CN114736265A - 一种四肽-9的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于生物技术领域，尤其涉及一种四肽‑9的合成方法。本申请的合成方法，包括：构建含有融合蛋白的表达载体质粒；融合蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；融合蛋白含有用于纯化蛋白的亲和层析标签；将表达载体质粒转化至宿主菌中，并使宿主菌诱导表达融合蛋白；将表达融合蛋白的宿主菌依次进行菌体破碎和除杂处理，得到含有融合蛋白的菌液；将菌液于亲和层析柱中进行亲和纯化，然后在亲和层析柱中通入激活内含肽切割的缓冲液以激活融合蛋白的内含肽进行自切割，得到四肽‑9。本申请提供了一种四肽‑9的合成方法，有效解决目前四肽‑9合成困难、产量低和纯化成本高等问题。
Description
技术领域
本申请属于生物技术领域，尤其涉及一种四肽-9的合成方法。
背景技术
全球化妆品市场每年的销售量在迅猛增长，成为日常生活的刚需，也带来了巨大的经济效益。近年来，功能性小分子肽成为合成领域中的明星靶标，在食品、药品、保健品和护肤品等领域表现出重要的功能和应用价值。乙酰基四肽-9，又名美素(Dermican)，其氨基酸序列为乙酰基-谷氨酰胺(Gln，Q)-天冬氨酸(Asp，D)-缬氨酸(Val，V)-组氨酸(His，H)。乙酰基四肽-9可以强化基膜聚糖在胶原纤维之间的连结和强化肌肤抵抗牵引，改善紧实性。具有以下功效：(1)刺激I型胶原蛋白和基膜聚糖合成，改善肌肤的支撑组织；(2)增加皮肤的密实感；(3)增加皮肤的密实感；(4)血管紧张素转换酶抑制剂，通过抑制血管紧张素I转换为血管紧张素II，从而改善血液循环；(5)抗水肿等等。因此，乙酰基四肽-9在化妆品领域具有重要的应用价值。
但是，乙酰基四肽-9的合成一直是合成领域的难题。传统的化学合成法利用逐个氨基酸体外缩合的固相合成方式合成四肽-9，四肽-9的氨基酸序列为QDVH，该化学合成法产量低，且副产物严重，有毒副产物多，使得四肽-9的生产存在难度大、成本高等问题。近年来，液相合成逐渐取代固相合成成为乙酰基四肽-9的主要化学合成方式，这种方式使用Ac-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-OH和H-Val-His(Trt)-OH缩合后脱保护来合成，具有副产物少、毒性小等优点，但成本较高，且污染较大，限制了乙酰基四肽-9的大规模生产和应用。
发明内容
鉴于此，本申请提供了一种四肽-9的合成方法，有效解决目前四肽-9合成困难、产量低和纯化成本高等问题。
本申请提供了一种四肽-9的合成方法，包括：
步骤1、构建含有融合蛋白的表达载体质粒，其中，所述融合蛋白由相互串联的内含肽MtuΔI-CM和四肽-9组成；所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述融合蛋白的末端连接有用于纯化蛋白的亲和层析标签；
步骤2、将所述表达载体质粒转化至宿主菌中，并使所述宿主菌诱导表达所述融合蛋白；
步骤3、将表达所述融合蛋白的宿主菌依次进行菌体破碎和除杂处理，得到含有所述融合蛋白的菌液；
步骤4、将所述菌液于亲和层析柱中进行亲和纯化，然后在所述亲和层析柱中通入激活内含肽切割的缓冲液以激活所述融合蛋白的内含肽MtuΔI-CM进行自切割，得到四肽-9。
具体的，为了保证纯化寡肽的完整性和正确性，所述融合蛋白不能有连接肽等额外的氨基酸残基。
具体的，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中，所述内含肽MtuΔI-CM的氨基酸序列为：
MGSSHHHHHHHHALAEGTRIFDPVTGTTHRIEDVVDGRKPIHVVAAAKDGTLHARPVVSWFDQGTRDVIGLRIAGGAILWATPDVKVLTEYGWRAAGELRKGDRVAQPRRFDGFGDSAPIPARVQALADALDDKFLHDMLAEELRYSVIREVLPTRRARTFGLEVEELHSLVAEGVVVHN。
具体的，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中，所述四肽-9的氨基酸序列为：QDVH。
另一实施例中，步骤1具体包括：将所述融合蛋白构建到原核表达载体中，得到含有融合蛋白的表达载体质粒。
另一实施例中，所述原核表达载体可以为市售任意原核表达载体，包括但不限于pET系列载体、pGEX系列载体、pSUMO系列载体和pBAD系列载体中的一种或多种。
另一实施例中，所述融合蛋白的数量为1个或复数个，所述融合蛋白的数量为2个以上时，两个相邻所述融合蛋白以所述原核表达载体的核糖体结合位点RBS相隔。
另一实施例中，所述融合蛋白的数量为2个、3个或4个。
另一实施例中，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
具体的，所述SEQ ID NO:2的核苷酸序列末端三个核苷酸TAA为终止子。
具体的，具体的，SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中，所述内含肽MtuΔI-CM的核苷酸序列为：
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACCATCACGCTCTGGCTGAGGGTACCCGCATTTTTGACCCGGTCACCGGTACCACCCATCGCATCGAAGATGTGGTTGATGGCAGAAAGCCGATTCATGTTGTGGCGGCCGCCAAAGACGGTACTCTGCATGCTCGTCCGGTTGTGTCCTGGTTTGACCAAGGTACGCGTGATGTCATCGGCCTGCGTATCGCCGGCGGTGCGATTCTGTGGGCGACCCCGGATGTGAAAGTTTTGACCGAATATGGCTGGCGTGCGGCGGGTGAATTACGTAAGGGTGATCGTGTTGCGCAACCGCGTCGTTTTGACGGCTTCGGCGACAGCGCGCCGATCCCGGCACGCGTTCAGGCATTGGCTGATGCACTTGATGACAAATTCCTGCACGACATGCTCGCGGAAGAGCTGCGTTACTCTGTAATTCGTGAGGTGTTGCCAACGCGCCGCGCTAGAACATTCGGTCTGGAGGTGGAAGAGCTGCACAGCCTGGTTGCGGAGGGCGTTGTGGTGCACAAC。
具体的，SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中，所述四肽-9的核苷酸序列为：CAGGATGTGCAT。
另一实施例中，步骤1中，所述亲和层析标签选自GST亲和层析标签、His标签亲和层析标签、MBP亲和层析标签、Halo亲和层析标签、Flag亲和层析标签和CL7亲和层析标签中的一种或多种。
另一实施例中，步骤2中，所述宿主菌选自BL21系列大肠杆菌、Rosetta系列大肠杆菌、OrigamiB系列大肠杆菌、JM109系列大肠杆菌和TOP10系列大肠杆菌中的一种或多种；优选的，所述宿主菌为BL21系列大肠杆菌。
具体的，步骤2具体包括：将所述表达载体质粒转化至宿主菌中，挑取单克隆菌株至培养基中扩大培养，直至培养基的OD600值为0.8，加入Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)和表达诱导剂，37℃继续培养4-6h，然后离心收集细菌沉淀，将细菌沉淀用PBS清洗1～3次。
另一实施例中，步骤3中，所述菌体破碎处理为加热破碎法、裂解液超声破碎法或高压破碎法中的一种或多种；
所述除杂处理包括将破碎后菌体离心后，弃沉淀，将收集得到的上清过滤。
优选的，所述菌体破碎处理为裂解液超声破碎法，裂解液超声破碎法具体包括将菌体重悬在裂解缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，pH 8.0)中，使用压力或超声进行菌体破碎，镜检染色直至没有明显的菌体。
具体的，所述除杂处理具体包括将破碎菌体经过12000rpm，4℃离心20min，收集上清，然后上清经0.45μm滤膜过滤。
另一实施例中，所述激活内含肽切割的缓冲液为pH 5～6.5的磷酸缓冲液、pH 5～6.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液和pH 5～6.5哌嗪-1,4-二乙磺酸中的一种或多种；优选的，所述激活内含肽切割的缓冲液为pH 6的磷酸缓冲液。
具体的，步骤4具体包括：用裂解缓冲液充分平衡亲和层析柱后，将所述菌液通入所述亲和层析柱中，所述菌液的流速为0.1～1ml/min，然后通入裂解缓冲液充分清洗所述亲和层析柱；在所述亲和层析柱中通入激活内含肽切割的缓冲液，混匀后室温放置过夜，收集流通液，为四肽-9。
具体的，所述亲和层析标签为His标签亲和层析标签，采用Ni-NTA亲和层析柱，步骤4具体包括：Ni-NTA亲和层析柱用裂解缓冲液充分平衡后，加入所述菌液，所述菌液的流速为0.5ml/min，再用含20mM咪唑裂解缓冲液充分清洗；接着加入pH 6.0的50mM磷酸缓冲液，混匀后室温放置过夜，收集含有四肽-9的流通液，再用含200mM咪唑裂解缓冲液洗脱内含肽未进行自切割的融合蛋白，该融合蛋白可重新过该亲和层析柱收集四肽-9。
本申请开发了一种基于自切割型内含肽的四肽-9表达和提纯方法，内含肽MtuΔI-CM和四肽-9融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码的DNA序列为SEQ ID NO:2。本申请通过表达载体质粒转化在宿主菌中，通过诱导宿主菌能够表达出大量的内含肽-四肽-9的融合蛋白，占总蛋白的90％以上。经过亲和标签纯化后可获得高纯度的内含肽-四肽-9的融合蛋白。在亲和层析柱上进行内含肽切割后，收集含有四肽-9的流通液，该流通液的四肽-9的含量可达每升菌液13mg产量，纯度在93％以上。本申请实施例结果表明本申请能够快速高效得表达和提纯四肽-9，四肽-9作为生产乙酰基四肽-9的前体，可显著降低乙酰基四肽-9的生产成本，可应用于乙酰基四肽-9的工业化生产，在化妆品领域具有广泛的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本申请实施例提供了一种四肽-9的合成方法的流程示意图，其中，内含肽为MtuΔI-CM，目标蛋白为四肽-9；
图2为本申请实施例提供的构建含有融合蛋白的表达载体质粒的结构示意图；
图3为本申请实施例提供的步骤3)得到的融合蛋白的菌液裂解缓冲液的胶图；
图4为本申请实施例提供的步骤5)得到的融合蛋白的菌液裂解缓冲液的蛋白纯化图；
图5为本申请实施例提供的HPLC检测流通液的四肽-9的结果图，其中，横坐标为时间(min)，纵坐标为电信号(mAU)。
具体实施方式
本申请提供了一种四肽-9的合成方法，用于解决现有技术中四肽-9合成困难、产量低和纯化成本高的技术缺陷。
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
其中，以下实施例所用原料或试剂均为市售或自制。
实施例1
本申请实施例提供了四肽-9的合成方法，本申请合成原理见图1，融合蛋白为相互串联连接的内含肽MtuΔI-CM与四肽-9，融合蛋白的末端连接有亲和标签，通过基因工程的方法在宿主菌中表达融合蛋白，菌体破碎除杂后得含有融合蛋白的菌液；菌液通过亲和层析柱纯化和洗杂(为现有常规洗涤杂质方法)后，亲和层析柱上附着有融合蛋白，在亲和层析柱中通入激活内含肽切割的缓冲液以激活融合蛋白的内含肽MtuΔI-CM进行自切割，得到的流通液含有大量的四肽-9，内含肽MtuΔI-CM仍附着在亲和层析柱上，合成方法具体包括：
1)融合蛋白表达载体的构建：按照图2所示，本申请实施例采用原核表达载体pET系列空白载体，在pET-28a空白载体的外源基因插入位点插入两个融合蛋白，融合蛋白为相互串联连接的内含肽(ICMm intein)与四肽-9(4肽-9)，两个融合蛋白之间由pET-28a表达载体的核糖体结合位点RBS相隔，融合蛋白的末端连接有亲和标签6×His；将两个内含肽MtuΔI-CM与四肽-9的融合蛋白编码的DNA序列为SEQ ID NO:2构建到pET-28a载体中，成功构建的融合蛋白表达载体标记为pET-28a-6his-ICM-4p9。
2)诱导表达：将构建好的表达载体质粒pET-28a-6his-ICM-4p9转化到BL21(DE3)表达菌株中，挑取单克隆菌株至LB培养基中扩大培养中OD600值为0.8，加入1/20体积1MTris-HCl缓冲液(pH 8.5)和终浓度为1mM的IPTG，37℃200rpm继续培养5h。10000rpm，4℃离心20min，收集菌体。菌体用PBS清洗2次，得到菌体。
3)菌体破碎：将上述菌体重悬在裂解缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，pH 8.0)中，使用常规超声手段进行菌体破碎，镜检染色直至没有明显的菌体。然后将破碎菌体经12000rpm，4℃离心20min，收集上清，该上清经过0.45μm滤膜过滤，得到含有融合蛋白的菌液裂解缓冲液。
验证该步骤中含有融合蛋白的菌液裂解缓冲液是否成功诱导表达，结果如图3，IPTG诱导能够表达出大量的内含肽MtuΔI-CM与四肽-9融合蛋白，占总蛋白的90％以上。
4)亲和层析：Ni-NTA亲和层析柱用裂解缓冲液充分平衡后，加入过滤后的菌液裂解缓冲液通过该Ni-NTA亲和层析柱，菌液裂解缓冲液流速为0.5ml/min，再用含20mM咪唑裂解缓冲液充分清洗亲和层析柱。
5)内含肽切割：在亲和层析柱中加入pH 6.0的50mM磷酸缓冲液，混匀后室温放置过夜，收集流通液，流通液含有高浓度四肽-9。再用含200mM咪唑裂解缓冲液洗脱亲和层析柱的内含肽未自切割的融合蛋白。
验证该步骤中含有融合蛋白的菌液裂解缓冲液是否成功纯化，结果如图4所示，图4为内含肽-四肽-9融合蛋白纯化图，左第一列Lane 1为蛋白分子量Marker；左第二列Lane2为IPTG诱导后的菌体破碎上清；左第三列Lane 3为柱清洗液；左第四列Lane 4为20mM咪唑洗脱液；左第五列Lane 5为50mM咪唑洗脱液；左第六列Lane 6为200mM咪唑洗脱液。
图4可知，经过亲和标签纯化后可获得高纯度的内含肽-四肽-9融合蛋白。对本申请实施例的流通液进行HPLC检测，结果如图5所示。在柱上进行内含肽切割后，流通液中四肽-9的含量可达每升菌液13mg产量，纯度在93％以上。这些结果表明本发明能够快速高效得表达和提纯四肽-9，四肽-9是乙酰基四肽-9的合成前体，有效提高乙酰基四肽-9的工业化生产和应用价值。
本发明利用内含肽-四肽-9融合蛋白技术来高效合成和提纯四肽-9，任何内含肽相关的四肽-9合成和提纯方法应均属于本发明的保护范畴之内。
以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
序列表
<110> 广州市乾相生物科技有限公司
<120> 一种四肽-9的合成方法
<130> MP22006882
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Ser Ser His His His His His His His His Ala Leu Ala Glu
1 5 10 15
Gly Thr Arg Ile Phe Asp Pro Val Thr Gly Thr Thr His Arg Ile Glu
20 25 30
Asp Val Val Asp Gly Arg Lys Pro Ile His Val Val Ala Ala Ala Lys
35 40 45
Asp Gly Thr Leu His Ala Arg Pro Val Val Ser Trp Phe Asp Gln Gly
50 55 60
Thr Arg Asp Val Ile Gly Leu Arg Ile Ala Gly Gly Ala Ile Leu Trp
65 70 75 80
Ala Thr Pro Asp Val Lys Val Leu Thr Glu Tyr Gly Trp Arg Ala Ala
85 90 95
Gly Glu Leu Arg Lys Gly Asp Arg Val Ala Gln Pro Arg Arg Phe Asp
100 105 110
Gly Phe Gly Asp Ser Ala Pro Ile Pro Ala Arg Val Gln Ala Leu Ala
115 120 125
Asp Ala Leu Asp Asp Lys Phe Leu His Asp Met Leu Ala Glu Glu Leu
130 135 140
Arg Tyr Ser Val Ile Arg Glu Val Leu Pro Thr Arg Arg Ala Arg Thr
145 150 155 160
Phe Gly Leu Glu Val Glu Glu Leu His Ser Leu Val Ala Glu Gly Val
165 170 175
Val Val His Asn Gln Asp Val His
180
<210> 2
<211> 555
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac catcacgctc tggctgaggg tacccgcatt 60
tttgacccgg tcaccggtac cacccatcgc atcgaagatg tggttgatgg cagaaagccg 120
attcatgttg tggcggccgc caaagacggt actctgcatg ctcgtccggt tgtgtcctgg 180
tttgaccaag gtacgcgtga tgtcatcggc ctgcgtatcg ccggcggtgc gattctgtgg 240
gcgaccccgg atgtgaaagt tttgaccgaa tatggctggc gtgcggcggg tgaattacgt 300
aagggtgatc gtgttgcgca accgcgtcgt tttgacggct tcggcgacag cgcgccgatc 360
ccggcacgcg ttcaggcatt ggctgatgca cttgatgaca aattcctgca cgacatgctc 420
gcggaagagc tgcgttactc tgtaattcgt gaggtgttgc caacgcgccg cgctagaaca 480
ttcggtctgg aggtggaaga gctgcacagc ctggttgcgg agggcgttgt ggtgcacaac 540
caggatgtgc attaa 555
Claims (10)
1.一种四肽-9的合成方法，其特征在于，包括：
步骤1、构建含有融合蛋白的表达载体质粒，其中，所述融合蛋白由相互串联的内含肽MtuΔI-CM和四肽-9组成；所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述融合蛋白的末端连接有用于纯化蛋白的亲和层析标签；
步骤2、将所述表达载体质粒转化至宿主菌中，并使所述宿主菌诱导表达所述融合蛋白；
步骤3、将表达所述融合蛋白的宿主菌依次进行菌体破碎和除杂处理，得到含有所述融合蛋白的菌液；
步骤4、将所述菌液于亲和层析柱中进行亲和纯化，然后在所述亲和层析柱中通入激活内含肽切割的缓冲液以激活所述融合蛋白的内含肽MtuΔI-CM进行自切割，得到四肽-9。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤1具体包括：将所述融合蛋白构建到原核表达载体中，得到含有融合蛋白的表达载体质粒。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述原核表达载体选自pET系列载体、pGEX系列载体、pSUMO系列载体和pBAD系列载体中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述融合蛋白的数量为复数个，两个相邻所述融合蛋白以所述原核表达载体的核糖体结合位点RBS相隔。
5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述融合蛋白的数量为2个、3个或4个。
6.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤1中，所述亲和层析标签选自GST亲和层析标签、His标签亲和层析标签、MBP亲和层析标签、Halo亲和层析标签、Flag亲和层析标签和CL7亲和层析标签中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤2中，所述宿主菌选自BL21系列大肠杆菌、Rosetta系列大肠杆菌、OrigamiB系列大肠杆菌、JM109系列大肠杆菌和TOP10系列大肠杆菌中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤3中，所述菌体破碎处理为加热破碎法、裂解液超声破碎法或高压破碎法中的一种或多种；
所述除杂处理包括将破碎后菌体离心后，弃沉淀，将收集得到的上清过滤。
10.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述激活内含肽切割的缓冲液为pH5～6.5的磷酸缓冲液、pH 5～6.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液和pH 5～6.5哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液的中的一种或多种。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115261398A (zh) * | 2022-08-02 | 2022-11-01 | 态创生物科技(广州)有限公司 | 基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法 |
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| US20110059892A1 (en) * | 2004-06-14 | 2011-03-10 | Philippe Moussou | Cosmetic preparations containing PTH fragments |
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- 2022-04-20 CN CN202210415908.3A patent/CN114736265A/zh active Pending
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