CN113549144A - 一种特立帕肽hPTH(1-34)的生产和纯化方法 - Google Patents

一种特立帕肽hPTH(1-34)的生产和纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特立帕肽hPTH(1‑34)的生产和纯化方法，属于基因工程领域。该方法包括：将聚集肽的基因序列、切割标签的基因序列及人特立帕肽hPTH(1‑34)的基因序列依次连接，形成融合蛋白的基因，将所述融合蛋白的基因导入宿主细胞，得到工程菌；培养工程菌表达所述融合蛋白，然后裂解工程菌，离心取沉淀，得到融合蛋白的聚集体；将融合蛋白的聚集体进行切割，得到所述人特立帕肽hPTH(1‑34)。本发明纯化得到的特立帕肽hPTH(1‑34)的产量和纯度都很高，而且该纯化方法对设备要求低，步骤少，操作简便，生产效率高，成本低，可应用于特立帕肽hPTH(1‑34)的高效制备中。

Description

一种特立帕肽hPTH(1-34)的生产和纯化方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，更具体地，本发明涉及一种特立帕肽hPTH(1-34)的生产和纯化方法。
背景技术
成熟的人甲状旁腺激素(hPTH)是由甲状旁腺分泌的一种含有84个氨基酸残基的多肽。这种激素是儿童神经、骨骼、肠道和血液中钙、磷和维生素D活性形式的主要调节者(Murray等，2005)。研究表明，甲状旁腺激素(hPTH)N端的34个氨基酸与完整的甲状旁腺激素(hPTH)具有相似的生物活性。这种34个氨基酸的肽就是特立帕肽(hPTH，1-34)(Cheng和Gupta，2012)。特立帕肽hPTH(1-34)的相对分子质量为4117.75，它由34个天然氨基酸组成，其序列为：H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH。它能促进骨形成，增加骨量(Elaena Quattrocchi等，2004)。特立帕肽hPTH(1-34)这种特性使其被用作骨质疏松症药物(Sepideh Abbaszadeh等，2019)。
骨质疏松症是一种以低骨密度和骨组织结构退化为特征的疾病，可导致骨骼脆弱，增加骨折的易感性，尤其是髋部、脊柱和腕部。2002年11月，美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)批准了特立帕肽(hPTH，1-34)，用于治疗“骨折高危”的男性和绝经后妇女的骨质疏松症。这是首次对促进骨骼合成代谢的药物给予了监管许可(R.Marcus，2011)。礼来公司是特立帕肽的原研企业，它采用基因重组表达获得特立帕肽(专利US6590081)。2015年，美国礼来公司的特立帕肽药物Forsteo全球市场份额达到15.6亿美元。中国是全世界骨质疏松人数最多的国家，有数据显示目前我国骨质疏松患者为9000万人，预计到2025年该数字将上升到1.5亿，特立帕肽的市场潜力巨大。
临床使用的特立帕肽(hPTH，1-34)主要是传统基因工程方法生产，特立帕肽hPTH(1-34)已在不同宿主中以重组形式生产，如大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母和哺乳动物细胞系(Vad等，2005；Liu等，2007)。在大肠杆菌中生产重组特立帕肽hPTH(1-34)的问题之一是表达后其结构固有的不稳定性。由于特立帕肽hPTH(1-34)分子量低，易于被宿主细胞蛋白酶消化，因此，从1988年开始，通过融合蛋白生产特立帕肽hPTH(1-34)(SepidehAbbaszadeh等，2019)。常用的融合标签有β-半乳糖苷酶标签(Yuji Suzuki等，1998)，GST促溶标签(Zhaoyang Xiu等，2002)，Trx促溶标签(Sanaz Yari等，2017)和pH响应的CspB标签(Takahiro Nonaka等，2019)。目前的特立帕肽hPTH(1-34)产生与纯化方法，其过程需用酶去除标签，并且要进行比较繁琐的纯化步骤，需要采用多种柱层析技术，如亲和层析、凝胶排阻层析等，收率低，成本较高，导致特立帕肽的产品价格高。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种特立帕肽hPTH(1-34)的生产和纯化方法。
本发明提供了一种基于自聚集肽和切割标签的低成本、简便、高效的特立帕肽hPTH(1-34)的产生和纯化方法。该方法是一种通过表达所述融合多肽来生产和纯化目的特立帕肽hPTH(1-34)的方法，所述融合多肽包含特立帕肽hPTH(1-34)和自聚集肽部分的融合多肽。
本发明提供的人特立帕肽hPTH(1-34)的高效表达与纯化方法，是通过分子克隆构建含特立帕肽hPTH(1-34)的融合蛋白基因，然后导入宿主细胞中，进行培养宿主细胞，以表达所述融合蛋白，接着裂解宿主细胞，收集融合蛋白，切割，得到所述人特立帕肽hPTH(1-34)。
本发明提供的人特立帕肽hPTH(1-34)的高效表达与纯化方法，具体包括如下步骤：
(1)将聚集肽的基因序列、切割标签的基因序列及人特立帕肽hPTH(1-34)的基因序列依次连接，形成融合蛋白的基因，将所述融合蛋白的基因导入宿主细胞，得到工程菌；
(2)培养步骤(1)所述工程菌表达所述融合蛋白，然后裂解工程菌，去除细胞裂解物中的可溶部分，回收不溶部分，即得到所述融合蛋白(在培养液中会形成不可溶的活性聚集体)；
(3)将步骤(2)所述融合蛋白进行切割(在切割标签部分进行切割，从而在不溶部分中释放可溶的人特立帕肽hPTH(1-34))，分离纯化得到所述人特立帕肽hPTH(1-34)。
进一步地，步骤(1)中，所述融合蛋白的基因的连接顺序为聚集肽的基因序列、切割标签的基因序列及人特立帕肽hPTH(1-34)的基因序列部分。所述融合蛋白在宿主细胞内表达后可通过所述自聚集肽部分形成不可溶的活性聚集体，然后经过体外切割即可获取所述人特立帕肽hPTH(1-34)。
进一步地，步骤(1)所述聚集肽包含一个以上的两亲性自组装短肽。所述聚集肽包括一个或者串联重复的两个以上的两亲性自组装短肽。
优选地，所述两亲性自组装短肽为类表面活性剂短肽、两亲性α螺旋短肽中的一种以上；所述类表面活性剂短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述两亲性α螺旋短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选地，所述类表面活性剂短肽为类表面活性剂短肽L6KD。
优选地，所述两亲性α螺旋短肽为两亲性α螺旋短肽α3-peptide。
进一步地，步骤(1)所述切割标签为化学切割位点、酶法切割位点或自切割位点。在一些实施方案中，所述自切割位点为内含肽(intein)。
优选地，所述切割标签为自切割位点，所述自切割位点为内含肽。
优选地，所述内含肽为MtuΔI-CM，所述MtuΔI-CM的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在本发明提供的人特立帕肽hPTH(1-34)的高效表达与纯化方法中，将缓冲buffer调至弱酸性就可诱导MtuΔI-CM内含肽在其羧基端进行自切割。
优选地，所述内含肽为MtuΔI-CM的突变体，所述MtuΔI-CM的突变体为MtuΔI-CM的m1、m2或m3突变体，所述MtuΔI-CM的m1突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述MtuΔI-CM的m2突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述MtuΔI-CM的m3突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
优选地，当所述自切割位点为内含肽时，步骤(3)中所述切割，包括：将所述融合蛋白的聚集体分散在缓冲液中，进行切割处理，离心取上清液，得到含人特立帕肽hPTH(1-34)的溶液；所述缓冲液的pH值为5.5～6.8，所述切割处理的温度为4～37℃，切割处理的时间为3～48h。
进一步地，所述人特立帕肽hPTH(1-34)的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
进一步地，所述聚集肽的基因序列与切割标签的基因序列之间通过接头连接，所述接头为PT型接头；所述PT型接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
优选地，所述切割标签的基因序列与人特立帕肽hPTH(1-34)的基因序列之间也可以通过接头连接。
进一步优选地，所述接头为PT型接头。
所述接头是指一定长度的由低电荷效应和低疏水性的氨基酸组成，可以使连接的多肽或蛋白各自充分展开，互不影响，各自折叠成自己的天然构象。常用的接头例如，富含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的GS型接头；富含脯氨酸(P)和苏氨酸(T)的PT型接头。
在另一方面，本发明提供了一种多核苷酸，其包含编码本发明上述的融合蛋白的核苷酸序列或其互补序列。
在另一方面，本发明提供了一种表达载构建体，其包含本发明上述的多核苷酸。
在另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明上述的多核苷酸或以本发明所述的表达载构建体，其中所述宿主细胞能够表达本发明上述的融合蛋白。
在本发明的重组表达构建体中，编码所述融合蛋白的多核苷酸序列与表达控制序列进行适当连接以实现如期的转录及最终在宿主细胞中生产所述融合蛋白。所述的表达控制序列包括但不限于启动子、增强子、核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、转录剪接序列、转录终止序列和稳定mRNA的序列等。
本发明用于表达构建体的载体包括可在宿主细胞中自主复制的载体，如质粒载体；和可整合到宿主细胞DNA中并和宿主细胞DNA一起复制的载体。在具体实施方案中，本发明所述的表达构建体衍生自Novagen公司的pET30a(+)。
用于表达本发明融合蛋白的宿主细胞包括原核生物、酵母和高等真核细胞。示例性的原核生物包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。在优选的实施方案中，宿主细胞是埃希氏菌属细胞，优选是大肠杆菌。在本发明的一个具体实施方案中，所使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)菌株细胞(Novagen)。
在本发明中，使宿主细胞裂解的方法选自本领域常用的处理方式，例如超声、匀浆、高压(例如在弗氏压碎器中)、低渗(osmolysis)、去垢剂、裂解酶、有机溶剂或其组合，并且所述破碎在第一pH条件(即近中性pH，例如pH 7.5-8.0)下进行，由此使得宿主细胞的细胞膜破碎，活性聚集体从胞内释放出来，但仍然保持不溶状态。进行自切割的缓冲液为弱酸性，优先pH 6.2。
本发明提供了一种新的聚集标签，用于蛋白质/肽的生产和无柱纯化，称为可切割的自聚集标签(cSAT,cleavable self-aggregating tags)。这个标签包括两个部分：易于聚集的部分和可裂解的部分。易于聚集的部分可以是在体内或体外聚集的蛋白质/肽。可切割部分通常是完整的自可切割内含肽，分裂内含肽、蛋白酶切割位点或化学切割位点。含有聚集标签的融合蛋白可通过离心简单，快速地分离；随后通过常规切割方法释放靶蛋白。与目前的融合标签相比，cSAT方法具有两个潜在的优势：(1)它诱导包涵体的形成，因此可以更好地保护靶肽免受蛋白水解降解，降低对宿主细胞的毒性；(2)由于包涵体中的融合实际上是有活性的，因此它通过离心和内含肽介导的裂解提供了一种更为简单的蛋白纯化方法，无需重新折叠或添加蛋白酶即可纯化和释放多肽。这种cSAT方法就其简单性和速度而言，具有相当大的优势，消除了对外源蛋白酶的需求，并减少了色谱纯化步骤的数量。从而比基于传统标签的方法(需要使用昂贵的色谱柱和树脂)产生更高的产量，更高的纯度和更低的成本。
本发明通过cSAT成功地建立了重组特立帕肽高效的制备方法，它能够提高特立帕肽的稳定性、简化纯化步骤、降低纯化成本，使特立帕肽在市场竞争中更有竞争力。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明采用的自聚集肽可以诱导融合蛋白形成大量的有活性的蛋白聚集体，可避免特立帕肽hPTH(1-34)在宿主内降解，并有助其在原核细胞内进行正确折叠形成有活性的特立帕肽hPTH(1-34)。
(2)本发明所获特立帕肽hPTH(1-34)为分子量及结构正确的多肽，中间无需繁琐的变复性操作，而且产量和纯度都很高。
(3)本发明的特立帕肽hPTH(1-34)纯化方法对设备要求低，步骤少，操作简便，生产成本低。
附图说明
图1a为cSAT法表达和纯化特立帕肽的示意图；
图1b为基于cSAT法特立帕肽融合蛋白表达载体的结构示意图。
图2a为MtuΔI-CM和MtuΔI-CM m1切割前上清ES、切割前沉淀EP、切割后的沉淀EP的SDS-PAGE图；
图2b为MtuΔI-CM m2和MtuΔI-CM m3切割前上清ES、切割前沉淀EP、切割后的沉淀EP的SDS-PAGE图；
图2c为切割条件为4℃切割16h然后25℃切割3h切割上清产物CS的SDS-PAGE图，①泳道是MtuΔI-CM切割上清产物，②泳道是MtuΔI-CM m1的切割上清产物，③泳道是MtuΔI-CM m2的切割上清产物，④泳道是MtuΔI-CM m3的切割上清产物；
图2d是切割条件为25℃切割24h时，切割上清产物的SDS-PAGE图，泳道①②③④同图2c。
图3a、图3b和图3c为MtuΔI-CM m2和MtuΔI-CM m3分别在切割前上清ES、切割前沉淀EP、切割后沉淀EP三次平行实验的SDS-PAGE图；
图3d为MtuΔI-CM m2切割后上清CS三次平行实验的SDS-PAGE图；
图3e为MtuΔI-CM m3切割后上清CS三次平行实验的SDS-PAGE图。
图4a为α3自聚集标签融合蛋白经MtuΔI-CM m2切割前上清ES、切割前沉淀EP、切割后沉淀EP三次平行实验的SDS-PAGE图；
图4b为α3自聚集标签融合蛋白经MtuΔI-CM m2切割后上清ES三次平行实验的SDS-PAGE图。
图5a为分子筛纯化的蛋白峰形图；
图5b为纯化后特立帕肽样品的SDS-PAGE分析结果图，1～4抑肽酶标准品，上样量依次为10μg、5μg、2.5μg、1.25μg，其中④、⑤、⑥、⑦为分子筛纯化过程中不同时段收集的蛋白溶液。
图6a为阳离子交换色谱纯化的蛋白峰形图；
图6b为纯化后特立帕肽样品的SDS-PAGE分析结果图，泳道1～4为抑肽酶标准品，上样量依次为10μg、5μg、2.5μg、1.25μg。①～⑤为分子筛纯化过程中不同时段收集的蛋白溶液。
图7为特立帕肽hPTH(1-34)的RP-HPLC分析图。
图8a为特立帕肽HPLC-MS分析图；
图8b为在4.46分钟进行前体质量扫描，得出特立帕肽的分子量为4117.2Da。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1：构建含有内含肽MtuΔI-CM不同突变株的特立帕肽融合蛋白表达构建体本申请实施例中所使用的表达载体为含4种不同MtuΔI-CM突变株的融合蛋白表达载体(pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CM-hPTH(1-34)、pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CM m1-hPTH(1-34)、pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CM m2-hPTH(1-34)、pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CM m3-hPTH(1-34))。图1a为cSAT法表达和纯化特立帕肽的示意图；图1b为基于cSAT法特立帕肽融合蛋白表达载体的结构示意图。
首先构建pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CM m2-hPTH(1-34)质粒，该质粒构建所需要的引物，通过oligo 7设计并由上海生工合成如表1所示的寡聚核苷酸引物。首先从文献(Teriparatide:A Review)中获得特立帕肽hPTH(1-34)的氨基酸序列，特立帕肽的序列是通过用DNA work设计引物J19062-J19067，由上海生工合成寡聚核苷酸引物，然后通过重叠PCR扩增出全长特立帕肽序列，特立帕肽的基因序列如SEQ ID NO:14，质粒构建过程中所涉及到的引物如表1所示。因为我们没有特立帕肽基因模板，无法通过一对引物来合成特立帕肽基因。这里使用6条引物是通过拼接的方法合成特立帕肽基因。用引物(J19068-Teri-F/J19069-Teri-R)通过PCR反应扩增出带有Xho I酶切位点的特立帕肽基因片段，然后用引物(J19003-L6KD-F/J19070-Mtu-R)扩增带有Nde I酶切位点的L6KD-PT-MtuΔI-CM m2基因片段，L6KD的基因序列如SEQ ID NO:2，PT型接头的基因序列如SEQ ID NO:16，MtuΔI-CM m2的基因序列如SEQ ID NO:10。将该片段与扩增出的特立帕肽片段用引物(J19018-L6KD-F/J19069-Teri-R)通过重叠PCR的方法扩增出完整的L6KD-PT-MtuΔI-CM m2-hPTH(1-34)片段，随后将该基因片段用Nde I和Xho I酶进行双酶切，并与经过同样内切酶切割后的载体pET30a连接，将连接产物化转入大肠杆菌DH5α，通过菌落PCR鉴定和测序筛选出正确的阳性克隆后，提取该质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)进行表达以及后续实验。
pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CM-hPTH(1-34)、pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CM m1-hPTH(1-34)、pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CM m3-hPTH(1-34)质粒以上述构建完成的pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CM m2-hPTH(1-34)质粒为模板，通过Gibson的方法构建。其中MtuΔI-CM的基因序列如SEQ ID NO:6，MtuΔI-CM m1的基因序列如SEQ ID NO:8，MtuΔI-CM m3的基因序列如SEQ ID NO:12。用引物通过PCR反应以pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CM m2-hPTH(1-34)质粒为模板利用引物(R20005-Teri-F/R20006-Teri-R，如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示)通过PCR反应扩增hPTH(1-34)-KanR-ori片段，PCR反应使用NEB公司的Q5聚合酶，PCR条件为：98℃30sec，98℃10sec，68℃30sec，72℃3min，共30个循环；最后72℃2min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶分离回收，作为Gibson的公共片段。以pET32a-L6KD-PT-MtuΔI-CM-hGH、pET32a-L6KD-PT-MtuΔI-CM m1-hGH、pET32a-L6KD-PT-MtuΔI-CM m3-hGH为模板，利用引物(R20007-Mtu-F/R20008-Mtu-R，如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示)通过PCR反应扩增lac1-L6KD-PT-MtuΔI-CM、lac1-L6KD-PT-MtuΔI-CM m1、lac1-L6KD-PT-MtuΔI-CM m3片段，反应使用NEB公司的Q5聚合酶，PCR条件为：98℃30sec，98℃10sec，68℃30sec，72℃3min，共30个循环；最后72℃2min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶分离回收。以hPTH(1-34)-KanR-ori/lac1-L6KD-PT-MtuΔI-CM、hPTH(1-34)-KanR-ori/lac1-L6KD-PT-MtuΔI-CM m1、hPTH(1-34)-KanR-ori/lac1-L6KD-PT-MtuΔI-CM m3三对片段进行Gibson反应，条件为：50℃1h。将Gibson产物加入的DH5α感受态中，通过菌落PCR鉴定和测序筛选出正确的阳性克隆后，提取该质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)进行表达以及后续实验。
表1本实施例所用寡聚核苷酸引物
Figure BDA0003142463730000071
Figure BDA0003142463730000081
a引物下划线部分分别为限制性内切酶Xho I和Nde I的识别位点。
实施例2：含内含肽MtuΔI-CM不同突变株的特立帕肽融合蛋白的表达与纯化
将实施例1中构建好含有质粒(pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CM-hPTH(1-34)、pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CM m1-hPTH(1-34)、pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CM m2-hPTH(1-34)、pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CM m3-hPTH(1-34))的BL21(DE3)菌株接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，并在37℃摇床中培养至对数期(OD600＝0.4～0.6)，加入终浓度0.2mMIPTG，培养条件为：18℃、250rpm，24小时后收获细胞，并测量菌浓度OD600(以下将1mL的OD600为1的细胞量称为1OD)。
将菌体用裂解缓冲液B1(2.4g的Tris、29.22g的NaCl、0.37g的Na2·EDTA·2H2O溶解于800mL水中，调pH至8.5，加水定容至1L)重悬至20OD/mL，进行超声破碎(破碎条件为：功率200W，超声时间3sec，间隔时间3sec，超声次数99次)。在4℃，12000rpm的条件下离心20min，分别收集上清和沉淀部分。将沉淀用裂解缓冲液洗涤2次后，使用切割缓冲液(PBS补加40mM Bis-Tris，2mM EDTA，调pH至6.2)充分重悬，置于25℃切割24h和4℃切割16h，25℃切割3h两种切割条件。之后将悬浊液离心分离，得到的上清和沉淀与切割前的沉淀一起进行SDS-PAGE检测(沉淀部分用与上一重悬步骤相同的体积的裂解缓冲液重悬)。结果如图2a、图2b及图2c、图2d所示。图2a、图2b及图2c、图2d中显示含四种MtuΔI-CM突变株特立帕肽表达载体在两种不同的切割条件下的产量。ES：细胞裂解物上清；EP：细胞裂解物沉淀，可检测到清晰的融合蛋白表达成的聚集体；CPⅠ：表示的切割条件为4℃切割16h，25℃切割3h时，切割后分离的沉淀；CPⅡ：表示的切割条件为25℃切割24h时，切割后分离的沉淀；CS：切割后分离的上清，图2c(4℃切割16h，25℃切割3h)和图2d(切割条件为25℃切割24h)可检测到清晰的特立帕肽hPTH(1-34)的条带。图2a和图2b泳道1-5为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为8μg、4μg、2μg、1μg、0.5μg。图2c是切割条件为4℃切割16h，25℃切割3h时，切割上清的SDS-PAGE的图，图2d是切割条件为25℃切割24h时，切割上清的SDS-PAGE的图，图2c和图2d中①泳道是MtuΔI-CM切割上清产物，②泳道是MtuΔI-CM m1的切割上清产物，③泳道是MtuΔI-CM m2的切割上清产物，④泳道是MtuΔI-CM m3的切割上清产物。图2c和图2d泳道1-5为含有抑肽酶的蛋白定量标准品，上样量依次为5μg、2.5μg、1.25μg、0.625μg、0.3125μg。
依照蛋白定量标准品，应用Bio-Rad公司的Quantity ONE凝胶定量分析软件对目的条带进行光密度分析，可计算得出融合蛋白形成的聚集体产量、在内含肽介导的自切割之后释放到上清中的特立帕肽的产量、MtuΔI-CM不同突变株的切割效率、特立帕肽hPTH(1-34)回收率及其在上清中的纯度，结果如表2和表3所示。
表2特立帕肽hPTH(1-34)在25℃切割3h，4℃切割12h的条件下的表达与纯化情况
Figure BDA0003142463730000091
表3特立帕肽hPTH(1-34)在25℃切割24h的条件下的表达与纯化情况
Figure BDA0003142463730000092
a蛋白聚集体产量，b内含肽介导的自切割后的特立帕肽hPTH(1-34)产量，c内含肽介导的自切割效率＝100％×(切割前聚集体表达量-切割后聚集体剩余量/切割前聚集体产量，d回收率＝100％×hPTH(1-34)实际产量/蛋白聚集体在完全切割的情况下可生产特立帕肽hPTH(1-34)的理论产量，e纯度＝100％×重组特立帕肽的灰度/(重组特立帕肽的灰度+杂蛋白的灰度)。
采用不同MtuΔI-CM突变株(MtuΔI-CM/MtuΔI-CM m1/MtuΔI-CM m2/MtuΔI-CMm3)的特立帕肽hPTH(1-34)融合蛋白均以沉淀形式存在，聚集体的表达量为201.2～970.6mg/L，4种融合蛋白经内含肽MtuΔI-CM自切割，特立帕肽hPTH(1-34)同MtuΔI-CM/MtuΔI-CM m1/MtuΔI-CM m2/MtuΔI-CM m3-L6KD分离，切割效率是42～78％。其中以MtuΔI-CM m2和MtuΔI-CM m3产量较高，且纯度较好，通过初步的cSAT纯化，特立帕肽hPTH(1-34)的产量为35.48～55.35mg/L，纯度达到70.25～80.94％。同时，也进行了切割条件的优化，证实了25℃切割24h特立帕肽hPTH(1-34)的产量较高，这种切割条件用于后续的实验。
实施例3：特立帕肽hPTH(1-34)融合蛋白利用发酵培养基的表达与纯化
将实施例1中构建好的两株BL21(DE3)菌株(分别含pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CMm2-hPTH(1-34)质粒和pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CM m3-hPTH(1-34)质粒)接种到含50μg/mL卡那霉素的发酵培养基(Shao-Yang Hu等，2004)，并在37℃摇床中培养至对数期(OD600＝0.4～0.6)，加入终浓度为0.2mM IPTG，在18℃诱导24小时，收获细胞，并测量菌浓度OD600。以下将1mL的OD600为1的细胞量称为1OD。所用的发酵培养基组分如表4所示。将葡萄糖与其他成分分开灭菌，121℃灭菌20min，微量元素溶液用0.22μm的滤头在超净工作台过滤除菌。培养基配好后在使用前加入终浓度50mg/L的卡那霉素。
表4发酵培养基组分
Figure BDA0003142463730000101
Figure BDA0003142463730000111
将菌体用裂解缓冲液B1(2.4g的Tris、29.22g的NaCl、0.37g的Na2·EDTA·2H2O溶解于800mL水中，调pH至8.5，加水定容至1L)重悬至20OD/mL，进行超声破碎(破碎条件为：功率200W，超声时间3sec，间隔时间3sec，超声次数99次)。在4℃，12000rpm的条件下离心20min，分别收集上清和沉淀部分。将沉淀用裂解缓冲液洗涤2次后，使用切割缓冲液(PBS补加40mM Bis-Tris，2mM EDTA，调pH至6.2)充分重悬，置于25℃切割24h。之后将悬浊液离心分离，得到的上清和沉淀与切割前的沉淀一起进行SDS-PAGE检测(沉淀部分用与上一重悬步骤相同的体积的裂解缓冲液重悬)。结果如图3a、图3b、图3c、图3d及图3e所示。图中显示pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CM m2-hPTH(1-34)质粒和pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CM m3-hPTH(1-34)质粒表达的融合蛋白在发酵培养基中利用cSAT法表达和纯化的三次平行实验结果，切割条件为25℃切割24h。图3a、图3b、图3c、图3d及图3e为基于MtuΔI-CM m2和MtuΔI-CMm3内含肽的特立帕肽在发酵培养基表达的SDS-PAGE结果图。ES：细胞裂解物上清；EP：细胞裂解物沉淀，可检测到清晰的融合蛋白表达成的聚集体；CP：切割后分离的沉淀；CS：切割后分离的上清，图3d和图3e可检测到清晰的特立帕肽hPTH(1-34)的条带。图3a、图3b和图3c中的泳道1-5为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为8μg、4μg、2μg、1μg、0.5μg。图3d和图3e泳道1-5为含有抑肽酶的蛋白定量标准品，上样量依次为5μg、2.5μg、1.25μg、0.625μg、0.3125μg。
依照蛋白定量标准品，应用Bio-Rad公司的Quantity ONE凝胶定量分析软件对目的条带进行光密度分析，可计算得出融合蛋白形成的聚集体产量、在内含肽介导的自切割之后释放到上清中的特立帕肽的产量、MtuΔI-CM m2和MtuΔI-CM m3的切割效率、特立帕肽hPTH(1-34)回收率及其在上清中的纯度，结果如表5所示。
表5特立帕肽hPTH(1-34)在发酵培养基中的表达与纯化情况
Figure BDA0003142463730000112
Figure BDA0003142463730000121
a蛋白聚集体产量，b内含肽介导的自切割后的特立帕肽hPTH(1-34)产量，c内含肽介导的自切割效率＝100％×(切割前聚集体表达量-切割后聚集体剩余量)/切割前聚集体产量，d回收率＝100％×hPTH(1-34)实际产量/蛋白聚集体在完全切割的情况下可生产特立帕肽hPTH(1-34)的理论产量，e纯度＝100％×重组特立帕肽的灰度/(重组特立帕肽的灰度+杂蛋白的灰度)。
所采用的2种不同MtuΔI-CM融合蛋白(L6KD-PT-MtuΔI-CM m2-hPTH(1-34)、L6KD-PT-MtuΔI-CM m3-hPTH(1-34))均以沉淀形式存在，2种不同MtuΔI-CM聚集体表达量为2708～4130mg/L发酵培养液。2种不同MtuΔI-CM融合蛋白经内含肽MtuΔI-CM自切割，hPTH(1-34)同L6KD-MtuΔI-CM分离，切割效率是63～78％，切割后释放到上清中的hPTH(1-34)的产量为187～524mg/L发酵培养液，切割后回收的hPTH(1-34)纯度为76.63～83.16％。经MtuΔI-CM m2切割后特立帕肽的平均产量为332.92mg/L，经MtuΔI-CM m3切割后特立帕肽的平均产量为336.89mg/L，这2种内含肽的特立帕肽产量类似，但由于经MtuΔI-CM m2切割后的特立帕肽的平均纯度更高(达到82.92％)，所以我们选择MtuΔI-CM m2内含肽用于后续实验。
实施例4：构建含有α3自聚集标签的特立帕肽融合蛋白表达构建体
本申请实施例中所使用的表达载体为含有α3自聚集标签的特立帕肽融合蛋白表达载体，分别为pET30a-α3-MtuΔI-CM m2-hPTH(1-34)，质粒构建所需要的引物，通过oligo7设计并由上海生工合成寡聚核苷酸引物。
以实施例1中构建完成的pET30a-L6KD-PT-MtuΔI-CM m2-hPTH(1-34)质粒为模板，利用引物(R20041-MtuΔI-CM m2-F/R20044-rob-R，如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示)通过PCR反应扩增MtuΔI-CM m2-hPTH(1-34)-KanR-rob片段，PCR反应使用NEB公司的Q5聚合酶，PCR条件为：98℃30sec，98℃10sec，68℃30sec，72℃80sec，共30个循环；最后72℃2min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶分离回收，作为Gibson的公共片段。以pET32a-a3-PT-MtuΔI-CM m2-hGH为模板，用引物(R20043-rob-F/R20042-MtuΔI-CMm2-R，如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示)通过PCR反应扩增lac1-a3片段，a3的基因序列如SEQ ID NO:4，反应使用NEB公司的Q5聚合酶，PCR条件为：98℃30sec，98℃10sec，68℃30sec，72℃2min，共30个循环；最后72℃2min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶分离回收。以MtuΔI-CM m2-hPTH(1-34)-KanR-rob/lac1-a3片段进行Gibson反应，PCR条件为：50℃、1h。将Gibson产物加入的DH5α感受态中，通过菌落PCR鉴定和测序筛选出正确的阳性克隆后，提取该质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)进行表达以及后续研究。
实施例5：含有α3自聚集标签的特立帕肽融合蛋白的表达和纯化
将案例4构建好的BL21(DE3)菌株接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，并在37℃摇床中培养至对数期(OD600＝0.4～0.6)，加入终浓度0.2mM IPTG，培养条件为：18℃、250rpm，24小时后收获细胞，并测量菌浓度OD600(以下将1mL的OD600为1的细胞量称为1OD)。
将菌体用裂解缓冲液B1(2.4g的Tris、29.22g的NaCl、0.37g的Na2·EDTA·2H2O溶解于800mL水中，调pH至8.5，加水定容至1L)重悬至20OD/mL，进行超声破碎(破碎条件为：功率200W，超声时间3sec，间隔时间3sec，超声次数99次)。在4℃，12000rpm的条件下离心20min，分别收集上清和沉淀部分。将沉淀用裂解缓冲液洗涤2次后，使用切割缓冲液(PBS补加40mM Bis-Tris，2mM EDTA，调pH至6.2)充分重悬，置于25℃切割24h。之后将悬浊液离心分离，得到的上清和沉淀与切割前的沉淀一起进行SDS-PAGE检测(沉淀部分用与上一重悬步骤相同的体积的裂解缓冲液重悬)。
结果如图4a和图4b所示，图中显示含α3自聚集标签的特立帕肽表达载体的产量，切割条件为25℃切割24h。ES：细胞裂解物上清；EP：细胞裂解物沉淀，可检测到清晰的融合蛋白表达成的聚集体；CP：切割后分离的沉淀；CS：切割后分离的上清，图4b可检测到清晰的特立帕肽hPTH(1-34)的条带。图4a泳道1-5为含有牛血清蛋白BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为8μg、4μg、2μg、1μg、0.5μg。图4b泳道1-5为含有抑肽酶的蛋白定量标准品，上样量依次为5μg、2.5μg、1.25μg、0.625μg、0.3125μg。
依照蛋白定量标准品，应用Bio-Rad公司的Quantity ONE凝胶定量分析软件对目的条带进行光密度分析，可计算得出融合蛋白形成的聚集体产量、在内含肽介导的自切割之后释放到上清中的特立帕肽的产量、不同聚集标签的切割效率、特立帕肽hPTH(1-34)回收率及其在上清中的纯度，结果如表6所示。
表6特立帕肽hPTH(1-34)使用不同自聚集标签融合表达的情况
Figure BDA0003142463730000131
Figure BDA0003142463730000141
a蛋白聚集体产量，b内含肽介导的自切割后的特立帕肽hPTH(1-34)产量，c内含肽介导的自切割效率＝100％×(切割前聚集体表达量-切割后聚集体剩余量)/切割前聚集体产量，d回收率＝100％×hPTH(1-34)实际产量/蛋白聚集体在完全切割的情况下可生产特立帕肽hPTH(1-34)的理论产量，e纯度＝100％×重组特立帕肽的灰度/(重组特立帕肽的灰度+杂蛋白的灰度)。
采用α3自聚集标签的特立帕肽hPTH(1-34)融合表达，α3聚集体虽然能生成沉淀，但是产量较低。融合蛋白经内含肽MtuΔI-CM m2自切割，特立帕肽hPTH(1-34)同α3-MtuΔI-CM m2分离，切割效率是79～81％，这种聚集标签的特立帕肽的产量为15.09～18.60mg/L，低于L6KD特立帕肽的产量。证实了L6KD标签比α3标签更适合特立帕肽hPTH(1-34)的生产和纯化。
实施例6：特立帕肽的分子筛纯化
以实施例3中由MtuΔI-CM m2内含肽得到的特立帕肽hPTH(1-34)样品为例，取约12.5mg特立帕肽hPTH(1-34)样品分子筛柱(HiLoadTM 16/60SuperdexTM 30pg)进行精细纯化。用缓冲液(20mM Na2HPO4，20mM NaH2PO4，pH 7.2)洗脱1CV，收集约785～806min的峰。图5a和图5b为AKTA纯化的结果示意图，图5a为蛋白出峰波形图，其中④、⑤、⑥、⑦为分子筛纯化过程中不同时段收集的蛋白溶液，取10μL加入50μL的6×loading buffer制成样品，跑SDS-PAGE蛋白胶，结果见图5b。图5b中抑肽酶的上样量依次为10μg、5μg、2.5μg、1.25μg。
表7分子筛(HiLoadTM 16/60SuperdexTM 30pg柱)纯化特立帕肽的情况
Figure BDA0003142463730000142
实施例7：特立帕肽的阳离子交换色谱纯化
取分子筛纯化的产物约0.96mg特立帕肽hPTH(1-34)样品进行阳离子交换色谱纯化。将样品的Buffer置换成Starting Buffer(50mM CH3COONa，pH 5.0)，上样后用StartingBuffer将紫外冲至基线平稳，然后用Elution Buffer(50mM CH3COONa，1M NaCl，pH 5.0)进行0～50％的梯度洗脱，洗脱时间为30min，收集所有的蛋白峰。图6a和图6b为阳离子交换色谱纯化的结果示意图，图6a为蛋白出峰波形图，其中①～⑤为分子筛纯化过程中不同时段收集的蛋白溶液，取10μL加入50μL的6×loading buffer制成样品，跑SDS-PAGE蛋白胶，结果见图6b。图6b中抑肽酶的上样量依次为10μg、5μg、2.5μg、1.25μg。
表8阳离子交换色谱(HiTrapTM CaptoTM S)纯化特立帕肽的情况
Figure BDA0003142463730000151
实施例8：特立帕肽的RP-HPLC测定
以实施例9中由分子筛纯化得到的特立帕肽hPTH(1-34)样品为例，进行RP-HPLC测定。取标准品和纯化后的特立帕肽hPTH(1-34)样品用无菌水配制成0.1mg/mL的溶液，采用RP-HPLC进行分析。仪器：Agilent 1260；色谱柱：SB-C18柱；流动相：A液为含有0.1％三氟乙酸的超纯水，B液为含有0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，采用的梯度如表7，进样量为99μL，流速为1mL/min，温度为25℃，检测波长为215nm。RP-HPLC结果见图7。
表9流动相梯度变化设定参数
时间(min) A液比例(％(v/v)) B液比例(％(v/v))
0 80 20
3 80 20
19 40 60
25 20 80
28 20 80
33 80 20
36 80 20
实施例9：特立帕肽hPTH(1-34)的分子量测定
以实验例4中由L6KD自聚集肽得到的特立帕肽hPTH(1-34)样品为例，进行分子量测定。取特立帕肽hPTH(1-34)样品将缓冲液换成流动相，配制成2mg/mL的特立帕肽hPTH(1-34)样品，采用HPLC-MS进行分子量分析。仪器：Agilent 1260HPLC连接Waters SYNAPT G2-S飞行时间质谱系统；色谱柱：Acquity UPLC BEH C18 column(2.1mm×100mm，1.7μmparticle size，
Figure BDA0003142463730000161
Waters，USA)；流动相：A液为0.1％(v/v)甲酸的水溶液，B液为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，采用的梯度如表9；进样量为10μL，流速为0.4mL/min，温度为60℃。HPLC-MS的结果分析图见图8a和图8b。
表10流动相梯度变化设定参数
时间(min) A液比例(％(v/v)) B液比例(％(v/v))
0 75 25
50 30 70
55 15 85
65 15 85
从图8a和图8b可看到所得到的分子量为4,117.2道尔顿，与理论的的分子量4,117.5道尔顿相一致，证明所得到的hPTH(1-34)序列正确。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种特立帕肽hPTH(1-34)的生产和纯化方法
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Lys Asp
1 5
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgctgctgc tgctgctgaa agat 24
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Leu Glu Thr Leu Ala Lys Ala Leu Glu Thr Leu Ala Lys Ala Leu Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ala Lys Ala
20
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctggaaaccc tcgcgaaggc tctggagacc ctggcgaaag cgctcgaaac gctcgctaaa 60
gcg 63
<210> 5
<211> 168
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
<400> 5
Ala Leu Ala Glu Gly Thr Arg Ile Phe Asp Pro Val Thr Gly Thr Thr
1 5 10 15
His Arg Ile Glu Asp Val Val Asp Gly Arg Lys Pro Ile His Val Val
20 25 30
Ala Ala Ala Lys Asp Gly Thr Leu His Ala Arg Pro Val Val Ser Trp
35 40 45
Phe Asp Gln Gly Thr Arg Asp Val Ile Gly Leu Arg Ile Ala Gly Gly
50 55 60
Ala Ile Leu Trp Ala Thr Pro Asp His Lys Val Leu Thr Glu Tyr Gly
65 70 75 80
Trp Arg Ala Ala Gly Glu Leu Arg Lys Gly Asp Arg Val Ala Gln Pro
85 90 95
Arg Arg Phe Asp Gly Phe Gly Asp Ser Ala Pro Ile Pro Ala Arg Val
100 105 110
Gln Ala Leu Ala Asp Ala Leu Asp Asp Lys Phe Leu His Asp Met Leu
115 120 125
Ala Glu Glu Leu Arg Tyr Ser Val Ile Arg Glu Val Leu Pro Thr Arg
130 135 140
Arg Ala Arg Thr Phe Gly Leu Glu Val Glu Glu Leu His Thr Leu Val
145 150 155 160
Ala Glu Gly Val Val Val His Asn
165
<210> 6
<211> 504
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
<400> 6
gcgctggctg aaggcacgcg catttttgat ccggtcacgg gcacgacgca ccgcattgaa 60
gatgttgttg atggccgcaa gccgattcat gtggttgcgg ccgcaaaaga tggcaccctg 120
cacgcccgtc cggtcgtgag ttggtttgat cagggtacgc gtgacgtcat tggtctgcgt 180
atcgcgggcg gtgcaattct gtgggcaacc ccggatcata aagtgctgac ggaatatggc 240
tggcgtgctg cgggtgaact gcgtaagggt gaccgtgttg cacagccgcg tcgctttgat 300
ggcttcggtg acagcgcacc gattccggct cgcgttcaag ccctggcaga tgctctggat 360
gacaagttcc tgcacgacat gctggcggaa gaactgcgtt actctgttat ccgcgaagtc 420
ctgccgaccc gtcgcgcccg cacgtttggt ctggaagtgg aagaactgca taccctggtt 480
gcggaaggcg ttgtggttca taac 504
<210> 7
<211> 168
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
<400> 7
Ala Leu Ala Glu Gly Thr Arg Ile Phe Asp Pro Val Thr Gly Thr Thr
1 5 10 15
His Arg Ile Glu Asp Val Val Asp Gly Arg Lys Pro Ile His Val Val
20 25 30
Ala Ala Ala Lys Asp Gly Thr Leu His Ala Arg Pro Val Val Ser Trp
35 40 45
Phe Asp Gln Gly Thr Arg Asp Val Ile Gly Leu Arg Ile Ala Gly Gly
50 55 60
Ala Ile Leu Trp Ala Thr Pro Asp Tyr Lys Val Leu Thr Glu Tyr Gly
65 70 75 80
Trp Arg Ala Ala Gly Glu Leu Arg Lys Gly Asp Arg Val Ala Gln Pro
85 90 95
Arg Arg Phe Asp Gly Phe Gly Asp Ser Ala Pro Ile Pro Ala Arg Val
100 105 110
Gln Ala Leu Ala Asp Ala Leu Asp Asp Lys Phe Leu His Asp Met Leu
115 120 125
Ala Glu Glu Leu Arg Tyr Ser Val Ile Arg Glu Val Leu Pro Thr Arg
130 135 140
Arg Ala Arg Thr Phe Gly Leu Glu Val Glu Glu Leu His Val Leu Val
145 150 155 160
Ala Glu Gly Val Val Val His Asn
165
<210> 8
<211> 504
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
<400> 8
gcgctggctg aaggcacgcg catttttgat ccggtcacgg gcacgacgca ccgcattgaa 60
gatgttgttg atggccgcaa gccgattcat gtggttgcgg ccgcaaaaga tggcaccctg 120
cacgcccgtc cggtcgtgag ttggtttgat cagggtacgc gtgacgtcat tggtctgcgt 180
atcgcgggcg gtgcaattct gtgggcaacc ccggattata aagtgctgac ggaatatggc 240
tggcgtgctg cgggtgaact gcgtaagggt gaccgtgttg cacagccgcg tcgctttgat 300
ggcttcggtg acagcgcacc gattccggct cgcgttcaag ccctggcaga tgctctggat 360
gacaagttcc tgcacgacat gctggcggaa gaactgcgtt actctgttat ccgcgaagtc 420
ctgccgaccc gtcgcgcccg cacgtttggt ctggaagtgg aagaactgca tgttctggtt 480
gcggaaggcg ttgtggttca taac 504
<210> 9
<211> 168
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
<400> 9
Ala Leu Ala Glu Gly Thr Arg Ile Phe Asp Pro Val Thr Gly Thr Thr
1 5 10 15
His Arg Ile Glu Asp Val Val Asp Gly Arg Lys Pro Ile His Val Val
20 25 30
Ala Ala Ala Lys Asp Gly Thr Leu His Ala Arg Pro Val Val Ser Trp
35 40 45
Phe Asp Gln Gly Thr Arg Asp Val Ile Gly Leu Arg Ile Ala Gly Gly
50 55 60
Ala Ile Leu Trp Ala Thr Pro Asp Val Lys Val Leu Thr Glu Tyr Gly
65 70 75 80
Trp Arg Ala Ala Gly Glu Leu Arg Lys Gly Asp Arg Val Ala Gln Pro
85 90 95
Arg Arg Phe Asp Gly Phe Gly Asp Ser Ala Pro Ile Pro Ala Arg Val
100 105 110
Gln Ala Leu Ala Asp Ala Leu Asp Asp Lys Phe Leu His Asp Met Leu
115 120 125
Ala Glu Glu Leu Arg Tyr Ser Val Ile Arg Glu Val Leu Pro Thr Arg
130 135 140
Arg Ala Arg Thr Phe Gly Leu Glu Val Glu Glu Leu His Ser Leu Val
145 150 155 160
Ala Glu Gly Val Val Val His Asn
165
<210> 10
<211> 504
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
<400> 10
gcgctggctg aaggcacgcg catttttgat ccggtcacgg gcacgacgca ccgcattgaa 60
gatgttgttg atggccgcaa gccgattcat gtggttgcgg ccgcaaaaga tggcaccctg 120
cacgcccgtc cggtcgtgag ttggtttgat cagggtacgc gtgacgtcat tggtctgcgt 180
atcgcgggcg gtgcaattct gtgggcaacc ccggatgtta aagtgctgac ggaatatggc 240
tggcgtgctg cgggtgaact gcgtaagggt gaccgtgttg cacagccgcg tcgctttgat 300
ggcttcggtg acagcgcacc gattccggct cgcgttcaag ccctggcaga tgctctggat 360
gacaagttcc tgcacgacat gctggcggaa gaactgcgtt actctgttat ccgcgaagtc 420
ctgccgaccc gtcgcgcccg cacgtttggt ctggaagtgg aagaactgca tagtctggtt 480
gcggaaggcg ttgtggttca taac 504
<210> 11
<211> 168
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
<400> 11
Ala Leu Ala Glu Gly Thr Arg Ile Phe Asp Pro Val Thr Gly Thr Thr
1 5 10 15
His Arg Ile Glu Asp Val Val Asp Gly Arg Lys Pro Ile His Val Val
20 25 30
Ala Ala Ala Lys Asp Gly Thr Leu His Ala Arg Pro Val Val Ser Trp
35 40 45
Phe Asp Gln Gly Thr Arg Asp Val Ile Gly Leu Arg Ile Ala Gly Gly
50 55 60
Ala Ile Leu Trp Ala Thr Pro Asp Val Lys Val Leu Thr Glu Tyr Gly
65 70 75 80
Trp Arg Ala Ala Gly Glu Leu Arg Lys Gly Asp Arg Val Ala Gln Pro
85 90 95
Arg Arg Phe Asp Gly Phe Gly Asp Ser Ala Pro Ile Pro Ala Arg Val
100 105 110
Gln Ala Leu Ala Asp Ala Leu Asp Asp Lys Phe Leu His Asp Met Leu
115 120 125
Ala Glu Glu Leu Arg Tyr Ser Val Ile Arg Glu Val Leu Pro Thr Arg
130 135 140
Arg Ala Arg Thr Phe Gly Leu Glu Val Glu Glu Leu His Cys Leu Val
145 150 155 160
Ala Glu Gly Val Val Val His Asn
165
<210> 12
<211> 504
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
<400> 12
gcgctggctg aaggcacgcg catttttgat ccggtcacgg gcacgacgca ccgcattgaa 60
gatgttgttg atggccgcaa gccgattcat gtggttgcgg ccgcaaaaga tggcaccctg 120
cacgcccgtc cggtcgtgag ttggtttgat cagggtacgc gtgacgtcat tggtctgcgt 180
atcgcgggcg gtgcaattct gtgggcaacc ccggatgtta aagtgctgac ggaatatggc 240
tggcgtgctg cgggtgaact gcgtaagggt gaccgtgttg cacagccgcg tcgctttgat 300
ggcttcggtg acagcgcacc gattccggct cgcgttcaag ccctggcaga tgctctggat 360
gacaagttcc tgcacgacat gctggcggaa gaactgcgtt actctgttat ccgcgaagtc 420
ctgccgaccc gtcgcgcccg cacgtttggt ctggaagtgg aagaactgca ttgtctggtt 480
gcggaaggcg ttgtggttca taac 504
<210> 13
<211> 34
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 13
Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn
1 5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His
20 25 30
Asn Phe
<210> 14
<211> 102
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 14
tctgtttctg aaatccagct gatgcacaac ctgggtaaac acctgaactc tatggaacgt 60
gttgaatggc tgcgtaaaaa actgcaggac gttcacaact tc 102
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
1 5 10 15
Pro
<210> 16
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccaaccccgc caaccacccc aacgccaccg acgaccccga cgccgacccc a 51
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tctgtttctg aaatccagct gat 23
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtgtttaccc aggttgtgca tcagctggat ttcagaaaca g 41
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcacaacctg ggtaaacacc tgaactctat ggaacgtgtt g 41
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcagtttttt acgcagccat tcaacacgtt ccatagagtt cag 43
<210> 21
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aatggctgcg taaaaaactg caggacgttc acaacttcta act 43
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctcgagttag aagttgtgaa cgtcct 26
<210> 23
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tgcggaaggc gttgtggttc ataactctgt ttctgaaatc cagctga 47
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gtggtgctcg agttagaagt tgtgaacgtc ctg 33
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gcattccata tgctgctgct gctgctgctg aaaga 35
<210> 26
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atcagctgga tttcagaaac agagttatga accacaacgc cttccgcaa 49
<210> 27
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ggcgttgtgg ttcataactc tgtttctgaa atccagctga tgcacaacct 50
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tcacaacgtt ccagtaaccg ggcat 25
<210> 29
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gaacatgccc ggttactgga acgttg 26
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aaacagagtt atgaaccaca acgccttccg caa 33
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gcaccgcatt gaagatgttg ttgatg 26
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ggcatcagtg accaaacagg aaaaaac 27
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tttcctgttt ggtcactgat gcc 23
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
caacaacatc ttcaatgcgg tgcgtc 26

Claims (10)

1.一种人特立帕肽hPTH(1-34)的生产与纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将聚集肽的基因序列、切割标签的基因序列及人特立帕肽hPTH(1-34)的基因序列依次连接，形成融合蛋白的基因，将所述融合蛋白的基因导入宿主细胞，得到工程菌；
(2)培养步骤(1)所述工程菌表达所述融合蛋白，然后裂解工程菌，离心取沉淀，得到融合蛋白的聚集体；
(3)将步骤(2)所述融合蛋白的聚集体进行切割，得到所述人特立帕肽hPTH(1-34)。
2.根据权利要求1所述的人特立帕肽hPTH(1-34)的高效表达与纯化方法，其特征在于，步骤(1)所述聚集肽包含一个以上的两亲性自组装短肽。
3.根据权利要求2所述的人特立帕肽hPTH(1-34)的高效表达与纯化方法，其特征在于，所述两亲性自组装短肽为类表面活性剂短肽、两亲性α螺旋短肽中的一种以上；所述类表面活性剂短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述两亲性α螺旋短肽的氨基酸序列如SEQID NO:3所示。
4.根据权利要求1所述的人特立帕肽hPTH(1-34)的高效表达与纯化方法，其特征在于，步骤(1)所述切割标签为化学切割位点、酶法切割位点或自切割位点。
5.根据权利要求4所述的人特立帕肽hPTH(1-34)的高效表达与纯化方法，其特征在于，所述切割标签为自切割位点，所述自切割位点为内含肽。
6.根据权利要求5所述的人特立帕肽hPTH(1-34)的高效表达与纯化方法，其特征在于，所述内含肽为MtuΔI-CM，所述MtuΔI-CM的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
7.根据权利要求5所述的人特立帕肽hPTH(1-34)的高效表达与纯化方法，其特征在于，所述内含肽为MtuΔI-CM的突变体，所述MtuΔI-CM的突变体为MtuΔI-CM的m1、m2或m3突变体，所述MtuΔI-CM的m1突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述MtuΔI-CM的m2突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述MtuΔI-CM的m3突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO:11所示。
8.根据权利要求5所述的人特立帕肽hPTH(1-34)的高效表达与纯化方法，其特征在于，当所述自切割位点为内含肽时，步骤(3)中所述切割，包括：将所述融合蛋白的聚集体分散在缓冲液中，进行切割处理，离心取上清液，得到含人特立帕肽hPTH(1-34)的溶液；所述缓冲液的pH值为5.5～6.8，所述切割处理的温度为4～37℃，切割处理的时间为3～48h。
9.根据权利要求1所述的人特立帕肽hPTH(1-34)的高效表达与纯化方法，其特征在于，所述人特立帕肽hPTH(1-34)的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
10.根据权利要求1-9任一项所述的人特立帕肽hPTH(1-34)的高效表达与纯化方法，其特征在于，所述聚集肽的基因序列与切割标签的基因序列之间通过接头连接，所述接头为PT型接头；所述PT型接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
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