JPH01502638A - グラム陽性及びグラム陰性菌に対する活性を有するポリペプチド類 - Google Patents
グラム陽性及びグラム陰性菌に対する活性を有するポリペプチド類Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
グラム陽性及びグラム陰性菌に対する活性を有するポリペプチド類
本出願は1985年11月13日付で出願された米国特許11797.472号
と関連しており、これは参考のため本明細書に組込まれる。
発明の分野
本発明はポリペプチド類に関し、更に詳しくは様々なC末端修飾をうけたセクロ
ピン様ポリペプチド類に関する。これらの修飾セクロピン様ポリペプチド類は、
セクロビン類よりも高い能力及び広い抗菌活性スペクトルを示す。本発明は、こ
れらの修飾セクロピン類の産生方法及びそれらの投与によるグラム陰性もしくは
グラム陽性菌の増殖抑制方法にも関する。
背景技術の簡単な説明
セクロビア(Ceeropla)が及び数種の鱗翅昆虫の免疫系は、最近発見さ
れた抗菌性ペプチド群たるセクロピン類と主に関係がある効果的な体液性応答性
によって特徴付けられる〔ボーマン、エッチ・ジー及びスタイナー。
エッチ、カレント・トピックス・イン・ミクロバイオロジ・アンド・イムノロジ
ー、第94/95巻、第75−91頁、1981年(BOIarl、 H,G、
and 5telner、 H,。
Current Topics 1n Microbiology and I
amunology、94/95: 75−91 (1981)) )。3種の
主なセクロピンA、B及びDは免疫血リンパから精製され、それらの配列が解明
された〔キューら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、第
127巻、第219−224頁。
1982年(Qu、 et al、、 European Journal o
r Blo−chemlstry、127:219−224(19g2) )
;ハルトマーク(Hultmark)ら、前掲、第127巻、第207−217
頁、1982年;並びに、/1ルトマークら、米国特許第4.355,104号
及び第4.520,016号明細書〕。すべてのセクロピン類は、高度の相互的
配列相同性をもつ小さな塩基性ペプチド類である。アンセラニア拳ペルニイ(A
ntheraea pernyl、 A、p、)及びヒロホラ・セクロピア(H
,C,)由来セクロピンA%B及びDのアミノ酸配列は以下のとおりである:
天然セクロピン類は、グラム陰性及びグラム陽性菌双方を含む様々な細菌に対し
て抗菌活性を有している。セクロピンの作用様式に関して利用可能なデータは、
それらが細菌の細胞質膜を破壊することを示している〔スタイナーら、ネーチ+
−(Nature)、第292巻、第246−248頁、1981年〕。異な
る細菌種はセクロピン類に対して異なる感受性を有しており、しかも各セクロピ
ンは異なる活性スペクトルを有していることは、文献から明らかである。例えば
、バチルスΦメガテリウム(Bacillus segaterlus )はセ
クロピンA及びBに対して非常に感受的であるが、セクロビンDに対しては比較
的耐性である。グラム陰性及びグラム陽性生物双方は、ミクロモル濃度範囲でセ
クロビン順に対し感受的であることが示された。セクロビン類に対して高度の感
受性を示す生物としては、大腸菌(Eseherlchla coll) 、シ
ュードモナス・アエルギノサ(Pseudosonas aeruglnO8a
)、バチルスψメガテリウム及びサルモネラ・チフイムリウム(Solmone
lla typhIsurlui+)があるOセクロビンA及びBは最初の32
残基中に8個のアミノ酸置換を有しかつ独特なC末端配列を有しているが、9種
の異なる細菌種に対するそれらの活性は非常に類似している。このことは、多数
のアミノ酸置換がペプチドの生物学的活性を変化させずに許容されうることを示
唆している。同様に、中国オークシルクガ(Chlnese oaksllk
moth ) (A、ベルニイ)由来セクロピンBは、4箇所で、北米シルクガ
(H,セクロピン)由来セクロピンBと異なるが、しかしながら3つの変化はH
,セクロビアA型中に存在する対応アミノ酸からの置換えである。
四番目の変化は、H,セクロピアA及びB型が異なる箇所に存在しており、保存
的な変化である。
すべての天然セクロビン類におけるカルボキシル末端はブロックされており、セ
クロピンAの場合における遮断基には一級アミドである〔アンドリューら、プロ
シーディングψオプ・ナショナルψアカデミ−・オブ・サイエンス(USA)、
第80巻、第6475−6479頁。
1983年(Andreu、 et al、、 Proceedlng or
NatlonalAcademy or 5c1ence (USA)、 80
: 8475−6479 (1980)) )。
セクロビンA及び数種の関連ペプチド類は最近固相法により合成されており、C
末端がアミド化された場合には化学的、物理的特徴及び生物学的活性に関して天
然セクロビンAと全体的に差異のないことが示された(アントリニーら、前掲)
。我々は、カルボキシ末端の修飾が大半のグラム陽性及び一部のグラム陰性菌に
対するミクロモル濃度範囲内での殺菌活性にとって必要であることを観察した。
タンパク質のカルボキシ末端における共有結合修飾は、メチオニル残基における
臭化シアンでの開裂によって定量的に成し遂げられる。この化学的開裂によりC
末端ホモセリンラクトンが形成されるが、これは様々な化学剤で修飾可能である
〔ホーン、アナライティカル・バイオケミストリー、第69巻、第583−58
9頁。
1975年(Horn、 Analytical Biocheslstry、
69: 583−589(1975)) ;ケンプら、ジーン、第39巻、第
239−245頁、1985年(Kempe et al、、 Gene、 3
9:2t9−245 (1985) ) ;ケンプら、バイオテクノロジー(B
io−technology) 、第4巻、第565−568頁、1986年〕
。
セクロビン類及びその類縁体の多大な有用性と、組換えDNA法がタンパク質産
生に関して与えられる多大な有望性とを考慮すれば、このような技術によりセク
ロピン様ポリペプチド類産生用の系を提供することが望ましかった。しかも、天
然セクロビン類の場合のようにグラム陰性及びグラム陽性菌双方に対して殺菌活
性を有する組換えセクロビン様ポリペプチド類を産生ずることが望ましいからで
あろう。
発明の要旨
本発明は、様々なC末端修飾をうけたセクロピン様ポリペプチド類に関する。末
端カルボキシ基からホモセリン伸長化された中性、負イオン化又は陽イオン化修
飾型への変換によって、グラム陰性及びグラム陰性菌双方に対して有意の殺菌作
用を有する本発明のポリペプチド類が得られる。セクロチンA様ポリペプチド類
の産生は、大腸菌中において融合タンパク質としてのセクロビンA様ポリペプチ
ドの発現により達成される。その結果、細菌的封入体中に物質が封入されるが、
これは宿主に対して無毒性である。
本発明は、C末端においてMet−X(Xはメチオニンから開裂可能な基である
)で伸長化されたセクロピン様ポリペプチドにも関する。
本発明は、C末端においてMet−X(Xはメチオニンから開裂可能な基である
)により伸長化されたセクロピン様ポリペプチドについてコードする遺伝子配列
を含むDNA分子にも関する。
セクロピンAプラスミドは、Met−X(Xはアミノ酸又はペプチド残基である
)の付加C末端残基を有しかつセクロピンのN末端アミノ酸のN末端側において
メチオニンを有する伸長化されたセクロピンA様ポリペプチド類についてコード
するように作成された。セクロピン人様ポリペプチドは臭化シアン消化により切
除され、C末端ホモセリンのあるセクロピンAを生じる。これは化学的に修飾さ
れて、天然セクロピンAよりも広範囲の殺菌活性をもつポリペプチドを生じる。
しかも、カルボキシ末端は特定の細菌種を標的とする様々な試薬(例えば、グラ
ム陰性の場合CA−HS −C0OH及び広範囲活性の場合CA−HS−NH−
Et−NH2)によって修飾することができる。
上記様々な天然セクロビン類の中では、セクロビンAが最も好ましい。下記配列
のセクロビンAが、本発明のセクロビン様ポリペプチド類を産生ずるために使用
された:
142N −Lys −Trp −Lys −Lau −Phe −Lys −
Lys −X1a −Glu −Lys −Val −Gly −Gin −人
sn −Xis −人rg −人@p −cxy −工1a −X1m −Ly
s −人1a −Gly −Pro −λla −Val −λ1a30 コ5
’Va1− Van −Gly −Gin −人1a −Thr −Gin −
!l@ −人1a −Lys −Co−R1゜
本発明はC末端においてホモセリン残基により伸長化されたセクロビン様ポリペ
プチドの産生方法に関し、その方法においては:
本発明の発現ビヒクルで適切な宿主を形質転換し;該宿主を培養し:
C末端にMet−Xを有する上記セクロピン様ポリペプチドを回収し;更に
上記Met−Xを開裂し、もってC末端ホモセリンを産生ずる。
本発明ハ、天然Co−R末端がR5−COR1(Isはホモセリン残基を表わし
、C0R1はC00H1CONH2、低級アルキル(C1−C6)アミド、低級
アルキルエステル又はC2−C4アルキレンジアミンのアミドを表わす)で置換
えられた修飾セクロビン様ポリペプチド類にも関する。C0R1はホモセリン残
基のヒドロキシ基と共に形成されたラクトンも表わす。
本発明は、有効量のセクロビン様ポリペプチド類又はその薬学上許容される塩と
薬学的に不活性な担体とを含有した、グラム陰性及びグラム陽性菌双方に対して
抗菌活性を有する医薬組成物にも関する。
更に本発明は、細菌に感染した組成物又は患者に有効量の本発明の医薬組成物を
投与することを特徴とする、グラム陰性又はグラム陰性菌の増殖抑制方法に関す
る。
本発明における従来技術以上に有意な進歩は、遺伝子工学技術により可能となっ
たセクロピン人様ポリペプチド類の大規模産生である。本発明の方法を用い1回
の10リットル発酵で得られる場合と同量の物質の産生のためには、従来技術で
開示された方法を用いた場合、2千倍以上のセクロピアサナギの使用を要し、し
かもその各々の場合で大量処理を要する。
もう1つの進歩は、様々なC末端付加物の大規模産生に適するようにC末端修飾
方法を適合化させたことである。他の進歩は、天然セクロピン類と比較して高い
殺菌活性を示すカルボキシル末端修飾セクロピン類の産生である。
図面の簡単な説明
第1図はプラスミドR2Sの作成経路図について示している。
第2図はプラスミドpCAMGの作成経路図について示している。
第3図はC末端修飾をうけた遺伝子工学処理セクロピンの産生経路図について示
している。
第4図は様々な型のセクロピン様ポリペプチド類のポリアクリルアミドゲル電気
泳動について示している。
好ましい態様の説明
明細書及び請求の範囲において用いられているセクロピン及びセクロピン様とい
う語は、いずれかの昆虫種から単離されたセクロピン類と同−又は類似し、活性
を測定するために当業界で許容されるインビボ又はインビトロ系において殺菌活
性を有するポリペプチド類を含んだ意味である。
これらの語は、本発明において、適切な系で殺菌活性を示す天然セクロピンのい
ずれかの類似体、相同体、変異体、異性体又は誘導体を含めても使用される。セ
クロピン様ポリペプチドがある天然セクロピンと相同的であると言われる場合に
は、ポリペプチドは天然セクロピンに対して少なくとも85%、好ましくは少な
くとも90%の相同性を有している。
この語は、天然セクロピン類又はそれれらの類似体の部分的断片のように、天然
数量下のアミノ酸を有する断片を含めた意味でもある。更にこの語は、1個以上
の側鎖アミノ酸と共に天然セクロビン又はその類似体の配列を有し、セクロビン
様殺菌活性を示すいずれの生成物も含めた意味も有する。これらの語は、天然セ
クロピン類の場合以下のアミノ酸数を有するが但しなおも殺菌活性を有している
ポリペプチド類を含めた意味でもある。
しかも、これらの語はMet−X(Xはアミノ酸、アミノ酸類似体又は場合によ
りアミノ酸類似体を含んでいてもよいペプチドである)を含む付加C末端残基で
伸長化されたセクロピンA様ポリペプチド類を含めた意味も本発明の中間生成物
は、付加Met−X残基をもつ修飾セクロピン類である。Xは臭化シアンでメチ
オニンから開裂される基であって、ホモセリン伸長化セクロビン様ポリペプチド
類を生成する。Xは、アミノ酸、アミノ酸の類似体、ペプチド又はアミノ酸類似
体を含むペプチドである。上記アミノ酸はいずれの天然アミノ酸〔レニンガー、
ニー・エル、バイオケミストリー、ワース・パブリッシャーズ社、1970年、
第67頁(Lehnlnger。
A、L、、 Biocheslstry、 Worth Publlshers
、 Inc、 (1970)。
p、87)参照〕又はその類似体であってもよい。これらの伸長セクロビン様ポ
リペプチド類は臭化シアンで消化され、ホモセリン伸長化セクロビン様ポリペプ
チド類を生成する。次いで、C末端においてホモセリン残基で伸長化されたこれ
らのセクロピン様ポリペプチド類は修飾され、中性、負イオン化又は正イオン化
C末端を生じる。
最も好ましい態様の場合、ホモセリン残基はC末端においてホモセリン誘導体に
変換される。中性誘導体としては、ホモセリンラクトン及びホモセリンアミドが
ある。
正イオン化ホモセリン誘導体とは、薬学上許容される酸との処理で得られるC
2− C4アルキレンジアミンのホモセリンアミドの塩である。負イオン化ホモ
セリン誘導体とは、薬学上許容される塩基との処理で得られるホモセリン残基カ
ルボキシル基の塩である。“薬学上許容される塩1という語は、格別制限されな
いが、水酸化アルカリ土類金属、水酸化アンモニウム及び水酸化アルキルアンモ
ニウムのような塩基又は硫酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、酢酸等のような酸を
含めた薬学上許容される酸又は塩基の塩を意味する。
ホモセリンラクトンは、濃トリフルオロ酢酸中でホモセリンからラクトン型への
環化によって容易に形成することができる。ホモセリンアミドの形成は、水酸化
アンモニウムによるラクトン体の処理で行われる。アルキレンジアミンの好まし
いホモセリンアミド型は、エチレンジアミンのホモセリンアミドである。エチレ
ンジアミン型は、ジメチルスルホキシド中エチレンジアミンの添加によってホモ
セリンラクトンから得られる。
好ましいセクロビン様ポリペプチドは、セクロピンAの配列から得られる。B又
はDのような他のセクロピン配列も使用可能である。1種のセクロビンの一部分
を他の異なるセクロビンの一部分と合わせて得られる合体配列も使用可能である
。
2、セクロピン様ポリペプチドの微生物産生本発明は、セクロピン感受性又は耐
性宿主を用いた、C末端において付加アミノ酸残基で伸長化されたセクロビン類
の微生物による産生方法を提供する。本発明の一態様は、殺菌活性を欠いた基M
et−Xをもつ伸長化セクロビン様ポリペプチドについてコードする遺伝子配列
を発現させることである。次いで、基Xの付加アミノ酸又はアミノ酸類は開裂せ
しめられて、殺菌活性のあるタンパク質を生成する。
もう1つの態様では、セクロピン様ポリペプチドについてコードする遺伝子配列
は誘導プロモーターに結合せしめられ、得られた遺伝子構造体は発現ビヒクル中
に組込まれる。次いで、発現ビヒクルは適切な宿主を形質転換するために用いら
れ、該宿主はプロモーターが不活性である正常条件下で発酵に付される。適切な
時間経過後、例えば細胞が定常相に達した時点で、プロモーターが塩濃度、光、
代謝産物、金属等の存否のような外部環境因子を変えることにより誘導されるが
、この変化によりセクロビン遺伝子配列からmRNAへの転写としかる後それか
ら伸長化セクロピンへの翻訳とが行われる。したがって、たとえ得られたセクロ
ビンが殺菌性であって、細菌宿主を破壊するような場合であっても、このような
破壊は発酵サイクルの終期に至るまで生じない。調節されるプロモーターの例と
しては、ラムダPL及びP R−1aCs gal、trp、ara、hut等
がある。
好ましい態様の場合、セクロビン様ポリペプチドについてコードする遺伝子配列
は上記セクロピン様ポリペプチド以外のポリペプチドについてコードする遺伝子
配列と作動可能に結合せしめられ、その結果発現が生じると、セクロビン様ポリ
ペプチド、付加残基及び付加ポリペプチドすべてのアミノ酸配列を有しかつ所望
のセクロピン様ポリペプチドアミノ酸配列の隣りに選択的開裂部位を有する融合
又は前駆体タンパク質が得られる。得られた融合タンパク質は殺菌性ではない。
次いで、殺菌活性セクロピン様ポリペプチドは、選択的開裂後に単離される。
最も一般的には、開裂は例えば微生物培養物回収後のように発現ビヒクルの複製
環境外で行われることになる。
したがって、付加ポリペプチドは細胞外開裂時までセクロビン様ポリペプチドか
らその殺菌効果を奪っているため、高レベルの所望生成物を産生ずるのに必要な
十分に長い時間にわたり宿主を生存させることができる。セクロピン様ポリペプ
チドは不要ポリペプチドを除くために用いられる選択的開裂部位に相当する内部
開裂部位を欠いていることが好ましいが、但しこれは必須の絶対条件ではない。
セクロビン類はメチオニンを含まないため、セクロピン配列に隣接するメチオニ
ンでの臭化シアン開裂が有効である。臭化シアン使用の場合は、不要な隣接ポリ
ペプチドを開裂するのみではな(、Met−X残基をカルボキシ末端ホモセリン
に変換することもできる。
基Xを含む不要な(余分な)隣接ポリペプチドの性質は重要でない。これは公知
構造の酵素、ホルモン又は他の生理学的関連タンパク質の部分、全部又は反復単
位のいずれかである。一方、これは非機能的ポリペプチドであってもよい。いず
れか特定の理論に拘束されるわけではないが、本発明者らは融合タンパク質の鎖
長増がポリペプチド全体の構造変換に基づきセクロピンの殺菌性を多少“マスク
1していると推測している。好ましくは、余分な隣接ポリペプチドについてコー
ドする遺伝子配列は、鎖長が少なくとも約30.0塩基対以上、好ましくは約4
oobp〜5Kbp、最も好ましくは4oobp〜2Kbpであるべきである。
これは、好ましくはアミノ酸残基的100〜1700の不要ポリペプチドに相当
する。
多数の余分なポリペプチド類のいずれも所望のセクロピン様ポリペプチド配列に
融合させることができる。ポリペプチド遺伝子配列は、有機合成により製造され
るか(この場合には、最適の操作法が推奨される)、又は適切なmRNAの逆転
写のような方法によって作成される。
次いで、ポリペプチド遺伝子配列と構造セクロビンベブチドの遺伝子配列との酵
素的カップリングにより、cDNAが作成される。酵素的カップリングは、プラ
ント結合によるか、又は制限エンドヌクレアーゼ認識部位の2本鎖のうちの1本
である付着性末端の付加による。
余分なポリペプチドの例は、β−ガラクトシダーゼ又はリブロキナーゼ(ara
B遺伝子でコードされている)である。酵素及び構造タンパク質が好ましい。使
用可能な他の生成物は、下記遺伝子によりコードされた生成物である:aceA
もしくはaceBsaraA。
araB、araC%araDSargG、aroB。
1acAs 5erA、purA%trpAs trpBst rpC,t r
pD%t rpEs tyrA等。不要ポリペプチドは通常グリコジル化されて
いない。araBプロモーターが好ましいプロモーターであるが、ラムダP 及
びP、、lac%gals trps huts及び他のarmプロモーターの
ような他のプロモーターも使用可能である。
本発明の更にもう一つの態様の場合には、セクロピン様遺伝子配列は、融合生成
物中でセクロピン様ポリペプチドの殺菌活性を阻害又は不活性化しうる余分のポ
リペプチドの配列と更には誘導プロモーターとに作動可能に結合せしめられてい
る。この方法の場合には、融合タンパク質技術から得られる効果及び誘導プロモ
ーターの使用から得られる効果の双方が有効かつ同時に得られる。
本発明の一態様によれば、細菌宿主のようなセクロピン感受性宿主中でのセクロ
ビン様ポリペプチド産生方法が得られるけれども、本発明で作成される遺伝子構
造体及びそれを要する方法は他の非セクロピン感受性宿主中でのセクロビン様ポ
リペプチドの発現用にも利用可能である。これらのセクロビン非感受性宿主とし
ては、酵母、哺乳動物細胞培養物及びあるダラム陽性菌がある。有用な酵母及び
哺乳動物宿主とベクターとは当業者に周知であり、例えば1983年11月9日
付で公開された欧州特許第93619号明細書が参考にされる。細菌宿主として
は、araBプロモーターをもつ前記宿主とシニードモナス属、シトロバクタ−
・(Citrobacter )属、キサントモナス(Xanthog+ona
s ) K及びエルウィニア(Erwinla )属のような細菌宿主がある。
araBプロモーターをもつ前記宿主と適合するのであればいかなるプラスミド
ベクターも使用可能である。
セクロビン様ポリペプチド用に好ましい他のプロモーターはラムダ(PL)であ
る。セクロピン様ポリペプチド及び余分のポリペプチドの遺伝子構造体は、バク
テリオファージラムダ(PL)の左方向プロモーターのコントロール下におくこ
とができる。このプロモーターは、コントロール可能な最強の公知プロモーター
の1つである。コンロールはラムダリプレッサーにより作動するが、隣接制限部
位は公知である。CI遺伝子の温度感受性対立遺伝子は、セクロビン完全配列を
含むベクター又は別のベクター上に位置させることができる。温度が42℃まで
上昇した場合にはリプレッサーが不活性化されて、プロモーターはその最大レベ
ルで発現せしめられるよう−になる。これらの条件下で産生きれるmRNA量は
、PLプロモーターに起因して約10%の新規合成RNAを含む細胞となりうる
ほど十分でなければならない。この場合には、機能性セクロビン様ポリペプチド
融合構造配列がリポソーム結合配列に隣接しかつラムダPt、プロモーターから
様々な距離をおいて存在しているクローンバンクを確立することが可能である。
次いで、これらのクローンはスクリーニングに付され、最高収率を示す1つが選
択される。
セクロピン様ポリペプチド配列の発現は、未形質転換状態の生物と“相同的°で
あってもよい他のレギユロンのコントロール下におくこともできる。例えば大腸
菌染色体DNAはβ−ガラクトシダーゼ酵素を同化することによりラクトース消
化を媒介するラクトース又はlacオペロンを有している。lacコントロール
要素は、大腸菌に感染するバクテリオファージラムダplac5から得られる。
ファージlacオペロンは同種細菌から形質導入によって得ることができる。本
発明の方法での使用に適したレギユロンは、生物に固有のプラスミドDNAから
得られる。lacプロモーター・オペレーター系はIPTGにより誘導される。
セクロピン様ポリペプチド類についてコードする合成ポリヌクレオチド配列を提
供することが、本発明において特に重要である。本発明の好ましい態様において
、(隣接配列をもつ)セクロピン様ポリペプチドの合成配列はその発現が酵母及
び細菌のような様々な宿主、特に後者と適合するように適正化されている。特に
、大腸国中におけるいずれか所定の配列の発現適正化が非常に重要である。した
がって、上記のような適正化処理を行った後、隣接配列存在又は非存衣セクロピ
ン様ポリペプチド類の現実の遺伝子配列は、原種の天然配列と通常具なってくる
。
更に、融合生成物にとって望ましい遺伝子のデザインには、余分のポリペプチド
との開裂部位において、メチオニン(臭化シアンで開裂可能)、トリプトファン
(〇−ヨードソ安息香酸で開裂可能)等のようなアミノ酸に関するコドンを好ま
しくは取入れてお(べきである。この上記開裂によって、特異的にC末端と反応
する様々な試薬で修飾されうるC末端が形成される。開裂部位としてメチオニン
(臭化シアンで開裂可能)の使用が好ましいが、その理由は開裂が極めて特異的
であってしかも容易に修飾されるC末端ホモセリンラクトンが得られるからであ
る。
本発明の一態様において、融合生成物にとって望ましいDNA配列中のいずれの
所定コドンも、特定部位突然変異誘発法により随意に変異させることができる。
したがって、望ましいDNA配列の合成後に、開裂部位を配列中に導入すること
ができる。特定部位突然変異誘発法は公知であって、ウォレスら、サイエンス、
第209巻。
第1396−1400頁、1980年[:Vallace et al、。
5cience、 209: 1B9B−1400(1980)]が参考にされ
るが、これは参考のため本明細書に組込まれる。
望ましいセクロピン様ポリペプチドの構造遺伝子が発現それ自体のためのビヒク
ル中に挿入されるべき場合には、その遺伝子は“開始”コドン及び1以上の終結
もしくは停止コドンの後にくることになる。発現生成物がセクロビン様ポリペプ
チドと付加ポリペプチドの一部もしくは全部の双方を含む融合タンパク質である
場合には、開始コドンはその余分のポリペプチドが先導しているならばそのN末
端の前に位置していてもよい。
ポリヌクレオチドの合成方法は当業者に周知である。
例えば、イト−ら、ヌクレイツク・アシッドψリサーチ。
第10巻、第1755−1769頁、1982年(It。
et al、、 Nuclelc Ac1d Re5each、 10: 17
55−1769 (19g2))のトリエステル法が参考とされる。
本発明の方法で産生されるセクロビン様ポリペプチド類は、具体的用途向の広域
抗菌剤として使用可能である。
このような用途としては、格別限定されないが、例えば加工食品標的の保存剤と
して〔標的生物:サルモネラ、イエルシニア(Yerslnia) 、シゲラ(
Shlgella) ) 、局所剤として【標的生物:シュードモナス、ストレ
プトコッカス(Streptococcus ) )又は臭気発生細菌を殺すた
めの〔標的生物:ミクロコブシ(Microcoecl) )セクロビン様ポリ
ペプチド類の使用がある。上記用途に際するセクロビン様ポリペプチド類の相対
的効力は、当業者によれば、セクロピン様ポリペプチド類の1つに対するいずれ
かの生物の感受性を調べることによって容易に評価される。インビトロで行われ
る同様の細菌スクリーニング法は投薬量及び濃度を決定するためにも用いられる
。
以上、本発明について一般的に記載してきたが、本発体例は説明のみのために本
明細書に含まれているのであって、他に指摘のない限り限定を目的としたもので
はない。
例1
プラスミドpCAMGを作成するためのプライマー突然変異誘発によるカルボキ
シル末端でのMet−Glyの付加
プラスミドpCAMGを同時係属中米国特許第797.472号明細書に記載さ
れたプラスミドpCA3Dから作成したが、そこでの開示は参考のため本明細書
に組込まれる。
ミャダ(Miyada)ら、ジーン、第17巻、第167頁。
1982年のプライマー突然変異誘発技術を用いてpCAMGを作成したが、そ
こでの開示は参考のため本明細書に組込まれる。
セクロピンAのカルボキシル末端における変化に関する突然変異誘発経路図は、
第2図に示されている。
工程1. EcoRl、Bam)11セクロビンA遺伝子断片を次のようにして
M13mp19に結合させた:pCA3Dを制限エンドヌクレアーゼBamHI
及びEcoRIで消化し、セクロピンA (CA)遺伝子を切出した。次いで、
CA3D/M13mp19を得るためにEcoRI、BamHI及びアルカリホ
スファターゼで前処理された2本鎖複製型(RF)M13mp19にこのCA遺
伝子断片を結合させた。
工程■、 突然変異誘発用のCAMGプライマー(5’ −AGTGAATTC
TATTAACCCATTTTAGCG−3’ )を次のようにして1本鎖M1
3mp19にアニーリングした: CAMGプライマー1100nをHin緩衝
液5oufI中で1木組型CA3D/M13mp19 1outと混合した。混
合物をH20g 00 ml含有ヒーカー中100”Cで3分間煮沸した。次い
で混合物を室温で徐々に37℃まで冷却し、CAMGプライマーをCA3D/M
13mp19にアニーリングさせた。
工程■、 突然変異されるセクロピンA遺伝子を含む2本鎖DNAを、次のよう
に突然変異誘発用プライマーの伸長化によってインビトロで合成したニプライマ
ー伸長化をDNAポリメラーゼIクレノウ断片及びdNTPにより37℃で2時
間かけて行なった。酵素をフェノール抽出により不活性化し、DNAをエタノー
ル沈降によって回収した。
工程■、 受容体プラスミドpR2Sを次のように作成した(第1図):pCA
3DをBamHIで部分消化し、T4DNAポリメラーゼを加え、しかる後Xb
alリンカ−CTCTAGAGをセクロピンA遺伝子の直前に結合させて、新し
いXba1部位をもつpH2を得た。
pH2をNdel及び5stlで消化し、付着端を74DNAポリメラーゼでプ
ラント末端化し、しがる後結合させて、5stl部位を欠<pH2デルタを得た
。
pH2デルタをEcoRI及びXbaIで消化し、しがる後EcoRI及びXb
aI消化RF型M13mp19と結合させて、1)R2Sを得た。このベクター
はaraC%araBの一部及びM13片を有しており、更にこのM13片はE
coRI、Xbal及び他の制限酵素部位を有している(第1図)。
工程V、 突然変異されるセクロビンA遺伝子をEcoRI及びXbaIでM1
3ベクターがら開裂させ、EcoRI及びXbalで前処理された未変異受容体
ベクターpR2Sに組込んでクローニングした。結合混合体を5stlで消化し
てpH2Sのバックグラウンドを減少させ、しかる後大腸菌MC1061に組込
んで形質転換させた。プローブとしてCAMGプライマーを用いるコロニーハイ
ブリッド形成により、50個の有効コロニーを確認した。正確なりNA配列を有
する1つのクローンをpCAMGと命名した。
匹一旦
セクロビン様ポリペプチドAのC末端修飾C末端の付加メチオニル−グリジンに
ついてコードする遺伝子構造体を用いて、様々なC末端修飾を行なった。
第1図及び第2図は、本発明で用いられる修飾経路について示している。
A、C末端ホモセリン
プラスミドpCAMGを含む大腸菌MC1061株を10リットル発酵容器中で
600nmのO,D、10となるまで増殖させ、アラビノース5tr/flで誘
導し、7〜10時間増殖させ、しかる後回収した。これらの細胞をガラリン(G
au l i n)ホモゲナイザーで破壊し、得られた溶液を14.OOOxg
で30分間遠心分離した。次いで、この遠心分離によるベレットをpH7〜7.
5の1mM EDTA含有50mMリン酸緩衝液中にブレンダーで懸濁化し、懸
濁液を前記のように遠心分離した。
ベレットをもう1度この操作で洗浄し、しかる後70%ギ酸(1,6リツトル/
kg湿潤細胞量)に溶解し、それに臭化シアン15.を6時間かけて加えたが、
その間に混合物を一定に攪拌した。この臭化シアン反応を室温で8〜16時間続
け、しかる後容量をロータリ一式エバポレーターの使用で300m1まで減少さ
せた。次いで、混合物をION NaOHで処理してpHを3.5〜4.0に上
げ、しかる後凍結乾燥した。
凍結乾燥粉末を導電率15m5の0.17N酢酸ナトリウム(pH4,0)1リ
ツトルで抽出した。物質をブレンダーで混合し、懸濁液を上記のように遠心分離
した。
この抽出操作を4〜6回繰返し、上澄を合わせ、等量の脱イオン水で希釈し、し
かる後ゼタクロム(Zetachro層)SP −200イオン交換デイスクに
供し、500mMNH4HCO3で溶離させた。溶離液をアムシコン(A■c1
conTM) YM −2膜で濃縮した。次いでこの物質を脱イオン水で希釈し
、もう2回程濃縮してNHHCO3濃度を低下させ、しかる後凍結乾燥し、一2
0℃で貯蔵した。
B、C末端ホモセリンラクトン
次いで、凍結乾燥粉末を室温で1時間にわたりタンパク質20〜50mg/ml
の濃度で濃トリフルオロ酢酸(T F A)により処理した。これにより、C末
端ホモセリンをラクトン型に変換した〔ホーン(Horn)、1975年;ケン
ブら、1985年〕。TFA処理物質を約2mg/mlの濃度で0.05%TF
A中に可溶化し、しかる後0.05%TFAで平衡化されたセミプレパラティグ
C−18逆相HPLCカラムに注入しく20mg/クロマトグラム)、0.05
%TFA含有37〜42%アセトニトリル勾配で溶離した。
C0C末端ホモセリンアミド
ホモセリンアミドの形成を、密封アンプル中45℃で2.5時間30%NH4O
Hでのラクトンの処理により行なった。過剰アンモニウムを窒素気流で除去し、
サンプルを上記条件下で逆相HPLCにより精製した。
カルボキシル末端へのエチレンジアミン付加をジメチルスルホキシド5〜20m
1使用により行なった。エチレンジアミンを10%濃度まで加え、混合物を一定
攪拌下37℃でインキュベートした〔ホーン、アナライティカル・バイオケミス
トリー、第69巻、第583−589頁、1975年(Horn、 Analy
tlcal Biocheslstry、 89:583−589 (1975
)) )。インキュベート後、トリフルオロ酢酸360μgを加え、サンプルを
(上記のように)逆相HPLCによるクロマトグラフィーに付した。次いで、こ
の濃縮された両分を20mM NHHCO3で平衡化されたHPLCモノ(Mo
no) Sカラム(強陽イオン交換体)によるクロマトグラフィーに付し、22
0mMNH4HCO3の同一溶離液で溶離した。
これらの操作で産生された様々な型のセクロピン様ポリペプチド類を、イオン系
界面活性剤の非存在下pH4,5で分離用ゲルを用いポリアクリルアミドゲル電
気泳動に供した(第4図)〔ライスフェルト(Reis4eld)ら、ホーチャ
ー。第195巻、第281−283頁。
1962年〕。C末端で電荷を変えているいかなる修飾もこの技術で識別される
。このゲルは、各々の修飾型セクロビン様ポリペプチドが高度に豊富化されてい
ることも示している。
抗菌活性アッセイは、試験生物生存細胞約10’個含有TYE培地中に寒天10
m1を注ぐことにより実施した。
直径2龍のウェルを寒天プレート中にパンチ形成した。
次いで、修飾セクロビン様ポリペプチド類のアリコート(2〜12μg)を各ウ
ェルに加えた。ウェル周囲の阻害ゾーン又は円環の直径を25℃で一夜インキュ
ベート後に測定した。
様々なセクロピン様ポリペプチド類の活性をグラム陰性及びグラム陽性生物双方
に対して試験した。グラム陰性生物に対する抗菌活性は、第1表で示されている
ように、大半のグラム陰性菌〔但し、セラチア・マルセッセンス(Serrat
ia garcescens )を除く〕の場合に不変のままであった。C末端
カルボキシル基で修飾されたペプチド類のみがダラム陽性菌に対して有意の活性
を有することが判明した(第2表参照)。円環形成標準を調べるために、様々な
修飾セクロビン様ポリペプチド類を大腸菌D21にも適用した。第1表及び第2
表に示された活性は、各生物の場合の透明円環半径対大腸菌D21の場合の半径
の比率として表わされている。
カルボキシ末端がエチレンジアミンで修飾されたセクロビン様ポリペプチド及び
天然セクロピンAを様々な生物に対して試験した。抗菌剤の相対的活性は、各ウ
ェルに供されたポリペプチド1ナノモル当たりで表わされた(第3表)。データ
は、修飾物質が広範囲の生物に対して天然セクロピンよりもナノモル当たりで有
効であることを示している。
本発明は理解の明確化目的でイラストレーション及び例によりやや詳細に説明さ
れてきたが、ある変更及び修正が、請求の範囲で制限されるけれども本発明の範
囲内で実施されうることは明らかであろう。
第1表
グラム陰性菌に対する修飾セクロピン類CA−COOHO,841,090,8
40,70CA−H8−Coon 0.88 1.07 0.79 0.78C
A−H8−ラクトン 0.84 1.03 0.88 0.80CA −HS
−NH2O,811,090,860,71CA −NH2O,801,0B
0.92 0.708活性は各生物の場合の透明円環半径対大腸菌D21の場合
の半径の比率として表わされている。
5遺伝子工学処理セクロピンAの化学的修飾されたC末端に関する。
CMC1061
’ CA−NH2はセクロビアサナギから単離されるようなセクロビンAである
。
第2表
ダラム陽性菌に対する修飾
セクロピン類の相対的活性8
修飾されたbM、 B、メガテ B、スブチ S、ファエセクロピン類 ルテウ
ス リウム リス 力リスCA−COOH00,2:l:0.08 0 0CA
”H’3−C0OHO,1:!:0.1 0.5±0.1 0 0CA−Is−
ラクトン 1.2±0.1 0.8±0.1 0.3±0.1 0.1±0.0
3CA−H8−N)!21.4±0.20.4±0.2 0.08±o、oe
。
CA−お−冊−Et−111H21,2±0.050.7±0.050.4±0
.1 0.35±0.18活性は各生物の場合の透明円環半径対大腸菌D21
。
の場合の半径の比率として表わされている。
5遺伝子工学処理セクロビンAの化学的修飾されたC末端に関する。
cCA−NH2はセクロピアサナギから単離されるようなセクロピンAである。
第3表
セクロピンAと修飾セクロピン
CA−H8−NH−Et −NHとの比較活が/ナノモJし5
微生物 セクロビンAC^−H8−■−Et−■2大腸菌
(Escherlchia coll) 6.1 9.8ミクロコツカス・ルテ
ウス
(Mlcroeoecus Iuteus) 6. 1 12.0バチルス・メ
ガテリウム
(hclllus segaterlum ) 5. 1 6. 9バチルス・
スブチリス
(Bacillussubterlus) <0.5 2.78円環アッセイに
より測定された活性は、ミリメートルで阻害環の半径を表わしている。
bナノモル数はアミノ酸分析により調べられている。
浄書(内容に変更なし)
FIG、 2
tりat”ンpイくE鉢I各
FIG、 3
手続補正書(方式)
平成1年6月12圓
Claims (27)
- 1.C末端においてホモセリン残基で伸長化されているセクロピン様ポリペプチ ド。
- 2.ホモセリン残基が中性、負イオン化又は正イオン化されるようにそれが修飾 されている、請求項1に記載のセクロピン様ポリペプチド。
- 3.セクロピン様ポリペプチドがセクロピンAと相同的であって、グラム陰性菌 及びグラム陽性菌双方に対して殺菌活性を示す、請求項1又は2に記載のセクロ ピン様ポリペプチド。
- 4.下記アミノ酸配列を有する、請求項1に記載のセクロピン様ポリペプチド: 【配列があります】 〔上記において、HSはホモセリン残基を表わす;COR1はCOOH、CON H2、低級アルキルアミド、低級アルキルエステル、C2−C4アルキレンジア ミンのアミド又はホモセリン残基のヒドロキシ基と一緒に形成されたラクトンを 表わす〕。
- 5.修飾ホモセリン伸長化C末端が正イオン化されている、請求項2に記載のセ クロピン様ポリペプチド。
- 6.修飾ホモセリン伸長化C末端がC2−C4アルキレンジアミンのホモセリン アミドの薬学上許容される塩である、請求項5に記載のセクロピン様ポリペプチ ド。
- 7.修飾ホモセリン伸長化C末端がエチレンジアミンのホモセリンアミドである 、請求項6に記載のセクロピン様ポリペプチド。
- 8.修飾ホモセリン伸長化C末端が中性である、請求項2に記載のセクロピン様 ポリペプチド。
- 9.修飾ホモセリン伸長化C末端がホモセリンラクトンである、請求項8に記載 のセクロピン様ポリペプチド。
- 10.修飾ホモセリン伸長化C末端がホモセリンアミド、ホモセリン低級アルキ ルアミド又はホモセリン低級アルキルエステルである、請求項8に記載のセクロ ピン様ポリペプチド。
- 11.修飾ホモセリン伸長化C末端が負イオン化されている、請求項2に記載の セクロピン様ポリペプチド。
- 12.修飾ホモセリン伸長化C末端がカルボキシル基の薬学上許容される塩の形 である、請求項11に記載のセクロピン様ポリペプチド。
- 13.C末端においてMet−X(XはCNBrによりメチオニンから開裂可能 な基である)により伸長化されているセクロピン様ポリペプチド。
- 14.基Xがアミノ酸、アミノ酸の類似体、ペプチド又はアミノ酸類似体を含む ペプチドである、請求項13に記載のセクロピン様ポリペプチド。
- 15.基Xがグリシンである、請求項14に記載のセクロピン様ポリペプチド。
- 16.ポリペプチドが下記アミノ酸配列を有する、請求項15に記載のセクロピ ン様ポリペプチド:【配列があります】
- 17.C末端においてMet−X(XはCNBrによりメチオニンから開裂可能 な基である)により伸長化されたセクロピン様ポリペプチドについてコードして いる遺伝子配列を含む組換えDNA分子。
- 18.Xがアミノ酸又はペプチド残基である、請求項17に記載の組換えDNA 分子。
- 19.Xがグリシンである、請求項18に記載の組換えDNA分子。
- 20.セクロピン様ポリペプチドがセクロピンAと相同的である、請求項17、 18又は19に記載の組換えDNA分子。
- 21.請求項17、18、19又は20に記載の組換えDNA分子を含む所定宿 主中で複製可能な発現ビヒクル。
- 22.プラスミドである、請求項21に記載の発現ビヒクル。
- 23.宿主が細菌である、請求項21に記載の発現ビヒクル。
- 24.C末端においてホモセリン残基により伸長化されているセクロピン様ポリ ペプチドの産生方法であって、 適切な宿主を請求項21に記載の発現ビヒクルで形質転換し; 上記宿主を培養し; C末端にMet−Xを有する上記セクロピン様ポリペプチドを回収し;及び 上記Met−Xを開裂し、もってC末端ホモセリンを産生する; ことを特徴ととする方法。
- 25.C末端ホモセリンを中性、負イオン化又は正イオン化修飾C末端ホモセリ ンに変換することを更に含む、請求項24に記載の方法。
- 26.有効量の請求項1又は2に記載のセクロピン様ポリペプチド及び薬学上不 活性な担体を含む、グラム陰性及びグラム陽性菌双方に対する抗菌活性を有する 医薬組成物。
- 27.グラム陽性又はグラム陰性菌の増殖抑制方法であって、 上記細菌により感染された組成物又は患者に有効量の請求項26に記載の医薬組 成物を投与することを特徴とする方法。
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