CN108503712A - 具有粘附-抗污双功能的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白及合成方法 - Google Patents

具有粘附-抗污双功能的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白及合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有粘附‑抗污双功能的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白及合成方法，将理性设计的融合蛋白基因克隆到质粒载体得到重组表达质粒，进一步转化宿主细胞后用诱导剂诱导宿主细胞过量表达融合蛋白，分离纯化后得到融合蛋白。所述贻贝粘附蛋白包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示序列。所述两性离子多肽包含SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示序列。实现了微生物一步法合成粘附‑抗污双功能融合蛋白，该过程温和高效，成本低廉，设备要求度低，易于后期扩大生产。

Description

具有粘附-抗污双功能的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋 白及合成方法
技术领域
本发明涉及一种具有粘附-抗污双功能的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白及合成方法，同时还涉及所述融合蛋白的基因设计、含有融合蛋白基因片段的重组表达载体的构建、在大肠杆菌中的发酵表达、融合蛋白的分离纯化方法以及对基质材料进行表面修饰的应用。
背景技术
生物污损(biofouling)是细菌等生命物质在基质材料表面附着并繁殖导致器材损耗的过程。在医药、航海、建筑、食品等众多领域中，生物污损不仅导致了材料的耗损，还引起了工业能耗和医疗安全等问题，如在人工心脏瓣膜和血管支架等移植材料接触血液组织时，在极短的时间内，非特异性蛋白吸附就会发生在移植物表面，之后引发一系列生物学级联反应，将极大可能地引发排异反应。抗污材料的开发和表面接枝技术的发展是解决生物污损的有效方法。
聚乙二醇(PEG)是聚醚类分子，其多羟基结构能形成水合层，曾经一度作为抗蛋白吸附材料的黄金标准。但是在氧气和过渡金属离子存在时，尤其是在较高温度下或体内酶存在条件下，PEG会发生降解。因此，近些年中，取代PEG的抗蛋白吸附材料备受关注。两性离子材料如羧酸甜菜碱(CB)和磺基甜菜碱(SB)，其分子结构中同时含有阳离子基团和阴离子基团，分子整体呈中性。分子中的极性基团使两性离子材料具有超亲水特性，在水溶液环境中材料表面能形成水合层抵抗蛋白非特异性吸附，而且稳定性好，这些特性使两性离子材料成为近些年的研究热点[Zhang L,Cao Z,Bai T,et al.Zwitterionic hydrogelsimplanted in mice resist the foreign-body reaction[J].Nature Biotechnology,2013,31(6):553]。其中氨基酸作为天然的两性离子，带有正电荷的赖氨酸(K)和带有负电荷的谷氨酸(E)形成的电中性两性离子多肽单分子层具有高效的抗蛋白吸附能力，生物多肽独特的生物相容性使其有望成为有广阔应用前景的抗污材料[Chen S,Cao Z,JiangS.Ultra-low fouling peptide surfaces derived from natural amino acids.[J].Biomaterials,2009,30(29):5892-5896]。
在表面接枝技术研究方面，可以调控性实现材料表面修饰的方法主要有表面的原子转移自由基聚合法、光引发活性接枝聚合法和点击化学表明接枝法等。这些方法涉及的反应不同，应用条件单一，合成步骤繁琐，如接枝反应前需对材料表面进行等离子体、UV和γ射线诱发，臭氧表面活化等预处理过程，对基体材料特异性较强[Liu Y,Zhang S,WangG.The preparation of antifouling ultrafiltration membrane by surface graftingzwitterionic polymer onto poly(arylene ether sulfone)containing hydroxylgroups membrane[J].Desalination,2013,316(2):127-136]。因此急需开发一种简单、普适性、温和高效的表面接枝方法。近年来，通过对自然界中生物粘附现象的观察和机理分析，尤其是基于海洋贻贝粘附蛋白的研究，开发具有广泛底物粘附性的表面接枝技术已成为研究和应用的亮点。
贻贝粘附蛋白(Mefp)是海洋生物贻贝分泌的具有粘附作用的一系列蛋白的统称。贻贝粘附蛋白中含有大量的3,4-二羟基-L-苯基丙氨酸(DOPA)，DOPA的强共价键和配位能力使蛋白能够在潮湿的水环境下牢固地粘附在多种基质材料表面，且贻贝粘附蛋白的粘附能力随DOPA含量的增加而增加，是近些年中自然界粘附蛋白的研究热点[Lin Q,GourdonD,Sun C,et al.Adhesion mechanisms of the mussel foot proteins mfp-1 and mfp-3.[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,2007,104(10):3782]。贻贝粘附蛋白大概有25-30种不同种类，包括Mefp-1、Mefp-2、Mefp-3、Mefp-4和Mefp-5等。Mefp-1主要存在于贻贝足丝线中，Mefp-2、Mefp-3、Mefp-4和Mefp-5等主要存在于贻贝足丝盘上，贻贝足丝盘能直接与所依附的材料发生粘接作用，形成交联并牢固粘附在材料表面[Waite J H.Nature's underwater adhesive specialist[J].International Journal of Adhesion&Adhesives,1987,7(1):9-14；Waite JH.Adhesionàla Moule[J].Integrative&Comparative Biology,2002,42(6):1172-1180]。其中Mefp-5中DOPA的含量高达27％，被认为是存在于贻贝足丝斑块和基质界面粘附能力最强的蛋白。有学者在天然贻贝粘附蛋白的基础上设计了fp-151，获得了具有很强粘附作用的融合蛋白[Dong S H,Gim Y,Yoo H J,et al.Practical recombinant hybrid musselbioadhesive mp[J].Biomaterials,2007,28(24):3560]。贻贝粘附蛋白最初是从贻贝足丝中直接提取的，但是存在成本高和产量低的局限，基因重组技术的发展实现了利用微生物进行贻贝粘附蛋白的重组外源表达。由于DOPA是非天然氨基酸，微生物不能直接合成含有DOPA的蛋白质，利用酪氨酸激酶对酪氨酸残基进行体外羟基化反应能实现部分酪氨酸残基向DOPA的转化，为利用微生物合成具有粘附功能的贻贝粘附蛋白奠定了基础[Marumo K,Waite J H.Optimization of hydroxylation of tyrosine and tyrosine-containingpeptides by mushroom tyrosinase.[J].Biochim Biophys Acta,1986,872(1-2):98-103]。利用基因工程技术将贻贝粘附蛋白和两性离子多肽片段融合，并利用酪氨酸酶对融合蛋白体外羟基化有望实现微生物一步法直接合成具有粘附和抗污双功能的融合蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一类贻贝粘附蛋白和两性离子多肽融合蛋白，融合蛋白的贻贝粘附蛋白部分能温和牢固地粘附在基质表面形成表面修饰层，融合蛋白的两性离子多肽部分能通过亲水性形成水合层抵抗外界蛋白质的非特异性吸附，即融合蛋白同时具有粘附和抗污的功能。
为实现上述目的，本发明提供一种具有粘附-抗污双功能的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白(我们将其命名为MZP(Mytilus edulis foot protein and zwitterionicpeptide fusion protein))，其特征在于所述的融合蛋白的贻贝粘附蛋白氨基酸序列包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的序列；两性离子多肽包含SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示的序列。
本发明的第二个目的是提供了上述贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白MZP的合成方法，其特征在于将融合蛋白的基因克隆到质粒载体得到重组表达质粒，重组表达质粒转化宿主细胞后用诱导剂诱导宿主细胞过量表达融合蛋白，分离纯化后得到融合蛋白。
具体技术方案如下：
一种具有粘附-抗污双功能的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白含有贻贝粘附蛋白和两性离子多肽。
所述的贻贝粘附蛋白包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的序列。
所述的两性离子多肽包含SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ IDNO.9所示的序列。
本发明所述具有粘附-抗污双功能的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白的合成方法，其特征在于：将融合蛋白的基因克隆到质粒载体得到重组表达质粒，重组表达质粒转化宿主细胞后用诱导剂诱导宿主细胞过量表达融合蛋白，分离纯化后得到融合蛋白。
优选所述融合蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.10，核苷酸序列为SEQ ID NO.11。重组表达载体是将贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中得到重组表达载体，所述的重组表达载体含有NdeI和HindIII限制性酶切位点，T7强启动子、lca乳糖操纵子以及卡那霉素的抗性筛选基因。
表达所述融合蛋白的宿主细胞为含有SEQ ID NO.11的核苷酸序列的宿主细胞；或者为含有重组表达载体的宿主细胞。优选所述的细胞为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。
优选本发明的融合蛋白的合成方法，将贻贝粘附蛋白和两性离子多肽利用基因工程技术进行融合，构建重组表达载体，再将重组表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行融合蛋白的表达，通过柱层析或乙酸提取的方法纯化贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白。包括以下步骤：
⑴人工合成贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白基因，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.11所示；
⑵将合成的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中，在融合蛋白基因5’端加入NdeI限制性酶切位点，在基因3’端加入HindIII限制性酶切位点，构建重组表达载体；
⑶将构建成功的重组表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，利用卡那霉素和氯霉素双抗性LB固体培养基平板筛选转化子；
⑷大肠杆菌BL21(DE3)pLysS发酵表达贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白；
⑸贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白的分离纯化。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：本发明中首次将贻贝粘附蛋白和两性离子多肽在基因水平上进行融合，构建了具有粘附-抗污双功能的融合蛋白。利用大肠杆菌发酵表达融合蛋白，并根据融合蛋白独特的性质，利用亲和层析技术纯化上清蛋白，利用乙酸纯化包涵体，构建了高纯度的分离纯化方法，实现了微生物一步法合成融合蛋白，该过程温和高效，成本低廉，设备要求度低，易于后期扩大生产。利用酪氨酸酶实现了在体外条件下融合蛋白中酪氨酸残基到非天然氨基酸DOPA的部分转化。羟基化后融合蛋白的贻贝粘附蛋白部分含有DOPA，能通过共价键和配位能力将融合蛋白牢固地粘附在基质材料表面，形成表面蛋白修饰层；同时两性离子多肽部分由于整体呈中性的两性离子结构能形成水合层抵抗外界蛋白质的非特异性吸附，使羟基化后融合蛋白同时具有粘附和抗污功效。经羟基化后融合蛋白修饰的基质材料在抗荧光蛋白吸附等实验中抗污效果十分明显。该发明开发的融合蛋白不仅同时具有粘附和抗污的功能，而且具有很好的细胞相容性，对正常动物细胞的生长没有任何毒性影响，有望成为医疗器材和生物芯片中抗污涂层材料。
附图说明
图1为重组表达载体pET-28a-MP-KE示意图；重组表达载体pET-28a-MP-KE中含有T7强启动子、lca乳糖操纵子、卡那霉素抗性标记位点、融合蛋白MP-KE编码基因及六聚组氨酸标签。
图2为大肠杆菌表达的融合蛋白及分离纯化后的融合蛋白；其中泳道M：蛋白Maker；泳道T：大肠杆菌全菌蛋白；泳道S：大肠杆菌破碎后上清可溶蛋白；泳道IS：大肠杆菌破碎后包涵体不可溶蛋白；泳道P：分离纯化后的融合蛋白。
图3为荧光蛋白(BSA-FITC)孵育玻璃珠的荧光强度柱状图。其中A为水处理的玻璃珠孵育后的荧光强度，水处理的玻璃珠作为空白对照组，并将空白对照组的荧光强度设置为100％；B为融合蛋白MP-KE修饰的玻璃珠孵育后的荧光强度；C为羟基化后融合蛋白修饰的玻璃珠孵育后的荧光强度。
具体实施方式
本发明以具体实施例提供一种优选的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白MP-KE(我们将其命名为MP-KE(Mytilus edulis foot protein and lysine(K)-glusate(E)zwitterionic peptide fusion protein))，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明中的融合蛋白MP-KE基因根据大肠杆菌表达偏好进行密码子优化，使融合蛋白能够在大肠杆菌中过量稳定表达。
本发明提供含有上述融合蛋白MP-KE基因的重组表达载体，其特征在于将贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白MP-KE基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中得到重组表达载体pET-28a-MP-KE(我们将其命名为pET-28a-MP-KE)，所述的重组表达载体含有NdeI和HindIII限制性酶切位点，T7强启动子、lca乳糖操纵子以及卡那霉素的抗性筛选基因。
本发明提供含有上述融合蛋白MP-KE基因的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列的宿主细胞，或者为含有上述的重组表达载体pET-28a-MP-KE的宿主细胞，优选的，所述的细胞为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。
本发明提供一种产生上述融合蛋白MP-KE的方法，其特征在于将贻贝粘附蛋白MP和KE两性离子多肽利用基因工程技术进行融合，构建重组表达载体pET-28a-MP-KE，再将pET-28a-MP-KE质粒载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行融合蛋白MP-KE的表达，通过柱层析或乙酸提取的方法纯化贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白MP-KE。
进一步的，上述的产生融合蛋白MP-KE的方法包括以下步骤：
⑴人工合成贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白MP-KE基因，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
①贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白MP-KE基因序列的确定。
在不改变贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白MP-KE氨基酸序列的基础上根据大肠杆菌表达的偏好性对基因进行密码子优化，得到核苷酸序列。
②贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白MP-KE基因的合成。
将上述优化的基因序列交于金唯智公司，人工合成贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白MP-KE基因。
⑵将合成的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白MP-KE基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中，在融合蛋白基因5’端加入NdeI限制性酶切位点，在基因3’端加入HindIII限制性酶切位点，构建重组表达载体pET-28a-MP-KE。
以pET-28a作为基因的载体，在人工合成贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白MP-KE基因的同时，在基因序列的5’端加入NdeI限制性酶切位点，在基因3’端加入HindIII限制性酶切位点直接构建重组表达载体pET-28a-MP-KE。
⑶将构建成功的重组表达载体pET-28a-MP-KE转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，利用卡那霉素和氯霉素双抗性LB固体培养基平板筛选转化子。
感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS与重组表达载体质粒pET-28a-MP-KE混合均匀，通过冰孵-热激-冰孵的化学方法使感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS吸收重组表达载体质粒pET-28a-MP-KE，复苏后将菌液涂布在含有卡那霉素和氯霉素双抗性LB固体培养基平板进行转化子的筛选。
⑷大肠杆菌BL21(DE3)pLysS发酵表达贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白MP-KE。
大肠杆菌BL21(DE3)pLysS转化子在LB抗性平板上划线活化，挑取单菌落进行种子液培养，取1ml种子液转接入含有50-100ml LB培养基的摇瓶中扩大培养大肠杆菌，发酵表达融合蛋白MP-KE。转接培养当大肠杆菌菌液浓度为OD600＝0.6-0.8时用0.4-1.5mM的IPTG进行诱导，25-40℃，200-300rpm培养6-18h后在4℃，6000-10000rpm下离心20-40min收集大肠杆菌菌体。菌体用PBS缓冲液重悬至菌液，菌液在冰水浴下超声破碎30-60min，输出功率100-300W，破碎2-8s，停歇2-8s。离心后收集上清和沉淀，并将上清和沉淀进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
⑸贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白MP-KE的分离纯化。
①融合蛋白MP-KE上清的分离纯化：
大肠杆菌发酵结束后离心收集菌体，将菌体重悬于binding buffer(20-40mM磷酸钠、0.4-0.8M氯化钠、20-40mM咪唑，pH7.0-7.4)中，在冰水浴下超声破碎30-60min，输出功率100-300W，破碎2-8s，停歇2-8s。离心后收集含有融合蛋白MP-KE的上清，上清用0.22μm膜过滤除去固体颗粒。
融合蛋白MP-KE中有六聚组氨酸标签，六聚组氨酸能和镍柱中的Ni2+通过配位键等结合，溶液中咪唑能竞争与Ni2+结合，因此高浓度咪唑溶液能洗脱结合在镍柱上的蛋白。选用GE公司的5mlHistrap柱对融合蛋白MP-KE上清进行亲和层析分离。Histrap柱经过水、binding buffer清洗后将过膜的融合蛋白MP-KE上清按0.2-2ml/min流速上柱，使融合蛋白MP-KE结合在柱上。用wash buffer(20-40mM磷酸钠、0.4-0.8M氯化钠、100-350mM咪唑，pH7.0-7.4)以1-5ml/min流速洗涤柱中的杂蛋白。洗涤结束后用elutionbuffer(20-40mM磷酸钠、0.4-0.8M氯化钠、500mM咪唑，pH7.0-7.4)洗脱柱上结合的融合蛋白MP-KE。洗脱液用高纯水超滤换液脱盐后冻干。
②融合蛋白MP-KE沉淀的分离纯化：
用包涵体洗涤液(2-3M尿素、0.2-1.0％Triton-X-100、20-80mM PBS、4-6mM EDTA)洗涤包涵体2次，每次30-60min，去除包涵体外的杂蛋白。用25-75％乙酸重悬包涵体，25-40℃，200-300rpm处理1-5h提纯包涵体中融合蛋白。提纯上清于4℃透析12-36h后超滤冻干。
最后，将最终的纯化蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯度。
以贻贝粘附蛋白/两性离子多肽MP-KE为例，本发明的具体操作过程为：
⑴重组表达载体的构建
利用基因工程技术将贻贝粘附蛋白MP和KE两性离子多肽在基因水平进行整合，构建融合蛋白MP-KE，在不改变其氨基酸序列的基础上根据大肠杆菌表达的偏好性对基因进行密码子优化，得到核苷酸序列。在基因序列的5’端加入NdeI限制性酶切位点并在基因3’端加入HindIII限制性酶切位点。人工合成并构建重组表达载体pET-28a-MP-KE，如图1所示。
⑵大肠杆菌的化学转化
将构建正确的重组表达载体pET-28a-MP-KE与感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS按比例混匀后冰上孵育30min，42℃热激后迅速在冰上静置3min。加入LB培养基复苏2h后均匀涂布菌液在卡那霉素和氯霉素的双抗性LB固体培养基平板上。无菌操作挑取平板上生长的单菌落进行菌落PCR，PCR产物进行琼脂糖电泳验证转化结果。无菌操作挑取同一单菌落，过夜培养后进行大肠杆菌的质粒提取，提取的质粒用NdeI限制性内切酶和HindIII限制性内切酶酶切并进行琼脂糖电泳。同时提取的质粒送往金唯智公司进行测序。转化成功的大肠杆菌菌株用甘油保存于-80℃。
⑶大肠杆菌发酵表达融合蛋白MP-KE
将转化成功的大肠杆菌在LB固体培养基平板上划线活化。挑取单菌落培养过夜作为种子液。转接大肠杆菌种子液于500ml摇瓶中扩大培养。在大肠杆菌转接后菌液浓度为OD600＝0.6-0.8时，用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠杆菌，使其过量表达融合蛋白MP-KE，诱导后继续培养，大肠杆菌积累过量表达的融合蛋白后收集大肠杆菌菌体。
⑷融合蛋白MP-KE的分离纯化
大肠杆菌发酵液离心弃去培养基收集大肠杆菌菌体。用PBS缓冲液重悬菌体，菌液在冰水浴下超声破碎。破碎得到的澄清菌液在4℃下离心分别得到上清和沉淀，将大肠杆菌菌体、破碎后上清、破碎后沉淀加入loading buffer煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，如图2所示。
①融合蛋白MP-KE上清的分离纯化：
发酵结束后的大肠杆菌菌体重悬于binding buffer中，在冰水浴下超声破碎。超声破碎后在4℃离心后收集的含有融合蛋白MP-KE的上清用0.22μm膜过滤除去固体颗粒，防止在亲和层析过程中发生堵塞。选用GE公司的5ml Histrap柱对融合蛋白MP-KE上清进行亲和层析分离。经含有融合蛋白MP-KE的上清上柱、wash buffer洗涤和elutionbuffer洗脱后得到含有融合蛋白MP-KE的洗脱液。洗脱液用高纯水超滤换液脱盐后冻干。
②融合蛋白MP-KE沉淀的分离纯化：
超声破碎得到的包涵体用包涵体洗涤液在室温下洗涤2次。加入乙酸重悬包涵体进行融合蛋白的提取。溶液在乙酸处理后透析、超滤浓缩并用冻干机冷冻干燥，得到融合蛋白MP-KE。
纯化得到的融合蛋白MP-KE溶于PBS缓冲液中加入loading buffer煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳并进行纯度分析，纯化后的融合蛋白纯度大于80％，如图2所示。
⑸体外羟基化
含有1mg/ml融合蛋白MP-KE、250U/ml酪氨酸酶、20mM硼酸钠、25mM抗坏血酸的0.1MPBS体系在25℃搅拌并鼓泡反应5h，将融合蛋白中酪氨酸残基羟基化为DOPA。反应结束后溶液透析、超滤并冻干。
实施例1：重组表达载体和菌株的构建
①重组表达载体的构建
以3个GGGGS重复序列作为连接多肽连接融合蛋白MP和20个KE重复序列的两性离子多肽构成融合蛋白MP-KE，在不改变其氨基酸序列的基础上根据大肠杆菌表达的偏好性对基因进行密码子优化。在基因序列的5’端加入NdeI限制性酶切位点并在基因3’端加入HindIII限制性酶切位点。人工合成该基因序列并克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中得到重组表达载体pET-28a-MP-KE，所述重组表达载体中含有T7强启动子、lca乳糖操纵子、卡那霉素抗性标记位点和六聚组氨酸标签，如图1所示。
②大肠杆菌的化学转化
将感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS在冰上融化。将构建正确的重组表达载体pET-28a-MP-KE与感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS混合均匀后在冰上孵育30min，42℃热激45s后迅速在冰上静置3min。加入450μlLB培养基，并震荡复苏2h，复苏后取100μl菌液均匀涂布在含有卡那霉素和氯霉素的双抗性LB固体培养基平板上进行抗性筛选。无菌操作挑取平板上生长的单菌落，进行菌落PCR。PCR产物进行琼脂糖电泳验证转化结果，电泳图在800bp左右出现条带，与融合蛋白基因大小一致。无菌操作挑取同一单菌落过夜培养后按照质粒小提试剂盒进行大肠杆菌的质粒提取，提取的质粒用NdeI限制性内切酶和HindIII限制性内切酶酶切并进行琼脂糖电泳，质粒被酶切出两个条带，分别在800bp和5.3kb左右，分别与理论结果的融合蛋白基因和pET-28a载体大小相符。同时提取的质粒送往金唯智公司进行测序。将测序结果与如SEQ ID NO.7所示的基因序列进行比对，相似性大于99％，认为该基因片段即为融合蛋白MP-KE基因。菌落PCR、质粒双酶切和测序均成功的菌落为目标转化子。转化成功的大肠杆菌菌株用甘油保存于-80℃。
实施例2：融合蛋白MP-KE的表达纯化
①大肠杆菌发酵表达融合蛋白MP-KE
将转化成功的大肠杆菌在含有卡那霉素和氯霉素的双抗性LB固体培养基平板上划线活化。挑取单菌落于5ml含有50μg/ml的卡那霉素和氯霉素的LB液体培养基的试管中，于37℃200rpm震荡培养过夜。按1:100比例转接大肠杆菌种子液于含有200ml培养基的500ml摇瓶中。用紫外分光光度计测量大肠杆菌的生长曲线，在大肠杆菌转接后当菌液浓度为OD600＝0.8时，用0.8mM的IPTG诱导大肠杆菌表达融合蛋白MP-KE，在37℃，250rpm条件下继续培养12h后收集大肠杆菌菌体。
②融合蛋白MP-KE的分离纯化
大肠杆菌发酵液在4℃，6000rpm条件下离心10min弃去培养基。用PBS溶液重悬大肠杆菌菌体，菌液在冰水浴下超声破碎40min，输出功率200W，破碎2s，停歇3s。破碎得到的澄清菌液4℃离心分别得到上清和包涵体，将大肠杆菌菌体、破碎后上清、破碎后包涵体加入上样缓冲液(loading buffer)并煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，如图3所示。可以看出融合蛋白MP-KE(分子量约为33KD)同时存在于上清和包涵体形中，因此后续实验采取用亲和层析方法分离上清中的融合蛋白MP-KE，从包涵体中用乙酸分离纯化融合蛋白MP-KE。
a.融合蛋白MP-KE上清的分离纯化：
大肠杆菌发酵结束后在4℃，6000rpm条件下离心10min离心收集菌体。用bindingbuffer(20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、40mM咪唑，pH 7.4)将大肠杆菌菌体重悬，菌液在冰水浴下超声破碎40min，输出功率200W，破碎2s，停歇3s。破碎得到的澄清菌液在4℃下离心得到上清。离心后收集的含有融合蛋白MP-KE的上清用0.22μm膜过滤除去固体颗粒。
选用GE公司的5ml Histrap柱对融合蛋白MP-KE上清进行亲和层析分离。将Histrap柱与AKAT prime plus连接好。Histrap柱依次用10倍柱体积的高纯水和bindingbuffer洗涤至基线走平。将过膜的融合蛋白MP-KE上清按1ml/min流速上柱，使融合蛋白MP-KE结合在柱上。上样结束后用的wash buffer(20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、320mM咪唑，pH7.4)以2ml/min流速洗涤柱中的杂蛋白至基线走平。洗涤结束后用elution buffer(20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、500mM咪唑，pH7.4)洗脱柱上结合的融合蛋白MP-KE并收集吸收峰出现时的洗脱液。Histrap柱依次用8倍柱体积的binding buffer和高纯水洗涤，最后将Histrap柱保存在20％乙醇中。洗脱液用超滤管超滤同时用高纯水换液。得到的溶液用冷冻干燥机冻干。
b.融合蛋白MP-KE沉淀的分离纯化：
得到的包涵体用含有2M尿素、0.6％Triton-X-100、50mM PBS、4mM EDTA的包涵体洗涤液洗涤包涵体2次，每次30min以除去包涵体以外的杂蛋白。60％乙酸重悬包涵体，在25℃、250rpm条件下震荡处理3h，使大部分包涵体蛋白溶于酸溶液中。处理后的乙酸上清在4℃下过夜透析18h。透析结束后，透析袋中的溶液在4℃离心后用超滤管超滤浓缩，并用冻干机冷冻干燥，得到融合蛋白MP-KE。
纯化得到的融合蛋白MP-KE溶于PBS缓冲液中，加入上样缓冲液(loading buffer)煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并进行纯度分析，纯化后的融合蛋白纯度大于80％，如图2所示，纯化后融合蛋白分子量约为34KD。
实施例3：体外羟基化及DOPA验证
①体外羟基化反应
含有1mg/ml融合蛋白MP-KE、250U/ml酪氨酸酶、20mM硼酸钠、25mM抗坏血酸的0.1MPBS体系在25℃搅拌并鼓泡反应5h将融合蛋白中酪氨酸残基羟基化为DOPA。反应过程中实时控制反应温度和鼓泡速度。反应结束后溶液透析、超滤并冻干。
②氮蓝四唑(NBT)染色
水、融合蛋白MP-KE及修饰后的融合蛋白三种样品溶液分别滴在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。等蛋白样品在膜上结合后将PVDF膜浸泡在含有0.5mg/ml的氮蓝四唑(NBT)的2M甘氨酸钾(pH 10)溶液中并在黑暗中处理1h。依次用0.2M硼酸钠(pH 8.5)和高纯水洗涤PVDF膜。修饰后融合蛋白位置的PVDF膜呈蓝紫色，说明在该实验条件下修饰后融合蛋白中DOPA发生氧化还原反应，氮蓝四唑(NBT)被还原形成蓝紫色甲瓒。水处理的位置呈无色，融合蛋白MP-KE处理的位置呈现微黄色的蛋白残留。之后PVDF膜用含有0.1％丽春红S的5％乙酸溶液复染，25℃和50rpm黑暗条件下处理1h后用高纯水洗涤两次。丽春红S复染后，修饰后融合蛋白位置的PVDF膜仍然呈蓝紫色，水处理的位置呈无色，融合蛋白MP-KE处理的位置呈红色，证明该处有蛋白存在，但是不含DOPA。染色实验说明体外羟基化实验后融合蛋白中含有DOPA。
实施例4：表面修饰及原子力显微镜分析
①样品对基质材料的表面修饰
以玻璃片、玻璃珠和云母片为基质材料，以水、融合蛋白MP-KE及修饰后的融合蛋白作为样品修饰基质材料表面。将清洗干净的基质材料浸润在三种样品中，在25℃下80％湿度孵育12h，每组至少3个重复。孵育结束后用高纯水将基质材料洗涤3次以去除多余的蛋白样品。
②原子力显微镜检测
用原子力显微镜采用轻敲模式检测基质材料的表面形貌，对比没有进行修饰的玻璃片表面，用羟基化后融合蛋白修饰的玻璃片表面呈紧凑致密的蛋白修饰层，而且规整有序。
实施例5：融合蛋白抵抗FITC-BSA荧光蛋白吸附能力检测
将按照步骤⑹中方法修饰后的玻璃珠浸润在0.1mg/ml的异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(BSA-FITC)中避光孵育30min，之后用PBS溶液洗涤3次以去除多余的未粘附蛋白。以蓝光为激发光用倒置显微镜(Nikon Eclipse Ti-S)观察玻璃珠表面吸附荧光蛋白的量。水溶液修饰的玻璃珠为空白组，其荧光强度设为100％；而融合蛋白MP-KE和羟基化反应后融合蛋白修饰的玻璃珠的实验组的荧光强度极弱，均小于10％。说明融合蛋白具有良好的抵抗荧光蛋白吸附效果，羟基化后更能有效地粘附在基质材料表面，使抗污蛋白部分即KE两性离子多肽发挥功能，如图3所示。
实施例6：MTT细胞毒性检测
①动物细胞培养
以NIH/3T3成纤维细胞作为实验动物细胞进行MTT细胞毒性检测。用含有1％青霉素和链霉素及10％小牛血清的DMEM培养基在37℃、5％CO2条件下培养NIH/3T3成纤维细胞。
②基质材料的无菌处理
按照步骤⑹中方法修饰后的云母片用无菌PBS溶液洗涤3次做无菌处理。
③MTT实验
在48孔板中每孔植入3.5*10^4个细胞，培养12h。经无菌处理的云母片对应加入孔中，NIH/3T3细胞继续培养24h。培养结束后每孔加入300μl 10％的MTT溶液，继续培养4h。培养结束后，吸去孔板中的上清，每孔加入330μl的DMSO溶解液，并在摇床上震荡摇动10min。将上述液体转移至96孔板中，并在490nm下检测吸光度。以未处理的云母片孵育的细胞孔作为空白对照，并设定为100％，发现两种融合蛋白修饰的云母片对细胞没有任何毒性影响，两种融合蛋白实验组细胞存活率均高于100％。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明。尽管前述实施方案对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，来实现融合蛋白最终的制备。特别需要指出的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围内。
核苷酸序列表：
SEQ ID NO.1：AKPSYPPTYK
SEQ ID NO.2：
MNNISVAVLVALVLIGSFAVQSDAADYYGPKYGPPRRYGGGNYNRYGRRYGGYKGWNNGWKRGRWGRKYY
SEQ ID NO.3：
SSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNSGKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSS
SEQ ID NO.4：YKYKY
SEQ ID NO.5：
AKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKSSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNSGKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSSGGGGSAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYK
SEQ ID NO.6：RDRDRDRDRD
SEQ ID NO.7：KDKDKDKDKD
SEQ ID NO.8：RERERERERE
SEQ ID NO.9：KEKEKEKEKE
SEQ ID NO.10：
AKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKSSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNSGKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSSAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKGGGGSGGGGSGGGGSKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKEKE
SEQ ID NO.11：
GCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAATCTTCTGAAGAATACAAAGGTGGTTACTACCCGGGTAACACCTACCACTACCACTCTGGTGGTTCTTACCACGGTTCTGGTTACCACGGTGGTTACAAAGGTAAATACTACGGTAAAGCTAAAAAATACTACTACAAATACAAAAACTCTGGTAAATACAAATACCTGAAAAAAGCTCGTAAATACCACCGTAAAGGTTACAAAAAATACTACGGTGGTGGTTCTTCTGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGCTAAACCGTCTTACCCGCCGACCTACAAAGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAA
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种具有粘附-抗污双功能的贻贝粘附蛋白-两性离子多肽融合蛋白及合成方法
<140> 2017109602185
<141> 2017-10-16
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Asn Asn Ile Ser Val Ala Val Leu Val Ala Leu Val Leu Ile Gly
1 5 10 15
Ser Phe Ala Val Gln Ser Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr
20 25 30
Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg
35 40 45
Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg
50 55 60
Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr
65 70
<210> 3
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His
1 5 10 15
Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr
20 25 30
Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys
35 40 45
Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg
50 55 60
Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser
65 70 75
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Tyr Lys Tyr Lys Tyr
1 5
<210> 5
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
1 5 10 15
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
20 25 30
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
35 40 45
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu
50 55 60
Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly
65 70 75 80
Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr
85 90 95
Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys
100 105 110
Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys
115 120 125
Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Lys Pro
130 135 140
Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
165 170 175
Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala
180 185 190
Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
195 200
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Asp
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp
1 5 10
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Arg Glu Arg Glu Arg Glu Arg Glu Arg Glu
1 5 10
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu
1 5 10
<210> 10
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
1 5 10 15
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
20 25 30
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
35 40 45
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu
50 55 60
Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly
65 70 75 80
Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr
85 90 95
Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys
100 105 110
Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys
115 120 125
Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
130 135 140
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
165 170 175
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
180 185 190
Pro Thr Tyr Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys
210 215 220
Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys
225 230 235 240
Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Lys
245 250
<210> 11
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa 60
gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa 120
gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa 180
tcttctgaag aatacaaagg tggttactac ccgggtaaca cctaccacta ccactctggt 240
ggttcttacc acggttctgg ttaccacggt ggttacaaag gtaaatacta cggtaaagct 300
aaaaaatact actacaaata caaaaactct ggtaaataca aatacctgaa aaaagctcgt 360
aaataccacc gtaaaggtta caaaaaatac tacggtggtg gttcttctgc taaaccgtct 420
tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct 480
tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct 540
tacccgccga cctacaaagc taaaccgtct tacccgccga cctacaaagg tggtggtggt 600
tctggtggtg gtggttctgg tggtggtggt tctaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa 660
gaaaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa gaaaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa 720
gaaaaagaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa gaa 753

Claims (10)

1.一种具有粘附-抗污双功能的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白含有贻贝粘附蛋白和两性离子多肽。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的贻贝粘附蛋白包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的序列。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的两性离子多肽包含SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示的序列。
4.如权利要求1、2或3所述具有粘附-抗污双功能的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白的合成方法，其特征在于：将融合蛋白的基因克隆到质粒载体得到重组表达质粒，重组表达质粒转化宿主细胞后用诱导剂诱导宿主细胞过量表达融合蛋白，分离纯化后得到融合蛋白。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白氨基酸序列为SEQ IDNO.10，核苷酸序列为SEQ ID NO.11。
6.如权利要求5所述的融合蛋白的合成方法，其特征在于重组表达载体是将贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白基因克隆到大肠杆菌表达载体pET‐28a中得到重组表达载体，所述的重组表达载体含有NdeI和HindIII限制性酶切位点，T7强启动子、lca乳糖操纵子以及卡那霉素的抗性筛选基因。
7.如权利要求5所述的融合蛋白的合成方法，其特征在于表达所述融合蛋白的宿主细胞为含有SEQ ID NO.11的核苷酸序列的宿主细胞；或者为含有重组表达载体的宿主细胞。
8.如权利要求5所述的融合蛋白的合成方法，其特征在于所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。
9.如权利要求5所述的融合蛋白的合成方法，其特征在于将贻贝粘附蛋白和两性离子多肽利用基因工程技术进行融合，构建重组表达载体，再将重组表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行融合蛋白的表达，通过柱层析或乙酸提取的方法纯化贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白。
10.如权利要求5所述的融合蛋白的合成方法，其特征在于包括以下步骤：
⑴人工合成贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白基因，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.11所示；
⑵将合成的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白基因克隆到大肠杆菌表达载体pET‐28a中，在融合蛋白基因5’端加入NdeI限制性酶切位点，在基因3’端加入HindIII限制性酶切位点，构建重组表达载体；
⑶将构建成功的重组表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，利用卡那霉素和氯霉素双抗性LB固体培养基平板筛选转化子；
⑷大肠杆菌BL21(DE3)pLysS发酵表达贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白；
⑸贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白的分离纯化。
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