JP2015520193A - ムチンドメインポリペプチドに連結された活性タンパク質を含む融合ポリペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は、ムチンドメインポリペプチドと共有結合していない同じ活性タンパク質と比較して、特性（例えば、薬物動態学的および／または物理化学的特性）が向上した活性タンパク質と共有結合したムチンドメインポリペプチドを含む融合タンパク質、ならびに本発明の融合タンパク質の作製法および使用法を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願（複数可）
本出願は、２０１２年６月８日に出願された米国仮出願第６１／６５７，２６４号、２０１３年３月１３日に出願された同第６１／７７８，５７５号、２０１２年６月８日に出願された同第６１／６５７，３７８号、２０１２年１１月６日に出願された同第６１／７２３，０８１号、２０１２年６月８日に出願された同第６１／６５７，２８５号、および２０１３年３月１３日に出願された同第６１／７７８，８１２号の利益を請求するものである。上記の出願（複数可）の全教示は、参照により本明細書に援用される。

配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由でＡＳＣＩＩ形式により提出された配列表を含み、この配列表は参照によりその全体が本明細書に援用される。２０１３年５月３１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、４０００.３０５８ＷＯ＿ＳＬ.ｔｘｔという名前であり、サイズは２７，４３１バイトである。

タンパク質治療薬の薬物動態、薬物分布（ｐｈａｒｍａｃｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）、溶解性、安定性、エフェクター機能および受容体結合の増強は、グリコシル化タンパク質の炭水化物部分が著しく影響を与え得る。さらに、多くの生物活性のあるペプチドおよびタンパク質は、溶解性が限られているか、または組換え生成中に凝集し、複雑な可溶化手順およびリフォールディング手順を必要とする。さらに、６０キロダルトン（ｋＤ）より低い分子量を有するタンパク質およびペプチド治療薬は、腎クリアランスにより半減期が短いことが悩みの種である場合が多い。

タンパク質治療薬の血中半減期を延長するために用いられている現在の戦略は、主に２つの一般的なカテゴリー：１）ＦｃＲｎ媒介性リサイクルの利用、および２）流体力学容積の増加に入る。説明されている具体的なアプローチには、前者の戦略についてはＦｃＲｎ結合タンパク質もしくはドメイン（Ｆｃ、アルブミン）へのコンジュゲーション、結合、または融合が含まれ、後者については多量体化、（ＰＥＧ、コロミン酸、またはヒドロキシエチルデンプンなどの）ポリマーまたは炭水化物への化学的結合、Ｎグリコシル化部位の組み込みが含まれる。しかし、Ｆｃ融合タンパク質の生成は、追加の製造ステップ、および多くの場合、複雑な精製手順を必要とする、時間がかかり、非効率的でお金のかかるプロセスである。さらに、最も広く使用されている化学的カップリング戦略のＰＥＧ化が、コンジュゲーションおよび精製ステップの追加ならびに全体的な収率の低下により製造コストの著しい増加をもたらす。近年、米国特許公開２０１０／０２３９５５４に記載されているものなどの、柔軟な長いポリペプチド配列の融合により産生される他の組換えＰＥＧ模倣物についても説明されている。この技術は、追加のコンジュゲーションステップを回避するが、非内因性の追加のペプチド配列は免疫原性の可能性を有する。

ムチンタンパク質およびタンパク質のムチンドメインは、ムチンタンパク質およびムチンドメインを含む他のポリペプチドが硬直したランダムコイルとして動作することを構造的に可能にする高度のグリコシル化を含む。高度にグリコシル化されたムチンドメインを構成する親水性の分枝状親水性炭水化物と組み合わせた、この硬直したランダムコイル状構造は、活性タンパク質の流体力学半径を、発現タンパク質の分子量に基づいて予想される半径よりも大きくさせるのに特に有用である。また、高レベルのグリコシル化にとって、ムチンドメインの付加は、活性タンパク質の電荷、溶解性および濃縮溶液の粘弾性特性などのタンパク質の物理化学的特性を変更する可能性も有する。

本発明の融合タンパク質組成物および方法は、活性タンパク質の生物学的特性、薬理学的特性、安全性特性、および／または薬学的特性を向上させる。

本発明は、ムチンドメインポリペプチドと共有結合していない同じ活性タンパク質と比較して、特性（例えば、薬物動態学的および／または物理化学的特性）が向上した活性タンパク質と共有結合したムチンドメインポリペプチドを含む融合タンパク質、ならびに本発明の融合タンパク質の作製法および使用法を提供する。

一実施形態において、本発明は、ムチンドメインポリペプチドに融合されていない対応する活性タンパク質と比較して、活性タンパク質の少なくとも１つの薬物動態学的または物理化学的特性が向上している活性タンパク質に結合したムチンドメインポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。

一実施形態において、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列、ならびに本発明の核酸を発現するためのベクターおよび宿主細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、治療活性タンパク質の血清半減期を延長するための方法を提供する。

一実施形態において、本発明は、治療活性タンパク質の溶解性の向上を提供する。

一実施形態において、本発明は、本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。

一実施形態において、本発明は、本発明の医薬組成物を用いた治療を必要とする対象における疾患、病状および障害を治療する方法を提供する。

クマシーブルー染色したＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル（Ａ）およびＩＬ１ＲａムチンコンストラクトのＩＥＦゲル（Ｂ）の写真である。矢印は、目的のタンパク質を示す。ＩＥＦゲル中のバンドの多重度は、Ｎグリコシル化の違いによる可能性が最も高い、電荷が異なる種を示す。 ＲＤＢ１８１３（灰色）および分子サイズ標準物質（黒）のゲル濾過クロマトグラムである。標準物質の分子量およびＲＤＢ１８１３の見かけの分子量を各溶出ピーク上に記す。 ＲＤＢ１８１４（灰色）および分子サイズ標準物質（黒）のゲル濾過クロマトグラムである。標準物質の分子量およびＲＤＢ１８１４の見かけの分子量を各溶出ピーク上に記す。 ＲＤＢ１８２６（灰色）および分子サイズ標準物質（黒）のゲル濾過クロマトグラムである。標準物質の分子量およびＲＤＢ１８２６の見かけの分子量を各溶出ピーク上に記す。 ＲＤＢ１８１５（灰色）および分子サイズ標準物質（黒）のゲル濾過クロマトグラムである。標準物質の分子量およびＲＤＢ１８１５の見かけの分子量を各溶出ピーク上に記す。 ＲＤＢ１８１６（灰色）および分子サイズ標準物質（黒）のゲル濾過クロマトグラムである。標準物質の分子量およびＲＤＢ１８１６の見かけの分子量を各溶出ピーク上に記す。 ＨＥＫ−ブルーアッセイにおけるＲＤＢ１８１３（２ＴＲ）およびＲＤＢ１８１４（４ＴＲ）によるＩＬ１βシグナル伝達の阻害を示すグラフである。阻害の非存在下における濃度の関数としてのＩＬ１β（■）の活性。ＲＤＢ１８１３（×）、ＲＤＢ１８１４（△）およびＩＬ１Ｒａ（アナキンラ、◆）による阻害を、１５ｐＭのＩＬ１βの存在下で測定した。全ての測定を二重に行った。ＩＣ_５０の推定値を図の右上隅に報告する。 ＨＥＫ−ブルーアッセイにおけるＲＤＢ１８２６（６ＴＲ）によるＩＬ１βシグナル伝達の阻害を示すグラフである。阻害の非存在下における濃度の関数としてのＩＬ１β（■）の活性。ＲＤＢ１８２６（△）およびＩＬ１Ｒａ（アナキンラ、◆）による阻害を、１５ｐＭのＩＬ１βの存在下で測定した。全ての測定を二重に行った。ＩＣ_５０の推定値を図の右上隅に報告する。 ＨＥＫ−ブルーアッセイにおけるＲＤＢ１８１５（８ＴＲ）およびＲＤＢ１８１６（１２ＴＲ）によるＩＬ１βシグナル伝達の阻害を示すグラフである。阻害の非存在下における濃度の関数としてのＩＬ１β（■）の活性。ＲＤＢ１８１５（--×--）、ＲＤＢ１８１６（△）およびＩＬ１Ｒａ（アナキンラ、◆）による阻害を、１５ｐＭのＩＬ１βの存在下で測定した。全ての測定を二重に行った。ＩＣ_５０の推定値を図の右上隅に報告する。 固定化したマウスＩＬ１ＲＩ受容体に結合するＲＤＢ１８１３の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定結果を示すグラフである。センサーグラムおよびフィット曲線をそれぞれ灰色および黒で示す。ＲＤＢ１８１３およびアナキンラ（データは示さず）の動態パラメータを挿入表に示す。 固定化したマウスＩＬ１ＲＩ受容体に結合するＲＤＢ１８１４の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定結果を示すグラフである。センサーグラムおよびフィット曲線をそれぞれ灰色および黒で示す。ＲＤＢ１８１４およびアナキンラ（データは示さず）の動態パラメータを挿入表に示す。 固定化したマウスＩＬ１ＲＩ受容体に結合するＲＤＢ１８２６の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定結果を示すグラフである。センサーグラムおよびフィット曲線をそれぞれ灰色および黒で示す。ＲＤＢ１８２６およびアナキンラ（データは示さず）の動態パラメータを挿入表に示す。 固定化したマウスＩＬ１ＲＩ受容体に結合するＲＤＢ１８１５の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定結果を示すグラフである。センサーグラムおよびフィット曲線をそれぞれ灰色および黒で示す。ＲＤＢ１８１５およびアナキンラ（データは示さず）の動態パラメータを挿入表に示す。 固定化したマウスＩＬ１ＲＩ受容体に結合するＲＤＢ１８１６の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定結果を示すグラフである。センサーグラムおよびフィット曲線をそれぞれ灰色および黒で示す。ＲＤＢ１８１６およびアナキンラ（データは示さず）の動態パラメータを挿入表に示す。 マウスＣＡＩＡ炎症モデルにおけるＲＤＢ１８１６の評価のための実験計画を示す図である。 マウスＣＡＩＡ炎症モデルにおけるＲＤＢ１８１６（▽）、ＩＬ１Ｒａ（アナキンラ、◆）、および生理食塩水対照（○）の２０ｍｇ／ｋｇの単回注射の抑制効果を示すグラフである。黒い矢印は、モノクローナル抗体混合物（ｍＡｂ）、ＬＰＳおよび治療分子の注射の日を示す。８匹のマウスのグループを各治療のために使用し、各時点は各群からの平均値を表す。 ラットにおけるＲＤＢ１８１５およびＲＤＢ１８１６の薬物動態プロファイルを示す。ＲＤＢ１８１５のｉ．ｖ．注射（●、２.１ｍｇ／ｋｇ［ｍｐｋ］の単回注射）、ＳＣ注射（破線■、５.６ｍｐｋの単回注射）およびＲＤＢ１８１６のｉ．ｖ．注射（△、２.４ｍｐｋの単回注射）、ＳＣ注射（破線▽、６.４ｍｐｋの単回注射）の血漿濃度−時間プロファイルを示す。シンボルは、条件あたり３匹の異なるラットの平均値を表す。ＳＣグループの薬物動態パラメータを表にまとめる。 エキセンジン−４ムチンコンストラクトＲＤＢ２２０３のクマシーブルー染色したＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルの写真である。 ＲＤＢ２２０３（灰色）および分子サイズ標準物質（灰色）のゲル濾過クロマトグラムを示す。標準物質の分子量を各溶出ピーク上に示す。 ＲＤＢ２２０３およびエキセンジン−４のＧＬＰ−１Ｒ活性アッセイを示すグラフである。 ＲＤＢ２２０３の薬物動態プロファイルである。

本発明の好ましい実施形態を以下に説明する。

定義
本明細書で使用する以下の用語は、特に断りのない限り、それらに帰する意味を有する。

本明細書および特許請求の範囲で使用する単数形「１つ（ａ」」、「１つ（ａｎ）」および「その」は、文脈が特に明確に指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、「細胞」という用語は、その混合物を含む複数の細胞を含む。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書において互換的に使用される。ポリマーは直鎖状でも分岐状でもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。

本明細書で使用する「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤもしくはＬの両方の光学異性体、アミノ酸類似体ならびにペプチド模倣体を含むがこれらに限定されない天然および／もしくは非天然アミノ酸または合成アミノ酸のいずれかを指す。標準的な単一文字または３文字コードを用いて、アミノ酸を指定する。

配列に適用され、本明細書で用いられる「非天然」という用語は、哺乳類にみられる野生型もしくは天然の配列に対する対応物を有していないか、相補的ではないか、または高度の相同性を有していないポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、非天然ポリペプチドは、適切に整列させた場合、天然配列と比較して９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％またはそれ以下のアミノ酸配列同一性を共有していてよい。

「グリコシル化」および「グリコシル化された」という用語は、細胞内での生成中に、タンパク質の炭水化物部分、または糖が翻訳後にタンパク質に結合して糖タンパク質を形成するプロセスを意味するために本明細書で交換的に使用される。タンパク質のグリコシル化は、翻訳後事象であり、セリンおよびスレオニンへのグリカンの結合、ならびに程度は低いがＯ−結合型グリコシル化の場合にはヒドロキシプロリンおよびヒドロキシリジンへのグリカンの結合、またはＮ−結合型グリコシル化の場合にはアスパラギンへのグリカンの結合を指す。

「断片」とは、治療活性および／または生物活性の少なくとも一部を保持する天然の活性タンパク質の切断型である。「変異体」は、活性タンパク質の治療活性および／または生物活性の少なくとも一部を保持する天然の活性タンパク質と配列相同性を有するタンパク質である。例えば、変異体タンパク質は、参照活性タンパク質と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を共有してよい。本明細書で使用する「活性タンパク質部分」という用語は、例えば、部位特異的変異誘発により、挿入により、または偶然の変異を介して意図的に修飾されたタンパク質を含む。

「宿主細胞」は、対象ベクターのレシピエントであり得るか、またはそうであった個々の細胞もしくは細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含む。子孫は、天然、偶発的、または意図的な変異により、（形態または全ＤＮＡ相補体のゲノムにおいて）元の親細胞と必ずしも完全に同一でなくてよい。宿主細胞は、本発明のベクターでインビボトランスフェクトされた細胞を含む。

本明細書に開示される様々なポリペプチドを記載するために使用される場合に、「単離された」とは、その自然環境の成分から特定および分離ならびに／または回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分は、典型的には、ポリペプチドの診断または治療上の使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含んでいてもよい。当業者には明らかなように、非天然のポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、その天然の対応物から区別するために「単離」を必要としない。さらに、「濃縮」、「分離」または「希釈」されたポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、容積あたりの分子の濃度または数が、一般的にその天然の対応物の容積あたりの分子の濃度または数より大きいという点で、その天然の対応物から区別可能である。一般的に、組換え手段により作製され、宿主細胞内で発現したポリペプチドは、「単離された」と考えられる。

「単離された」ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドをコードする核酸または他のポリペプチドをコードする核酸は、ポリペプチドがコードする核酸の天然源に通常付随する少なくとも１種類の混入核酸分子から特定および分離される核酸分子である。単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は、自然界で見られる形態または設定では存在しない。したがって、単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は、天然の細胞中に存在するような特定のポリペプチドをコードする核酸分子とは区別される。しかし、単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は、例えば、その核酸分子が天然細胞のものとは異なる染色体または染色体外の位置にあり、通常そのポリペプチドを発現する細胞に含まれるポリペプチドをコードする核酸分子を含む。

「コンジュゲートされる」、「連結される」、「融合される」および「融合」は、本明細書中で交換的に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含む何らかの手段によって２種類以上の化学的要素または成分が結合することを指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合に、コード配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が読み枠（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）中またはインフレームで近接することを意味する。「インフレーム融合」は、元のＯＲＦの正しいリーディングフレームを維持する方法で、連続的なより長いＯＲＦを形成するための、２種類以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の結合を指す。したがって、得られる組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２種類以上のセグメント（これらのセグメントは通常、自然界ではそのように結合していない）を含む単一タンパク質である。

ポリペプチドの文脈において、「直鎖状配列」または「配列」は、配列中で互いに隣接する残基がポリペプチドの一次構造において近接している、アミノ末端からカルボキシル末端方向へのポリペプチド中のアミノ酸の順番である。「部分配列」は、一方向または両方向に追加残基を含むことが知られているポリペプチド部分の直鎖状配列である。

「異種」とは、比較されている実体の残りとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、その天然のコード配列から取り出され、天然配列以外のコード配列に作動可能に連結されたグリシンリッチ配列は、異種グリシンリッチ配列である。ポリヌクレオチド、ポリペプチドに適用される「異種」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、比較されている実体の残りのそれとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。

「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。これらは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチド、またはそのアナログのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、既知または未知の任意の三次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を実行することができる。以下のものは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾されたヌクレオチドを含むことができる。存在する場合には、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーのアセンブリの前後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。

ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドが、潜在的に宿主細胞内で発現させることができるコンストラクトをもたらすインビトロクローニング、制限酵素切断および／またはライゲーションのステップ、ならびに他の手順の様々な組合せの産物であることを意味する。

「遺伝子」または「遺伝子断片」という用語は、本明細書で互換的に使用される。これらは、転写および翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子または遺伝子断片は、ポリヌクレオチドが少なくとも１種類のオープンリーディングフレームを含む限り、全コード領域またはそのセグメントをカバーすることができるゲノムまたはｃＤＮＡであり得る。「融合遺伝子」は、共に連結された少なくとも２種類の異種ポリヌクレオチドで構成される遺伝子である。

「相同性」または「相同」は、２種類以上のポリヌクレオチド配列または２種類以上のポリペプチド配列間の配列の類似性または互換性を指す。２種類の異なるアミノ酸配列間の配列同一性、類似性または相同性を決定するためにベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）などのプログラムを使用する場合、デフォルト設定を使用するか、またはｂｌｏｓｕｍ４５またはｂｌｏｓｕｍ８０などの適切なスコアリングマトリックスを選択して、同一性、類似性または相同性のスコアを最適化することができる。好ましくは、相同なポリヌクレオチドは、本明細書で定義されるストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、それらの配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、さらにより好ましくは９９％の配列同一性を有する。

「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、ポリヌクレオチドが、他の配列よりも検出可能な高い割合（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）でその標的配列にハイブリダイズする条件への言及を含む。一般的に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ある程度、洗浄ステップが実施される温度および塩濃度に関連して表される。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７.０〜８.３で約１．５Ｍ未満のＮａイオンであり、典型的には約０.０１〜１.０ＭのＮａイオン（または他の塩）濃度であり、短いポリヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）についての温度は少なくとも約３０℃であり、（例えば、５０ヌクレオチドより大きい）長いポリヌクレオチドについての温度は少なくとも約６０℃である。例えば、「ストリンジェントな条件」は、３７℃で５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、およびそれぞれ６０〜６５℃での０.１×ＳＳＣ／１％ＳＤＳにおける１５分間の３回の洗浄を含み得る。あるいは、約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度を使用してもよい。ＳＤＳは約０.１％で存在し、ＳＳＣ濃度は、約０．１〜２×ＳＳＣと変化してもよい。このような洗浄温度は、典型的には、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定配列の熱融点よりも約５℃〜２０℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする（規定のイオン強度およびｐＨ下での）温度である。核酸ハイブリダイゼーションのためのＴｍおよび条件を計算するための式は、公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ.ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｖｏｌ １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ Ｎ．Ｙ．； で見つけることができ、特に、Ｃｏｌｕｍｅ そして Ｃｈａｐｔｅｒ ９を参照されたい。典型的には、ブロッキング試薬を用いて、非特異的なハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング試薬は、例えば、剪断および変性されたサケ精子ＤＮＡを約１００〜２００μｇ／ｍｌで含む。約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドなどの有機溶媒も、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションなどのための特定の条件下で使用してもよい。これらの洗浄条件に有用なバリエーションは、当業者には容易に明らかであろう。

ポリヌクレオチド配列に適用される「パーセント同一性」および「％同一性」という用語は、標準化されたアルゴリズムを使用して整列される少なくとも２種類のポリヌクレオチド配列間の残基の一致の割合を指す。このようなアルゴリズムは、標準化され、再現性のある方法で、２種類の配列間のアラインメントを最適化するために比較される配列中にギャップを挿入し、それによって、２種類の配列のより有意義な比較を達成することができる。パーセント同一性は、例えば、特定の配列番号によって定義されるような所与のポリヌクレオチド配列の全長にわたって測定されるか、またはより短い長さにわたって、例えば、より長い所与のポリヌクレオチド配列から取得される断片、例えば、少なくとも４５、少なくとも６０、少なくとも９０、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも２１０または少なくとも４５０個の連続残基の断片の長さにわたって測定されてもよい。このような長さは単なる例示であり、本明細書、表、図、または配列表に示される配列によって支持される任意の断片長を用いて、パーセント同一性を測定することができる長さについて説明してもよいことが理解される。

本明細書で同定されるポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、必要に応じて、最高のパーセント配列同一性を達成するために配列を整列させ、ギャップを導入した後の、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない、第２の参照ポリペプチド配列またはその一部のアミノ酸残基と同一であるクエリー配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の範囲内の様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最高のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。パーセント同一性は、例えば、特定の配列番号によって定義されるような所与のポリペプチド配列の全長にわたって測定されるか、またはより短い長さにわたって、例えば、所与のより長いポリペプチド配列から取得される断片、例えば、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０または少なくとも１５０個の連続残基の断片の長さにわたって測定されてもよい。このような長さは単なる例示であり、本明細書、表、図、または配列表に示される配列によって支持される任意の断片長を用いて、パーセント同一性を測定することができる長さについて説明してもよいことが理解される。

「ベクター」は、核酸分子であり、好ましくは、宿主細胞内におよび／または宿主細胞間に挿入された核酸分子を伝達する適切な宿主内で自己複製する。この用語は、主に細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡの挿入のために機能するベクター、主にＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために機能するベクターの複製、ならびにＤＮＡもしくはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。上記の機能の２つ以上を提供するベクターも含まれる。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入される場合、ポリペプチド（複数可）に転写および翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」は、通常、所望の発現産物を生じるように機能することができる発現ベクターで構成される適切な宿主細胞を暗示する。

ポリペプチドに適用される「分解抵抗」は、典型的には血清または血漿中、またはタンパク質の貯蔵または送達ビヒクルとして意図される製剤内のプロテアーゼを伴う、血液またはその成分の劣化に耐えるポリペプチドの能力を指す。分解耐性は、典型的には日の範囲（例えば、０.２５、０.５、１、２、４、８、１６日）の間、−８０℃、−２０℃、０℃、４℃、２５℃、および３７℃などの特定の温度で、ヒト（もしくは必要に応じて、マウス、ラット、サル）の血液、血清、血漿、または製剤とタンパク質を組み合わせることによって測定することができる。次いで、試料中のインタクトなタンパク質を、標準的なタンパク質定量法を用いて測定する。タンパク質の５０％が分解される時点は、タンパク質の「分解半減期」である。

「半減期」という用語は、典型的には、薬物の血漿濃度を半分に減少させるのに必要な時間を指す。「半減期」、「ｔ_１／２」、「消失半減期」および「循環半減期」という用語は、本明細書において互換的に使用される。

「流体力学半径」は、拡散の特性から計算される溶液中での分子の見かけの半径（ｎｍ単位のＲ_ｈ）である。タンパク質の「流体力学半径」は、水溶液中での拡散速度ならびに高分子ゲル中を移動する能力に影響を与える。タンパク質の流体力学半径は、その分子量だけでなく、形状および緊密さを含むその構造、ならびにその水和状態によって影響を受ける。ＤＬＳおよびサイズ排除クロマトグラフィーなどを用いる流体力学半径を決定するための方法は、当該技術分野において公知である。ほとんどのタンパク質は、タンパク質が最小の流体力学半径を有することができる最もコンパクトな三次元構造である球状構造を有する。いくつかのタンパク質は、ランダムおよびオープン、不定形、または「直鎖状」の構造を採用した結果、同様の分子量の典型的な球状タンパク質と比べてはるかに大きな流体力学半径を有する。

「生理的条件」は、生きている宿主における条件のセットならびに生体のそれらの条件を模倣する温度、塩濃度、ｐＨを含むインビトロ条件下を指す。インビトロアッセイにおける使用のための生理学的に関連する条件の宿主が確立されている。一般的に、生理的緩衝液は、塩の生理的濃度を含有し、約６.５〜約７.８、好ましくは約７.０〜約７.５の範囲の中性ｐＨに調整される。様々な生理的緩衝液がＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されている。生理学的に関連する温度は、約２５℃〜約３８℃、好ましくは約３５℃〜約３７℃の範囲である。

「制御放出剤」、「徐放剤」、「デポー製剤」または「徐放剤」は、ポリペプチドが薬剤の非存在下で投与される時の放出の持続時間と比べて、本発明のポリペプチドの放出の持続時間を延長することができる薬剤を指すために互換的に使用される。本発明の別の実施形態は、異なる放出速度を有し、異なる治療量をもたらしてもよい。

本明細書で使用される「アンタゴニスト」という用語は、本明細書に開示される天然ポリペプチドの生物活性を部分的にまたは完全に阻止、阻害、または中和する任意の分子を含む。ポリペプチドのアンタゴニストを同定するための方法は、候補アンタゴニスト分子と天然ポリペプチドとを接触させること、および通常は天然ポリペプチドと関連する１以上の生物活性の検出可能な変化を測定することを含み得る。本発明の文脈において、アンタゴニストは、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体または活性タンパク質の効果を減少させる任意の他の分子を含むことができる。

「アゴニスト」という用語は、最も広い意味で使用され、本明細書に開示される天然ポリペプチドの生物活性を模倣する任意の分子を含む。適切なアゴニスト分子には、特に、アゴニスト抗体もしくは抗体断片、天然のポリペプチド、ペプチド、小有機分子などの断片またはアミノ酸配列変異体を含む。天然ポリペプチドのアゴニストを同定するための方法は、候補アゴニスト分子と天然ポリペプチドとを接触させること、および通常は天然のポリペプチドに関連する１以上の生物活性における検出可能な変化を測定することを含み得る。

本明細書における目的のための「活性」は、対応する天然活性タンパク質のそれと一致する融合タンパク質の成分の作用または効果を指し、「生物学的活性」または「生物活性」は、受容体結合、アンタゴニスト活性、アゴニスト活性、または細胞応答もしくは生理学的応答を含むがこれらに限定されないインビトロもしくはインビボでの生物学的機能または作用を指す。

本明細書で使用する「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」もしくは「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「緩和」もしくは「寛解」は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、治療上の利点および／または予防上の利点を含むがこれらに限定されない有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療上の利点とは、治療される基礎疾患の根絶または改善を意味する。また、対象において改善が観察されるが、対象はまだその基礎疾患を患っている可能性があるように、基礎疾患に関連する生理学的症状のうちの１以上の根絶または改善により、治療上の利点が達成される。予防上の利点のために、特定の疾患を発症するリスクのある対象、またはその疾患の診断がなされていなくても、疾患の生理学的症状のうちの１以上を報告する対象に、本組成物を投与することができる。

本明細書で使用する「治療効果」は、活性タンパク質が保持する抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の、本発明の融合タンパク質によって引き起こされるヒトもしくは他の動物における疾患の治療、緩和、緩解、もしくは予防を含むがこれらに限定されない生理学的効果、またはそうでなければ、ヒトもしくは動物の身体的もしくは精神的幸福を増強する生理学的効果を指す。治療有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。

本明細書で使用する「治療有効量」および「治療有効用量」という用語は、対象に単回用量または反復用量で投与した場合に、疾患状態もしくは病状の任意の症状、態様、測定されるパラメータまたは特性に対する任意の検出可能で、有益な効果を有することが可能である、単独でのまたは融合タンパク質組成物の一部としての活性タンパク質の量を指す。このような効果は、有益であることが絶対的である必要はない。

本明細書で使用する「治療的に有効な投与計画」という用語は、単独でのまたは融合タンパク質組成物の一部としての活性タンパク質の連続投与される用量のためのスケジュールを指し、この用量は、疾患状態もしくは病状の任意の症状、態様、測定されるパラメータまたは特性に対して持続した有益な効果をもたらすために治療有効量で与えられる。

融合タンパク質
様々な態様において、本発明は、活性タンパク質に連結されたムチンドメインポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。このようなタンパク質は、「ムチン化（ｍｕｃｉｎｙｌａｔｅｄ）」されたタンパク質とも呼ばれる。本明細書で使用する本発明の「融合タンパク質」は、活性タンパク質に連結されたムチンドメインポリペプチドを含む。一実施形態において、ムチンドメインポリペプチドおよび活性タンパク質は、通常、個々のタンパク質中に存在し、融合タンパク質と結合されるか、またはそれらは、通常同じタンパク質中に存在し得るが、融合タンパク質では新しい配置に置かれる。本発明の組成物および方法は、ムチンドメインポリペプチドと融合した場合に、活性タンパク質の半減期などの薬物動態学的特性を増強するのに特に有用である。一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ムチンドメインポリペプチドに結合していない対応する活性タンパク質の生物活性および／または治療活性の全てまたは一部を保持する。一実施形態において、本発明の融合タンパク質を形成するためにムチンドメインポリペプチドと融合すると、活性タンパク質の治療活性／生物活性が向上する。

一実施形態において、本発明による融合タンパク質は、免疫グロブリン分子またはＦｃドメインを含む任意の分子、またはそれらの任意の断片を特異的に排除する。一実施形態において、融合タンパク質またはその任意の部分は、α１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼまたはβ１，６−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼによってグリコシル化されない。一実施形態において、融合タンパク質は、αＧａｌに特異的な抗体に結合しない。一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、Ｇａｌ α１，３Ｇａｌ特異的な抗体に結合しない。

ムチンタンパク質およびタンパク質のムチンドメインは、ムチンタンパク質およびムチンドメインを含む他のポリペプチドが硬直したランダムコイルとして動作することを構造的に可能にする高度なグリコシル化を含む。高度にグリコシル化されたムチンドメインを構成する親水性の分枝状親水性炭水化物と組み合わせた、この硬直したランダムコイル構造は、発現タンパク質の分子量に基づいて予想されるものを超える活性タンパク質の流体力学半径を増加させるのに特に有用である。また、高レベルのグリコシル化にとって、ムチンドメインの付加は、活性タンパク質の濃縮溶液の電荷、溶解性および粘弾性特性などのタンパク質の物理化学的特性を変更する可能性も有する。本発明のムチン化された融合タンパク質は、タンパク質の半減期を延長するための従来の戦略を上回るいくつかの利点を有する。本発明の融合タンパク質は、さらなるコンジュゲーションおよび精製ステップを必要としない標準的な発現手段を介して生成することができる。ムチンドメインポリペプチドは、活性タンパク質のＮ−末端またはＣ−末端のいずれかを介して活性タンパク質に連結することができる。ムチンドメインポリペプチドは、容積が減少し、生物活性に対して大した影響を与えない単量体の非球状タンパク質であるという点で他の融合パートナーよりも構造的に制限がない。ムチンドメインの使用は、Ｆｃエフェクター機能などの内因性生物活性のリスクを低下させる。ヒト治療薬を調製するために使用する場合、本発明の融合タンパク質は、免疫原性のリスクを減らすために高いグリコシル化を有する完全なヒト配列を含むことができる。

結果として生じる機能的特性または生物活性および薬理学的活性ならびにパラメータを含む本発明の融合タンパク質組成物の活性は、所望の特性を測定するための、当技術分野で公知の任意の適切なスクリーニングアッセイによって決定することができる。融合タンパク質の活性および構造は、本発明の組成物の半減期、溶解度、構造および生物活性の保持ならびに本発明の融合タンパク質ではない活性タンパク質との比較を確定するために、本明細書に記載のアッセイ、実施例のアッセイによって、または当技術分野で公知の方法によって測定することができる。

融合タンパク質に言及する場合、「連結された」または「融合された」もしくは「融合」という用語は、ムチンドメインポリペプチドおよび活性タンパク質が、ムチンドメインポリペプチドのＯ−結合グリコシル化を可能にし、活性タンパク質の活性を維持する方法で、細胞内で単一ポリペプチドとして発現することを示すものと意図される。一実施形態において、ムチンドメインポリペプチドは、必要に応じて、アミノ酸リンカーを介して活性タンパク質に連結することができる。アミノ酸リンカーは、さらに必要に応じて、対象への融合タンパク質の投与に際して活性タンパク質を放出するように設計され得る切断配列を含んでもよい。

必要に応じて、ムチンドメインポリペプチドに融合された活性タンパク質を含む融合タンパク質は、さらに、活性を増強するか、または融合タンパク質にさらなる活性を付与することが意図される１以上の追加の部分に融合されてもよい。一実施形態において、この融合タンパク質は、構造：Ａ−Ｍ−Ｂを含み、式中、ＡはＮ末端融合パートナーであり、Ｍはムチンドメインであり、Ｂは、Ｃ末端融合パートナーである。ＡおよびＢは、類似しているおよび異なるアイデンティティを含んでもよい。この実施形態の一態様において、ＡおよびＢは、アゴニズム、アンタゴニズム、酵素活性、特異的なタンパク質もしくは細胞への標的化、化学反応性、またはオリゴマー化を含むがこれらに限定されない方法で、独立してまたは相乗的に作用することができる生物活性のある部分である。別の態様において、ＡおよびＢが同じである場合、活性の増強は、結合活性を介して促進される。

本発明の融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、従来の技術に従って、例えば、ライゲーションのための平滑末端またはシグザグ末端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ ｔｅｒｍｉｎｉ）、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて付着末端の補充、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーションによってインフレームで共に連結される。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を、２つの連続した遺伝子断片の間に相補的オーバーハングをもたらすアンカープライマーを用いて行い、その後、アニールおよび再増幅を行って、キメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ.（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２参照）。融合部分を補助するための多くの発現ベクターは、市販されており、以下でより詳細に説明される。

ムチンドメインポリペプチド
「ムチンドメインポリペプチド」は、「ムチンドメイン」を含む任意のタンパク質として本明細書で定義される。ムチンドメインは、潜在的なグリコシル化部位が豊富であり、ムチンドメイン内のアミノ酸の４０％以上を示し得るセリンおよび／またはスレオニンならびにプロリンの含有量が高い。ムチンドメインは、主にＯ−結合型グリカンで高度にグリコシル化されている。ムチンドメインポリペプチドは、グリカンによってその質量の少なくとも約６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を有する。ムチンドメインの長さは、各タンデムリピート単位当たり約８個のアミノ酸〜１５０個のアミノ酸で変化し得るタンデムアミノ酸リピート単位（本明細書ではＴＲとも呼ぶ）を含むことができる。タンデムリピート単位の数は、本発明のムチンドメインポリペプチドにおいて１〜２５個の間で変化し得る。

本発明のムチンドメインポリペプチドは、ムチンタンパク質を含むが、これらに限定されない。「その一部」は、ムチンポリペプチドリンカーが、ムチンタンパク質の少なくとも１つのムチンドメインを含むことを意味する。ムチンタンパク質は、ＭＵＣ遺伝子（すなわち、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３Ａ、ＭＵＣ３Ｂ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７、ＭＵＣ８、ＭＵＣ９、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１５、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ１９、ＭＵＣ２０、ＭＵＣ２１）によってコードされる任意のタンパク質を含む。ムチンタンパク質のムチンドメインは、典型的には、非反復アミノ酸領域のいずれかの側に隣接している。ムチンドメインポリペプチドは、ムチンタンパク質の細胞外部分、ムチンタンパク質のシグナル配列部分、ムチンタンパク質の膜貫通ドメイン、および／またはムチンタンパク質の細胞質ドメインを含むムチンタンパク質（例えば、ＭＵＣ２０）の全てまたは一部を含んでもよい。ムチンドメインポリペプチドは、可溶性ムチンタンパク質の全てまたは一部を含むことができる。好ましくは、ムチンドメインポリペプチドは、ムチンタンパク質の細胞外部分を含む。

ムチンドメインポリペプチドはまた、ムチンドメインを含むタンパク質の全てまたは一部も含むことができるが、それはＭＵＣ遺伝子によってコードされていない。ＭＵＣ遺伝子はコードしないが、ムチンドメインを含むこのような天然タンパク質には、膜貫通免疫グロブリンおよびムチンドメイン（ＴＩＭ）ファミリータンパク質、フラクタルカイン（ニューロタクチン）、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１、ＣＤ１６２）、Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＣＤ３４、ＣＤ４３（ロイコシアリン、シアロホリン（ｓｉａｌｏｐｈｏｒｉｎ））、ＣＤ４５、ＣＤ６８、ＣＤ９６、ＣＤ１６４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭＡｄＣＡＭ、赤血球グリコホリン、グリコカリシン、グリコホリン、ＬＤＬ−Ｒ、ＺＰ３、エンドシアリン、崩壊促進因子（ｄａｆ、ＣＤ５５）、ポドカリキシン、エンドグリカン、α−ジストログリカン、ニューロファスチン、ＥＭＲ１、ＥＭＲ２、ＥＭＲ３、ＥＭＲ４、ＥＴＬおよびエピグリカニンなどの膜アンカータンパク質が含まれるが、これらに限定されない。

ムチンドメインポリペプチドはまた、その用語が本明細書で定義されるようなムチンドメインを有する非天然ポリペプチドを含んでもよい。一実施形態において、ムチンドメインポリペプチドは、本発明に従ってムチンドメインを含むように新規に設計される。

一実施形態において、ムチンドメインポリペプチドは、Ｐｒｏ、ＳｅｒおよびＴｈｒに富むアミノ酸のタンデムリピートドメインを含む。この実施形態の一態様において、本発明のムチンドメインポリペプチド内のタンデムリピート単位数は、１〜２５個である。好ましくは、ムチンドメインポリペプチド内のタンデムリピート単位数は、２〜２０個である。より好ましくは、ムチンドメインポリペプチド内のタンデムリピート単位数は、少なくとも約４個である。この実施形態のさらなる態様において、本発明のムチンドメインポリペプチド内のセリンおよび／またはスレオニンならびにプロリン残基の割合は、少なくとも１０％である。好ましくは、本発明のムチンドメインポリペプチド内のセリンおよび／またはスレオニンならびにプロリン残基の割合は、少なくとも２０％である。より好ましくは、本発明のムチンドメインポリペプチド内のセリンおよび／またはスレオニンならびにプロリン残基の割合は、３０％を超える。この実施形態の最後の態様において、ムチンドメイン内の各タンデムアミノ酸リピート単位は、少なくとも８個のアミノ酸で構成されている。好ましくは、各単位は、少なくとも１６個のアミノ酸で構成されている。より好ましくは、各単位は、少なくとも１９個のアミノ酸で構成され、各単位の長さは、約１９個のアミノ酸〜１５０個のアミノ酸で変化してもよい。

一実施形態において、ムチンドメインポリペプチドは、少なくとも４０％のセリン、スレオニン、およびプロリンを含む少なくとも３２個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本発明によるムチンドメインポリペプチドは、タンデムリピート単位当たり少なくとも８個のアミノ酸長のタンデムリピートアミノ酸単位を少なくとも２、４、８、１０または１２個を含む。タンデムリピート単位の好ましいアミノ酸配列には、表Ｉのものが含まれるが、これらに限定されない。ムチンドメインポリペプチド、および／またはムチンドメインポリペプチドをコードする核酸は、当該技術分野で公知であり、ＧｅｎＢａｎｋなどの供給源から公的に入手可能であるタンパク質のムチンドメインコード配列を用いて構築されてもよい。

ＭＵＣ８およびＭＵＣ９は削除する；信頼できるデータなし。
ＰＴＳ→ プロリン／セリン／スレオニンに富む配列。
＊ → 概算；ＴＲ数は、ほとんどの場合の範囲として報告する。
＋ → Ｕｎｉｐｒｏｔ番号
∞ →ＴＲの数は特定の領域で異なる。
ＮＡ → 公表せず。

一実施形態において、ムチンドメインポリペプチドの全長配列は３２〜２００である。半減期の延長は、流体力学半径、および最も重要なことだが、腎臓ろ過の迂回を可能にする約６０ｋＤを超える見かけの分子量の増大と相関するので、ムチンドメインポリペプチドの長さは、活性部分のサイズに多少依存する。例えば、５ｋＤ未満の分子量のペプチドは、所望の半減期の延長を達成するために、２００個のアミノ酸のムチンドメインポリペプチドを必要とし得る。対照的に、４０ｋＤの分子量のタンパク質は、所望の半減期を達成するために、３２個のアミノ酸のムチンドメインポリペプチドのみを必要とし得る。さらに、ムチン化は、融合タンパク質のムチンドメインペプチドにおけるムチンタンデムリピート数を増加または減少させることによって半減期の最適化を可能にする。

あるいは、ムチンドメインポリペプチド部分は、野生型タンパク質の天然ムチンドメイン配列に変異を有する変異型ムチンドメインポリペプチドとして提供される。例えば、変異型ムチンドメインポリペプチドは、野生型ムチンドメインポリペプチドと比較して、追加のＯ−結合型グリコシル化部位を含む。あるいは、変異型ムチンドメインポリペプチドは、野生型ムチンドメインポリペプチドと比較して、セリン、スレオニン、またはプロリン残基の数の増加をもたらすアミノ酸配列の変異を含む。あるいは、変異型ムチンドメインポリペプチド配列は、特定のｐＨにおけるｐＩまたは分子の電荷を変更するアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、およびアルギニンを含むがこれらに限定されない、追加されるかまたは差し引かれた荷電残基を含む。

活性タンパク質および治療活性タンパク質
本明細書で使用され、本発明の融合タンパク質に含まれる「活性タンパク質」とは、生物学的、治療的、予防的、もしくは診断的な関心または機能のタンパク質を意味し、かつ／または生物活性を媒介することができる。この用語が本明細書で使用されるとおり、「治療活性タンパク質」は、対象に投与した場合に、疾患、障害もしくは病状を予防または改善することができるタンパク質である。

一実施形態において、本発明による活性タンパク質または治療活性タンパク質は、具体的には、Ｆｃドメインを含む免疫グロブリン分子またはそれらの任意の断片を排除する。

特に興味深いのは、薬物動態学的パラメータの増加、溶解性の増加、安定性の増加、もしくはいくつかの他の強化された薬学的特性が求められる活性タンパク質および治療活性タンパク質であるか、あるいは半減期の延長が、有効性、安全性を向上させるかまたは投与頻度の減少および／もしくは患者のコンプライアンスの向上をもたらす活性タンパク質である。したがって、本発明の融合タンパク質は、ムチンドメインポリペプチドに連結されていない活性タンパク質と比較して、治療活性タンパク質の治療効力を向上させること、例えば、対象に投与された場合に、インビボ曝露または本発明の融合タンパク質が治療枠内に留まる時間の長さを増加させることを含むことを考慮して、様々な目的で調製される。

一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、（以下でより完全に説明するように）ムチンドメインポリペプチドに連結された単一活性タンパク質を含むことができる。別の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、１以上のムチンドメインポリペプチドを介して連結された２種類の活性タンパク質を含む融合タンパク質をもたらす第１の活性タンパク質および同じ活性タンパク質の第２の分子を含むことができる。別の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、１以上のムチンドメインポリペプチドを介して連結され、異なる活性を有する２種類の活性タンパク質を含む融合タンパク質をもたらす第１活性タンパク質および第２の異なる活性タンパク質を含むことができる。

一実施形態において、活性タンパク質は、インビボで使用されるか、またはインビトロアッセイで利用される場合に、所与の標的または別の所望の生物学的特性に対して結合特異性を示す。例えば、活性タンパク質は、アゴニスト、受容体、リガンド、アンタゴニスト、酵素、またはホルモンであり得る。特に興味深いのは、疾患または障害のために使用されるかまたは疾患または障害に有用であることが知られている活性タンパク質であり、その際、半減期の延長は投与頻度の減少または薬理学的効果の増強を可能にする。最小有効用量または血中濃度（Ｃ_ｍｉｎ）と最大耐用量または血中濃度（Ｃ_ｍａｘ）との間の狭い治療枠を有する活性タンパク質も興味深い。このような場合には、ムチンドメインポリペプチドを含む融合タンパク質に活性タンパク質を結合させると、ムチンドメインポリペプチドに連結されていない活性タンパク質と比較して、それらの特性が向上し、治療薬または予防薬としてより有用なものにさせることができる。

治療活性タンパク質である本発明の活性タンパク質は、グルコースおよびインスリン障害、代謝障害、心臓血管疾患、血液凝固／出血性障害、成長の障害もしくは病状、腫瘍化の状態、炎症状態、自己免疫状態、ならびに他の疾患および疾患カテゴリーを含むがこれらに限定されず、ムチンドメインポリペプチドに結合していない治療用タンパク質もしくはペプチドが準最適な半減期を示すか、または治療用タンパク質もしくはペプチドが存在しない様々な治療カテゴリーまたは疾患カテゴリーの治療に有用性を有し得る。

本発明の活性タンパク質は、天然の全長タンパク質であり得るか、または天然の活性タンパク質の治療活性の少なくとも一部を保持している活性タンパク質の断片もしくは配列変異体であり得る。一実施形態において、本発明による活性タンパク質は、天然に見出されるタンパク質に対応する配列を有する組換えポリペプチドであり得る。別の実施形態において、この活性タンパク質は、天然の活性タンパク質の生物活性の少なくとも一部を保持する天然の配列の配列変異体、断片、ホモログ、および模倣物であり得る。

非限定的な実施例において、活性タンパク質は、天然の活性タンパク質もしくは天然の活性タンパク質の変異体と少なくとも約８０％の配列同一性、または８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示す配列であり得る。このようなタンパク質およびペプチドには、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：（ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、オキシトシン、オピエートペプチドなどの）生物活性ペプチド、サイトカイン、成長因子、ケモカイン、リンホカイン、リガンド、受容体、ホルモン、酵素、抗体および抗体断片、ドメイン抗体、ナノボディ、一本鎖抗体、ＤＡＲＰｉｎ、センチリン（ｃｅｎｔｙｒｉｎ）、アドネクチンなどの改変抗体の「代替骨格（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ）」、ならびに成長因子。受容体の例としては、ＴＮＦＲ２、ＶＥＧＦ受容体、ＩＬ−１Ｒ１、ＩＬ−１ＲＡｃＰ、ＩＬ−４受容体、ｈＧＨ受容体、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＩＬ−６Ｒα、ＦＧＦ受容体などの）膜結合受容体の細胞外ドメイン、それらの膜貫通ドメインから切断された可溶性受容体、（ＩＬ−１ＲＩＩ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＤｃＲ３などの）「ダミー」もしくは「デコイ」受容体、および任意の化学的または遺伝的に修飾された可溶性受容体が挙げられる。酵素の例としては、活性化プロテインＣ、第ＶＩＩ因子、コラゲナーゼ、アガルシダーゼベータ、ドルナーゼα、アルテプラーゼ、ペグ化アスパラギナーゼ、アスパラギナーゼおよびイミグルセラーゼが挙げられる。特定のポリペプチドまたはタンパク質の例としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターフェロンガンマ誘導因子Ｉ（ＩＧＩＦ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｐｒｅｓｕｍａｂｌｙ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、マクロファージ炎症性タンパク質（例えば、ＭＩＰ−１−αおよびΜΙΡ−１−β、リーシュマニア伸長開始因子（ＬＥＩＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、成長因子、例えば、表皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−２（ＮＴ−２）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、ニューロトロフィン−５（ＮＴ−５）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＴＮＦタイプＩＩ受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリンおよび可溶性糖タンパク質、例えば、ｇｐ１２０およびｇｐ１６０糖タンパク質が挙げられる。ｇｐ１２０糖タンパク質は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープタンパク質であり、ｇｐ１６０糖タンパク質はｇｐ１２０糖タンパク質に対する既知の前駆体である。

一実施形態において、生物活性ポリペプチドはＧＬＰ−１である。別の実施形態において、生物活性ポリペプチドは、ネシリチド、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ｈＢＮＰ）である。さらに別の実施形態において、生物活性ポリペプチドは、２７個のアミノ酸からなる天然のブタセクレチンと同一のアミノ酸配列で構成されたペプチドホルモンであるセクレチンである。一実施形態において、生物活性ポリペプチドは、ＣＤ４＋細胞とＨＩＶ−１の融合物の阻害剤である、３６個のアミノ酸の一本鎖合成ポリペプチドのエンフビルチドである。一実施形態において、生物活性ポリペプチドは、特異的で、可逆的な直接トロンビン阻害剤のビバリルジンである。抗血友病因子（ＡＨＦ）は、活性ポリペプチドとして選択されてもよい。ＨＥＭＯＦＩＬ Ｍ（商標）ＡＨＦの生体内半減期の平均値は１４.７±５.１時間（ｎ＝６１）であることが知られている。別の実施形態において、エリスロポエチンは、生物活性ポリペプチドである。エリスロポエチンは、組換えＤＮＡ技術によって製造される１６５個のアミノ酸の糖タンパク質であり、内因性エリスロポエチンと同じ生物学的効果を有する。慢性腎不全の成人および小児患者では、静脈内投与後の未修飾血漿エリスロポエチンの排出半減期は、４〜１３時間の範囲であることが知られている。さらに別の実施形態において、生物活性ポリペプチドはレテプラーゼある。レテプラーゼは、クリングル２およびヒトｔＰＡのプロテアーゼドメインを含む組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）の非グリコシル化欠失変異タンパク質である。血栓溶解活性の測定に基づいて、未修飾レテプラーゼの有効半減期は、約１５分であることが知られている。

好ましい一実施形態において、活性ポリペプチドは、組換え型のヒトインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−ＩＲａ）の非グリコシル化形態のアナキンラまたは哺乳類細胞で発現させたグリコシル化形態である。一例において、アナキンラは、１５３個のアミノ酸からなり、１７.３キロダルトンの分子量を有する。アナキンラは、大腸菌細菌発現系を用いて組換えＤＮＡ技術によって生成することができる。ＩＬ−ＩＲａのグリコシル化バージョンは、哺乳類発現系で生成することができる。未修飾アナキンラのインビボ半減期は、４〜６時間の範囲であることが知られている。

別の好ましい実施形態において、活性ポリペプチドは、エキセンジン−４である。一例において、エキセンジン−４は３９個のアミノ酸からなる。エキセンジン−４は、大腸菌細菌発現系を用いた組換えＤＮＡ技術によって生成することができる。未修飾エキセンジン−４のインビボ半減期は、０.５時間ｉｖであることが知られている（Ａｉ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．；Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｅｘｅｎｄｉｎ−４ ｉｎ Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；１７（２００８）６−１０）。

ベカプレルミンはまた、活性ポリペプチドとして選択されてもよい。ベカプレルミンは、局所投与用の組換えヒト血小板由来成長因子（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）である。ベカプレルミンは、酵母株サッカロマイセス・セレビシエに血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のＢ鎖の遺伝子を挿入することにより、組換えＤＮＡ技術によって生成することができる。ベカプレルミンの一形態は、約２５ｋＤの分子量を有し、ジスルフィド結合により共に結合されている２つの同一ポリペプチド鎖で構成されたホモ二量体である。活性ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）内で生成されるインターロイキン１１（ＩＬ−１１）の組換え形態であるオプレルベキンで有り得る。一実施形態において、選択された生物活性ポリペプチドは、約１９，０００ダルトンの分子量を有し、非グリコシル化型である。このポリペプチドは、長さが１７７個のアミノ酸であり、ネイティブのＩＬ−１１の１７８個のアミノ酸長とは異なり、唯一アミノ末端プロリン残基を欠いており、これはインビトロまたはインビボのいずれかの生物活性における測定可能な差異を生じないことが知られている。未修飾オプレルベキンの終末半減期は約７時間であることが知られている。さらに別の実施形態は、血中グルコースを増加させ、胃腸管の平滑筋を弛緩させるヒトグルカゴンと同一のポリペプチドホルモンのグルカゴンである生物活性ポリペプチドを提供する。グルカゴンは、グルカゴンの遺伝子を添加することによって遺伝子改変された大腸菌の非病原性の特別な実験室株において合成されてもよい。具体的な実施形態において、グルカゴンは、２９個のアミノ酸残基を含み、３，４８３の分子量を有する一本鎖ポリペプチドである。インビボ半減期は、８〜１８分の範囲で、短いことが知られている。

Ｇ−ＣＳＦは、活性ポリペプチドとしても選択され得る。組換え顆粒球コロニー刺激因子、すなわちＧ−ＣＳＦは、白血球の回復を刺激するために様々な化学療法治療後に使用される。組換えＧ−ＣＳＦの報告された半減期はわずか３.５時間である。

一実施形態において、生物活性ポリペプチドは、インターフェロンα（ＩＦＮα）であり得る。化学的にＰＥＧ修飾されたインターフェロンアルファ２ａは、Ｃ型肝炎の治療に対して臨床的に有効である。このＰＥＧ化タンパク質は週１回の注射を必要とし、より長い半減期を有する徐放製剤が望ましい。

さらなる細胞性タンパク質には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＶＥＧＦ−Ｒ３、Ｈｅｒ−１、Ｈｅｒ−２、Ｈｅｒ−３、ＥＧＦ−１、ＥＧＦ−２、ＥＧＦ−３、Ａｌｐｈａ３、ｃＭｅｔ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＦＡ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＩＬ−６、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＯＸ４０、ＩＬ−１ｂ、ＴＡＣＩ、ＩｇＥ、ＢＡＦＦ、またはＢＬｙｓ、ＴＰＯ−Ｒ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＩＬ−１−Ｒ１、ＴＮＦα、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、補体受容体１、ＦＧＦａ、オステオポンチン、ビトロネクチン、エフリンＡ１〜Ａ５、エフリンＢ１〜Ｂ３、α−２−マクログロブリン、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＰＤＧＦ、ＴＧＦｂ、ＧＭＣＳＦ、ＳＣＦ、ｐ４０（ＩＬ１２／ＩＬ２３）、ＩＬ１ｂ、ＩＬ１ａ、ＩＬ１ｒａ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２３、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、Ｆｌｔ３リガンド、４１ＢＢ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、ＫＧＦ、ＦＧＦ−７、ＳＣＦ、ネトリン１、ネトリン２、ＩＦＮａ、ＩＦＮｂ、ＩＦＮｇ、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ１０、ＡＤＡＭＳ１、ＡＤＡＭＳ５、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１５、ＴＳ１、ＴＳ５、アディポネクチン、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ−１、ＡＰＲＩＬ、アネキシンＶ、アンジオゲニン、アンフィレグリン、アンジオポエチン−１、アンジオポエチン−２、アンジオポエチン−４、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂｃｌ−２、ＢＡＣＥ−１、ＢＡＫ、ＢＣＡＭ、ＢＤＮＦ、ｂＮＧＦ、ｂＥＣＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＣＲＰ、カドヘリン−６、カドヘリン−８、カドヘリン−１１、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ、カテプシンＸ、ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＧＰ２ｂ３ａ、ＧＨ受容体、ＲＳＶ Ｆタンパク質、ＩＬ−２３（ｐ４０、ｐ１９）、ＩＬ−１２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ａ４Ｐ１、ａ４１３７、ＴＮＦ／リンフォトキシン、ＩｇＥ、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＢＬＹＳ／ＢＡＦＦ、ＩＬ−２Ｒ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ジゴキシン、Ｒｈｏ（Ｄ）、水痘、肝炎、ＣＭＶ、破傷風、ワクシニア、抗毒素、ボツリヌス、Ｔｒａｉｌ−Ｒ１、Ｔｒａｉｌ−Ｒ２、ｃＭｅｔ、ＴＮＦ−Ｒファミリー、例えば、ＬＡ ＮＧＦ−Ｒ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ９５、リンフォトキシンａ／ｂ受容体、Ｗｓｌ−１、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−Ｒ／ＴＭＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＲＡＩＬＲ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＲＡＩＬＲ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６ ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＲＡＩＬ Ｒ３／ＴＭＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫ Ｌ／ＴＮＦＳＦ１１、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦＳ、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＲＡＩＬ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＲＡＩＬ Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＡＣ１／ＴＦＲＳＦ１３Ｂ、ＮＧＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＲＡＩＬ Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＷＥＡＫＲ／ＴＮＦＲＳＦ１２、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３、ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦＡ１、Ｐｒｏ−ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａ、リンフォトキシンベータＲ／ＴＮＦＲＳＦ３、リンフォトキシンベータＲ（ＬＴｂＲ）／Ｆｃキメラ、ＴＮＦ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦ−ｂｅｔａ／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、ＰＧＲＰ−Ｓ、ＴＮＦ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＥＤＡ−Ａ２、ＴＮＦ−アルファ／ＴＮＦＳＦ１Ａ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＮＦ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ ４ＥＢＰ１、１４−３−３ゼータ、５３ＢＰ１、２Ｂ４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＣＬ２１／６Ｃｋｉｎｅ、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、８Ｄ６Ａ、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９，８−オキソ−ｄＧ、４−アミノ−１，８−ナフタルイミド、Ａ２Ｂ５、アミノペプチダーゼＬＲＡＰ／ＥＲＡＰ２、Ａ３３、アミノペプチダーゼ Ｎ／ＡＮＰＥＰ、Ａａｇ、アミノペプチダーゼＰ２／ＸＰＮＰＥＰ２、ＡＢＣＧ２、アミノペプチダーゼＰ１／ＸＰＮＰＥＰ１、ＡＣＥ、アミノペプチダーゼＰＩＬＳ／ＡＲＴＳ１、ＡＣＥ−２、アムニオンレス（Ａｍｎｉｏｎｌｅｓｓ）、アクチン、アンフィレグリン、ベータアクチン、ＡＭＰＫアルファ１／２、アクチビンＡ、ＡＭＰＫアルファ１、アクチビンＡＢ、ＡＭＰＫアルファ２、アクチビンＢ、ＡＭＰＫベータ１、アクチビンＣ、ＡＭＰＫベータ２、アクチビンＲＩＡ／ＡＬＫ−２、アンドロゲンＲ／ＮＲ３Ｃ４、アクチビンＲＩＢ／ＡＬＫ−４、アンジオゲニン、アクチビンＲＩＩＡ、アンジオポエチン−１、アクチビンＲＩＩＢ、アンジオポエチン−２、ＡＤＡＭＳ、アンジオポエチン−３、ＡＤＡＭ９、アンジオポエチン−４、ＡＤＡＭ１０、アンジオポエチン様１、ＡＤＡＭ１２、アンジオポエチン様２、ＡＤＡＭ１５、アンジオポエチン様３、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７、アンジオポエチン様４、ＡＤＡＭ１９、アンジオポエチン様７／ＣＤＴ６、ＡＤＡＭ３３、アンジオスタチン、ＡＤＡＭＴＳ４、アネキシンＡ１／アネキシンＩ、ＡＤＡＭＴＳＳ、アネキシンＡ７、ＡＤＡＭＴＳ１、アネキシンＡ１０、ＡＤＡＭＴＳＬ−１／プンクチン（Ｐｕｎｃｔｉｎ）、アネキシンＶ、アディポネクチン／Ａｃｒｐ３０、ＡＮＰ、ＡＥＢＳＦ、ＡＰサイト、アグレカン、ＡＰＡＦ−１、アグリン、ＡＰＣ、ＡｇＲＰ、ＡＰＥ、ＡＧＴＲ−２、ＡＰＴ、ＡＩＦ、ＡＰＬＰ−１、Ａｋｔ、ＡＰＬＰ−２、Ａｋｔ１、アポリポタンパク質ＡI、Ａｋｔ２、アポリポタンパク質Ｂ、Ａｋｔ３、ＡＰＰ、血清アルブミン、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＡＬＣＡＭ、ＡＲＣ、ＡＬＫ−１、アルテミン、ＡＬＫ−７、アリールスルファターゼＡ／ＡＲＳＡ、アルカリホスファターゼ、ＡＳＡＨ２／Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ−２、アルファ２ｕ−グロブリン、ＡＳＣ、アルファ１−酸性糖タンパク質、ＡＳＧＲ１、アルファフェトプロテイン、ＡＳＫ１、ＡＬＳ、ＡＴＭ、アメロブラスチン、ＡＴＲＩＰ、ＡＭＩＣＡ／ＪＡＭＬ、オーロラＡ、ＡＭＩＧＯ、オーロラＢ、ＡＭＩＧＯ２、アキシン−１、ＡＭＩＧＯ３、Ａｘ１、アミノアシラーゼ／ＡＣＹ１、アズロシジン／ＣＡＰ３７／ＨＢＰ、アミノペプチダーゼＡ／ＥＮＰＥＰ、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＢＩＭ、Ｂ７−１／ＣＤ８０、６−ビオチン−１７−ＮＡＤ、Ｂ７−２／ＣＤ８６、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＸＣＬ１３／ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、Ｂ７−Ｈ２、ＢＬＩＭＰ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂｌｋ、Ｂ７−Ｈ４、ＢＭＩ−１、ＢＡＣＥ−１、ＢＭＰ−１／ＰＣＰ、ＢＡＣＥ−２、ＢＭＰ−２、Ｂａｄ、ＢＭＰ−３、ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＭＰ−３ｂ／ＧＤＦ−１０、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＢＭＰ−４、Ｂａｇ−１、ＢＭＰ−５、ＢＡＫ、ＢＭＰ−６、ＢＡＭＢＩ／ＮＭＡ、ＢＭＰ−７、ＢＡＲＤ１、ＢＭＰ−８、Ｂａｘ、ＢＭＰ−９、ＢＣＡＭ、ＢＭＰ−１０、Ｂｃｌ−１０、ＢＭＰ−１５／ＧＤＦ−９Ｂ、Ｂｃｌ−２、ＢＭＰＲ−ＩＡ／ＡＬＫ−３、Ｂｃｌ−２関連タンパク質Ａｌ、ＢＭＰＲ−ＩＢ／ＡＬＫ−６、Ｂｃｌ−ｗ、ＢＭＰＲ−ＩＩ、Ｂｃｌ−ｘ、ＢＮＩＰ３Ｌ、Ｂｃｌ−ｘＬ、ＢＯＣ、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＢＯＫ、ＢＤＮＦ、ＢＰＤＥ、ベンズアミド、ブラキュリー（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）、共通β鎖、Ｂ−Ｒａｆ、ベータＩＧ−Ｈ３、ＣＸＣＬ１４／ＢＲＡＫ、ベタセルリン、ＢＲＣＡ１、ベータ−デフェンシン２、ＢＲＣＡ２、ＢＩＤ、ＢＴＬＡ、バイグリカン、Ｂｕｂ−１、Ｂｉｋ様キラータンパク質、ｃ−ｊｕｎ、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ｃ−Ｒｅｌ、ＣＤ９４、ＣＣＬ６／Ｃ１０、ＣＤ９７、Ｃｌｑ Ｒ１／ＣＤ９３、ＣＤ１５１、Ｃ１ｑＴＮＦ１、ＣＤ１６０、ＣｌｑＴＮＦ４、ＣＤ１６３、ＣｌｑＴＮＦ５、ＣＤ１６４、補体成分Ｃ１ｒ、ＣＤ２００、補体成分Ｃ１ｓ、ＣＤ２００Ｒ１、補体成分Ｃ２、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、補体成分Ｃ３ａ、ＣＤ２３／ＦｃイプシロンＲＩＩ、補体成分Ｃ３ｄ、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、補体成分ＣＳａ、ＣＤＳＬ、カドヘリン−４／Ｒ−カドヘリン、ＣＤ６９、カドヘリン−６、ＣＤＣ２、カドヘリン−８、ＣＤＣ２５Ａ、カドヘリン−１１、ＣＤＣ２５Ｂ、カドヘリン−１２、ＣＤＣＰ１、カドヘリン−１３、ＣＤＯ、カドヘリン−１７、ＣＤＸ４、Ｅ−カドヘリン、ＣＥＡＣＡＭ−１／ＣＤ６６ａ、Ｎ−カドヘリン、ＣＥＡＣＡＭ−６、Ｐ−カドヘリン、ケルベロス−１、ＶＥ−カドヘリン、ＣＦＴＲ、カルビンジンＤ、ｃＧＭＰ、カルシニューリンＡ、Ｃｈｅｍ Ｒ２３、カルシニューリンＢ、ケマリン、カルレティキュリン−２、ケモカインサンプラーパック、ＣａＭキナーゼＩＩ、キチナーゼ３様１、ｃＡＭＰ、キトトリオシダーゼ／ＣＨＩＴ１、カンナビノイドＲ１、Ｃｈｋ１、カンナビノイドＲ２／ＣＢ２／ＣＮＲ２、Ｃｈｋ２、ＣＡＲ／ＮＲ１１３、ＣＨＬ−１／Ｌ１ＣＡＭ−２、炭酸脱水酵素Ｉ、コリンアセチルトランスフェラーゼ／ＣｈＡＴ、炭酸脱水酵素ＩＩ、コンドロレクチン、炭酸脱水酵素ＩＩＩ、コーディン、炭酸脱水酵素ＩＶ、コーディン様１、炭酸脱水酵素Ｖａ、コーディン様２、炭酸脱水酵素ＶＢ、ＣＩＮＣ−１、炭酸脱水酵素ＶＩ、ＣＩＮＣ−２、炭酸脱水酵素ＶＩＩ、ＣＩＮＣ−３、炭酸脱水酵素ＶＩＩＩ、クラスピン、炭酸脱水酵素ＩＸ、クローディン６、炭酸脱水酵素Ｘ、ＣＬＣ、炭酸脱水酵素ＸＩＩ、ＣＬＥＣ−１、炭酸脱水酵素ＸＩＩＩ、ＣＬＥＣ−２、炭酸脱水酵素ＸＩＶ、ＣＬＥＣＳＦ１３／ＣＬＥＣ４Ｆ、カルボキシメチルリジン、ＣＬＥＣＳＦ８、カルボキシペプチダーゼＡ１／ＣＰＡ１、ＣＬＦ−１、カルボキシペプチダーゼＡ２、ＣＬ−Ｐ１／ＣＯＬＥＣ１２、カルボキシペプチダーゼＡ４、クラステリン、カルボキシペプチダーゼＢ１、クラステリン様１、カルボキシペプチダーゼＥ／ＣＰＥ、ＣＭＧ−２、カルボキシペプチダーゼＸ1、ＣＭＶ ＵＬ１４６、カルジオトロフィン−１、ＣＭＶ ＵＬ１４７、カルノシンジペプチダーゼ１、ＣＮＰ、カロンテ、ＣＮＴＦ、ＣＡＲＴ、ＣＮＴＦ Ｒアルファ、カスパーゼ、凝固因子ＩＩ／トロンビン、カスパーゼ−１、凝固因子ＩＩＩ／組織因子、カスパーゼ−２、凝固因子ＶＩＩ、カスパーゼ−３、凝固因子Ｘ、カスパーゼ−４、凝固因子ＸＩ、カスパーゼ−６、凝固因子ＸＩＶ／プロテインＣ、カスパーゼ−７、ＣＯＣＯ、カスパーゼ−８、コヒーシン、カスパーゼ−９、コラーゲンＩ、カスパーゼ−１０、コラーゲンＩＩ、カスパーゼ−１２、コラーゲンＩＶ、カスパーゼ−１３、共通γ鎖／ＩＬ−２Ｒガンマ、カスパーゼペプチド阻害剤、ＣＯＭＰ／トロンボスポンジン−５、カタラーゼ、補体成分Ｃ１ｒＬＰ、ベータカテニン、補体成分Ｃ１ｑＡ、カテプシン１、補体成分
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Ｒ９、インテグリンアルファＭ／ＣＤ１１ｂ、ＩＬ−２、インテグリンアルファＭベータ２、ＩＬ−２Ｒアルファ、インテグリンアルファＶ／ＣＤ５１、ＩＬ−２Ｒベータ、インテグリンアルファＶベータ５、ＩＬ−３、インテグリンアルファＶベータ３、ＩＬ−３Ｒアルファ、インテグリンアルファＶベータ６、ＩＬ−３Ｒベータ、インテグリンアルファＸ／ＣＤ１１ｃ、ＩＬ−４、インテグリンベータ１／ＣＤ２９、ＩＬ−４Ｒ、インテグリンベータ２／ＣＤ１８、ＩＬ−５、インテグリンベータ３／ＣＤ６１、ＩＬ−５Ｒアルファ、インテグリンベータ５、１Ｌ−６、インテグリンベータ６、ＩＬ−６Ｒ、インテグリンベータ７、ＩＬ−７、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０／ＣＲＧ−２、ＩＬ−７Ｒアルファ／ＣＤ１２７、ＩＲＡＫ１、ＣＸＣＲ１／ＩＬ−８ＲＡ、ＩＲＡＫ４、ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８ＲＢ、ＩＲＳ−１、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、Ｉｓｌｅｔ−１、ＩＬ−９、ＣＸＣＬ１１／１−ＴＡＣ、ＩＬ−９Ｒ、Ｊａｇｇｅｄ １、ＪＡＭ−４／ＩＧＳＦＳ、Ｊａｇｇｅｄ ２、ＪＮＫ、ＪＡＭ−Ａ、ＪＮＫ１／ＪＮＫ２、ＪＡＭ−Ｂ／ＶＥ−ＪＡＭ、ＪＮＫ１、ＪＡＭ−Ｃ、ＪＮＫ２、キニノーゲン、カリクレイン３／ＰＳＡ、キニノスタチン（Ｋｉｎｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、カリクレイン４、ＫＩＲ／ＣＤ１５８、カリクレイン５、ＫＩＲ２ＤＬ１、カリクレイン６／ニューロシン、ＫＩＲ２ＤＬ３、カリクレイン７、ＫＩＲ２ＤＬ４／ＣＤ１５８ｄ、カリクレイン８／ニューロプシン、ＫＩＲ２ＤＳ４、カリクレイン９、ＫＩＲ３ＤＬ１、血漿カリクレイン／ＫＬＫＢ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、カリクレイン１０、Ｋｉｒｒｅｌ２、カリクレイン１１、ＫＬＦ４、カリクレイン１２、ＫＬＦＳ、カリクレイン１３、ＫＬＦ６、カリクレイン１４、クロトー（Ｋｌｏｔｈｏ）、カリクレイン１５、クロトーベータ、ＫＣ、ＫＯＲ、Ｋｅａｐ１、クレメン−１、Ｋｅｌｌ、クレメン−２、ＫＧＦ／ＦＧＦ−７、ＬＡＧ−３、ＬＩＮＧＯ−２、ＬＡＩＲ１、リピン２、ＬＡＩＲ２、リポカリン−１、ラミニンアルファ４、リポカリン−２／ＮＧＡＬ、ラミニンガンマ１，５−リポキシゲナーゼ、ラミニンＩ、ＬＸＲアルファ／ＮＲ１Ｈ３、ラミニンＳ、ＬＸＲベータ／ＮＲ１Ｈ２、ラミニン−１、リヴィン（Ｌｉｖｉｎ）、ラミニン−５、ＬＩＸ、ＬＡＭＰ、ＬＭＩＲ１／ＣＤ３００Ａ、ランジェリン（Ｌａｎｇｅｒｉｎ）、ＬＭＩＲ２／ＣＤ３００ｃ、ＬＡＲ、ＬＭＩＲ３／ＣＤ３００ＬＦ、ラテキシン、ＬＭＩＲＳ／ＣＤ３００ＬＢ、ライリン（Ｌａｙｉｌｉｎ）、ＬＭＩＲ６／ＣＤ３００ＬＥ、ＬＢＰ、ＬＭＯ２、ＬＤＬ Ｒ、ＬＯＸ−１／ＳＲ−Ｅ１、ＬＥＣＴ２、ＬＲＨ−１／ＮＲ５Ａ２、ＬＥＤＧＦ、ＬＲＩＧ１、レフティ、ＬＲＩＧ３、レフティ−１、ＬＲＰ−１、レフティ−Ａ、ＬＲＰ−６、レグマイン、ＬＳＥＣｔｉｎ／ＣＬＥＣ４Ｇ、レプチン、ルミカン、レプチンＲ、ＣＸＣＬ−１５／ラングカイン（Ｌｕｎｇｋｉｎｅ）、ロイコトリエンＢ４、ＸＣＬ１／リンホタクチン、ロイコトリエンＢ４ Ｒ１、リンフォトキシン、ＬＩＦ、リンフォトキシンベータ／ＴＮＦＳＦ３、ＬＩＦ Ｒアルファ、リンフォトキシンベータＲ／ＴＮＦＲＳＦ３、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、Ｌｙｎ、リミチン、Ｌｙｐ、ＬＩＭＰＩＩ／ＳＲ−Ｂ２、リシルオキシダーゼモホログ２、ＬＩＮ−２８、ＬＹＶＥ−１、ＬＩＮＧＯ−１、アルファ２−マクログロブリン、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＭＡＤ２Ｌ１、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、ＭＡｄＣＡＭ−１、ミンジン、ＭａｆＢ、ミネラルコルチコイドＲ／ＮＲ３Ｃ２、ＭａｆＦ、ＣＣＬ３Ｌ１／ＭＩＰ−１アルファ アイソフォームＬＤ７８ベータ、ＭａｆＧ、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１アルファ、ＭａｆＫ、ＣＣＬ４Ｌ１／ＬＡＧ−１、ＭＡＧ／Ｓｉｇｌｅｃ−４−ａ、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１ベータ、ＭＡＮＦ、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ−１デルタ、ＭＡＰ２、ＣＣＬ９／１０／ＭＩＰ−１ガンマ、ＭＡＰＫ、ＭＩＰ−２、マラプシン／パンクレアシン（Ｍａｒａｐｓｉｎ／Ｐａｎｃｒｅａｓｉｎ）、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３ベータ、ＭＡＲＣＫＳ、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３アルファ、ＭＡＲＣＯ、ＭＩＰ−Ｉ、Ｍａｓｈ１、ＭＩＰ−ＩＩ、マトリリン−２、ＭＩＰ−ＩＩＩ、マトリリン−３、ＭＩＳ／ＡＭＨ、マトリリン−４、ＭＩＳ Ｒ１１、マトリプターゼ／ＳＴ１４、ＭＩＸＬ１、ＭＢＬ、ＭＫＫ３／ＭＫＫ６、ＭＢＬ−２、ＭＫＫ３、メラノコルチン３Ｒ／ＭＣ３Ｒ、ＭＫＫ４、ＭＣＡＭ／ＣＤ１４６、ＭＫＫ６、ＭＣＫ−２、ＭＫＫ７、Ｍｃｌ−１、ＭＫＰ−３、ＭＣＰ−６、ＭＬＨ−１、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＭＬＫ４アルファ、ＭＣＰ−１１、ＭＭＰ、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＭＭＰ−１、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３／ＭＡＲＣ、ＭＭＰ−２、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４、ＭＭＰ−３、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ−５、ＭＭＰ−７、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＭＰ−８、Ｍ−ＣＳＦ Ｒ、ＭＭＰ−９、ＭＣＶ−タイプＩＩ、ＭＭＰ−１０、ＭＤ−１、ＭＭＰ−１１、ＭＤ−２、ＭＭＰ−１２、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＭＭＰ−１３、ＭＤＬ−１／ＣＬＥＣＳＡ、ＭＭＰ−１４、ＭＤＭ２、ＭＭＰ−１５、ＭＥＡ−１、ＭＭＰ−１６／ＭＴ３−ＭＭＰ、ＭＥＫ１／ΜΕΚ２、ＭＭＰ−２４／ＭＴ５−ＭＭＰ、ＭＥＫ１、ＭＭＰ−２５／ＭＴ６−ＭＭＰ、ＭＥＫ２、ＭＭＰ−２６、メルシン、ＭＭＲ、ＭＥＰＥ、ＭＯＧ、メプリンアルファ、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１、メプリンベータ、Ｍ−Ｒａｓ／Ｒ−Ｒａｓ３、Ｍｅｒ、Ｍｒｅｌｌ、メソテリン、ＭＲＰ１、メテオリン、ＭＳＫ１／ＭＳＫ２、メチオニンアミノペプチダーゼ１、ＭＳＫ１、メチオニンアミノペプチダーゼ、ＭＳＫ２、メチオニンアミノペプチダーゼ２、ＭＳＰ、ＭＦＧ−Ｅ８、ＭＳＰ Ｒ／Ｒｏｎ、ＭＦＲＰ、Ｍｕｇ、ＭｇｃＲａｃＧＡＰ、ＭＵＬＴ−１、ＭＧＬ２、ムサシ−１、ＭＧＭＴ、ムサシ−２、ＭＩＡ、ＭｕＳＫ、ＭＩＣＡ、ＭｕｔＹ ＤＮＡグリコシラーゼ、ＭＩＣＢ、ＭｙＤ８８、ＭＩＣＬ／ＣＬＥＣ１２Ａ、ミエロペルオキシダーゼ、ベータ２ミクログロブリン、ミオカルディン、ミッドカイン、ミオシリン、ＭＩＦ、ミオグロビン、ＮＡＩＰ ＮＧＦＩ−Ｂガンマ／ＮＲ４Ａ３、Ｎａｎｏｇ、ＮｇＲ２／ＮｇＲＨｌ、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＮｇＲ３／ＮｇＲＨ２、Ｎｂｓ１、ニドジェン−１／エンタクチン、ＮＣＡＭ−１／ＣＤ５６、ニドジェン−２、ＮＣＡＭ−Ｌ１、一酸化窒素、ネクチン−１、ニトロチロシン、ネクチン−２／ＣＤ１１２、ＮＫＧ２Ａ、ネクチン−３、ＮＫＧ２Ｃ、ネクチン−４、ＮＫＧ２Ｄ、ネオゲニン、ＮＫｐ３０、ネプリライシン／ＣＤ１０、ＮＫｐ４４、ネプリライシン−２／ＭＭＥＬ１／ＭＭＥＬ２、ＮＫｐ４６／ＮＣＲ１、ネスチン、ＮＫｐ８０／ＫＬＲＦ１、ＮＥＴＯ２、ＮＫＸ２．５、ネトリン−１、ＮＭＤＡＲ、ＮＲ１サブユニット、ネトリン−２、ＮＭＤＡＲ、ＮＲ２Ａサブユニット、ネトリン−４、ＮＭＤＡＲ、ＮＲ２Ｂサブユニット、ネトリン−Ｇｌａ、ＮＭＤＡＲ、ＮＲ２Ｃサブユニット、ネトリン−Ｇ２ａ、Ｎ−Ｍｅ−６，７−ｄｉＯＨ−ＴＩＱ、ニューレグリン−１／ＮＲＧ１、ノダル（Ｎｏｄａｌ）、ニューレグリン−３／ＮＲＧ３、ノギン、ニューリチン、Ｎｏｇｏ受容体、ニューロＤ１（ＮｅｕｒｏＤ１）、Ｎｏｇｏ−Ａ、ニューロファシン、ＮＯＭＯ、ニューロゲニン−１、ノープ（Ｎｏｐｅ）、ニューロゲニン−２、ノリン（Ｎｏｒｒｉｎ）、ニューロゲニン−３、ｅＮＯＳ、ニューロリシン、ｉＮＯＳ、ニューロフィシンＩＩ、ｎＮＯＳ、ニューロピリン−１、ノッチ−１、ニューロピリン−２、ノッチ−２、ニューロポエチン、ノッチ−３、ニューロトリミン、ノッチ−４、ニュールツリン、ＮＯＶ／ＣＣＮ３、ＮＦＡＭ１、ＮＲＡＧＥ、ＮＦ−Ｈ、ＮｒＣＡＭ、ＮＦｋＢ１、ＮＲＬ、ＮＦｋＢ２、ＮＴ−３、ＮＦ−L、ＮＴ−４、ＮＦ−Ｍ、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＮＧ２／ＭＣＳＰ、ＮＴＨ１、ＮＧＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ヌクレオステミン、ベータ−ＮＧＦ、Ｎｕｒｒ−１／ＮＲ４Ａ２、ＮＧＦＩ−Ｂアルファ／ＮＲ４Ａ１、ＯＡＳ２、オレキシンＢ、ＯＢＣＡＭ、ＯＳＣＡＲ、ＯＣＡＭ、ＯＳＦ−２／ペリオスチン、ＯＣＩＬ／ＣＬＥＣ２ｄ、オンコスタチンＭ／ＯＳＭ、ＯＣＩＬＲＰ２／ＣＬＥＣ２１、ＯＳＭ Ｒベータ、Ｏｃｔ−３／４、オステオアクチビン／ＧＰＮＭＢ、ＯＧＧ１、オステオアドヘリン、オリゴ１、オリゴ２、オリゴ３、オステオカルシン、Ｏｌｉｇ１、オステオクリン、Ｏｌｉｇ２、オステオポンチン、Ｏｌｉｇ３、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、オリゴデンドロサイトマーカー０１、Ｏｔｘ２、オリゴデンドロサイトマーカー０４、ＯＶ−６、ＯＭｇｐ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、オプチチン（Ｏｐｔｉｃｉｎ）、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、オレキシンＡ、ＯＡＳ２、オレキシンＢ、ＯＢＣＡＭ、ＯＳＣＡＲ、ＯＣＡＭ、ＯＳＦ−２／ペリオスチン、ＯＣＩＬ／ＣＬＥＣ２ｄ、オンコスタチンＭ／ＯＳＭ、ＯＣＩＬＲＰ２／ＣＬＥＣ２１、ＯＳＭ Ｒベータ、Ｏｃｔ−３／４、オステオアクチビン／ＧＰＮＭＢ、ＯＧＧ１、オステオアドヘリン、オリゴ１、オリゴ２、オリゴ３、オステオカルシン、Ｏｌｉｇ１、オステオクリン、Ｏｌｉｇ２、オステオポンチン、Ｏｌｉｇ３、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、オリゴデンドロサイトマーカー０１、Ｏｔｘ２、オリゴデンドロサイトマーカー０４、ＯＶ−６、ＯＭｇｐ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、オプチシン（Ｏ
ｐｔｉｃｉｎ）、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、オレキシンＡ、ＲＡＣＫ１、Ｒｅｔ、Ｒａｄ１、ＲＥＶ−ＥＲＢアルファ／ＮＲ１Ｄ１、Ｒａｄ１７、ＲＥＶ−ＥＲＢベータ／ＮＲ１Ｄ２、Ｒａｄ５１、Ｒｅｘ−１、Ｒａｅ−１、ＲＧＭ−Ａ、Ｒａｅ−１アルファ、ＲＧＭ−Ｂ、Ｒａｅ−１ベータ、ＲＧＭ−Ｃ、Ｒａｅ−１デルタ、Ｒｈｅｂ、Ｒａｅ−１イプシロン、リボソ−ムタンパク質Ｓ６、Ｒａｅ−１ガンマ、ＲＩＰ１、Ｒａｆ−１、ＲＯＢＯ１、ＲＡＧＥ、ＲＯＢＯ２、Ｒａ１Ａ／Ｒａ１Ｂ、ＲＯＢＯ３、Ｒａ１Ａ、ＲＯＢＯ４、Ｒａ１Ｂ、ＲＯＲ／ＮＲ１Ｆ１−３（ｐａｎ）、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＲＯＲアルファ／ＮＲ１Ｆ１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＲＯＲガンマ／ＮＲ１Ｆ３、Ｒａｐ１Ａ／Ｂ、ＲＴＫ様オーファン受容体１／ＲＯＲｌ、ＲＡＲアルファ／ＮＲ１Ｂ１、ＲＴＫ−オーファン受容体２／ＲＯＲ２、ＲＡＲベータ／ＮＲ１Ｂ２、ＲＰ１０５、ＲＡＲガンマ／ＮＲ１Ｂ３、ＲＰＡ２、Ｒａｓ、ＲＳＫ（ｐａｎ）、ＲＢＰ４、ＲＳＫ１／ＲＳＫ２、ＲＥＣＫ、ＲＳＫｌ、Ｒｅｇ２／ＰＡＰ、ＲＳＫ２、ＲｅｇＩ、ＲＳＫ３、ＲｅｇＩＩ、ＲＳＫ４、ＲｅｇＩＩＩ、Ｒ−スポンジン１、Ｒｅｇ Ｍａ、Ｒ−スポンジン２、ＲｅｇＩＶ、Ｒ−スポンジン３、レラキシン−１、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２、リラキシン−２、ＲＵＮＸ２／ＣＢＦＡ１、リラキシン−３、ＲＵＮＸ３／ＣＢＦＡ３、ＲＥＬＭアルファ、ＲＸＲアルファ／ＮＲ２Ｂ１、ＲＥＬＭベータ、ＲＸＲベータ／ＮＲ２Ｂ２、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＲＸＲガンマ／ＮＲ２Ｂ３、レジスチン、Ｓ１００Ａ１０、ＳＬＩＴＲＫ５、Ｓ１００Ａ８、ＳＬＰ１、Ｓ１００Ａ９、ＳＭＡＣ／ディアブロ、Ｓ１００Ｂ、Ｓｍａｄ１、ＳＴＯＯＰ、Ｓｍａｄ２、ＳＡＬＬ１、Ｓｍａｄ３、デルタ−サルコグリカン、Ｓｍａｄ４、Ｓｃａ−１／Ｌｙ６、Ｓｍａｄ５、ＳＣＤ−１、Ｓｍａｄ７、ＳＣＦ、Ｓｍａｄ８、ＳＣＦ Ｒ／ｃ−ｋｉｔ、ＳＭＣ１、ＳＣＧＦ、アルファ−平滑筋アクチン、ＳＣＬ／Ｔａｌｌ、ＳＭＵＧ１、ＳＣＰ３／ＳＹＣＰ３、Ｓｎａｉｌ、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１、ナトリウムカルシウム交換体１、ＳＤＮＳＦ／ＭＣＦＤ２、Ｓｏｇｇｙ−１、アルファ−セクレターゼ、ソニック・ヘッジホッグ、ガンマ−セクレターゼ、ＳまたはＣＳ１、ベータ−セクレターゼ、ＳまたはＣＳ３、Ｅ−セレクチン、ソルチリン、Ｌ−セレクチン、ＳＯＳＴ、Ｐ−セレクチン、ＳＯＸ１、セマフォリン３Ａ、ＳＯＸ２、セマフォリン３Ｃ、ＳＯＸ３、セマフォリン３Ｅ、ＳＯＸ７、セマフォリン３Ｆ、ＳＯＸ９、セマフォリン６Ａ、ＳＯＸ１０、セマフォリン６Ｂ、ＳＯＸ１７、セマフォリン６Ｃ、ＳＯＸ２１、セマフォリン６Ｄ、ＳＰＡＲＣ、セマフォリン７Ａ、ＳＰＡＲＣ様１、セパラーゼ、ＳＰ−Ｄ、セリン／スレオニンホスファターゼ基質Ｉ、スピネシン、セルピンＡ１、Ｆ−スポンジン、セルピンＡ３、ＳＲ−ＡＩ／ＭＳＲ、セルピンＡ４／カリスタチン、Ｓｒｃ、セルピンＡ５／プロテインＣ阻害剤、ＳＲＥＣ−Ｉ／ＳＲ−Ｆ１、セルピンＡ８／アンジオテンシノーゲン、ＳＲＥＣ−ＩＩ、セルピンＢ５、ＳＳＥＡ−１、セルピンＣ１／アンチトロンビン−ＩＩＩ、ＳＳＥＡ−３、セルピンＤ１／ヘパリン補因子ＩＩ、ＳＳＥＡ−４、セルピンＥ１／ＰＡＩ−１、ＳＴ７／ＬＲＰ１２、セルピンＥ２、スタビリン−１、セルピンＦ１、スタビリン−２、セルピンＦ２、スタニオカルシン１、セルピンＧ１／Ｃ１阻害剤、スタニオカルシン２、セルピン１２、ＳＴＡＴ１、血清アミロイドＡ１、ＳＴＡＴ２、ＳＦ−１／ＮＲ５Ａ１、ＳＴＡＴ３、ＳＧＫ、ＳＴＡＴ４、ＳＨＢＧ、ＳＴＡＴ５ａ／ｂ、ＳＨＩＰ、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＨＰ／ＮＲＯＢ２、ＳＴＡＴ５ｂ、ＳＨＰ−１、ＳＴＡＴ６、ＳＨＰ−２、ＶＥ−スタチン、ＳＩＧＩＲＲ、Ｓｔｅｌｌａ／Ｄｐｐａ３、シグレック−２／ＣＤ２２、ＳＴＲＯ−１、シグレック−３／ＣＤ３３、サブスタンスＰ、シグレック−５、スルファミダーゼ／ＳＧＳＨ、シグレック−６、スルファターゼ変更因子１／ＳＵＭＦｌ、シグレック−７、スルファターゼ変更因子２／ＳＵＭＦ２、シグレック−９、ＳＵＭＯ１、シグレック−１０、ＳＵＭＯ２／３／４、シグレック−１１、ＳＵＭＯ３、シグレック−Ｆ、スーパーオキシドジスムターゼ、ＳＩＧＮＲ１／ＣＤ２０９、スーパーオキシドジスムターゼ−１／Ｃｕ−Ｚｎ ＳＯＤ、ＳＩＧＮＲ４、スーパーオキシドジスムターゼ２／Ｍｎ−ＳＯＤ、ＳＩＲＰベータ１、スーパーオキシドジスムターゼ−３／ＥＣ−ＳＯＤ、ＳＫＩ、サバイビン、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０、シナプシンＩ、スリーピングビューティートランスポサーゼ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）、シンデカン−１／ＣＤ１３８、Ｓｌｉｔ３、シンデカン−２、ＳＬＩＴＲＫ１、シンデカン−３、ＳＬＩＴＲＫ２、シンデカン−４、ＳＬＩＴＲＫ４、ＴＡＣ１／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＭＦＦＦ１／トモレグリン−１、ＴＡＯ２、ＴＭＦＦＦ２、ＴＡＰＰ１、ＴＮＦ−アルファ／ＴＮＦＳＦ１Ａ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＴＮＦ−ベータ／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、Ｔａｕ、ＴＮＦ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＣ２１／Ｒ−Ｒａｓ２、ＴＮＦ Ｒ１１／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＣＡＭ−１、ＴＯＲ、ＴＣＣＲ／ＷＳＸ−１、ＴＰ−１、ＴＣ−ＰＴＰ、ＴＰ６３／ＴＰ７３Ｌ、ＴＤＧ、ＴＲ、ＣＣＬ２５／ＴＥＣＫ、ＴＲアルファ／ＮＲ１Ａ１、テネイシンＣ、ＴＲベータ１／ＮＲ１Ａ２、テネイシンＲ、ＴＲ２／ＮＲ２Ｃ１、ＴＥＲ−１１９、ＴＲ４／ＮＲ２Ｃ２、ＴＥＲＴ、ＴＲＡ−１−８５、テスチカン１／ＳＰＯＣＫｌ、ＴＲＡＤＤ、テスチカン２／ＳＰＯＣＫ２、ＴＲＡＦ−１、テスチカン３／ＳＰＯＣＫ３、ＴＲＡＦ−２、ＴＦＰＩ、ＴＲＡＦ−３、ＴＦＰＩ−２、ＴＲＡＦ−４、ＴＧＦ−アルファ、ＴＲＡＦ−６、ＴＧＦ−ベータ、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＲＡＩＬ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＬＡＰ（ＴＧＦ−ベータ１）、ＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、潜在型ＴＧＦ−ベータ１、ＴＲＡＩＬ Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＧＦ−ベータ１．２、ＴＲＡＩＬ Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１、ＴＧＦ−ベータ３、ＴｆＲ（トランスフェリンＲ）、ＴＧＦ−ベータ５、アポトランスフェリン、潜在型ＴＧＦ−ベータｂｐ１、ホロ−トランスフェリン、潜在型ＴＧＦ−ベータｂｐ２、トラッピン（Ｔｒａｐｐｉｎ）−２／Ｅｌａｆｉｎ、潜在型ＴＧＦ−ベータｂｐ４、ＴＲＥＭ−１、ＴＧＦ−ベータＲＩ／ＡＬＫ−５、ＴＲＥＭ−２、ＴＧＦ−ベータＲＩＩ、ＴＲＥＭ−３、ＴＧＦ−ベータＲｌｌｂ、ＴＲＥＭＬ１／ＴＬＴ−１、ＴＧＦ−ベータＲＩＩＩ、ＴＲＦ−１、サーモリシン、ＴＲＦ−２、チオレドキシン−１、ＴＲＨ分解エクト酵素／ＴＲＨＤＥ、チオレドキシン−２、ＴＲＩＭＳ、チオレドキシン８０、トリペプチジル−ペプチダーゼＩ、チオレドキシン様５／ＴＲＰ１４、ＴｒｋＡ、ＴＨＯＰ１、ＴｒｋＢ、トロンボモジュリン／ＣＤ１４１、ＴｒｋＣ、トロンボポエチン、ＴＲＯＰ−２、トロンボポエチンＲ、トロポニンＩペプチド３、トロンボスポンジン−１、トロポニンＴ、トロンボスポンジン−２、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、トロンボスポンジン４、トリプシン１、チモポエチン、トリプシン２／ＰＲＳＳ２、胸腺ケモカイン−１、トリプシン３／ＰＲＳＳ３、Ｔｉｅ−１、トリプターゼ−５／Ｐｒｓｓ３２、Ｔｉｅ−２、トリプターゼアルファ／ＴＰＳ１、ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ、トリプターゼベータ−１／ＭＣＰＴ−７、ＴＩＭ−２、トリプターゼベータ−２／ＴＰＳＢ２、ＴＩＭ−３、トリプターゼイプシロン／ＢＳＳＰ−４、ＴＩΜ−４、トリプターゼガンマ−１／ＴＰＳＧ１、ＴＩＭ−５、トリプトファンヒドロキシラーゼ、ＴＩＭ−６、ＴＳＣ２２、ＴＩＭＰ−１、ＴＳＧ、ＴＩＭＰ−２、ＴＳＧ−６、ＴＩＭＰ−３、ＴＳＫ、ＴＩＭＰ−４、ＴＳＬＰ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＳＬＰ Ｒ、ＴＬＲ１、ＴＳＰ５０、ＴＬＲ２、ベータＩＩＩチューブリン、ＴＬＲ３、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、ＴＬＲ４、ＴＷＥＡＫ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１２、ＴＬＲＳ、Ｔｙｋ２、ＴＬＲ６、ホスホチロシン、ＴＬＲ９、チロシンヒドロキシラーゼ、ＴＬＸ／ＮＲ２Ｅ１、チロシンホスファターゼ基質Ｉ、ユビキチン、ＵＮＣ５Ｈ３、Ｕｇｉ、ＵＮＣ５Ｈ４、ＤＧＲＰｌ、ＵＮＧ、ＵＬＢＰ−１、ｕＰＡ、ＵＬＢＰ−２、ｕＰＡＲ、ＵＬＢＰ−３、ＵＲＢ、ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＶＤＥ、ＵＮＣ５Ｈ２、バニロイドＲ１、ＶＥＧＦ Ｒ、ＶＡＳＡ、ＶＥＧＦ Ｒ１／Ｆｌｔ−１、バソヒビン、ＶＥＧＦ Ｒ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、バソリン、ＶＥＧＦ Ｒ３／Ｆｌｔ−４、バソスタチン、バーシカン、Ｖａｖ−１、ＶＧＳＱ、ＶＣＡＭ−１、ＶＨＲ、ＶＤＲ／ＮＲ１１１、ビメンチン、ＶＥＧＦ、ビトロネクチン、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＬＤＬＲ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ｖＷＦ−Ａ２、ＶＥＧＦ−Ｄ、シヌクレイン−アルファ、Ｋｕ７０、ＷＡＳＰ、Ｗｎｔ−７b、ＷＩＦ−１、Ｗｎｔ−８ａ ＷＩＳＰ−１／ＣＣＮ４、Ｗｎｔ−８ｂ、ＷＮＫ１、Ｗｎｔ−９ａ、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−９ｂ、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−１０ｂ、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ−５ｂ、ｗｎｖＮＳ３、Ｗｎｔ７ａ、ＸＣＲ１、ＸＰＥ／ＤＤＢ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＰＥ／ＤＤＢ２、Ｘｇ、ＸＰＦ、ＸＩＡＰ、ＸＰＧ、ＸＰＡ、ＸＰＶ、ＸＰＤ、ＸＲＣＣ、Ｙｅｓ、ＹＹ１、ＥｐｈＡ４。

他の活性ポリペプチドには以下のものが含まれる：ＢＯＴＯＸ、ミオブロック、ニューロブロック、ディスポート（または他のボツリヌス神経毒の血清型）、アルグルコシダーゼアルファ、ダプトマイシン、ＹＨ−１６、コリオゴナドトロピンアルファ、フィルグラスチム、セトロレリクス、インターロイキン−２、アルデスロイキン、テセロイキン、デニロイキンジフチトックス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、インターフェロンアルファ−ｎ３（注射）、インターフェロンアルファ−ｎ１、ＤＬ−８２３４、インターフェロン、サントリ（ガンマ−１ａ）、インターフェロンガンマ、チモシンアルファ１、タソネルミン、ＤｉｇｉＦａｂ、ＶｉｐｅｒａＴＡｂ、ＥｃｈｉＴＡｂ、ＣｒｏＦａｂ、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、レビフ、エプトテルミンアルファ、テリパラチド（骨粗しょう症）、注射用カルシトニン（骨疾患）、カルシトニン（点鼻用、骨粗しょう症）、エタネルセプト、ヘモグロビングルタマー２５０（ウシ）、ドロトレコギンアルファ、コラゲナーゼ、カルペリチド、組換えヒト上皮細胞増殖因子（局所ゲル、創傷治癒）、ＤＷＰ−４０１、ダルベポエチンアルファ、エポエチンオメガ、エポエチンベータ、エポエチンアルファ、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグアルファ、モノニン（Ｍｏｎｏｎｉｎｅ）、エプタコグアルファ（活性化）、組換えファクタ−ＶＩＩＩ＋ＶＷＦ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ、組換え第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（組換え体）、アルファネート、オクトコグアルファ、第ＶＩＩＩ因子、パリフェルミン、インディキナーゼ（Ｉｎｄｉｋｉｎａｓｅ）、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、ホリトロピンアルファ、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモレリン、グルカゴン、エキセナチド、プラムリンチド、イミグルセラーゼ、ガルスルファーゼ、ロイコトロピン、モルグラモスチム、トリプトレリンアセテート、ヒストレリン（皮下インプラント、ハイドロン）、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、ロイプロリド徐放デポー（ＡＴＲＩＧＥＬ）、ロイプロリドインプラント（ＤＵＲＯＳ）、ゴセレリン、ソマトロピン、ユートロピン、ＫＰ−１０２プログラム、ソマトロピン、ソマトロピン、メカセルミン（成長障害）、エンフビルチド、Ｏｒｇ−３３４０８、インスリングラルギン、インスリングルリシン、インスリン（吸入薬）、インスリンリスプロ、インスリンデテミル、インスリン（バッカル剤、ＲａｐｉｄＭｉｓｔ）、メカセルミンリンファベート（ｍｅｃａｓｅｒｍｉｎ ｒｉｎｆａｂａｔｅ）、アナキンラ、セルモロイキン、９９ｍＴｃ−アプシタイド（ａｐｃｉｔｉｄｅ）注射剤、ミエロピド、ベータセロン、酢酸グラチラマー、ゲポン（Ｇｅｐｏｎ）、サルグラモスチム、オプレルベキン、ヒト白血球由来アルファインターフェロン、ビリブ（Ｂｉｌｉｖｅ、）インスリン（組換え体）、組換えヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセルミン、ロフェロン−Ａ、インターフェロン−アルファ２、アルファフェロン（Ａｌｆａｆｅｒｏｎｅ）、インターフェロンアルファコン−１、インターフェロンアルファ、アボネックス組換えヒト由来黄体形成ホルモン、ドルナーゼアルファ、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン、ベカプレルミン、エプチフィバチド、ゼマイラ（Ｚｅｍａｉｒａ）、ＣＴＣ−１１１、シャンバック（Ｓｈａｎｖａｃ）−Ｂ、ＨＰＶワクチン（四価）、ＮＯＶ−００２、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、酢酸プレザチド銅（局所用ゲル）、ラスブリカーゼ、ラニビズマブ、アクティミューン、ＰＥＧ−イントロン、トリコミン（Ｔｒｉｃｏｍｉｎ）、組換えハウスダストダニアレルギー脱感作注射剤、組換えヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）１−８４（皮下、骨粗しょう症）、エポエチンデルタ、トランスジェニックアンチトロンビンＩＩＩ、グランジトロピン（Ｇｒａｎｄｉｔｒｏｐｉｎ）、ビトラーゼ（Ｖｉｔｒａｓｅ）、組換えインスリン、インターフェロンアルファ（経口トローチ剤）、ＧＥＭ−２１Ｓ、バプレオチド、イデュルスルファーゼ、オマパトリラート、組換え血清アルブミン、セルトリズマブペゴール、グルカルピダーゼ、ヒト組換えＣ１エステラーゼ阻害剤（血管性浮腫）、ラノテプラーゼ、組換えヒト成長ホルモン、エンフビルチド（無針注射剤、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ ２０００）、ＶＧＶ−１、インターフェロン（アルファ）、ルシナクタント、アビプタジル（吸入用、肺疾患）、イカチバント、エカランチド、オミガナン（ｏｍｉｇａｎａｎ）、オーログラブ（Ａｕｒｏｇｒａｂ）、酢酸ペキシガナン、ＡＤＩ−ＰＥＧ−２０、ＬＤＩ−２００、デガレリクス、シントレデキン・ベスドトクス（ｃｉｎｔｒｅｄｅｋｉｎ ｂｅｓｕｄｏｔｏｘ）、ＦａｖＩｄ、ＭＤＸ−１３７９、ＩＳＡｔｘ−２４７、リラグルチド、テリパラチド（骨粗しょう症）、チファコギン（ｔｉｆａｃｏｇｉｎ）、ＡＡ−４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション、カツマキソマブ、ＤＷＰ−４１３、ＡＲＴ−１２３、クリサリン（Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ）、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ、コリフォリトロピンアルファ、ＴＨ−９５０７、テヅグルチド、ジアミド、ＤＷＰ−４１２、成長ホルモン（除放性注射剤）、組換えＧ−ＣＳＦ、インスリン（吸入用、ＡＩＲ）、インスリン（吸入用、Ｔｅｃｈｎｏｓｐｈｅｒｅ）、インスリン（吸入用、ＡＥＲＸ）、ＲＧＮ−３０３、ＤｉａＰｅｐ２７７、インターフェロンベータ（Ｃ型肝炎ウイルス感染症（ＨＣＶ））、インターフェロンアルファ−ｎ３（経口用）、ベラタセプト、経皮用インスリンパッチ、ＡＭＧ−５３１、ＭＢＰ−８２９８、キセレセプト、オペバカン、ＡＩＤＳＶＡＸ、ＧＶ−１００１、リンホスキャン、ランピルナーゼ、リポキシサン、ルスプルチド、ＭＰ５２（ベータトリカルシウムホスフェート担体、骨再生）、メラノーマワクチン、シプレウセル−Ｔ、ＣＴＰ−３７、インセギア、ビテスペン、ヒトトロンビン（凍結、手術出血）、トロンビン、トランスＭＩＤ、アリフィメプラーゼ、プリカーゼ、テルリプレシン（静脈内、肝腎臓症候群）、ＥＵＲ−１００８Ｍ、組換えＦＧＦ−１（注射用、血管疾患）、ＢＤＭ−Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ−２１６、Ｐ−１１３、ＭＢＩ−５９４ＡＮ、デュラマイシン（吸入用、嚢胞性線維症）、ＳＣＶ−０７、ＯＰＩ−４５、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＡＢＴ−５１０、ボーマンバーク阻害剤濃縮物、ＸＭＰ−６２９、９９ｍＴｃ−Ｈｙｎｉｃ−アネキシンＶ、カハラリドＦ、ＣＴＣＥ−９９０８、テベレリクス（延長放出）、オザレリックス、ロミデプシン、ＢＡＹ−５０−４７９８、インターロイキン−４、ＰＲＸ−３２１、ペプスキャン、イボクタデキン、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ−０１５、ＩＬ−２１、ＡＴＮ−１６１、シレンジチド、アルブフェロン、ビファジックス（Ｂｉｐｈａｓｉｘ）、ＩＲＸ−２、オメガインターフェロン、ＰＣＫ−３１４５、ＣＡＰ−２３２、パシレオチド、ｈｕＮ９０１−ＤＭ１、卵巣癌免疫療法用ワクチン、ＳＢ−２４９５５３、オンコバックス−ＣＬ、オンコバックス−Ｐ、ＢＬＰ−２５、セルバックス−１６、多エピトープペプチドメラノーマワクチン（ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ）、ネミフィチド、ｒＡＡＴ（吸入用）、ｒＡＡＴ（皮膚科用）、ＣＧＲＰ（吸入用、喘息）、ペグスネルセプト、チモシンベータ−４、プリチデプシン、ＧＴＰ−２００、ラモプラニン、ＧＲＡＳＰＡ、ＯＢＩ−１、ＡＣ−１００、サケカルシトニン（経口用、ｅｌｉｇｅｎ）、カルシトニン（経口用、骨粗鬆症）、エキサモレリン、カプロモレリン、カルデバ、ベラフェルミン、１３１Ｉ−ＴＭ−６０１、ＫＫ−２２０、ＴＰ−１０、ウラリチド、デペレスタット、ヘマチド、クリサリン（局所用）、ｒＮＡＰｃ２、組換え第ＶＩＩＩ因子（ＰＥＧ化リポソーム）、ｂＦＧＦ、ＰＥＧ化組換えスタフィロキナーゼ変異体、Ｖ−１０１５３、ソノリシスプロリーゼ、ニューロバックス、ＣＺＥＮ−００２、島細胞新生療法、ｒＧＬＰ−１、ＢＩＭ−５１０７７、ＬＹ−５４８８０６、エキセナチド（制御放出、Ｍｅｄｉｓｏｒｂ）、ＡＶＥ−００１０、ＧＡ−ＧＣＢ、アボレリン、ＡＯＤ−９６０４、リナクロチドアセテート、ＣＥＴｉ−１、ヘモスパン、ＶＡＬ（注射用）、急速作用性インスリン（注射用、Ｖｉａｄｅｌ）、鼻内インスリン、インスリン（吸入用）、インスリン（経口用、ｅｌｉｇｅｎ）、組換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ皮下注射、湿疹）、ピトラキンラ（吸入用乾燥粉末、喘息）、マルチカイン、ＲＧ−１０６８、ＭＭ−０９３、ＮＢＩ−６０２４、ＡＴ−００１、ＰＩ−０８２４、Ｏｒｇ−３９１４１、Ｃｐｎ１０（自己免疫疾患／炎症）、タラクトフェリン（局所用）、ｒＥＶ−１３１（眼用）、ｒＥＶ−１３１（呼吸疾患）、経口用組換えヒトインスリン（糖尿病）、ＲＰＩ−７８Ｍ、オプレルベキン（経口用）、ＣＹＴ−９９００７ ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＤＴＹ−００１、バラテグラスト、インターフェロンアルファ−ｎ３（局所用）、ＩＲＸ−３、ＲＤＰ−５８、タウフェロン、胆汁酸塩刺激リパーゼ、メリスパーゼ、アルカリホスファターゼ、ＥＰ−２１０４Ｒ、メラノタン−ＩＩ、ブレメラノチド、ＡＴＬ−１０４、組換えヒトミクロプラスミン、ＡＸ−２００、ＳＥＭＡＸ、ＡＣＶ−１、Ｘｅｎ−２１７４、ＣＪＣ−１００８、ジノルフィンＡ、ＳＩ−６６０３、ＬＡＢ ＧＨＲＨ、ＡＥＲ−００２、ＢＧＣ−７２８、マラリアワクチン（ビロソーム、ＰｅｖｉＰＲＯ）、ＡＬＴＵ−１３５、パルボウイルスＢ１９ワクチン、インフルエンザワクチン（組換えノイラミニダーゼ）、マラリア／ＨＢＶワクチン、炭疽病ワクチン、Ｖａｃｃ−５ｑ、Ｖａｃｃ−４ｘ、ＨＩＶワクチン（経口用）、ＨＰＶワクチン、Ｔａｔトキソイド、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ−１３３４０、ＰＴＨ（１−３４）リポソームクリーム（ノバソーム）、オスタボリン−Ｃ、ＰＴＨ類縁体（局所用、乾癬）、ＭＢＲＩ−９３．０２、ＭＴＢ７２Ｆワクチン（結核）、ＭＶＡ−Ａｇ８５Ａワクチン（結核）、ＦＡＲ−４０４、ＢＡ−２１０、組換えペストＦ１Ｖワクチン、ＡＧ−７０２、ＯＸＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶ１、Ｄｅｒ−ｐ１／Ｄｅｒ−ｐ２／Ｄｅｒ−ｐ７アレルゲン標的化ワクチン（ダストダニアレルギー）、ＰＲ１ペプチド抗原（白血病）、突然変異体ｒａｓワクチン、ＨＰＶ−１６Ｅ７リポペプチドワクチン、ラビリンシンワクチン（腺癌）、ＣＭＬワクチン、ＷＴ１−ペプチドワクチン（癌）、ＩＤＤ−５、ＣＤＸ−１１０、ペントリス、ノレリン、サイトファブ、Ｐ−９８０８、ＶＴ−１１１、イクロカプチド、テルベルミン（皮膚科、糖尿病性脚部潰瘍）、ルピントリビル、レチキュロース、ｒＧＲＦ、ＰＩＡ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、ＡＣＥ−０１１、ＡＬＴＵ−１４０、ＣＧＸ−１１６０、アンジオテンシン治療用ワクチン、Ｄ−４Ｆ、ＥＴＣ−６４２、ＡＰＰ−０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ−０７（経口用、結核）、ＤＲＦ−７２９５、ＡＢＴ−８２８、ＥｒｂＢ２特異的イムノトキシン（抗癌）、ＤＴ３８８１Ｌ−３、ＴＳＴ−１００８８、ＰＲＯ−１７６２、コムボトックス、コレシストキニン−Ｂ／ガストリン−受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ−ｈＥＧＦ、ＡＥ−３７、トラスツヅマブ−ＤＭ１、拮抗剤Ｇ、ＩＬ−１２（組換え）、ＰＭ−０２７３４、ＩＭＰ−３２１、ｒｈＩＧＦ−ＢＰ３、ＢＬＸ−８８３、ＣＵＶ−１６４７（局所用）、Ｌ−１９系放射線免疫療法剤（癌）、Ｒｅ−１８８−Ｐ−２０４５、ＡＭＧ−３８６、ＤＣ／Ｉ５４０／ＫＬＨワクチン（癌）、ＶＸ−００１、ＡＶＥ−９６３３、ＡＣ−９３０１、ＮＹ−ＥＳＯ−１ワクチン（ペプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、メラノーマワクチン（パルスド抗原治療薬）、前立腺癌ワクチン、ＣＢＰ−５０１、組換えヒトラクトフェリン（ドライアイ）、ＦＸ−０６、ＡＰ−２１４、ＷＡＰ−８２９４Ａ２（注射用）、ＡＣＰ
−ＨＩＰ、ＳＵＮ−１１０３１、ペプチドＹＹ［３−３６］（肥満、鼻内）、ＦＧＬＬ、アタシセプト、ＢＲ３−Ｆｃ、ＢＮ−００３、ＢＡ−０５８、ヒト副甲状腺ホルモン１−３４（鼻内、骨粗鬆症）、Ｆ−１８−ＣＣＲ１、ＡＴ−１００１（セリアック病／糖尿病）、ＪＰＤ−００３、ＰＴＨ（７−３４）リポソームクリーム（ノバソーム）、デュラマイシン（眼用、ドライアイ）、ＣＡＢ−２、ＣＴＣＥ−０２１４、グリコＰＥＧ化エリスロポエチン、ＥＰＯ−Ｆｃ、ＣＮＴＯ−５２８、ＡＭＧ−１１４、ＪＲ−０１３、第ＸＩＩＩ因子、アミノカンジン、ＰＮ−９５１、７１６１５５、ＳＵＮ−Ｅ７００１、ＴＨ−０３１８、ＢＡＹ−７３−７９７７、テベレリックス（即時放出）、ＥＰ−５１２１６、ｈＧＨ（制御放出、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅ）、ＯＧＰ−Ｉ、シフビルチド、ＴＶ−４７１０、ＡＬＧ−８８９、Ｏｒｇ−４１２５９、ｒｈＣＣ１０、Ｆ−９９１、チモペンチン（肺疾患）、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝選択的インスリン、スバリン、Ｌ１９−ＩＬ−２融合タンパク質、エラフィン、ＮＭＫ−１５０、ＡＬＴＵ−１３９、ＥＮ−１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポエチン受容体アゴニスト（血小板減少症）、ＡＬ−１０８、ＡＬ−２０８、神経成長因子拮抗剤（疼痛）、ＳＬＶ−３１７、ＣＧＸ−１００７、ＩＮＮＯ−１０５、経口用テリパラチド（ｅｌｉｇｅｎ）、ＧＥＭ−ＯＳ１、ＡＣ−１６２３５２、ＰＲＸ−３０２、ＬＦｎ−ｐ２４融合ワクチン（テラポア）、ＥＰ−１０４３、小児肺炎ワクチン、マラリアワクチン、髄膜炎細菌グループＢワクチン、新生児グループＢ連鎖球菌ワクチン、炭疽菌ワクチン、ＨＣＶワクチン（ｇｐＥ１＋ｇｐＥ２＋ＭＦ−５９）、中耳炎治療、ＨＣＶワクチン（コア抗原＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）、ｈＰＴＨ（１−３４）（経皮用、ＶｉａＤｅｒｍ）、７６８９７４、ＳＹＮ−１０１、ＰＧＮ−００５２、アビスクミン、ＢＩＭ−２３１９０、結核ワクチン、多エピトープチロシナーゼペプチド、癌ワクチン、エンカスチム、ＡＰＣ−８０２４、ＧＩ−５００５、ＡＣＣ−００１、ＴＴＳ−ＣＤ３、血管標的化ＴＮＦ（固形腫瘍）、デスモプレシン（舌下制御放出）、オネルセプト、ＴＰ−９２０１。

多数の活性タンパク質の核酸およびアミノ酸配列は、当技術分野で公知であり、説明および配列は、ケミカルアブストラクトサービスデータベース（例えば、ＣＡＳレジストリ）、ＧｅｎＢａｎｋ、ＧｅｎＰｅｐｔ、Ｅｎｔｒｅｚヌクレオチド、Ｅｎｔｒｅｚタンパク質、ユニバーサルタンパク質リソース（ＵｎｉＰｒｏｔ）およびＧｅｎＳｅｑなどのサブスクリプションデータベース（例えば、ダーウェント）などの公開データベースで利用可能である。ポリヌクレオチド配列は、所与の活性タンパク質（例えば、全長または成熟のいずれか）をコードする野生型ポリヌクレオチド配列であるか、または場合によって、配列は、野生型ポリヌクレオチド配列（例えば、ポリヌクレオチドのＤＮＡ配列が、例えば、特定の種における発現のために最適化されている野生型活性タンパク質をコードするポリヌクレオチド；または部位特異的変異体または対立遺伝子変異体などの野生型タンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチド）の変異体であってもよい。当技術分野で公知の方法を用いて、かつ／または本明細書に提供され、実施例に詳細に記載されるガイダンスおよび方法と組み合わせて、本発明によって企図される融合タンパク質コンストラクトを作製するために、活性タンパク質の野生型配列もしくはコンセンサスｃＤＮＡ配列またはコドン最適化変異体を使用することは、十分に当業者の能力内である。

融合タンパク質の薬物動態特性
本発明は、ムチンポリペプチドドメインに連結されていない治療活性タンパク質と比較して、強化された薬物動態を有する治療活性タンパク質の融合タンパク質であって、本明細書に記載の方法によって組成物に対して決定された最適な用量で使用した場合に、本発明に従ってムチンドメインポリペプチドに連結されていない治療活性タンパク質の同等の用量と比較して、強化された薬物動態を達成することができる融合タンパク質を提供する。本明細書で使用する「同程度の用量」とは、同等の様式で対象に投与される治療活性タンパク質の等モル／ｋｇを有する用量を意味する。融合タンパク質の「同程度の投与量」は、薬剤のより重い重量を表すが、融合タンパク質の用量の中に本質的に同じモル当量の治療活性タンパク質を有するか、かつ／または治療活性タンパク質と比較してほぼ同じモル濃度を有することは、当技術分野では理解されるであろう。

治療活性タンパク質にムチンポリペプチドドメインを連結することによって高めることができる治療活性タンパク質の薬物動態（ＰＫ）特性には、半減期、曲線下面積（ＡＵＣ）、Ｃ_ｍａｘ、Ｔ_ｍａｘ、トラフ／ピーク濃度比、および分布容積が含まれる。ＰＫ特性の強化は、暴露の増加による有効性の向上、用量の減少による有害事象の減少、Ｃ_ｍａｘの低下、および投与頻度の減少につながり得る。実施例においてより完全に記載するとおり、本発明は、融合タンパク質に連結されていない対応する治療活性タンパク質と比較して、投与された融合タンパク質の半減期を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍またはそれ以上長くさせる、治療活性タンパク質に連結されたムチンドメインポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。

同様に、本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質に連結されていない対応する治療活性タンパク質と比較して、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％のＡＵＣの増加を有し得る。本発明の融合タンパク質の半減期およびＡＵＣの薬物動態パラメータは、投薬を含む標準的な方法、複数の時間間隔での血液試料の採取、およびＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、ラジオアッセイを用いるタンパク質のアッセイ、または当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載の他の方法によって決定することができ、続いて、データの標準的な計算を行い、半減期および他のＰＫパラメータを導くことができる。

半減期の増加は、ピーク／トラフ濃度比の減少をもたらし、複数回用量が送達されたときの濃度対時間プロファイルを平滑化する。より一貫した暴露は、有効性の向上だけでなく、高いＣ_ｍａｘ（超治療濃度（ｓｕｐｒａｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））によって促進される場合が多い有害事象の減少をもたらすことができる。個々の用量の持続時間の延長は、投与頻度も低減させ、（注射部位反応などの）任意の送達関連有害事象の減少、コンプライアンスの向上、および患者に対する利便性の追加をもたらす。

物理化学特性および医薬特性
治療薬のＰＫ特性を強化することに加えて、ムチンドメインポリペプチドへの融合は、治療活性ペプチドまたはタンパク質の医薬特性または（水溶解度の程度などの）物理化学的特性を向上させるのに有用であり得る。溶解度の向上は、ムチン上の高度に親水性の炭水化物の付加、ならびにアスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンなどのイオン化可能な残基をさらに含み得る適切なムチンポリペプチド配列の選択の両方を介して媒介され得る。イオン化可能な残基は、融合タンパク質のｐＩおよびそれによって特定の製剤中のタンパク質の全電荷の調節をもたらす。

本発明の融合タンパク質は、所望の特性をもたらす融合タンパク質の物理化学的特性を確認するために、本明細書に記載の方法を使用して、構築し、アッセイすることができる。一実施形態において、ムチンドメインポリペプチドは、融合タンパク質が、融合タンパク質に連結されていない治療活性タンパク質と比較して、融合タンパク質に連結されていない対応する治療活性タンパク質よりも少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、または少なくとも約１０００％上回る範囲内にある水溶性を有するように選択される。好ましいムチンドメインポリペプチド配列は、表Ｉから選択されるムチンドメインポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％の配列同一性を有し得る。

融合タンパク質の使用
別の態様において、本発明は、治療活性タンパク質によって媒介される疾患、障害または病状において有益な効果を達成するための方法を提供する。本発明は、比較的短い終末半減期および／もしくは最小有効量と最大耐量との間の狭い治療枠を有する治療活性タンパク質の欠点ならびに／または制限に対処する。

一実施形態において、本発明は、対象において有益な効果を達成するための方法であって、治療的または予防的有効量の融合タンパク質を対象へ投与するステップを含む方法を提供する。有効量は、疾患または障害を治療するうえで有益な効果をもたらし得る。場合によっては、有益な効果を達成するための方法は、ムチンドメインポリペプチドに連結されていない治療用タンパク質またはペプチドが、準最適な半減期を示す疾患および疾患カテゴリーについて対象を治療するために、治療有効量の融合タンパク質組成物を投与することを含み得る。他の場合において、有益な効果を達成するための方法は、治療用タンパク質またはペプチドが存在しない疾患および疾患カテゴリーについて対象を治療するために、治療有効量の融合タンパク質組成物を投与することを含み得る。さらに他の場合において、有益な効果を達成するための方法は、治療用タンパク質またはペプチドがそれぞれアゴニストまたはアンタゴニストとして準最適な刺激効果または準最適な阻害効果を示す疾患および疾患カテゴリーについて対象を治療するために、治療有効量の融合タンパク質組成物を投与することを含み得る。

本発明の組成物の投与により治療可能な疾患には、癌、炎症性疾患、関節炎、骨粗しょう症、特に肝炎における感染症、細菌感染症、ウイルス感染症、遺伝的疾患、肺疾患、１型糖尿病、２型糖尿病、ホルモン関連疾患、アルツハイマー病、心疾患、心筋梗塞、深部血管血栓症、循環器系疾患、高血圧症、低血圧症、アレルギー、鎮痛、小人症および他の増殖性疾患、中毒、ブロット凝固疾患、先天性免疫系の疾患、塞栓症、創傷治癒、火傷の治癒、クローン病、喘息、潰瘍、敗血症、緑内障、脳血管虚血、呼吸窮迫症候群、角膜潰瘍、腎疾患、糖尿病性足潰瘍、貧血、第ＩＸ因子欠損症、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏、粘膜炎、嚥下障害、血小板障害、肺塞栓症、不妊症、性腺機能低下症、白血球減少、好中球減少症、子宮内膜症、ゴーシェ病、肥満症、リソソーム蓄積症、エイズ、月経前症候群、ターナー症候群、悪液質、筋ジストロフィー、ハンチントン病、大腸炎、ＳＡＲＳ、カポジ肉腫、肝臓腫瘍、乳房腫瘍、神経膠腫、非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、腎細胞癌、肝腫瘍、リンパ腫、黒色腫、多発性硬化症、カポジ肉腫、乳頭腫ウイルス、肺気腫、気管支炎、歯周病、認知症、分娩、非小細胞肺癌、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、末端肥大症、乾癬、卵巣腫瘍、ファブリー病、リソソーム蓄積症が含まれるが、これらに限定されない。

一実施形態において、本方法は、同程度の用量で投与される、ムチンドメインポリペプチドに連結されていない治療活性タンパク質を含む医薬組成物の投与によって媒介される効果と比較して、融合タンパク質の治療活性タンパク質によって媒介される少なくとも１つのパラメータ、生理学的条件、または臨床転帰においてより大きな改善をもたらし、ムチンドメインポリペプチドに連結された治療活性タンパク質を含む融合タンパク質および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む治療有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。一実施形態において、この医薬組成物は、治療有効用量で投与される。別の実施形態において、この医薬組成物は、投薬期間の長さについて（本明細書で定義される）治療有効用量投与計画を使用して、複数の同時投与または連続投与により投与される。

延長された半減期などの本明細書に記載されるような融合タンパク質の強化された薬物動態学的パラメータの結果として、ムチンドメインポリペプチドに連結された治療活性タンパク質は、疾患、障害もしくは病状の症状または臨床的異常を予防、治療、緩和、逆転もしくは緩解するか、または治療されている対象の生存を延長するために、ムチンドメインポリペプチドに連結されていない対応する治療活性タンパク質と比較して、長い投与間隔を用いて投与され得る。

融合タンパク質の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する抗体または抗体部分の能力などの要因に従って変化し得る。治療有効量はまた、融合タンパク質の任意の毒性もしくは有害な効果を治療的に有益な効果が上回るものでもある。予防有効量は、所望の予防結果を達成するのに要する期間に必要とされる融合タンパク質の量を指す。

一実施形態において、治療方法は、本発明の融合ポリペプチドに連結されていない同程度の用量の治療活性タンパク質と比較して、治療活性タンパク質の半減期の増加をもたらす本発明の融合タンパク質を含む治療有効用量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。

別の態様において、本発明は、発現後の化学的カップリングを必要とする半減期延長技術に関連する製造の容易さを向上させ、ネイティブな治療活性タンパク質と比較して、安定性の増加、水溶性の増加、および／または製剤化の容易さをもたらす融合タンパク質の作製法を提供する。一実施形態において、本発明は、ムチンドメインポリペプチドに連結されていない治療活性タンパク質と比較して、生理学的条件下または治療上許容される製剤中で、得られた融合体の可溶性形態での高い濃度を達成することができるように選択されるムチンドメインポリペプチドに治療活性タンパク質を連結するステップを含む、治療活性タンパク質の水溶性を増加させる方法を含む。融合タンパク質に組み込まれた場合に、活性タンパク質の水溶性の増加を付与するムチンドメインポリペプチドの性質に寄与する要因には、高率のグリコシル化、グリカンの種類、およびムチンドメインポリペプチドのアミノ酸の電荷が含まれる。いくつかの実施形態において、本方法は、生理学的条件下で、または治療上許容される製剤中で、ネイティブな治療活性タンパク質と比較して、水溶性が、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約４００％、少なくとも約６００％、少なくとも約８００％、少なくとも約１０００％、少なくとも約２０００％、少なくとも約４０００％、または少なくとも約６０００％高い融合タンパク質をもたらす。

核酸配列
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする単離されたポリ核酸、および本発明の融合タンパク質をコードするポリ核酸分子に相補的な配列を提供する。別の態様において、本発明は、相同変異体を含む本発明の融合タンパク質をコードするポリ核酸および本発明の融合タンパク質に相補的な配列を生成する方法を包含する。一般的に、本発明は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を生成し、得られた遺伝子産物を発現する方法であって、ムチンドメインポリペプチドおよび活性タンパク質のそれぞれをコードするヌクレオチドを構築することと、構成要素をインフレームで連結することと、適切な発現ベクターにコード遺伝子を組み込むことと、発現ベクターで適切な宿主細胞を形質転換することと、融合タンパク質を形質転換された宿主細胞内で発現させることと、それによって本発明の融合タンパク質を産生することと、を含む方法を提供する。分子生物学における標準的な組換え技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを作製することができる。本発明によれば、融合タンパク質をコードする核酸配列を用いて、適切な宿主細胞における融合タンパク質の発現を指向する組換えＤＮＡ分子を作製してもよい。いくつかのクローニング戦略は、本発明を実施するのに適していることが想定され、これらの多くを用いて、融合タンパク質またはその相補体をコードする遺伝子を含むコンストラクトを作製することができる。一実施形態において、クローニング方法を用いて、活性タンパク質およびムチンドメインポリペプチドを含む単量体融合タンパク質をコードする遺伝子を作製する。この段落で説明される上述の実施形態において、この遺伝子はさらに、切断配列（複数可）をコードすることもできるスペーサー配列をコードするヌクレオチドを含むことができる。

一つのアプローチでは、最初に、融合タンパク質に対応するＤＮＡ配列を含むコンストラクトが調製される。活性タンパク質および／またはムチンポリペプチドドメインをコードするＤＮＡは、活性タンパク質のｍＲＮＡを保有し、それを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織または単離された細胞から、標準的な方法を用いて調製されるｃＤＮＡライブラリーから取得してもよい。必要であれば、ｃＤＮＡに逆転写されていない可能性のあるｍＲＮＡの前駆体およびプロセシング中間体を検出するために、コード配列は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらに記載されるような従来のプライマー伸長手順を用いて取得することができる。したがって、ＤＮＡは、そのような供給源から調製されたｃＤＮＡライブラリーから都合よく取得することができる。コード遺伝子（複数可）は、ゲノムライブラリから取得されるか、または公的に利用可能なデータベース、特許、または参考文献から取得されるＤＮＡ配列を用いて、当技術分野で公知の標準的な合成手順（例えば、自動核酸合成）によって作製することもできる。このような手順は、当技術分野で公知であり、科学文献および特許文献に十分に記載されている。例えば、配列は、活性タンパク質または活性タンパク質の断片もしくは変異体、またはムチンドメインポリペプチドのアミノ酸配列を含むＣＡＳレジストリまたはＧｅｎＢａｎｋデータベース内のエントリに対応する、ケミカルアブストラクトサービス（ＣＡＳ）の登録番号（アメリカ化学会発行）および／もしくはｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖのワールドワイドウェブ上で利用可能な米国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブページを通じて利用可能なＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号から取得することができる。

その後、活性タンパク質をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドは、例えば、生物系における高レベルのタンパク質発現のための適切な転写および翻訳配列の制御下にあるプラスミドまたは他のベクターであり得るコンストラクトにクローニングすることができる。後者のステップでは、例えば、ムチンドメインポリペプチドをコードする第２の遺伝子またはポリヌクレオチドは、活性タンパク質をコードする遺伝子（複数可）と隣接し、インフレームでコンストラクトにクローニングすることによって、活性タンパク質遺伝子のＮ末端および／またはＣ末端をコードするヌクレオチドに遺伝的に融合される。

その後、融合ポリペプチドをコードする、得られたポリヌクレオチドは、個別に発現ベクターにクローニングすることができる。核酸配列は、多様な方法によってベクターに挿入することができる。一般に、ＤＮＡは、当該分野で公知の技術を用いて適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（複数可）に挿入される。ベクター成分は、一般的に、シグナル配列、複製起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列のうちの１以上を含むが、これらに限定されない。これらの成分のうちの１以上を含む適切なベクターの構築は、当業者に公知の標準的なライゲーション技術を用いる。このような技術は当技術分野で公知であり、科学文献および特許文献で十分に説明されている。

適切なベクター、宿主、および発現系は、組換え発現の当業者に公知である。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であってもよい。両方の発現ベクターおよびクローニングベクターは、１以上の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含み、さらに宿主細胞内での組換えタンパク質の発現および翻訳後修飾を可能にする。

本発明はまた、本明細書に開示される単量体融合タンパク質組成物を発現するための宿主細胞も提供する。適切な真核宿主細胞の例としては、サッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、およびハンゼヌラ・ポリモルファなどの酵母宿主、ヨトウガＳｆ９細胞、スポドプテラ・フルギペルダＳｆ２１、およびハイファイブ（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）細胞などの昆虫宿主、マウス線維芽細胞（Ｃ１２７−ＢＰＶ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−ＤＨＦＲ、ＣＨＯ−ＮＥＯＳＰＬＡ、ＣＨＯ−ＧＳ）、およびマウス骨髄腫細胞（ＮＳＯ−ＧＳ）などの哺乳類宿主が挙げられるが、これらに限定されない。

発現させた融合タンパク質は、当技術分野で公知の方法によって、または本明細書に開示される方法によって精製することができる。ゲル濾過、アフィニティー精製、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびゲル電気泳動などの手順を使用してもよく、それぞれの手順は、それぞれの宿主細胞によって産生された融合タンパク質を回収し、精製するために調整されている。精製の方法は、Ｒｏｂｅｒｔ Ｋ.Ｓｃｏｐｅｓ,Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（タンパク質の精製：原理と実践）,Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒ.Ｃａｓｔｏｒ（編集）,Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ １９９４、および上記のＳａｍｂｒｏｏｋらで説明されている。多段階の精製分離は、ＢａｒｏｎらのＣｒｉｔ.Ｒｅｖ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.１０：１７９−９０（１９９０）およびＢｅｌｏｗらのＪ.Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ.Ａ.６７９：６７−８３（１９９４）にも記載されている。

医薬組成物
本発明は、本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、医薬組成物、融合タンパク質および少なくとも１種類の薬学的に許容される担体を含む。本発明の融合タンパク質は、ポリペプチドが水溶液または緩衝液などの薬学的に許容される担体ビヒクル、薬学的に許容される懸濁剤および乳剤と組み合わされる薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化することができる。非水性溶媒の例としては、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコールおよび植物油が挙げられる。治療用製剤は、レミントンの薬学、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ.編（１９８０）に記載されるように、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と、所望の純度を有する活性成分とを混合することによって貯蔵のために調製される。

医薬組成物は、経口、鼻腔内、非経口または吸入療法により投与することができ、錠剤、トローチ剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、アンプル剤、坐剤またはエアロゾルの形態を取ってもよい。医薬組成物はまた、水性もしくは非水性の希釈剤、シロップ剤、顆粒剤または散剤中の有効成分の懸濁液、溶液およびエマルジョンの形態をとってもよい。さらに、医薬組成物はまた、他の薬学的活性化合物または複数の本発明の化合物も含むことができる。

さらに具体的には、本医薬組成物は、経口、直腸、経鼻、（経皮、エアロゾル、頬側および舌下を含む）局所、膣、（皮下、注入ポンプによる髄腔内、筋肉内、静脈内および皮内を含む）非経口、硝子体内、および肺を含む任意の適切な経路によって治療のために投与されてもよい。好ましい経路は、治療薬、レシピエントの病状および年齢、ならびに治療される疾患に応じて変化することも理解されるであろう。

好ましい実施形態において、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適した医薬組成物としてルーチン手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。組成物が注入により投与される場合、無菌の医薬グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルに分注することができる。組成物が注射により投与される場合、成分が投与前に混合できるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。

別の好ましい実施形態において、医薬組成物は皮下に投与される。この実施形態において、本組成物は、投与前に再構成される凍結乾燥粉末として供給されてもよい。この組成物はまた、患者に直接投与することができる液体形態で供給されてもよい。一実施形態において、本組成物は、患者が容易に本組成物を自己投与することができるように、プレフィルドシリンジ中の液体として供給される。

別の実施形態において、本発明の組成物は、長期間にわたって制御された様式で有益な活性薬剤を送達することに有用性を示しているリポソームにカプセル化される。リポソームは、封入された水性容量を含む二重膜で閉じられている。リポソームはまた、単一の膜二重層を有する単層小胞または複数の膜二重層を有する多層小胞であってもよく、それぞれ水層によって隣のものから分離される。結果として生じる膜二重層の構造は、脂質の疎水性（非極性）尾部が二重層の中心に向かって方向付けられるが、親水性（極性）頭部は水相に向かって方向付けられるようになっている。一実施形態において、リポソームは、単核食細胞系の臓器、主に肝臓および脾臓による取り込みを回避する柔軟な水溶性ポリマーでコーティングすることができる。リポソームを囲むのに適した親水性ポリマーには、米国特許第６，３１６，０２４号、同第６、１２６，９６６号、同第６，０５６，９７３号および同第６，０４３，０９４号（これらの内容は、参照によりその全体が援用される）に記載のＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルタミドおよび親水性ペプチド配列が含まれるが、これらに限定されない。

リポソームは、当技術分野で公知の任意の脂質または脂質の組み合せで構成されてもよい。例えば、小胞形成脂質は、米国特許第６，０５６，９７３号および同第５，８７４、１０４号に開示されるようなホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、およびスフィンゴミエリンなどのリン脂質を含む天然脂質または合成脂質であってもよい。小胞を形成する脂質はまた、米国特許第６，０５６，９７３号にも開示されている１,２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシ）プロピル]−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル]−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；３[Ν−（Ν’，Ν'−ジメチルアミノエタン）カルバモイル]コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏl）；またはジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）などの糖脂質、セレブロシド、またはカチオン性脂質であってもよい。コレステロールも、米国特許第５，９１６，５８８号および同第５，８７４，１０４号に開示されているような小胞に安定性を付与するために適切な範囲で存在してもよい。

液体製剤については、所望の特性は、製剤が、静脈内、筋肉内、関節内、または皮下投与のための２５、２８、３０、３１、３２ゲージ針を通過することができる形態で供給されることである。

他の実施形態において、組成物は、ＣＮＳへの嗅覚路を通る活性薬剤の移動を可能にし、全身投与を減少させるために鼻腔内、頬側、または舌下経路を介して脳へ送達されてもよい。この投与経路のために一般的に使用される装置は、米国特許第６，７１５，４８５号に含まれる。この経路を介して送達される組成物は、ＣＮＳ投与を増加させるか、または特定の薬物に関連した全身毒性リスクを低減する総身体負荷を軽減し得る。皮下埋め込み型デバイスにおける送達のための医薬組成物の調製は、例えば、米国特許第３，９９２，５１８号、同第５，６６０，８４８号、および同第５，７５６，１１５号に記載されるものなどの当技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。

実施例
以下の実施例は、例示のために提供され、決して特許請求の範囲のように本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。

実施例１．ムチンドメイン融合コンストラクトの設計、調製、発現、および精製
１．ムチン化ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の設計
様々な長さのムチン化を有するＩＬ−１Ｒａの融合タンパク質を設計した。ムチンドメインの長さは、ムチンタンデムリピートの数を変化させることによって系統的に増加させた。融合タンパク質のムチン化ドメインは、ヒトＭＵＣ２０タンパク質由来のタンデムリピート（ＴＲ）に基づいていた。ＩＬ−１Ｒａと２ＴＲ、４ＴＲ、６ＴＲ、８ＴＲ、および１２ＴＲの融合タンパク質を設計し、それぞれＲＤＢ１８１３［配列番号１（タンパク質）；配列番号２（ＤＮＡ）］、ＲＤＢ１８１４［配列番号３（タンパク質）；配列番号４（ＤＮＡ）］、ＲＤＢ１８２６［配列番号５（タンパク質）；配列番号６（ＤＮＡ）］、ＲＤＢ１８１５［配列番号７（タンパク質）；配列番号８（ＤＮＡ）］、ならびにＲＤＢ１８１６［配列番号９（タンパク質）；配列番号１０（ＤＮＡ）］と命名した。４グリシン（ＧＧＧＧ（配列番号：２７））のリンカーを、ＩＬ−１Ｒａ配列のＣ末端と第１のムチンＴＲとの間、および２つのムチンＴＲの各セットの間に挿入した。精製を容易にするためにＨｉｓタグをＲＤＢ１８１３、ＲＤＢ１８１４、ＲＤＢ１８１５、およびＲＤＢ１８１６のＣ末端に付加し、ＦＬＡＧタグをＲＤＢ１８２６のＣ末端に付加した。

２．ムチン化エキセンジン−４融合タンパク質ＲＤＢ２２０３の設計
ヒトＭＵＣ２０タンパク質からの８ＴＲとエキセンジン−４の融合タンパク質を設計した：ＲＤＢ２２０３[配列番号２４]。４グリシン（ＧＧＧＧ（配列番号：２７））のリンカーを、エキセンジン−４配列のＣ末端と第１のムチンＴＲとの間、および２つのムチンＴＲの各セットの間に挿入した。精製を容易にするためにＨｉｓタグをＣ末端に付加し、スペーサー（ＧＧＧＧＳ（配列番号２８）を最後のＴＲとＨＩＳ−タグとの間に挿入した。

３．遺伝子合成
設計したコンストラクトの発現のための遺伝子合成を、標準的な方法を用いて行った。

４．哺乳類発現ベクターへの合成遺伝子のサブクローニング
Ａ）発現ベクターｐｃＤＮＡ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の調製
ｐｃＤＮＡ５μｇを、３７℃で２時間、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。この消化物を、５’リン酸を除去するために仔ウシアルカリホスファターゼで処理し、したがって、ベクターそれ自体の再連結を防止した。緩衝液を交換し、仔ウシアルカリホスファターゼ反応から塩を除去した。メーカーの推奨プロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎ社のＰＣＲのクリーンアップキットを使用した。ＤＮＡを、Ｈ20３０μｌで溶出した。

Ｂ）目的の遺伝子の調製
目的の遺伝子を、３７℃で２時間、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化反応を、０.８％ＳＹＢＲグリーンを用いるＥ−Ｇｅｌ（登録商標）クローンウェル（商標）装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で行った。目的の遺伝子に対応する断片をゲルのウェルの第２列から単離した。

Ｃ）ｐｃＤＮＡへの遺伝子のライゲーション反応
調製したｐｃＤＮＡ（ステップＡ）を、Ｔ４リガーゼの存在下で、ステップＢのＤＮＡと混合し、３０分間室温でインキュベートした。ライゲーション後、生成物をＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；大腸菌の化学的コンピテント菌株）に形質転換し、正しいクローンを採取し、−８０℃でグリセロールストックとして保存した。

５．ムチン化ＩＬ−１Ｒａおよびエキセンジン−４融合タンパク質の発現
全てのタンパク質を、製造業者のプロトコルに従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＣＨＯ細胞中で発現させた。簡単に述べると、トランスフェクションの前日に、細胞を０.５×１０^６細胞／ｍＬで播種し、トランスフェクションの日に、製造業者が推奨するとおりに細胞を１×１０^６細胞／ｍＬに調整した。１リットルのトランスフェクションについては、培地（ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の２本のチューブ（ＡおよびＢ）を調製し、それぞれ約１９ｍＬ含んでいた。ＤＮＡ１ｍｇをチューブＡに添加し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ試薬１ｍｌをチューブＢに添加した。両方のチューブの内容物を直ちに混合し、１５分間室温でインキュベートした。インキュベーション期間後に、混合物をＣＨＯ細胞１リットルにゆっくりと添加した。トランスフェクション後、これらの細胞を６〜７日間放置し、次いで上清を回収した。

６．ムチン化ＩＬ−１Ｒａおよびエキセンジン−４融合タンパク質の精製
Ｈｉｓタグ発現タンパク質の精製をニッケルカラム上で行った。タンパク質結合後、カラムを最大５カラム容積の緩衝液Ａ（５０ｍＭのトリスｐＨ８および５００ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。結合タンパク質を、イミダゾールの濃度を増加させて（２０〜５００ｍＭ）溶出した。精製タンパク質をＰＢＳに対して一晩透析した。

ＲＤＢ１８２６を抗ＦＬＡＧカラムで精製した。タンパク質結合後、カラムを最大５カラム容積のＰＢＳで洗浄した。タンパク質をｐＨ３で溶出し、トリス緩衝液ｐＨ７で直接中和した。精製タンパク質をＰＢＳに対して一晩透析した。

実施例２．ムチン化ＩＬ−１Ｒａコンストラクトの分子量およびｐＩ
ＩＬ−１Ｒａムチン融合タンパク質ＲＤＢ１８１３（ＩＬ１Ｒａ２ＴＲ）、ＲＤＢ１８１４（ＩＬ１Ｒａ４ＴＲ）、ＲＤＢ１８１５（ＩＬ１Ｒａ８ＴＲ）、およびＲＤＢ１８１６（ＩＬ１Ｒａ１２ＴＲ）をＳＤＳ／ＰＡＧＥを用いて特徴づけた（図１Ａ）。全てのコンストラクトの見かけの分子量は、ポリペプチド配列の計算された分子量よりも著しく高く、予想される高レベルのグリコシル化と一致した。ＲＤＢ１８１３、ＲＤＢ１８１４、ＲＤＢ１８１５、およびＲＤＢ１８１６のポリペプチドのそれぞれ計算された分子量は、２２ｋＤ、２６.２ｋＤ、３４.８ｋＤおよび４３.３ｋＤであり、ゲル上でのそれらの移動に基づくそれぞれの見かけの分子量は３５ｋＤ、４５ｋＤ、６５ｋＤおよび８０ｋＤである（図１Ａ；下）。

コンストラクトＲＤＢ１８１３（ＩＬ１Ｒａ２ＴＲ）、ＲＤＢ１８２６（ＩＬ１Ｒａ６ＴＲ）、ＲＤＢ１８１５（ＩＬ１Ｒａ８ＴＲ）、およびＲＤＢ１８１６（ＩＬ１Ｒａ１２ＴＲ）の等電点を、等電点電気泳動を用いて測定した（図１Ｂ）。全てのコンストラクトは、電荷に関して不均一であり、タンパク質のＰＩの周辺に複数のバンドがあった。タンパク質のＰＩは、大部分がポリペプチド配列に基づくそれらの計算されたＰＩと一致し、Ｏ−グリカンは高度にシアル化されていないことが示唆された。バンドの多重度は、Ｎグリコシル化の違いによる可能性が最も高い。

全てのコンストラクトを、スーパーデックス２００カラム（図２〜６）上での分析用ゲル濾過によってさらに特徴付けた。ゲルろ過は、未変性条件下でのそれらの流体力学容積に基づいてタンパク質を分離する（すなわち、ＳＤＳ／ＰＡＧＥとは異なり、非変性である）。溶出時間は、未知の球状タンパク質の見かけの分子量を算出することができるような球状タンパク質標準物質を用いて較正することができる。溶出時間は、実際の分子量よりも流体力学半径に直接関係しており、それらの計算された分子量よりも有意に高い見かけの分子量が、非球状（すなわち、細長いまたはロッド状）構造、高レベルのグリコシル化、および／または高レベルの水和を示唆する。

ゲルろ過では、ＲＤＢ１８１３、ＲＤＢ１８１４、ＲＤＢ１８２６、ＲＤＢ１８１５、およびＲＤＢ１８１６の見かけの分子量は、それぞれ４２ｋＤ、５０ｋＤ、１１８ｋＤ、１３９ｋＤ、および２３０ｋＤである（図２〜６）。全てのムチンコンストラクトの見かけの分子量は、（アミノ酸配列のみに基づく）それらの計算された分子量およびＳＤＳ／ＰＡＧＥ上での移動度の両方よりも著しく高かった。これらの観察は、高レベルのグリコシル化およびムチンコンストラクトの予想される棒状構造の両方と高度に一致する。

実施例３．ムチンＩＬ−１Ｒａコンストラクトのアンタゴニスト活性
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）は、ＮＦ−κＢ／ＡＰ−１分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子のＩＬ−１β誘導発現を監視することによって、生物活性のあるＩＬ−１βをインビトロで検出するように特別に設計されたヒト胚性腎臓細胞である。ＳＥＡＰは、ＳＥＡＰ検出試薬のＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）を使用した場合に容易に監視することができる。ＩＬ−１Ｒａは、ＩＬ−１ＲＩとの結合を介してＩＬ−１β誘導シグナルを阻害し、ＩＬ−１ＲＡｃＰの結合を阻止し、したがって完全なシグナル伝達複合体のアセンブリを阻止する。ムチンＩＬ１ＲａコンストラクトのＲＤＢ１８１３（ＩＬ１Ｒａ２ＴＲ）、ＲＤＢ１８１４（ＩＬ１Ｒａ４ＴＲ）、ＲＤＢ１８２６（ＩＬ１Ｒａ６ＴＲ）、ＲＤＢ１８１５（ＩＬ１Ｒａ８ＴＲ）、およびＲＤＢ１８１６（ＩＬ１Ｒａ１２ＴＲ）のＩＬ−１β誘発性ＳＥＡＰを阻害する能力を評価した。融合されたムチンドメインを欠くＩＬ１Ｒａ（アナキンラ）を陽性のアンタゴニスト対照として使用した。

ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β細胞を含む培地１００μＬを、５０,０００細胞／ウェルの最終濃度になるように９６ウェルマイクロタイタープレートに播種した。ムチンＩＬ１ＲａコンストラクトＲＤＢ１８１３（ＩＬ１Ｒａ２ＴＲ）、ＲＤＢ１８１４（ＩＬ１Ｒａ４ＴＲ）、ＲＤＢ１８２６（ＩＬ１Ｒａ６ＴＲ）、ＲＤＢ１８１５（ＩＬ１Ｒａ８ＴＲ）、およびＲＤＢ１８１６（ＩＬ１Ｒａ１２ＴＲ）を、１２ｎＭ（ＲＤＢ１８１３）、４.８ｎＭ（ＲＤＢ１８１４）、３４.５ｎＭ（ＲＤＢ１８２６）、２.４ｎＭ（ＲＤＢ１８１５）、および１１.６ｎＭ（ＲＤＢ１８１６）の初期濃度で調製し、その後、連続希釈して、２組ずつＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β細胞に試験試料を添加した。ＳＥＡＰを誘導するために、０.０１５ｎＭのＩＬ−１βを全ての試験試料中で使用した。０.１１７ｎＭのＩＬ−１βのみ、および１１.７６ｎＭのＩＬ１Ｒａ＋０.０１５ｎＭのＩＬ−１βを、陽性試料中で使用した。これらの試料を、３７℃で２０〜２４時間インキュベートし、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）アッセイを用いて評価した。

ムチン−ＩＬ１ＲａコンストラクトのＲＤＢ１８１３（ＩＬ１Ｒａ２ＴＲ）、ＲＤＢ１８１４（ＩＬ１Ｒａ４ＴＲ）、ＲＤＢ１８２６（ＩＬ１Ｒａ６ＴＲ）、ＲＤＢ１８１５（ＩＬ１Ｒａ８ＴＲ）、およびＲＤＢ１８１６（ＩＬ１Ｒａ１２ＴＲ）は、用量依存的にＩＬ−１β誘発性ＳＥＡＰ発現を阻害し、０．１〜０．１５ｎＭの対照（未修飾ＩＬ１Ｒａ）のＩＣ_５０値と有利に比較すると、それぞれのＩＣ_５０値は０.７２ｎＭ、０.３７ｎＭ、３.５ｎＭ、０.４２ｎＭの値、および０.５３ｎＭであった（図７〜９）。したがって、全てのムチン化コンストラクトの阻害活性は、未修飾ＩＬ１Ｒａ（非ムチン化）タンパク質対照の数倍以内である。

実施例４．ムチンＩＬ−１ＲａのＩＬ−１ＲＩへの結合親和性
ＩＬ−１ＲI_Ｆｃ（融合タンパク質）を、ヒト抗体捕捉キット（ＧＥヘルスケア社）を用いてビアコア（商標）センサーチップ上に固定化した。未修飾ＩＬ−１Ｒａ（陽性結合対照）、ＲＤＢ１８１３（ＩＬ１Ｒａ２ＴＲ）、ＲＤＢ１８１４（ＩＬ１Ｒａ４ＴＲ）、ＲＤＢ１８１５（ＩＬ１Ｒａ８ＴＲ）、ＲＤＢ１８１６（ＩＬ１Ｒａ１２ＴＲ）、およびＲＤＢ１８２６（ＩＬ１Ｒａ６ＴＲ）を５つの濃度：２０ｎＭ、６.６ｎＭ、２.２ｎＭ、０.７４ｎＭおよび０.２４ｎＭでチップ上に流した。最初のサイクルでは、０.２４ｎＭ濃度の特定のコンストラクトを、チップの表面に結合したリガンド上に１８０秒間流し、その後、分析物を解離させるためにブランク溶液を表面上に通過させた。同じ手順を、各コンストラクトについて０.７４〜２０ｎＭの濃度の増加を使用して、さらに４回繰り返した。得られたセンサーグラムを、これらのコンストラクトの結合親和性を計算するために、ネイティブ機器ソフトウェアを用いて分析した（図１０〜１４）。

細胞ベースアッセイからのそれらの活性データと一致して、全てのコンストラクトは、ＩＬ−１ＲＩに対する強力な結合親和性を保持していた。ＲＤＢ１８１３（ＩＬ１Ｒａ２ＴＲ）、ＲＤＢ１８１４（ＩＬ１Ｒａ４ＴＲ）、ＲＤＢ１８２６（ＩＬ１Ｒａ６ＴＲ）、１８１５ＲＤＢ（ＩＬ１Ｒａ８ＴＲ）、およびＲＤＢ１８１６（ＩＬ１Ｒａ１２ＴＲ）についてのＩＬ−１ＲＩに対する計算された結合定数（Ｋ_Ｄ）は、それぞれ２４０ｐＭ、６４ｐＭ、５２６ｐＭ、１６０ｐＭ、および９００ｐＭであった。したがって、ムチン化コンストラクトの結合親和性は、Ｋ_Ｄが５２ｐＭであると決定された未修飾ＩＬ−１Ｒａよりも４.６倍（ＲＤＢ１８１３）、１.２倍（ＲＤＢ１８１４）、１０倍（１８２６ＲＤＢ）、３.１倍（ＲＤＢ１８１５）、および１７.３倍（ＲＤＢ１８１６）高い。ＩＬ−１ＲＩに対して最も弱い親和性を有するコンストラクト（すなわち、ＲＤＢ１８１６）は、連続するムチンタンデムリピートの最大数（１２ＴＲ）を有していたことに留意することが重要である。したがって、ＲＤＢ１８１６（Ｋ_ｄ＝１.４×１０^−４）の解離速度（Ｋ_ｄ）が、未修飾ＩＬ−１Ｒａ（Ｋ_ｄ＝１.５×１０^−４）と同じであるように、ＲＤＢ１８１６の親和性の減少は、未修飾ＩＬ−１Ｒａ（Ｋ_ａ＝２．８×１０^６）と比較した場合のより遅い会合速度（Ｋ_ａ＝１.５×１０^５）が主な原因であり、おそらくより遅いタンブリング速度が原因であった。

実施例５．ＲＤＢ１８１６のインビボ有効性
ＲＤＢ１８１６（ＩＬ１Ｒａ１２ＴＲ）の作用の有効性および持続時間を、マウスコラーゲン抗体誘発性関節炎（ＣＡＩＡ）モデルで評価した。このモデルにおいて、未修飾ＩＬ−１Ｒａは、６ｍｇ／ｋｇ／時間の速度で連続注入した場合に活性があるが、その非常に短い半減期により、２０ｍｇ／ｋｇの単回用量としては効果がない。

群当たり８匹のｎでのマウスＣＡＩＡモデルの実験計画を図１５に示す。簡単に説明すると、マウスにおける関節炎を、抗コラーゲン抗体カクテルの静脈内（ＩＶ）注射により開始する。３日後、炎症反応をリポ多糖（ＬＰＳ）の腹腔内（ＩＰ）注射によりブーストし、同時に、試験化合物ＲＤＢ１８１６（２０ｍｇ／ｋｇ）およびアナキンラ（未修飾ＩＬ−１Ｒａ、２０ｍｇ／ｋｇ）、ならびに生理食塩水対照を皮下（ＳＣ）送達した。炎症の程度を評価するために、足の体積を複数の日にわたって測定した。

マウスＣＡＩＡ実験の結果を図１６に示す。アナキンラ処置群は、生理食塩水対照と比較して炎症の低下を示さなかった。これは、アナキンラの連続注入がこのモデルにおいて有効であるので、低暴露をもたらすその短い半減期に起因する。著しく対照的に、生理食塩水処置およびアナキンラ処理群の両方と比較して、足の体積の著しい減少がＲＤＢ１８１６処置マウスにおいて観察された。したがって、ムチン化が、ＩＬ−１Ｒａ分子の暴露を著しく増加させ、薬力学的効果を引き出した。

実施例６．ＲＤＢ１８１５およびＲＤＢ１８１６の薬物動態（ＰＫ）
２種類のＩＬ−１Ｒａムチン融合ポリペプチドコンストラクト：ＲＤＢ１８１５およびＲＤＢ１８１６の半減期を決定するために、ラットにおいて薬物動態学的研究を行った。用量群あたりｎ＝３匹のラットで、ＲＤＢ１８１５の単回用量を皮下（５.６ｍｇ／Ｋｇ）または静脈内（２.１ｍｇ／Ｋｇ）に送達し、ＲＤＢ１８１６の単回用量を皮下（６．４ｍｇ／Ｋｇ）または静脈内（２.４ｍｇ／Ｋｇ）に送達した。血液を６日間にわたって様々な時点で採取し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１Ｒａについて分析した。

薬物動態学的データ（図１７）から、ＲＤＢ１８１５およびＲＤＢ１８１６の半減期は、ＩＶによる場合にはそれぞれ１７.９ｈおよび１３.９ｈと計算され、ＳＣによる送達の場合にはそれぞれ１１．０ｈおよび８．０ｈと計算された。これは、未修飾のＩＬ−１Ｒａ対照（アナキンラ）について報告された値を上回る１０倍〜１４倍の半減期の延長を示す。その結果、ＲＤＢ１８１５およびＲＤＢ１８１６の両方の暴露は、著しく増加し、マウスＣＡＩＡモデルにおいて観察された有効性と一致する。

実施例７．ムチン−エキセンジン−４コンストラクトＲＤＢ２２０３の分子量
ＲＤＢ２２０３を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびスーパーデックス２００カラムでの分析用ゲル濾過を用いて特徴付けた。ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより、ＲＤＢ２２０３の見かけの分子量は約４５ｋＤであり、その計算されたポリペプチドの分子量２２.８ｋＤの約２倍であり、高レベルのグリコシル化と一致する（図１８：左上の分子マーカー）。分析用ゲル濾過により、ＲＤＢ２２０３の見かけの分子量は、高度にグリコシル化されたムチンドメインによって付与される巨大流体力学半径により、１２０ｋＤ（１５８ｋＤと７５ｋＤの標準物質の間の単一ピーク）である（図１９）。

実施例８．ＲＤＢ２２０３の生物活性
ＧＬＰ−１受容体をアゴナイズするＲＤＢ２２０３の能力を、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ社のＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ ｅＸｐｒｅｓｓ ＧＬＰ−１受容体ｃＡＭＰアッセイを用いて測定した。このアッセイを、製造業者の指示に従って実行した。結果は、ＲＤＢ２２０３がＧＬＰ−１受容体の強力なアゴニストであり、１.５ｎＭのＥＣ_５０を示し、これは未修飾のエキセンジン−４（０．０７ｎＭのＥＣ_５０）よりも約２１倍効力が低い（図２０）。

実施例９．ＲＤＢ２２０３の薬物動態プロファイル
ラットにおいて、ＲＤＢ２２０３を０.６５ｍｇ／ｋｇで静脈内に、０.６５ｍｇ／ｋｇおよび７.０ｍｇ／ｋｇで皮下に投与した。非ムチン化エキセンジン−４と比較して、ＲＤＢ２２０３は、半減期の増加（２.０時間対０.５時間、ｉｖ）およびクリアランスの低下（７４ｍｌ／時／ｋｇ対２００ｍｌ／時／ｋｇ、ｉｖ）を示し、総暴露の増加をもたらした（¹Ａｉ,Ｇ.,ｅｔ ａｌ.；Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｅｘｅｎｄｉｎ−４ ｉｎ Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；１７（２００８）６−１０）（図２１）。皮下経路を介して、ＲＤＢ２２０３も、未修飾エキセンジン−４の６５％と比較して、９５％を超えるバイオアベイラビリティの向上を示した（図２１）。

本明細書で言及される特許および科学文献は、当業者に利用可能である知識を確立する。本明細書に引用される全ての米国特許および公開されたまたは未公開の米国特許出願は、参照により援用される。本明細書で引用される公開された全ての外国特許および特許出願は、参照により本明細書に援用される。本明細書で引用される公開された全ての他の参考文献、文書、原稿および科学文献は、参照により本明細書に援用される。

本発明は、特にその好ましい実施形態を参照して示し、説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細における様々な変更がなされ得ることは当業者に理解されるであろう。また、本明細書に記載の実施形態は相互に排他的ではなく、様々な実施形態の特徴は、本発明に従って全体的にまたは部分的に組み合わせることができることも理解されたい。

Claims (27)

1. 少なくとも１つの活性タンパク質に結合したムチンドメインポリペプチドを含む融合タンパク質であって、前記ムチンドメインポリペプチドに融合されていない対応する活性タンパク質と比較して、前記活性タンパク質の少なくとも１つの薬物動態学的、薬理学的または物理化学的特性が向上している融合タンパク質。
2. 前記ムチンドメインポリペプチドに融合されていない対応する活性タンパク質と比較して、前記活性タンパク質を含む融合タンパク質の少なくとも１つの薬物動態特性が向上している、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 前記活性タンパク質が治療活性タンパク質であり、向上した薬物動態特性が、前記ムチンポリペプチドに連結されていない場合の対応する治療活性タンパク質と比較しての半減期の増加である、請求項１に記載の融合タンパク質。
4. 融合タンパク質の半減期が、前記ムチンポリペプチドに連結されていない場合の対応する治療活性タンパク質の半減期よりも２倍増加している、請求項３に記載の融合タンパク質。
5. 半減期の延長が、同程度の治療有効量の前記融合タンパク質および前記治療活性タンパク質のそれぞれを対象に投与した後に血中濃度を測定することによって決定される、請求項３に記載の融合タンパク質。
6. 変更される前記物理化学的特性が、前記ムチンドメインポリペプチドに連結されていない対応する活性タンパク質と比較したときの、前記活性タンパク質を含む融合タンパク質の溶解度の増加である、請求項１に記載の融合タンパク質。
7. さらに、前記ムチンポリペプチドと前記活性タンパク質との間にリンカー配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
8. 前記活性タンパク質が治療タンパク質である、請求項１に記載の融合タンパク質。
9. ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３Ａ、ＭＵＣ３Ｂ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７、ＭＵＣ８、ＭＵＣ９、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１５、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ１９、ＭＵＣ２０、およびＭＵＣ２１からなる群から選択されるＭＵＣ遺伝子によってコードされるムチンドメインポリペプチド配列の全てまたは一部を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
10. 膜貫通免疫グロブリンおよびムチンドメイン（ＴＩＭ）ファミリータンパク質、フラクタルカイン（ニューロタクチン）、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１、ＣＤ１６２）、ＣＤ３４、ＣＤ４３（ロイコシアリン、シアロホリン）、ＣＤ４５、ＣＤ６８、ＣＤ９６、ＣＤ１６４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭＡｄＣＡＭ、赤血球グリコホリン、グリコカリシン、グリコホリン、ＬＤＬ−Ｒ、ＺＰ３、エンドシアリン、崩壊促進因子（ｄａｆ、ＣＤ５５）、ポドカリキシン、エンドグリカン、アルファジストログリカン、ニューロファスシン、ＥＭＲ１、ＥＭＲ２、ＥＭＲ３、ＥＭＲ４、ＥＴＬまたはエピグリカニンの遺伝子によってコードされるムチンドメインポリペプチド配列の全部または一部を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
11. １〜２５個のタンデムリピートを含む、請求項９に記載の融合タンパク質。
12. 総残基が３２〜２００個のムチンドメインポリペプチドを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
13. 請求項１に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
14. 請求項１３に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
15. さらに、前記ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された組換え調節配列を含む、請求項１４に記載の発現ベクター。
16. 請求項１５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
17. 免疫グロブリン分子またはその任意の一部ではない治療タンパク質である活性タンパク質に連結されたムチンドメインポリペプチドを含む融合タンパク質。
18. 前記ムチンドメインポリペプチドに融合されていない対応する活性タンパク質と比較して、活性タンパク質の少なくとも１つの薬物動態学的、薬理学的または物理化学的特性が向上している、請求項１７に記載の融合タンパク質。
19. 前記治療活性タンパク質の半減期が、前記ムチンドメインポリペプチドに連結されていない場合の治療活性タンパク質の半減期と比較して、ムチンドメインポリペプチドに融合された場合に少なくとも２倍増加する、請求項１８に記載の融合タンパク質。
20. ａ）治療活性タンパク質を提供することと；
    ｂ）前記治療活性タンパク質をムチンドメインポリペプチドに連結し、融合タンパク質を形成することと；
    ｃ）対象に治療有効用量を投与した後に、融合タンパク質の血清半減期を測定し、同程度の治療量で投与された場合にのみ対応する治療タンパク質と比較して、半減期が増加していると決定することと
    を含む治療活性タンパク質の血清半減期を延長させる方法。
21. 連結ステップが、アミノ酸リンカーを介してムチンドメインポリペプチドに前記活性タンパク質を連結することを含む、請求項２０に記載の方法。
22. 請求項１〜２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
23. 請求項１８に記載の治療有効量の医薬組成物を、それを必要としている患者に投与することを含む、疾患もしくは障害または病状を治療する方法。
24. 前記疾患もしくは障害または病状が、２型糖尿病、血友病、好中球減少症、貧血、血小板減少症、関節リウマチ、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊柱炎、変形性関節症から選択される、請求項１９に記載の方法。
25. 前記医薬組成物が皮下、筋肉内または静脈内に投与される、請求項２３に記載の方法。
26. 前記治療有効用量が、同程度の治療用量で投与された対応する治療タンパク質単独と比較して、前記融合タンパク質の半減期の２倍の増加をもたらす、請求項２３に記載の方法。
27. 前記活性タンパク質が、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、成長ホルモン、エリスロポエチン、アンギオゲニン、Ｇ−ＣＳＦ、ナトリウム利尿ペプチド、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１１、ＩＬ−３６Ｒａ、ＩＬ−３７、ＩＬ−３８、エキセンジン−４から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。

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