DE3650625T2

DE3650625T2 - AraB-Promoter und Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden einschliesslich Cecropinen mittels mikrobiologischer Verfahren

Info

Publication number: DE3650625T2
Application number: DE3650625T
Authority: DE
Inventors: Jiunu Lai; Jar-How Lee; Yun-Long Lin; Dan Ray; Gary Wilcox
Original assignee: Xoma Corp
Current assignee: Xoma Corp
Priority date: 1985-01-28
Filing date: 1986-01-24
Publication date: 1997-10-02
Anticipated expiration: 2006-01-25
Also published as: ATE101203T1; DE3689598T2; JPH0829112B2; WO1986004356A1; EP0211047B1; FI863891A; JPS62501538A; JPH082308B2; KR870700095A; NO863806L; FI94774C; FI863891A0; EP0460709A1; EP0460709B1; NO175870B; EP0211047A4; NO863806D0; EP0211047A1; NO175870C; DE3689598D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Bereich der rekombinanten DNA-Technologie und kann araB-Promotoren in der Expression heterologer Gene in transformierten Wirten verwenden. Diese Erfindung betrifft auch die Konstruktion, das Klonen und die Expression von Genen, die für das bakterizide Peptid Cecropin und Analoge davon kodieren.
Die genetische Information, die in DNA-Molekülen kodiert ist, wird durch eine Reihe von Schritten exprimiert, welche die Transkription der DNA in mRNA und die anschließende Transiation der mRNA in Polypeptide und Proteine beinhalten. Die Expression der kodierten Information zur Bildung von Polypeptiden wird an der Promotorstelle ausgelöst, einer Region an dem DNA-Molekül, an welche RNA-Polymerase bindet und die Transkription auslöst. Promotoren, die in rekombinanten DNA-Methoden zur Expression heterologer Gene verwendet werden, umfassen die Beta-Lactamase(Penicillinase) und Lactose- (Beta-Galactosidase) Promotorsysteme (Chang et al Nature 275: 615 (1978); Itakura et al., Science, 198: 1056 (1977); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)) und das Tryptophan- (trp) Promotorsystem (Goeddel et al Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); EPO-Anmeldungsveröffentlichung Nr.0036776). Andere bekannte Promotoren umfassen die Bakteriophage Lambda-Promotoren (PI) und (PR), hut, Colicin E&sub1;, Galactose, alkalische Phosphatase, Xylose A und tac.
Das arab-Gen und sein Promotor (araB) sind in dem L-Arabinose-Operon angeordnet. Das L-Arabinose-Operon (araBAD) in Escherichia coli und in Salmonella typhimurium wurde untersucht. Von besonderem Interesse ist das L-Arabinose-Operon in S. typhimurium; seine Sequenz ist in Horwitz, A. et al., "DNA Sequence of the araBAD-araC Controlling Region in Salmonella typhimurium LT2", Gene, 14: 309-319 (1981), Lin, H.-C et al "The araBAD Operon of Salmonella Typhimurium L12, I. Nucleotide Sequence of araB and Primary Structure of Its Product, Ribulokinase", Gene, 34:111-122 (1985); II. "Nucleotide Sequence of araA and Primary Structure of Its Product, L-Arabinose Isomerase", Gene 34:123-128 (1985); III. Nucleotide Sequence of araD and Its Flanking Regions, and Primary Structure of Its Product, L-Ribulose-5-Phosphate-4-Epimerase", Gene, 34: 129-134 (1985) beschrieben. Das arabad-Operon enthält drei Strukturgene, die für den anfänglichen Metabolismus von L-Arabinose verantwortlich sind. Lee, Jar-How et al "Genetic Characterization of Salmonella typhimurium LT2 ara Mutations", J. of Bacteriology, 158: 344-46 (1984). L-Arabinose wird zunächst durch das araa-Genprodukt L-Arabinose-Isomerase in L-Ribulose umgewandelt. L-Ribulose wird dann durch das araB-Genprodukt Ribulokinase zu L-Ribulose-5-phosphat phosphoryliert. Das araD-Genprodukt L-Ribulose-5-phosphat-4-epimerase katalysiert die Umwandlung von L-Ribulose-5-phosphat zu D-Xylose-5-phosphat, das dann in den Pentosephosphatweg gelangt. Das araBAD-Operon wird koordinativ von dem Induktor L-Arabinose und dem araC-Regulationsgenprodukt kontrolliert.
Da in einem hierin offenbarten und beanspruchten Ausführungsbeispiel der Erfindung der araB-Promotor funktionsfähig an das Gen gebunden ist, das für Cecropin kodiert, und in einen geeigneten Wirt zur Expression des Cecropin-Proteins eingesetzt wird, ist es sinnvoll, einen Überblick über die Literaturstellen zu geben, die Cecropin betreffen.
Das Immunsystem der Cecropia-Motte und einiger Lepidopteran-Insekten ist durch eine effektive humorale Reaktion gekennzeichnet, die vorwiegend mit den Cecropinen zusammenhängt, einer vor kurzem entdeckten Familie von antibakteriellen Peptiden (Boman, H.G. und Steiner, H., Current Topics in Microbiology and Immunology, 94/95: 75-91(1981)). Drei Haupt-Cecropine, A, B und D, wurden aus Immunhämolymphe gereinigt und ihre Sequenzen geklärt (Steiner, et al Nature, 292: 246-248 (1981); Qu, et al., European Journal of Biochemistry, 127: 219-224 (1982); Hultmark, D. ibid 127: 207-217 (1982); und Hultmark, U.S. Patent 4.355.104). Alle Cecropine sind kleine Grundpeptide mit einem hohen Grad an wechselseitiger Sequenzhomologie. Die Aminosäuresequenzen von Cecropin B und D von Antheraea pernyi (A.p.) und von Hylophora cecropia (H.c.) sind wie folgt:
Die Cecropine sind in der Struktur dem Bienengift Mellitin ähnlich, haben aber ein breiteres antibakterielles Spektrum als Mellitin und lysieren kultivierte Leberzellen, Schaf-Erythrozyten oder Insektenzellen nicht. Wie vorstehend gezeigt wurde, ist der Carboxy-Terminus bei allen Cecropinen blockiert und im Falle von Cecropin A ist die blockierende Gruppe ein primäres Amid (Andreu, et al Proceedings of the National Academy of Sciences. USA, 80: 6475-6479 (1983)). Cecropin A und mehrere verwandte Peptide wurden vor kurzem durch Festphasentechniken synthetisiert und haben sich als vollkommen ununterscheidbar von natürlichem Cecropin A nach chemischen und physikalischen Kriterien erwiesen (Andreu, etal., supra).
Es ist interessant, daß das Tetrapeptidimid am Carboxy-Terminus sich als kaum bedeutend für die antibakterielle Aktivität gegenüber E. coli erwiesen hat, daß aber bei den anderen drei getesteten Bakterien die Aktivität auf 3% bis 20% von jener von Cecropin A verringert war.
Die Cecropine sind gegenüber einer Vielzahl von Bakterien einschließlich sowohl gram-negativer als auch gram-positiver Bakterien antibakteriell. Die verfügbaren Daten über die Wirkungsweise der Cecropine zeigen, daß sie die zytoplasmatischen Membrane von Bakterien aufbrechen (Steiner, et al., Nature, 292: 246-248 (1981)). Aus der Literatur geht hervor, daß verschiedene bakterielle Arten verschiedene Empfindlichkeiten gegenüber den Cecropinen aufweisen, und daß jedes Cecropin ein anderes Aktivitätsspektrum besitzt. Zum Beispiel ist Bacillus megaterium besonders empfindlich gegen Cecropin A und B, aber verhältnismäßig widerstandsfähig gegen Cecropin D. Sowohl gram-negative als auch gram-positive Organismen erwiesen sich als empfindlich gegen Cecropine im mikromolaren Konzentrationsbereich. Organismen, die ein hohes Maß an Empfindlichkeit gegen Cecropine zeigen, umfassen E. coli., Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Xenorhabdus nematophilus, B. megatherium und Micrococcus luteus. Obwohl Cecropin A und B insgesamt zwölf Aminosäuresubstitutionen haben, ist ihre Aktivität gegen neun verschiedene bakterielle Arten sehr ähnlich, was darauf schließen laßt, daß viele Aminsosäuresubstitutionen toleriert werden können, ohne die biologische Aktivität des Peptids zu verändern. Ebenso unterscheidet sich das Cecropin B vom Chinesischen Eichenseidenspinner (A. pernyi) vom Cecropin B der Nordamerikanischen Seidenspinner (H. cecropia) in vier Positionen; drei der Änderungen sind jedoch Substitutionen für die entsprechenden Aminosäuren, die in der H. cecropia A-Form gefunden werden. Die vierte Änderung ist in einer Position, wo sich H. cecropia A- und B-Formen unterscheiden, und ist eine konservative Änderung. Es ist daher offensichtlich, daß einzigartige Derivate der Cecropine, die durch konservative Aminosäuresubstitutionen erzeugt werden, ihre biologische Aktivität beibehalten würden. Bei nicht konservativen Änderungen wie jenen, die bei Cecropin D vorgefunden werden, kann erwartet werden, daß die Aktivität des Peptids verändert wird. Cecropin D hat nahezu soviel Aktivität gegen E. coli wie Cecropin A und B, besitzt aber eine signifikant verringerte Aktivität gegen acht andere Bakterienarten.
Angesichts der großen Zweckdienlichkeit der Cecropine und deren Analoge und der großen Hoffnung, die rekombinante DNA-Methoden für die Herstellung von Proteinen bieten, schien es wünschenswert, ein System für die Herstellung von Cecropinen durch eine solche Technologie bereitzustellen.
H. Steiner et al., Nature 292: 246-248 (16. Juli 1981) beschreibt die Reinigung und Charakterisierung von zwei Proteinen, die von der Cecropia-Motte Hyalophora cecropia erhalten wurden. Diese Proteine haben antibakterielle Aktivität und der Name Cecropin A und B wird vorgeschlagen. Die vorläufigen Aminosäuresequenzen für diese beiden Cecropine sind auf Seite 247 angeführt.
EP-A-0139501 beschreibt die Expression von Thaumatin in E. coli MC1061 Zellen, die mit dem Plasmid pING 307 transformiert wurden, welches das araB-Gen enthält.
Es wurde nun gefunden, daß der araB-Promotor als Promotor in rekombinanten DNA-Molekülen verwendet werden kann, so daß der arab-Promotor funktionsfähig mit einem heterologen Gen verbunden ist, das für ein biologisch aktives Produkt kodiert. Die Verwendung des araB-Promotors zur Regulierung der Expression von heterologen Genen hat viele verbundene Vorteile. Das araB-Promotor-Regulierungssystem ist eng reguliert. Der araB-Promotor ist mit L-Arabinose induzierbar; z.B. werden erzeugte Polypeptide nicht vor der Zugabe von L-Arabinose zu den Kulturmedien synthetisiert. Somit kommt es in Abwesenheit von L-Arabinose zu keiner Expression des heterologen Gens zur Bildung der Polypeptide. Nach der Induktion mit L-Arabinose wird das Polypeptid als Teil einer Boten-RNA transkribiert, die am araB-Promotor beginnt. Wenn einmal induziert, dann werden Polypeptide rasch und effizient erzeugt. Ferner ist die Fermentationsperiode kurz im Vergleich zu anderen Systemen. Es ist von Bedeutung, daß das Ausmaß der Expression erhöht ist, d.h., die Produktionsmenge des heterologen Polypeptids deutlich verbessert ist, wodurch es für eine kommerzielle Verwendung interessant wird. Schließlich bilden die exprimierten Fusionspolypeptide Einschlußkörper in der Wirtszelle, die sehr stabil bleiben, unabhängig von der größeren Größe, und auf heterologes Protein gereinigt werden können.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird daher ein Polynukleotidmolekül geschaffen, das in einem bestimmten Wirt exprimierbar ist, welches die Sequenz des araB-Promotors umfaßt, die funktionsfähig an ein Gen gebunden ist, das für Cecropin kodiert ("Cecropin" hat die Bedeutung, die in den letzten vier Absätzen des Abschnitts "DEFINITIONEN" angegeben ist - supra). Cecropin kann unter Verwendung des obengenannten araB-Promotors oder jedes anderen Promotors exprimiert werden.
Das Gen, das für Cecropin kodiert, kann alleine oder als Teil einer längeren Sequenz bereitgestellt werden, die für Cecropin kodiert, gemeinsam mit anderen Peptiden von Aminosäureresten. Es können Berechnungsmethoden zur Optimierung der Annehmbarkeit von E. coli als Expressionswirt angewendet werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein genetisches Konstrukt geschaffen, das eine erste genetische Sequenz umfaßt, die für ein Polypeptid kodiert, die an eine zweite genetische Sequenz gebunden ist, die für Cecropin kodiert, so daß die erste und zweite genetische Sequenz gemeinsam für ein Fusionsprotein kodieren (der Begriff "Cecropin" hat die Bedeutung, die in der Beschreibung in den letzten vier Absätzen unter DEFINITIONEN angegeben ist), wobei das Polypeptid imstande ist, die bakterizide Wirkung von Cecropin in dem Fusionsprotein gegenüber einem Cecropin-empfindlichen Bakterium zu unterdrücken.
Die genetische Sequenz, die für Cecropin kodiert, kann funktionsfähig an eine induzierbare Promotorsequenz gebunden sein.
Die genetische Sequenz, die für Cecropin kodiert, ist häufig eine synthetische Sequenz. Das bakterielle Suppressionspolypeptid kann ein Leader-Polypeptid sein und/oder kann etwa 300 bis 5000 Basenpaare umfassen.
Das Cecropin kann Cecropin A, B oder D sein. Die genetische Sequenz, die für das Polypeptid kodiert, kann für das araB-Gen kodieren.
Die Erfindung schafft auch einen Cecropin-empfindlichen Wirt (der Begriff "Cecropin" hat die Bedeutung, die in der Beschreibung in den letzten vier Absätzen unter DEFINITIONEN angegeben ist), der mit einem darin exprimierbaren Träger transformiert ist, wobei der Träger eine erste genefische Sequenz trägt, die für ein Polypeptid kodiert, die an eine zweite genetische Sequenz gebunden ist, die für Cecropin kodiert, so daß die erste und zweite genetische Sequenz gemeinsam für ein Fusionsprotein kodieren, wobei das Polypeptid imstande ist, die bakterizide Wirkung von Cecropin gegenüber dem Wirt in dem Fusionsprotein zu unterdrücken.
Die Erfindung schafft ferner ein Fusionsprotein, welches ein erstes Segment, das Cecropin ist (der Begriff "Cecropin" hat die Bedeutung, die in der Beschreibung in den letzten vier Absätzen unter DEFINITIONEN angegeben ist), und ein zweites Segment umfaßt, das ein Polypeptid ist, u. zw. derart daß dem Fusionsprotein im wesentlichen die bakteriziden Eigenschaften des Cecropins fehlen.
Das Fusionsprotein kann zwischen beiden Segmenten eine selektiv spaltbare Stelle haben.
Vorzugsweise werden die genetischen Sequenzen, die für ein Cecropin kodieren, durch Berechnungsmethoden konstruiert, so daß ihre Annehmbarkeit durch E. coli als Expressionswirt optimiert wird. Die Optimierung der Konstruktion wird auch zur Minimierung der Eigenkomplementarität durchgeführt, um Restriktionsendonukleasenstellen innerhalb oder außerhalb der Sequenz zu schaffen oder zu vermeiden und somit das Einsetzen zu eileichtern, sowie zur Minimierung der Komplementarität mit den gewünschten Expressionsträgern. Indem die Polynukleotidsequenz derartigen Optimierungen unterzogen wird, schafft die Erfindung synthetische Sequenzen, die in den meisten Fällen strukturell anders als jene in den natürlichen Genen der verschiedenen Arten sind, die als Quellen für Cecropin verwendet werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 zeigt die Aminosäure- und Nukleotidsequenzen von Cecropin A und des synthetischen Gens, das zur Expression in E.coli verwendet wird.
Figur 2 zeigt die Konstruktion von Plasmid pING 1 aus Plasmid pMH6 und M13mp9. pING trägt sowohl araB- als auch araC-Gene. Die Figur zeigt auch die Konstruktion der Plasmide pCA1A, pCA1B, pCA1' aus Plasmid pING 1 (als Quelle für die araB- und araC-Gene).
Figur 3 zeigt die Konstruktion der Plasmide pCA3', pCA3A, pCA3B und pCA2' und pCA2A aus pMH6 und pCA1A, pCA1B und PCA1'. Die Unterschiede zwischen pCA1 (oder pCA1A und 1B), PCA2' (oder pCA2A) und pCA3' (oder pCA3A und PCA3B) liegen in der unterschiedlichen Länge zwischen dem Cecropin A-Gen und der BamHI-Stelle zwischen beiden ara-Genen, die bei pCA1' (oder pCA1A und 1B) 500 bp beträgt, bei pCA2' (oder pCA2A) 1253 bp und bei pCA3' (oder pCA3A und pCA3B) 1550 bp.
Figur 4 zeigt die Konstruktion von Plasmid p19C.
Figur 5 zeigt die Konstruktion von Plasmid pCA3A- -1 aus pCA3A. Die Figur zeigt auch die Konstruktion von Plasmid pCA3D aus pCA3A- -1 und p19C (Figur 4).
Figur 6 zeigt die Aminosäure- und Nukleotidsequenzen von Cecropin A, einem zweiten chemisch synthetisierten Gen, das zur Expression in E. coli verwendet wird.
Figur 7 zeigt die Aminosäure- und Nukleotidsequenzen von Wildtyp- und mutantem Cecropin A
wobei (1) den CA-Wildtyp bezeichnet (pCA3D);
(2) die CA-Mutante A bezeichnet (pCA3A); und
(3) die CA-Mutante B bezeichnet (pCA3B); und die Position der Mutation.
Figur 8 zeigt die Konstruktion von Plasmid phTGF5, das eine araB-HTGF-Fusion enthält.
Figur 9 zeigt die Konstruktion von Plasmid pTGF58.
Figur 10 zeigt die Konstruktion von zwei Plasmiden, p115 und p318, die ein synthetisches Human-Calcitoningen tragen.
Figur 11 zeigt die Konstruktion eines Plasmids, pHCT1, welches das Gen für das fusionierte Polypeptid Ribulokinase-Human-Calcitonin (hCT) enthält.
Figur 12 zeigt die Konstruktion von Plasmid pING1, das als Vehikel für das Klonen und Exprimieren von Calcitonin-Peptid-Genen verwendet wird; pING1 trägt araB- und araC-Gene.

DEFINITIONEN

In der folgenden Beschreibung werden zahlreiche Begriffe, die in der rekombinanten DNA-Technologie verwendet werden, häufig genannt. Die folgenden Definitionen dienen dem besseren und eindeutigeren Verständnis der Beschreibung und Ansprüche, wie auch des Umfangs, der solchen Begriffen verliehen wird.
Operon. Ein Gen, das ein oder mehrere Strukturgene zur Polypeptidexpression und die Kontrollregion, welche diese Expression reguliert, umfaßt.
Operator. Eine DNA-Sequenz, die mit einem bestimmten Repressor in Wechselwirkung treten kann, wodurch die Funktionsfähigkeit eines oder mehrerer benachbarter Gene kontrolliert wird.
Promotor. Eine DNA-Sequenz in der Kontrollregion, an welche die RNA-Polymerase bindet und die Transkription eines oder mehrerer benachbarter Gene auslöst.
Aktivator. Ein Protein, das zur Auslösung der RNA-Synthese durch RNA-Polymerase erforderlich ist.
Initiator. Eine DNA-Sequenz, mit der ein Aktivator zur Kontrolle benachbarter Gene in Wechselwirkung tritt.
Polynukleotidmolekül. Eine lineare Sequenz von Nukleotiden, die durch eine Hauptkette verbunden sind, die aus einer abwechselnden Reihe von Zucker- und Phosphatresten besteht, und wie hierin verwendet, DNA- und RNA-Polymere enthalten kann.
Strukturgen. Eine DNA-Sequenz, die durch ihre Matrize oder Boten-RNA eine Sequenz von Aminosäuren kodiert, die für ein bestimmtes Peptid charakteristisch ist.
Heterologes Gen. Ein Gen, das fremd ist, d.h., von einem Spender stammt, der sich vom Wirt unterscheidet, oder ein chemisch synthetisiertes Gen ist, und das einen Spender von einer anderen Art als jener des Wirts enthalten kann. Das Gen kodiert für Polypepfide, die für gewöhnlich nicht von dem Organismus erzeugt werden, der durch den Expressionsträger transformiert werden soll.
Biologisch aktiv. Bedeutet hierin die Qualität oder das Verfahren, eine beabsichtigte Wirkung zu erzielen, die in einem biologischen System eintritt.
Funktionsfähig gebunden. Bedeutet hierin, daß der Promotor die Auslösung der Expression des Polypeptids kontrolliert, das von dem heterologen Gen kodiert wird.
Expression. Expression ist der Vorgang, durch welchen ein Strukturgen ein Polypeptid erzeugt. Sie umfaßt die Transkription des Gens in Boten-RNA (mRNA) und die Translation einer solchen mRNA in ein oder mehrere Polypeptide.
Klonierungsvehikel. Ein Plasmid oder Phage-DNA- oder andere DNA-Sequenzen, die in einer Wirtszelle replizieren können, die durch eine einzige oder eine geringe Anzahl von Endonuklease-Erkennungsstellen gekennzeichnet sind, an welchen solche DNA-Sequenzen in einer bestimmbaren Weise geschnitten werden können, ohne eine wesentliche biologische Funktion der DNA zu verlieren, und die einen phänotypischen Selektionsmarker enthalten, der zur Verwendung in der Identifizierung transformierter Zellen geeignet ist. Marker sind zum Beispiel Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz. Der Begriff "Vektor" wird manchmal für Klonierungsvehikel verwendet.
Expressionskontrollsequenz. Eine Sequenz von Nukleotiden, welche die Expression von Strukturgenen kontrolliert oder reguliert, wenn sie mit diesen Genen funktionsfähig verbunden ist. Sie umfassen das lac-System, das trp-System, Haupt-Operator- und -Promotorregionen von Phage Lambda, die Kontroliregion des fd-Hüllproteins und andere Sequenzen, von welchen bekannt ist, daß sie die Expression von Genen in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen steuern.
Expressionsvehikel. Ein Vehikel ähnlich dem Klonierungsvehikel, das aber imstande ist, ein bestimmtes Strukturgen in einem Wirt zu exprimieren, normalerweise unter der Kontrolle bestimmter Regulatorsequenzen.
Wirt. Jeder Organismus, der den Empfänger eines replizierbaren Expressionsvehikels darstellt, einschließlich Bakterien und Hefe.
Cecropin. Dieser Begriff, wie in der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, betrifft ein Polypeptid von irgendeiner Insektenart, die bakterizide Aktivität in einem in vivo oder in vitro System besitzt, das in der Wissenschaft zur Messung einer solchen Aktivität anerkannt ist.
Der Begriff Cecropin wird in dieser Erfindung auch so verwendet, daß er jedes Analog, jedes Homolog, jede Mutante, jedes Isomer oder Derivat eines natürlich vorkommenden Cecropins beinhaltet, das bakterizide Aktivität in einem geeigneten System zeigt. Der Begriff soll auch Fragmente umfassen, die weniger als die von Natur aus vorkommende Anzahl von Aminosäuren aufweisen, wie Teilftagmente von natürlichen Cecropinen und deren Analoge. Der Begriff wird auch so verwendet, daß er jedes Produkt beinhaltet, welches die Sequenz eines natürlich vorkommenden Cecropins oder Analoge davon umfaßt, gemeinsam mit einer oder mehreren flankierenden Aminosäuren, vorzugsweise am Carboxy-Terminus, welche cecropinartige bakterizide Aktivität aufweisen. Der Begriff soll auch Cecropine umfassen, die weniger als die von Natur aus vorkommende Anzahl von Aminosäuren aber nach wie vor bakterizide Aktivität aufweisen.
Das Ausmaß der Homologie, durch das ein Cecropin in den Umfang dieser Definition fallt, hängt von den Cecropin-Regionen ab, die für die bakterizide Aktivität verantwortlich sind; Domänen, die für die bakterizide Aktivität kritisch sind, zeigen ein hohes Maß an Homologie, um in die Definition zu fallen, während Sequenzen, die an der Aufrechterhaltung der bakteriziden Konformation oder bei der Durchführung der Rezeptorbindung nicht beteiligt sind, eine verhältnismäßig geringe Homologie aufweisen können. Zusätzlich können kritische Domänen eine bakterizide Aktivität aufweisen und dennoch homolog bleiben, wie hierin definiert, wenn Reste, die funktionell ahnliche Seitenketten enthalten, substituiert sind. "Funktionell ähnlich" betrifft dominante Eigenschaften der Seitenketten wie basisch, neutral oder sauer, oder die Gegenwart oder Abwesenheit eines sterischen Volumens. Im allgemeinen enthält ein als Cecropin definiertes Peptid Regionen, die im wesentlichen mit jenen der Cecropine homolog sind, die in dem Abschnitt dieser Beschreibung mit dem Titel "Beschreibung des wissenschaftlichen Hintergrunds" dargestellt sind. In der Amino-Terminusregion ist eine geringere Homologie erforderlich als in der Carboxy-Terminusregion.
"Bakterizide Aktivität" soll die zuvor definierte Aktivität umfassen, die entweder größer oder kleiner als jene von natürliche vorkommenden Cecropin-Arten sein kann. Insbesondere sind Cecropin-Peptide mit bakterizider Aktivität enthalten, die von etwa 1 % jener der natürlich vorkommenden Arten bis zu Aktivitäten reicht, die wesentlich höher sein können (z. B. das Zehnfache, Hundertfache oder höher) als jene der natürlich vorkommenden Cecropine.

BESTH AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG

1. Der araB-Promotor

In einem Ausführungsbeispiel schafft die vorliegende Erfindung ein Polynukleotidmolekül, das in einem bestimmten Wirt exprimierbar ist und das die Sequenz des araB-Promotors, die funktionsfähig mit einem Gen verbunden ist, das für Cecropin kodiert.
Der araB-Promotor ist ein induzierbarer Promotor, d.h., die Expression des heterologen Gens zur Bildung des kodierten Polypeptids wird durch die Zugabe von L-Arabinose ausgelöst oder induziert. L-Arabinose tritt mit einem Aktivator, dem Produkt des araC-Gens, in Wechselwirkung, um die Expression von araB zu regulieren. Dies ist ein positives Kontrollsystem im Gegensatz zu einem negativen Kontrollsystem; zum Beispiel lac, trp, Lambda PL und tac.
Ohne die Zugabe von L-Arabinose wird das Cecropin weder exprimiert noch synthetisiert. Nach der Induktion wird das Cecropin rasch und wirksam erzeugt. Dieses Produkt bildet für gewöhnlich Einschlußkörper in den Wirtszellen. Die Einschlußkörper vergrößern sich rasch mit Erhöhung der Zelldichte. Die Einschlußkörper bleiben in den Wirtszellen sehr stabil. Diese Eigenschaft führt zu einer reproduzierbaren hohen Ausbeute und macht die Fermentationsüberwachung zu einer leichten Aufgabe. Zur Beendigung des laufenden Fermentationsvorgangs kann eine exakte Entscheidung getroffen werden, die einfach auf der Größe der Einschlußkörper und dem gesättigten Wachstum beruht.
Der araB-Promotor in S.typhimurium hat die folgende Nukleotidsequenz.
Der araB-Promotor als Teil des araB-Gens ist in dem L-Arabinose-Operon angeordnet. Das L-Arabinose-Operon (araBAD) wurde in E. coli und S. typhimurium isoliert. Die Durchführung dieser Erfindung ist jedoch nicht auf diese beiden Quellen des araB-Promotors beschränkt. Andere Quellen können jeden Organismus umfassen, der Gene enthält, die für das L-Arabinose-Operon kodieren. Diese Quellen für den araB-Promotor können die Gattungen Pseudomonas, Citrobacter, Xanthomonas und Erwinia umfassen.
Zusätzlich kann der araB-Promotor synthetisiert werden; z.B. durch Manipulation im Labor anstelle eines natürlichen Ursprungs. Mit anderen Worten, der Begriff schließt ein künstlich hergestelltes oder sogar künstlich abgebautes Produkt ein. Selbst wenn daher eine bestimmte komplette Sequenz für einen natürlich vorkommenden araB-Promotor in der genomischen DNA einer bestimmten Organismusart integriert bestehen kann, kommt die isolierte Sequenz, die dem araB-Promotor entspricht, getrennt von der genomischen DNA des Organismus, mit oder ohne benachbarte Sequenzen, die den Leader-Polypeptiden, Start- und Stoppsignalen entsprechen, von Natur aus nicht vor und ist als "synthetisch" zu betrachten. Zusätzlich, unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Kodes, führt die Kenntnis der Aminosäuresequenz nicht unbedingt und unwiderruflich zu der natürlich vorkommenden genetischen Sequenz, die dafür kodiert.
Die Optimierung jeder synthetischen Sequenz umfaßt vier oder mehr mögliche Schritte und ist bei der Synthese des araB-Promotors wie auch bei der Synthese von Peptidsequenzen, einschließlich heterologer Polypeptide, anwendbar. Erstens wird für jede bestimmte gewünschte Sequenz eine Liste möglicher DNA-Kodons für jede Aminosäure in einer solchen Sequenz erstellt, wobei diese Kodons in der Reihenfolge der Häufigkeit geordnet werden, mit der sie in Bakterien oder Hefe verwendet werden. Eine vorläufige Reihung der Kodons kann auf der Arbeit von Bennetzen und Hall, Journal of Biological Chemistry, 257: 3026-3031(1982) (Hefe) oder Fiers, W., Nature, 260 500 (1976) (Bakterien) beruhen, die hierin durch Bezugnahme eingebracht werden.
Eine weitere Vervollkommnung der Sequenz über die Techniken dieser Arbeiten hinaus wird auch empfohlen.
Ein zweiter Faktor, der die Wahl eines bestimmten Kodons beeinflußt, ist Vorhandensein oder Fehlen bestimmter Restriktionsenzymstellen, die in dem Verfahren zum Klonen des Gens verwendet werden könnten, so daß die Verwendung dieser Enzyme während des Klonierungsverfahrens erleichtert wird. Die Optimierung dieses Faktors umfaßt den Vergleich bekannter Sequenzen von Endonukleasestellen (umfassend vier bis sechs Nukleotide pro Stelle) mit der primären "wirtbevorzugten" Sequenz. Eine Liste von Restriktionsendonukleasestellen findet sich zum Beispiel in Roberts, R.J., Nucleic Acid Research 11.1(1983), r135-r137.
Ein dritter Faktor, der die Wahl bestimmter Kodons beeinflußt, ist die Notwendigkeit, die innere sekundäre Struktur der synthetisierten DNA-Fragmente zu minimieren um zu verhindern, daß sie sich aufeinanderfalten und die Aufschmelzreaktionen an benachbarte DNA-Fragmente hemmen. Dieser Faktor umfaßt die Suche nach einer bestimmten Konstruktionssequenz, so daß eine unpassende Komplementarität ihrer Segmente miteinander vermieden wird, mit Ausnahme der Segmente, die in dem gewünschten Gen nebeneinanderliegen. Eine Suche nach Komplementarität (d.h. deren Vermeidung) kann auch zwischen der konstruierten Gensequenz und vorgeschlagenen Replikationsträgern wie Plasmiden oder Phagen erfolgen.
Ein vierter Faktor, der in der Optimierung zu berücksichtigen ist, ist das Vermeiden von Sequenzen, die reich an AT-Basenpaaren sind (etwa 5 oder mehr), insbesondere wenn vor ihnen eine Sequenz liegt, die reich an GC-Basenpa,aren ist, um eine vorzeitige Beendigung der Transkription zu vermeiden.
Ein fünfter Faktor, der die Wahl von Kodons beeinflußt, ist das Vermeiden von RNase-Stellen, so daß die Botschaft stabil ist.
Schließlich, wenn eines von zwei möglichen Kodons verwendet werden kann, wird die Verwendung von jenem bevorzugt, das die Expression in miktobiellen Genomen maximiert (siehe zum Beispiel Fiers et al., Nature, 260 500 (1976); Grosjean, et al, Gene, 18: 199-209 (1982); und Riggs, U.S. Patent 4.366.246, Spalte 6, die alle hierin durch Bezugnahme eingebracht werden).
Insbesondere wird für die Optimierung ein Computerprogramm verwendet, das zur Durchführung der notwendigen Vergleiche ausgelegt ist, um die Expression in bakteriellen Mikroben oder Hefe zu optimieren.
Der induzierbar araB-Promotor kann mit einer genetischen Sequenz gekoppelt werden, die für Cecropin kodiert, und das erhaltene genetische Konstrukt kann in ein Expressionsvehikel eingesetzt werden oder Teil von diesem bilden. Das Expressionsvehikel kann dann zur Transformation eines geeigneten Wirts verwendet werden. Der Wirt wird unter ausgewählten Kultivierungsbedingungen fermentiert, um ein optimales Wachstum zu erzielen. Der araB-Promotor wird erst aktiv, wenn er mit L-Arabinose behandelt wird, welche den Promotor zur Auslösung der Expression des heterologen Gens induziert. Die Reihenfolge von Abläufen umfaßt die Transkription des Gens in mRNA und deren Translation in das oder die Polypeptidprodukte.
Der araB-Promotor kann mit einer genetischen Sequenz verbunden werden, die für Cecropin kodiert und selbst mit einem Polypeptid verbunden ist, welches die bakterizide Wirkung von Cecropin gegenüber einem Cecropin-empfindlichen Bakterium unterdrücken kann.
Die Expression ergibt ein Fusions- oder Vorläuferprotein, das eine Spaltstelle neben der gewünschten Aminosäuresequenz enthalten kann.
Die Spaltstelle ist vorzugsweise Methionin, obwohl die Stelle jede bevorzugte Stelle sein kann, die in der Wissenschaft bekannt ist. Dem gewünschten heterologen Polypeptid sollten vorzugsweise interne Spaltstellen fehlen, die der tatsächlichen gewählten Spaltstelle entsprechen. Andere bekannte Spaltstellen umfassen Asn-Gly, Asp-Pro, Lys, Arg und Lys-Arg.
Die selektive Spaltung des Fusions- oder Vorläuferproteins wird für gewöhnlich außerhalb des replikativen Milieus des Expressionsvehikels ausgeführt. In diesem posttranslationalen Schritt wird das Fusions- oder Vorläuferprotein durch selektive Behandlung geschnitten. Wenn zum Beispiel Methionin die Spaltstelle ist, wird das Fusions- oder Vorläuferprotein mit Bromcyan behandelt, um das gewünschte heterologe Polypeptid zu schneiden. Bei anderen bekannten spaltstellen beinhaltet die Schneidbehandlung Hydroxylamin, Säure, Trypsin und Lys-Arg-Spaltenzym.
Verfahren zur Herstellung fusionierter, funktionsfähig gebundener Gene und zu deren Expression in Bakterien sind bekannt und zum Beispiel in U.S. 4.366.246 gezeigt, das hierin durch Bezugnahme eingebracht wird.
Die genetischen Konstrukte und die hierin verwendeten Verfahren können zur Expression der heterologen Polypeptide in bakteriellen Wirten verwendet werden.
Zum Beispiel sind E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31466) und Stamm MC1061 (ATCC 39450) besonders zweckdienlich. Andere mikrobielle Stämme, die verwendet werden können, umfassen E. coli X1776 (ATCC 31537), sind aber nicht darauf beschränkt. Die obengenannten Stämme, wie auch E. coli W3 110 (F&supmin;, Lambda&supmin;, prototroph (ATCC 27325)) und andere Enterobakterien wie S. typhimurium oder Serratia marcescens und verschiedene Pseudomonasarten können verwendet werden.
Im allgemeinen werden Plasmidvektoren, die Replikon- und Kontrollsequenzen enthalten, die von Arten abgeleitet werden, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor trägt für gewöhnlich eine Replikationsstelle, wie auch spezifische Gene, die für eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen sorgen können. Zum Beispiel wird E. coli für gewöhnlich unter Verwendung von pBR322 transformiert, einem Plasmid, das von einer E. coli-Art abgeleitet wird (Bolivar, et al. Gene 2 95 (1977)). pBR322 enthält Gene für die Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt somit ein einfaches Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen dar. Das pBR322 Plasmid oder andere mikrobielle Plasmide müssen auch Promotoren enthalten, oder modifiziert sein, um diese zu enthalten, die von dem mikrobiellen Organismus zur Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden können.
Der araB-Promotor kann funktionsfähig an eine genetische Sequenz gebunden sein, die für Cecropin kodiert.
Der transformierte Wirt kann nach in der Wissenschaft bekannten Mitteln fermentiert und kultiviert werden, um ein optimales Zeliwachstum zu erreichen. Das bevorzugte Fermentations- und Produktionsverfahren dieser Erfindung, wie in der Folge beschrieben, kann für eine Herstellung von heterologen Polypeptiden im großen Maßstab verwendet werden. Zusätzlich wird unter Verwendung des araB-Promotors, der funktionsfähig an ein heterologes Gen gebunden ist, das für Cecropin kodiert, das Ausmaß der Expression des heterologen Gens erhöht.
Das bevorzugte Fermentationsverfahren ist wie folgt: Der transformierte Wirt, vorzugsweise ein Bakterium, insbesondere E. coli, wird in ein Kulturmedium eingebracht, daß Nährstoffe enthält, welche den Wachstumsanforderungen des Bakteriums entsprechen. Zu solchen Materialien können Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Mineralien, Aminosäuren, Purine, Pyrimidine und Vitamine zählen. Das bevorzugte Kulturmedium umfaßt auch einen Metaboliten in einer ausreichenden Menge für eine phänotypische Marker-Resistenz, wie einen Metaboliten, der zum Beispiel Tetracyclin oder Ampicillin ist. Der Wirt wird unter Kultivierungsbedingungen gezüchtet, die zur Erzielung einer maximalen Wachstumsrate gewählt werden. Die Temperaturbedingungen hängen von dem Wirt ab, der optimale Bereich liegt aber für gewöhnlich bei etwa 30ºC bis etwa 40ºC, wobei 37ºC für transformiertes E. coli besonders bevorzugt sind. Dem Medium wird auch Sauerstoff beigegeben. Der Wirt wird bis zur späten Exponentialphase wachsen gelassen und dann in ein frisches Kulturmedium übergeleitet.
Die Wirte werden dann mit Produktionskulturmedium beimpft. In diesem Schritt teilen sich die Bakterien weiter und wachsen, bis die Bakterien eine Konzentration, Sättigungsdichte erreichen, bei der sich die Bakterien nicht mehr teilen, aber noch lebensfähig sind. Die Zeit, die zum Erreichen der Sättigungsdichte ausreichend ist, hängt von dem Medium, dem Genotyp des Wirts, der Temperatur und dem Ausmaß der Belüftung ab.
Zu Beginn sind die Fermentations- und Kultivierungsbedingungen für den Herstellungsschritt dieselben wie zuvor beim Züchtungsschritt angegeben, mit Ausnahme, daß in dem Maße, in dem Gelöstsauerstoff während des Wachstums verbraucht wird, die Rühr- und Belüftungsrate entsprechend erhöht werden, um ein Minimum von Gelöstsauerstoff (D.O.) bei 30% zu halten. Der bevorzugte pH-Bereich liegt zwischen etwa 6 bis 8. Der pH-Wert des zuvor beschriebenen Produktionsmediums wird ständig bei 6,5-6,8 selbstreguliert, der für das E. coli-Wachstum optimal ist. Daher ist eine Säure- und Basenkontrolle des pH-Mediums beim E. coli-Wirt nicht notwendig; es kann jedoch notwendig sein, das pH-Medium bei anderen Wirten einzustellen. Wenn eine optimale Zelldichte erreicht ist, im besten Fall OD&sub6;&sub0;&sub0;¹&sup0; für E. coli., wird L-Arabinose in einer ausreichenden Menge zugesetzt, um die Synthese des heterologen Gens zur Bildung von Cecropin auszulösen. Wie zuvor beschrieben, bildet das Cecropin Einschlußkörper im Wirt. Das Cecropin wird dann durch in der Wissenschaft bekannte Mittel wie Filtern oder Ausfällen gewonnen. Wenn ein Fusionsprotein das erhaltene exprimierte heterologe Peptid ist, wird das Fusionsprotein gewonnen und kann dann in einem posttranslationalen Schritt zur Abtrennung des Cecropins behandelt werden. Das Cecropin kann dann mit bekannten Mitteln gewonnen und gereinigt werden.

2. Verfahren zur mikrobiellen Produktion von Cecropinen unter Verwendung Cecropin-empfindlicher Wirte

Ein Teil der vorliegenden Erfindung schafft auch Verfahren zur mikrobiellen Produktion von Cecropinen unter Verwendung Cecropin-empfindlicher Wirte. Ein Konzept der Erfindung ist die Expression einer Gensequenz, die für Cecropin kodiert, während gleichzeitig die bakteriziden Wirkungen des Produkts vermieden oder verzögert werden.
Die genetische Sequenz, die für Cecropin kodiert, kann mit einem induzierbaren Promotor gekuppelt sein und das erhaltene genetische Konstrukt kann in ein Expressionsvehikel eingegliedert werden. Das Expressionsvehikel kann dann zum Transformieren eines geeigneten Wirts verwendet werden und der Wirt wird unter normalen Bedingungen fermentiert, wobei der Promotor nicht aktiv ist. Nach eine angemessenen Zeitperiode wie zum Beispiel zu einem Zeitpunkt, in dem sich die Zellen in einer stationären Phase befinden, wird der Promotor induziert, wie durch Ändern eines äußeren Umgebungsfaktors wie der Salzkonzentration, des Lichts, des Vorhandenseins oder Fehlens eines Metaboliten, eines Metalls und dergleichen, wobei diese Änderung zur Transkription der genetischen Sequenz von Cecropin in mRNA führt und dann zu deren Translation in bakterizides Cecropin. Selbst wenn das erhaltene Cecropin bakterizid ist und den bakteriellen Wirt zerstört, tritt diese Zerstörung erst spät im Fermentationszyklus ein. Beispiele für regulierte Promotoren sind Lambda PL und PR, lac, gal, trp, ara hut und dergleichen.
Es wurde entdeckt, daß wenn eine genetische Sequenz, die für Cecropin kodiert, funktionsfähig mit einem anderen Polypeptid als dem Cecropin so verbunden ist, daß die Expression ein Fusions- oder Vorläuferprotein ergibt, das sowohl die Aminosäuresequenz von Cecropin als auch jene des zusätzlichen Polypeptids umfaßt wie auch eine selektive Spaltstelle neben der gewünschten Cecropin-Aminosäuresequenz, das erhaltene Fusionsprotein nicht bakterizid ist. Bakterizid aktives Cecropin kann dann nach der Transiation durch selektive Spaltung isoliert werden.
Häufig wird die Spaltung außerhalb des replikativen Milieus des Expressionsvehikels ausgeführt, wie zum Beispiel nach der Gewinnung der mikrobiellen Kultur. Somit beraubt das zusätzliche Polypeptid das Cecropin seiner bakteriziden Wirkung bis zur extrazellulären Spaltung, wodurch der Wirt lange genug überleben kann, um große Ausbeuten des gewünschten Produkts zu erhalten. Vorzugsweise fehlen dem Cecropin interne Spaltstellen, die der selektiven Spaltstelle entsprechen, die zum Abstoßen des überflüssigen Polypeptids verwendet werden, obwohl dies nicht unbedingt eine absolute Bedingung ist. Da die Cecropine frei von Methionin sind, ist eine Bromcyan-Spaltung an dem Methionin neben der Cecropin-Sequenz effektiv.
Vorzugsweise wird die genetische Sequenz, die für das überflüssige Polypeptid kodiert, vor dem Strukturgen des Cecropins transkribiert, aber dies muß nicht unbedingt der Fall sein, da es auch möglich ist, das überflüssige Polypeptid in einer Position neben dem C-Terminus des Cecropins zu exprimieren.
Die Art des überflüssigen benachbarten Polypeptids ist nicht kritisch. Es kann entweder Teil, die Gesamtheit oder wiederkehrende Einheiten eines bekannten strukturellen, enzymatischen, hormonalen oder anderen physiologisch relevanten Proteins sein. Als Alternative könnte es ein nicht funktionelles Polypeptid sein. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie fesfiegen zu wollen, nehmen die Erfinder an, daß die größere Lange des Fusionsproteins die bakteriziden Eigenschaften des Cecropins aufgrund der unterschiedlichen Konformation des gesamten Polypeptids irgendwie "maskiert". Vorzugsweise sollte die genetische Sequenz, die für das benachbarte überflüssige Polypeptid kodiert, mindestens eine Länge von mehr als etwa 300 Basenpaaren aufweisen, vorzugsweise zwischen etwa 400 bp und 5 Kb lang sein und insbesondere zwischen 400 bp und 2 Kb. Dies entspricht einem überflüssigen Polypeptid mit vorzugsweise zwischen etwa 100-1700 Aminosäureresten.
Jedes aus einer großen Zahl überflüssiger Polypeptide kann mit der gewünschten Cecropin-Peptidsequenz fusioniert werden. Die Polypeptid-Gensequenz kann entweder durch organische Synthese hergestellt werden, in welchem Fall Optimierungsverfahren empfohlen werden, oder kann durch Techniken wie die reverse Transkription einer geeigneten mRNA hergestellt werden. Die enzymatische Kupplung der Gensequenz für das Polypeptid mit der Gensequenz für das strukturelle Cecropin-Peptid würde dann der Herstellung der cDNA folgen. Die enzymatische Kupplung kann entweder durch Ligation stumpfer Enden oder durch die Bereitstellung kohäsiver Termini erfolgen, die einen der beiden Stränge einer Restriktionsendonuklease-Erkennungsstelle umfassen. Beispiele für überflüssige Polypeptide sind Beta-Galactosidase oder Ribulokinase (für die das araB-Gen kodiert). Enzyme und Strukturproteine sind bevorzugt. Andere Produkte, die verwendet werden können, sind Produkte, für die folgende Gene kodieren: aceA oder aceB, araA, araB, araC, araD, argG, aroB, lacA, serA, purA, trpA, trpB, trpC, trpD, trpE, tyrA und dergleichen. Das überflüssige Polypeptid ist normalerweise frei von Glycosylierung. Der araB-Promotor ist der bevorzugte Promotor, obwohl andere Promotoren wie Lambda PL und PR, lac, gal, trp, hut und andere ara-Promotoren verwendet werden können.
In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die genetische Sequenz von Cecropin funktionsfähig an die Sequenz für ein überflüssiges Polypeptid, die in dem Fusionsprodukt imstande ist, die bakterizide Aktivität von Cecropin zu hemmen oder zu inaktivieren, und zusätzlich an einen induzierbaren Promotor gebunden. Auf diese Weise können sowohl die Wirkung, die durch die Fusionsproteintechnik erzielt werden kann, als auch die Wirkung, die durch die Verwendung des induzierbaren Promotors erzielt werden kann, vorteilhaft und gleichzeitig genützt werden.
Obwohl die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Cecropinen in Cecropin-empfindlichen Wirten, z.B. bakteriellen Wirten, ergibt, können die genetischen Konstrukte, die hierin erzeugt werden, und die verwendeten Verfahren auch zur Expression von Cecropin in einem anderen, nicht Cecropin-empfindlichen Wirt verwendet werden. Diese nicht Cecropin-empfindlichen Wirte umfassen Hefe und Säugetierzellkulturen. Zweckdienliche Hefe- und Säugetierwirte und Vektoren sind dem Fachmann gut bekannt und es wird zum Beispiel auf die Europäische Patentveröffentlichung 0093619, veröffentlicht am 9. November 1983, verwiesen. Bakterielle Wirte können die zuvor beim araB-Promotor genannten wie auch bakterielle Wirte wie die Gattungen Pseudomonas, Citrobacter, Xanthomonas und Erwinia umfassen. Jeder Plasmidvektor, der mit diesen Wirten kompatibel ist, wie zuvor bei dem araB-Promotor beschrieben, kann verwendet werden.
Ein anderer bevorzugter Promotor für Cecropin ist Lambda PL). Das genetische Konstrukt für Cecropin und das überflüssige Polypeptid kann unter die Kontrolle des linksseitigen Promotors von Bakteriophage Lambda (PL) gebracht werden. Dieser Promotor ist einer der stärksten bekannten Promotoren, die kontrolliert werden können. Die Kontrolle wird durch den Lambda-Repressor ausgeführt und benachbarte Restriktionsstellen sind bekannt. Ein temperaturempfindliches Allel des CI-Gens kann auf dem Vektor angebracht werden, der die vollständige Cecropin-Sequenz enthält, oder auf einem anderen Vektor. Wenn die Temperatur auf 42ºC erhöht wird, ist der Repressor inaktiviert und der Promotor wird mit seinem Höchstwert exprimiert. Die Menge der unter diesen Bedingungen erzeugten mRNA sollte ausreichend sein, um eine Zelle zu ergeben, die etwa 10% ihrer neu synthetisierten RNA enthält, die von dem PL-Promotor stammt. In diesem Schema ist es möglich, eine Bank von Klonen zu erstellen, in welchen eine funktionelle Cecropin-Fusionskonstruktsequenz neben einer Ribosombindungssequenz und mit unterschiedlichen Abständen zu dem Lambda PL-Promotor angeordnet ist. Diese Klone können dann durchmustert und jener mit der höchsten Ausbeute ausgewahlt werden.
Die Expression einer Cecropin-Sequenz kann auch unter die Kontrolle anderer Regulons gebracht werden, die "homolog" zu dem Organismus in seinem nichttransformierten Zustand sein können. Zum Beispiel enthält die chromosomale DNA von E. coli ein Lactose- oder lac-Operon, das den Lactose-Abbau durch Erzeugung des Enzyms Beta-Galactosidase vermittelt. Die lac-Kontrollelemente können von Bakteriophage Lambda plac5 erhalten werden, der für E. coli infektiös ist. Das Phage-lac-Operon kann durch Transduktion von derselben Bakterienart abgeleitet werden. Regulons, die zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung geeignet sind, können von der zu dem Organismus nativen Plasmid-DNA abgeleitet werden. Das lac-Promotor-Operator-System kann durch IPTG induziert werden.
Von besonderem Interesse in der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung von synthetischen Polynukleotidsequenzen, die für die Cecropin-Peptide kodieren. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird die synthetische Sequenz des Cecropin-Peptids (mit oder ohne benachbarte Sequenzen) optimiert, so daß deren Expression mit einer Anzahl von Wirten wie Hefen und Bakterien, insbesondere den letztgenannten, kompatibel ist. Insbesondere ist die Optimierung der Expression jeder bestimmten Sequenz in E. coli von großer Bedeutung. Somit unterscheidet sich nach der Durchführung solcher Optimierungsverfahren wie zuvor angeführt, die tatsächliche genetische Sequenz der Cecropin-Peptide mit oder ohne benachbarte Sequenzen für gewöhnlich von der von Natur aus vorkommenden Sequenz bei den ursprünglichen Arten.
Zusätzlich sollte die Konstruktion des gewünschten Gens für das Fusionsprodukt vorzugsweise Kodons für Aminosäuren an der Spaltstelle wie Methionin (durch Bromcyan spaltbar), Trytophan (durch o-Iodosobenzoesäure spaltbar), Glutaminsäure (durch Staph. Protease spaltbar) und dergleichen enthalten.
In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung kann jedes bestimmte Kodon in der gewünschten DNA-Sequenz für das Fusionsprodukt nach Wunsch durch ortsgerichtete Mutagenese mutagenisiert werden. Daher ist es möglich, nach der Synthese der gewünschten DNA-Sequenz, eine spaltbare Stelle in die Sequenz einzugliedern. Ortsgerichtete Mutagenese ist bekannt und es wird auf Wallace et al., Science, 209. 1396-1400 (1980) verwiesen, das hierin durch Bezugnahme eingebracht wird.
Auf den oder die Aminosäurereste, die dem möglichen C-Terminusrest in dem Cecropin-Peptid folgen, kann ein weiteres Polypeptid ("Trailer-Polypeptid") mit unterschiedlicher Lange und gleicher oder anderer Struktur als ein Leader-Polypeptid, falls dies vorhanden ist, wie zuvor beschrieben folgen. In diesem Fall ist es praktisch, dieselben oder verschiedene selektive Spaltstellen zwischen dem Aminosäurerest am C-Terminus und der Trailer-Polypeptidsequenz bereitzustellen. Diese spaltbare Stellen können, müssen aber nicht, dieselben wie jene sein, die zwischen dem Leader-Polypeptid und dem Strukturgen für das Cecropin-Peptid liegen.
Mit anderen Worten, das überflüssige Polypeptid kann als Leader-Peptid, Trailer-Peptid oder als beide vorhanden sein.
Wenn das Strukturgen des gewünschten Cecropin-Peptids in ein Vehikel zur Expression als solcher eingegliedert werden soll, geht dem Gen ein "Startkodon" voran, und wenn Trailer-Sequenzen folgen,. eine oder mehrere Terminations- oder Stoppkodons. Wenn das Expressionsprodukt ein Fusionsprotein ist, das sowohl das Cecropin-Peptid als auch einen Teil oder das Ganze eines Polypeptids umfaßt, kann das Startkodon vor dem N-Terminus des Polypeptids angebracht werden, wenn es ein Leader ist.
Verfahren für die Synthese von Polynukleotiden sind dem Fachmann allgemein bekannt. Es wird zum Beispiel auf das Triester-Verfahren von Itakura et al., Journal of American Chemical Society, 97: 3727 (1975), verwiesen.
Die durch die Verfahren der Erfindung erzeugten Cecropine können als breite antimikrobielle Mittel verwendet werden, die auf bestimmte Anwendungen ausgerichtet sind. Zu solchen Anwendungen zählen zum Beispiel die Verwendung der Cecropine als Konservierungsmittel in verarbeiteten Fleischprodukten (Zielorganismen: (1) Clostridium botulinum, (2) Lactobacilli, (3) Micrococci); als karieshemmende Mittel in Mundhygieneprodukten (Zielorganismus: Streptococcus mutans); als Mittel, die in der Behandlung vaginaler Pilzinfektionen zweckdienlich sind (Zielorganismus; Candida albicans); und als antibakterielle Mittel in Deodorants (Zielorganismen: (1) Micrococci, (2) Diphtheroide) Die relative Wirksamkeit von Cecropin-artigen Peptiden für die beschriebenen Anwendungen kann einfach von einem Fachmann durch Bestimmung der Empfindlichkeit jedes Organismus gegenüber einem der Cecropin-Peptide ermittelt werden. Dieselbe bakterielle Durchmusterung, die in vitro verwendet wird, kann zur Bestimmung von Dosierungen und Konzentrationen verwendet werden.
Nachdem diese Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird sie mit Bezugnahme auf ein bestimmtes Beispiel besser verständlich, das hierin nur zum Zwecke der Veranschaulichung angeführt wird und nicht als Einschränkung, falls nicht anders angegeben, anzusehen ist.

VERFAHREN

Aminosäurezusammensetzungen

Die Hydrolyse von Cecropin-Polypeptiden wurde unter Verwendung von 5,5M HCl (Pierce) bei 110ºC über 24 stunden in vacuo ausgeführt. Proben wurden unter Vakuum bei 40ºC getrocknet und in 200 ul eines Beckman Modell 6300 Probenpuffers (Citrat mit niederem pH) resuspendiert.
Die Aminosäureanalyse wurde unter Verwendung eines Beckanan Modell 6300 Analysegeräts durchgeführt. Für den Nachweis wurde Ninhydrin nach Verlassen der Trennsäule verwendet. Die Daten wurden unter Verwendung eines Hewlett Packard (HP) Integrators, Modell 3390, aufgezeichnet. Die einzelnen Spitzen wurden als die Summe der Signale bei 540 und 440 nm aufgezeichnet. Beckman-Standards, die jede Aminosäure enthalten, wurden zum Kalibrieren des Integrators verwendet und Pottwal-Myoglobin (Applied Biosystems) wurde zur Prüfung der Kalibrierung verwendet.

Proteinsequenzierung

Ein Protein-Sequenator von Applied Biosystems, Modell 470A, wurde für alle Proteinsequenzbestimmungen verwendet. Die Spezifikationen für die Sequenzierungsmethodik folgen dem Hunkapiller-Hood-Programm. Das System verwendet ein vakuumfreies Programm mit Spaltung durch methanolische HCl.

PTH-Bestimmungen

PTH-Bestimmungen wurden unter Verwendung einer HPLC, HP Modell 1090A, mit einem HP Integrator, Modell 3390A, zur Datendarstellung durchgeführt. Eine IBM Cyano-Propyl-Säule wurde zur Trennung der PTH-Aminosäuren verwendet. Der Puffer war 30 mM NaHAc, pH 5,1, enthaltend 5% Tetrahydrofuran. Die Laufgeschwindigkeit betrug 1 ml/min und die Temperatur 37ºC.
Proben wurden nach dem Trocken in vacuo mit 30 ul 33% Acetonitril in Wasser 30 Min. aufgelöst. Die verwendeten PTH-Standards waren von Pierce Chemical Co..

BEISPIEL 1

Synthese und Klonieren eines synthetischen Cecropin A (CA) Gens

A. Synthese des CA-Gens

Ein Gen, das für CA kodiert, wurde mit dem Computer konstruiert, so daß es Kodons enthielt, die für gewöhnlich in hoch exprimierten E. coli Proteinen vorgefunden werden. Am Ende des Gens wurde 4-bp Überhänge eingebaut, so daß die Ligation von SalI- bzw. Eco RI-Stellen möglich war. Zur Erleichterung der Konstruktion verschiedener Größen von Fusionsproteinen war eine BamHI-Stelle nach der SalI-Stelle enthalten. Ebenso wurden unter Verwendung eines Computerprogramms die Optimierungsverfahren, wie zuvor beschrieben, berücksichtigt. Das Gen wurde in acht Oligonukleotide unterteilt, die eine Lange im Bereich von 23 bis 37 Basen aufwiesen (Figur 1).
Die acht einzeisträngigen DNA-Fragmente wurden nach dem Festphasen-Phosphotriester-Verfahren synthetisiert, das von Ito et al., Nucleic Acids Research, 8, 5491(1982) beschrieben wurde.
Es wurden mehrere Änderungen und Verbesserungen durchgeführt, welche die folgenden umfaßten:
(1) Die Kupplungsreaktion wurde bei 37ºC über 40 Minuten bei leichtem Schütteln durchgeführt.
(2) Für die Entfernung der Schutzgruppen der DNA nach der endgültigen Kupplungsreaktion wurde das DNA-Harz (10 mg) mit einer 0,5 M 2-Pyridinaldoxim-tetramethylguanidin-Lösung (2 ml) in Pyridin-Wasser (8:2 Vol/Vol) 60 Stunden bei 37ºC unter Schütteln zur Reaktion gebracht. Die vereinte Lösung wurde verdampft und mit NH&sub4;OH (28%, 3 ml) in einer verschlossenen Ampulle bei 60ºC 36 Stunden behandelt. Nach dem Verdampfen des Ammoniaks wurde die Lösung dreimal mit Ether extrahiert und dann verdampft. Für die Reinigung der DNA wurde der Rückstand in 0,1 ml 50 mM Triethylammoniumbicarbonat, pH 7,5 (TEAB), aufgelöst und auf eine Sephadex G-50 Säule (1 x 50 cm) aufgebracht. Es wurden 1 ml Fraktionen gesammelt. Die ersten wenigen Fraktionen und die Front der 260 nm-Hauptabsorptionsspitze enthielten das gewünschte Produkt. Diese Fraktionen wurden verdampft, dann durch Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) weiter gereinigt. Die HPLC-Reinigung wurde auf einer Bondapak C18 (Waters) Säule bei 55ºC unter Verwendung eines linearen Acetonitril-Gradienten (10-40%) in 10 mM Triethylammoniumacetatpuffer (pH 7,8) ausgeführt. Die DMT-Gruppe wurde durch Behandlung mit 80% Essigsäure (0,1 ml) über 25 Minuten bei Raumtemperatur und anschließendes Verdampfen hydrolysiert und dann mit 0,1 ml Wasser zur vollständigen Entfernung der Essigsäure verdampft.

B. CA-Genverknüpfung durch Ligation

Die 5'OH-Termini der chemisch synthetisierten Fragmente 1 bis 8 wurden getrennt in Gegenwart von 10 ul Lösung phosphoryliert, die folgendes enthielt:
70 mM Tris-HCl (pH 7,6)
10 mM MgCl&sub2;
5 mM Dithiothreitol
66 uM Gamma-³²P-ATP (1 uCi)
400 ng DNA und 2 Einheiten T4 Polynukleotidkinase.
Die Reaktion wurde bei 25ºC 15 Minuten gehalten und dann wurden 1 ml 10 mM unmarkiertes ATP zugegeben, um die Reaktion weitere 15 Minuten fortzusetzen. Zur Prüfung der Reinheit wurden 10% der phosphorylierten DNA durch das Standardverfahren unter Verwendung der Polyacrylamidgel- (15%) Elektrophorese in Gegenwart von 7 M Harnstoff analysiert.
400 ng der phosphorylierten DNA-Fragmente 2, 3, 4, 5, 6 und 7 wurden bei 95 ºC fünf Minuten zur Inaktivierung der T4-Polynukleotidkinase erwannt. Dann wurden 400 ng nicht phosphorylierte Fragmente 1 und 8 zugefügt und bei 95 ºC weitere 5 Minuten erwärmt und dann langsam auf 25 ºC abgekühlt (1 ºC pro 10 Minuten). Die acht DNA-Fragmente wurden in einem Gesamtvolumen von 100 ul in Gegenwart von 66 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6,6 mM MgCl&sub2;; 10 mM Dithiothreitol, 0,4 mM ATP und 2 Einheiten T4 DNA-Ligase zwei Stunden bei 25ºC ligiert.

C. Konstruktion der Plasmide pING 1, pCa1A, pCa1B und pCA1'

Konstruktion der Plasmide pING 1. pCA1A. pCA1B und PCA1'
Das Konstruktionsschema ist in Figur 2 dargestellt.
pMH6 ist in Horwitz, A.H. et al, Gene, 14: 309-319 (1981), beschrieben und M13m9 ist im Handel erhältlich.
1. Die in Schritt B, supra erhaltenen CA-Genfragmente wurden an Plasmid pING 1 ligiert, das mit Restriktionsendonuklease SalI und EcoRI vorbehandelt worden war, dann mit Restriktionsendonuklease SmaI zur Verringerung der Transformanden, die pING 1 trugen, aufgeschlossen.
2. Das SmaI-behandelte Plasmid wurde in E. coli MC1061 transformiert.
3. Die Kolonien, die Plasmide enthielten, die das CA-Genfragment trugen, wurden durch Koloniehybridisierung unter Verwendung des synthetischen DNA-Fragments 7 (Figur 1) als Sonde identifiziert. Drei unabhängige Klone, die das CA-Fragment enthielten, wurden in 1000 Kolonien gefunden. Jedes der isolierten Plasmide wurde mit Sall und EcoRI aufgeschlossen, um die Größe des ausgeschnittenen Fragments zu prüfen. Die Nukleotidsequenzanalyse des CA-Einschubs wurde durch das Didesoxy-Kettenabbruchverfahren von Sanger et al PNAS 74: 5463-5467 (1977) mit einer gewissen Veränderung (Wallace et al., Gene 16: 21-26 (1981)) durchgeführt. Es wurden zwei Sequenzen bestimmt und diese sind in Figur 7(2) und 7(3) dargestellt. Die Plasmide, welche diese Sequenzen enthielten, wurden als pCA1A und pCA1B bezeichnet (Figur 2). Jede dieser Sequenzen unterschied sich von der Wildtyp-CA-Sequenz an den Positionen, die durch die Pfeile in Figur 7(2) und 7(3) bezeichnet sind.
Es können verschiedene Verfahren zur Erzeugung einer Wildtyp-Sequenz verwendet werden, zum Beispiel die in vivo oder in vitro Rekombination von pCA1A und pCA1B oder das Screenen zusätzlicher unabhängiger Klone. Das Plasmid, das die vorgeschlagene Wildtyp-Sequenz enthält, wird als pCA1' bezeichnet (Figur 2).
In der folgenden Beschreibung bezeichnen Plasmide mit dem Index (') Wildtyp-CA-Sequenzen, während Plasmide ohne Index von den Mutanten PCAIA und PCAIB abgeleitet sind.

D. Konstruktion der Plasmide pCA2', pCA2A, pCA3', pCA3A und pCA3B

Dies ist in Figur 3 dargestellt. pCA1 (oder pCA1A oder pCA1B) wird mit BamHI aufgeschlossen und nach der Behandlung mit Polymerase und dTNP und einem anschließenden Aufschluß mit SstI wurde ein Fragment (1) erhalten, das an einem Ende stumpfendig ist und an dem anderen einen SstI-Überhang trägt. Dieses Fragment wird mit einem Fragment ligiert, das von pMH6 durch Aufschluß mit NarI Bildung eines stumpfen Endes und SstI-Behandlung erhalten wurde, um nach der T4-Ligation pCA3' (oder pCA3 oder pCA3B) zu erhalten. Dieses Fragment (1) wird auch mit einem Fragment ligiert, das von pMH6 durch Aufschluß mit HgiAI, Bildung eines stumpfen Endes und SstI-Behandlung erhalten wurde, um nach der T4-Ligation pCA2' (oder pCA2A) zu erhalten.
Die gewünschten Produkte werden durch Transformieren von E. coli MC1061 mit den Ligationsprodukten gesucht. Plasmide werden durch das oben angeführte Minilysatverfahren isoliert. Jedes der isolierten Plasmide wird mit BamHI bzw. Psti aufgeschlossen. Plasmide von jeder Gruppe mit der korrekten Größe und korrekten Orientierung des BamHI-Fragments werden als pCA2 (oder pCA2A) und pCA3' (oder pCA3A oder pCA3B) bezeichnet.

E. Expression des araB-CA-Fusionsproteins

E. coli Zellen die araB-CA-Fusionsgene in Plasmiden pCA1A, pCA2A, pCA3A, pCA3B und pCA3D enthielten (Anmerkung: pCA3D wird in der Folge austauschbar verwendet, um Wildtyp-CA zu bezeichnen, das Plasmid pCA3' enthält) wurden bei 37ºC in einem Medium gezüchtet, das 1,5% Trypton, 1,0% Hefeextrakt und 0,5% NaCl (TYE) mit Ampicillin bei 50 ug/ml enthielt. Bei Zelidichten von OD&sub6;&sub0;&sub0; = 0,2 wurden die Kulturen mit L-Arabinose auf eine Endkonzentration von 0,5% behandelt, um die Expression des araB-CA-Fusionsproteins auszulösen, und wurden, sobald die Zelldichten OD&sub6;&sub0;&sub0; = 1,5 bis 1,7, durch Zentrifügation bei 4000 rpm bei 4ºC über 20 Minuten in einem Beckanan JS-4.2 Rotor gewonnen. Die Zellen wurden einmal durch Resuspendieren in einer Hälfte des ursprünglichen Kulturvolumens des 50 mM Phosphatpuffers (pH 6,6) gewaschen. Gewaschene Zellpellets, welche die Plasmide pCA1A, pCA2A und pCA3A enthielten, wurden in einem Zehntel Volumen Phosphatpuffer und 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) extrahiert und auf einem 10% Polyacrylamid SDS-Denaturierungsgel analysiert. Durch diese Analyse wurde gezeigt, daß E. coli Kulturen, die Plasmid pCA3A enthalten, mehr araB-CA-Protein erzeugten, als entweder eine pCA1A- oder pCA2A-transformierte Kultur.

F. Fraktionieren von induzierten E. coli-Zellen, die Plasmid pCA3A, pCA3B und pCA3D enthalten

Gewaschene Pellets von Schritt E wurden in einem Zehntel des ursprünglichen Volumens Phosphatpuffer resuspendiert, auf 0ºC gekühlt und dann wurde die Zelle in einer French-press aufgebrochen. Die subzellulären Komponenten wurden dann bei 4000 rpm bei 4ºC 20 Minuten lang in dem Rotor zentrifugiert. Die Analyse des erhaltenen Überstands und des 4000 rpm Pellets auf einem 10% Polyacrylamid-SDS-Denaturierungsgel zeigte, daß das gesamte arab-CA-Fusionsprotein von pCA3A, 3B und 3D in dem 4 K Pellet gefunden wurde.

G. Reinigung des synthetischen CA

(a) Bromcyanspaltung

1. Die 4K Pelletfraktion, die das araB-Fusionsprotein enthielt und in dem letzten Schritt erhalten wurde, wurde mit 90% Ameisensäure gemischt, um 0,7-1,1 mg/ml Protein in 70% Ameisensäure zu erhalten. Ein zehnfacher Überschuß Bromcyan (1 g/ml Ausgangsmaterial in Acetonitril), basierend auf dem Gewicht, wurde zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde mit Stickstoff gespült und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert.
2. Die Ameisensäure und das Bromcyan wurden unter einem Stickstoffstrom entfernt. Der Rückstand wurde in 70% Ameisensäure aufgelöst und unter einem Stickstoffstrom noch zweimal getrocknet.
3. Eine Lösung aus 0,1 % Trifluoressigsäure in Wasser wurde zugesetzt; dies löste das gespaltene CA vollständig mit 1 mg Protein/ml auf.

Hochdruckflüssigchromatographie von Bromcyanfragmenten

Das mit Bromcyan gespaltene Fusionsprotein wurde durch HPLC chromatographiert, um das Fragment von dem CA-Teil des Moleküls zu trennen. Es wurde eine C-18 Umkehrphasensäule (Waters) verwendet. Ein Gradient wurde mit 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser (Puffer A) und 0,1 % TFA in Acetonitril (Puffer B) laufen gelassen. Das Ausgangselufionsmittel enthielt 20% Puffer B; 2 Minuten nach der Probeninjektion wurde ein Gradient von 20% B bis 60% B über 60 Minuten gestartet. Die Laufgeschwindigkeit betrug 1 ml/Minute. Das Elutionsprofil wurde bei 280 nm aufgezeichnet. Verschiedene Spitzen im Chromatogramm des mit Bromcyan gespaltenen Fusionsproteins, die eluiert wurden, wurden zur Testung der bakteriziden Aktivität, wie in der Folge beschrieben wird (Beispiel 4), gesammelt. H. pCA3A kodiert für ein mutantes Cecropin-Polypeptid Tabelle I Aminosäurezusammensetzung von Cecropin-A, hergestellt durch pCA3A in E. coli
NB = nicht bestimmt
* Theoretische Werte: Aus der DNA-Sequenzierungsanalyse jedes mutanten Klons erhalten
Die Nukleinsäure- und Aminsäuresequenz sind in Fig. 7 dargestellt.

BEISPIEL 2

Darstellung eines anderen mutanten Cecropin-Polypeptids

Die Zellen von Plasmid pCA3B wurden fraktioniert, CA-Sequenzen wurden erfaßt und das synthetische CA wurde gereinigt und analysiert, wie in Beispiel 1, Abschnitt F-G dargestellt. Die Daten zur Aminosäurezusammensetzung und Sequenz, die in Tabelle II dargestellt sind, zeigen, daß der zweite Klon auch eine CA-Gensequenz enthielt, die für ein mutantes Cecropin kodiert. Tabelle II Aminosäurezusammensetzung von Cecropin-A, hergestellt durch pCA3B in E. coli
NB = nicht bestimmt
* Theoretische Werte: Aus der DNA-Sequenzierungsanalyse jedes mutanten Klons erhalten
Die Nukleinsäure- und Aminsäuresequenz sind in Fig. 7 dargestellt.

BEISPIEL 3

Konstruktion von Plasmid pCA3D, das für Wildtyp-Cecropin A kodiert

Das Konstruktionsschema ist in den Figuren 4 und 5 gezeigt

A. Konstruktion von p19C

1. Plasmid pING 1 wurde vollständig mit Endonuklease Fok1 und dann BamHI aufgeschlossen; der erhaltene Aufschluß wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion (Verhältnis 1:1) beendet, und dann wurde der wässerige Rückstand mit Ether gewaschen und dann durch eine Bio-Gel P-10 Säule zur Entfernung von Phenol/Chloroform geleitet.
Das Ergebnis des Fok1-Aufschlusses ergab einen "CTAC"-5'-Überhang.
Dieses BamHI, Fok1-Fragment mit 76 Basenpaaren enthält den araB-Promotor.
2. Ein neues CA-Genfragment (siehe Figur 6) wurde unter Verwendung desselben Verfahrens wie in Beispiel 1, Schritt B beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, daß die beiden DNA-Fragmente Nr. 1 und 5 durch Nr. nn-1 und nn-5 (Sequenz in Figur 6 dargestellt) ersetzt wurden, um einen GATG"-5'-Überhang am N-Terminus und ein an der EcoRI-Stelle überhängenden ATTT am C-Terminus zu erzeugen.
3. pBR322 wurde vollständig mit den Endonukleasen BamHI und EcoRI aufgeschlossen. Der erhaltene Aufschluß wurde wie beschrieben beendet.
4. Das BamHI-Fok1-Fragment aus Schritt 1, supra, und das neue CA-Genftagment aus Schritt 2, supra, wurden an das größere BamHI-EcoRI-Fragment von pBR322 ligiert.
5. Das Ligationsprodukt wurde mit Endonuklease HindIII zur Verringerung der Anzahl von Transformanden, die pBR322 trugen, aufgeschlossen.
6. Das HindIII-behandelte Plasmid wurde in E. coli MC1061 transformiert.
7. Die Kolonien, die Plasmide enthielten, die das CA-Genfragment trugen, wurden durch Koloniehybridisierung unter Verwendung des synthetischen DNA-Fragments 7 (Figur 6) als Sonde identifiziert. Drei unabhängige Klone, die das CA-Fragment enthielten, wurden in 1000 Kolonien gefunden. Jedes der isolierten Plasmide wurde mit BamHI und EcoRI aufgeschlossen; ein Plasmid, das zur Freisetzung des korrekten Fragments imstande war, wurde als p19C bezeichnet. Die Nukleotidsequenzanalyse der CA-Einschübe wurde durch das Didesoxy-Kettenabbruchverfahren von Sanger et al PNAS, 74: 5463-5467 (1977) mit einer gewissen Veränderung (Wallace et al Gene 16: 21-26 (1981)) durchgeführt. p19C enthielt die korrekte Sequenz für das CA-Gen. Das CA-Gen wurde direkt stromabwärts des araB-Promotors ohne dazwischenliegende araB-Kodierungssequenz angeordnet.

B. Konstruktion von pCA0

1. Die BamHI-EcoRI-Fragmente von p19C wurden durch Aufschluß mit überschüssigen Mengen Restriktionsendonuklease EcoRI und BamHI ausgeschnitten. Die Plasmide wurden auch mit PvuI aufgeschlossen, um die Möglichkeit zu verringern, daß die ausgeschnittenen Fragmente wieder an das Plasmid im nächsten Ligationsschritt ligiert werden.
2. Die BamHI-EcoRI-Fragmente von Schritt A.7 wurden an Plasmid pING 1 ligiert, das zuvor mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und BamHI behandelt worden war, dann mit der Restriktionsendonuklease SmaI zur Verringerung des Transformanden, der pING 1 trug, aufgeschlossen.
3. Das SmaI-behandelte Plasmid wurde in E. coli MC 1061 transformiert.
4. Die Kolonien, die Plasmide enthielten, welche das CA-Genfragment trugen, wurden durch Plasmidcharakterisierung identifiziert. Jedes der isolierten Plasmide wurde mit BamHI und EcoRI aufgeschlossen, um die Größe des ausgeschnittenen Fragments zu prüfen. Ein Plasmid, das die korrekte Größe hatte, wurde als pCA0 bezeichnet, Die Nukleotidsequenzanalyse der CA-Einschübe wurde mit dem Didesoxy-Kettenabbruchverfahren ausgeführt. Dieses pCA0 enthielt die korrekte Sequenz für das CA-Gen. Dieses pCA0, das das komplette araB-Regulationsgen und CA-Gen enthält, wird direkt nach dem araB-Promotor zur direkten Expression von Cecropin A, ohne ein araB-CA-Fusionsprotein zu erzeugen, angeordnet.

C. Konstruktion von Plasmid pCA3A- -1

Der Zweck dieser Konstruktion ist die Entfernung der AvaI-PvuII-Region von pCA3A, um eine Xmn1-Stelle zu beseitigen. Durch die Entfernung kann auch die Plasmid-Kopiezahl in E. coli-Zellen erhöht werden.
1. pCA3A wurde mit Endonuklease AvaI und PvuII aufgeschlossen und dann mit dem Klenow-Fragment von DNA Polymerase I in Gegenwart von dNTP aufgefüllt, um ein stumpfes Ende zu erzeugen.
2. Das Plasmid von Schritt 1 wurde religiert und dann mit AvaI und PvuII aufgeschlossen, um die Anzahl von Transformanden zu verringern, welche das ursprüngliche pCA3A enthielten.
3. Das mit AvaI, PvuII-behandelte Plasmid wurde in E. coli MC 1061 transformiert.
4. Kolonien, die Plasmide enthielten, deren AvaI-PvuII-Region entfernt worden war, wurden durch Koloniehybridisierung unter Verwendung des synthetischen DNA-Fragments 5'-TCATCAGCGTGGTCG-3' als Sonde identifiziert. Sechsundvierzig unabhängige Klone, deren AvaI-PvuII-Region entfernt worden war, wurden in fünfzig Kolonien gefunden. Jedes der isolierten Plasmide wurde mit XmnI aufgeschlossen, um die Größe der ausgeschnittenen Fragmente zu prüfen. Eines der Plasmide, das die korrekte Größe besaß, wurde als pCA3A- -1 bezeichnet.

D. Endkonstruktion von Plasmid pCA3D

p19C enthält die Wildtyp-Cecropin-A-Sequenz, es fehlt aber einer passende Restriktionsstelle an seinem N-Terminus, um eine Proteinfusion mit araB zu erzeugen.
pCA3A weist eine Deletion von zwei Basenpaaren auf, die nahe dem C-Terminus des CA-Gens auftritt, wodurch es ein mutantes araB-Fusionsprotein erzeugt.
Diese beiden Plasmide wurden zur Konstruktion eines Plasmids wiedervereint, bei dem das Wildtyp-CA-Gen an araB fusioniert war, um ein araB-CA Fusionsprotein zu erzeugen.
Das Konstruktionsschema ist in Figur 5 dargestellt.
1. Plasmid p19C (1 ug) wurde vollständig mit der Endonuklease Xmn1 aufgeschlossen; der erhaltene Aufschluß wurde durch Erwärmen bei 65ºC über 10 Minuten beendet.
2. Plasmid pCA3A- -1 (0,1 ug) wurde vollständig mit der Endonuklease XmnI aufgeschlossen; der erhaltene Aufschluß wurde durch Erwärmen bei 65ºC über 10 Minuten beendet.
3. DNA von Schritt D. 1 und D.2 wurde vermischt und ligiert.
4. Das ligierte Produkt wurde mit PvuII zur Verringerung der Transformanden, die p19C trugen, aufgeschlossen.
5. Das PvuII-behandelte Plasmid wurde in E. coli MC1061 transformiert.
6. Die Kolonien, die Plasmide enthielten, welche das Wildtyp-araB-CA-Gen trugen und ein araB-CA-Fusionsprotein erzeugen konnten, wurden durch DNA-Sequenzanalyse, wie zuvor beschrieben, identifiziert. Von sieben analysierten Kolonien wurde eine erhalten, welche die Wildtyp-Sequenz enthielt, und als pCA3D bezeichnet. Tabelle III Aminosäurezusammensetzung von Wildtyp-Cecropin-A, hergestellt durch pCA3D in E. coli
NB = nicht bestimmt
Die Nukleinsäure- und Aminsäuresequenz sind in Fig. 7 dargestellt.

BEISPIEL 4

Test der bakteriziden Aktivität

Agarplatten (mit einem Durchmesser von 8 cm) wurden mit 6 ml TYE-Medium vorbereitet, das etwa 107 lebensfähige Zellen des Testorganismus enthielt. Vertiefungen, mit einem Durchmesser von 2 mm, wurden in die Platten gestanzt. Das Testmaterial wurde in 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,6) aufgelöst und 3 ul wurden in jede Vertiefung eingebracht. Die Durchmesser der Hemmzonen oder die Höfe um die Vertiefungen wurden nach einer Inkubation über Nacht bei 25ºC gemessen. Zur Bestimmung eines Standards der Hofbildung wurde CA 1-33 Protein verwendet. 1 ug und 3 ug von CA 1-33 in Vertiefungen aufgetragen erzeugte Höfe mit Durchmesser von 8 mm bzw. 11 mm auf dem mit E. coli Stamm JF568 induzierten Medium. 10 ug und 30 ug von mit Bromcyan aufgeschlossenem pCA3A-araB-CA-Fusionsprotein ergaben Höfe mit Durchmessern von 7 mm bzw. 18 mm.
Mit Bromcyan aufgeschlossenes Fusionsprotein, das durch HPLC fraktioniert wurde, wurde ebenso in diesem Test aufgetragen. Es wurden verschiedene Spitzen getestet und eine bestimmte Spitze erwies sich als bioaktiv. Andere bakterielle und Hefe-Stämme wurden ebenso in diesem Test getestet. Mit Bromcyan aufgeschlossene und nicht aufgeschlossene Fusionsproteinproben wurden in den zuvor beschriebenen Mengen beim Test von E. coli Stamm JF568 aufgetragen und die erhaltenen Hofdurchmesser gemessen.
Die Ergebnisse sind für alle erhaltenen Cecropine in Tabelle IV dargestellt. Tabelle IV Bioaktivität von CNBR-aufgeschlossenen pCA3A, pCA3B, pCA3D Fusionsproteinisolaten (5 ug) und Ampicillin (750 ng) auf verschiedenen Bakterienstämmen, gemessen durch die Hofaktivität
* Wild
Y Mutanten
NE keine Hofaktivität

BEISPIEL 5

Fermentative Produktion von Cecropin und Tumorwachstumsfaktor

Dieses Beispiel beschreibt die Fermentationsproduktion von Alpha-TGF (Tumorwachstumsfaktor) und von Cecropin unter der Kontrolle des araB-Promotors in E. coli.
Der E. coli Stamm MC1061 enthält den Plasmid-getragenen araB-Promotor, der das araB-Alpha-TGF- (pTGF58) oder araB-Cecropin(pCA3D) Fusionsgen reguliert. Die Kulturen wurden bei 37ºC, 250 rpm in 100 ml TYE-Kulturmedium, das Ampicillin (0,1 g/l) enthielt, gezüchtet. Die Kulturen wurden bis zur späten Exponentialphase, etwa 200 Klett-Einheiten, wachsen gelassen; Rotfilter. Die Kulturen wurden dann in einen mit Leitblechen versehenen 4-Liter Rüttelkolben eingebracht, der 900 ml frisches TYE-Medium enthielt. Die Inkubation wurde drei weitere Stunden vor der Inokulation in 9 Liter Produktionsmedium fortgesetzt. Das Produktionsmedium umfaßt die in Tabelle V angeführten Inhaltsstoffe: Tabelle V
Zunächst wurden die Produktionsfermentationsbedingungen bei 37ºC, 800 rpm und 1 vvm (Volumen Gefaß pro Minute) eingestellt. Da der Gelöstsauerstoff während der Wachstumsperiode verbraucht wurde, wurden sowohl die Rühr- als auch Belüftungsraten entsprechend erhöht, um ein Minimum an Gelöstsauerstoff (D.O.) von 30% beizubehalten. Der pH dieses Mediums wurde ständig bei 6,5-6,8 selbstreguliert, der für das E. coli-Wachstum optimal ist, so daß eine Säuren- und Basenkontrolle des Medium-pH-Wertes nicht notwendig war. Etwa 4 Stunden nach der Inokulation in das Produktionsmedium erreichte die Zelldichte einen OD&sub6;&sub0;&sub0;-Wert von 10, als L-Arabinose (50 g) zugesetzt wurde, um die Synthese von Cecropin-Fusionsprotein auszulösen. Um weiterhin die Stabilität des Expressionvektors zu gewährleisten, wurde 1 g Ampicillin der Nährlösung bei einem OD&sub6;&sub0;&sub0;-Wert von 20 zugesetzt.
Sowohl Alpha-TGF- als auch Cecropin-araB-Fusionsproteine wurden nur in der unlöslichen Fraktion der E. coli-Zellen festgestellt. Die mikroskopische Untersuchung zeigte, daß unlösliche Einschlußkörper sich innerhalb der Zellen eine Stunde nach der Induktion gebildet hatten und während der Fermentation stabil blieben. Mehr als 95% der Zellen enthielten mindestens einen Einschlußkörper, der sich rasch mit ständig zunehmender Zelldichte vergrößerte. Die Ausbeute der Zeilmasse betrug 13,1 g (Trockengewicht) pro Liter. Von der Zellmasse waren etwa 30% das Fusionsprotein.

BEISPIEL 6

Konstruktion des E. Coli-Vektors, in dem die Expression des araB-hTGF-Fusionsproteins unter der Regulierung des S- typhimurium-araB-Promotors steht

Der araB-Promotor wird von dem araC-Genprodukt positiv reguliert. L-Arabinose steht mit dem araC-Protein zur Bildung eines Aktivators in Wechselwirkung, der zur Expression des araB-Promotors erforderlich ist. Ein Plasmid, das die S. typhimurium-araB- und araC-Gene enthält, wurde zur Konstruktion des araB-hTGF (Human-Tumorwachstumsfaktor Alpha) Expressionsvektors verwendet. Die Strategie der Plasmidkonstruktion ist in Figur 8 dargestellt. Das Endplasmid phTGF5 enthält eine araB-hTGF-Fusion, die für ein Protein mit 548 Aminosäuren kodiert. Der E. coli Stamm MC1061, der phTGF5 enthält, wurde in Minimalglycerol- (1 %) Medium, ergänzt mit Caseinhydrolysat (0,5%) und Thiamin (1 ug/ml) gezüchtet. Sobald die Dichte der Kultur A600 = 0,2 erreichte, wurde L-Arabinose auf 1 % zugesetzt und die Inkubation fünf Stunden fortgesetzt, bevor die Kultur geerntet wurde. Ein 55 Kdal Protein, das etwa 10% des gesamten zellulären Proteins darstellt, wurde durch SDS-PAGE nachgewiesen.

BEISPIEL 7

Transkriptionsterminator 3', der dem araB-HTGF-Gen hinzugefügt wurde

Ein Transkriptionsterminator ist eine DNA-Sequenz, die bewirkt, daß die RNA-Polymerase die Transkription beendet. Die Anordnung eines Transkriptionsterminators am 3'-Ende des araB-hTGF-Gens verhindert die Expression des oder der unerwünschten Genprodukte stromabwärts des Transkriptionsterminators. Die Strategie der Plasmidkonstruktion ist in Figur 9 dargestellt. Das Endplasmid phTGF58 enthält einen E. coli rrnB-Gen Transkriptionsterminator, der am 3'-Ende des arab-HTGF-Gens eingesetzt ist. Wenn die teilweise gereinigten araB-hTGF-Proteine, die vom E. coli Stamm MC1061 isoliert wurden und entweder phTGF58 oder phTGF5 (das Stammplasmid) enthielten, nach der Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgel verglichen wurden, war ein Hauptkontaminationsprotein, Beta-Lactamase, in phTGF58-haltigen Zellen signifikant verringert.

BEISPIEL 8

Der araB-Promotor und Calcitonin

A. Das Human-Calcitoningen (HCT)

Calcitonin oder Thyrocalcitonin (CT) ist die Bezeichnung, die dem hypokalzämischen Hormon verliehen wurde, das von der Schilddrüse sezerniert wird. CT-verringert die resorptive Aktivität des Knochens. CT wirkt auch auf die Nieren zur Stimulierung einer erhöhten Harnkalzium- und Phosphatclearance. Die rasche Freisetzung von CT als Reaktion auf Blutkalziumanstiege läßt vermuten, daß die Hauptaufgabe von CT darin besteht, höhere Tiere vor akuten hyperkalzämischen Episoden zu schützen. Die CT-Forschung untersucht dessen Verwendung zur Kontrolle der Paget's Krankheit, eines Problems mit beschleunigter Knochenumbildung.
Die Sequenz für das Humangen für Calcitonin ist wie folgt (Craig, et al., Nature, 295: 345-347 (1982)):

B. Konstruktion eines Plasmids, das ein induzierbares Regulon, das araB-Strukturgen und das hCT-Gen trägt

Plasmid p115, dessen Konstruktion in Figur 10 dargestellt ist, enthält die korrekte Calcitonin-Gensequenz. Das Plasmid wurde mit Endonuklease MstI und PstI aufgeschlossen, um das Calcitoningen auszuschneiden, wie in Figur 11 dargestellt ist. Das ausgeschnittene Fragment wurde an ein Plasmid ligiert, welches das araB-Strukturgen trug (Plasmid pING1, siehe Figure 12).
Plasmid PMH6 (Horwitz, et al., Gene, 14: 309-319 (1981)), das intaktes arac und arab enthält, wurde als Ausgangsmaterial zur Konstruktion von PINGI verwendet. Das Konstruktionsschema ist in Figur 12 dargestellt. Das Plasmid pMH6 wurde mit Restriktionsendonuklease EcoRI und SalI aufgeschlossen, welche das araB- bzw. araA-Gen schneiden, und das 1,9 kb Sall-EcoRI-Fragment wurde durch ein SalI-EcoRI-Fragment mit 16 Basenpaaren aus M13 mpg (Vieira und Messing, Gene 19: 259-268 (1982)) ersetzt, um pING1 zu erhalten. Der Leserahmen des araB-Gens wurde durch Fusion des lacZ-Gens an die EcoRI-Stelle in pING1 bestimmt. Da beide Restriktionsendonukleasen SmaI und MstI stumpfendige Fragmente erzeugen, wurde dann das Fragment von pING1 mit 760 Basenpaaren durch ein MstI-PstI-Fragment von Plasmid #115 ersetzt, um pHCT1 zu erzeugen. Bei Plasmid #115 ist das chemisch synthetisierte hCT-Gen in dem MstI-PstI-Fragment angeordnet. Die Verbindung des MstI und SmaI-Endes, fusionierte das HCT-Gen mit dem araB-Gen, wodurch eine araB-hCT-Proteinfüsion erhalten wurde.

C. Wachstum von E. coli-Zellen. die phCT1 enthalten

Transformierte E. coli-Zellen, die phCT1 enthalten, wurden bei 37ºC unter Schütteln bis zu einer Dichte von 108-109/ml wachsen gelassen und die Synthese des arab-Calcitonin-Fusionsproteins wurde durch Zugabe von L-Arabinose (1 % Gewivol) während eines weiteren Wachstums über 1-6 Stunden ausgelöst. Die geemteten Zellen wurden beschallt (5 sec, dreimal) und die Konzentration von araB-Calcitonin wurde durch ein ELISA-Verfahren unter Verwendung von Anti-hCT-Antikörpern getestet.
Die vorangehende Erfindung wurde zwar anhand von Darstellungen und Beispielen für ein besseres Verständnis ziemlich ausführlich beschrieben, aber es ist offensichflich, daß gewisse Änderungen und Modifizierungen im Umfang der Erfindung durchgeführt werden können, die durch den Umfang der beiliegenden Ansprüche begrenzt ist.

Claims

1. Genetisches Konstrukt, das eine erste für ein Polypeptid kodierende genetische Sequenz aufweist, die an eine zweite für Cecropin kodierende genetische Sequenz gebunden ist, so daß die erste und zweite genetische Sequenz gemeinsam für ein Fusionsprotein kodieren (der Begriff "Cecropin" hat die Bedeutung, die in der Beschreibung in den letzten vier Absätzen unter DEFINITIONEN angegeben ist), wobei das Polypeptid imstande ist, die bakterizide Wirkung von Cecropin in dem Fusionsprotein gegenüber einem Cecropin-empfindlichen Bakterium zu unterdrücken.

2. Genetisches Konstrukt nach Anspruch 1, bei welchem die für Cecropin kodierende genetische Sequenz an einen induzierbaren Promotor gebunden ist.

3. Genetisches Konstrukt nach Anspruch 2, bei welchem der induzierbare Promotor der arab-Promotor ist.

4. Cecropin-empfindlicher Wirt (der Begriff "Cecropin" hat die Bedeutung, die in der Beschreibung in den letzten vier Absätzen unter DEFINITIONEN angegeben ist), der mit einem darin exprimierbaren Vehikel transformiert ist) wobei das Vehikel eine erste für ein Polypeptid kodierende genetische Sequenz trägt, die an eine zweite für Cecropin kodierende genetische Sequenz gebunden ist, so daß die erste und zweite genetische Sequenz gemeinsam für ein Fusionsprotein kodieren, wobei das Polypeptid imstande ist, die bakterizide Wirkung von Cecropin gegenüber dem Wirt in dem Fusionsprotein zu unterdrücken.

5. Fusionsprotein, welches ein erstes Segment, das Cecropin ist (der Begriff "Cecropin" hat die Bedeutung, die in der Beschreibung in den letzten vier Absätzen unter DEFINITIONEN angegeben ist), und ein zweites Segment aufweist, das ein Polypeptid ist, so daß dem Fusionsprotein im wesentlichen die bakteriziden Eigenschaften des Cecropins fehlen.

6. Verfahren zur Herstellung von Cecropin (der Begriff "Cecropin" hat die Bedeutung, die in der Beschreibung in den letzten vier Absätzen unter DEFINITIONEN angegeben ist) durch mikrobielle Techniken, das folgendes umfaßt:

Bereitstellen eines genetischen Konstrukts, das eine erste genetische Sequenz aufweist, die für Cecropin kodiert und mit einer zweiten genetischen Sequenz verbunden ist, die für ein anderes Polypeptid kodiert, so daß ein fusioniertes Gen entsteht;

Transformieren des genetischen Konstrukts in einen Cecropin-empfänglichen Wirt;

Kultivieren des transformierten Wirts, wodurch ein für den Wirt nicht toxisches Fusionsprotein erzeugt wird;

und anschließend Gewinnen von Cecropin aus dem Fusionsprotein.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei welchem das Cecropin durch Spaltung des Fusionsproteins erzeugt wird.

8. Polynukleotidmolekül, das in einem bestimmten Wirt exprimierbar ist, wobei es die Sequenz des araB-Promotors aufweist, die funktionsfähig an ein Gen gebunden ist, das für Cecropin kodiert (der Begriff "Cecropin" hat die Bedeutung, die in der Beschreibung in den letzten vier Absätzen unter DEFINITIONEN angegeben ist).

9. Wirt, der mit einem genetischen Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einem Polynukleotidmolekül gemäß Anspruch 8 transformiert ist.