DE3689598T2

DE3689598T2 - Arab-promoter und verfahren zur herstellung von polypeptiden einschliesslich cecropinen mittels mikrobiologischer verfahren.

Info

Publication number: DE3689598T2
Application number: DE3689598T
Authority: DE
Inventors: Jiunu Lai; Jar-How Lee; Yun-Long Lin; Dan Ray; Gary Wilcox
Original assignee: Xoma Corp
Current assignee: Xoma Corp
Priority date: 1985-01-28
Filing date: 1986-01-24
Publication date: 1994-06-30
Anticipated expiration: 2006-01-25
Also published as: ATE101203T1; JPH0829112B2; WO1986004356A1; EP0211047B1; FI863891A; JPS62501538A; JPH082308B2; KR870700095A; NO863806L; FI94774C; FI863891A0; EP0460709A1; EP0460709B1; DE3650625T2; NO175870B; EP0211047A4; NO863806D0; EP0211047A1; NO175870C; DE3689598D1

Description

Technischer Bereich

Die vorliegende Erfindung betrifft den Bereich rekombinanter DNA-Technologie und die Verwendung von araB-Promotoren in der Expression heterologer Gene in transformierten Wirten. Dieses Patent betrifft auch die Konstruktion, die Klonierung und Expression von Genen, die für das bakterizide Peptid Cecropin und dessen Analoge codieren.

Wissenschaftlicher Hintergrund

Die genetische Information, die in den DNA-Molekülen codiert ist, wird durch eine Reihe von Schrillen exprimiert, die die Transcription der DNA zu mRNA und die folgende Translation der mRNA in Polypeptide oder Proteine beinhalten. Die Expression der codierten Information zur Bildung von Polypeptiden beginnt an der Promotorstelle, einer Region auf dem DNA-Molekül, an die RNA-Polymerase bindet und die Transcription auslöst. Zu Promotoren, die in rekombinanten DNA-Techniken zur Expression heterologer Gene verwendet werden, zählen Beta-Lactamase- (Penicillinase) und Lactose- (Beta-Galactosidase) Promotorsysteme (Chang et al., Nature, 275 : 615 (1978); Itakura et al., Science, 198 : 1056 (1977); Goeddel etal., Nature, 281 : 544 (1979)) und das Tryptophan- (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acid Res., 8 : 4057 (1980); EPO Anmeldung Veröffentlichungsnr. 0036776). Andere bekannte Promotoren umfassen die Bakteriophage Lambda-Promotoren, (PI) und (PR) hut Colicin E&sub1;, Galactose, alkalische Phosphatase, Xylose A und tac.
Das araB-Gen und sein Promotor (araB) sind in dem L-Arabinose Operon angeordnet. Das L-Arabinose-Operon (araBAD) in Escherichia coli und in Salmonella typhimurium wurde untersucht. Von besonderem Interesse ist das L-Arabinose-Operon in S. typhimurium; eine Beschreibung seiner Sequenz findet sich bei Horwitz, A., et al., "DNA Sequence of the araBAD-araC Controlling Region in Salmonella typhimurium LT2", Gene, 14 : 309-319 (1981), Lin, H.-C. etal., "The araBAD Operon of Salmonella Typhimurium LT2, I. Nucleotide Sequence of araB and Primary Structure of Its Product, Ribulokinase", Gene, 34 : 111-122 (1985); II. "Nucleotide Sequence of araA and Primary Structure of Its Product, L-Arabinose Isomerase", Gene 34. 123-128 (1985); III. "Nucleotide Sequence of araD and Its Flanking Regions, and Primary Structure of Its. Product, L-Ribulose-5-Phosphate-4-Epimerase", Gene, 34, 129-134 (1985). Das araBAD-Operon enthält drei Strukturgene, die für den Anfangsmetabolismus von L-Arabinose verantwortlich sind. Lee, Jar-How etal., "Genetic Characterization of Salmonella typhimurium LT2 ara Mutations", J. of Bacteriology, 158 : 344-46 (1984). L-Arabinose wird zunächst durch das araA-Genprodukt, L-Arabinose-Isomerase, in L-Ribulose umgewandelt. Dann wird L-Ribulose durch das araB-Genprodukt, Ribulokinase, zu L-Ribulose-5-phosphat phosphoryliert. Das araD-Genprodukt, L-Ribulose-5-phosphat-4-epimerase, katalysiert die Umwandlung von L-Ribulose-5-phosphat zu D-Xylose-5-phosphat, das dann in den Pentosephosphatweg gelangt. Das araBAD-Operon wird von dem Induktor L-Arabinose und dem araC Regulations-Genprodukt koordinativ kontrolliert.
Da in einem Ausführungsbeispiel der hierin offenbarten und beanspruchten Erfindung der araB-Promotor funktionsfähig mit dem Gen verbunden ist, das für Cecropin codiert, und in einen geeigneten Wirt zur Expression des Cecropinproteins eingesetzt wird, ist eine Übersicht über die Hintergrundinformation zu Cecropinen angebracht.
Das Immunsystem des Cecropia-Falters und verschiedener, zu den Schmetterlingen gehörenden Insekten ist durch eine wirksame humorale Reaktion gekennzeichnet, die hauptsächlich mit den Cecropinen zusammenhängt, einer jüngst entdeckten Familie antibakterieller Peptide (Boman, H.G. und Steiner, H., Current Topics in Microbiology And Immunology, 94195 : 75-91(1981)).
H. Steiner et al., Nature, 292 : 246-248 (16. Juli 1991) beschreibt die Reinigung und Charakterisierung von zwei Proteinen, die von dem Cecropia-Falter Hyalophora Cecropia erhalten werden. Diese Proteine besitzen antibakterielle Aktivität und der Name Cecropin A und B wird vorgeschlagen. Die vorläufigen Aminosäuresequenzen für diese beiden Cecropine sind auf Seite 247 angeführt.
EP-A-0139501 beschreibt die Expression von Thaumatin in E. coli MC1061-Zellen, die mit dem Plasmid pING 307, welches das araB-Gen enthält, transformiert wurden.
Gemäß einem ersten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird daher ein replizierbarer Expressionsvektor geschaffen, der ein Polynucleotidmolekül aufweist, das in einem bestehenden Wirt exprimierbar ist und die Sequenz des araB-Promotors umfaßt, der mit einem Gen funktionsfähig verbunden ist, das zu dem Wirt heterolog ist, wobei das Gen für ein Polypeptid kodiert, das biologisch aktiv ist, oder für ein Fusionsvorläuferprotein, das ein zweites Polypeptid und eine selektive Spaltstelle angrenzend an das biologisch aktive Polypeptid umfaßt, wobei das biologisch aktive Polypeptid ein Enzym, Hormon, Antikörper, Hämoglobin, Strukturprotein, α-, 4b- oder γ-Interferon, Interleukin, Insulin oder Gewebsplasminogenaktivator, aber nicht Thaumatin ist.
Ein zweites Merkmal der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven, heterologen Polypeptids in einem zur Expression des Peptids transformierten Bakterium, aufweisend:
a) das Einsetzen eines Polynucleotidmoleküls, bestehend aus dem araB-Promotor, der mit einem heterologen Gen funktionsfähig verbunden ist, das für das biologisch aktive Polypeptid oder ein Fusionsvorläuferprotein codiert, das ein zweites Polypeptid und eine selektive Spaltstelle umfaßt, die an das biologisch aktive Polypeptid angrenzt, in einen replizierbaren Expressionsvektor, wobei das biologisch aktive Polypeptid ein Enzym, Hormon, Antikörper, Hämoglobin, Strukturprotein, α, β- oder γ-Interferon, Interleukin, Insulin oder Gewebsplasminogenaktivator, aber nicht Thaumatin ist;
b) das Transformieren eines Bakteriums, das zur Expression des Polypeptids fähig ist, mit dem Expressionsvektor, der das Polynucleotidmolekül enthält;
c) das Kultivieren des transformierten Bakteriums unter Kultivierungsbedingungen; und
d) das Gewinnen des Polypeptids aus der Kultur.
Ein drittes Merkmal umfaßt ein Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven, heterologen Polypeptids durch Kultivieren eines Bakteriums, das mit einem Polynucleotidmolekül transformiert ist, das den araB-Promotor umfaßt, der mit dem Gen funktionsfähig verbunden ist, das zu dem Bakterium heterolog ist, und für das Polypeptid codiert, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
a) das Inkubieren eines transformierten Bakteriums in einem Kulturmedium unter bestimmten Wachstumsbedingungen bis die späte exponentielle Wachstumsphase erreicht ist, wobei das Bakterium mit einem Expressionsvektor des ersten Merkmals transformiert ist;
b) dem Übertragen der Kultur von Schritt a) in ein frisches Kulturmedium und dem Inkubieren der Kultur über einen ausreichenden Zeitraum, der ein weiteres Wachstum ermöglicht;
c) dem Beimpfen der Kultur von Schritt b) mit Produktionsmedium und dem Inkubieren der Kultur unter Fermentationsbedingungen zur Erzielung eines maximalen bakteriellen Wachstums über einen ausreichenden Zeitraum, der zur Erzielung einer bestimmten Zelldichte ausreicht;
d) dem Zugeben einer Menge von L-Arabinose, welche die Herstellung wesentlicher Mengen des heterologen Polypeptids in dem Medium bewirkt; und
e) dem Gewinnen des heterologen Peptids.
Zusätzlich umfaßt die Erfindung Wirte, die mit dem replizierbaren Expressionsvektor des ersten Merkmals transformiert wurden, der vorzugsweise B. coli, S. typhimurium oder Serratia marcescens ist.
Es hat sich nun gezeigt, daß der araB-Promotor als Promotor in rekombinanten DNA-Molekülen verwendet werden kann, so daß der araB-Promotor funktionsfähig mit einem heterologen Gen verbunden ist, das für ein biologisch aktives Produkt codiert. Die Verwendung des araB-Promotors zur Steuerung der Expression heterologer Gene bringt viele Vorteile mit sich. Das araB-Promotorkontrollsystem ist streng reguliert. Der araB-Promotor kann mit L-Arabinose angeregt werden; z. B. werden erzeugte Polypeptide nicht synthetisiert, bevor dem Kulturmedium L-Arabinose beigegeben wird. Somit kommt es ohne L-Arabinose zu keiner Expression der heterologen Gene zur Bildung der Polypeptide. Bei der Auslösung mit L-Arabinose wird das Polypeptid als Teil einer Boten-RNA transcribiert, die bei dem araB-Promotor beginnt. Sobald der Vorgang eingeleitet ist, werden Polypeptide rasch und wirksam erzeugt. Ferner ist der Fermentationszeitraum im Vergleich zu anderen Systemen kurz. Es ist von Bedeutung, daß das Ausmaß der Expression erhöht wird, d. h., der Produktionsmenge von heterologem Polypeptid deutlich verbessert wird, wodurch es für die kommerzielle Verwendung interessant wird. Die exprimierten Fusionspolypeptide bilden schließlich Einschlußkörper in der Wirtszelle, die sehr stabil bleiben, unabhängig von der Größenzunahme, und können einer Reinigung für heterologes Protein unterzogen werden.
Die vorliegende Erfindung schafft somit ein Polynucleotidmolekül, das in einem bestimmten Wirt exprimierbar ist, das die Sequenz des araB-Promotors umfaßt, der mit einem Gen, das zu dem Wirt heterolog ist, funktionsfähig verbunden ist. Das heterologe Gen codiert für ein oder mehrere Polypeptide, die biologisch aktiv sind. Die Erfindung schafft auch Vektoren, die zu einer Replikation und Expression fähig sind und das Polynucleotidmolekül umfassen; Wirte, die mit dem Vektor transformiert sind; und Fermentationsmethoden zur Kultivierung der Wirte für die endgültige Expression und Gewinnung des oder der heterologen Peptide.
Das Polynucleotid kann ein DNA-Molekül sein, zum Beispiel ein doppelstrangiges DNA-Molekül. Der Vektor kann ein Plasmid oder Bakteriophage sein; wenn er ein Plasmid ist, kann er auch einen phänotypischen Selektionsmarker, wie Antibiotikaresistenz, enthalten.
Die vorliegende Erfindung schafft auch ein Verfahren und Mittel zur Anwendung des Verfahrens zur Herstellung von Cecropin-Peptiden und Analogen davon durch rekombinante DNA-Methodologie. Die Cecropine können durch Verwendung des zuvor genannten araB-Promotors oder jedes anderen Promotors exprimiert werden.
Die Erfindung kann ein genetisches Konstrukt schaffen, das zur Expression in einem Cecropin-sensitivem Wirt fähig ist, das eine genetische Sequenz umfaßt, die für Cecropin codiert und funktionsfähig mit einer induzierbaren Promotorsequenz verbunden ist.
Die Erfindung schafft auch Vektoren, die zur Replikation und Expression imstande sind, bestehend aus den zuvor genannten genetischen Konstrukten, sowie Wirte, die mit den Vektoren transformiert sind, wie auch Verfahren zur Herstellung von Cecropinen unter Verwendung der zuvor genannten Vektoren, Konstrukte und Wirte.
Die Erfindung schafft ferner ein Fusionsprotein eines Cecropins mit einem Polypeptid, wobei das Fusionsprotein verminderte bakterizide Wirkungen gegenüber einem bestimmten bakteriellen Wirt besitzt.
Das Fusionsprotein kann zwischen den beiden Segmenten eine selektiv spaltbare Stelle aufweisen.
Vorzugsweise werden die genetischen Sequenzen, die für ein Cecropin codieren, durch Computertechnologie konstruiert, so daß ihre Akzeptanz durch E.coli als Expressionswirte optimiert wird. Eine Optimierung der Konstruktion wird ausgeführt zur Minimierung der Selbstkomplementarität, zur Vermeidung oder Schaffung von Restriktionsendonucleasestellen innerhalb oder außerhalb der Sequenz und somit zur Erleichterung des Einschubs und zur Minimierung der Komplementarität mit den gewünschten Expressionsvektoren. Durch die Optimierungsbehandlung der Polynucleotidsequenz schafft die Erfindung synthetische Sequenzen, die sich in den meisten Fällen strukturell von jenen in den natürlichen Genen zahlreicher Arten, die als Quelle für Cecropin verwendet werden, unterscheiden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Aminosäure und Nucleotidsequenzen von Cecropin A und das synthetische Gen, das zur Expression in B. coli verwendet wird.
Fig. 2 zeigt die Konstruktion von Plasmid pING 1 aus Plasmid pMH6 und M13mp9. pING enthält sowohl das araB- als auch das araC-Gen. Die Figur zeigt auch die Konstruktion der Plasmide pCA1A, pCA1B und pCA1' aus Plasmid pING1 (als Quelle für das araB- und araC-Gen).
Fig. 3 zeigt die Konstruktion der Plasmide pCA3', PCA3A, PCA3B und PCA2' und pCA2A aus pMH6 und pCA1A, pCA1B und pCA1'. Der Unterschied zwischen pCA1 (oder pCA1A und 1B), pCA2' (oder pCA2A) und pCA3' (oder pCA3A und pCA3B) liegt in der unterschiedlichen Länge zwischen dem Cecropin A-Gen und der BamHI-Stelle zwischen beiden ara-Genen, die bei pCAl' (oder pCA1A und 1B) 500 bp, bei pCA2' (oder pCA2A) 1253 bp und bei pCA3' (oder pCA3A und 3B) 1550 bp beträgt.
Fig. 4 zeigt die Konstruktion von Plasmid p19C.
Fig. 5 zeigt die Konstruktion von Plasmid pCA3A- - 1 aus pCA3A. Die Figur zeigt auch die Konstruktion von Plasmid pCA3D aus pCA3A- - 1 und p19C (Fig. 4).
Fig. 6 zeigt die Aminosäure- und Nucleotidsequenzen von Cecropin A, einem 0 zweiten chemisch synthetisierten Gen, das zur Expression in E. coli verwendet wird.
Fig. 7 zeigt die Aminosäure- und Nucleotidsequenzen vom Wildtyp und der Mutante von Cecropin A, wobei
(1) den CA-Wildtyp (pCA3D) bezeichnet;
(2) die CA-Mutante A (pCA3A) bezeichnet; und
(3) die CA-Mutante B (pCA3B) bezeichnet;
↑ bezeichnet die Position der Mutation.
Fig. 8 zeigt die Konstruktion von Plasmid phTGF5, das eine araB-hTGF-Fusion enthält.
Fig. 9 zeigt die Konstruktion von Plasmid pTGF58.
Fig. 10 zeigt die Konstruktion von zwei Plasmiden, p115 und p318, die ein menschliches synthetisches Calcitoningen enthalten.
Fig. 11 zeigt die Konstruktion eines Plasmids, pHCT1, welches das Gen für das fusionierte Polypeptid Ribulokinase-menschliches Calcitonin (hCT) enthält.
Fig. 12 zeigt die Konstruktion von Plasmid pING1, das als Vektor zur Klonierung und Expression von Calcitonin-Peptidgenen verwendet wird; pING1 enthält araB- und araC-Gene.

DEFINITIONEN

In der folgenden Beschreibung wird eine Reihe von Begriffen, die in der rekombinanten DNA-Technologie üblich sind, häufig verwendet. Die folgenden Definitionen dienen einem besseren und folgerichtigen Verständnis der Beschreibung und Ansprüche sowie auch des Umfanges dieser Begriffe.

Operon

Ein Gen, das ein oder mehrere Strukturgene zur Polypeptidexpression und die Kontrollregion, welche die Expression reguliert, umfaßt.

Operator

Eine DNA-Sequenz, die zu einer Wechselwirkung mit einem spezifischen Repressor fähig ist, wodurch das Funktionieren eines oder mehrerer benachbarter Gene gesteuert wird.

Promotor

Eine DNA-Sequenz in der Kontrollregion, an die die RNA-Polymerase bindet und die Transcription eines oder mehrerer benachbarter Gene auslöst.

Aktivator

Ein Protein, das zur Auslösung der RNA-Synthese durch RNA-Polymerase erforderlich ist.

Initiator

Eine DNA-Sequenz, mit der ein Aktivator zur Kontrolle benachbarter Gene in Wechselwirkung steht.

Polynucleotidmolekül

Eine lineare Sequenz von Nucleotiden, die durch ein Gerüst, das aus einer abwechselnden Reihe von Zucker- und Phosphatresten besteht, miteinander verbunden sind, und die in der vorliegenden. Verwendung DNA- und RNA-Polymere enthalten kann.

Strukturgen

Eine DNA-Sequenz, die durch ihre Matrizen- oder Boten-RNA für Deine Sequenz von Aminosäuren codiert, die für ein spezifisches Peptid typisch ist.

Heterologes Gen

Ein Gen das fremd ist, d. h. von einem Spender stammt, der sich von dem Wirt unterscheidet, oder ein chemisch synthetisiertes Gen ist und einen Spender einer Art umfaßt, die sich vom Wirt unterscheidet. Das Gen codiert für Polypeptide, die üblicherweise nicht von dem Organismus erzeugt werden, der durch den Expressionsvektor transformiert werden soll.

Biologisch aktiv

In der vorliegenden Verwendung bedeutet dies die Qualität oder das Verfahren zur Erzielung einer beabsichtigten Wirkung, die in einem biologischen System eintritt.

Funktionsfähig verbunden

In der vorliegenden Verwendung bedeutet dies, daß der Promotor die Auslösung der Expression des Polypeptids steuert, das durch das heterologe Gen codiert wird.

Expression

Die Expression ist das Verfahren, durch welches eine Strukturgen ein Polypeptid erzeugt. Es umfaßt die Transcription des Gens zu einer Boten-RNA (mRNA) und die Translation einer solchen mRNA zu einem oder mehreren Polypeptiden.

Klonierungsvektoren

Eine Plasmid- oder Phage-DNA oder andere DNA-Sequenzen, die in einer Wirtszelle replizieren können, die durch eine oder eine geringe Anzahl von Endonuclease-Erkennungsstellen gekennzeichnet sind, an welche solche DNA-Sequenzen in einer bestimmbaren Art ohne Verlust einer essentiellen biologischen Funktion der DNA zerschnitten werden können, und die einen phänotypischen Selektionsmarker enthalten, der zur Verwendung in der Identifikation von transformierten Zellen geeignet ist. Marker sind, zum Beispiel, Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz. Manchmal wird der Begriff "Vektor" für Klonierungsvektor verwendet.

Expressionskontrollsequenz

Eine Sequenz von Nucleotiden, welche die Expression von Strukturgenen kontrolliert oder reguliert, wenn sie mit diesen Genen funktionsfähig verbunden ist. Sie umfassen das lac-System, das trp-System, Hauptoperator- und Promotorregionen von Phage Lambda, die Kontrollregion des fd-Hüllproteins und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, daß sie die Expression von Genen in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen steuern. Expressionsvektor. Ein Vektor, der einem Klonierungsvektor ähnlich ist, der aber ein bestimmtes Strukturgen in einem Wirt exprimieren kann, normalerweise unter der Kontrolle von bestimmten Regulationssequenzen.

Wirt

Jeder Organismus, der den Empfänger eines replizierbaren Expressionsvektors darstellt, einschließlich Bakterien und Hefe.

Cecropin

Dieser Begriff wird in der gesamten Beschreibung und in den Ansprüchen mit der Bedeutung verwendet, daß er ein Polypeptid von jeder Insektenart enthält, das bakterizide Aktivität in einem in vivo- oder in vitro-System aufweist, das in der Wissenschaft zur Messung einer solchen Aktivität akzeptiert wird.
Der Begriff Cecropin wird in dieser Erfindung auch so verwendet, daß er jedes Analog, Homolog, jede Mutante, jedes Isomer oder Derivat eines natürlich vorkommenden Cecropins umfaßt, das bakterizide Aktivität in einem geeigneten System zeigt. Der Begriff soll auch Fragmente mit weniger als der natürlich vorkommenden Anzahl von Aminosäuren umfassen, wie Teilfragmente von natürlichen Cecropinen oder ihre Analoge. Der Begriff wird auch in dem Sinne verwendet, daß er jedes Produkt umfaßt, das die Sequenz eines natürlich vorkommenden Cecropins oder eines Analogs davon enthält, gemeinsam mit einer oder mehreren flankierenden Aminosäuren, vorzugsweise am Carboxyterminus, die cecropinähnliche bakterizide Aktivität zeigen. Der Begriff soll auch Cecropine mit weniger als der natürlich vorkommenden Anzahl von Aminosäuren umfassen, die aber nach wie vor bakterizide Aktivität zeigen.
Der Begriff "bakterizide Aktivität" soll die Aktivität wie zuvor definiert umfassen, die entweder größer oder geringer als jene von natürlich vorkommenden Cecropinarten sein kann. Insbesondere sind Cecropin-Peptide mit bakterizider Aktivität enthalten, die im Bereich von etwa 1% der natürlich vorkommenden Arten bis zu einer Aktivität, die wesentlich größer sein kann (zum Beispiel das Zehnfache, Hundertfache oder mehr) als jene der natürlich vorkommenden Cecropine, liegt.

BESTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG

1. Der araB-Promotor

Die vorliegende Erfindung schafft ein Polynucleotidmolekül, das in einem bestimmten Wirt exprimierbar ist und die Sequenz des araB-Promotors enthält, die funktionsfähig mit einem Gen verbunden ist, das zu dem Wirt heterolog ist. Das heterologe Gen codiert für das oder die Polypeptide, die biologisch aktiv sind. Die Erfindung schafft auch mit dem araB-Promotor verbundene Konstruktionen. Der araB-Promotor ist ein induzierbarer Promotor, d. h., die Expression des heterologen Gens zur Bildung des codierten Polypeptids wird durch die Zugabe von L-Arabinose ausgelöst oder induziert. L-Arabinose steht mit einem Aktivator, dem Produkt des araC-Gens, zur Regulierung der Expression von araB in Wechselwirkung. Dies ist ein positives Kontrollsystem im Gegensatz zu einem negativen Kontrollsystem; zum Beispiel lac, trp, Lambda PL und tac. Ohne Zugabe von L-Arabinose wird das heterologe Polypeptid nicht exprimiert oder synthetisiert. Sobald der Vorgang ausgelöst ist, werden das oder die biologisch aktiven Polypeptidprodukte rasch und wirksam erzeugt. Das oder die Polypeptidprodukte werden üblicherweise als Einschlußkörper in den Wirtszellen gebildet. Die Einschlußkörper werden mit zunehmender Zelldichte rasch größer. Die Einschlußkörper bleiben in den Wirtszellen sehr stabil. Diese Eigenschaft führt zu einer reproduzierbaren hohen Ausbeute und macht die Überwachung der Fermentation zu einer leichten Aufgabe. Zur Beendigung eines laufenden Fermentationsvorganges kann eine genaue Entscheidung einfach aufgrund der Größe der Einschlußkörper und des gesättigten Wachstums vorgenommen werden.
Der araB-Promotor in S. typhimurium weist die folgende Nucleotidsequenz auf:
Der araB-Promotor als Teil des araB-Gens ist in dem L-Arabinose-Operon angeordnet. Das L-Arabinose-Operon (araBAD) wurde in E. coli und S. typhimurium isoliert. Die Durchführung dieser Erfindung ist jedoch nicht auf diesen beiden Quellen für den araB-Promotor begrenzt. Andere Quellen können jeden Organismus umfassen, der Gene enthält, die für das L-Arabinose-Operon codieren. Diese Quellen für den araB-Promotor können die Gattungen Pseudomonas, Citrobacter, Xanthomonas und Erwinia enthalten.
Zusätzlich kann der araB-Promotor synthetisiert werden; z. B. durch Manipulation im Labor anstelle eines natürlichen Ursprungs. Mit anderen Worten, der Begriff bedeutet zugleich ein künstlich zusammengesetztes oder sogar ein künstlich abgebautes Produkt. Selbst wenn eine bestimmte vollständige Sequenz für einen natürlich vorkommenden araB-Promotor in der genomischen DNA einer bestimmten Organismusart integriert existieren mag, kommt somit die isolierte, dem araB-Promotor entsprechende Sequenz, die von der genomischen DNA des Organismus abgetrennt wird, mit oder ohne benachbarten, den vordersten Polypeptiden entsprechenden Sequenzen, Start- oder Stoppsignalen, nicht natürlich vor und wird als "synthetisch" angesehen. Zusätzlich muß angesichts der Degeneration des genetischen Codes die Kenntnis der Aminosäuresequenz nicht unbedingt und unwiderruflich zu der natürlich vorkommenden genetischen Sequenz führen, die dafür codiert.
Die Optimierung jeder synthetischen Sequenz umfaßt vier oder mehr mögliche Schritte und ist bei der Synthese des araB-Promotors anwendbar, wie auch bei der Synthese von Peptidsequenzen, einschließlich heterologer Peptide. Zunächst wird für jede bestimmte gewünschte Sequenz eine Liste möglicher DNA-Codons für jede Aminosäure in einer solchen Sequenz erstellt, wobei diese Codons nach der Häufigkeit, mit der sie bei Bakterien oder Hefe verwendet werden, gereiht sind. Eine vorläufige Ordnung der Codons kann auf der Schrift von Benetzen und Hall, Journal of Biological Chemistry, 257 : 30263031(1982) (Hefe) oder Fiers, W., Nature, 260: 500 (1976) (Bakterien) beruhen, die durch Bezugnahme hierin eingeführt sind. Eine weitere Verfeinerung der Sequenz über die Techniken dieser Schriften hinaus wird auch empfohlen.
Ein zweiter Faktor, der die Wahl jedes bestimmten Codons beeinflußt, ist das Vorhandensein oder Fehlen gewisser Restriktionsenzymstellen, die in dem Klonierungsverfahren des Gens verwendet werden, so daß die Verwendung dieser Enzyme im Klonierungsverfahren erleichtert wird. Die Optimierung dieses Faktors umfaßt den Vergleich der bekannten Endonucleasestellensequenzen (mit vier bis sechs Nucleotiden pro Stelle) mit der primären "für den Wirt bevorzugten" Sequenz. Eine Liste der Restriktionsendonucleasestelle findet sich zum Beispiel bei Roberts, R., J.,
Nucleic Acid Research, 11 : 1 (1983), r135-r137.
Ein dritter Faktor, der die Wahl besonderer Codons beeinflußt, ist das Erfordernis, die innere Sekundärstruktur der synthetisierten DNA-Fragmente zu minimieren, so daß ihr Übereinanderfalten vermieden und Schmelzreaktionen mit angrenzenden DNA-Fragmenten verhindert werden. Dieser Faktor umfaßt die Suche nach einer bestimmten Konstruktionssequenz, so daß eine ungewünschte Komplementarität ihrer Segmente miteinander vermieden wird, mit Ausnahme der Segmente, die in dem gesuchten Gen aneinander angrenzen. Eine Suche nach Komplementarität (d. h. deren Vermeidung) kann auch zwischen der konstruierten Gensequenz und den vorgeschlagenen Replikationsvektoren, wie Plasmiden oder Phagen, erfolgen.
Ein vierter Faktor, der zur Optimierung dient, ist das Vermeidung von Sequenzen, die reich an AT-Basenpaaren (etwa 5 oder mehr) sind, besonders, wenn ihnen eine Sequenz vorangeht, die reich an GC- Basenpaaren ist, um eine vorzeitige Beendigung der Transcription zu vermeiden.
Ein fünfter Faktor, der die Wahl von Codons beeinflußt, ist das Vermeiden von RNase-Stellen, so daß die Botschaft stabil ist.
Wenn schließlich jeder von zwei möglichen Codons verwendet werden könnte, wird der Einsatz jenes bevorzugt, der die Expression in mikrobiellen Genomen maximiert (siehe, zum Beispiel, Fiers, et al., Nature, 260 500 (1976); Grosjean, et al., Gene, 18 : 199-209 (1982); und Riggs, U.S.-Patent 4.366.246, Spalte 6, die alle hierin durch Bezugnahme eingeführt werden).
Besonders bevorzugt wird zur Optimierung ein Computerprogramm verwendet, das für die Durchführung der notwendigen Vergleiche erstellt wurde, so daß die Expression in bakteriellen Mikroben oder Hefe optimiert wird.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung ist der induzierbare araB-Promotor funktionsfähig mit einer genetischen Sequenz verbunden, die für ein Polypeptid codiert, das biologisch aktiv ist, und das erhaltene genetische Konstrukt wird in einen Expressionsvektor eingeführt oder bildet einen Teil davon. Der Expressionsvektor wird dann zur Transformierung eines geeigneten Wirtes verwendet. Der Wirt wird unter bestimmten Kultivierungsbedingungen fermentiert, um ein optimales Wachstum zu erzielen. Der araB-Promotor wird erst bei Behandlung mit L-Arabinose aktiv, die den Promotor zur Auslösung der Expression des heterologen Gens induziert. Die Schrittfolge umfaßt die Transcription des Gens in mRNA und deren Translation zu Polypeptidprodukt(en).
In einem anderen Ausführungsbeispiel dieser Erfindung ist der araB-Promotor funktionsfähig mit einer genetischen Sequenz verbunden, die für ein heterologes Polypeptid codiert, das biologisch aktiv ist, und diese genetische Sequenz ist funktionsfähig mit einer zweiten genetischen Sequenz verbunden, die für ein anderes Polypeptid codiert. Die Expression ergibt ein Fusions oder Vorläuferprotein, das sowohl die Aminosäuresequenz des zweiten Polypeptids als auch jene des gewünschten heterologen Polypeptids umfaßt und eine selektive Spaltstelle enthält, die an die gewünschte Aminosäuresequenz angrenzt.
Die Spaltstelle ist vorzugsweise Methionin, obwohl die Stelle jede bevorzugte Stelle sein kann, die in der Wissenschaft bekannt ist. Das gewünschte heterologe Polypeptid sollte vorzugsweise keine inneren Spaltstellen aufweisen, die der tatsächlich gewählten Spaltstelle entsprechen. Zu anderen bekannten Spaltstellen zählen Asn-Gly, Asp-Pro, Lys, Arg und Lys-Arg.
Die selektive Spaltung des Fusions- oder Vorläuferproteins wird üblicherweise außerhalb der replikativen Umgebung des Expressionsvektors durchgeführt. In diesem posttranslationalen Schritt wird das Fusions- oder Vorläuferprotein durch selektive Behandlung abgeschnitten. Wenn zum Beispiel die Spaltstelle Methionin ist, wird das Fusions- oder Vorläuferprotein zum Abschneiden des gewünschten heterologen Polypeptids mit Bromcyan behandelt. Bei anderen bekannten Spaltstellen umfaßt die Schnittbehandlung Hydroxylamin, Säure, Trypsin und Lys-Arg-Spaltenzym.
Verfahren zur Herstellung fusionierter, funktionsfähig verbundener Gene und zur Expression dieser in Bakterien sind bekannt und zum Beispiel in U.S. 4.366.246 angeführt, auf das hierin Bezug genommen wird.
Die genetischen Konstruktionen und die Verfahren, die hierin verwendet werden, können zur Expression der heterologen Polypeptide in bakteriellen Wirten eingesetzt werden.
Zum Beispiel sind E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31446) und Stamm MC1061 (ATCC 39450) besonders zweckmäßig. Andere mikrobielle Stämme, die verwendet werden können, umfassen E. coli X1776 (ATCC 31537), sind aber nicht darauf beschränkt. Es können die zuvor genannten Stämme, wie auch E. coli W31 10 (F, Lambda, prototroph (ATCC 27325)), und andere Enterobakteriaceae wie S. typhimurium oder Serratia marcescens und verschiedene Pseudomonasaaten verwendet werden.
Im allgemeinen werden Plasmidvektoren, die Replikon- und Kontrollsequenzen enthalten, die von Arten, die mit der Wirtszelle vereinbar sind, stammen, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor weist normalerweise eine Replikationsstelle auf wie auch spezifische Gene, die eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen gewährleisten können. Zum Beispiel wird E. coli üblicherweise unter Verwendung von pBR322 transformiert, einem Plasmid, das von einer E. coli-Art abgeleitet wird (Bolivar, etal., Gene, 2 : 95 (1977)). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und bietet somit ein leichtes Mittel zur Identifikation transformierter Zellen. Das pBR322-Plasmid, oder andere mikrobielle Plasmide, muß auch Promotoren enthalten oder modifiziert sein, um diese zu enthalten, die von dem mikrobiellen Organismus zur Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden können.
Der araB-Promotor kann funktionsfähig mit einer genetischen Sequenz verbunden sein, die für jedes heterologe Polypeptid oder Protein codiert, das biologisch aktiv ist. Zu Beispielen solcher Polypeptide oder Proteine zählen Enzyme, Hormone, Hämoglobin, Antikörper, Strukturproteine, Alpha-, Beta- und Gamma-Interferone, Interleukine, Insulin und Gewebsplasminogenaktivatoren, sind aber nicht auf diese beschränkt. Zu spezifischen Beispielen zählen der menschliche Tumorwachstumsfaktor, Calcitonin und Cecropin.
Der transformierte Wirt kann mit in der Wissenschaft bekannten Mitteln fermentiert und kultiviert werden, um ein optimales Zellwachstum zu erzielen. Das bevorzugte Fermentations und Herstellungsverfahren dieser Erfindung, das in der Folge beschrieben wird, kann zur Durchführung einer Herstellung heterologer Polypeptide im großtechnischen Maßstab verwendet werden. Zusätzlich wird das Ausmaß der Expression des heterologen Gens durch Verwendung des araB-Promotors, der mit dem heterologen Gen funktionsfähig verbunden ist, erhöht.
Das bevorzugte Fermentationsverfahren ist wie folgt: Der transformierte Wirt, vorzugsweise Bakterien, besonders bevorzugt E. coli, wird in ein Kulturmedium eingebracht, daß Nährmaterialien enthält, die den Wachstumsanforderungen des Bakteriums entsprechen. Solche Materialien können Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Mineralien, Aminosäuren, Purine, Pyrimidine und Vitamine enthalten. Das bevorzugte Kulturmedium umfaßt auch einen Metabolit in einer für die phänotypische Markerresistenz ausreichenden Menge, wobei ein solcher Metabolit zum Beispiel Tetracyclin oder Ampicillin ist. Der Wirt wird unter Kultivierungsbedingungen vermehrt, die so gewählt werden, daß eine maximale Wachstumsrate erzielt wird. Die Temperaturbedingungen hängen von dem Wirt ab, der optimale Bereich beträgt aber üblicherweise etwa 30ºC bis etwa 40ºC, wobei 37ºC für transformierte E. coli besonders bevorzugt wird. Dem Medium wird auch Sauerstoff zugegeben. Der Wirt wird bis in die späte Expenentialphase wachsen gelassen und dann in ein frisches Kulturmedium übertragen.
Die Wirte werden dann mit Produktionskulturmedium beimpft. Während dieses Schrittes teilen sich die Bakterien und wachsen weiter, bis die Bakterien eine Konzentration, Sättigungsdichte erreichen, bei der sich die Bakterien nicht mehr teilen, aber noch lebensfähig sind. Die Zeit, die zur Erzielung der Sättigungsdichte ausreicht, hängt von dem Medium, dem Genotyp des Wirtes, der Temperatur und dem Maß der Belüftung ab.
Zu Beginn sind die Fermentations- und Kultivierungsbedingungen für den Produktionsschritt dieselben wie oben im Kultivierungsschritt, mit der Ausnahme, daß, da während des Wachstums gelöster Sauerstoff verbraucht wird, die Rührgeschwindigkeit und Belüftungsrate entsprechend erhöht werden, um ein Minimum an gelöstem Sauerstoff (D.O.) bei 30% aufrechtzuerhalten. Der bevorzugte pH-Bereich beträgt etwa 6 bis 8. Der pH des oben beschriebenen Produktionsmediums stellt sich durchwegs selbst bei 6,5 - 6,8 ein, einem optimalen Wert für das E. coli-Wachstum. Somit ist keine Säure- und Basenkontrolle des pH-Mittels für den E. coli-Wirt erforderlich; bei anderen Wirten kann jedoch eine Einstellung des pH-Mittels notwendig sind. Sobald eine optimale Zelldichte erreicht ist, im besten Fall OD&sub6;&sub0;&sub0;¹&sup0; für E. coli, wird L-Arabinose in einer Menge zugegeben, die zur Auslösung der Synthese des heterologen Gens zur Bildung des Polypeptids ausreicht. Wie zuvor beschrieben, bildet das Polypeptid Einschlußkörper in dem Wirt. Das Peptid wird dann durch in der Wissenschaft bekannte Mittel wie Filtern oder Ausfällen gewonnen. Wenn das erhaltene, exprimierte, heterologe Peptid ein Fusionsprotein ist, wird das Fusionsprotein gewonnen und kann dann in einem pesttranslationalen Schritt zur Abtrennung des gewünschten heterologen Polypeptids behandelt werden. Das heterologe Polypeptid kann dann mit bekannten Mitteln gewonnen und gereinigt werden.
Die Verwendung des araB-Promotors wird der Einfachheit wegen mit Bezugnahme auf verschiedene Ausführungsformen der Erfindung, die Cecropin umfassen, beschrieben, obwohl es so zu verstehen ist, daß der araB-Promotor mit einer genetischen Sequenz funktionsfähig verbunden werden kann, die für jedes Polypeptid oder Protein codiert, das biologisch aktiv ist.

2. Mikrobielle Herstellungsverfahren von Cecropinen unter Verwendung

Cecropin-sensitiver Wirte

Ein Teil der vorliegenden Erfindung schafft auch mikrobielle Herstellungsverfahren von Cecropinen unter Verwendung Cecropin-sensitiver Wirte. Ein Gedanke der Erfindung ist die Expression einer Gensequenz, die für Cecropin codiert, während gleichzeitig die bakteriziden Wirkungen des Produkts vermieden oder verzögert werden.
In einer Ausführungsform wird die genetische Sequenz, die für Cecropin codiert, mit einem induzierbaren Promotor verbunden und die erhaltene genetische Konstruktion in einen Expressionsvektor eingefügt. Der Expressionsvektor wird dann zur Transformierung eines geeigneten Wirtes verwendet, und der Wirt wird unter normalen Bedingungen fermentiert, wobei der Promotor nicht aktiv ist. Nach einem angemessenen Zeitraum, wie zum Beispiel zu einem Zeitpunkt, zu dem sich die Zellen in einer stationären Phase befinden, wird der Promotor induziert, wie zum Beispiel durch Veränderung eines äußeren Umgebungsfaktors, wie der Salzkonzentration, des Lichts, des Vorhandenseins oder Fehlens eines Metaboliten, eines Metalls und dergleichen, wobei diese Veränderung zu einer Transcription der genetischen Cecropinsequenz zu mRNA führt und dann zu deren Translation zu bakterizidem Cecropin. Selbst wenn das erhaltene Cecropin bakterizid ist und den bakteriellen Wirt zerstört, tritt eine derartige Zerstörung erst spät im Fermentationszyklus ein. Beispiele für regulierte Promotoren sind Lambda PL und PR, lac, gal, trp, ara, hut und dergleichen.
Bei der zweiten bevorzugten Ausführungsform wurde entdeckt, daß, wenn eine genetische Sequenz, die für Cecropin codiert, funktionsfähig mit einem Polypeptid, das sich von Cecropin unterscheidet, verbunden wird, so daß die Expression ein Fusions- oder Vorläuferprotein ergibt, das sowohl die Aminosäuresequenz von Cecropin als auch jene des zusätzlichen Polypeptids umfaßt und eine selektive Spaltstelle enthält, die an die gewünschte Cecropin-Aminosäuresequenz angrenzt, das erhaltene Fusionsprotein nicht bakterizid ist. Bakterizid aktives Cecropin kann dann posttranslational durch selektives Spalten isoliert werden.
Üblicherweise wird die Spaltung außerhalb der replikativen Umgebung des Expressionsvektors durchgeführt, wie zum Beispiel nach dem Ernten der mikrobiellen Kultur. So nimmt das zusätzliche Polypeptid dem Cecropin die bakterizide Wirkung bis zur extrazellulären Spaltung, wodurch der Wirt lange genug überleben kann, um hohe Ausbeuten des gewünschten Produkts zu liefern. Vorzugsweise fehlen dem Cecropin innere Spaltstellen, die der selektiven Spaltstelle entsprechen, die zur Abtrennung des überflüssigen Polypeptids dient, obwohl dies nicht unbedingt eine absolute Bedingung ist. Da die Cecropine frei von Methionin sind, ist eine Bromcyanspaltung bei dem Methionin, das an die Cecropinsequenz angrenzt, effektiv.
Vorzugsweise wird die genetische Sequenz, die für das überflüssige Polypeptid codiert, vor dem Strukturgen des Cecropins transcribiert, aber das muß nicht unbedingt der Fall sein, da es auch möglich ist, das überflüssige Polypeptid in einer Position zu exprimieren, die an den C-Terminus des Cecropins angrenzt.
Die Art des überflüssigen, angrenzenden Polypeptids ist nicht entscheidend. Es kann entweder ein Teil, die Gesamtheit oder sich wiederholende Einheiten von bekannten Struktur-, enzymatischen, hormonalen oder anderen physiologisch relevanten Proteinen sein. Es kann aber auch ein nichtfunktionales Polypeptid sein. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, nehmen die Erfinder an, daß die größere Länge des Fusionsproteins die bakteriziden Eigenschaften des Cecropins aufgrund der unterschiedlichen Konformation des gesamten Polypeptids irgendwie "maskiert". Vorzugsweise sollte die genetische Sequenz, die für das angrenzende, überflüssige Polypeptid codiert, eine Länge von zumindest mehr als etwa 300 Basenpaaren, vorzugsweise zwischen etwa 400 bp und 5 Kb, besonders bevorzugt zwischen 400 bp und 2 Kb aufweisen. Dies entspricht einem überflüssigen Polypeptid mit vorzugsweise etwa 100-1700 Aminosäureresten.
Es kann jede aus einer großen Zahl überflüssiger Polypeptide an die gewünschte Cecropin-Peptidsequenz fusioniert werden. Die Polypeptid-Gensequenz kann entweder durch organische Synthese hergestellt werden, wobei Optimierungsverfahren empfohlen werden, oder durch Techniken wie die reverse Transcription geeigneter mRNA erhalten werden. Der Herstellung der cDNA folgte dann eine enzymatische Kopplung der Gensequenz für das Polypeptid an die Gensequenz für das Struktur-Cecropinpeptid. Die enzymatische Kopplung kann entweder durch Ligation stumpfer Enden oder durch die Schaffung kohäsiver Termini erfolgen, die einen der beiden Stränge einer Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle umfassen. Beispiele für überflüssige Polypeptide sind Beta-Galactosidase oder Ribulokinase (für das das araB-Gen codiert). Enzyme und Strukturproteine werden bevorzugt. Andere Produkte, die verwendet werden können, sind Produkte, für die folgende Gene codieren: aceA oder aceB, araA, araB, araC, araD, argG, aroB, lacA, serA, purA, trpA, trpB, trpC, trpD, trpE, tyrA und dergleichen. Das überflüssige Polypeptid ist üblicherweise frei von Glykosylierung. Der araB-Promotor ist der zu verwendende Promotor.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die genetische Cecropinsequenz funktionsfähig mit der Sequenz für ein überflüssiges Polypeptid verbunden, das in dem Fusionsprodukt die bakterizide Aktivität von Cecropin hemmen oder inaktivieren kann, sowie zusätzlich mit einem induzierbaren Promotor. Auf diese Weise kann sowohl die Wirkung, die durch die Fusionsproteintechnik erzielt werden kann, als auch die Wirkung, die durch Verwendung des induzierbaren Promotors erzielt werden kann, vorteilhaft und gleichzeitig genützt werden.
Die vorliegende Erfindung führt zwar zu Verfahren zur Herstellung von Cecropinen in Cecropin-sensitiven Wirten, z. B. bakteriellen Wirten, aber die genetischen Konstrukte, die hierin hergestellt werden, und die verwendeten Verfahren können auch zur Expression von Cecropin in anderen, nicht Cecropin-sensitiven Wirten verwendet werden. Zu diesen nicht Cecropin-sensitiven Wirten zählen Hefen und Säugetierzellkulturen. Zweckmäßige Hefe- und Säugetierwirte und Vektoren sind dem Fachmann bestens bekannt und es wird zum Beispiel auf die Europäische Patentveröffentlichung 0093619, veröffentlicht am 9. November 1983, Bezug genommen. Zu bakteriellen Wirten können die zuvor mit dem araB-Promotor genannten zählen wie auch bakterielle Wirte, wie zum Beispiel die Gattungen Pseudomonas, Citrobacter, Xanthomonas und Erwinia. Es kann jeder Plasmidvektor, der mit diesen Wirten vereinbar ist, wie oben bei dem araB-Promotor beschrieben wurde, verwendet werden.
Ein weiterer bevorzugter Promotor für Cecropin ist Lambda (PL). Das genetische Konstrukt für Cecropin und das überflüssige Polypeptid kann unter die Kontrolle des linken Promotors von Bakteriophage Lambda (PL) gestellt werden. Dieser Promotor ist einer der stärksten bekannten Promotoren, die kontrolliert werden können. Die Kontrolle wird von dem Lambda-Repressor ausgeübt und angrenzende Restriktionsstellen sind bekannt. Ein temperaturempfindliches Allel von CI-Gen kann auf den Vektor plaziert werden, der die vollständige Cecropinsequenz enthält, oder einen anderen Vektor. Wenn die Temperatur auf 42ºC angehoben wird, ist der Repressor inaktiviert und der Promotor wird mit maximalem Wert exprimiert. Die Menge der unter diesen Bedingungen hergestellten mRNA sollte ausreichend sein, um eine Zelle zu erhalten, die etwa 10% der neu synthetisierten RNA enthält, die von dem PL-Promotor stammt. Bei diesem Weg ist es möglich, eine Bank von Klonen zu erstellen, in die eine funktionelle Cecropin-Fusionskonstruktsequenz angrenzend an eine Ribosombindesequenz und mit unterschiedlichen Abständen zum Lambda-PL-Promotor angeordnet wird. Diese Klone können dann durchmustert und jener mit der höchsten Ausbeute kann ausgewählt werden.
Die Expression einer Cecropinsequenz kann auch unter die Kontrolle anderer Regulone gestellt werden, die zu dem Organismus in seinem nichttransformierten Zustand "homolog" sein können. Zum Beispiel enthält die chromosomale DNA von E. coli ein Lactose- oder lac-Opewn, das die Lactosedigestion durch Aufbau des Enzyms Beta-Galactosidase vermittelt. Die lac-Kontrollelemente können von Bakteriophage Lambda plac5 erhalten werden, der für E. coli infectiv ist. Das lac-Operon des Phagen kann durch Transduction von denselben bakteriellen Arten erhalten werden. Regulons, die zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung geeignet sind, können von zu dem Organismus nativer Plasmid-DNA abgeleitet werden. Das lac-Promotor-Operatorsystem kann durch IPTG induziert werden.
Bei der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung synthetischer Polynucleotidsequenzen, die für die Cecropinpeptide codieren, von besonderem Interesse. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die synthetische Sequenz des Cecropinpeptids (mit oder ohne angrenzende Sequenzen) optimiert, so daß deren Expression mit einer Reihe von Wirten wie Hefen und Bakterien vereinbar ist, besonders mit den letzteren. Insbesondere ist die Optimierung der Expression jeder bestimmten Sequenz in E. coli von großer Bedeutung. Somit unterscheidet sich nach der Durchführung solcher Optimierungsverfahren, wie oben angegeben, die tatsächliche genetische Sequenz der Cecropinpeptide mit oder ohne angrenzende Sequenzen von der in der ursprünglichen Art natürlich vorkommenden Sequenz.
Zusätzlich sollte die Konstruktion des gewünschten Gens für das fusionierte Produkt vorzugsweise Codons für Aminosäuren an der Spaltstelle wie Methionin (spaltbar durch Bromcyan), Tryptophan (spaltbar durch o-Jodosobenzoesäure), Glutaminsäure (spaltbar durch Staph. Protease) und dergleichen enthalten.
In einer Ausführungsform der Erfindung kann jedes bestimmte Codon in der gewünschten DNA-Sequenz für das Fusionsprodukt willkürlich durch ortsspezifische Mutagenese mutagenisiert werden. Es ist daher möglich, nach der Synthese der gewünschten DNA-Sequenz eine spaltbare Stelle in die Sequenz einzuführen. Ortsspezifische Mutagenese ist bekannt und es wird auf Wallace et al., Science, 209: 1396-1400 (1980) verwiesen, welche Veröffentlichung hierin durch Bezugnahme eingeführt wird.
Auf den oder die Aminosäurereste, die auf den potentiellen C-terminalen Rest in dem Cecropinpeptid folgen, kann wiederum ein anderes Polypeptid folgen ("schwanzbildendes" Polypeptid) mit unterschiedlicher Länge und einer Struktur, die dem führenden Polypeptid ähnlich ist oder sich von diesem unterscheiden, falls dies vorhanden ist, wie zuvor beschrieben wurde. In einem solchen Fall ist es angemessen, dieselben oder unterschiedliche selektive Spaltstellen zwischen dem C-terminalen Aminosäurerest und der schwanzbildenden Polypeptidsequenz zu schaffen. Diese spaltbaren Stellen sind jenen, die zwischen dem führenden Polypeptid und dem Strukturgen für das Cecropinpeptid liegen, gleich oder nicht.
Mit anderen Worten, das überflüssige Polypeptid kann als führendes Peptid, schwanzbildendes Polypeptid oder beides vorhanden sein.
Wenn das Strukturgen des gewünschten Cecropinpeptids in einen Vektor zur Expression als solches eingesetzt werden soll, geht dem Gen ein "Start-" Codon voran, und wenn schwanzbildende Sequenzen folgen, ein oder mehr Terminations- oder Stoppcodons. Wenn das Expressionsprodukt ein Fusionsprotein ist, das sowohl das Cecropinpeptid als auch einen Teil oder die Gesamtheit eines Polypeptids umfaßt, kann das Startcodon vor dem N-Terminus des Polypeptids angeordnet werden, wenn es führend ist.
Verfahren für die Synthesen von Polynucleotiden sind dem Fachmann gut bekannt. Es wird zum Beispiel auf das Triester Verfahren von Itakura etal., Journal of American Chemical Society, 97 : 3727 (1975), Bezug genommen.
Die Cecropine, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, können als breite antimikrobielle Mittel verwendet werden, die auf spezifische Anwendungen ausgerichtet sind. Zu solchen Anwendungen zählen zum Beispiel die Verwendung der Cecropine als Konservierungsmittel in verarbeiteten Fleischprodukten (Zielorganismen: (1) Clostridium botulinum, (2) Lactobacilli, (3) Micrococci); kariesbekämpfende Mittel in Mundhygieneprodukten (Zielorganismus: Streptococcus mutans); Mittel, die in der Behandlung vaginaler Hefeinfektionen zweckdienlich sind (Zielorganismus: Candida albicans); und als antibakterielle Mittel in Deodorants (Zielorganismen: (1) Micrococci, (2) Diphtheroide). Die relative Wirksamkeit von cecropinähnlichen Peptiden für die beschriebenen Anwendungen kann leicht von einem Fachmann durch Bestimmung der Empfindlichkeit jedes Organismus gegenüber einem der Cecropinpeptide bewertet werden. Dieselbe bakterielle Durchmusterung, die in vitro verwendet wird, kann zur Bestimmung der Dosierungen und Konzentrationen herangezogen werden.
Nachdem diese Erfindung nun im allgemeinen beschrieben wurde, wird sie mit Bezugnahme auf ein spezifisches Beispiel, das hierin ausschließlich der Veranschaulichung dient und, falls nicht anders angegeben, nicht als Einschränkung gedacht ist, verdeutlicht.

VERFAHREN

Aminosäurezusammensetzungen

Die Hydrolyse von Cecropinpelypeptiden wurde unter Verwendung von 5,5 M HCl (Pierce) bei 110º 24 Stunden in vacuo durchgeführt. Proben wurden unter Vakuum bei 40ºC getrocknet und in 200 ul Beckman Model 6300 Probenpuffer (Citrat mit geringem pH) resuspendiert.
Die Aminosäurenalyse wurde unter Verwendung eines Beckman Model 6300 Analysators durchgeführt. Für den Nachweis wurde säulennachgeordnetes Ninhydrin verwendet. Die Daten wurden unter Verwendung eines Hewlett Packard (HP) Integrators, Model 3390 aufgezeichnet. Die einzelnen Spitzen wurden als Summe der Signale bei 540 und 440 nm aufgezeichnet. Beckman-Standards, die jede Aminosäure enthalten, wurden zur Kalibrierung des Integrators verwendet und zur Verifizierung der Kalibrierung wurde Spermölmyoglobin (Applied Biosystems) verwendet.

Proteinsequenzierung

Für alle Proteinsequenzbestimmungen wurde ein Applied Biosystems Model 470A Proteinsequenator verwendet. Die Spezifikationen für die Sequenzierungsmethodologie folgen dem Hunkapiller-Hood-Programm. Das System verwendet ein Nichtvakuum-Programm mit Spaltung durch methanolische HCl.

PTH-Bestimmungen

PTH-Bestimmungen wurden unter Verwendung einer HP Model 1090A HPLC mit einem HP Model 3390A Integrator zur Datenpräsentation durchgeführt. Eine IBM Cyanopropylsäule wurde zur Trennung der PTH-Aminosäuren verwendet. Der Puffer war 30 mM NaHAc, pH 5,1, enthaltend 5% Tetrahydrofuran. Die Fließgeschwindigkeit betrug 1 ml/Min. und die Temperatur 37ºC.
Die Proben wurden nach dem Trocknen in vacuo mit 30 ul 33% Acetonitril in Wasser 30 Min. gelöst. Die verwendeten PTH-Standards stammten von Pierce Chemical Co.

BEISPIEL 1

Synthese und Klonierung eines synthetischen Cecropin A- (CA-) Gens

A. Synthese des CA-Gens

Ein Gen, das für CA codiert, wurde mittels Computer so konstruiert, daß es Codons enthielt, die normalerweise in hoch exprimierten E. coli-Proteinen vorhanden sind. Am Ende des Gens wurden 4-bp Überhänge eingegliedert, so daß die Ligation der SalI- bzw. EcoRI-Stelle möglich war. Zur Erleichterung der Konstruktion verschiedener Größen von fusionierten Proteinen wurde nach der SalI-Stelle eine BamHI-Stelle eingefügt. Durch Verwendung eines Computerprogramms wurden auch Optimierungsverfahren, wie zuvor beschrieben, berücksichtigt. Das Gen wurde in acht Oligonucleotide unterteilt, deren Länge 23 bis 37 Basen betrug (Fig. 1).
Die acht einzelsträngigen DNA-Fragmente wurden nach dem Festphasen-Phosphotriesterverfahren, wie von Ito, et al., Nucleic Acids Research, 8: 5491(1982), beschrieben, synthetisiert.
Es wurden verschiedene Modifikationen und Verbesserungen einschließlich der folgenden durchgeführt:
1) Die Kopplungsreaktion wurde bei 37ºC 40 Minuten mit leichtem Schütteln ausgeführt.
2) Für die Deprotektion der DNA nach der abschließenden Kopplungsrektion wurde das DNA-Harz (10 mg) mit einer 0,5 M 2-Pyridinaldoxim-tetramethyl Guanidiniumlösung (2 ml) in Pyridinwasser (8 : 2 V/V) 60 Stunden bei 37ºC unter Schütteln zur Reaktion gebracht. Die kombinierte Lösung wurde verdampft und mit NH&sub4;OH (28%, 3 ml) in einer verschlossenen Ampulle bei 60ºC 36 Stunden behandelt. Nach dem Verdampfen des Ammoniaks wurde die Lösung dreimal mit Ether extrahiert und danach verdampft. Für die Reinigung der DNA wurde der Rückstand in 0, 1 ml 50 mM Triethylammoniumbicarbonat, pH 7,5 (TEAB) gelöst und auf eine Sephadex G-50 Säule (1 · 50 cm) aufgebracht. Es wurden Fraktionen mit einem ml gesammelt. Die ersten wenigen Fraktionen, an der vorderen Kante der 260 nm Absorptionshauptspitze enthielten das gewünschte Produkt. Diese Fraktionen wurden verdampft, dann durch Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) weiter gereinigt. Die HPLC-Reinigung wurde auf einer Bondapak C18R- (Waters) Säule bei 55ºC unter Verwendung eines linearen Gradienten von Acetonitril (10-40%) in 10 mM Triethylammoniumacetatpuffer (pH 7,8) durchgeführt. Die DMT-Gruppe wurde durch Behandlung mit 80% Essigsäure (0, 1 ml) 25 Minuten bei Raumtemperatur mit anschließender Verdampfung hydrolysiert und dann mit 0,1 ml Wasser verdampft, um die Essigsäure vollständig zu entfernen.

B. CA-Genzusammenfügung durch Ligation

Die 5'OH-Termini der chemisch synthetisierten Fragmente 1 bis 8 wurden getrennt in Gegenwart von 10 ul Lösung phosphoryliert, die folgendes enthielt:
10 mM Tris-HCl (pH 7,6)
10 mM MgCl&sub2;
5 mM Dithiothreitol
66 uM Gamma-32p-ATP (1 uCi)
400 ng DNA und 2 Einheiten T4 Polynucleotidkinase
Die Reaktion wurde 15 Minuten bei 25ºC gehalten und dann wurde zur Fortsetzung der Reaktion um weitere 15 Minuten 1 ml 10 mM nichtmarkiertes ATP beigegeben. Zur Prüfung der Reinheit wurden 10% der phosphorylierten DNA durch das Standardverfahren unter Verwendung von Polyacrylamidgel- (15%) Elektrophorese in Gegenwart von 7M Harnstoff analysiert. Vierhundert ng der phosphorylierten DNA-Fragmente 2, 3, 4, 5, 6 und 7 wurden fünf Minuten zur Inaktivierung der T4 Polynucleotidkinase bei 95ºC erwärmt. Dann wurden 400 ng der unphosphorylierten Fragmente 1 und 8 zugegeben und weitere fünf Minuten bei 95ºC erwärmt und dann langsam auf 25ºC abgekühlt (1ºC pro 10 Min.). Die acht DNA-Fragmente wurden in einem Gesamtvolumen von 100 N¹ in Gegenwart von 66 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol, 0,4 mM ATP und 2 Einheiten T4 DNA-Ligase zwei Stunden bei 25ºC ligiert.

C. Konstruktion der Plasmide pING1. pCA1A. pCA1B und pCA1'

Das Konstruktionsschema ist in Fig. 2 dargestellt.
pMH6 ist in Horwitz, A. H. etal., Gene, 14 : 309-319 (1981), beschrieben und M13mp9 ist im Handel erhältlich.
1. Die CA-Genfragmente, die in Schritt B, supra, erhalten wurden, wurden an Plasmid pING1 ligiert, das mit der Restriktionsendonuclease SalI und EcoRI vorbehandelt und dann mit Restriktionsendonuclease SmaI zur Verringerung der Transformanden, die pING1 enthalten, digeriert wurde.
2. Das mit SmaI behandelte Plasmid wurde in E.coli MC1061 transformiert.
3. Die Kolonien, die Plasmide mit dem CA-Genfragment enthielten, wurden durch Koloniehybridisierung unter Verwendung des synthetischen DNA-Fragments 7 (Fig. 1) als Sonde identifiziert. Drei unabhängige Klone, die das CA-Fragment enthielten, wurden in 1.000 Kolonien nachgewiesen. Jedes der isolierten Plasmide wurde mit SalI und EcoRI zur Prüfung der Größe des ausgeschnittenen Fragments digeriert. Die Nulceotidsequenzanalyse des CA-Inserts wurde durch das Didesoxy-Kettenabbruchsverfahren von Sanger et al., PNAS 74 : 5463-5467 (1977), mit einigen Abänderungen (Wallace et al., Gene, 16 : 21-26 (1981)) durchgeführt. Es wurden zwei Sequenzen bestimmt, die in Fig. 7(2) und 7(3) dargestellt sind. Die Plasmide, die diese Sequenzen enthielten, wurden als pCA1A und pCA1B bezeichnet (Fig. 2). Jede dieser Sequenzen unterschied sich von der Wildtyp-CA-Sequenz an den Position, die durch die Pfeile in Fig. 7(2) und 7(3) angezeigt werden.
Zur Erzeugung einer Wildtyp-Sequenz können verschiedene Verfahren angewendet werden, zum Beispiel die in vivo oder in vitro Rekombination von pCA1A und pCA1B oder das Auslesen zusätzlicher unabhängiger Klone. Das Plasmid, das die vorgeschlagene Wildtypsequenz enthält, wird als pCA1' bezeichnet (Fig. 2).
In der folgenden Beschreibung bezeichnen Plasmide mit Strich (') Wildtyp-CA-Sequenzen, während Plasmide ohne Strich von Mutanten pCA1A oder pCA1B abgeleitet sind.

D. Konstruktion der Plasmide pCA2', pCA2A, pCA3', pCA3A und pCA3B

Dies ist in Fig. 3 dargestellt. pCA1 (oder pCA1A oder pCA1B) wird mit BamHI digeriert und ergibt nach Behandlung mit Polymerase plus dTNP mit anschließender SstI-Digestion ein Fragment (1), das an einem Ende ein stumpfes Ende aufweist und an dem anderen einen SstI-Überhang. Dieses Fragment wird mit einem Fragment, das von pMH6 durch NarI-Digestion, Bildung eines stumpfen Endes und SstI Behandlung erhalten wird, ligiert, um nach der T4-Ligation pCA3' (oder pCA3 oder pCA3B) zu erhalten. Das Fragment (1) wird auch mit einem Fragment ligiert, das von pMH6 durch HgiAI-Digestion, Bildung eines stumpfen Endes und SstI-Behandlung erhalten wurde, um nach der T4-Ligation pCA2' (oder pCA2A) zu erhalten.
Die gewünschten Produkte werden durch Transformation von E. coli MC1061 mit den Ligationsprodukten erlangt. Die Plasmide werden durch das obengenannte Minilysatverfahren isoliert. Jedes der isolierten Plasmide wird mit BamHI bzw. PstI digeriert. Plasmide von jeder Gruppe mit richtiger Größe und richtiger Orientierung des BamHI-Fragments werden als pCA2 (oder pCA2A) und pCA3' (oder pCA3A oder pCA3B) bezeichnet.

E. Expression des araB-CA-Fusionsproteins

E. coli-Zellen die araB-CA fusionierte Gene in Plasmiden pCA1A, pCA2A, pCA3A, pCA3B und pCA3D (zu beachten: pCA3D wird in der Folge austauschbar zur Bezeichnung eines Wildtyp-CA-hältigen Plasmids pCA3' verwendet) enthielten, wurden bei 37ºC in einem Medium vermehrt, das 1,5% Trypton, 1,0% Hefeextrakt und 0,5% NaCl (TYE) mit Ampicillin bei 50 ug/ml enthielt. Bei Zelldichten von OD&sub6;&sub0;&sub0;=0,2 wurden die Kulturen mit L-Arabinose zu einer Endkonzentration von 0,5% behandelt, um die Expression des araB-CA-Fusionsproteins auszulösen, und wurden durch Zentrifugation bei 4000 rpm bei 4ºC über 20 Minuten in einem Beckman JS-4.2 Rotor geerntet, wenn die Zelldichte OD&sub6;&sub0;&sub0;=1,5 bis 1,7 erreichte. Die Zellen wurden einmal durch Resuspendierung im halben ursprünglichen Kulturvolumen von 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,6) gewaschen. Gewaschene Zellpellets, welche die Plasmide pCA1A, pCA2A und pCA3A enthielten, wurden in einem Zehntel Volumen Phosphatpuffer und 1% Natriumdodecylsulfät (SDS) extrahiert und auf einem 10% SDS-denaturierenden Polyacrylamidgel analysiert. Durch diese Analyse wurde nachgewiesen, daß E. coli-Kulturen, die Plasmid pCA3A enthielten, mehr araB-CA-Protein erzeugten, als entweder pCA1A- oder pCA2A-transformierte Kulturen.

F. Fraktionierung induzierter E. coli-Zellen, welche die Plasmide pCA3A, pCA3B und pCA3D enthalten

Die gewaschenen Pellets von Schritt E wurden in einem Zehntel des ursprünglichen Volumens von Phosphatpuffer resuspendiert, auf 0ºC abgekühlt und anschließend wurde die Zelle in einer French-press aufgespalten. Die subzellulären Komponenten wurden dann bei 4000 rpm bei 4ºC über 20 Minuten in dem Rotor zentrifugiert. Die Analyse des erhaltenen Überstandes und 4000 rpm Pellets auf einem 10% SDS-denaturierendem Polyacrylamidgel zeigte, daß das gesamte araB-CA-Fusionsprotein von pCA3A, 3B und 3D in dem 4K Pellet zu finden war.

6. Reinigung der synthetischen CA

a) Bromcyanspaltung

1. Die im vorangehenden Schritt erhaltene 4K-Pelletfraktion, die das araB-CA-fusionierte Protein enthielt, wurde mit 90% Ameisensäure gemischt, um 0,7-1,1 mg/ml Protein in 70% Ameisensäure zu erhalten. Es wurde ein zehnfacher Überschuß von Bromcyan (1 gm/ml Stamm in Acetonitril) auf Gewichtsbasis zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde mit Stickstoff gespült und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert.
2. Die Ameisensäure und das Bromcyan wurden unter einem Stickstoffstrom entfernt. Der Rückstand wurde in 70% Ameisensäure gelöst und noch zweimal unter einem Stickstoffstrom getrocknet.
3. Eine Lösung von 0, 1% Trifluoressigsäure in Wasser wurde zugegeben; dadurch wurde die gespaltene CA vollständig mit 1 mg Protein/ml gelöst.

b) Hochdruckflüssigchromatographie von Bromcyanfragmenten

Das mit Bromcyan gespaltene, fusionierte Protein wurde mittels HPLC zur Isolierung des Fragments vom CA-Teil des Moleküls chromatographiert. Es wurde eine C-18 Umkehrphasensäule (Waters) verwendet. Ein Gradient lief mit 0, 1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser (Puffer A) und 0, 1% TFA in Acetonitril (Puffer B). Das Ausgangselutionsmittel enthielt 20% Puffer B; 2 Minuten nach der Probeneinführung wurde ein Gradient mit 20% B bis 60% B über 60 Minuten gestartet. Die Fließgeschwindigkeit betrug 1 ml/Minute. Das Elutionsprofil wurde bei 280 nm aufgezeichnet. Verschiedene Spitzen in dem Chromatogramm des mit Bromcyan gespaltenen, fusionierten Proteins, die eluierten, wurden für den Test der bakteriziden Aktivität, wie in der Folge beschrieben (Fig. 4) gesammelt. H. pCA3A codiert für ein mutiertes Cecropin-Polypeptid Tabelle I Aminosäurezusammensetzung von Cecropin A, hergestellt durch pCA3A in E.coli Mutante A Aminosäure Experimentelle Werte Theoretische Werte nicht bestimmt
* Theoretische Werte: aus der DNA-Sequenzierungsanalyse jedes mutierten Klons erhalten
Die Nucleinsäure- und die Aminosäurensequenzen sind in Fig. 7 dargestellt.

BEISPIEL 2

Darstellung eines weiteren mutierten Cecropin-Polypeptids Die Zellen von Plasmid pCA3B wurden fraktioniert, CA-Sequenzen nachgewiesen und die synthetische CA wurde, wie in Beispiel 1, Abschnitte F-G, dargestellt, gereinigt und analysiert. Die Aminosäurezusammensetzung und die Sequenzdaten, die in Tabelle II angeführt sind, wiesen darauf hin, daß der zweite Klon auch eine CA-Gensequenz enthält, die für ein mutiertes Cecropin codiert. Tabelle II Aminosäurezusammensetzung von Cecropin A, hergestellt durch pCA3B in E. coli Mutante B Aminosäure Experimentelle Werte Theoretische Werte nicht bestimmt
* Theoretische Werte: aus der DNA-Sequenzierungsanalyse jedes mutierten Klons erhalten
Die Nucleinsäure- und die Aminosäurensequenzen sind in Fig. 7 dargestellt.

BEISPIEL 3

Konstruktion von Plasmid pCA3D, das für den Wildtyp von Cecropin A codiert

Das Konstruktionsschema ist in den Fig. 4 und 5 dargestellt.

A. Konstruktion von p19C

1. Das Plasmid pING1 wurde vollständig mit den Endonucleasen Fok1 und danach BamHI digeriert; der resultierende Aufschluß wurde durch Phenol/Chloroform- (Verhältnis 1 : 1) Extraktion gestoppt und der wässerige Rückstand wurde mit Ether gewaschen und dann durch eine Bio-GelR P-10-Säule zur Entfernung des Phenol/Chloroforms geleitet.
Der Fokl-Aufschluß ergab einen "CTAC" 5'-Überhang. Dieses 76 Basenpaare amHI, Fok1 -Fragment enthält den araB-Promotor.
2. Unter Verwendung desselben Verfahrens, wie in Beispiel 1, Schritt B beschrieben, wurde ein neues CA-Genfragment (siehe Fig. 6) konstruiert, mit der Ausnahme, daß die beiden DNA Fragmente Nr. 1 und 5 durch Nr. nn-1 und nn-5 ersetzt wurden (die Sequenz ist in Fig. 6 dargestellt), um einen "GATG" 5'-Überhang am N-Terminus und einen EcoRI-Stellen ATTT-Überhang am C-Terminus zu erzeugen.
3. pBR322 wurde vollständig mit den Endonucleasen BamHI und EcoRI digeriert. Der resultierende Aufschluß wurde wie beschrieben gestoppt.
4. Das BamHI-Fokl-Fragment aus Schritt 1, supra, und das neue CA-Gen von Schritt 2, supra, wurden an das größere BamHI-EcoRI-Fragment von pBR322 ligiert.
5. Das ligierte Produkt wurde mit Endonuclease HindIII zur Verringerung der Anzahl von Transformanden, die pBR322 enthalten, digeriert.
6. Das mit HindIII behandelte Plasmid wurde in E. coli MC1061 transformiert.
7. Die Kolonien, die Plasmide mit dem CA-Genfragment enthielten, wurden durch Koloniehybridisierung unter Verwendung des synthetischen DNA-Fragments 7 (Fig. 6) als Sonde identifiziert. In 1.000 Kolonien wurden drei unabhängige Klone nachgewiesen, die das CA-Fragment enthielten. Jedes der isolierten Plasmide wurde mit BamHI und EcoRI digeriert; ein Plasmid, das imstande war, das richtige Fragment freizusetzen, wurde p19C genannt. Die Nulceotidsequenzanalyse der CA-Inserts wurde durch das Didesoxy-Kettenabbruchsverfähren von Sanger et al., PNAS, 74 : 5463-6467 (1977), mit einigen Abänderungen (Wallace etal., Gene, 16: 21-26 (1981)) durchgeführt. p19C enthielt die richtige Sequenz für das CA-Gen. Das CA-Gen wurde direkt stromabwärts des araB-Promotors ohne irgendeine dazwischenliegende araB codierende Sequenz angeordnet.

B. Konstruktion von pCA0

1. Die BamHI-EcoRI-Fragmente von p19C wurden durch Digestion mit überschüssigen Mengen der Restriktionsendonucleasen EcoRI und BamHI zerschnitten. Die Plasmide wurden auch mit PvuI digeriert, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, daß die zerschnittenen Fragmente in dem nächsten Ligationsschritt wieder an das Plasmid ligiert werden könnten.
2. Die BamHI-EcoRI-Fragmente aus Schritt A.7 wurden an Plasmid PINGI ligiert, das mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und BamHI vorbehandelt worden war, und dann mit der Restriktionsendonuclease SmaI zur Verringerung des Transformanden, der pING1 enthält, digeriert.
3. Das mit SmaI behandelte Plasmid wurde in E.coli MC1061 tranformiert.
4. Die Kolonien, die Plasmide mit dem CA-Genfragment enthielten, wurden durch Plasmidkennzeichnung identifiziert. Jedes der isolierten Plasmide wurde mit BamHI und EcoRI zur Prüfung der Größe des ausgeschnitten Fragments digeriert. Ein Plasmid, das die richtige Größe besaß, wurde pCA0 benannt. Die Nucleotidsequenzanalyse der CA-Inserts wurde durch das Didesoxy-Kettenabbruchsverfahren durchgeführt. Dieses pCA0 enthielt die richtige Sequenz für das CA-Gen. Dieses pCA0, das das vollständige araB-Regulationsgen und CA-Gen enthielt, wird direkt nach dem araB-Promotor zur direkten Expression des Cecropin-A, ohne araB-CA-Fusionsprotein, angeordnet.

C. Konstruktion von Plasmid pCA3A- -1

Der Zweck dieser Konstruktion ist die Deletion der AvaI-PvuII-Region von pCA3A zur Eliminierung einer Xmn1-Stelle. Die Deletion vermag auch die Anzahl er Plasmidkopien in E. coli-Zellen zu erhöhen.
1. pCA3A wurde mit Endonuclease AvaI und PvuII digeriert und dann mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I in Gegenwart von dNTP aufgefüllt, so daß ein stumpfes Ende erhalten wurde.
2. Das Plasmid von Schritt 1 wurde religiert und dann mit AvaI und PvuII zur Verringerung der Anzahl von Transformanden, die das ursprüngliche pCA3A enthielten, digeriert.
3. Das mit AvaI und PvuII behandelte Plasmid wurde in E. coli MC1061 transformiert.
4. Kolonien, die Plasmide enthielten, deren AvaI-PvuII-Region deletiert wurde, wurden durch Koloniehybridisierung unter Verwendung des synthetischen DNA-Fragments 5'-TCATCAGCGTGGTCG-3' als Sonde identifiziert. In 50 Kolonien wurden 46 unabhängige Klone mit deletierter AvaI-PvuII-Region nachgewiesen. Jedes der isolierten Plasmide wurde mit Xmn1 zur Prüfung der Größe der ausgeschnittenen Fragmente digeriert. Eines der Plasmide, das die richtige Größe besaß, wurde pCA3A- -1 benannt.

D. Endgültiges Zusammenfügen von Plasmid pCA3D

p19C enthält die Wildtyp Cecropin-A-Sequenz, es fehlt ihm aber eine geeignete Restriktionsstelle am N-Terminus zur Erzeugung einer Proteinfusion mit araB.
pCA3A weist eine Deletion von zwei Basenpaaren auf, die in der Nähe des C-Terminus des CA-Gens auftritt, woraus sich eine Erzeugung eines mutierten araB-Ca fusionierten Proteins ergibt.
Diese beiden Plasmide wurden zur Konstruktion eines Plasmids rekombiniert, bei dem das Wildtyp-CA-Gen an araB fusioniert war, und Erzeugung eines araB-CA fusionierten Proteins.
Das Konstruktionsschema ist in Fig. 5 dargestellt.
1. Das Plasmid p19C (1 ug) wurde mit der Endonuclease Xmn1 vollständig digeriert; der resultierende Aufschluß wurde durch Erwärmen auf 65ºC über 10 Minuten gestoppt.
2. Das Plasmid pCA3A- -1 (0,1 ug) wurde mit der Endonuclease Xmn1 vollständig digeriert; der resultierende Aufschluß wurde durch Erwärmen auf 65ºC über 10 Minuten gestoppt.
3. DNA aus den Schritten D.1 und D.2 wurde vermischt und ligiert.
4. Das ligierte Produkt wurde mit PvuII zur Verringerung der Transformanden, die p19C enthielten, digeriert.
5. Das mit PvuII behandelte Plasmid wurde in E.coli MC1061 transformiert.
6. Die Kolonien, die Plasmide mit dem Wildtyp araB-CA-Gen enthielten und zur Erzeugung eines araB-CA fusionierten Proteins imstande waren, wurden durch DNA-Sequenzanalyse, wie zuvor beschrieben, identifiziert. Unter sieben analysierten Kolonien wurde eine erhalten, welche die Wildtyp-Sequenz enthielt, und pCA3D 15 benannt. Tabelle III Aminosäurezusammensetzung des Wildtyp- Cecropin A, hergestellt durch pCA3D in E. coli Aminosäure Experimentelle Werte Erwartete Werte nicht bestimmt
Die Nucleinsäure- und die Aminosäuresequenzen sind in Fig. 7 dargestellt.

BEISPIEL 4

Test der bakteriziden Aktivität

Es wurden Agarplatten (Durchmesser 8 cm) mit 6 ml TYE-Medium, das etwa 10- lebensfähig Zellen des Testorganismus enthielt, vorbereitet. In die Platten wurden Vertiefungen mit 2 mm Durchmesser gestanzt. Das Testmaterial wurde in 56 mM Phosphatpuffer (pH 6,6) gelöst und in jede Vertiefung wurden 3 ul eingebracht. Die Durchmesser der Hemmzonen, oder Höfe, um die Vertiefungen wurden nach einer Inkubation bei 25ºC über Nacht gemessen. Zur Bestimmung eines Standards einer Hofbildung wurde CA 1-33 Protein verwendet. 1 ug und 3 ug CA 1-33 bei Anwendungen in der Vertiefung verursachten Höfe mit Durchmessern von 8 mm bzw. 11 mm auf Medium, das mit E. coli, Stamm JF568 infundiert war. 10 ug und 30 ug Bromcyan-digeriertes pCA3A araB-CA Fusionsprotein verursachte Höfe mit Durchmessern von 7 mm bzw. 18 mm.
In diesem Test wurde auch Bromcyan-digeriertes, durch HPLC fraktioniertes Fusionsprotein aufgetragen. Es wurden verschiedene Spitzen untersucht und eine bestimmte Spitze war nachweislich bioaktiv. Andere bakterielle und Hefe-Stämme wurde auch in diesem Test untersucht. Bromcyan-digerierte und nichtdigerierte Fusionsproteinproben wurden in Mengen, die oben bei der Testung von E.coli Stamm JF568 beschrieben wurden, aufgebracht und die erhaltenen Hofdurchmesser gemessen.
Die Ergebnisse für alle erhaltenen Cecropine sind in Tabelle IV dargestellt. TABELLE IV Bioaktivität von CNBr-digerierten pCA3A, pCA3B, pCA3D Fusionsproteinisolaten (5 ug) und Ampicillin (750 ng) bei verschiedenen Bakterienstämmen, bestimmt durch Messung der Hofaktivität Hofaktivität in Millimetern Bakterienstamm Ampicillin * Wild Mutanten keine Hofaktivität

BEISPIEL 5

Fermentative Herstellung von Cecropin und Tumorwachstumsfaktor

Dieses Beispiel beschreibt die Fermentationsproduktion von Alpha-TGF (Tumorwachstumsfaktor) und von Cecropin unter der Kontrolle des araB-Proiiiotors in E. coli.
Der E. coli Stamm MC1061 enthält vom Plasmid stammendes, den araB-Promotor regulierendes araB-Alpha-TGF (pTGFS8) oder araB-Cecropin (pCA3D) Fusionsgen. Die Kulturen wurden bei 37ºC, 250 rpm in 100 ml TYE-Kulturmedium, das Ampicillin (0, 1 gm/l) enthielt, vermehrt. Die Kulturen wurden bis zur späten Exponentialphase, etwa 200 Kletteinheiten; Rotfilter; vermehrt. Die Kulturen wurden dann in einen 4-Liter Schüttelkolben mit Prallflächen eingebracht, der 900 ml frisches TYE-Medium enthielt. Die Inkubation wurde drei weitere Stunden fortgesetzt, bevor die Beimpfung in 9 Liter Produktionsmedium begann. Das Produktionsmedium umfaßt die in Tabelle V angeführten Inhaltsstoffe. Tabelle V Grundmedium Inhaltsstoffe Menge Zusätze Inhaltsstoffe Menge Caseinhydrolysat Glycerol Hefeextrakt Thiamin-HCl Ampicillin
Zunächst wurden die Produktionsfermentationsbedingungen auf 37ºC, 800 rpm und 1 vvm (Gefäßvolumen pro Minute) eingestellt. Da der gelöste Sauerstoff während der Wachstumsperiode verbraucht wurde, wurden sowohl die Rührgeschwindigkeit als auch die Belüftungsrate derart erhöht, daß ein Minimum von gelöstem Sauerstoff (D.O.) bei 30% aufrechterhalten wurde. Das pH dieses Mediums stellte sich durchwegs selbst bei 6,5 - 6,8 ein, einem optimalen Wert für das E. coli-Wachstum, so daß eine Säuren- und Basenregulierung des mittleren pH nicht erforderlich war. Etwa vier Stunden nach der Impfung in das Produktionsmedium erreichte die Zelldichte eine O.D.&sub6;&sub0;&sub0; von 10, als L-Arabinose (50 g) zur Auslösung der Synthese von Cecropin-Fusionsprotein beigegeben wurde. Der Nährlösung wurde 1 g Ampicillin bei einer O.D.&sub6;&sub0;&sub0; von 20 beigegeben, um die Stabilität des Expressionsvektors weiterhin zu gewährleisten.
Sowohl das Alpha-TGF als auch das Cecropin-araB-Fusionsprotein waren nur in der unlöslichen Fraktion der E. coli-Zellen vorhanden. Eine mikroskopische Untersuchung zeigte, daß sich unlösliche Einschlußkörper innerhalb der Zellen eine Stunde nach der Induktion gebildet hatten und während der Fermentation stabil blieben. Mehr als 95% der Zellen enthielten zumindest einen Einschlußkörper, der sich rasch mit zunehmender Zelldichte vergrößerte. Die Ausbeute der Zellmasse betrug 13,1 g (Trockengewicht) pro Liter. Von der Zellmasse waren etwa 30% das Fusionsprotein.

Beispiel 6

Konstruktion des E. coli-Vektors, bei dem die Expression des araB-hTGF-Fusionsproteins unter der Regulierung des S. typhimurium araB-Promotors steht

Der araB-Promotor wird von dem araC-Genprodukt positiv reguliert. L-Arabinose steht mit dem araC-Protein zur Bildung eines Aktivators in Wechselwirkung, der für die Expression des araB-Promotors erforderlich ist. Ein Plasmid, das die S. typhimurium araB- und araC-Gene enthält, wurde zur Konstruktion des araB-hTGF (menschlicher Tumorwachstumsfaktor Alpha) Expressionsvektors herangezogen. Die Strategie der Plasmidkonstruktion ist in Fig. 8 dargestellt. Das endgültige Plasmid phTGFs enthält eine araB-hTGP-Fusion, die für ein Protein mit 548 Aminosäuren codiert. E. coli, Stamm MC1061, das phTGFs enthält, wurde in Minimalgiycerol- (1%) Medium, das mit Caseinhydrolysat (0,5%) und Thiamin (1 ug/ml) ergänzt war, vermehrt. Sobald die Dichte der Kultur A600=0,2 erreichte, wurde L-Arabinose zu 1% zugesetzt und die Inkubation fünf Stunden fortgesetzt, bevor die Kultur geerntet wurde. Ein 55 KDal Protein, das etwa 10% des gesamten zellulären Proteins darstellt, wurde durch SDS-PAGE nachgewiesen.

BEISPIEL 7

Transcriptionsterminator 3'. der dem araB-hTGF-Gen zugegeben wird

Ein Transcriptionsterminator ist eine DNA-Sequenz, die bewirkt, daß eine RNA-Polymerase die Transcription stoppt. Die Anordnung eines Transcriptionsterminators am 3'-Ende des araB-hTGF-Gens verhindert die Expression eines oder mehrere unerwünschter Genprodukte stromabwärts des Transcriptionsterminators. Die Strategie der Plasmidkonstruktion ist in Fig. 9 dargestellt. Das endgültige Plasmid phT(3F58 enthält einen E. coli rrnB-Gen Transcriptionsterminator, der am 3'-Ende des araB-hTGF-Gens eingefügt ist. Wenn die teilweise gereinigten araB-hTGF-Proteine, die von dem E. coli Stamm MC1061 isoliert wurden, entweder phTGF58 oder phT6F5 (das Elternplasmid) enthaltend, nach der Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgel verglichen wurden, war ein Hauptkontaminantprotein, Beta-Lactamase, in phTGF58-hältigen Zellen deutlich verringert.

BEISPIEL 8

Der araB-Promotor und Calcitonin

A. Das menschliche Calcitoningen (hCT)

Calcitonin oder Thyrocalcitonin (CT) ist der Name, der dem hypokalzämischen Hormon verliehen wurde, das von der Schilddrüse sekretiert wird. CT vermindert die resorptive Aktivität des Knochens. CT wirkt auch auf die Nieren zur Stimulierung einer erhöhten Harnkalzium- und Phosphatclearance. Die rasche Freisetzung von CT als Antwort auf Anstiege im Blutkalzium läßt darauf schließen, daß die Hauptaufgabe von CT der Schutz höherer Tiere vor akuten hyperkalzämischen Episoden ist. Die Forschung bei CT ist die Untersuchung seiner Verwendung in der Kontrolle der Ostitis deformans (Paget's Krankheit), einer beschleunigten Knochenumbildung.
Die Sequenz für das menschliche Gen für Calcitonin ist wie folgt (Craig at al., Nature, 295: 345-347 (1982)):
Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly TGC GGT AAT CTG AGT ACT TGC ATC CTG GGC
Thr Tyr Thr Gin Asp Phe Asn Lys Phe His ACA TAC ACG CAG GAC TTC AAC AAG TTT CAC
Thr Phe Pro Gin Thr Ala lle Giy Val Gly ACG TTC CCC CAA ACT GCA ATT GGG GTT GGA
Ala Pro Gly GCA CCT GGA

B. Konstruktion eines Plasmids mit einem induzierbaren Regulon, dem araB-Strukturgen und hCT Gen

Plasmid p115, dessen Konstruktion in Fig. 10 dargestellt ist, enthält die richtige Calcitonin-Gensequenz. Das Plasmid wurde mit den Endonucleasen MstI und PstI zum Ausschneiden des Calcitoningens digeriert, wie in Fig. 11 dargestellt ist. Das ausgeschnittene Fragment wurde an ein Plasmid ligiert, das das araB-Strukturgen enthielt (Plasmid pING1, siehe Fig. 12).
Plasmid pMH6 (Horwitz etal., Gene, 14: 309-319 (1981)), das intaktes araC und araB enthält, wurde als Ausgangsmaterial zur Konstruktion von pING1 verwendet. Das Konstruktionsschema ist in Fig. 12 dargestellt. Das Plasmid pMH6 wurde mit der Restriktionsendonuclease EcoRI und SalI digeriert, die in araB- bzw. araA-Gen schneiden, und das 1,9 kb SalI-EciRI-Fragment wurde durch ein 16 Basenpaar SalI-EcoRI-Fragment von M13 mp9 (Vieira und Messing, Gene, 19: 259-268 (1982)) zur Erzeugung von pING1 ersetzt. Der Leseraster des araB-Gens wurde durch Fusion des lacZ-Gens an die EcoRI-Stelle in pING1 bestimmt. Da beide Restriktionsendonucleasen, SmaI und MstI, stumpfe Endfragmente erzeugen, wurde das 760 Basenpaar Fragment von pING1 dann durch ein MstI-PstI-Fragment von Plasmid #115 zur Erzeugung von phCT1 ersetzt. Plasmid #115 weist das chemisch synthetisierte hCT-Gen in dem MstI-PstI-Fragment auf. Die Verbindung des MstI und SamI Endes fusionierte das hCT-Gen mit dem araB-Gen, wodurch eine araB-hCT-Proteinfusion entstand.

C. Wachstum von B. coli-Zellen. die phCT1 enthalten

Transformierte E. coli-Zellen, die phCT1 enthielten, wurden bei 37ºC unter Schütteln zu einer Dichte von 10&sup8;-10&sup9;/ml vermehrt und die Synthese des araB-Calcitonin fusionierten Proteins wurde durch die Zugabe von L-Arabinose (1 Gew.-/Vol.- %) während des zusätzlichen Wachstums über 1-6 Stunden induziert. Die geernteten Zellen wurden beschallt (5 Sek., dreimal) und die Konzentration von araB-Calcitonin wurde durch ein ELISA-Verfahren unter Verwendung von anti-hCT-Antikörpern getestet.
Die vorangehende Erfindung wurde zwar zum besseren Verständnis veranschaulichend und beispielhaft im einzelnen beschrieben, es ist aber offensichtlich, daß gewisse Änderungen und Modifikationen im Bereich der Erfindung, der durch den Umfang der beigefügten Ansprüche begrenzt wird, durchgeführt werden können.

Claims

1. Replizierbarer Expressionsvektor, bestehend aus einem Polynucleotidmolekül, das in einem bestimmten Wirt exprimierbar ist und die Sequenz des araB-Promotors umfaßt, der mit einem Gen funktionsfähig verbunden ist, das zu dem Wirt heterolog ist, wobei das Gen für ein Polypeptid kodiert, das biologisch aktiv ist, oder für ein Fusionsvorläuferprotein, das ein zweites Polypeptid und eine selektive Spaltstelle angrenzend an das biologisch aktive Polypeptid umfaßt, wobei das biologisch aktive Polypeptid ein Enzym, Hormon, Antikörper, Hämoglobin, Strukturprotein, α, β- oder γ-Interferon, Interieukin, Insulin oder Gewebsplasminogenaktivator, aber nicht Thaumatin ist.

2. Expressionsvektor nach Anspruch 1, der ein Plasmid oder Bakteriophage ist.

3. Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei das aktive Polypeptid menschliches Calcitonin, menschlicher Tumorwachstumsfaktor oder Cecropin ist.

4. Expressionsvektor nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Spaltstelle Met, Asn-Gly, Asp-Pro, Lys, Arg oder Lys-Arg ist.

5. Wirt, der mit einem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4 transformiert wurde.

6. Wirt nach Anspruch 5, der E. coli, S. typhimurium oder Serratia marcescens ist.

7. Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven, heterologen Polypeptids in einem zur Expression des Peptids transformierten Bakterium, bestehend aus:

a) dem Einsetzen eines Polynucleotidmoleküls, bestehend aus dem araB-Promotor, der mit einem heterologen Gen funktionsfähig verbunden ist, das für das biologisch aktive Polypeptid oder ein Fusionsvorläuferprotein codiert, das ein zweites Polypeptid und eine selektive Spaltstelle umfaßt, die an das biologisch aktive Polypeptid angrenzt, in einen replizierbaren Expressionsvektor, wobei das biologisch aktive Polypeptid ein Enzym, Hormon, Antikörper, Hämoglobin, Strukturprotein, α-, β- oder γ-Interferon, Interleukin, Insulin oder Gewebsplasminogenaktivator, aber nicht Thaumatin ist;

b) dem Transformieren eines Bakteriums, das zur Expression des Polypeptids fähig ist, mit dem Expressionsvektor, der das Polynucleotidmolekül enthält;

c) dem Kultivieren des transformierten Bakteriums unter Kultivierungsbedingungen; und

d) dem Gewinnen des Polypeptids aus der Kultur.

8. Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven, heterologen Polypeptids durch Kultivieren eines Bakteriums, das mit einem Polynucleotidmolekül transformiert ist, das den araB-Promotor umfaßt, der mit dem Gen funktionsfähig verbunden ist, das zu dem Bakterium heterolog ist, und für das Polypeptid codiert, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

a) das Inkubieren eines transformierten Bakteriums in einem Kulturmedium unter bestimmten Wachstumsbedingungen, bis die späte exponentielle Wachstumsphase erreicht ist, wobei das Bakterium mit einem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4 transformiert ist;

b) dem Einbringen der Kultur von Schritt a) in ein frisches Kulturmedium und dem Inkubieren der Kultur über einen ausreichenden Zeitraum, der ein weiteres Wachstum ermöglicht;

c) dem Beimpfen der Kultur von Schritt b) mit Produktionsmedium und dem Inkubieren der Kultur unter Fermentationsbedingungen zum Erzielen eines maximalen bakteriellen Wachstums über einen ausreichenden Zeitraum, der zur Erzielung einer bestimmten Zelldichte ausreicht;

d) dem Zugeben einer Menge von L-Arabinose, welche die Herstellung wesentlicher Mengen des heterologen Polypeptids in dem Medium bewirkt; und

e) dem Gewinnen des heterologen Peptids.