CN112745393A - 多肽的生产和纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程领域。更具体地,本发明涉及包含目的多肽部分和自聚集肽部分的融合多肽,所述目的多肽为人生长激素,以及通过表达所述融合多肽来生产和纯化人生长激素的方法。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域。更具体地,本发明涉及包含目的多肽部分和自聚集肽部分的融合多肽,以及通过表达所述融合多肽来生产和纯化目的多肽的方法。
背景技术
目前,关于多肽在医药中应用的研发已广泛涉及抗肿瘤药物、心脑血管药物、疫苗和抗病毒药物,以及诊断试剂盒等多个方面(Leader等,2008)。同迅速增长的市场需求相比,多肽的生产方法在一定程度上限制了其发展。常规的化学固相合成法在生产超过30个氨基酸的中长多肽时,随着肽段长度增大,合成的成本和难度将大幅增加(Bray等,2003)。
另一种有效的手段是采用重组方法在宿主细胞内产生多肽。在重组产生多肽的方法中,纯化步骤非常关键。据报道,重组多肽的分离与纯化成本约占其全部生产成本的60%-80%(陈浩等人,2002)。重组多肽的纯化方法包括传统的离子交换层析、疏水性相互作用层析、亲和层析等。离子交换层析和疏水性相互作用层析由于对样品起始条件有一定的要求,通用性和效率不及亲和层析。亲和纯化通常可以获得超过90%的高收率,使其成为目前最常用的重组蛋白纯化方法。常用的亲和纯化技术包括组氨酸标签 (his-tag)或谷胱甘肽转移酶标签(GST-tag)与目的多肽的融合表达,为不同目的多肽的生产提供了通用的纯化手段。然而昂贵纯化柱使亲和纯化成本较高,不利于工业领域的应用。
人生长激素(human growth hormone,hGH)是一种由脑垂体前叶分泌的蛋白类激素,其成熟态是去除了信号肽的非糖基化亲水性球蛋白,由191 个氨基酸组成,具有两个二硫键,相对分子量约为22kDa。人生长激素hGH 可通过血液循环系统到达人体的各个器官组织,其受体也遍及人体的各种细胞,因此生长激素几乎能够作用于所有的组织、细胞。人生长激素hGH 在人体中发挥着许多重要的功能,如在生理上保持正氮平衡并启动肌肉细胞中的蛋白质合成,增加骨骼肌中的氨基酸摄取,调节骨骼的纵向生长,保护心肌细胞和淋巴细胞免于凋亡等(Levarski等,2014;Zamani等,2015)。因此,人生长激素hGH已被广泛用于多种疾病的治疗,通过美国FDA批准的生长激素适应症共有11种。在我国获批的适应症主要有儿童生长激素缺乏症、烧伤症状和下丘脑-垂体疾病所致的生长激素缺乏症、Tuner综合症、成人生长激素缺乏症、慢性肾功能不全等6种。当前,生长激素的全球销售额超过30亿美元。在我国,儿童矮小症发病率约3%,患儿约有700 万,预计市场容量超过100亿。
临床应用的生长激素hGH主要有两种来源,直接提取法和传统基因工程法。直接提取法必须是从垂体中提取,产量低,价格昂贵,无法满足大量医用。传统基因工程法,由于人生长激素hGH无糖基化而采用原核表达体系进行生产,以重组大肠杆菌为主。然而,直接在大肠杆菌胞内进行表达时,人生长激素hGH以无活性的包涵体形式存在,需要后续的变复性才能得到具有生物活性的生长激素hGH。目前主要采用融合标签,进行促溶 (如谷胱苷肽片段、TNFα等)(Levarski等,2014;Nguyen等,2014)或进行周质空间表达(MBP标签)(王库强等,2018)。这些技术过程需要进行比较繁琐的纯化步骤,而且需要采用多种柱层析技术,如亲和层析、凝胶排阻层析等,收率低,成本较高,导致人生长激素hGH产品价格高。
近年来有研究指出了目的蛋白、内含肽和自组装短肽融合表达时可以诱导融合蛋白形成有活性的蛋白聚集体,聚集体通过内含肽的自切割使得目的蛋白释放到上清中(吴伟等,2011;邢磊等,2011;周碧红等,2012)。虽然这种蛋白质的分离纯化方法成本低、操作简单,在工业生产中具有良好的应用前景,但是现有技术中有报道这种方法只适合于生产不带有二硫键的蛋白质,而人生长激素具有两个二硫键(其结构信息可以登录号P01241 见于数据库UniProt,https://www.uniprot.org/uniprot/P01241);为了解决二硫键所带来的问题,需要进一步在目的蛋白一端连接促溶标签,例如TrxA标签(Zhao等,2016;中国专利CN 104755502B)。
因此,本领域仍然需要低成本、简便、高效的生产与纯化人生长激素的方法。
发明内容
本发明提供了基于自聚集肽和切割标签的低成本、简便、高效的含二硫键多肽的生产和纯化方法。
在一方面,本发明提供了一种融合多肽,其包含目的多肽部分和自聚集肽部分,所述目的多肽为人生长激素,其中所述目的多肽部分通过间隔物连接于所述自聚集肽部分,并且其中所述切割标签包含切割位点。在一些实施方案中,所述融合多肽在宿主细胞内表达后可通过所述自聚集肽部分形成活性聚集体。在一些实施方案中,本发明的融合多肽中的目的多肽部分位于所述融合多肽的N端。在另一些实施方案中,本发明的融合多肽中的目的多肽部分位于所述融合多肽的C端。
在一些实施方案中,本发明的融合多肽中的自聚集肽部分包含两亲性自组装短肽。在一些实施方案中,所述自聚集肽部分包含一个或更多个串联重复的两亲性自组装短肽。
在一些实施方案中,本发明的融合多肽中的两亲性自组装短肽选自两亲性β折叠短肽、两亲性α螺旋短肽和类表面活性剂短肽。在一些实施方案中,优选类表面活性剂短肽。
在一些实施方案中,所述类表面活性剂短肽具有7-30个氨基酸残基,其从N端到C端具有以下通式表示的氨基酸序列:
A-B或B-A
其中A是由亲水性氨基酸残基组成的肽,所述亲水性氨基酸残基可以是相同的或不同的,且选自Lys、Asp、Arg、Glu、His、Ser、Thr、Asn和 Gln;B是由疏水性氨基酸残基组成的肽,所述疏水性氨基酸残基可以是相同的或不同的,且选自Leu、Gly、Ala、Val、Ile、Phe和Trp;A与B通过肽键连接;并且其中在所述类表面活性剂短肽中疏水性氨基酸残基的比例是55%-95%。在一些实施方案中,所述类表面活性剂短肽具有8个氨基酸残基,其中在所述类表面活性剂短肽中疏水性氨基酸残基的比例是75%。在一些实施方案中,所述类表面活性短肽选自L6KD、L6KK、L6DD、L6DK、 L6K2、L7KD和DKL6。在一些实施方案中,本发明的融合多肽中的类表面活性剂短肽是L6KD,其氨基酸序列示于SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中,所述两亲性β折叠短肽的长度为4-30个氨基酸残基;并且其中疏水性氨基酸残基含量为40%-80%。在一些实施方案中,本发明的融合多肽中的两亲性β折叠短肽是EFK8,其氨基酸序列示于SEQ ID NO:2。
在一些实施方案中,所述两亲性自组装短肽是两亲性α螺旋短肽的长度为4-30个氨基酸残基;并且其中疏水性氨基酸残基含量为40%-80%。在一些实施方案中,本发明的融合多肽中的两亲性α螺旋短肽是α3-peptide,其氨基酸序列示于SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中,本发明的融合多肽中的目的多肽是人生长激素。在一些实施方案中,所述人生长激素部分包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明的融合多肽中的间隔物与目的多肽部分和/ 或自聚集肽部分直接连接。在另一些实施方案中,所述间隔物在其N端和/ 或C端进一步包含接头,其通过接头与目的多肽部分和/或自聚集肽部分连接。
在一些实施方案中,本发明的融合多肽中的切割位点选自温度依赖性切割位点、pH依赖性切割位点,离子依赖性切割位点、酶切割位点或自切割位点。在一些实施方案中,所述切割位点为自切割位点。在一些具体实施方案中,所述间隔物为内含肽(intein),其包含自切割位点。在一些实施方案中,所内含肽连接于所述人生长激素部分的N端或C端。在一些实施方案中,所述内含肽为Mxe GyrA,其具有SEQ ID NO:4所示的序列。在一些可选的实施方案中,所述Mxe GyrA连接于所述人生长激素部分的C 端。
在一些实施方案中,本发明的间隔物中的接头为GS型接头,其氨基酸序列示于SEQID NO:6。在另一些实施方案中,所述接头为PT型接头,其氨基酸序列示于SEQ ID NO:7。
在另一方面,本发明提供了一种分离的多核苷酸,其包含编码本发明的融合多肽的核苷酸序列或其互补序列。
在另一方面,本发明提供了一种表达构建体,其包含本发明的多核苷酸。
在另一方面,本发明提供了一种宿主细胞,其包含本发明的多核苷酸或由本发明的表达构建体转化,其中所述宿主细胞能够表达所述融合多肽。
在一些实施方案中,所述宿主细胞选自原核生物、酵母和高等真核细胞。在一些具体实施方案中,所述原核生物包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙门氏菌属(Salmonella)以及假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。更具体而言,所述原核生物是埃希氏菌属,优选大肠杆菌(E.coli)。
在另一方面,本发明提供了一种生产和纯化人生长激素的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)培养本发明的宿主细胞,从而表达本发明的融合多肽;
(b)裂解所述宿主细胞,然后去除细胞裂解物的可溶部分,回收不溶部分;
(c)通过切割所述切割位点从所述不溶部分释放可溶的人生长激素;和 (d)去除步骤(c)中的不溶部分,回收含有所述人生长激素的可溶部分。
在一些实施方案中,所述裂解通过超声、匀浆、高压、低渗、裂解酶、有机溶剂或其组合进行。在另一些实施方案中,所述裂解在弱碱性的pH条件下进行。在一些具体实施方案中,所述切割是二硫苏糖醇(DTT)介导的自切割。
附图说明
图1示出基于自聚集肽的人生长激素hGH的表达与纯化策略以及所采用的表达载体结构图。A:表达与纯化策略;B:pET30-hGH-Mxe-L6KD、 pET30-hGH-Mxe-EFK8、pET30-hGH-Mxe-α3的载体结构图。
图2示出人生长激素hGH融合蛋白表达与纯化的SDS-PAGE分析结果图。A:基于L6KD自聚集肽;B:基于EFK8自聚集肽;C:基于α3-peptide 自聚集肽。
图3示出人生长激素hGH的质谱分析图。
图4示出人生长激素hGH的生物活性分析图。
具体实施方式
本发明并不限于本文所述的具体方法、方案、试剂等,因为这些可以变化。本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的而不是为了限制本发明的范围。除非另有定义,本文所用的所有技术和科学术语均具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。
在一方面,本发明提供了一种融合多肽,其包含目的多肽部分和自聚集肽部分,所述目的多肽为人生长激素,其中所述目的多肽部分通过间隔物连接于所述自聚集肽部分,并且其中所述切割标签包含切割位点。
在另一方面,本发明提供了一种分离的多核苷酸,其包含编码本发明的融合多肽的核苷酸序列或其互补序列。
在另一方面,本发明提供了一种表达构建体,其包含本发明的多核苷酸。
在另一方面,本发明提供了一种宿主细胞,其包含本发明的多核苷酸或由本发明的表达构建体转化,其中所述宿主细胞能够表达所述融合多肽。
在另一方面,本发明提供了一种生产和纯化人生长激素的方法,所述方法包括以下步骤:(a)培养本发明的宿主细胞,从而表达本发明的融合人多肽;(b)裂解所述宿主细胞,然后去除细胞裂解物的可溶部分,回收不溶部分;(c)通过切割所述切割位点从所述不溶部分释放可溶的人生长激素;和(d)去除步骤(c)中的不溶部分,回收含有所述人生长激素的可溶部分。
如本文所用,术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换使用,并且定义为由通过肽键连接的氨基酸残基组成的生物分子。
如本文所用,本发明的“目的多肽”的氨基酸序列含有至少两个半胱氨酸,所述半胱氨酸可以形成分子内二硫键。本发明的“目的多肽”含有至少两个巯基,例如两个巯基、三个巯基、四个巯基或更多个巯基,所述巯基之间可以形成二硫键。目的多肽的长度可以为20-400个氨基酸,例如30-300 个氨基酸,35-250个氨基酸,40-200个氨基酸。
如本文所用,“人生长激素”和“目的多肽”可互换使用,其指由脑垂体前叶分泌的蛋白类激素,其成熟态是去除了信号肽的非糖基化亲水性球蛋白,由191个氨基酸组成,具有两个二硫键,相对分子量约为22kDa,本发明的融合多肽中的人生长激素部分包含SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中,本发明的“目的多肽”具有与“人生长激素”类似的结构。
在一些实施方案中,所述融合多肽在宿主细胞内表达后可通过所述自聚集肽部分形成活性聚集体。在一些实施方案中,本发明的融合多肽中的目的多肽部分位于所述融合多肽的N端。在另一些实施方案中,本发明的融合多肽中的目的多肽部分位于所述融合多肽的C端。
如本文所用,“自聚集肽”是指与目的多肽部分融合并在宿主细胞表达后能够介导融合蛋白在胞内形成不可溶的活性聚集体的多肽。如本文所用,“活性聚集体”指的是人生长激素部分仍然能够正确折叠并保持活性或者是指聚集体中的人生长激素部分在与自聚集肽分离后能够处于可溶状态。
无意于受到任何理论的限制,本领域中已知一些两亲性(amphipathic) 多肽由于具有彼此分隔的亲水性区域和疏水性区域,在疏水相互作用以及其它推动力作用下能自发地形成特定的自组装结构(Zhao等,2008)。本发明人令人惊奇地发现一些具有自组装能力的两亲性短肽能够诱导细胞内活性聚集体的形成。用作本发明的自聚集肽的两亲性自组装短肽可以选自两亲性β折叠短肽、两亲性α螺旋短肽和类表面活性剂短肽。
如本文所用,“类表面活性剂肽”是可用作本发明的自聚集肽的一类两亲性多肽,其通常由7-30个氨基酸残基组成,延伸长度约2-5nm,结构类似于脂质,由一段疏水性氨基酸尾部和亲水性氨基酸头部构成。类表面活性剂结构的性质类似于表面活性剂,在水溶液中可以形成胶束、纳米管等组装结构。适于用作本发明的自聚集肽的类表面活性剂短肽的长度可以是 7-30个氨基酸残基,其包括从N端到C端的以下通式表示的氨基酸序列:
A-B或B-A,
其中A与B之间通过肽键连接。A是由亲水性氨基酸组成的亲水性头部,所述亲水性氨基酸残基可以是相同的或不同的极性氨基酸,且选自Lys、 Asp、Arg、Glu、His、Ser、Thr、Asn和Gln。A的实例包括KD、KK或 DK等。B是由疏水性氨基酸残基组成的疏水性尾部,所述疏水性氨基酸残基可以是相同的或不同的非极性氨基酸,且选自Leu、Gly、Ala、Val、Ile、 Phe和Trp。B的实例包括LLLLLL(L6)、L7或GAVIL等。本发明的类表面活性剂短肽中疏水性氨基酸比例高于亲水性氨基酸的比例,在所述类表面活性剂短肽中的疏水性氨基酸比例可以是55-95%,60-95%,65-95%, 70-95%,75-95%,80-95%,85-95%,90-95%。在一些实施方案中,所述类表面活性剂短肽具有8个氨基酸残基,其中疏水性氨基酸的比例是75%。在水溶液中,类表面活性剂肽会发生自组装,使得疏水尾部聚集在内部,亲水头部暴露在溶液中,与水溶液相互作用,避免疏水区域与水溶液接触。适用于本发明的自聚集肽的类表面活性剂短肽的具体实例包括L6KD、 L6KK、L6DD、L6DK、L6K2、L7KD和DKL6等。本发明的融合多肽利用 L6KD,其氨基酸序列示于SEQ ID NO:1。
此外,本领域技术人员已知,具有上述结构的类表面活性剂肽(例如 L6KD、L6K2、L6D2等)具有相似的活性,均能够介导融合蛋白在胞内形成不可溶的活性聚集体(Zhou等,2012)。
如本文所用,“两亲性β折叠短肽”是指具有4-30个氨基酸残基,由疏水性氨基酸、带电荷的亲水性氨基酸交替排列构成的短肽,其形成β折叠时,一侧为疏水氨基酸残基,另一侧是交替排列带正电荷和带负电荷的亲水性氨基酸残基。这些短肽可以在疏水相互作用、静电相互作用以及氢键作用下形成自组装结构。一般而言,两亲性β折叠结构的长度越长或疏水性越强,自组装越容易发生,形成的自聚集体的机械强度越强。为了保证足够的自组装能力,本发明的两亲性β折叠短肽应当包含一定量的疏水性氨基酸。本发明的两亲性β折叠短肽包括40-80%、45-70%、50-60%,例如大约50%的疏水性氨基酸残基。可用作本发明的自聚集肽的两亲性β折叠短肽的具体实例是氨基酸序列示于SEQ ID NO:2的EFK8。
α螺旋是肽链骨架围绕一个轴以螺旋的方式伸展的一种蛋白二级结构。如本文所用,“两亲性α螺旋短肽”是指具有4-30个氨基酸残基,与普通α螺旋相比具有独特的亲水、疏水氨基酸排列,使得在形成的α螺旋结构的一侧主要为亲水性氨基酸,而在另一侧主要为疏水性氨基酸的短肽。据推测两亲性α螺旋在水溶液中通过形成卷曲螺旋(coiled-coil)而实现自组装,其中两个α螺旋通过疏水相互作用结合,并进一步通过带电氨基酸的静电相互作用力稳定这种结合。本发明的两亲性α螺旋短肽包括40-80%、 45-70%、50-60%,例如大约50%的疏水性氨基酸残基。可用作本发明的自聚集肽的两亲性α螺旋短肽的具体实例为氨基酸序列示于SEQ ID NO:3的α3-peptide。
本领域已有通过多个重复单元串联重复形成具有自聚集特性的多肽的报道,如类弹性蛋白ELP,其由110个VPGXG重复单元组成,其聚集特性与重复单元数目相关(Banki,etal.,2005;MacEwan和Chilkoti,2010)。也有报道显示由多个重复单元组成的两亲性β折叠的自聚集倾向随着重复单元数目增加而增强(Zhang et al.,1992)。可以预期,由多个上述“两亲性自组装短肽”串联组成的多肽能够保留甚至获得增强的自组装能力。
因此,本发明的自聚集肽部分可以包括一或多个串联连接的所述两亲性自组装短肽。本发明的自聚集肽部分可以包含1-150、1-130、1-110、1-90、 1-70、1-50、1-30、1-10个、1-5个,例如1、2、3、4、5个所述两亲性自组装短肽。所述自聚集肽部分中的两或多个两亲性自组装短肽可以形成串联重复。为了便于重组操作以及考虑到生产成本问题,期望使用较少的重复。因此,在一些实施方案中,所述“自聚集肽部分”仅包含一个所述两亲性自组装短肽。
此外,已有报道,一些蛋白结构域,例如β淀粉样肽、VP1、MalE31、 CBDclos等,也能够诱导融合蛋白形成聚集体,本发明预期这样的结构域也可用作本发明“自聚集肽”。然而这些结构域的结构相对复杂并且其诱导聚集的机理仍不清楚(Mitraki,2010)。在本发明中优选使用结构相对简单以及长度较短的两亲性自组装短肽。
现有的研究发现,具有诱导活性聚集体形成的能力的自聚集肽(如两亲性自组装肽)与目的多肽作为融合蛋白在宿主细胞内表达后,表达的融合蛋白可形成不可溶的聚集体。聚集体的形成可以避免胞内蛋白酶对融合蛋白的降解,因此提高目的多肽的产量。细胞裂解后,可以简单地通过离心沉淀或过滤等方法从细胞裂解物中收集不溶的聚集体,除去可溶的杂质,实现对融合蛋白的初步纯化。之后,通过切割位于自聚集肽部分以及目的多肽之间的接头中的切割位点,使得可溶的包含目的多肽的部分从不可溶部分(沉淀)释放出来,分布于上清液中,再次简单地通过离心沉淀或过滤等方法即可去除不溶的杂质,收获可溶的目的多肽。通过这样的基于自聚集肽的方法生产多肽可以简化分离纯化步骤,避免使用昂贵的纯化柱,显著地降低生产成本。
现有技术还报道,上述方法仅适合于生产不带有二硫键的一类蛋白,例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)脂肪酶A(LipA)(Van Pouderoyen等, 2001)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)II型酮胺氧化酶(AMA)(Collard等, 2008)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶(XynB)(其结构信息可以登录号1YIF见于蛋白质数据库PDB,https://www.rcsb.org/structure/1YIF)等。带有二硫键的目的蛋白(例如CCL5(2个二硫键)、SDF-1α(3个二硫键)、和 leptin(1个二硫键)在内含肽介导的切割后易于形成聚集体,无法释放到上清液中;这些切割后的目的蛋白保持聚集的原因可能在于暴露的疏水序列或难以在大肠杆菌的周质空间中形成正确的二硫键(Zhao等,2016)。为了解决二硫键带来的问题,现有研究发现通过在目的蛋白一端添加促溶标签能够有效生产带有二硫键的蛋白(Zhao等,2016;中国专利CN 104755502 B)。
然而,出人意料地,本发明人发现尽管人生长激素带有两个二硫键,但是即使没有添加促溶标签,其也能够有效地通过上述利用自聚集肽的方法生产。
如本文所用,“间隔物”是指具有一定长度的的氨基酸组成的多肽,其包括实现切割所需的序列,如用于酶切割的蛋白酶识别序列、用于自切割的内含肽序列等,以连接融合蛋白的各部分并不影响各部分的结构和活性。因此,本发明的间隔物包含“切割位点”。在本发明的融合多肽中,间隔物与目的多肽部分和/或自聚集肽部分直接连接。在另一些实施方案中,所述间隔物在其N端和/或C端进一步包含接头,其通过接头与目的多肽部分和/ 或自聚集肽部分连接。
在一些具体实施方案中,所述间隔物为内含肽,其包含自切割位点。在一些实施方案中,所内含肽连接于所述人生长激素部分的N端或C端。应当理解,本领域技术人员可以根据需要选择合适的内含肽,并选择内含肽合适的连接位置。
本发明的用于将可溶的目的多肽部分从不可溶部分(沉淀)释放出来的切割位点包括可以选自温度依赖性切割位点、pH依赖性切割位点,离子依赖性切割位点、酶切割位点或自切割位点,或本领域技术人员已知的其它任何切割位点。本发明中优选的切割位点可以进行自切割,例如,其包含可自切割的内含肽的氨基酸序列。这是因为基于内含肽的切割方法不需要外加酶或使用如化学法中所用的溴化氢等有害物质,而仅仅需要改变聚集体所处的缓冲环境就能简单地诱导切割(Wu et al.,1998;TELENTI et al., 1997)。本领域已知多种自切割内含肽,例如NEB公司的一系列具有不同自切割特性的内含肽。
在本发明的一些具体实施方案中,所述内含肽为Mxe GyrA,其具有 SEQ ID NO:4所示的序列。在一些可选的实施方案中,所述Mxe GyrA连接于所述人生长激素部分的C端。在一个具体的实施方案中,所述内含肽 Mxe GyrA通过在缓冲体系中加入合适量的二硫苏糖醇(DTT)就可诱导该内含肽在其羧基端的自切割。本领域技术人员能够根据需要确定DTT浓度和反应时间。
本领域技术人员能够理解,为了减少本发明的融合蛋白中不同部分之间的相互干扰,可以通过接头连接融合蛋白的不同部分。如本文所用,“接头”是指具有一定长度的由低疏水性和低电荷效应的氨基酸组成的多肽,其用于融合蛋白时可以使所连接的各部分充分展开,互不干扰地充分折叠成各自的天然构象。
本领域常用的接头包括例如,富含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的柔性的GS 型接头;富含脯氨酸(P)和苏氨酸(T)的刚性的PT型接头。在一些实施方案中,本发明所使用的GS型接头氨基酸序列示于SEQ ID NO:6。在另一些实施方案中,本发明所使用的PT型接头其氨基酸序列示于SEQ ID NO:7。
在多肽类药物的生产中,常常需要重组的多肽与目的多肽具有一致的序列,即两端不具有额外的氨基酸残基。在本发明中,这可以通过选择合适的切割位点及它们与目的多肽的连接方式来实现。本领域技术人员清楚如何根据切割位点的特性来进行这样的选择。例如,在一个具体实施方案中,可以使切割位点的Mxe GyrA与所述目的多肽部分的C端直接连接,使得其与所述人生长激素部分之间没有额外的氨基酸残基。在另一些具体实施方案中,本发明的“目的多肽”与“间隔物”之间可以包含提高切割效率的短序列,例如“MRM”,而不影响目的多肽的最终活性。本领域技术人员可以理解,当选择具有不同的切割位点的间隔物时,可以切割产生C端和/或 N端没有多余的氨基酸残基的目的多肽。
如上所述,本发明也涉及多核苷酸,其包含编码本发明的融合多肽的核苷酸序列或其互补序列。如本文所用,“多核苷酸”是指多个核苷酸通过 3’-5’-磷酸二酯键连接而成的大分子,其中所述核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。本发明的多核苷酸的序列可以针对不同的宿主细胞(如大肠杆菌)进行密码子优化,从而改善融合蛋白的表达。进行密码子优化的方法是本领域已知的。
如上所述,本发明也涉及包含本发明上述的多核苷酸的表达构建体。在本发明的表达构建体中,编码所述融合蛋白的多核苷酸的序列与表达控制序列可操纵地连接以进行希望的转录及最终在宿主细胞中产生所述融合多肽。合适的表达控制序列包括但不限于启动子、增强子、核糖体作用位点如核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、转录剪接序列、转录终止序列和稳定mRNA的序列等等。
用于本发明的表达构建体的载体包括那些在宿主细胞中自主复制的载体,如质粒载体;还包括能够整合到宿主细胞DNA中并和宿主细胞DNA 一起复制的载体。可商购获得许多适于本发明的载体。在一个具体实施方案中,本发明的表达构建体衍生自Novagen公司的pET30a(+)。
本发明还涉及一种宿主细胞,其含有本发明的多核苷酸或由本发明的表达构建体转化,其中所述宿主细胞能够表达本发明的融合多肽。用于表达本发明融合多肽的宿主细胞包括原核生物、酵母和高等真核细胞。示例性的原核宿主包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙门氏菌属(Salmonella)以及假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。在优选的实施方案中,宿主细胞是埃希氏菌属细胞,优选是大肠杆菌。在本发明的一个具体实施方案中,所使用的宿主细胞为大肠杆菌 BL21(DE3)菌株细胞(Novagen)。
可以通过许多已熟知的技术之一将本发明的重组表达构建体导入宿主细胞,这样的技术包括但不限于:热激转化,电穿孔,DEAE-葡聚糖转染,显微注射,脂质体接介导的转染,磷酸钙沉淀,原生质融合,微粒轰击,病毒转化及类似技术。
本发明还涉及生产和纯化人生长激素的方法,所述方法包括以下步骤: (a)培养本发明的宿主细胞,从而表达本发明的融合多肽;(b)裂解所述宿主细胞,然后去除细胞裂解物的可溶部分,回收不溶部分;(c)通过切割所述切割位点从所述不溶部分释放可溶的人生长激素;和(d)去除步骤(c)中的不溶部分,回收含有所述人生长激素的可溶部分。本发明的方法的示意图可参见图1A。
在本发明中,使宿主细胞裂解的方法选自本领域常用的处理方式,例如超声、匀浆、高压(例如在弗氏压碎器中)、低渗(osmolysis)、去垢剂、裂解酶、有机溶剂或其组合,并且所述裂解在弱碱性的pH条件(例如pH 7.5-8.5) 下进行,由此使得宿主细胞的细胞膜裂解,使得活性聚集体从胞内释放出来,但仍然保持不溶状态。
释放出来的聚集体直接以沉淀形式回收,省略了通过改变环境条件(例如温度、离子浓度、pH值等)以获得沉淀状态的融合蛋白的步骤,也避免了剧烈的环境条件变化对蛋白稳定性及活性的影响。
传统生长激素的生产中,由于人生长激素带有二硫键,需要通过标签将生长激素分泌到大肠杆菌的周质空间来解决二硫键对表达带来的问题。而这种通过分泌到周质空间的蛋白表达方式一般被认为产量在0.1-10mg/L 的水平,大多在1mg/L左右的水平,而且纯化过程中,主要采用以下两种方法:采用特别昂贵的针对生长激素的抗体(采用抗体特异来纯化,但抗体特别昂贵,而且使用的批次也不多,即用了若干批次后就得换新的)填充柱进行纯化(Chang et al,1986);或采用亲和标签,然后通过1)亲和标签纯化出融合蛋白,2)换缓冲液,3)外加蛋白酶切开标签,4)亲和标签纯化去掉蛋白酶和标签,5)再换缓冲液等一系列复杂的步骤,然后再经过分子筛纯化获得生长激素(Nguyen et al,2014;Moony et al,2014)。
与现有技术所教导的通过添加促溶标签克服二硫键的问题不同的是,尽管本发明的目的多肽人生长激素带有两个二硫键,但是本发明人令人惊奇地发现,基于自聚集肽而不添加促溶标签的融合方法也可成功地大量产生有活性的人生长激素。本发明采用的自聚集肽可以诱导融合蛋白形成大量的有活性的蛋白聚集体,可避免人生长激素在宿主内降解,并有助其在原核细胞内进行正确折叠形成有活性的人生长激素。本发明所获人生长激素为正确折叠的可溶蛋白,中间无需繁琐的变复性操作,而且产量和纯度都很高。本发明的人生长激素的纯化对设备要求低,不需要纯化柱,生产成本低,操作简便。
如本文所用,“纯度”是指目的蛋白的纯度,即在纯化液中,人生长激素占总蛋白的比例。由于通过细胞表达目的蛋白,在胞内有大量的其他蛋白(如大肠杆菌就有几千种蛋白),要把目的蛋白从如此多种类且量较大的蛋白混合物中纯化出来一直是一个关键的技术难题。通过细胞的破碎、离心、切割后的分离等步骤,纯化液中基本只有蛋白质和无机盐,因此纯化液中人生长激素的比例越高,则生产的纯度越高。
实施例
为使本发明的技术方案和优点更加清楚,下面将通过实施例对本发明实施方式作进一步地详细描述。应当理解实施例不应理解为限制性的,本领域技术人员能够基于本发明的原理对实施方式做进一步的调整。
以下实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法,具体步骤可参见,例如,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook,J.,Russell,David W.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。所用引物均由上海生工生物合成。
实施例1:构建人生长激素融合蛋白表达构建体
本申请实施例中所使用的表达载体pET30-hGH-Mxe-L6KD、 pET30-hGH-Mxe-EFK8、pET30-hGH-Mxe-α3的构建过程类似,以下以 pET30-hGH-Mxe-L6KD的构建为例,所需要的引物,通过oligo 6设计并由上海生工合成如表1所示的寡聚核苷酸引物。
表1本实施例所用寡聚核苷酸引物
a引物下划线部分分别为限制性内切酶Nde I、Xho I和Spe I的识别位点。
首先从NCBI获得人生长激素hGH(NCBI号:AAA98618.1)多核苷酸序列,采用jcat软件进行大肠杆菌密码子优化,并由上海生工进行基因合成得到基因片段。以合成的基因为模板、以hGH-F和hGH-R为引物通过 PCR反应扩增得到生长激素hGH多核苷酸片段。PCR反应使用NEB公司的Q5聚合酶(New England Biolab(NEB)),PCR条件为:98℃30sec,98℃10sec,60℃30sec,72℃30sec,共30个循环;最后72℃2min。反应结束后,对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶分离回收。
以pET30-lipA-Mxe-L6KD(邢磊等,2011)为模板、以MxeL6KD-F和 MxeL6KD-R为引物通过PCR反应扩增得到Mxe-L6KD多核苷酸片段。PCR 反应使用NEB公司的Q5聚合酶,PCR条件为:98℃30sec,98℃10sec, 60℃30sec,72℃30sec,共30个循环;最后72℃2min。反应结束后,对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶分离回收。再将hGH、Mxe-L6KD两个片段进行重叠PCR反应:先在不加入引物的情况下98℃30sec,98℃ 10sec,68℃30sec,72℃25sec,共15个循环;最后72℃5min。再加入引物hGH-F和MxeL6KD-R,98℃30sec,98℃10sec,68℃30sec,72℃ 25sec,共30个循环;最后72℃5min。反应结束后,对PCR扩增产物进行电泳检测,结果PCR扩增出与预期相符的正确条带,进而进行分离回收。将重叠PCR回收产物用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET30(a)用T4连接酶连接,将连接产物转化到大肠杆菌 DH5α感受态细胞,将转化细胞涂布于添加有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆,提取质粒,对其进行测序,测序结果表明所克隆的 pET30-hGH-Mxe-L6KD序列正确。
再将测序正确的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)感受态细胞,将转化细胞涂布于添加有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆用于后续的表达纯化。采用类似的方法分别获得pET30-hGH-Mxe-EFK8 和pET30-hGH-Mxe-α3质粒及其表达菌株。其中,pET30-hGH-Mxe-EFK8 的构建时,由引物Mxe-EFK-R代替Mxe-L6KD-R进行克隆操作; pET30-hGH-Mxe-α3的构建时,由引物hGH-F和hGHalpha-R从 pET30-hGH-Mxe-L6KD获得hGH-Mxe核苷酸片段,随后插入到Nde I和Spe I限制性内切酶双酶切的pET30-lipA-Mxe-α3质粒载体上(林章凛等,2018)。所构建的pET30-hGH-Mxe-L6KD、pET30-hGH-Mxe-EFK8、 pET30-hGH-Mxe-α3质粒的结构如图1B所示。
实施例2:人生长激素融合蛋白的表达与纯化
将实施例1中构建好的菌株(含有质粒pET30-hGH-Mxe-L6KD、 pET30-hGH-Mxe-EFK8、pET30-hGH-Mxe-α3)接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,并在37℃摇床中培养至对数期(OD600=0.4-0.6),加入 0.2mM IPTG,在18℃诱导18小时、30℃诱导6小时,收获细胞,并测量菌浓度OD600。(以下将1mL的OD600为1的细胞量称为1OD)
将菌体用裂解缓冲液B1(2.4g的Tris、29.22g的NaCl、0.37g的Na2EDTA·2H2O溶解于800mL水中,调pH至8.5,加水定容至1L)重悬至 20OD/mL,进行超声破碎(破碎条件为:功率200W,超声时间3sec,间隔时间3sec,超声次数99次)。在4℃,12000rpm的条件下离心20min,分别收集上清和沉淀部分。将沉淀用裂解缓冲液洗涤2次后,使用切割缓冲液(20mMTris-HCl,500mM NaCl,40mM二硫苏糖醇,1mM EDTA, pH 8.5)充分重悬,置于4℃过夜24h,使得内含肽充分进行自切割。之后将悬浊液离心分离,得到的上清和沉淀与切割前的沉淀一起进行SDS-PAGE 检测(沉淀部分用与上一重悬步骤相同的体积的裂解缓冲液重悬)。结果如图 2所示。泳道a-d为人生长激素hGH表达与纯化样品,分别是a:细胞裂解物上清;b:细胞裂解物沉淀,可检测到清晰的融合蛋白表达成的聚集体; c:切割后分离的沉淀;d:切割后分离的上清,可检测到清晰的人生长激素hGH条带。泳道1-4为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品,上样量依次为4μg、2μg、1μg、0.5μg。
依照蛋白定量标准品,应用Bio-Rad公司的Quantity ONE凝胶定量分析软件对目的条带进行光密度分析,可计算得出融合蛋白形成的聚集体产量、在内含肽介导的自切割之后释放到上清中的人生长激素hGH产量、Mxe GyrA切割效率、人生长激素hGH回收率及其在上清中的纯度,结果如表2 所示。
表2人生长激素hGH的表达与纯化情况
a蛋白聚集体产量,b内含肽介导的自切割后的人生长激素hGH产量(以菌浓度OD600为2时,每升LB培养基中的大肠杆菌细胞产生2.66mg细胞湿重计算),c内含肽介导的自切割效率=100%×(切割前聚集体表达量-切割后聚集体剩余量)/切割前聚集体产量,d回收率=100%×hGH实际产量/蛋白聚集体在完全切割的情况下可生产人生长激素 hGH的理论产量。
所采用的3种融合蛋白(hGH-Mxe-L6KD、hGH-Mxe-EFK8、hGH-Mxe-α3) 均以沉淀形式存在,聚集体表达量为44.9~150.0μg/mg细胞湿重。3种融合蛋白经内含肽Mxe GyrA自切割,hGH同Mxe-L6KD/EFK8/α3-peptide分离,切割效率是52.8~64.2%,切割后释放到上清中的人生长激素hGH的产量为 2.8~21.4μg/mg细胞湿重,切割后回收的hGH纯度为31.4~88.2%。其中, hGH-Mxe-L6KD融合蛋白的人生长激素hGH产量及纯度最高,即通过本基于自聚集肽和自切割标签的纯化技术可一步纯化得到人生长激素hGH的产量为21.4μg/mg细胞湿重,纯度为88.2%。
实施例3:人生长激素hGH的分子量测定
以实验例2中由L6KD自聚集肽得到的人生长激素hGH样品为例,进行分子量测定。取人生长激素hGH样品用流动相(A液:B液=1:1)透析,配制成2mg/mL的hGH样品,采用HPLC-MS进行分子量分析。仪器: Agilent 1260HPLC连接Waters SYNAPT G2-S飞行时间质谱系统;色谱柱: Acquity UPLC BEH C18column(2.1mm×100mm,1.7μm particle size, Waters,USA);流动相:A液为0.1%(v/v)甲酸的水溶液,B液为0.1%(v/v) 甲酸的乙腈溶液,采用的梯度如表2;进样量为10μL,流速为0.4mL/min,温度为60℃。
表3流动相梯度变化设定参数
时间(min) | A液比例(%(v/v)) | B液比例(%(v/v)) |
0 | 75 | 25 |
50 | 30 | 70 |
55 | 15 | 85 |
65 | 15 | 85 |
从图3可看到所得到的分子量为22678.0道尔顿,与计算的分子量 22678.8道尔顿基本一致,相差0.8道尔顿在机器测量误差范围内,证明所得到的hGH序列正确。
实施例4:人生长激素的生物活性检测
以实验例2中由L6KD自聚集肽得到的人生长激素hGH样品为例,进行生物活性检测。以人生长激素标准的增殖测试细胞NB2-11细胞株(欧洲细胞株/微生物保藏中心(ECACC))作为测试细胞。将生长状态良好的 NB2-11细胞通过胰酶消化,并计数。用无血清培养基重悬细胞,制备细胞悬液,按每孔接种5000个细胞接种到96孔细胞培养板中,进行血清饥饿处理24小时。将各样品稀释成设定的浓度加入对应的细胞培养孔中,在培养箱中培养24小时。采用CCK8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)进行增殖检测,向每孔加入20μL CCK8溶液;将培养板在培养箱内孵育2小时;用酶标仪测定在450nm处的吸光度。检测样品包括牛血清白蛋白(BSA)、实验例2中由L6KD自聚集肽得到的人生长激素hGH、商品人生长激素hGH (proteintech,USA),样品浓度为1、5、10、20、30、40、50ng/mL。
如图4所示,本方法纯化获得的人生长激素hGH可有效促进NB2-11 细胞的增殖,随加入浓度从1~50ng/mL的增加而增强,趋势与商品化hGH 样品基本一致。在添加50ng/mL的hGH条件下,本方法纯化获得的人生长激素hGH对NB2-11细胞的增殖活性是商品化hGH样品的88.5%。考虑到测试的hGH样品纯度为88.2%,因此,所得到的人生长激素hGH样品的生物活性与商品化人生长激素hGH相当。
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<400> 4
Cys Ile Thr Gly Asp Ala Leu Val Ala Leu Pro Glu Gly Glu Ser Val
1 5 10 15
Arg Ile Ala Asp Ile Val Pro Gly Ala Arg Pro Asn Ser Asp Asn Ala
20 25 30
Ile Asp Leu Lys Val Leu Asp Arg His Gly Asn Pro Val Leu Ala Asp
35 40 45
Arg Leu Phe His Ser Gly Glu His Pro Val Tyr Thr Val Arg Thr Val
50 55 60
Glu Gly Leu Arg Val Thr Gly Thr Ala Asn His Pro Leu Leu Cys Leu
65 70 75 80
Val Asp Val Ala Gly Val Pro Thr Leu Leu Trp Lys Leu Ile Asp Glu
85 90 95
Ile Lys Pro Gly Asp Tyr Ala Val Ile Gln Arg Ser Ala Phe Ser Val
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Asp Cys Ala Gly Phe Ala Arg Gly Lys Pro Glu Phe Ala Pro Thr Thr
115 120 125
Tyr Thr Val Gly Val Pro Gly Leu Val Arg Phe Leu Glu Ala His His
130 135 140
Arg Asp Pro Asp Ala Gln Ala Ile Ala Asp Glu Leu Thr Asp Gly Arg
145 150 155 160
Phe Tyr Tyr Ala Lys Val Ala Ser Val Thr Asp Ala Gly Val Gln Pro
165 170 175
Val Tyr Ser Leu Arg Val Asp Thr Ala Asp His Ala Phe Ile Thr Asn
180 185 190
Gly Phe Val Ser His Ala
195
<210> 5
<211> 191
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hGH
<400> 5
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 190
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GS linker
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PT linker
<400> 7
Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
1 5 10 15
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hGH-F primer
<400> 8
cgccatatgt tcccgaccat cccgctg 27
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hGH-R primer
<400> 9
gatgcacatt cgcatgaaac cgcaag 26
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mxe-L6KD-F primer
<400> 10
cctaatgttt catgcgaatg tgcatcacg 29
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mxe-L6KD-R primer
<400> 11
tgctcgagtc aatctttcag cagcagcagc agcagcggcg tcggggttgg 50
<210> 12
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mxe-EFK8-R primer
<400> 12
tgctcgagtc acttgaactc gaattcgaac tcgaacggcg tcggggt 47
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hGHalpha-R primer
<400> 13
cggactagtg catctcccgt gatgcacatt cgcatgaaac cg 42
Claims (37)
1.一种分离的融合多肽,其包含目的多肽部分和自聚集肽部分,所述目的多肽为人生长激素,其中所述目的多肽部分通过间隔物连接于所述自聚集肽部分,并且其中所述间隔物包含切割位点。
2.权利要求1的融合多肽,其中所述自聚集肽部分包含两亲性自组装短肽。
3.权利要求2的融合多肽,其中所述自聚集肽部分包含一个或更多个串联重复的两亲性自组装短肽。
4.权利要求2的融合多肽,其中所述两亲性自组装短肽选自两亲性β折叠短肽、两亲性α螺旋短肽和类表面活性剂短肽。
5.权利要求4的融合多肽,其中所述两亲性自组装短肽是类表面活性剂短肽。
6.权利要求4的融合多肽,其中所述类表面活性剂短肽具有7-30个氨基酸残基,其从N端到C端具有以下通式表示的氨基酸序列:
A-B或B-A
其中A是由亲水性氨基酸残基组成的肽,所述亲水性氨基酸残基可以是相同的或不同的,且选自Lys、Asp、Arg、Glu、His、Ser、Thr、Asn和Gln;
B是由疏水性氨基酸残基组成的肽,所述疏水性氨基酸残基可以是相同的或不同的,且选自Leu、Gly、Ala、Val、Ile、Phe和Trp;
A与B通过肽键连接;并且
其中在所述类表面活性剂短肽中疏水性氨基酸残基的比例是55%-95%。
7.权利要求6的融合多肽,其中所述类表面活性剂短肽具有8个氨基酸残基,其中在所述类表面活性剂短肽中疏水性氨基酸残基的比例是75%。
8.权利要求4的融合多肽,其中所述类表面活性短肽选自L6KD、L6KK、L6DD、L6DK、L6K2、L7KD和DKL6。
9.权利要求4的融合多肽,其中所述类表面活性剂短肽是L6KD,其氨基酸序列示于SEQID NO:1。
10.权利要求4的融合多肽,其中所述两亲性自组装短肽是两亲性β折叠短肽。
11.权利要求10的融合多肽,其中所述两亲性β折叠短肽的长度为4-30个氨基酸残基。
12.权利要求10的融合多肽,其中所述两亲性β折叠短肽的疏水性氨基酸残基含量为40%-80%。
13.权利要求10的融合多肽,其中所述两亲性β折叠短肽是EFK8,其氨基酸序列示于SEQID NO:2。
14.权利要求4的融合多肽,其中所述两亲性自组装短肽是两亲性α螺旋短肽。
15.权利要求14的融合多肽,其中所述两亲性α螺旋短肽的长度为4-30个氨基酸残基。
16.权利要求14的融合多肽,其中所述两亲性α螺旋短肽的疏水性氨基酸残基含量为40%-80%。
17.权利要求14的融合多肽,其中所述两亲性α螺旋短肽是α3-peptide,其氨基酸序列示于SEQ ID NO:3。
18.权利要求1的融合多肽,其中所述目的多肽部分位于所述融合多肽的N端。
19.权利要求1的融合多肽,其中所述目的多肽部分位于所述融合多肽的C端。
20.权利要求1-19中任一项的融合多肽,其中所述人生长激素部分包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
21.权利要求1-20中任一项的融合多肽,其中所述间隔物与目的多肽部分和/或自聚集肽部分直接连接;或者其中所述间隔物在其N端和/或C端进一步包含接头,其通过接头与目的多肽部分和/或自聚集肽部分连接。
22.权利要求1-21中任一项的融合多肽,其中所述切割位点选自温度依赖性切割位点、pH依赖性切割位点,离子依赖性切割位点、酶切割位点或自切割位点。
23.权利要求22的融合多肽,其中所述切割位点为自切割位点。
24.权利要求1-23中任一项的融合多肽,其中所述间隔物为内含肽,其包含自切割位点。
25.权利要求24的融合多肽,其中所述内含肽为Mxe GyrA,其包含SEQ ID NO:4所示的序列。
26.权利要求25的融合多肽,其中所述Mxe GyrA连接于所述人生长激素部分的N端或C端。
27.权利要求21的融合多肽,其中所述接头为GS型接头,其氨基酸序列示于SEQ ID NO:6;或其中所述接头为PT型接头,其氨基酸序列示于SEQ ID NO:7。
28.一种分离的多核苷酸,其包含编码权利要求1-27中任一项的融合多肽的核苷酸序列或其互补序列。
29.表达构建体,其包含权利要求28的多核苷酸。
30.宿主细胞,其包含权利要求28的多核苷酸或由权利要求29的表达构建体转化,其中所述宿主细胞能够表达所述融合多肽。
31.权利要求30的宿主细胞,其选自原核生物、酵母和高等真核细胞。
32.权利要求31的宿主细胞,其中所述原核生物包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙门氏菌属(Salmonella)以及假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。
33.权利要求31的宿主细胞,其中所述原核生物是埃希氏菌属,优选大肠杆菌(E.coli)。
34.生产和纯化人生长激素的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)培养权利要求30-33中任一项的宿主细胞,从而表达融合多肽;
(b)裂解所述宿主细胞,然后去除细胞裂解物的可溶部分,回收不溶部分;
(c)通过切割所述切割位点从所述不溶部分释放可溶的目的多肽;和
(d)去除步骤(c)中的不溶部分,回收含有所述人生长激素的可溶部分。
35.权利要求34的方法,其中所述裂解通过超声、匀浆、高压、低渗、裂解酶、有机溶剂或其组合进行。
36.权利要求34的方法,其中所述裂解在弱碱性的pH条件下进行。
37.权利要求34的方法,其中所述切割是二硫苏糖醇(DTT)介导的自切割。
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