CN108314719A - 一种抗菌肽CC313js、制备方法及应用 - Google Patents

一种抗菌肽CC313js、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程抗菌肽技术领域，具体涉及一种抗菌肽CC313js，所述抗菌肽CC313js的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗菌肽CC313js的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该抗菌肽CC313js对多种细菌具有抑菌活性、其热稳定性好且分离纯化简单、易操作，适于大规模工业化生产，其在抗菌药物、食品抗菌剂、饲料添加剂等领域具有良好的应用前景。另外，本发明还提供了一种抗菌肽CC313js的制备方法。

Description

一种抗菌肽CC313js、制备方法及应用
技术领域
本发明属于基因工程抗菌肽技术领域，具体涉及一种抗菌肽CC313js、制备方法及应用。
背景技术
抗菌肽具有分子质量小、水溶性好、耐热性强、无免疫原性、抗菌谱广、无耐药性和作用机制独特等特点，因此被认为是能够成为替代抗生素的首选药物。但由于从天然资源中提取抗菌肽成本高、得率低、工序繁琐，化学合成则价格相当昂贵，难以应用生产，因此，利用基因工程技术生产抗菌肽具有重要意义。
天蚕素抗菌肽(cecropins)是目前研究最清楚、效果最好的天然抗菌肽；我们在前期研究工作中利用家蝇抗菌肽Cec Md与中国林蛙抗菌肽Chensirin作为母体肽所合成的杂合肽CC31具有较好的抑菌活性，但仍存在溶血活性，表达量低，不适合大规模发酵生产。
发明内容
本发明提供的一种抗菌肽CC313js、制备方法及应用，该抗菌肽CC313js溶血性低、抗菌活性高，该制备方法表达量高、分离纯化步骤简单，适用于大规模的工业化生产。
本发明提供了一种抗菌肽CC313js，用于编码所述抗菌肽CC313js的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗菌肽CC313js的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种抗菌肽CC313js的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的目的基因；
步骤2，以限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切步骤1的目的基因，并回收目的基因片段；以限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切载体pGAPZαA，并回收载体片段；将所述目的基因和所述载体片段连接，得到含有重组载体pGAPZαA/CC313js的连接液；
步骤3，将步骤2的连接液转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，并提取重组载体pGAPZαA/CC313js，得到重组载体pGAPZαA/CC313js；
步骤4，将重组载体pGAPZαA/CC313js转化到宿主细胞中，得到表达工程菌；
步骤5，培养步骤4的表达工程菌，进行抗菌肽CC313js的表达，并提取纯化，得到抗菌肽CC313js。
优选的，上述抗菌肽CC313js的制备方法中，步骤4的宿主细胞为毕赤酵母SMD1168。
本发明还提供了一种抗菌肽CC313js在制备用于治疗革兰氏阴性菌疾病药物或者用于治疗革兰氏阳性菌疾病药物中的应用。
本发明还提供了一种抗菌肽CC313js，在制备动物饲料添加剂中的应用。
本发明提供的一种抗菌肽CC313js，并应用基因工程技术在毕赤酵母中高效表达了该抗菌肽CC313js，经验证，利用该抗菌肽CC313js制备的抗菌肽Cec Md溶血性低、对多种细菌具有抗菌活性、热稳定性好，表达量高，且分离纯化简单、易操作，适于大规模工业化生产，该抗菌肽CC313js在医药(抗菌药物)、食品(抗菌剂)、饲料添加剂等领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1为重组载体pGAPZαA/CC313js的PCR产物鉴定电泳图；
图1中M泳道为DNA标准分子量(Marker)，1号泳道为空载体pGAPZαA的PCR产物(540bp)，2号泳道为重组载体pGAPZαA/Cec Md的PCR产物(648bp)，3号泳道为重组载体pGAPZαA/CC313js的PCR产物(825bp)，4号泳道为重组载体pGAPZαA/CC34S3js的PCR产物(843bp)，5号泳道为重组载体pGAPZαA/CR333js的PCR产物(843bp)；
图2为重组载体pGAPZαA/CC313js的双酶切产物鉴定电泳图；
图2中M泳道为DNA标准分子量(Marker)，1号泳道为空载体pGAPZαA的酶切产物(69bp)，2号泳道为重组载体pGAPZαA/Cec Md的酶切产物(177bp)，3号泳道为重组载体pGAPZαA/CC313js的酶切产物(354bp)，4号泳道为重组载体pGAPZαA/CC34S3js的酶切产物(372bp)，5号泳道为重组载体pGAPZαA/CR333js的酶切产物(372bp)；
图3为重组载体pGAPZαA/CC313js的线性化产物鉴定电泳图；
图3中M泳道为DNA标准分子量(Marker)，1号泳道为重组载体pGAPZαA/Cec Md的线性化产物(3255bp)，2号泳道为重组载体pGAPZαA/CC313js的线性化产物(3432bp)，3号泳道为重组载体pGAPZαA/CC34S3js的线性化产物(3450bp)，4号泳道为重组载体pGAPZαA/CR333js的线性化产物(3450bp)；
图4为酵母转化子的菌落PCR鉴定电泳图；
图4中M泳道为DNA标准分子量(Marker)，1号泳道为重组酵母菌SMD1168/pGAPZαA/Cec Md的菌落PCR产物(648bp)，2号泳道为重组酵母菌SMD1168/pGAPZαA/CC313js的PCR产物(825bp)，3号泳道为重组酵母菌SMD1168/pGAPZαA/CC34S3js的PCR产物(843bp)，4号泳道为重组酵母菌SMD1168/pGAPZαA/CR333js的PCR产物(843bp)；
图5为抗菌肽CC313js(12.97kDa)的Tricine-SDS-PAGE分析图谱；
图5中M泳道为标准蛋白Marker，1号泳道为抗菌肽Cec Md(5.91kDa)，2号泳道为抗菌肽CC313js(12.97kDa)，3号泳道为抗菌肽CC34S3js(12.98kDa)，4号泳道为抗菌肽CR333js(13.02kDa)；
图6为抗菌肽CC313js的western blot分析结果；
图6中1号泳道为抗菌肽Cec Md的western blot检测结果，2号泳道为抗菌肽CC313js的western blot检测结果，3号泳道为抗菌肽CC34S3js的western blot检测结果，4号泳道为抗菌肽CR333js的western blot检测结果；
图7为纯化后抗菌肽CC313js(11.31kDa)的Tricine-SDS-PAGE分析图谱。
图7中M号泳道为标准蛋白Marker，1号泳道为去除His标签后的抗菌肽Cec Md(4.26kDa)，2号泳道为去除His标签后的抗菌肽CC313js(11.31kDa)，3号泳道为去除His标签后的抗菌肽CC34S3js(11.32kDa)，4号泳道为去除His标签后的抗菌肽CR333js(11.37kDa)。
图8为抗菌肽CC313js水解产物(3.58kDa)的Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定图；
图8中M号泳道为标准蛋白Marker，1号泳道为抗菌肽Cec Md(4.26kDa)，2号泳道为甲酸水解后的的抗菌肽CC31(3.58kDa)，3号泳道为甲酸水解后的抗菌肽CC34S(3.58kDa)，4号泳道为甲酸水解后的抗菌肽CR33(3.60kDa)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明提供了一种抗菌肽CC313js，用于编码所述抗菌肽CC313js的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗菌肽CC313js的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
基于同一种发明构思，本发明还提供了一种抗菌肽CC313js的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的目的基因。
为了使抗菌肽能在毕赤酵母中大量表达，首先根据毕赤酵母偏爱密码子将母体肽氨基酸(CC31)序列翻译成如SEQ ID NO.3的核苷酸序列，然后采用甲酸识别位点将基因序列串联起来构成三倍体，序列末端添加His标签便于蛋白亲和纯化，在标签和序列之间添加肠激酶识别位点，并在序列5’端添加EcoRⅠ(GAATTC)酶切位点，3’端添加MfeⅠ(CAATTG)和XbaⅠ(TCTAGA)两个酶切位点，其中EcoRⅠ(GAATTC)和MfeⅠ(CAATTG)互为同尾酶，5’端添加起始密码子(ATG)，3’端在两个酶切位点之间添加终止密码子(TAA)，得到如SEQ ID NO.1所示的目的基因。
步骤2，以限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切步骤1的目的基因，并回收354bp的目的基因片段；以限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切载体pGAPZαA，并回收3078bp的载体片段；将所述目的基因和所述载体片段连接，得到含有重组载体pGAPZαA/CC313js的连接液。具体包括以下步骤：
步骤2.1，以限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切步骤1的目的基因，目的基因的双酶切体系如表1所示，得到目的基因双酶切溶液；该步骤添加的是目的基因1.5μg；
取5μL目的基因双酶切溶液与1μL的6×Loading Buffer混合均匀，在含有EB的1％琼脂糖电泳检测，电泳检测正确后，将剩下15μL的载体双酶切溶液按照DNA凝胶回收试剂盒方法进行胶回收，得到354bp的载体片段。
表1载体pGAPZαA的双酶切体系
其中，双酶切的条件为：将表1所示双酶切体系中的各物质加入PCR管中混匀，于37℃水浴3h。
步骤2.2，以限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切步骤1的载体pGAPZαA，载体pGAPZαA的双酶切体系如表1所示，得到载体双酶切溶液；该步骤添加的是载体1.5μg；双酶切条件同步骤2.1；
取5μL载体双酶切溶液与1μL的6×Loading Buffer混合均匀，在含有EB的1％琼脂糖电泳检测，电泳检测正确后，将剩下15μL的载体双酶切溶液按照DNA凝胶回收试剂盒方法进行胶回收，得到3078bp的载体片段。
步骤2.3，将所述目的基因和所述载体片段连接，其连接体系如表2所示，连接的条件为16℃水浴2h，得到含有重组载体pGAPZαA/CC313js的连接液。
表2目的基因和载体片段的连接体系
步骤3，将所述连接液转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，并提取重组载体pGAPZαA/CC313js，得到重组载体pGAPZαA/CC313js，具体步骤如下：
将步骤2.3的连接液转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，37℃振荡培养1h，涂布在含有25μg/mL ZeocinTM(博莱霉素)的低盐LB平板培养基上，倒置在37℃恒温培养箱中，过夜培养(12-16h)直至形成单菌落，挑取单菌落进行PCR产物(825bp)鉴定，筛选出含有重组载体pGAPZαA/CC313js的阳性克隆子，并提取阳性克隆子中的重组载体pGAPZαA/CC313js，得到重组载体pGAPZαA/CC313js。所述低盐LB平板培养基的配方为：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、15g/L琼脂、5g/L氯化钠、余量为水，pH 7.5。所述PCR产物鉴定体系如表3所示。
表3重组载体pGAPZαA/CC313js的PCR产物鉴定体系
其中，步骤3的PCR产物(825bp)鉴定采用的引物序列是：
Forward Primer：5’-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3’
3’AOX1Primer：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。
重组载体pGAPZαA/CC313js的PCR产物鉴定结果如图1，825bp处有条带，说明重组载体pGAPZαA/CC313js构建成功；重组载体pGAPZαA/CC313js的XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切产物鉴定结果如图2所示，354bp处有条带，说明重组载体pGAPZαA/CC313js构建成功。
步骤4，将重组载体pGAPZαA/CC313js转化到宿主细胞(毕赤酵母SMD1168)中，得到表达工程菌，具体包括以下步骤：
步骤4.1，毕赤酵母SMD1168感受态细胞的制备
步骤4.1.1，活化：取-80℃冻存的毕赤酵母SMD1168，采用YPD平板划线培养，培养温度为28-30℃(约2天)，得到第一单克隆细胞的单菌落；
挑取第一单克隆细胞的单菌落，采用YPD平板划线培养，培养温度为28-30℃(约2天)，得到第二单克隆细胞的单菌落；
挑取第二单克隆细胞的单菌落采用YPD平板划线培养，培养温度为28-30℃(约2天)，得到毕赤酵母SMD1168的单菌落。
其中，步骤4.1.1所述采用YPD平板划线培养时可用保鲜膜包裹YPD平板。
步骤4.1.2，小量培养：挑取毕赤酵母SMD1168的单菌落接种到5mL YPD液体培养基中，28-30℃，200r/min摇瓶培养16-18h(OD600值2.0左右)，得到毕赤酵母SMD1168菌悬液。
需要说明的是，步骤4.1.2中摇瓶培养一般过夜即可，不需测OD600值。
步骤4.1.3，放大培养：将5mL毕赤酵母SMD1168菌悬液接种到500mL YPD液体培养基中，并按1:100～200的体积比例接种，培养瓶采用2L的培养瓶，其中每1L培养瓶内装250mL YPD液体，以便于让毕赤酵母SMD1168充分吸收吸氧气，28-30℃，200r/min摇瓶培养16-18h(OD600值2.0左右)，得到毕赤酵母SMD1168培养菌液。
需要说明的是，步骤4.1.3中摇瓶培养一般过夜即可，不需测OD600值。
步骤4.1.4，将毕赤酵母SMD1168培养菌液冰浴10min，移入4℃预冷的离心管，然后4℃1500×g离心5min，去上清，收集沉淀；并用500mL 4℃预冷的无菌水重悬沉淀，得到第一酵母菌重悬液。
步骤4.1.5，将第一酵母菌重悬液于4℃1500×g离心5min，去上清，收集第一酵母菌沉淀；并用250mL 4℃预冷的无菌水重悬酵母菌沉淀，得到第二酵母菌重悬液。
步骤4.1.6，将第二酵母菌重悬液于4℃1500×g离心5min，去上清，收集第二酵母菌沉淀；并用20mL 4℃预冷的无菌1mol/L山梨醇重悬第二酵母菌沉淀，得到第一山梨醇重悬液。
步骤4.1.7，将第一山梨醇重悬液于4℃1500×g离心5min，去上清，收集第三酵母菌沉淀；并用1mL 4℃预冷的无菌1mol/L山梨醇重悬第三酵母菌沉淀，得到毕赤酵母SMD1168细胞。
步骤4.1.8，制备毕赤酵母SMD1168细胞的感受态，得到毕赤酵母SMD1168感受态细胞，冰浴保存，且当天制备当天使用，不可冻存。
步骤4.2，重组载体pGAPZαA/CC313js的线性化
将步骤3的重组载体pGAPZαA/CC313js用限制性内切酶AvrⅡ进行线性化酶切，得到线性化产物溶液，其中线性化酶切的反应体系如表4所示，反应条件为37℃水浴3h；
取5μL线性化产物溶液与1μL的6×Loading Buffer混合均匀，在含有EB的1％琼脂糖电泳检测，电泳检测正确后，将剩下45μL的线性化产物溶液进行质粒浓缩，得到线性化重组载体pGAPZαA/CC313js。
其中，质粒浓缩步骤如下：向线性化产物溶液中加入相当于线性化产物溶液1/10倍体积的NaAC(3mol/L)、相当于线性化产物溶液2倍体积无水乙醇，-80℃放置0.5h以上；12000r/min离心10min后弃上清；75％无水乙醇洗涤沉淀，真空干燥，得到线性化重组载体pGAPZαA/CC313js，-80℃保存备用。
其中，线性化产物溶液中的重组载体pGAPZαA/CC313js的线性化产物的鉴定结果如图3所示，3432bp处有条带，则说明重组载体pGAPZαA/CC313js的线性化成功。
表4线性化酶切处理的反应体系
步骤4.3，将步骤4.2的线性化重组载体pGAPZαA/CC313js电转化到步骤4.1.8的毕赤酵母SMD1168感受态细胞中，得到表达工程菌，具体包括：
将80μL毕赤酵母SMD1168感受态细胞与5-10μg或者5-10μL线性化重组载体pGAPZαA/CC313js冰浴混匀，转入冰浴预冷的2mm电转杯中；继续冰浴5min；电击转化，其中电击转化条件为：电压275V，脉冲长度15ms，脉冲次数为3次。电击转化后，立即往2mm电转杯中加入1mL冰浴冷的1mol/L山梨醇溶液，并将电击产物转移至一个1.5mL无菌EP管中，于30℃静置培养1-2h，得到电转化酵母。
取50μL、60μL、70μL、80μL、100μL的电转化酵母，分别涂布在5个不同的YPDS培养基平板(含100μg/mL ZeocinTM)上(小密度的电转化酵母涂布更有利于ZeocinTM抗性选择)；于30℃培养3-10天，直至酵母单克隆菌落出现；挑取10-20个酵母单克隆菌落在YPDS培养基平板(含100μg/mL的博莱霉素ZeocinTM)上进行划线培养，得到酵母转化子的单菌落。
步骤4.4，筛选步骤4.3的酵母转化子的单菌落中的阳性转化子进行PCR鉴定：
挑取步骤4.3的酵母转化子的单菌落接种于5mL含25μg/mL ZeocinTM的YPD液体培养基中，于30℃200r/min摇床培养15-16h(过夜)，得到酵母转化子菌悬液。
取500μL酵母转化子菌悬液离心，弃上清，开盖，在500W微波加热至煮沸，于液氮中放置5min，然后加入50μL无菌水，在500W微波加热至煮沸，离心，收集上清，并将上清作为PCR的酵母基因组DNA模板。
采用引物对Forward Primer：5’-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3’和3’AOX1Primer：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’，进行菌落PCR，鉴定重组载体pGAPZαA/CC313js是否整合入毕赤酵母基因组中，其中菌落PCR的反应体系如表5所示，菌落PCR的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸7min。
待菌落PCR反应结束后，取5μL PCR产物在含有EB的2％琼脂糖凝胶电泳中进行检测，酵母转化子的菌落PCR鉴定电泳图结果如图4所示，825bp处有条带，说明该酵母转化子为阳性克隆，该酵母转化子的菌液为阳性克隆菌液，阳性克隆命名为表达工程菌(pGAPZαA/CC313js/SMD1168菌株)，-80℃保存。
表5菌落PCR的反应体系
步骤5，培养步骤4.4的表达工程菌，进行抗菌肽CC313js的表达，并提取抗菌肽CC313js，得到抗菌肽CC313js，同时水解得到单体肽CC31，具体包括以下步骤：
步骤5.1，抗菌肽CC313js的表达
在100μg/mL ZeocinTM筛选下稳定性较好的表达工程菌(pGAPZαA/CC313js/SMD1168菌株)，-80℃保存。
将表达工程菌接种至装有20mL YPD液体培养基的50mL锥形瓶中，于30℃、200r/min培养72h，得到表达工程菌菌悬液；
取1mL的表达工程菌菌悬液于已灭菌的100mL YPD液体培养基中，用8层灭菌脱脂纱布封口，于30℃、200r/min培养72h，得到菌液样品；
步骤5.2，抗菌肽CC313js的Tricine-SDS-PAGE检测
取步骤5.1的菌液样品50mL，4000r/min离心2min，取上清液，于0.45μm膜过滤，用TCA方法浓缩表达产物，得到抗菌肽CC313js浓缩液。根据Tricine-SDS-PAGE试剂盒说明书配制蛋白胶，取10μL浓缩液和10μL的2×Tris-Tricine-SDS-PAGE上样缓冲液混合后，沸水中煮10min使蛋白变性，吸取10μL样品加入蛋白胶加样孔中，设定电压30V跑至夹层胶与分离胶之间，然后电压改为100V至电泳结束。通过考马斯亮蓝染色及脱色，鉴定目的蛋白，抗菌肽CC313js(12.97kDa)的Tricine-SDS-PAGE分析图谱检测结果见图5。
步骤5.3抗菌肽CC313js的Western blot检测
同步骤5.2相同步骤浓缩表达产物，，得到抗菌肽CC313js浓缩液，将浓缩液样品进行Tricine-SDS-PAGE电泳，但不经考马斯亮蓝染色，将蛋白胶上目的蛋白部分切割下来，利用转膜缓冲液将目的蛋白转移到PVDF膜上，小心取下PVDF膜进行封闭处理，然后将PVDF膜放入His-tag抗体(小鼠单抗)中4℃过夜孵育。利用PBST将孵育后的PVDF膜洗脱三次，每次10min，然后转移到辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)中孵育1h，加入PBST洗涤5-10min。共洗涤3次。采用超敏ECL化学发光试剂盒进行染色，显色2min，鉴定目的蛋白的准确性，抗菌肽CC313js的western blot分析结果见图6。
步骤5.4抗菌肽CC313js的提取纯化及鉴定
取步骤5.1中所得的菌液样品50mL，4000r/min离心20min，取上清液进行浓缩，浓缩后的蛋白加入平衡后的层析柱中孵育2h，然后用20倍柱体积的平衡缓冲液洗去未吸附的样品。配制pH＝7.4的洗脱缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液+0.15M NaCl+0.1M咪唑)洗脱柱子，洗脱体积为5-10个柱体积，收集洗脱下来的蛋白经超滤管浓缩，将上一步经过亲和纯化后的洗脱缓冲液换为25mM的Tris-HCl(pH＝8.0)，以保证肠激酶得到最佳酶切环境。然后加入适量的肠激酶(5mg融合蛋白/1μL肠激酶)，25℃下8h即可将融合蛋白完全切开。将切割后的蛋白再次进行亲和层析除去融合蛋白的标签，得到纯化的抗菌肽CC313js，然后通过Tricine-SDS-PAGE电泳进行鉴定，纯化后抗菌肽CC313js(11.31kDa)的Tricine-SDS-PAGE分析图谱见图7。
步骤5.5CC313js蛋白的水解及浓度测定
采用聚乙二醇沉淀法浓缩步骤5.4所得的纯化的抗菌肽CC313js，配制50％的甲酸溶液与浓缩后的蛋白沉淀混合与1.5mLEP管中，50℃水浴切割36h；切割结束后，每管加入两倍于切割体系的蒸馏水，真空冷冻干燥；每管再加入3mL蒸馏水复溶，再冻干，以彻底去除甲酸。水解后的抗菌肽溶于适宜PBS溶液中，得到水解得到单体肽CC31，部分蛋白样品与上样缓冲液混合煮沸用于Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定，抗菌肽CC313js水解产物单体肽CC31(3.58kDa)的Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定图见图8。
步骤6抗菌肽CC313js水解产物(单体肽CC31)的活性鉴定
步骤6.1最小抑菌浓度(MIC)采用96孔板法测定。
对串联抗菌肽CC313js水解制备而成的抗菌肽CC31进行活性检测，具体包括：
将短乳杆菌、德氏乳杆菌、毕赤酵母SMD1168和停乳链球杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌于平板划线培养，并挑取单菌落与相应的液体培养基中培养。其中停乳链球杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌37℃，200r/min空气震荡培养过夜；短乳杆菌、德氏乳杆菌厌氧37℃，200r/min震荡培养过夜；毕赤酵母SMD1168于30℃，200r/min空气震荡培养48h。
将单体肽CC31用1×PBS分别稀释成2000μmol/L、1000μmol/L、500μmol/L、250μmol/L、125μmol/L、62.5μmol/L、31.25μmol/L和15.625μmol/L共计8个梯度。将培养后的菌液稀释至2×105-7×105CFU/mL，将稀释好的测试菌液分别滴加到3个96孔培养板中，每行的1-12孔，每孔60μL，然后每孔滴加20μL的单体肽CC31，每孔加120μL培养基。每个样品设定3个重复，同时以不含测试菌作为阴性对照，培养48h。用肉眼观察有无浑浊，即为受试菌的最小抑菌浓度。当服用抗菌肽CC313js后，在体内水解为单体肽CC31，可以发挥良好的抗菌活性。
表6抗菌肽CC313js水解产物的MIC(μM)
注：“-”表示无明显抑菌浓度
步骤6.2抗菌肽CC313js及其水解产物溶血活性的测定
通过测定血红素的释放量来探索抗菌肽的溶血活性。采取浓度为2％的新鲜绵羊血红细胞悬浮液，与0.1mL测试抗菌肽混合均匀。测试抗菌肽混匀后的浓度为100μM、50μM、25μM、12.5μM，混合均匀后在37℃恒温培养箱中温育1h，2000r/min离心10min。将上清液转移至96孔板，使用酶标仪在570nm下测定吸光值。使用无菌的生理盐水和0.1％(v/v)的Triton-100作为溶血百分比0％和100％的标准。阴性对照用PBS缓冲液，阳性对照用0.1％TritonX-100。每个样品设定3个平行，结果取其平均值。溶血率(％)＝(试验管吸光度-阴性对照管吸光度)/(阳性对照管吸光度-阴性对照管吸光度)×100％。抗菌肽CC313js及其水解产物单体肽CC31对绵羊红细胞溶血活性影响结果如表7所示。抗菌肽CC313js及其水解产物单体肽CC31在各个浓度下均具有较低的溶血活性。
表7不同多肽对绵羊红细胞溶血活性的影响
注：不同字母表示相同浓度不同抗菌肽之间有显著差异(P<0.05)。*引自孙艳发(2010)
毕赤酵母在发酵生产的过程中能够缩短菌种的培养周期、简化操作步骤、减少了资料的耗费且降低了发酵成本，具备真核细胞蛋白合成通路。乙醇氧化酶(AlocholOxidase，AOX1)基因启动子是毕赤酵母用来严格并启动调控源蛋白的表达的有力工具，在此基础上，对于外源蛋白的诱导、糖基化修饰、二硫键的修饰以及加工都具有一定的生物学功能。虽然酵母菌所需的培养基组成单一，但却是能在简单的培养条件下快速的高密度生长，对于重组质粒重组于毕赤酵母菌中遗传性质稳定，可较少地分泌自身蛋白，但整体细胞干重可达130g/L，由此可见酵母菌即是表达外源蛋白的最佳菌种。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<120> 一种抗菌肽CC313js、制备方法及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaattcatgg gttggttgaa gaagattggt aagaagattg aaagagttgg tcaacacact 60
agaattattc cattgccatt gggttacttc gctaagaaga ctgatccacc aggttggttg 120
aagaagattg gtaagaagat tgaaagagtt ggtcaacaca ctagaattat tccattgcca 180
ttgggttact tcgctaagaa gactgatcca ccaggttggt tgaagaagat tggtaagaag 240
attgaaagag ttggtcaaca cactagaatt attccattgc cattgggtta cttcgctaag 300
aagactgatg atgatgataa gcaccaccac caccaccacc aattgtaatc taga 354
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gly Trp Leu Lys Lys Ile Gly Lys Lys Ile Glu Arg Val Gly Gln
1 5 10 15
His Thr Arg Ile Ile Pro Leu Pro Leu Gly Tyr Phe Ala Lys Lys
20 25 30
Thr Asp Pro Pro Gly Trp Leu Lys Lys Ile Gly Lys Lys Ile Glu
35 40 45
Arg Val Gly Gln His Thr Arg Ile Ile Pro Leu Pro Leu Gly Tyr
50 55 60
Phe Ala Lys Lys Thr Asp Pro Pro Gly Trp Leu Lys Lys Ile Gly
65 70 75
Lys Lys Ile Glu Arg Val Gly Gln His Thr Arg Ile Ile Pro Leu
80 85 90
Pro Leu Gly Tyr Phe Ala Lys Lys Thr Asp Asp Asp Asp Lys His
95 100 105
His His His His His Gln Leu
110
<210> 3
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggttggttga agaagattgg taagaagatt gaaagagttg gtcaacacac tagaattatt 60
ccattgccat tgggttactt cgctaagaag act 93

Claims (5)

1.一种抗菌肽CC313js，其特征在于，用于编码所述抗菌肽CC313js的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述抗菌肽CC313js的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种权利要求1所述的抗菌肽CC313js的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的目的基因；
步骤2，以限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切步骤1的目的基因，并回收目的基因片段；以限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切载体pGAPZαA，并回收载体片段；将所述目的基因和所述载体片段连接，得到含有重组载体pGAPZαA/CC313js的连接液；
步骤3，将步骤2的连接液转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，并提取重组载体pGAPZαA/CC313js，得到重组载体pGAPZαA/CC313js；
步骤4，将重组载体pGAPZαA/CC313js转化到宿主细胞中，得到表达工程菌；
步骤5，培养步骤4的表达工程菌，进行抗菌肽CC313js的表达，并提取纯化，得到抗菌肽CC313js。
3.根据权利要求2所述的抗菌肽CC313js的制备方法，其特征在于，步骤4的宿主细胞为毕赤酵母SMD1168。
4.一种权利要求1所述的抗菌肽CC313js在制备用于治疗革兰氏阴性菌疾病药物或者用于治疗革兰氏阳性菌疾病药物中的应用。
5.一种权利要求1所述的抗菌肽CC313js在制备动物饲料添加剂中的应用。
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