CN110938643A - 一种重组人Betacellulin的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组人Betacellulin的制备方法。该方法首先构建含有GB1标签的重组表达质粒，然后转化大肠杆菌构建工程菌株，通过IPTG诱导重组工程菌在无动物源培养基中高效表达融合蛋白，镍填料捕获融合蛋白并利用肠激酶在目的蛋白的N端的酶切位点进行特异性切割去除标签蛋白，切割后的蛋白具有与人天然Betacellulin保持一致的序列，最后采用反相精纯的方法得到目的蛋白。该制备方法简单快捷，生产条件温和、分离提取方便、整个过程工艺简单，具有明显的产业化应用前景，且制备得到的重组人Betacellulin纯度和活性均较高，为重组人Betacellulin的制备提供了一种新的思路。

Description

一种重组人Betacellulin的制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组人Betacellulin的制备方法。
背景技术
β细胞素蛋白(Betacellulin，也称为BTC蛋白)是一种来源于转基因小鼠的胰腺β肿瘤细胞产生的多肽因子，通过cDNA分析已清楚它的全长氨基酸序列。虽然，最初发现BTC蛋白是一种小鼠3T3细胞生长的促进因子，随后又发现它对血管平滑肌细胞和视网膜色素上皮细胞具有促进生长的活性(Shing等，Science，259：1604(1993年))。
生理条件下人的BTC蛋白数量非常少，由于受到各种限制从组织中提取也非常困难。近年来，通过基因工程技术已经成功地生产了数量较多，价格也相对低廉的人BTC蛋白。而且已有报道BTC蛋白可用于治疗一些疾病如创伤、肿瘤和血管畸形，还可制备成诸如抗体或假性肽的竞争剂用于治疗一些由于平滑肌生长导致的疾病，如动脉粥样硬化和糖尿病视网膜病变。
现有技术中，多采用基因工程方法制备BTC蛋白，主要是采用大肠杆菌和哺乳动物细胞进行表达。已有报道中，采用哺乳动物细胞表达Betacellulin过程中，会使用含有血清的培养基，但由于血清批间差异大,成分未能保持一致,造成重组蛋白稳定性差，同时由于血清会使表达的重组蛋白存在一定病毒风险，不利于后续的工业化生产。而大肠杆菌表达时，会引入外源融合标签，且制备过程不对标签进行切割去除，外源标签的存在将会极大地影响Betacellulin的结构和功能，造成重组Betacellulin活性丧失或者赋予非目的功能。例如，专利JPH10191989A报道大肠杆菌表达重组人Betacellulin，但制备的蛋白除Betacellulin序列外在蛋白N端多了一个甲硫氨酸。
因此，急需开发一种工艺过程简单、纯度和活性高、适于工业化生产的重组人Betacellulin的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组人Betacellulin的制备方法。设计Betacellulin融合蛋白表达的氨基酸序列(甲硫氨酸+His-tag+GB1+肠激酶酶切位点+Betacellulin)，进而构建Betacellulin融合蛋白表达菌株。通过IPTG诱导重组工程菌在无动物源培养基中表达融合蛋白，镍填料捕获融合蛋白并利用肠激酶在目的蛋白N端的酶切位点进行特异性切割去除标签蛋白，切割后的蛋白具有与人天然Betacellulin一致的序列，最后采用反相精纯的方法得到目的蛋白。该制备方法简单快捷，生产条件温和、分离提取方便、整个过程工艺简单，具有明显的产业化应用前景，且制备得到的重组人Betacellulin纯度和活性高。本发明的上述技术目的是通过下述技术方案实现：
一种重组人Betacellulin的制备方法，在一些实施方案中，构建的重组表达质粒包含编码GB1标签蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO:1。
在本发明的一些实施方案中，构建的重组表达质粒还包含编码其他标签蛋白、蛋白酶识别位点和人Betacellulin的核苷酸序列SEQ ID NO:2。
在本发明的一些实施方案中，所述的其他融合标签蛋白是His-tag标签蛋白。
在本发明的一些实施方案中，所述的蛋白酶识别位点是肠激酶酶切位点。
在本发明的一些实施方案中，所述的制备方法还包含重组蛋白的表达过程，在无动物源培养基中进行种子培养和发酵表达。
在本发明的一些实施方案中，所述的制备方法还包含重组人Betacellulin的纯化过程，采用镍填料进行融合蛋白的捕获。
在本发明的一些实施方案中，重组人Betacellulin的纯化过程还包含标签蛋白的去除；所述的标签蛋白的去除不仅包含His-tag标签蛋白，还包含GB1融合标签蛋白。
在本发明的一些实施方案中，所述的标签蛋白的去除是采用肠激酶特异性酶切重组蛋白中肠激酶位点的方式。
在本发明的一些实施方案中，所述的肠激酶特异性酶切重组蛋白所采用的肠激酶的用量是每毫克蛋白加入10～100IU；在本发明的一些实施方案中，所述的肠激酶特异性酶切融合蛋白的酶切温度是4～20℃；在本发明的一些实施方案中，所述的肠激酶特异性酶切融合蛋白的酶切时间是2～10h。
在本发明的一些实施方案中，所述的重组人Betacellulin的纯化过程还包含采用C8反相柱的方式进行精纯。
在本发明的一些实施方案中，GB1标签蛋白可用于提高重组人Betacellulin的表达量。
在本发明一些实施方案中，一种重组人Betacellulin的制备方法，包括如下步骤：
(1)构建一种重组表达质粒；
(2)重组表达质粒转化大肠杆菌细胞；
(3)无动物源培养基中高效表达融合蛋白；
(4)重组人Betacellulin蛋白的纯化；
(5)重组人Betacellulin活性检测。
在本发明的一些实施方案中，所述的重组蛋白的纯化过程包括如下步骤：
(1)收获包涵体；
(2)融合蛋白捕获；
(3)标签蛋白的去除；
(4)重组人Betacellulin精纯。
本发明所述的“Kan”是指卡那霉素抗性基因，用于筛选阳性克隆子。
本发明所述的“IPTG”是指异丙基硫代半乳糖苷，用于诱导融合蛋白的表达。
本发明所述的“EK”是指肠激酶酶切位点(Enterokinase)。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：
1)本发明使用无动物源培养基在大肠杆菌中进行表达，培养成分简单，重组蛋白受污染风险小，利于工业化生产；
2)引入外源标签并对标签进行特异性切割和去除，既提高了重组蛋白的表达量，又避免了外源标签的存在对重组蛋白结构、功能、以及活性的影响；
3)本发明采用镍填料捕获融合蛋白、肠激酶酶切外源标签、以及反相精纯的方法对重组蛋白进行纯化，纯化后的重组蛋白纯度高(95％以上)，活性也高；
4)本发明重组蛋白的制备方法简单快捷、生产条件温和、分离提取方便，整个工艺过程简单，具有明显的产业化应用前景。
附图说明
图1为重组表达质粒pET22b-kan-GB1-EK-Betacellulin的示意图；
图2为重组工程菌质粒酶切鉴定示意图；
图3为Betacellulin和融合蛋白表达菌株诱导前后电泳对比结果图；
图4为反相纯化得到重组人Betacellulin样品SDS-PAGE鉴定示意图；
图5为反相纯化得到重组人Betacellulin样品质谱鉴定示意图；
图6为R&D Systems Recombinant Human Betacellulin质谱鉴定示意图；
图7为Betacellulin促BALB/c 3T3细胞增殖活性过程图；
图8为重组人Betacellulin的生物学活性测定结果示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1重组表达质粒pET22b-kan-GB1-EK-Betacellulin的构建
1.Betacellulin的全基因合成
按照大肠杆菌BL21(DE3)密码子优化原则，对Betacellulin氨基酸序列进行优化。同时对序列末端添加5'-NcoI和3'-XhoI，最后交给通用生物系统(安徽)有限公司进行合成，合成的Betacellulin序列连接至pUC57载体获得pUC57-Betacellulin重组质粒。
2.GB1融合标签的筛选
本发明筛选了GB1、GST(26Kda)、TrxA(11.7Kda)、SUMO(10Kda)等标签蛋白，发现在采用GB1融合标签时，Betacellulin在融合蛋白中的占比更高，目标蛋白有效表达量更高，所以使用GB1融合标签与Betacellulin融合表达，两者间加入肠激酶酶切位点，设计GB1-EK-Betacellulin融合蛋白的表达方式进行制备重组人Betacellulin。
3.重组表达质粒pET22b-kan-GB1-EK-Betacellulin的构建
以合成的puc57-Betacellulin为模板，通过上游引物GB1-Betacellulin-F：
Figure BDA0002232013280000041
含有XhoI酶切位点；下游引物GB1-Betacellulin-R：
Figure BDA0002232013280000042
含有BamHI酶切位点。加入其它反应液进行PCR，扩增得到含有EK-Betacellulin的片段。使用BamHI和XhoI双酶切EK-Betacellulin片段，回收目的基因EK-Betacellulin(264bp)，与含有编码GB1标签的载体pET22b-kan-GB1经BamHI和XhoI双酶切回收载体片段进行连接，得到最终重组表达质粒pET22b-kan-GB1-EK-Betacellulin(见图1)。
融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
实施例2工程菌株构建
使用氯化钙转化法将重组表达质粒pET22b-kan-GB1-EK-Betacellulin转化至大肠杆菌BL21(DE3)，卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆子，将阳性克隆子挑取至液体LB培养基中加压扩培，扩培菌液进行甘油菌保种至-70℃以下冰箱。使用OMEGA质粒提取试剂盒提取重组菌质粒，质粒使用相应的酶酶切验证，酶切电泳结果与理论一致(见图2)。取扩培菌液送至测序公司进行测序，结果与理论一致，得到表达融合蛋白的工程菌株。
实施例3融合蛋白高效表达
将表达融合蛋白的工程菌株按0.1％接种量接种至液体植物源LB，37℃、250rpm活化培养12h，活化完成的菌液按照2％的接种量转接至装有液体植物源LB培养基的摇瓶内，37℃、250rpm培养OD600至0.6～0.8加入终浓度为1mM的IPTG，37℃、250rpm诱导表达4～6小时。
对比例1缺少GB1融合标签的Betacellulin蛋白表达
将质粒pUC57-Betacellulin使用NcoI和XhoI酶切回收Betacellulin与载体pET28a经NcoI和XhoI双酶切回收载体片段进行连接，连接产物使用氯化钙转化法转化至大肠杆菌BL21(DE3)，卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆子，获得表达缺少GB1融合标签的Betacellulin工程菌，将工程菌株按0.1％接种量接种至液体植物源LB，37℃、250rpm活化培养12h，活化完成的菌液按照2％的接种量转接至装有液体植物源LB培养基的摇瓶内，37℃、250rpm培养OD600至0.6～0.8加入终浓度为1mM的IPTG，37℃、250rpm诱导表达4～6小时。
对比结果显示，加入GB1融合标签与Betacellulin共表达，能够提高Betacellulin的表达水平，结果见图3。
实施例4重组人Betacellulin纯化
重组人Betacellulin纯化工艺如下：
1.收获包涵体
将诱导表达4～6小时的发酵液8000g离心10min收集菌体，菌体使用BufferA(20mMTris，200mM NaCl pH 7.4～8.5)重悬并用超声波破碎仪进行破碎，破碎液12000g离心10min收集包涵体。
2.重组融合蛋白捕获
包涵体使用8M尿素溶解，12000g离心10min收集上清，上清采用装载镍填料柱的FPLC AKTA纯化设备进行融合蛋白捕获，并用50～500mM浓度的咪唑溶液洗脱镍柱收集洗脱液即得到GB1-EK-Betacellulin融合蛋白。
3.肠激酶特异性酶切融合蛋白
肠激酶能够特异性切割含有DDDDK(EK)的位点，该方案中将融合蛋白(GB1-EK-Betacellulin)在合适的缓冲液溶液(20mM～50mM Tris PH 7.4～8.5)中使用每毫克蛋白加入10～100IU的肠激酶在4～20℃酶切2～10h。
4.重组人Betacellulin精纯
酶切产物使用C8反相柱进行精纯，用5％的乙腈及千分之一的三氟乙酸平衡反相柱，用20％～30％乙腈洗脱Betacellulin样品。反相得到的Betacellulin样品使用氮气将乙腈除去，并用3500透析膜透析至0.01～0.02M PBS PH7.4的缓冲液中，4℃透析过夜，最终得到Betacellulin精品。理论纯化获得Betacellulin蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
该蛋白含有四对二硫键，理论分子量大小为：8976.07。Betacellulin精纯样品电泳结果见图4，质谱结果见图5，从质谱结果可知，纯化获得Betacellulin分子量8975.97与人Betacellulin理论分子量基本一致，为正确的人Betacellulin蛋白。市售产品的R&DSystems Recombinant Human Betacellulin质谱鉴定示意图见图6，从质谱结果分子量9759.65与人Betacellulin分子量不一致，推测可能市售Betacellulin产品有其他修饰，比如标签融合蛋白。
实施例5重组人Betacellulin活性检测
本法系依据重组人Betacellulin对小鼠胚胎成纤维细胞(BALB/c 3T3细胞)的生长具有刺激作用，BALB/c 3T3细胞的生长状况因重组人Betacellulin生物学活性的不同而不同，以此检测重组人Betacellulin的生物学活性。
Betacellulin促BALB/c 3T3细胞增殖活性过程见图7。
检测吸光值使用四参数拟合(GraphPad Prism软件)计算EC50，结果见图8，EC50值为0.9548ng/ml。相比较于市售的R&D Systems Recombinant Human Betacellulin活性高约1.8倍。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 东莞市东阳光生物药研发有限公司
<120> 一种重组人Betacellulin的制备方法
<160> 4
<210> 1
<211> 168
<212> DNA
<213> GB1 sequence
<400> 1
atgcagtaca aggtcatcct gaacggcaag acgctgaaag gcgaaacgac gacggaagca 60
gtggacgcgg ccaccgcaga aaaagtggtt aagcagtttt tcaacgataa tggcgtcgac 120
ggtgaatgga cgtatgatga cgctaccaaa acgtttaccg tgacggaa
168
<210> 2
<211> 240
<212> DNA
<213> Betacellulin sequence
<400> 2
gatggcaata gtacccgtag cccggaaacc aatggcctgc tgtgcggtga cccggaagaa 60
aattgtgccg caaccaccac ccagagcaaa cgtaaaggcc attttagccg ttgtccgaaa 120
cagtataaac attattgcat taagggccgc tgtcgttttg tggtggcaga acagaccccg 180
agttgcgtgt gtgatgaagg ttatattggt gcccgctgcg aacgcgttga tctgttttat 240
<210> 3
<211> 150
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 3
Met His His His His His His Met Gln Tyr Lys Val Ile Leu Asn Gly
1 5 10 15
Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr
20 25 30
Ala Glu Lys Val Val Lys Gln Phe Phe Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly
35 40 45
Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Gly
　　50 55 60
Ser Asp Asp Asp Asp Lys Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr
65 70 75 80
Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr
85 90 95
Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr
100 105 110
Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln
115 120 125
Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu
130 135 140
Arg Val Asp Leu Phe Tyr
145 150
<210> 4
<211> 80
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 4
Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys
20 25 30
Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys
35 40 45
Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys
50 55 60
Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr
65 70 75 80

Claims (10)

1.一种重组人Betacellulin的制备方法，其特征在于，构建的重组表达质粒包含编码GB1标签蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，构建的重组表达质粒还包含编码其他标签蛋白、蛋白酶识别位点和人Betacellulin的核苷酸序列SEQ ID NO:2。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的其他标签蛋白是His-tag标签蛋白。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶识别位点是肠激酶酶切位点。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包含重组蛋白的表达过程，在无动物源培养基中进行种子培养和发酵表达。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包含重组人Betacellulin的纯化过程，采用镍填料进行重组蛋白的捕获。
7.根据权利要求6所述的重组人Betacellulin的纯化过程，其特征在于，还包含标签蛋白的去除。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的标签蛋白的去除是采用肠激酶特异性酶切重组蛋白中肠激酶位点的方式。
9.根据权利要求1-8所述的方法，其特征在于，重组人Betacellulin的纯化过程还包含采用C8反相柱的方式进行精纯。
10.权利要求1所述的GB1标签蛋白在提高重组人Betacellulin表达量中的用途。
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