CN109251896A - 一株高表达hKLs-his蛋白的细胞株及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高表达hKLs‑his蛋白的细胞株CHO‑hKLs‑his‑12#及其制备方法和应用。所述细胞株于2018年6月4日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：C2018116。本发明通过将人源klotho基因CDS序列与His标签序列连接后插入到真核表达载体的多克隆酶切位点处，构建含有klotho基因的重组质粒，并将重组质粒线性化后转染CHO细胞，经药物筛选后得到具有抗生素抗性的阳性细胞克隆即得。意外获得了表达量突出的细胞株CHO‑hKLs‑his‑12#，其蛋白表达含量在上清中能达到1μg/mL以上，且有很好的稳定性和可靠性，具有较好的市场前景。

Description

一株高表达hKLs-his蛋白的细胞株及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一株高表达hKLs-his蛋白的细胞株及其制备方法和应用。
背景技术
klotho基因是1997年日本科学家在小鼠体内发现的一种“抗衰老”基因，该基因的缺失导致小鼠表现出多种类似人类衰老的表型，而过表达该基因则能延长小鼠的寿命。klotho基因表达缺失的小鼠(KL小鼠)作为一种衰老动物模型，被广泛应用于衰老相关的遗传学与信号转导通路研究中。因此，通过该模型研究klotho基因调控衰老的分子机制对理解人类衰老有重要的启发性意义。
研究表明klotho基因编码一种单跨膜蛋白，称为Klotho蛋白。该蛋白有三个家族成员分别是α-Klotho蛋白、β-Klotho蛋白和γ-Klotho蛋白。膜型Klotho蛋白分子量约为130kDa，由膜外、跨膜、膜内三个结构域组成。其中膜外结构域较大，有两个内在重复功能域(KL1和KL2)，膜内结构域最小只有10个氨基酸。Klotho蛋白的膜外结构域在膜结合蛋白酶ADAM10和ADAM17的酶切作用下从细胞质膜上脱落形成了分泌或可溶形式的Klotho蛋白。此外，klotho基因转录产物的选择性剪切也能够形成分泌型的Klotho蛋白。分泌型的Klotho蛋白有两种形式，一种是仅有Klotho蛋白N端的KL1结构域，这种形式在人类中占主导，即hKLs(human secreted Klotho)；另外一种则是由膜外结构域构成，在小鼠中占主要形式。分泌型的Klotho蛋白从细胞中释放进入血液、尿液和脑脊液参与体液循环，因此很可能作为一种激素类分子信号，执行Klotho蛋白系统性的远程调节功能。分泌型Klotho蛋白具有重要的生物学功能：分泌型Klotho可以和FGFR1结合，调控FGF信号通路，同时维持骨髓来源的间充质干细胞的干性；分泌型Klotho可以抑制胰岛素和胰岛素样生长因子IGF1信号，从而延长寿命、保护心脑血管、抑制肿瘤细胞增殖等；外周注射Klotho蛋白可以改善神经退行性疾病模型小鼠大脑认知能力，为后续临床上利用该蛋白治疗相关神经性疾病提供新的实验依据。但是由于只有少数组织分泌Klotho蛋白，且分泌量不高，在取材方面存在一定的困难。因此建立一种高表达分泌型hKLs的细胞系对于研究分泌型Klotho蛋白的生物学功能，以及衰老机制和临床研究有着重要的意义。
目前尚未见能够从体外获取大量(高表达)hKLs纯化蛋白的方法或相关报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，通过将人源klotho基因KL1开放阅读框序列与His标签序列连接，并插入到真核表达载体pcDNA3.1(-)的多克隆酶切位点处，得到的重组质粒pcDNA3.1(-)-hKLs-his，通过将该重组质粒导入哺乳动物细胞，经药物筛选后能得到高表达hKLs-his蛋白的细胞株。
本发明的目的在于提供一株高表达hKLs-his蛋白的细胞株CHO-hKLs-his-12#。
本发明的另一目的在于提供上述细胞株分泌的人源hKLs-his蛋白。
本发明的另一目的在于提供上述细胞株在分泌表达hKLs-his蛋白中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明首先提供一种重组质粒，包含人源klotho基因CDS序列与His标签序列连接后得到的重组序列。
优选地，所述人源klotho基因KL1开放阅读框(CDS)序列与His标签序列连接，并插入到真核表达载体pcDNA3.1(-)的多克隆酶切位点BamHI与HindIII之中，得到重组质粒pcDNA3.1(-)-hKLs-his。
所述重组质粒中除了包含插入编码hKLs蛋白的基因的序列外，还含有组氨酸6×His标签序列，便于后期的纯化和检测。
本发明还请求保护一株高表达hKLs-His蛋白的中国仓鼠卵巢细胞株CHO-hKLs-his-12#，所述细胞株于2018年6月4日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2018116，保藏地址为中国·武汉·武汉大学。
优选地，所述细胞株包含上述重组质粒。
本发明还请求保护上述细胞株的制备方法，包括如下步骤：
S1.将人源klotho基因CDS序列与His标签序列连接，将得到的重组序列插入到真核表达载体的多克隆位点处BamHI与HindIII之中，构建含有klotho基因的重组质粒；
S2.将S1所得重组质粒线性化后转染哺乳动物细胞，经药物筛选后得到具有抗生素抗性的阳性细胞克隆，即得。
S3.将S2所得的细胞克隆进行无血清驯化悬浮培养，用于生产hKLs-his蛋白。
优选地，S1中所述真核表达载体为pcDNA3.1(-)。
优选地，S2中所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞CHO。
优选地，S2中所述转染的方法为使用Lipofectamine 2000转染法。利用Lipofectamine2000转染线性化质粒法建立细胞系，hKLs-his蛋白表达稳定，在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平。
优选地，S2中所述药物为遗传霉素(Geneticin)G418。
优选地，S3中使用的无血清悬浮培养基为商业化CD FortiCHOTM(Gibco)培养基。
本发明还请求保护上述细胞株在分泌表达或制备hKLs-his蛋白中的应用。
一种细胞株CHO-hKLs-his-12#分泌表达hKLs-his蛋白的方法，将细胞株CHO-hKLs-his-12#进行悬浮驯化培养，再将驯化好的细胞株以3.75×105个/mL的密度接种到无血清悬浮培养基中进行悬浮培养3天后，回收细胞上清液，经抗His标签琼脂糖珠亲和纯化后即得hKLs-his蛋白。
具体为，将悬浮驯化后的细胞株CHO-hKLs-his-12#按照3.75×105个/mL的密度接种到FortiCHO培养基中，于37℃在5％CO2培养箱中培养三天，回收上清，经抗His标签琼脂糖珠亲和纯化后即得hKLs-his蛋白。
本发明发现若细胞的初始培养密度过低时，会使培养时间过长，从而导致分泌的蛋白发生降解；若细胞的初始培养密度过高时，由于后期表达量会逐渐趋于稳定，过高的细胞密度并不会增加蛋白的表达量，反而会增加生产成本；因此，综合考虑，选择细胞培养密度为3.75×105个/mL，培养时间为3天，此时hKLs-his蛋白表达含量在上清中能达到1μg/mL，显著优于现有技术中的常规的真核表达分泌蛋白产量。
本发明还请求保护细胞株CHO-hKLs-his-12#分泌的人源hKLs-his蛋白。
此外，本发明还请求保护上述细胞株CHO-hKLs-his-12#或其分泌的hKLs-his蛋白在制备抗衰老制剂中的应用，具体为在制备治疗和/或改善衰老相关疾病的制剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过将人源klotho基因CDS序列与His标签序列连接后插入到真核表达载体的多克隆酶切位点处，构建含有klotho基因的重组质粒，并将重组质粒转染CHO细胞，经药物筛选后得到具有抗生素抗性的阳性细胞克隆，意外获得了表达量特点突出的细胞株CHO-hKLs-his-12#，其蛋白表达含量在上清中能达到1μg/mL。细胞株CHO-hKLs-his-12#分泌hKLs-his蛋白到培养基中，通过抗His标签琼脂糖珠亲和纯化来提纯hKLs蛋白，成本低廉、蛋白纯度高，具有很好的稳定性和可靠性。该发明为获得大量分泌型Klotho蛋白用于抗衰老基础研究和临床转化提供技术支撑，同时纯化所得蛋白也具有很好的市场前景。
附图说明
图1为实施例1中筛选高表达细胞株鉴定结果图。
图2为实施例2中CHO-hKLs-his-12#细胞驯化流程图。
图3为实施例3中CHO-hKLs-his-12#细胞系克隆上清液中hKLs-his蛋白免疫印迹(Western blot)检测结果。
图4为实施例3中细胞培养上清液中hKLs-his蛋白定量结果。
图5为实施例4中超滤浓缩后考马斯亮蓝染色鉴定纯化结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
DMEM(商业化培养基CorningTM10-013-CVR)；抗生素P/S(1:1000稀释使用，Gibco货号15140122)；终浓度10％胎牛血清(Gibco货号10437028)；非必需氨基酸NEAA(1:100稀释使用，Gibco货号11140050)；CD FortiCHOTM培养基(商业化培养基Gibco货号A1148301)；GlutaMAXTM(1:100稀释使用，Gibco货号35050061)。
实施例1稳定表达hKLs-his细胞系的构建与检测
1、编码hKLs-his蛋白的基因序列设计及制备
(1)编码hKLs-his蛋白的基因序列设计
以人源klotho开放阅读框KL1结构域序列(SEQ ID NO:1)为模板，设计用于编码表达重组hKLs蛋白(SEQ ID NO:2)的特异性引物KL-his-F(SEQ ID NO:3)和KL-his-R(SEQ IDNO:4)。KL-his-F在起始密码子前面加入BamHI酶切位点以及保护碱基。KL-his-R在hKLs编码末端加有终止子、HindIII酶切位点与保护性碱基，并在终止子前加入编码6×His的碱基序列，以在真核表达的hKLs蛋白C端加入6×His标签。
(2)编码hKLs-his重组蛋白的核酸片段制备
以人源KL的cDNA为模板，加入引物KL-his-F和KL-his-R进行基因扩增。扩增体系如表1所示。
表1扩增体系
组分 体系
2×KOD Buffer 25μL
dNTP 10μL
Primer Pairs(均为5μM) 3μL
cDNA 0.4μL
KOD Enzyme 1.0μL
H<sub>2</sub>O 10.6μL
扩增条件为94℃预变性2分钟，再进行32个循环；循环条件为98℃变性10秒，63℃退火10秒，68℃延伸100秒；最后68℃延伸10分钟。
2、重组质粒的构建
将真核表达载体pcDNA3.1(-)用BamHI和HindIII双酶切后回收，然后与经BamHI和HindIII双酶切后回收的hKLs-his基因扩增产物在T4连接酶作用下连接，转化DH5α感受态细胞后涂布在含氨苄的LB平板，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，进行测序鉴定，鉴定的阳性质粒即为所需重组质粒，命名为pcDNA3.1(-)-hKLs-his。
3、重组hKLs-his质粒转染细胞
为构建稳定表达hKLs-his的真核细胞系，利用Lipofectamine 2000转染法将BglII线性化重组质粒pcDNA3.1(-)-hKLs-his转染入CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)，具体步骤如下：
用FastDigest BglII酶切线性化pcDNA3.1(-)-hKLs-his，回收纯化线性化的pcDNA3.1(-)-hKLs-his。转染前一天，在六孔板中接种CHO细胞，于37℃、5％CO2、含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基中培养，至转染时细胞密度为40％～60％。在250μL Opti-MEM减血清培养基中稀释5μg线性化回收的pcDNA3.1(-)-hKLs-his，并轻轻混匀。另取10μLLipofectamine 2000，稀释于250μL Opti-MEM减血清培养基中。室温下静置5分钟。混合Lipofectamine 2000和线性化质粒的稀释液。轻轻混匀并在室温下静置20分钟。向细胞板上接种CHO细胞的孔中加混合液500μL，并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养液混匀，转入CO2培养箱中培养。次日更换新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基中继续培养。
4、阳性克隆的筛选
转染细胞培养约48小时后，在细胞培养基中加入G418(Geneticin，遗传霉素)使其终浓度为100μg/mL，再48小时后换入G418终浓度为100μg/mL的新鲜完全培养基培养细胞。此后每隔2天换含100μg/mL G418的新鲜完全培养基培养2天，重复6次。消化、收集细胞，用有限稀释法将细胞分在96孔板中，加入含100μg/mL的G418完全培养基培养10天左右。挑取96孔板中由单个细胞增殖来的一团细胞到1个24孔板中，待其长到合适的数量后，消化、收集细胞，传代到12孔板中。重复此过程，将细胞依次培养在6孔板、60mm培养皿、100mm培养皿，并保种。
5、阳性克隆的鉴定
将克隆细胞在培养皿中培养2天，收集细胞并裂解，用Western blot进行鉴定，以获得克隆细胞中hKLs-his的表达情况。利用抗His标签的特异性抗体检测，发现1#、2#、5#、8#、12#克隆中有hKLs-his的表达，但表达量有差异，其中12#表达量最高(图1)。其主要原因是：其一，外源质粒片段整合入细胞染色体的位置不同，导致目的基因的转录活性不同；其二，不同的细胞克隆，插入基因组的质粒的拷贝数是不同的。因此，选择hKLs-his表达量较高的12号细胞克隆继续扩大培养后保存，将该细胞系命名为中国仓鼠卵巢细胞株CHO-hKLs-his-12#，所述细胞株于2018年6月4日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2018116，保藏地址为中国·武汉·武汉大学。以进行后续实验。
实施例2 CHO-hKLs-his12#细胞悬浮培养的驯化过程
1、配制细胞驯化培养基
基本完全培养基(A液)，包括：包括：DMEM、抗生素P/S(1:1000)、终浓度10％胎牛血清、非必需氨基酸NEAA(1:100)。
无血清悬浮培养基(B液)，包括：CD FortiCHOTM培养基、抗生素P/S(1:1000)、非必需氨基酸NEAA(1:100)、GlutaMAXTM(1:100)。
A液和B液的详细配置方法(以500mL为例)如表2所示。
表2完全培养基(A液)和悬浮培养基(B液)的配方
2、驯化培养
将实施例1意外得到的细胞株CHO-hKLs-his-12#接种到A液培养，细胞密度调整为3.75×105个/mL。于37℃、5％CO2条件下培养三天，传代。在保证细胞生理状态稳定无污染的前提下，每次传代增加10％B液，直至基础培养基A液完全被无血清培养基B液取代，用于悬浮培养的细胞驯化完成(图2)。
实施例3悬浮培养细胞上清液中hKLs-his蛋白的鉴定与定量
1、收集培养上清(Conditioned Medium)
将实施例2中驯化好的CHO-hKLs-his-12#接种到FortiCHO培养基中悬浮培养，细胞密度调为3.75×105个/mL，于37℃、5％CO2条件下培养三天，回收上清，用于鉴定hKLs-his蛋白的表达。
2、三氯乙酸(TCA)沉淀上清液中蛋白
(1)收集细胞培养上清，于12,000g离心1分钟除去细胞碎片，将上清转移至一个新的离心管中。
(2)每1mL样品加入10μL BSA工作液(工作液浓度1mg/mL，常用NEB限制性内切酶配置的BSA稀释10倍后使用)。
(3)再加入冰冻的100％TCA(5g三氯乙酸用2.27mL水来溶解，所得溶液即100％三氯乙酸溶液)至混合溶液中TCA的终浓度为25％。混匀后-20℃冻存5分钟，冰上放置1小时或4℃过夜。
(4)于4℃条件下12,000g离心15分钟，除去上清，小心不能弃掉沉淀(沉淀可能看不到)。
(5)加入1mL冰冻丙酮洗涤沉淀，4℃条件下12,000g离心5分钟，然后重新冰冻丙酮洗涤一次。打开离心管盖子，于65℃下处理10分钟除去剩余丙酮。
(6)加入45μL 2×蛋白上样缓冲液，沸水浴中煮15分钟，然后进行SDS-PAGE和Western blot标准实验。结果表明CHO-hKLs-his-12#细胞可以分泌目的蛋白hKLs-his至培养基上清中(图3)。
3、悬浮培养细胞上清分泌型Klotho蛋白定量
(1)配制浓度梯度的BSA蛋白标准样，选取2000ng/μL、200ng/μL、100ng/μL、50ng/μL、25ng/μL、5ng/μL各取32μL加8μL的5×loading buffer，混匀后沸水浴中煮10分钟后备用。
(2)取CHO-hKLs-his-12#细胞上清经TCA沉淀的蛋白样，与上述步骤获得的BSA标准样品均吸取20μL，一同进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
(3)考马斯亮蓝染色并脱色。将电泳后的蛋白胶小心的取出，用新鲜配制的考马斯亮蓝染色液将其浸没染色1小时，随后用脱色液脱色至条带清晰为止。
(4)对所得结果拍照后使用Image J软件进行灰度定量，并根据BSA标准曲线计算CHO-hKLs-his-12#细胞上清hKLs-his目的蛋白的表达量为1.276μg/mL(图4)。
实施例4悬浮培养细胞上清液中hKLs-His蛋白的分离纯化
1、将实施例2中驯化好的CHO-hKLs-his-12#以3.75×105个/mL的密度接种到FortiCHO培养基中进行悬浮培养三天，回收细胞培养上清，用于纯化hKLs-his蛋白。
2、配置纯化相关试剂
1×Equilibration and wash buffer(TBS)：50mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH7.4；
1×Elution buffer：0.1M Tris、0.5M NaCl，pH 12.0；
1×Neutralization：1M HCl(828μL浓盐酸加水至10mL)。
提前确定酸碱比例至溶液刚好中和。
3、样品预处理
在细胞培养上清液中加入5M NaCl溶液至终浓度为0.15M，并调节pH7.4。
4、蛋白纯化
根据分泌型蛋白的量确定纯化所需的抗His标签琼脂糖珠(Anti-His AffinityResin,GenScript,TM0641)总量(结合能力≥0.6mg/mL)，加2～3倍柱体积的TBS，缓慢重悬以彻底平衡珠子。随后将珠子加入处理好的细胞培养上清，室温孵育2小时。再用10倍柱体积的Elution buffer洗脱hKLs-his蛋白，流出液收集至加有1×Neutralization溶液的EP管中，立即用微量移液器吹打混匀进行酸碱中和反应。洗脱时珠子不能长期暴露在碱性环境下，应控制15分钟内完成中和反应。
5、超滤浓缩
选用30kDa滤膜的超滤浓缩管(MilliporeTM UFC803096)，按照说明书对其进行预处理，用1×Elution buffer润洗超滤膜和浓缩管，3,000g离心5分钟。将上一步收集的洗脱液加入超滤管3,000g离心，每隔2-3分钟观察超滤情况，至滤膜上还余150～200μL左右，收集取超滤液。
6、蛋白检测
分离结束后收集样品，处理后进行SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色1小时，脱色液脱至背景透明，蛋白条带清晰。观察目的蛋白条带位置和表达情况，另外将纯化出来的蛋白进行Western blot分析，利用抗Klotho蛋白抗体验证，表明得到的纯化蛋白即为目的蛋白hKLs-his(图5)。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，比如纯化步骤可以使用常规镍柱纯化等，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
&lt;110&gt; 中山大学
&lt;120&gt; 一株高表达hKLs-his蛋白的细胞株及其制备方法和应用
&lt;160&gt; 4
&lt;170&gt; SIPOSequenceListing 1.0
&lt;210&gt; 1
&lt;211&gt; 1647
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人(human)
&lt;400&gt; 1
atgcccgcca gcgccccgcc gcgccgcccg cggccgccgc cgccgtcgct gtcgctgctg 60
ctggtgctgc tgggcctggg cggccgccgc ctgcgtgcgg agccgggcga cggcgcgcag 120
acctgggccc gtttctcgcg gcctcctgcc cccgaggccg cgggcctctt ccagggcacc 180
ttccccgacg gcttcctctg ggccgtgggc agcgccgcct accagaccga gggcggctgg 240
cagcagcacg gcaagggtgc gtccatctgg gacacgttca cccaccaccc cctggcaccc 300
ccgggagact cccggaacgc cagtctgccg ttgggcgccc cgtcgccgct gcagcccgcc 360
accggggacg tagccagcga cagctacaac aacgtcttcc gcgacacgga ggcgctgcgc 420
gagctcgggg tcactcacta ccgcttctcc atctcgtggg cgcgagtgct ccccaatggc 480
agcgcgggcg tccccaaccg cgaggggctg cgctactacc ggcgcctgct ggagcggctg 540
cgggagctgg gcgtgcagcc cgtggtcacc ctgtaccact gggacctgcc ccagcgcctg 600
caggacgcct acggcggctg ggccaaccgc gccctggccg accacttcag ggattacgcg 660
gagctctgct tccgccactt cggcggtcag gtcaagtact ggatcaccat cgacaacccc 720
tacgtggtgg cctggcacgg ctacgccacc gggcgcctgg cccccggcat ccggggcagc 780
ccgcggctcg ggtacctggt ggcgcacaac ctcctcctgg ctcatgccaa agtctggcat 840
ctctacaata cttctttccg tcccactcag ggaggtcagg tgtccattgc cctaagctct 900
cactggatca atcctcgaag aatgaccgac cacagcatca aagaatgtca aaaatctctg 960
gactttgtac taggttggtt tgccaaaccc gtatttattg atggtgacta tcccgagagc 1020
atgaagaata acctttcatc tattctgcct gattttactg aatctgagaa aaagttcatc 1080
aaaggaactg ctgacttttt tgctctttgc tttggaccca ccttgagttt tcaacttttg 1140
gaccctcaca tgaagttccg ccaattggaa tctcccaacc tgaggcaact gctttcctgg 1200
attgaccttg aatttaacca tcctcaaata tttattgtgg aaaatggctg gtttgtctca 1260
gggaccacca agagagatga tgccaaatat atgtattacc tcaaaaagtt catcatggaa 1320
accttaaaag ccatcaagct ggatggggtg gatgtcatcg ggtataccgc atggtccctc 1380
atggatggtt tcgagtggca cagaggttac agcatcaggc gtggactctt ctatgttgac 1440
tttctaagcc aggacaagat gttgttgcca aagtcttcag ccttgttcta ccaaaagctg 1500
atagagaaaa atggcttccc tcctttacct gaaaatcagc ccctagaagg gacatttccc 1560
tgtgactttg cttggggagt tgttgacaac tacattcaag taagtcagct gacaaaacca 1620
atcagcagtc tcaccaagcc ctatcac 1647
&lt;210&gt; 2
&lt;211&gt; 1668
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人(human)
&lt;400&gt; 2
atgcccgcca gcgccccgcc gcgccgcccg cggccgccgc cgccgtcgct gtcgctgctg 60
ctggtgctgc tgggcctggg cggccgccgc ctgcgtgcgg agccgggcga cggcgcgcag 120
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ttccccgacg gcttcctctg ggccgtgggc agcgccgcct accagaccga gggcggctgg 240
cagcagcacg gcaagggtgc gtccatctgg gacacgttca cccaccaccc cctggcaccc 300
ccgggagact cccggaacgc cagtctgccg ttgggcgccc cgtcgccgct gcagcccgcc 360
accggggacg tagccagcga cagctacaac aacgtcttcc gcgacacgga ggcgctgcgc 420
gagctcgggg tcactcacta ccgcttctcc atctcgtggg cgcgagtgct ccccaatggc 480
agcgcgggcg tccccaaccg cgaggggctg cgctactacc ggcgcctgct ggagcggctg 540
cgggagctgg gcgtgcagcc cgtggtcacc ctgtaccact gggacctgcc ccagcgcctg 600
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gagctctgct tccgccactt cggcggtcag gtcaagtact ggatcaccat cgacaacccc 720
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ccgcggctcg ggtacctggt ggcgcacaac ctcctcctgg ctcatgccaa agtctggcat 840
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Claims (5)

1.一株高表达人源hKLs蛋白的细胞株CHO-hKLs-his-12#，其特征在于，所述细胞株于2018年6月4日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：C2018116。
2.权利要求1所述细胞株CHO-hKLs-his-12#分泌的人源hKLs蛋白。
3.权利要求2所述人源hKLs蛋白在制备抗衰老制剂中的应用。
4.权利要求1所述细胞株CHO-hKLs-his-12#在分泌表达hKLs蛋白中的应用。
5.一种利用权利要求1所述细胞株分泌表达hKLs蛋白的方法，其特征在于，将权利要求1所述细胞株进行悬浮驯化培养，再将驯化好的细胞株以3.75×105个/mL的密度接种到无血清悬浮培养基中进行悬浮培养3天后，回收细胞上清液，经抗His标签琼脂糖珠亲和纯化后即得hKLs-his蛋白。
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