador no tiene actividad biológica en sí y funciona solo para unir y proporcionar alguna distancia entre las dos proteínas activas que comprenden la proteína de fusión. Sin embargo, un experto en la materia reconocerá que los restos del espaciador se pueden elegir para optimizar una propiedad de la proteína de fusión. Por ejemplo, un espaciador que contiene restos polares o cargados en el espaciador puede potenciar la solubilidad en soluciones acuosas. De manera similar, los restos del espaciador se pueden elegir para su efecto sobre el plegamiento de la proteína de fusión.

Se entiende que la invención incluye los ácidos nucleicos descritos anteriormente que codifican los polipéptidos de fusión de las invenciones tales como ácidos nucleicos recombinantes producidos mediante metodología del ADN recombinante, así como vectores de expresión que comprenden los ácidos nucleicos de la invención y células hospedadoras que comprenden los vectores de la invención.

Usos terapéuticos

Los polipéptidos de fusión de la invención descritos en el presente documento son particularmente muy adecuados como agentes terapéuticos que se dirigen a células de interés in vivo (es decir, células diana) dado que presentan, entre otras propiedades, mayores afinidades de unión por receptores naturales que los ligandos naturales y actividades agonistas y antagonistas. Por tanto, las composiciones y las composiciones farmacéuticas que contienen los presentes polipéptidos de fusión se pueden administrar a un paciente que necesite tratamientos terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, los polipéptidos de fusión de la invención que comprenden ligandos permutados circularmente, y diversas composiciones que contienen estas moléculas se administran a un paciente que padece una enfermedad o trastorno en una cantidad terapéuticamente eficaz.

La invención proporciona composiciones que comprenden los polipéptidos de fusión de la invención y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, y métodos terapéuticos y de diagnóstico que emplean los ligandos o composiciones de la invención.

Los usos terapéuticos o profilácticos de ligandos de la invención implican la administración de ligandos de acuerdo con la invención a un receptor mamífero, tal como un ser humano. Los polipéptidos de fusión de la invención preferentemente se unen a dianas con alta afinidad y/o avidez. Los ligandos sustancialmente puros de al menos 90 a 95 % de homogeneidad son preferidos para la administración a un mamífero, y del 98 al 99 % o más de homogeneidad es lo más preferido para usos farmacéuticos, especialmente cuando el mamífero es un ser humano. Una vez purificados, de forma parcial o hasta la homogeneidad tal como se desee, los polipéptidos de fusión de la invención se pueden usar como diagnóstico o terapéuticamente (incluyendo de manera extracorpórea) o en el desarrollo y la realización de procedimientos de ensayo, tinciones inmunofluorescentes y similares.

Por ejemplo, los polipéptidos de fusión de la presente invención típicamente encontrarán su uso en la prevención, en la supresión o en el tratamiento de estados de enfermedad. Por ejemplo, los polipéptidos de fusión se pueden administrar para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad o trastorno provocada por una actividad del receptor o caracterizada por la expresión o sobreexpresión del receptor, tal como inflamación crónica o enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades metabólicas (por ejemplo, obesidad, diabetes de tipo II, síndrome metabólico), enfermedades respiratorias (por ejemplo, asma, EpOC), enfermedades oftálmicas (por ejemplo, DMAE, glaucoma), trastornos hematopoiéticos, inmunosupresión, rechazo a los trasplantes de órganos, enfermedad de injerto frente a huésped, enfermedades del hueso y del cartílago (osteoporosis, artrosis), hipersensibilidad alérgica, cáncer, infección bacteriana o vírica, trastornos autoinmunes (que incluyen, pero sin limitación, diabetes de tipo I, asma, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis psoriásica, espondiloartropatía (por ejemplo, espondilitis anquilosante), trastornos autoinflamatorios, lupus eritematoso sistémico, enteropatía inflamatoria (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), miastenia grave y síndrome de Behcet), psoriasis, endometriosis y bridas abdominales (por ejemplo tras cirugía abdominal).

Una aplicación preferida es, a través del uso de IL2 permutada circularmente fusionada a IL-2Ra generando un IL-2 superagonista), el tratamiento de cáncer o de afecciones autoinmunes tales como la enfermedad de injerto frente a hospedador, o el rechazo a los trasplantes de órganos.

Se puede usar una IL-6 permutada circularmente fusionada al dominio D1 de gp130 (que genera un antagonista de IL-6 muy potente) en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunes (que incluyen, pero sin limitación, artritis reumatoide, psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide juvenil, enfermedad de Crohn, enteropatía inflamatoria), cáncer (que incluye mieloma múltiple), y enfermedad de Castleman. Tal como se describe en los ejemplos de referencia 2 y 3, la proteína de fusión ligando-gp130 permutada circularmente

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(RDB1527) presenta mayor afinidad de unión específica al receptor de IL6 natural (Figs. 6A frente a 6C) e inhibición de células diana (FIG. 5) en comparación con los ligandos naturales. La elevada afinidad de unión y la inhibición del crecimiento de los polipéptidos de fusión IL6-gp130 permutados circularmente pueden permitir que se administren estas proteínas a dosis más bajas en comparación con otros inhibidores de señalización de IL6, mientras se logra la misma eficacia terapéutica. Como alternativa, la administración a las mismas dosificaciones da como resultado una eficacia terapéutica prolongada, ya que las proteínas de fusión se deben eliminar desde la circulación a una concentración más baja antes de que dejen de presentar una eficacia significativa. Además, la elevada eficacia terapéutica no se acompaña de un aumento de efectos secundarios indeseables debidos a uniones no específicas y a citotoxicidad.

Una IL-1 permutada circularmente fusionada a un dominio de cualquiera de IL-1RI, IL-1RII o IL-1RAcP (que genera un antagonista muy potente de IL-1) se puede usar en el tratamiento de enfermedades autoinflamatorias, diabetes de tipo I, enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunes (que incluyen, pero sin limitación, artritis reumatoide, psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide juvenil, enfermedad de Crohn, enteropatía inflamatoria), cáncer, gota y artrosis.

Una IL-15 permutada circularmente fusionada a IL-15a (que genera un superagonista de IL-15) se puede usar en el tratamiento de cáncer, de afecciones autoinmunes tales como la enfermedad de injerto frente a hospedador, el rechazo a los trasplantes de órganos o de infección.

La parte de ligando permutado circularmente del polipéptido de fusión se elige de acuerdo con el uso que se pretende. Las proteínas que pueden servir como dianas para los ligandos permutados circularmente incluyen pero no se limitan a moléculas de señalización tales como factores de crecimiento o fragmentos biológicamente activos o mutantes de los mismos. Por ejemplo, el factor de crecimiento puede ser una citocina (por ejemplo, una interleucina o quimiocina). Aunque un experto en la materia puede determinar fácilmente si una molécula es una molécula de señalización (es decir, si se produce y se secreta por un primer tipo celular y ejerce un efecto sobre sí misma (autocrina) o sobre un segundo tipo celular (paracrina), normalmente mediante la unión específica a un receptor), varias moléculas particulares de señalización pueden colocarse adecuadamente en dos o más categorías. Por ejemplo, IL-1 puede denominarse apropiadamente como una citocina o interleucina y la eritropoietina se puede denominar apropiadamente como un factor de crecimiento o una hormona; etc.

Una citocina incluye pero no se limita a, IL-1a, IL-1p, IL-IRa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL- 12, IL-12p35, IL-13, IL-15, miembros de la familia de la IL-17, IL18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-23p19, IL-30 (IL27p28), IL- 33, IL-34, IL-35, IL-35p35, IL-36Ra, IL-36a, IL-36b, IL-36g, IL-37, IL-38, LIF, CNTF, oncostatina M, CLCF-1, GCSF, GMCSF, ferritina, , lactógeno placentario, apolipoproteína e, interferón alfa (IFNa), interferón beta (IFNp), o interferón gamma (IFNy). Una quimiocina puede ser un miembro de la subfamilia a y/o se puede unir a un receptor CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4 o CXCR5; puede ser un miembro de la subfamilia p y/o se puede unir a una molécula CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10 o CCR11. Una quimiocina también puede ser linfotactina u otra quimiocina que se una a un receptor XCR1; una quimiocina también puede ser fractalkina o se puede unir a un receptor CX3CRI Por ejemplo, la quimiocina puede ser CCL7, CCL23, CCL27, CCL28, CXCL12, CXCL14 o CXCL15.

Los factores de crecimiento incluyen pero no se limitan a miembros de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF), miembros de la familia del factor de crecimiento nervioso (NGF), miembros de la familia del factor de crecimiento transformante (TGF), miembros de la familia GDF, miembros de la familia BMP, miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)(incluyendo FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8a, FGF-8b, FGF-8e, FGF-8f, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14, FGF-16, FGF-17, FGF-18, FGF-19, FGF-20, FGF-21, FGF-22, FGF-23, miembros de la familia del factor de crecimiento de tipo insulina (IGF), miembros de la familia del factor de crecimiento epidérmico (EGF) o miembros de la familia del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDFG). Por ejemplo, el factor de crecimiento puede ser TNF, EGF, TGFa, TGFp, FGF, NGF, eritropoyetina, IGF-1 o IGF-2.

Una hormona puede ser una hormona producida por la glándula suprarrenal, la glándula paratiroides, la glándula hipófisis o la glándula tiroides; también se puede producir por el hipotálamo, el ovario, el testículo, el páncreas, la glándula pineal o el timo. Por ejemplo, la hormona puede ser una hormona estimulante de tiroides, una hormona estimulante de folículos, una hormona leuteinizante, prolactina, hormona de crecimiento, hormona adrenocorticotrópica, hormonas antidiurética, oxitocina, hormona liberadora de tirotropina, hormona liberadora de gonadotropina, hormona liberadora de la hormona del crecimiento, hormona liberadora de corticotropina, somatostatina, dopamina, melatonina, tiroxina, calcitonina, hormona paratiroidea, un glucocorticoide, un mineralocorticoide, un andrógeno, adrenalina, un estrógeno, progesterona, gonadotropina coriónica humana, insulina, glucagones, somatostatina, eritropoyetina, calcitriol, péptido natriurético auricular, gastrina, secretina, colecistoquinina, somatostatina, neuropéptido Y, ghrelina, PYY3-36, factor de crecimiento de tipo insulina 1, angiotensiógeno, trombopoietina o leptina.

Los neurotransmisores incluyen acetilcolina, dopamina, norepinefrina, serotonina, histamina o epinefrina. El neurotransmisor también puede ser un péptido neuroactivo (por ejemplo, bradiquinina, colecistoquinina, gastrina,

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secretina, oxitocina, un péptido del sueño, hormona liberadora de gonadotropina, beta-endorfina, encefalina, sustancia P, somatostatina, prolactina, galanina, hormona liberadora de la hormona del crecimiento, bombesina, dinorfina, neurotensina, motilina, tirotropina, neuropéptido Y, hormona leuteinizante, calcitonina o péptido intestinal vasoactivo). Las moléculas coestimuladoras adecuadas incluyen B7-1 y B7-2.

Composiciones Farmacéuticas

La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de fusión de la invención y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las proteínas de fusión de la presente invención se pueden formular de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, mediante las cuales el polipéptido se combina con un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable, tal como soluciones acuosas o tampones, suspensiones y emulsiones farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de disolventes no acuosos incluyen propiletilenglicol, polietilenglicol y aceites vegetales. Las formulaciones terapéuticas se preparan para el almacenamiento mezclando el principio activo que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables opcionales, tal como se describe en Pharmaceutical Sciences de Remington, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas.

Más particularmente, las presentes composiciones farmacéuticas se pueden administrar para terapia mediante cualquier ruta adecuada incluyendo subcutánea, subcutánea o intratecal mediante bomba de infusión, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intravítrea, nasal y pulmonar. También se apreciará que la ruta preferida variará con el agente terapéutico, con la afección y con la edad del receptor, y la enfermedad que se esté tratando.

En una realización, la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea. En esta realización, la composición se puede suministrar como un polvo liofilizado que se reconstituye antes de la administración. La composición también se puede suministrar en una forma líquida, que se puede administrar directamente al paciente. En una realización, la composición se suministra como un líquido en una jeringa precargada de manera que el paciente se pueda autoadministrar la composición.

En otra realización, las composiciones de la presente invención están encapsuladas en liposomas, que tienen una utilidad demostrada en la administración de agentes activos beneficiosos de forma controlada durante períodos de tiempo prolongados. Los liposomas son membranas de bicapa encerradas que contienen un volumen acuoso atrapado. Los liposomas también pueden ser vesículas unilamelares que poseen una única bicapa de membrana o vesículas multilamelares con múltiples bicapas de membrana, cada una separada de la siguiente por una capa acuosa. La estructura de la bicapa de membrana resultante es tal que las colas hidrófobas (no polares) del lípido se orientan hacia el centro de la bicapa, mientras que las cabezas hidrófilas (polares) se orientan hacia la fase acuosa. En una realización, el liposoma puede estar recubierto con un polímero flexible soluble en agua que evita la absorción por los órganos del sistema de fagocitos mononucleares, principalmente el hígado y el bazo. Los polímeros hidrófilos adecuados para rodear a los liposomas incluyen, sin limitación, PEG, polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropiloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, polihidroxipropilmetacrilato, polihidroxetilacrilato, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietilenglicol, poliaspartamida y secuencias de péptidos hidrófilos tal como se describen en las Patentes de Estados Unidos N.° 6.316.024; 6.126.966; 6.056.973 y 6.043.094.

Los liposomas pueden estar comprendidos por cualquier lípido o combinación de lípidos conocida en la materia. Por ejemplo, los lípidos formadores de vesículas pueden ser lípidos de origen natural o sintéticos, incluyendo fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol y esfingomielina tal como se desvela en las Patentes de Estados Unidos N.° 6.056.973 y 5.874.104. Los lípidos formadores de vesículas también pueden ser glucolípidos, cerebrósidos o lípidos catiónicos, tales como 1,2-dioleiloxi-3-(trimetilamino) propano (DOTAP); bromuro de N-[1-(2,3,-ditetradeciloxi)propil]-N,N-dimetil-N- hidroxietilamonio (DMRIE); bromuro de N-[1-(2,3,-dioleiloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxi etilamonio (DORIE); cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTmA); 3 [N-(N',N'-dimetilaminoetano) carbamoil] colesterol (DC-Chol); o dimetildioctadecilamonio (DDAB) también tal como se desvela en la Patente de Estados Unidos N.° 6.056.973. El colesterol también puede estar presente en el intervalo apropiado para impartir estabilidad a la vesícula tal como se desvela en las Patentes de Estados Unidos N.° 5.916.588 y 5.874.104.

Para las formulaciones líquidas, una propiedad deseada es que la formulación se suministre en una forma que pueda pasar a través de una aguja de calibre 25, 28, 30, 31, 32 para administración intravenosa, intraarticular o subcutánea.

En otras realizaciones, la composición puede administrarse por vía intranasal para permitir la transferencia de los agentes activos a través de los conductos olfativos hacia el SNC y reducir la administración sistémica. Los dispositivos usados comúnmente para esta vía de administración se incluyen en la Patente de Estados Unidos N.° 6.715.485. Las composiciones administradas a través de esta ruta pueden permitir una mayor dosificación del SNC o una carga corporal total reducida, lo que reduce los riesgos de toxicidad sistémica asociados con ciertos fármacos. La preparación de una composición farmacéutica para la administración a un dispositivo implantable en subdermis

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se puede realizar usando métodos conocidos en la materia, tales como los descritos en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 3.992.518; 5.660.848; y 5.756.115.

Una composición farmacéutica típica para administración parenteral sería de aproximadamente 0,1 a 3 mg/kg por paciente por día. Los métodos para preparar composiciones administrables por vía parenteral serán conocidos o evidentes para los expertos en la materia y se describen con más detalle en publicaciones tales como Pharmaceutical Science de Remington, 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980).

Las administraciones individuales o múltiples de las composiciones se pueden administrar dependiendo de la dosificación y frecuencia tal como se requiera y se tolere por el paciente. En cualquier caso, la composición debería proporcionar una cantidad suficiente de las proteínas de la presente invención para tratar eficazmente al paciente.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y de ningún modo se deben interpretar como limitantes de la invención que se reivindica.

Ejemplo de referencia 1. Diseño, preparación, expresión y purificación de construcciones de fusión Picasso

1. Diseño de IL-6 permutada circularmente y fusión al dominio D1 del receptor gp130

La estructura cristalina del complejo hexamérico de señalización IL-6 (1P9M.pdb; FIG. 1) se utilizó para diseñar una variante permutada circularmente de la IL6 humana, llamada picasso3 (FIG. 2; RDB1503; SEQ ID NO: 1 (proteína) y SEQ ID NO: 2 (ácido nucleico)), de manera que el extremo C-terminal diseñado se pudiese fusionar al extremo N- terminal del dominio D1 de gp130 en el complejo a través de un espaciador corto. En resumen, los extremos N- terminal y C-terminal diseñados en picasso3 se corresponden con los restos 182 y 180 en la IL-6 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 3) y los extremos de IL-6 natural se unieron a través de un enlazador de 7 aminoácidos. El dominio D1 de gp130 se eligió como el miembro de fusión de manera que no solo interferiría estéricamente con la formación del hexámero, sino que también potenciaría la afinidad de unión a IL-6R a través de interacciones naturales presentes en el complejo (FIG. 3B). El extremo C-terminal diseñado de picasso3 se fusionó al dominio D1 a través de un espaciador de dos aminoácidos para formar RDB1527 (FIG. 3B; SEQ ID NO: 4 (proteína) y SEQ ID NO: 5 (ácido nucleico)). Como control se diseñó un análogo de proteína de fusión que consistía en una IL6 natural fusionada a D1 (RDB1529) (FIG. 3A; SEQ ID NO: 6 (proteína) y SEQ ID NO: 7 (ácido nucleico)).

2. Síntesis génica

La síntesis de los genes para la expresión de las construcciones diseñadas se llevó a cabo usando métodos convencionales.

3. Subclonación de los genes sintetizados en un vector de expresión en mamíferos

A) Preparación del vector de expresión pcDNA™ (Invitrogen).

Se digirieron 5 |jg de pcDNA con BamHI y HindIII durante dos horas a 37 °C. El digerido se trató con fosfatasa alcalina de ternera para eliminar el 5' fosfato, evitando de este modo el religamiento del vector sobre sí mismo. Se intercambió el tampón para eliminar sales de la reacción de fosfatasa alcalina de ternera. El kit de limpieza de PCR de Qiagen se usó siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. El ADN se eluyó en 30 jl de H2O.

B) Preparación del gen de interés.

El gen de interés se digirió con BamHI y HindIII durante dos horas a 37 °C. La reacción de digestión se dejó correr sobre un aparato E-Gel® CloneWell™ (Invitrogen) usando SYBR Green al 0,8 %. El fragmento correspondiente al gen de interés se aisló de la segunda fila de pocillos en el gel.

C) Reacción de ligamiento del gen a pcDNA.

El pcDNA preparado (etapa A) se mezcló con el ADN de la etapa B en presencia de ligasa T4 y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Tras el ligamiento, los productos se transformaron en células TOP10 (Invitrogen; cepa químicamente competente de E. coli) y el clon correcto se tomó y se almacenó como un reservorio en glicerol a -80 °C.

4. Expresión de RDB1503, RDB1527 y RDB1529

Todas las proteínas se expresaron en células CHO usando el reactivo FreeStyle™ Max Reagent (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, un día antes de la transfección, las células se sembraron a 0,5x106 célula/ml y en el día de la transfección se ajustaron a 1x106 células/ml tal como se recomienda por el

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fabricante. Para una transfección de 1 litro, se prepararon dos tubos (A y B) de medio (OptiPRO™, Invitrogen) que contenían aproximadamente 19 ml, se añadió 1 mg de ADN al tubo A y se añadió 1 ml de reactivo FreeStyle™ Max al tubo B.Inmediatamente, los contenidos de ambos tubos se mezclaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Tras el período de incubación se añadió lentamente la mezcla a 1 litro de células CHO. Tras la transfección se dejaron las células durante 6 a 7 días y después se recogió el sobrenadante.

5. Purificación de RDB1527 y RDB1529

La proteína expresada en el sobrenadante se capturó en una columna de proteína A para unir la porción Fc de la proteína de fusión. Tras la unión de la proteína, la columna se lavó con hasta 5 volúmenes de columna de PBS. La proteína se eluyó de la columna disminuyendo el pH del tampón de funcionamiento y se neutralizó directamente con tampón Tris a pH=7. La proteína purificada se dializó toda la noche frente a PBS.

Ejemplo de referencia 2. Actividad in vitro de proteínas de fusión de IL6 permutadas circularmente

Las células HEK-Blue™ IL-6 (Invitrogen) son células embrionarias humanas diseñadas específicamente para detectar IL-6 bioactiva in vitro mediante el control de la expresión inducida por IL-6 de un gen reportero de fosfatasa alcalina embrionaria secretada inducible con STAT3 (SEAP). SEAP se puede controlar fácilmente cuando se usa el medio de detección de SEAP QUANTI-Blue™ (Invitrogen). La línea celular humana y el medio de detección se usaron para ensayar la capacidad de le IL6 permutada circularmente y de las construcciones de proteína de fusión IL6 RDB1503, RD1527 y RDB1529 para actuar como agonistas o antagonistas de SEAP inducida por IL-6.

Se colocaron 100 pl de medio que contiene células HEK-Blue™ IL-6 en placas de microtítulo de 96 pocillos hasta una concentración final de 50.000 células/pocillo. Para medir la actividad agonista, se prepararon IL6 y RDB1503 a una concentración final d 200 pM y después se diluyeron de manera seriada y se añadieron por duplicado muestras de ensayo a las células HEK-Blue™ IL-6. Para medir la potencia del antagonista, se prepararon RD1527 y RDB1529 a una concentración inicial de 3,3 nM, después se diluyeron de manera seriada t se añadieron en duplicado muestras de ensayo a las células HEK-Blue™ IL-6 en presencia de una concentración constante de IL6 de 12,5 pM. Las muestras se incubaron a 37 °C, con CO2 al 5 % durante 20-24 horas, después, se transfirieron 40 pl de cada muestra a una nueva placa de 96 pocillos que contiene 160 pl de QUANTI-Blue™ en cada pocillo, y se incubó a 37 °C, con CO2 al 5 %. Se tomaron lecturas de absorbancia a 630 nm tras 3 horas de incubación.

La IL-6 permutada circularmente (RDB1503) demostró actividad agonista con una CE50 comparable con la de IL-6 (FIG. 4). RDB1527 (CP_IL-6_D1_Fc) fue capaz de inhibir la expresión de SEAP inducida por IL-6 en una forma dependiente d la dosis con un valor de CI50 de 0,22 nM (FIG. 5). En contraste, RDB1529 (IL-6_D1_Fc no modificada) no presentó efecto antagonista (FIG. 5).

Se sacaron las siguientes conclusiones: 1) La permutación circular de IL-6 da como resultado que no haya pérdida de afinidad de unión; 2) la fusión del dominio D1 de gp130 al extremo C-terminal de la IL-6 de tipo silvestre no convierte a IL-6 en un potente agonista, mientras que la fusión del dominio D1 de gp130 al extremo C-terminal de la IL-6 permutada circularmente da como resultado un potente antagonismo de la señalización mediada por IL-6.

Ejemplo de referencia 3. Medidas de cinética de wtIL6, RDB1527 y RDB1529

La IL6-Fc de tipo silvestre (wtIL6), RDB1527 y RDB1529 se inmovilizaron en una microplaca de sensor de Biacore™ usando el kit de captura de anticuerpos humanos (GE Healthcare) según el protocolo del fabricante. IL-'6R se pasó sobre la superficie de la microplaca en un modelo por etapas. IL-6R se preparó en 5 concentraciones; 3,0 nM, 1,0 nM, 0,33 nM, 0,11 nM y 0,03 nM. En el primer ciclo, la concentración de 0,03 nM de IL-6R fluyó sobre el ligando de unión en la superficie de la microplaca durante 180 segundos, tras los cuales, se pasó una solución de blanco sobre la superficie para permitir que se disociase IL-6R. Se repitió el mismo procedimiento durante cuatro veces adicionales usando una concentración en aumento desde 0,03 a 3 nM de 6R. Los sensogramas resultantes se analizaron con el programa informático de instrumento natural para calcular las afinidades de unión de las construcciones.

La afinidad de unión de RDB1527 a IL-6R se calculó que era 40 pM (FIG. 6C), representando un aumento de más de 200 veces cuando se compara con la afinidad del control wtIL6 (9 nM, FIG. 6A). El sensograma para RDB1529 (FIG. 6B) dio como resultado un mal ajuste y, por lo tanto la afinidad de unión calculada no es fiable. Esto puede deberse a una unión mixta entre IL-6 e IL-6R e independientemente de D1 e IL-6R.

Basándose en los resultados, se concluyó que la afinidad de unión de RDB1527 a IL-6R es de 40 pM o mayor de 200 veces superior a la de wtIL6. Estos datos, en combinación con la potente actividad antagonista, sugieren fuertemente que los determinantes de unión en IL-6 y en D1 se unen simultáneamente a IL-6R y evitan la asociación del complejo de señalización, tal como se diseñó.

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Ejemplo de referencia 4. Diseño de IL1p permutada circularmente y fusionada a los dominios D1-D2 de IL-1RI (RDB1538)

La estructura cristalina del complejo heterotrimérico de señalización IL-1p (4DEP.pdb; FIG. 7A) se utilizó para diseñar una variante permutada circularmente de IL-1p (RDB1515; SEQ ID NO: 8 (proteína) y SEQ ID NO: 9 (ácido nucleico)), de manera que el extremo N-terminal diseñado se pudiese fusionar al extremo C-terminal del dominio D1- D2 de IL-1RI a través de un espaciador corto. En resumen, los extremos N-terminal y C-terminal diseñados se corresponden con los restos 224 y 223, respectivamente, en IL-1 p de tipo silvestre, y los extremos naturales de IL-1 p estaban unidos mediante un enlazador de 7 aminoácidos. El extremo N-terminal recién creado se fusionó al dominio D1-D2 de RI con un espaciador de 5 aminoácidos y se añadió el marcador FLAG al extremo N-terminal de RI, dando como resultado RDB1538 (FIG. 7B; SEQ ID NO: 10 (proteína) y SEQ ID NO: 11 (ácido nucleico)). La proteína de fusión resultante se diseña para ser un antagonista de la señalización mediada por IL-1p uniéndose a IL-1RAcP e impidiendo que se ensamble el complejo de señalización completo.

Ejemplo de referencia 5. Diseño de IL-2 permutada circularmente y fusionada a IL-2Ra (RDB1405)

Tras unirse a IL-2Ra, la conformación de unión de IL-2 se estabiliza para permitir que se forme un complejo de alta afinidad con IL-2Rp y Yc. RDB1405 está diseñada para ser un superagonista de la señalización mediada por IL-2, particularmente en células que carecen de IL-2Ra, ya que sería capaz de formar el complejo de alta afinidad sin requerir la unión a IL-2Ra asociado a células. La estructura cristalina del complejo cuaternario de señalización de IL- 2 (2B5I.pdb; FIG. 8A) se utilizó para diseñar una variante de IL-2 permutada circularmente, de manera que el extremo C-terminal diseñado se pudiese fusionar al extremo N-terminal de IL-2Ra a través de un espaciador corto. En resumen, los extremos N-terminal y C-terminal diseñados se corresponden con los restos 95 y 94, respectivamente, en IL-2 de tipo silvestre. El extremo C-terminal de IL-2 natural estaba unido al resto 4 de la IL-2 a través de un enlazador de 2 aminoácidos. Finalmente, el extremo C-terminal recién creado estaba fusionado al extremo N-terminal de IL-2Ra a través de un espaciador de 6 aminoácidos y el extremo C-terminal de IL-2Ra estaba fusionado a Fc de IgG1 humana, dando como resultado RDB1405 (FIG. 8B; SEQ ID NO: 12 (proteína) y SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico)).

Ejemplo 1. Diseño de proteínas de fusión permutadas circularmente

Se diseñó una proteína de fusión de IL-2 o IL-15 con selectividad mejorada por células que expresan IL-2RpY (pero no IL-2a) sobre células que expresan IL-2RapY en relación con la IL-2 de tipo silvestre (IL-2 de tipo silvestre tiene una mayor preferencia por células que expresan IL-2RapY ). Al fusionar IL-2Ra a IL-2 o IL-15Ra a IL-15, la proteína de fusión resultante tenía una mayor actividad sobre células que carecen de la respectiva cadena alfa (IL-2Ra o IL- 15Ra) en comparación con el ligando natural, y se reduciría la preferencia por células que expresan la respectiva cadena alfa. Por tanto, el radio de actividad, CE50 (IL-2RapY+)/ CE50(IL-2RalL-2RpY+) aumentaría para las proteínas de fusión CP-IL-2-IL-2Ra, sería menor en comparación con la IL-2 de tipo silvestre. Se podrían esperar resultados análogos para las proteínas de fusión CP-IL-15-IL-15Ra. Se requiere la permutación circular de la citocina para orientar de manera apropiada los extremos en una localización óptima para la fusión, ya que los extremos nativos están orientados distalmente a las cadenas alfa en el complejo de señalización.

Resultados: En células que carecen de IL-2Ra, pero que expresan IL-2RpY (línea celular HH)1, las construcciones diseñadas son tan eficaces (de hecho, de dos a cinco veces mejor) como la proleucina en la promoción de la fosforilación de STAT5 (Figura 11A, panel izquierdo). En contraste, en una línea celular que expresa el complejo receptor heterotrimérico de alta afinidad, IL-2RapY, (línea celular CTLL-2)2, dos de las construcciones diseñadas (RDB1411, RDB1413) son de 100 a 300 veces menos activas que la proleucina tal como se mide mediante la proliferación celular. En su conjunto, las construcciones diseñadas presentan entre 400 y 600 veces mejor selectividad por células que carecen de IL-2Ra, en relación con la IL-2 de tipo silvestre y, por lo tanto, tienen el potencial de administrar un perfil terapéutico mejorado. Aunque se ha observado el aumento en la proporción de actividad, tal como se esperaba, fue sorprendente, que el mayor efecto sobre el aumento en la proporción fuera la pérdida dramática de actividad (de 100 a 300 veces) en células que contienen IL-2Ra, en lugar de una mejora en la actividad (solo 2 a 5 veces) para células que carecen de IL-2Ra.

En células que carecen de IL-2Ra, pero que expresan IL-2RpY (línea celular HH)i, las construcciones diseñadas son potentes activadores de fosforilación de STAT5, pero aproximadamente 10 veces menos potentes que la IL-15 de tipo silvestre (Figura 12A, panel izquierdo). En una línea celular que expresa el complejo receptor heterotrimérico de alta afinidad, IL-2RapY, (línea celular CtLl-2)", las construcciones diseñadas (RDB1408, RDB1416) son de 2000 a 6000 veces menos activas que la IL-15 de tipo silvestre tal como se mide mediante la proliferación celular. En su conjunto, las construcciones diseñadas presentan entre 200 y 600 veces mejor selectividad por células que carecen de IL-2Ra, en relación con la IL-15 de tipo silvestre. Aunque se ha observado el aumento en la proporción de actividad, tal como se esperaba, fue sorprendente, que el mayor efecto sobre el aumento en la proporción fuera la pérdida dramática de actividad (de 2000 a 6000 veces) en células que contienen IL-2Ra y que se observe una pérdida de actividad de 10 veces para células que carecen de IL-2Ra.

1ATCC CRL-2105 2ATCC TIB-214

5

10

15

Construcciones:

RDB1409: CP-IL-2(C145S)-FLAG; IL-2 permutada circularmente. La mutación C145S es análoga a la de la proleucina (rhIL-2) para mejorar las propiedades físicas de la proteína. El marcador FLAG se añade para facilitar la purificación.

SKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSI ISTLTGGSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPK KATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQGSDYKDDDDK (SEQ ID NO: 24)

RDB1411: CP-IL-2(C145S)-IL-2Ra-Fc; IL-2 permutada circularmente y fusionada a IL-2Ra. La mutación C145S es análoga a la de la proleucina (rhIL-2) para mejorar las propiedades físicas de la proteína. El Fc se añade para facilitar la purificación.

SKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSI

ISTLTGGSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPK

KATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQGSGGGSELCDDDPPEIPHATFKAMA

YKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNT

TKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYH

FVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGGGGS

EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS

HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN

GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT

CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW

QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 25)

RDB1413: CP-IL-2(C145S)-IL-2Ra-FLAG; IL-2 permutada circularmente y fusionada a IL-2Ra. La mutación C145S es análoga a la de la proleucina (rhIL-2) para mejorar las propiedades físicas de la proteína. El marcador FLAG se añade para facilitar la purificación. Construcción análoga a RDB1411, sustituyendo Fc con FLAG.

SKNFHLRPRDLISNINVIVLELKG SETTFMCEY ADET ATIVEFLNRWITFSQSI ISTLT G G SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPK KATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQGSGGGSELCDDDPPEIPHATFKAMA YKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNT TKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATER1YH

FVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQL1CTGDYK DDDDK (SEQ ID NO: 26)

RDB1408: Fc-IL-15Ra(sushi)-CP-IL-15; IL-15 permutada circularmente y fusionada al dominio sushi de IL-15Ra. El Fc se añade para facilitar la purificación.

5

10

15

20

25

30

35

40

EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHE ALHNHYTQKS LS LSPGKGSITCPPPM S VEHADIWVKS YSLYSRERYICNSG FKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDGGSELEEKNIKEFLQSFVHI VQMFINGGGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCF LLELQV1SLESGDAS1HDTVENLMLANNSLSSNGNVTESGCKEC (SEQ ID NO:

27)

RDB1416: FLAG-IL-15Ra(sushi)-CP-IL-15; IL-15 permutada circularmente y fusionada al dominio sushi de IL-15Ra. El marcador FLAG se añade para facilitar la purificación. Construcción análoga a RDB1408, sustituyendo Fc con FLAG.

DYKDDDDKGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTE CVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDGGSELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINGGGSN WVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESG DASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKEC (SEQ ID NO: 28)

Aunque la presente invención se ha mostrado y se ha descrito haciendo particular referencia a realizaciones preferentes de la misma, los expertos en la materia entenderán que pueden realizarse diversos cambios en la forma y los detalles sin desviarse del alcance de la invención englobada en las reivindicaciones adjuntas. También se debería entender que las realizaciones descritas en el presente documento no son mutuamente excluyentes y que las características de las diversas realizaciones se pueden combinar en su totalidad o en parte de acuerdo con la invención.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> ALKERMES, INC.

<120> LIGANDOS MODIFICADOS MEDIANTE PERMUTACIÓN CIRCULAR COMO AGONISTAS Y ANTAGONISTAS

<130> 4000.3059 WO

<140>

<141>

<150> 61/778,575 <151> 13/03/2013

<150> 61/778,812 <151> 13/03/2013

<150> 61/723,081 <151> 06/11/2012

<150> 61/657,264 <151> 08/06/2012

<150> 61/657,378 <151> 08/06/2012

<150> 61/657,285 <151> 08/06/2012

5

<160> 28

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1 <211> 170 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Polipéptido sintético 15

<400> 1

Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu lie Leu Arg Ser 15 10 15

Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met Ser 20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser Glu Arg lie Asp Lys Gln lie Arg 35 40 45

Tyr lie Leu Asp Gly lie Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys 50 55 60

Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu 65 70 75 80

Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe 85 90 95

Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys lie lie Thr Gly Leu Leu Glu Phe 100 105 110

Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu 115 120 125

Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu lie Gln Phe Leu 130 135 140

Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala lie Thr Thr Pro Asp Pro Thr 145 150 155 160

Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln 165 170

<210>2 <211> 516 <212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Polinucleótido sintético <400>2

10

cagaaccagt: ggctgcagga catgaccacc cacctgatcc tgcggtcctt caaagagttc 60

ctgcagtcct: ccctgcgggc cctgagacag atgagcggag gatctggcgg aggctcctct 120

gagcggatcg: acaagcagat ccggtacatc ctggacggca tctccgccct gcggaaagag 180

acatgcaaca: agtccaacat gtgcgagtcc agcaaagagg ccctggccga gaacaacctg 240

aacctgccca: agatggctga gaaggacggc tgcttccagt ccggcttcaa cgaagagact 300

tgcctggtca: agatcatcac cggoctgctg gaatttgagg tgtacotgga atacctgcag 360

aacagattcg: agtcctccga ggaacaggcc agagccgtgc agatgtccac caaggtgctg 420

atccagtttc: tgcagaagaa ggccaagaac ctggacgcta tcaccacccc cgaccctacc 480

accaatgcct: ccctgctgac caagctgcag tgataa 516

<210> 3 <211> 212 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

imagen1

Ser Leu 15

Pro Pro Leu Thr Gly lie

Glu Ser 80

Met Ala

95

Cys Leu

Glu Tyr

Val Gln

Lys Asn 160

Leu Leu 175

Thr His

Arg Ala

<210>4 <211> 511 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Polipéptido sintético

<400> 4

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido de fusión que comprende los aminoácidos 1 a 303 de la SEQ ID NO: 26, o una secuencia de aminoácidos homóloga a la misma con al menos el 70 % de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos que

5 comprende una IL-2 permutada circularmente y tiene una selectividad mejorada por IL-2RpY sobre IL-2RapY en relación con la IL-2 de tipo silvestre.
2. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de fusión de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10
3. Un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica el polipéptido de fusión de la reivindicación 1.
4. Un vector recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 3.

15 5. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 4.
6. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1 para su uso en medicina.
7. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1 para su uso en un método de tratamiento del cáncer o de una 20 afección autoinmune.

imagen1

gpi30

v¿\.

Complejo hexamerico de señalización de IL6

Vista

lateral

Vista superior

Fig.1

Permutación circular de IL6

imagen2

LTSSERIDKQ IRYILDGISA LRKETCNKSN MCESSKEALA ENNLNLPKMA EKDGCFQSGF NEETCLVKII 117 TGLLEFEVYL EYLQNP.fESS EEQARAVQHS TKVLIQFLQK KAKNLDAITT PDPTTNASLL TKLQAQNQWL 187 QDMTTHLILR SFKEFLQSSL RALRQM** C

— Picasso3_IL6

D Enlazador

1 QNQWLQDMTT HLILRSFKEF LQSSLRALRQ M(gGSSG^SS ERIDKQIRYI LDGISALRKE TCNKSNMCES 71SKEALAEKNL NLPKMAEKDG CFQSGFWEEr clvkTTTgll efevyleylq nrfesseeqa ravqmstkvl 141IQFLQKKAKN LDAITTPDPT TNASLLTKLQ** b c

Fig.2

imagen3

RDB1527

Fig. 3

RDB1527 (picasso3_D1) y RBD1529 (wtlL6_D1)

1,0n

0,9

0,8

0,7

0,6
0.5

0,4

0,3

0,2

0,1

0,

01

gpl 30

a Dosis de IL6 oDosis de RDB1503

1000

1 10 100 Concentración (pM)

Fig. 4

Absorbencia

—X— Dosis de IL6

—O—Dosis de RDB1529 + 250 pg/ml de IL6

imagen4

Fig.5

imagen5

Kd (1/s)

Ka (l/Ms)

KD (M)

4,735E+9
9.146E-9

43,31

160-

140-

20

wtll_6

100-

Datos sin procesar

Ajuste

80-

60

40-

20-

-500

500

1000

1500

2000

Tiempo (s)

Fiq.6A

80

Ka (l/Ms)

Kd (1/s)

KD (M)

70-

1,86E+06
0.001117

6,01E-10

60-

50-

Datos sin procesar

RDB1529

® 40

Ajuste

30-

20-

0

-500

500

1000

1500

2000

Tiempo (s)

Fig. 6B

Respuesta

imagen6

Tiempo (s)

Fig.6C

imagen7

imagen8

imagen9

FGFRli

Familia de IL-1

Familia de FGF

FGF2

IL-1 RAcP V A IL-1R1

FGFR1

Citocinas de agrupación de 4 hélices

iL-6^pmJs

IL 4

IL-2Ra

IL-2

IL-6R0C

IL-2RP

Fig.9

CP- L-6:D1:Fc

IL-6RH

IL-6Ra

IL-6Ra

Fig.10

Fluorescencia 560,590

imagen10

Ensayo de proliferación de CTLL-2

imagen11

o~l-----------1-----------1-----------1-----------1

0,0001 0,01 1 100 10000

Concentración (nM)

Fig. 11B

Fluorescencia 560,590

FACS de HH - pSTAT5

imagen12

Fig. 12A

Proliferación de CTLL-2

imagen13

Fig. 12B

imagen14