CN107629129A

CN107629129A - 生产和纯化多肽的方法

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Publication number: CN107629129A
Application number: CN201610569812.7A
Authority: CN
Inventors: 林章凛; A·萨亚尼; 周碧红; 赵青; 王胥
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2016-07-19
Filing date: 2016-07-19
Publication date: 2018-01-26
Anticipated expiration: 2036-07-19
Also published as: CN107629129B

Abstract

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明涉及包含第一肽和第二肽的融合蛋白，以及通过表达所述融合蛋白来生产和纯化多肽的方法。

Description

生产和纯化多肽的方法

技术领域

背景技术

随着基因工程和重组蛋白表达技术的日益发展，重组蛋白类生物制品在生物催化和生物医药领域的应用越来越广泛。人们对工业酶制剂和蛋白类药物制剂的需求也越来越大。

作为生物催化剂，酶制剂因其催化效率高、反应温和及环境友好等优势，已经被广泛地应用于多种工业产品的生产中，比如酿酒、洗涤剂、饲料、烘焙、果汁、化妆品和医药中间体等[1]。据统计，全球酶制剂的市场一直保持快速增长的趋势。2013年全球工业酶市场约为48亿美元，预计到2018年会达到71亿美元[2]。

多肽类药物(分子数小于100个氨基酸)因其分子量小，兼具蛋白药物和小分子药物的优点，受到了研究者和患者的青睐[3]。主要包括多肽类激素、抗病毒多肽、抗肿瘤多肽、细胞因子模拟肽和抗菌肽等。在2009-2011年间，美国FDA批准的多肽药物占总批准药物数的11％[4]。2011年，美国FDA批准的25个多肽类药物的全球销售额高达到147亿美元[5]。

尽管酶制剂和多肽药物的市场需求非常大，而且已有的重组蛋白技术已经带来了酶制剂和多肽类药物生产的巨大飞跃，但是目前蛋白类生物制品(尤其是多肽类药物)的价格仍居高不下。其中非常重要的原因是重组多肽的合成与分离纯化过程复杂，生产和纯化成本高。因此，如何实现重组多肽的高效、大量表达，并简化分离流程、降低分离成本，是工业生物技术的重要研究课题。

发明概述

本发明提供了包含第一肽和第二肽的融合蛋白，以及通过表达所述融合蛋白来生产和纯化多肽的低成本、简便、高效的方法，具体技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种分离的融合蛋白，其包含第一肽和第二肽，

所述第一肽由以下通式定义的氨基酸序列组成：

X₁-X₂……X_n-1-X_n，

其中，n为8到20的偶数，所述氨基酸序列的奇数位为苯丙氨酸，偶数位为交替分布的带相反电荷的氨基酸，其中每一带正电荷的氨基酸独立地选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸，每一带负电荷的氨基酸独立地选自天冬氨酸和谷氨酸；

所述第二肽是目的多肽。

在本发明的融合蛋白的一个实施方案中，所述带相反电荷的氨基酸以每一个偶数位变换一次的频率分布。在一些实施方案中，X₂是带负电荷的氨基酸。在另外的实施方案中，X₂是带正电荷的氨基酸。

在本发明的融合蛋白的另一个实施方案中，所述第一肽由以下通式定义的氨基酸序列组成：

[A-B]_m，

其中A＝[F-X_a]_p，B＝[F-X_b]_p，m是1到5的整数，p是1到4的整数，F是苯丙氨酸，X_a和X_b彼此为带相反电荷的氨基酸，其中每一带正电荷的氨基酸独立地选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸，每一带负电荷的氨基酸独立地选自天冬氨酸和谷氨酸，其中所述第一肽中的X_a是相同的或不同的，且所述第一肽中的X_b是相同的或不同的。

在涉及[A-B]_m定义的氨基酸序列组成的肽的一个实施方案中，p＝1，且m为2、3、4或5。在一具体实施方案中，X_a是带负电荷的氨基酸，例如所述第一肽由SEQ ID NO:1、SEQID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。在另外的具体实施方案中，X_a是带正电荷的氨基酸。

在涉及[A-B]_m定义的氨基酸序列组成的肽的另一个实施方案中，p＝2，且m为1或2。在一具体实施方案中，X_a是带负电荷的氨基酸，例如所述第一肽由SEQ ID NO:39或SEQID NO:40所示的氨基酸序列组成。在另外的具体实施方案中，X_a是带正电荷的氨基酸。

在涉及[A-B]_m定义的氨基酸序列组成的肽的另一个实施方案中，p＝3，且m为1。

在涉及[A-B]_m定义的氨基酸序列组成的肽的另一个实施方案中，p＝4，且m为1。

在本发明的融合蛋白的另一个实施方案中，所述第一肽位于所述融合蛋白的C端。

在本发明的融合蛋白的另一个实施方案中，所述第二肽位于所述融合蛋白的N端。

在本发明的融合蛋白的另一个实施方案中，所述第二肽通过间隔物连接于所述第一肽。

在一具体实施方案中，所述间隔物包含SEQ ID NO:5所示序列。

在另一具体实施方案中，所述间隔物包含切割位点。

在另一具体实施方案中，所述切割位点选自化学切割位点、酶法切割位点和自切割位点。

在另一具体实施方案中，所述自切割位点为内含肽。

在另一具体实施方案中，所述内含肽具有SEQ ID NO:6所示的序列。

在本发明的融合蛋白的另一个实施方案中，所述第二肽的长度为20-500个氨基酸残基。

第二方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供了一种表达构建体，其包含本发明的多核苷酸。

第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸或以本发明的表达构建体转化，其中所述宿主细胞能够表达所述融合蛋白。

第五方面，本发明提供了一种制备多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在适合融合蛋白表达的条件下培养本发明的宿主细胞；

(b)在第一pH条件下，使所述宿主细胞破碎，回收不溶部分；

(c)在第二pH条件下，重悬步骤(b)获得的不溶部分；

(d)回收包含融合蛋白的上清液。

在一个实施方案中，第一pH是近中性pH，例如pH 6.8-7.2。

在另一个实施方案中，使所述宿主细胞破碎的方法选自以下处理方式：超声、匀浆、高压(例如在弗氏压碎器中)、低渗(osmolysis)、去垢剂、裂解酶、有机溶剂或其组合。

在另一个实施方案中，第二pH是10或更高，优选11或更高。

在另一个实施方案中，上述制备多肽的方法还包括以下步骤：

(e)通过融合蛋白切割，释放目的多肽；

(f)回收所述目的多肽。

任选地，在回收步骤之前将pH调节至中性pH附近，使得与可溶的目的多肽分离的第一肽重新形成聚集体，从而易于与可溶的目的多肽分离，以有利于目的多肽的纯化。

本发明的融合蛋白在宿主细胞内表达后可通过所述第一肽形成活性聚集体。所述活性聚集体在适合宿主细胞生长和蛋白表达的条件下形成，例如宿主细胞生理培养条件，例如中性pH附近。当pH值调节至较高(例如10或更高)时，包含本发明融合蛋白的所述活性聚集体发生解聚，变成可溶蛋白。

附图说明

图1.示出本发明的融合蛋白表达载体图谱。

图2.示出包含第一肽和作为第二肽的LipA的融合蛋白表达分析。A：SDS-PAGE；B：酶活测定结果。

图3.示出包含第一肽和作为第二肽的GFP的融合蛋白的聚集体在大肠杆菌中分布的结果。(a)GFP-EFK8，(b)GFP-EFRK8，(c)GFP-EFR8，(d)GFP-EVK8。

图4.示出包含第一肽和作为第二肽的LipA的融合蛋白的聚集体在大肠杆菌中分布的结果。(a)LipA-EFK8，(b)LipA-EFRK8，(c)LipA-EFR8，(d)LipA-EVK8。

图5.示出在不同pH下，包含第一肽和作为第二肽的LipA的融合蛋白在固液两相中的分布。(a)LipA-ELK16，(b)LipA-EFK8，(c)LipA-EFRK8，(d)LipA-EFR8，(e)LipA-FEFEFRFR。泳道s：上清中的蛋白；泳道in：沉淀中的蛋白；M为蛋白质分子标准品。

图6.示出包含EFK8肽、内含肽和目的多肽的融合蛋白的表达与纯化结果。

图6A：不同pH下，融合蛋白在固液两相中的分布。(a)PNRC03-Mxe-EFK8融合蛋白；(b)HM-Mxe-EFK8融合蛋白；(c)Sermorelin-Mxe-EFK8融合蛋白；(d)SDF1α-Mxe-EFK8融合蛋白；(e)GLP1-Mxe-EFK8融合蛋白。泳道1：细胞沉淀；泳道2：经pH 10或pH 11的缓冲液重悬解聚并离心后的可溶部分；泳道3：经pH 10或pH 11的缓冲液重悬解聚并离心后的沉淀部分；泳道M：蛋白质分子标准品。

图6B：目的多肽的纯化结果。泳道1：细胞沉淀；泳道2：解聚后的样品；泳道4：切割后上清；泳道5：透析后上清；泳道6：HPLC纯化后样品；泳道s1-s3：蛋白定量标准品(Std)；泳道M：蛋白质分子标准品。

发明详述

本发明并不限于本文所述的具体方法、方案、试剂等，因为这些可以变化。本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的而不是为了限制本发明的范围。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。

本发明涉及分离的融合蛋白。本发明还涉及包含编码所述融合蛋白的核苷酸序列的分离的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的表达构建体。本发明另外涉及能够表达所述融合蛋白的宿主细胞，以及制备多肽的方法。

如本文所用，术语“多肽”和“蛋白”可互换使用，并且定义为由通过肽键连接的氨基酸残基组成的生物分子。如本文所用，“目的多肽”是指可通过本发明的方法生产并纯化的任何多肽或蛋白质，其非限制性例子包括酶、激素、免疫球蛋白链、诸如抗癌多肽的治疗性多肽、诊断性多肽或者可以用于免疫目的的多肽或其生物学活性片段等等。目的多肽可以来自任何来源，包括微生物来源多肽、哺乳动物来源多肽和人工蛋白质(例如融合蛋白或突变的蛋白质)等等。

目的多肽可以是任何长度的多肽和蛋白。可通过本发明的方法生产并纯化的目的多肽的长度可以是20-500个氨基酸残基，例如，大约30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500个氨基酸残基。

本发明目的多肽的生产和纯化可在较温和的pH变化(例如pH 7-11)条件下实现，对于目的多肽的种类和性质没有特殊的限制，可用于多种不同多肽的表达和纯化，且最终目的多肽的产量和产率均较高。

可通过本发明的方法来生产并纯化的“目的多肽”的实例包括但不限于枯草芽孢杆菌脂肪酶A(LipA)、绿色荧光蛋白(GFP)和烟曲霉II型酮胺氧化酶(AMA)、胰高血糖素样肽(GLP-1)、基质细胞衍生因子(SDF-1α)、舍莫瑞林(Sermorelin)、pleurocidin样阳离子抗菌肽NRC-03(PNRC03)和Hinnavin II-Melanocyte(HM)或它们的生物学活性片段等。

本发明融合蛋白的第一肽优选结构相对简单且长度较短的肽，其奇数位为疏水的苯丙氨酸(F)，偶数位为交替分布的带相反电荷的氨基酸，由此构成一侧亲水、一侧疏水的两亲性(amphipathic)结构。其中每一带正电荷的氨基酸独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)，每一带负电荷的氨基酸独立地选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。所述第一肽中带正电荷的氨基酸可以相同或不同，且所述第一肽中带负电荷的氨基酸可以相同或不同。优选的带正电荷氨基酸为赖氨酸(K)和/或精氨酸(R)，优选的带负电荷氨基酸为谷氨酸(E)。

如本文所用，“第一肽”是指与目的多肽部分融合并在宿主细胞表达后能够介导融合蛋白在胞内形成不可溶的活性聚集体的多肽。如本文所用，“活性聚集体”指的是目的多肽部分仍然能够正确折叠并保持原有生物学活性，并且所述目的多肽部分在与所述第一肽分离后能够处于可溶状态。

如本文所用，“交替分布”可以表示带相反电荷的氨基酸以每一个偶数位变换一次的频率分布。在这种情况下，本发明融合蛋白的第一肽例如可以由以下氨基酸序列组成：“F-AA⁺-F-AA^--F-AA⁺-F-AA^-”、“F-AA^--F-AA⁺-F-AA^--F-AA⁺”、“F-AA⁺-F-AA^--F-AA⁺-F-AA^--F-AA⁺-F-AA^--F-AA⁺-F-AA^-”或“F-AA^--F-AA⁺-F-AA^--F-AA⁺-F-AA^--F-AA⁺-F-AA^--F-AA⁺”。其中，AA⁺代表本文限定的带正电荷的氨基酸，AA^-代表本文限定的带负电荷的氨基酸。

如本文所用，“交替分布”还可以表示带相反电荷的氨基酸以每两个或更多个偶数位变换一次的频率分布。在这种情况下，本发明融合蛋白的第一肽例如可以由以下氨基酸序列组成：“F-AA⁺-F-AA⁺-F-AA^--F-AA^-”、“F-AA^--F-AA^--F-AA⁺-F-AA⁺”、“F-AA⁺-F-AA⁺-F-AA^--F-AA^--F-AA⁺-F-AA⁺-F-AA^--F-AA^-”、“F-AA^--F-AA^--F-AA⁺-F-AA⁺-F-AA^--F-AA^--F-AA⁺-F-AA⁺”、“F-AA⁺-F-AA⁺-F-AA⁺-F-AA^--F-AA^--F-AA^-”、“F-AA^--F-AA^--F-AA^--F-AA⁺-F-AA⁺-F-AA⁺”、“F-AA⁺-F-AA⁺-F-AA⁺-F-AA⁺-F-AA^--F-AA^--F-AA^--F-AA^-”或“F-AA^--F-AA^--F-AA^--F-AA^--F-AA⁺-F-AA⁺-F-AA⁺-F-AA⁺”。其中，AA⁺代表本文限定的带正电荷的氨基酸，AA^-代表本文限定的带负电荷的氨基酸。

具有上述示例性结构的本发明融合蛋白的第一肽之间可以通过分子间氢键作用形成反平行β折叠，其中疏水侧的苯丙氨酸(F)通过苯环的π-π堆积可以发生相互作用，亲水侧的带正电荷的氨基酸与带负电荷的氨基酸通过静电效应发生相互作用。在中性pH下，所述第一肽发生上述相互作用，导致融合蛋白形成不可溶聚集体，而在较低pH(例如4或更低)或者在较高pH下(例如10或更高)，带负电荷氨基酸与带正电荷氨基酸的质子化和去质子化引发的电荷排斥作用会破坏上述相互作用，导致融合蛋白聚集体稳定性变差而解聚，成为可溶性多肽。

本发明融合蛋白的第一肽是长为8-20个氨基酸残基的肽，优选长度为8、12、16或20个氨基酸残基的肽，例如具有上述示例性结构的肽。由于自身长度较短，所述肽的表达不会对宿主细胞例如细菌造成较大的负担，同时使得目的多肽以明显更高的量表达，并存在于包涵体中。

本发明融合蛋白的第一肽的非限制性优选实例如SEQ ID NO:1(FEFKFEFK)所示的EFK8、如SEQ ID NO:2(FEFRFEFK)所示的EFRK8、如SEQ ID NO:3(FEFRFEFR)所示的EFR8、如SEQ ID NO:39所示的FEFEFRFR和如SEQ ID NO:40所示的FEFEFKFK。

本发明融合蛋白的第一肽的带电荷的氨基酸中，带正电荷的氨基酸占例如40-60％，例如大约40％、大约50％、大约60％，带负电荷氨基酸占例如40-60％，例如大约40％、大约50％、大约60％。优选地，本发明融合蛋白的第一肽的带电荷的氨基酸中，带正电荷的氨基酸与带负电荷的氨基酸各占50％。

在一些实施方案中，本发明的融合蛋白中的第一肽和第二肽通过间隔物连接。如本文所用，“间隔物”是指具有一定长度的由低疏水性和低电荷效应的氨基酸组成的多肽，其用于融合蛋白时可以使所连接的各部分充分展开、互不干扰地充分折叠成各自的天然构象。本领域常用的间隔物包括例如，富含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的柔性的GS型接头；富含脯氨酸(P)和苏氨酸(T)的刚性的PT型接头。由于PT型接头通常相对于GS型接头具有更好的蛋白酶耐受性，因而在本发明中优选使用PT型接头。在一些具体实施方案中，本发明所使用的间隔物包含序列PTPPTTPTPPTTPTPT(SEQ ID NO:5)。

在多肽类药物的生产中，常常需要重组生产的多肽与目的多肽具有一致的序列，即两端不具有额外的氨基酸残基。为了实现此目的，在一些实施方案中，本发明的融合蛋白中的间隔物还包含切割位点。通过切割所述切割位点，可以将目的多肽从聚集体中分离。

合适的切割位点包括可以化学切割、酶法切割或自切割的切割位点，或本领域技术人员已知的其它任何切割位点。本发明中优选的切割位点可以进行自切割，例如，其包含可自切割的内含肽的氨基酸序列。这是因为基于内含肽的切割方法不需要外加酶或使用如化学法中所用的溴化氢等有害物质，而仅仅需要改变聚集体所处的缓冲环境就能简单地诱导切割。

本领域已知多种自切割内含肽，例如NEB公司的一系列具有不同自切割特性的内含肽。在一个具体的实施方案中，所述内含肽具有SEQ ID NO:6所示的序列，通过在缓冲体系中加入合适量的二硫苏糖醇(DTT)就可诱导该内含肽在其羧基端的自切割。

本发明的切割在融合蛋白处于可溶状态下进行，并得到可溶的目的多肽。与在融合蛋白处于不溶状态下进行切割或另外添加促溶肽的方法相比，本发明的方法成本更低，更为简便、高效，同时避免了聚集体切割后目的多肽无法有效释放到上清的问题。

本发明也涉及多核苷酸，其包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列或其互补序列。如本文所用，“多核苷酸”是指多个核苷酸通过3’-5’-磷酸二酯键连接而成的大分子，其中所述核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。本发明的多核苷酸的序列可以针对不同的宿主细胞(如大肠杆菌)进行密码子优化，从而改善融合蛋白的表达。进行密码子优化的方法是本领域已知的。

本发明也涉及包含本发明上述的多核苷酸的表达构建体。在本发明的表达构建体中，编码所述融合蛋白的多核苷酸的序列与表达控制序列可操纵地连接以进行希望的转录及最终在宿主细胞中生产所述融合蛋白。合适的表达控制序列包括但不限于启动子、增强子、核糖体作用位点如核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、转录剪接序列、转录终止序列和稳定mRNA的序列等等。

用于本发明的表达构建体的载体包括那些在宿主细胞中自主复制的载体，如质粒载体；还包括能够整合到宿主细胞DNA中并和宿主细胞DNA一起复制的载体。可商购获得许多适于本发明的载体。在一个具体实施方案中，本发明的表达构建体衍生自Novagen公司的pET30a(+)。

本发明还涉及一种宿主细胞，其含有本发明的多核苷酸或以本发明的表达构建体转化，其中所述宿主细胞能够表达本发明的融合蛋白。用于表达本发明融合蛋白的宿主细胞包括原核生物、酵母和高等真核细胞。示例性的原核宿主包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙门氏菌属(Salmonella)以及假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。在优选的实施方案中，宿主细胞是埃希氏菌属细胞，优选是大肠杆菌。在本发明的一个具体实施方案中，所使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)菌株细胞(Novagen)。

可以通过许多已熟知的技术之一将本发明的重组表达构建体导入宿主细胞，这样的技术包括但不限于：热激转化，电穿孔，DEAE-葡聚糖转染，显微注射，脂质体接介导的转染，磷酸钙沉淀，原生质融合，微粒轰击，病毒转化及类似技术。

本发明还涉及制备多肽的方法，在适合融合蛋白表达的条件下培养本发明的宿主细胞，包括以下步骤：在第一pH条件下，使所述宿主细胞破碎，回收不溶部分；在第二pH条件下，重悬步骤(b)获得的不溶部分；回收包含融合蛋白的上清液。

本发明人惊奇地发现，本发明的融合蛋白在生理培养条件(正常温度、正常pH值、正常培养和诱导时间)下培养的宿主细胞内表达后便可直接形成处于包涵体内的不溶性活性聚集体。与可溶状态表达相比，这种不溶性活性聚集体可以防止融合蛋白在胞内被降解，大大增加融合蛋白或目的多肽的稳定性。同时，由于表达是在正常生理培养条件下培养的宿主细胞内进行，既避免了宿主细胞培养周期的延长，同时因培养条件适宜可以提高融合蛋白的产量和产率。

在本发明中，使宿主细胞破碎的方法选自本领域常用的处理方式，例如超声、匀浆、高压(例如在弗氏压碎器中)、低渗(osmolysis)、去垢剂、裂解酶、有机溶剂或其组合，并且所述破碎在第一pH条件(即近中性pH，例如pH 6.8-7.2)下进行，由此使得宿主细胞的细胞膜和包涵体破碎，活性聚集体从包涵体中释放出来，但仍然保持不溶状态。

此外，释放出来的聚集体直接以沉淀形式回收，省略了通过改变环境条件(例如温度、离子浓度、pH值等)以获得沉淀状态的融合蛋白的步骤，也避免了剧烈的环境条件变化对蛋白稳定性及活性的影响。

本发明进一步在第二pH条件(例如10或更高，优选11或更高)下重悬获得的不溶部分，回收包含融合蛋白的上清液，并可以直接进行后续纯化处理，无需很高的盐浓度，从而避免离子残留，减少操作次数，降低成本。

实施例

为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将通过实施例对本发明实施方式作进一步地详细描述。应当理解实施例不应理解为限制性的，本领域技术人员能够基于本发明的原理对实施方式做进一步的调整。

以下实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见，例如，《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell,David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物均由英俊生物(Invitrogen)合成。

实施例1：以LipA或GFP作为目的多肽构建融合蛋白表达载体

本实施例中使用一组肽：EFK8、EFRK8、EFR8、EVK8和FEFEFRFR，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-4和SEQ ID NO:39所示。

下面，以其中一种肽EFK8为例，说明构建本申请实施例中所使用的表达载体pET-30a(+)-LipA-EFK8的方法：

首先使用在线工具DNAworks设计EFK8肽的核苷酸序列。然后，根据DNAworks设计的核苷酸序列，使用Oligo 7软件设计并合成如表1所示的一对引物LipA-For和EFK8-Low。之后，以之前构建的质粒pET30a(+)-LipA-ELK16(参见WO 2014/056199，所述质粒的全长序列可见于SEQ ID NO:12)为模版，利用如下正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增获得LipA-EFK8系列肽的多核苷酸片段：上游引物5’-GCGATACATATGCACCATCACCATCA-3’(SEQ ID NO:17，带下划线碱基为限制性内切酶Nde I识别位点)，和下游引物5’-CCGCTCGAGTCATTTGAATTCGAACTTGAACTCGAACGGCGTCGGGGTTGGGGTGGTTGG-3’(SEQ ID NO:18，带下划线碱基为限制性内切酶Xho I识别位点)。

表1用于扩增本发明肽的引物列表

^a引物下划线部分分别为限制性内切酶Hind III和Xho I的识别位点。

配制如下PCR反应液：模板(稀释10倍)，2μL；5×fast pfu缓冲液，20μL；dNTPs，8μL；上游引物(20μM)，4μL；下游引物(20μM)，4μL；Fast pfu(全式金公司)，2μL；双重蒸馏水，60μL；总计100μL。

按照如下反应程序扩增LipA-EFK8基因：步骤1，95℃，5min；步骤2，95℃，20s；步骤3，59℃，20s；步骤4，72℃，15s；步骤5，返回步骤2共29次；步骤6，72℃，5min；步骤7，4℃，长时间。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带。

将由上述得到的PCR产物用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切后分别与经同样酶双酶切的商业化质粒pET-30a(+)进行连接。然后，将连接产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所克隆的pET-30a(+)-LipA-EFK8序列正确。

通过类似的方法，以质粒pET30a(+)-LipA-ELK16(SEQ ID NO:12)为模版，分别采用LipA-For(SEQ ID NO:17)和EFRK8-Low(SEQ ID NO:19)、LipA-For(SEQ ID NO:17)和EFR8-Low(SEQ ID NO:20)、LipA-For(SEQ ID NO:17)和EVK8-Low(SEQ ID NO:21)、LipA-For(SEQ ID NO:17)和FEFEFRFR-Low(SEQ ID NO:41)这4对引物，扩增得到LipA-EFRK8、LipA-EFR8、LipA-EVK8和LipA-FEFEFRFR这4个基因片段。进一步对这些基因片段使用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切后，分别与经同样酶双酶切的商业化质粒pET-30a(+)进行连接，并化转到大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)感受态细胞中。经阳性克隆筛选和测序，获得3种具有正确序列的表达质粒pET-30a(+)-LipA-EFRK8、pET-30a(+)-LipA-EFR8、pET-30a(+)-LipA-EVK8和pET-30a(+)-LipA-FEFEFRFR。

对于pET-30a(+)-GFP-EFK8表达载体，其具体构建流程如下：首先，提取上述步骤构建的pET-30a(+)-LipA-EFK8质粒，使用限制性内切酶Hind III和Xho I进行双酶切处理，获得Hind III-PT接头-EFK8-Xho I基因片段。然后，将双酶切处理过的基因片段插入到经相同酶切处理的之前构建的pET-30a(+)-GFP-ELK16质粒(所述质粒的全长序列可见于SEQID NO:13)，用EFK8取代ELK16，获得表达GFP-EFK8融合蛋白的质粒载体。

同样的，可提取pET-30a(+)-LipA-EFRK8、pET-30a(+)-LipA-EFR8和pET-30a(+)-LipA-EVK8质粒，经双酶切Hind III和Xho I处理后，获得Hind III-PT接头-EFRK8-Xho I、Hind III-PT接头-EFR8-Xho I和Hind III-PT接头-EVK8-Xho I这3个基因片段。分别将其插入到经相同双酶切处理的pET-30a(+)-GFP-ELK16质粒(SEQ ID NO:13)，可获得分别表达GFP-EFRK8、GFP-EFR8和GFP-EVK8这3种融合蛋白的质粒载体。

此外，本申请实施例中所使用的对照蛋白的表达载体pET-30a(+)-LipA-native和pET-30a(+)-GFP-native均为本发明人已构建但未公开的质粒，其全长序列分别为SEQ IDNO:14和SEQ ID NO:15。本领域技术人员可以容易地制备这些质粒。

实施例2：以LipA作为目的多肽的融合蛋白的表达和酶活测定

2.1融合蛋白的诱导表达

将实施例1中构建好的菌株(含有质粒pET-30a(+)-LipA-native、pET-30a(+)-LipA-EFK8、pET-30a(+)-LipA-EFRK8、pET-30a(+)-LipA-EFR8和pET-30a(+)-LipA-EVK8)接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，并在37℃摇床中培养约1.5-2h至对数期(OD₆₀₀＝0.4-0.6)，加入0.2mM IPTG，在30℃下诱导6小时，收获细胞，并测量菌浓度OD₆₀₀。

本发明融合蛋白的表达在正常生理培养条件(正常温度、正常pH值、正常培养和诱导时间)下培养的宿主细胞内进行，既避免了宿主细胞培养周期的延长，同时因培养条件适宜可以提高融合蛋白的产量和产率。

2.2SDS-PAGE测定

收获2.1所得的细胞，用等体积的缓冲液(50mM Tris-HCl，50mM NaCl，5％甘油，pH7.2)重悬。在冰上通过超声破碎细胞(破碎条件为：功率200W，超声时间3s，间隔时间3s，超声次数99次)。超声完成后，通过离心小心地分离缓冲液的上清和沉淀。为了尽可能去除沉淀中混杂的可溶成分，用等体积的缓冲液将得到的沉淀洗涤两遍。上清液和沉淀重悬液直接用于相应的SDS-PAGE测定。

SDS-PAGE的分析结果如图2A所示。LipA-EFK8、LipA-EFRK8和LipA-EFR8这3种融合蛋白均大量地分布在沉淀中，大约有89-94％的融合蛋白形成了聚集体。而融合蛋白LipA-EVK8则与对照组(LipA-native，单独表达的LipA)相似，大量以可溶形式表达，可溶蛋白占总蛋白量的比例约为92％。该结果表明，EFK8、EFRK8和EFR8这3个肽都可以诱导LipA在大肠杆菌中形成聚集体，而相对疏水性较弱的EVK8则无法诱导融合蛋白在胞内聚集。

2.3酶活测定

收获2.1所得的细胞，用等体积的缓冲液(50mM Tris-HCl，50mM NaCl，5％甘油，pH7.2)重悬。在冰上通过超声破碎细胞(破碎条件为：功率200W，超声时间3s，间隔时间3s，超声次数99次)。超声完成后，通过离心小心地分离上清和沉淀。为了尽可能去除沉淀中混杂的可溶成分，用等体积的缓冲液将得到的沉淀洗涤两遍。上清液和沉淀重悬液直接用于相应的酶活测定。其中，脂肪酶活性的定量测定方法如下：

测定LipA对硝基苯酚丁酸酯(pNPB，C4)的活性。脂肪酶活性测量方法详见文献(Winkler，U.K.，M.Stuckmann，Glycogen，Hyaluronate，and Some Other PolysaccharidesGreatly Enhance the Formation of Exolipase by Serratia marcescens，JOURNAL OFBACTERIOLOGY，1979，138(3):663-670)。活性定义为：在测定条件下，1分钟内水解上述底物产生1nmol的对硝基苯酚(p-nitrophenol)或是脂肪酸(fatty acid)所需要的酶量定义为1个活性单位。

融合蛋白的酶活数据如图2B所示，LipA-EFK8、LipA-EFRK8和LipA-EFR8融合蛋白沉淀均表现出对pNPB底物的水解活性，且这3种融合蛋白沉淀的活性相当，融合蛋白沉淀的活性占总融合蛋白活性的比例约为93-95％。可溶的LipA-native和LipA-EVK8融合蛋白对pNPB也表现出水解活性。以LipA-native的总酶活为100％，LipA-EVK8的可溶蛋白的活性为140％，而LipA-EFK8、LipA-EFRK8和LipA-EFR8这3种沉淀的酶活则约为168％。

综合SDS-PAGE和酶活数据(图2A和B)，本实施例中涉及的4种作为融合蛋白中的第一肽中，3种疏水性较强的肽(EFK8、EFRK8和EFR8)能够诱导LipA在大肠杆菌中形成具有脂肪酶催化活性的融合蛋白聚集体。而奇数位采用缬氨酸(V)作为疏水氨基酸的EVK8肽因疏水性相对较弱，无法诱导LipA在大肠杆菌中形成聚集体。

实施例3：以GFP作为目的多肽的融合蛋白的表达及其在胞内的分布

将实施例1中构建好的菌株接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，并在37℃摇床中培养至对数期(OD₆₀₀＝0.4-0.6)，加入0.2mM IPTG，在23℃下诱导22小时，收获细胞。

将收获的细胞用4％的多聚甲醛在4℃处理1h。GFP细胞的荧光共焦显微观测在Zeiss710倒置共聚焦显微镜(Zeiss LSM 710confocal microscope)上完成，激发波长为488nm。

GFP融合蛋白在细胞内的分布情况如图3所示。从荧光照片可以清楚地看到：表达GFP-EVK8融合蛋白的大肠杆菌，其荧光均匀分布在细胞中，与单独表达GFP的大肠杆菌的荧光结果很相似。而对于表达了融合EFK8、EFRK8和EFR8这3种肽的GFP的大肠杆菌，其荧光分布非常相似，都呈现出明显的局部分布。该结果说明，GFP-EVK8在大肠杆菌中可溶表达，而GFP-EFK8、GFP-EFRK8和GFP-EFR8这3种融合蛋白则以聚集体的形式表达，而且聚集体中的目的多肽具有很高的生物活性。

实施例4：以LipA作为目的多肽的融合蛋白在胞内的分布

发明人进一步对LipA融合蛋白在大肠杆菌中的分布进行了研究。通过对表达了LipA融合蛋白的大肠杆菌进行超薄细胞切片，用透射电子显微镜观察LipA融合蛋白在胞内的分布，并与相应GFP融合蛋白在胞内的分布结果进行比较。

实验方法如下：

将相应在实施例1中构建好的菌株(含质粒pET-30a(+)-LipA-EFK8、pET-30a(+)-LipA-EFRK8、pET-30a(+)-LipA-EFR8和pET-30a(+)-LipA-EVK8)接种到含50g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，并在37℃摇床中培养至对数期(OD₆₀₀＝0.4-0.6)，加入0.2mM IPTG，在30℃下诱导6小时，收获细胞。

依次加入2.5％戊二醛溶液和2％四氧化锇(osmium tetraoxide)溶液对细胞进行固定处理。固定的细胞经一系列梯度浓度(30％，50％，70％，90％，100％)的乙醇脱水步骤后，用环氧树脂包埋。利用超薄切片机(Lecia EM UC6)获得超薄细胞切片，然后用醋酸铀(uranyl acetate)溶液和柠檬酸铅(lead citrate)溶液染色一定时间，在Hitachi H-7650B透射式电子显微镜观察，电子加速电压为80kV。

实验结果如下：LipA-EVK8融合蛋白均匀分布在细胞中，而LipA-EFK8、LipA-EFRK8和LipA-EFR8这3种融合蛋白则形成明显的颗粒状包涵体，分布在细胞质中。该结果与实施例3中GFP融合蛋白在胞内的分布结果是一致的。

实施例5：不同pH条件下融合蛋白的聚集

本实施例对5种融合蛋白聚集体LipA-EFK8、LipA-EFRK8、LipA-EFR8、LipA-FEFEFRFR和LipA-ELK16(对照)在不同pH条件的聚集进行了研究。

实验方法如下：

将相应在实施例1中构建好的菌株(含质粒pET-30a(+)-LipA-EFK8、pET-30a(+)-LipA-EFRK8、pET-30a(+)-LipA-EFR8和pET-30a(+)-LipA-FEFEFRFR)，以及对照菌株(含质粒pET-30a(+)-LipA-ELK16，SEQ ID NO:12)接种到含50g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，并在37℃摇床中培养约1.5-2h至对数期(OD₆₀₀＝0.4-0.6)，加入0.2mM IPTG，在30℃下诱导6小时，收获细胞。

收获上述诱导所得的细胞，用等体积的缓冲液(50mM Tris-HCl，50mM NaCl，5％甘油，pH 7.2)重悬。在冰上通过超声破碎细胞(破碎条件为：功率200W，超声时间3s，间隔时间3s，超声次数99次)。超声完成后，通过离心小心地分离上清和沉淀。为了尽可能去除沉淀中混杂的可溶成分，用等体积的缓冲液将得到的沉淀洗涤两遍，获得纯化后的融合蛋白聚集体。然后，使用不同pH值(pH分别为4、7、10或11)的缓冲液重悬上述融合蛋白沉淀。将重悬液置于4℃，过夜振荡。通过离心分离得到上清和沉淀。上清液和沉淀重悬液直接用于相应的SDS-PAGE测定。

SDS-PAGE的分析结果如图5所示。当pH为7时，5种融合蛋白均以聚集体状态保留在沉淀中。当pH为4时，融合蛋白聚集体状态均未发生改变，仍保留在沉淀中，说明该pH条件不能改变融合蛋白的聚集状态。

当pH为10时，融合蛋白LipA-ELK16(ELK16：奇数位采用亮氨酸(L)作为疏水氨基酸，即LELELKLKLELELKLK)仍全部在沉淀中，无法解聚。

当pH为10时，LipA-EFK8、LipA-EFRK8和LipA-EFR8部分融合蛋白保留在沉淀中、部分融合蛋白分布在上清中。该结果表明，pH 10的缓冲液可以在一定程度上破坏上述3种融合蛋白的聚集，使融合蛋白沉淀发生解聚，即pH 10的缓冲液能够使部分融合蛋白聚集体解聚。这可能是因为在较低pH(pH 4)的缓冲液中，融合蛋白聚集体的稳定性较好，不会发生解聚；在较高pH(pH 10)的缓冲液中，融合蛋白聚集体稳定性变差，故发生解聚。

当pH为10时，LipA-FEFEFRFR的解聚效果不佳(结果未示)；但当pH为11时，与上述3种融合蛋白类似，LipA-FEFEFRFR部分融合蛋白保留在沉淀中、部分融合蛋白分布在上清中。

通过对pH 10或11条件下4种融合蛋白LipA-EFK8、LipA-EFRK8、LipA-EFR8和LipA-FEFEFRFR分布在上清和沉淀中的蛋白进行定量分析，可知：对于LipA-EFK8，在pH 10时，约84％的融合蛋白分布在上清中，对于LipA-EFRK8和LipA-EFR8，分别有63％和46％的融合蛋白分布在上清中，而对于LipA-FEFEFRFR，在pH 11时，约95％的融合蛋白分布在上清中。上述结果说明，4种融合蛋白LipA-EFK8、LipA-EFRK8、LipA-EFR8和LipA-FEFEFRFR具有很好的pH响应，在胞内(pH 7左右)为聚集状态，在胞外pH 10或11的条件下发生解聚。其中LipA-EFK8融合蛋白最容易发生解聚，其次是LipA-EFRK8、LipA-EFR8和LipA-FEFEFRFR。而对照蛋白聚集体LipA-ELK16无法发生解聚。

实施例6：构建五种医药用多肽或抗菌肽的EFK8融合表达载体

本实施例中选定了3种医药用多肽(舍莫瑞林Sermorelin、胰高血糖素样肽GLP-1和基质细胞衍生因子SDF-1α)和2种抗菌肽(pleurocidin-like cationic antimicrobialpeptides NRC-03(PNRC03)和Hinnavin II-Melanocyte(HM))作为目的多肽，通过本发明的方法进行重组生产和纯化。所述目的多肽信息见下表2。对编码以上目的多肽的核苷酸序列进行密码子优化(见表2)，以便其能更好地在大肠杆菌中表达，并采用化学合成法获得相应编码序列。

表2目的多肽信息

在构建表达目的多肽的重组质粒之前，本实施例中先构建一个中间质粒pET-30a(+)-LipA-Mxe-EFK8。具体构建方法如下：提取实施例1中构建的重组质粒pET-30a(+)-LipA-EFK8和实验室之前构建的质粒pET-30a(+)-LipA-Mxe-ELK16(所述质粒的全长序列可见于SEQ ID NO:16)，对两种质粒均使用Hind III和Xho I进行双酶切处理，通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收处理，分别回收Hind III-PT连接头-EFK8-Xho I小片段和pET-30a(+)-LipA-Mxe大片段。然后使用T4连接酶，连接上述两个回收的片段，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，通过测序验证，获得正确序列的中间质粒pET-30a(+)-LipA-Mxe-EFK8。

下面以PNRC03为例说明5种目的多肽的EFK8融合表达构建体的构建方法。

表3引物列表

^a引物下划线部分分别为限制性内切酶Nde I和Spe I的识别位点。

本实施例中采用PNRC03-For和Mxe-Rev分别为上下游引物(见表3)，以化学合成的PNRC03基因为模版。

按照如下反应程序进行PCR反应：步骤1，95℃，5min；步骤2，95℃，20s；步骤3，59℃，20s；步骤4，72℃，15s；步骤5，返回步骤2共29次；步骤6，72℃，5min；步骤7，4℃，长时间。

由此得到具有Nde I和Spe I两个酶切位点的PNRC03基因片段

然后，对获得的基因片段进行Nde I和Spe I双酶切处理，然后将双酶切处理的基因片段插入到同样经过Nde I和Spe I双酶切处理的中间质粒pET-30a(+)-LipA-Mxe-EFK8中，并将重组质粒化转导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，通过菌落PCR和质粒测序鉴定得到阳性克隆，并对阳性克隆进行测序验证，获得能够编码目的融合蛋白的重组质粒pET-30a(+)-PNRC03-Mxe-EFK8。同样的方法可以分别得到编码其它4种目的融合蛋白的重组质粒：pET-30a(+)-HM-Mxe-EFK8、pET-30a(+)-Sermorelin-Mxe-EFK8、pET-30a(+)-GLP1-Mxe-EFK8和pET30a(+)-SDF 1α-Mxe-EFK8。

实施例7：五种目的多肽的表达和初步纯化

将实施例6中构建好的5种菌株(含pET-30a(+)-PNRC03-Mxe-EFK8、pET-30a(+)-HM-Mxe-EFK8、pET-30a(+)-Sermorelin-Mxe-EFK8、pET-30a(+)-GLP1-Mxe-EFK8和pET30a(+)-SDF 1α-Mxe-EFK8)，接种到含50g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，并在37℃摇床中培养约1.5-2h至对数期(OD₆₀₀＝0.4-0.6)。其中，在含pET-30a(+)-PNRC03-Mxe-EFK8和pET-30a(+)-HM-Mxe-EFK8质粒的菌液中分别加入0.2mM IPTG，在30℃下诱导10小时，收获细胞；在含 pET-30a(+)-Sermorelin-Mxe-EFK8、pET-30a(+)-GLP1-Mxe-EFK8和pET30a(+)-SDF 1α-Mxe-EFK8质粒的菌液中分别加入0.2mM IPTG，在37℃下诱导6小时，收获细胞，并测量菌浓度OD₆₀₀。

将收获的细胞用缓冲液(50mM Tris-HCl，50mM NaCl，5％甘油，pH 7.2)重悬。在冰上通过超声破碎细胞(破碎条件为：功率200W，超声时间3s，间隔时间3s，超声次数99次)。超声完成后，通过离心小心地分离上清和沉淀。为了尽可能去除沉淀中混杂的可溶成分，用等体积的缓冲液将得到的沉淀洗涤两遍，获得纯化后的融合蛋白聚集体。然后，使用pH 10或11的缓冲液重悬上述融合蛋白沉淀，并将重悬液置于4℃，过夜振荡，得到溶解的融合蛋白。之后，在解聚的融合蛋白溶液中加入DTT(终浓度40mM)诱导内含肽Mxe切割，在4℃切割24h。

进一步地，本实施例将对上述5种切割后得到目的多肽混合物进行反相HPLC纯化。在HPLC纯化之前，先使用透析的方法(截留分子量为2KDa的透析卡)将样品的缓冲液替换成10mM、pH 7.2的磷酸钾缓冲液，去除样品中的DTT和其它高浓度的盐成分。然后，通过反相HPLC对样品中的目的多肽进行纯化和收集。详细过程如下：

配置流动相A：100％H₂O(含0.1％TFA)，与流动相B：80％乙腈(含0.12％TFA)；在流速为1mL/min的条件下，使用含5％B的流动相平衡HPLC色谱柱，所使用的为反相C18色谱柱；采用梯度洗脱，使在0～60min内流动相组成由5％上升至80％B，同时检测波长为215nm(肽键特征吸收波长)与280nm(氨基酸Tyr、Trp与Phe的共轭双键吸收波长)的吸光度曲线；使用高效液相色谱系统自动收集器采集洗脱过程中出现的吸收峰对应级分；将吸收峰对应级分分装、冻干并保存于-20℃条件下，用水将冻干样品重悬后用SDS-PAGE检测吸收峰对应的级分，并进一步进行质谱检测。

将上述所有样品都进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE的结果如图6A和6B所示：分别为泳道1：切割前的细胞沉淀，可检测到清晰的融合蛋白三联体表达成的酶聚集体；泳道2和3：经pH为10或pH为11的缓冲液重悬解聚并离心后的上清部分和沉淀部分，可检测到清晰的融合蛋白三联体条带；泳道4：经内含肽自切割的可溶部分，可检测到清晰的目的多肽条带；泳道5：对泳道4样品进行透析后样品；泳道6：经HPLC精制纯化后样品，可检测到清晰的目的多肽条带；泳道s1-s3：蛋白定量标准品，其中较大的条带为牛血清白蛋白BSA(67kD)，上样量依次为3μg、1.5μg、0.75μg；其中较小的条带为抑菌肽Aprotinin(6.5kD)，上样量依次为1.5μg、0.75μg、0.3μg。

依照蛋白定量标准品，应用Bio-Rad公司的Quantity ONE凝胶定量分析软件对目的条带进行光密度分析，可计算得出融合蛋白形成的聚集体产量、解聚的融合蛋白的产量、在内含肽介导的自切割之后释放到上清中的目的多肽产量、以及经HPLC纯化后目的多肽的产量，结果如表4所示。

表4目的多肽表达和纯化结果

^a融合蛋白中Mxe自切割的效率定义：(聚集体中融合蛋白的表达量-切割后融合蛋白剩余量)/聚集体中融合蛋白的表达量×100％；^b ND为无法测定。^c先前工作中相同多肽的表达量。^d No表示没人做过该数据。^e失败表示没有成功的用HPLC纯化。

具体结果如下：

(1)5种三联体融合蛋白(PNRC03-Mxe-EFK8、HM-Mxe-EFK8、Sermorelin-Mxe-EFK8、GLP1-Mxe-EFK8和SDF 1α-Mxe-EFK8)均以沉淀形式存在，说明EFK8可以诱导上述5种目的多肽和内含肽Mxe的融合蛋白在大肠杆菌中形成聚集体。经定量计算可知，融合蛋白聚集体的表达量约为102.6-112.6mg/L菌液。

(2)使用pH 10的缓冲液，PNRC03-Mxe-EFK8和GLP1-Mxe-EFK8融合蛋白聚集体能发生解聚，大部分的融合蛋白都变成了可溶蛋白，进入到上清中。但是，另外3种融合蛋白HM-Mxe-EFK8、Sermorelin-Mxe-EFK8和SDF 1α-Mxe-EFK8均未发生解聚，绝大部分蛋白仍在沉淀中。

由于5种目的多肽的等电点分别为：PNRC03的pI为12.19、HM的pI为10.09、Sermorelin的pI为9.99、GLP1的pI为5.53、SDF 1α的pI为9.81。显然，除了PNRC03和GLP1之外，其他3种目的多肽的等电点均在pH 10左右。故本实施例中进一步使用了pH 11的缓冲液溶解融合蛋白。结果发现，3种融合蛋白聚集体均发生溶解，超过95％的聚集体都变成可溶蛋白。

(3)可溶的融合蛋白经内含肽Mxe自切割，目的多肽同Mxe-EFK8分离。对于不同的目的多肽融合蛋白，其切割效率有所不同，约为43.5-74.3％。对于不同的目的多肽，其融合蛋白的切割效率有所不同。

(4)切割后，释放出来的目的多肽的产量也有所不同，其中：PNRC03和SDF 1α这两种目的多肽的产量较高，每升菌液的多肽产量分别16.42mg和17.4mg。

(5)切割后的溶液中，除了目的多肽，还有切割后的Mxe-EFK8蛋白和未切割完全的三联体融合蛋白，所得目的多肽需进一步纯化，方可获得高纯度的产品。

(6)经反相HPLC，PNRC03、HM、Sermorelin和GLP1这4种目的多肽被成功地回收；

(7)SDF-1α样品在透析的过程中会形成大量沉淀，故无法使用HPLC进行分离纯化。推测可能的原因是，在透析去除DTT的过程中，SDF 1α中的3个半胱氨酸形成了错误的二硫键，导致多肽不可溶。后续可以尝试使用凝胶过滤层析，在含有DTT等还原剂的环境下进一步纯化该多肽。

本发明的方法具有普遍的适用性，适于多种多肽的表达和纯化，并且最终多肽的产量和产率均普遍较高(见表4)。

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Claims

1.分离的融合蛋白，其包含第一肽和第二肽，

所述第一肽由以下通式定义的氨基酸序列组成：

X₁-X₂……X_n-1-X_n，

其中，n为8到20的偶数，所述氨基酸序列的奇数位为苯丙氨酸，偶数位为交替分布的带相反电荷的氨基酸，其中每一带正电荷的氨基酸独立地选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸，每一带负电荷的氨基酸独立地选自天冬氨酸和谷氨酸，

所述第二肽是目的多肽。

2.权利要求1的融合蛋白，其中所述带相反电荷的氨基酸以每一个偶数位变换一次的频率分布。

3.权利要求2的融合蛋白，其中X₂是带负电荷的氨基酸。

4.权利要求2的融合蛋白，其中X₂是带正电荷的氨基酸。

5.权利要求1的融合蛋白，其中所述第一肽由以下通式定义的氨基酸序列组成：

[A-B]_m，

6.权利要求5的融合蛋白，其中p＝1，且m为2、3、4或5。

7.权利要求6的融合蛋白，其中X_a是带负电荷的氨基酸。

8.权利要求3或7的融合蛋白，其中所述第一肽由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列组成。

9.权利要求6的融合蛋白，其中X_a是带正电荷的氨基酸。

10.权利要求5的融合蛋白，其中p＝2，且m为1或2。

11.权利要求10的融合蛋白，其中X_a是带负电荷的氨基酸。

12.权利要求11的融合蛋白，其中所述第一肽由SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列组成。

13.权利要求10的融合蛋白，其中X_a是带正电荷的氨基酸。

14.权利要求5的融合蛋白，其中p＝3，且m为1。

15.权利要求5的融合蛋白，其中p＝4，且m为1。

16.权利要求1-15任一项的融合蛋白，其中所述第一肽位于所述融合蛋白的C端。

17.权利要求1-16任一项的融合蛋白，其中所述第二肽通过间隔物连接于所述第一肽。

18.权利要求17的融合蛋白，其中所述间隔物包含SEQ ID NO:5所示序列。

19.权利要求17或18的融合蛋白，其中所述间隔物包含切割位点。

20.权利要求19的融合蛋白，其中所述切割位点选自化学切割位点、酶法切割位点和自切割位点。

21.权利要求20的融合蛋白，其中所述自切割位点为内含肽。

22.权利要求21的融合蛋白，其中所述内含肽具有SEQ ID NO:6所示的序列。

23.权利要求1-20任一项的融合蛋白，其中所述第二肽的长度为20-500个氨基酸残基。

24.分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-23任一项的融合蛋白的核苷酸序列。

25.表达构建体，其包含权利要求24的多核苷酸。

26.宿主细胞，其包含权利要求24的多核苷酸或以权利要求25的表达构建体转化，其中所述宿主细胞能够表达所述融合蛋白。

27.制备多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在适合融合蛋白表达的条件下培养权利要求24的宿主细胞；

(b)在第一pH条件下，使所述宿主细胞破碎，回收不溶部分；

(c)在第二pH条件下，重悬步骤(b)获得的不溶部分；

(d)回收包含融合蛋白的上清液。

28.权利要求27的方法，其中第一pH是近中性pH，例如pH 6.8-7.2。

29.权利要求27或28的方法，其中使所述宿主细胞破碎的方法选自以下处理方式：超声、匀浆、高压、低渗、去垢剂、裂解酶、有机溶剂或其组合。

30.权利要求27-29任一项的方法，其中第二pH是10或更高，优选11或更高。

31.权利要求27-30任一项的方法，还包括以下步骤：

(e)通过融合蛋白切割，释放目的多肽；

(f)回收所述目的多肽。