DE3320339A1 - Expressionsvektor, verfahren zu seiner herstellung und verwendung des expressionsvektors zur herstellung eines polypeptids - Google Patents

Description

Expressions'vektor, Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung des Expressionsvektors zur Herstellung eines Polypeptids

Die Erfindung bezieht sich auf einen Expressionsvektor mit einem DNS-Fragment (DNA), der eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein und ein Replikon aus der Gruppe der Plasmide und Bakteriophagen enthält, sowie auf ein Verfahren zu dessen Herstellung und seine Verwendung bei der Herstellung eines Polypeptids mit Hilfe einer Genexpression mit dem Expressionsvektor. Insbesondere bezieht sie sich auf einen Expressionsvektor mit einer starken Genexpression, der eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsproteiη mit sich führt.

Unter dem Begriff der "Genexpression'¹ wird hier die Translation aus einer Genkodierung für eine Polypeptidsequenz in das Polypeptid verstanden. In der Genexpression wird die Kodierung in einer DNS-Kette für die Polypeptidsequenz zuerst in eine komplementäre Ribonucleinsäure transkribiert, in eine sogenante Boten-RNS, und anschließend findet die Translation der so transkribierten Boten-RNS in das vorgenannte Polypeptid statt.

1970 wurde die Technik der Umwandlung von Escherichia coil entdeckt (M. Mandel und A. Higa, Journal of Molecular Biology, 53 (159-162 (1970)), und man fand ein Restriktionsenzym (H.0. Smith und K.W. Wilcox, Journal of Molecular Biology, 51, 379-391 (1970)). Diese Erkenntnisse führten zu einem raschen Fortschritt in der Gentechnik und in der ZeI1 techno!ogie. Beispielsweise wurde auf

der Basis dieser Erkenntnisse die grundlegende Technik der Genrekombination entwickelt, wie sie in der US-PS 4,237,224 beschrieben ist. Des weiteren wurden neue Vektoren entwickelt, sowie Verfahren zur Herstellung nutzbringender Substanzen mit Hilfe der Gentechnik. Die genannten neuen Vektoren sind beispielsweise in der DT-OS 27 12 615, in der FR-PS 2 441 659, der US-PS 4,273,875, in der PCT-Anmeldung WO 79/01169, der GB-PS 2 052 516 und in der EPC-PS 32238 beschrieben. Die vorgenannten Verfahren zur Herstellung nutzbringender Substanzen sind beispielsweise in der US-PS 4,375,514 beschrieben.

Aus all den vorgenannten Veröffentlichungen geht jedoch nur hervor, daß die gewünschten nützlichen Substanzen mit Hilfe der Genexpression hergestellt werden können. Die Techniken, die in den genannten Veröffentlichungen zum Stand der Technik beschrieben sind, haben jedoch den Nachteil, daß die Ausbeute an den gewünschten Nutzsubstanzen nicht hoch genug ist. Aus diesem Grund besteht auf diesem Gebiet der ernstgemeinte Wunsch nach Entwicklung eines Expressionsvektors,der zur Herstellung von nutzbringenden Substanzen mit hoher Ausbeute geeignet ist.

Unter dem Gesichtspunkt des industriellen Einsatzes der Gentechnik und im Hinblick auf eine Senkung der Kosten zur Herstellung von nutzbringenden Substanzen bestand hier der Wunsch, einen Expressionsvektor zu entwickeln, der sich durch eine große Genexpressionskraft auszeichnet. Die grundlegenden Techniken zur Genrekombination sind in den Proceedings of the National Academy of Science, U.S.A., 70, 3240-3244 (1973) und 71, 1743-1747 (1974) beschrieben, doch wurde in diesen Veröffentlichungen kein allgemeines Verfahren zur Isolierung eines Gens vorgeschlagen, das sich durch eine hohe Genexpressionskraft auszeichnet und aus einer großen Anzahl natürlich vorkom-

mender Gene isoliert wird, woraus sich bei der Lösung der genannten Aufgabenstellung Schwierigkeiten ergeben.

Zur vorliegenden Erfindung wurden umfangreiche intensive Untersuchungen und Studien zur Lösung dieses Problems durchgeführt, mit dem Ergebnis, daß eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein gefunden wurde, die einen Expressionsvektor mit äußerst starker Genexpression - verglichen mit den bis dahin bekannten Vektoren - ergibt. Dann wurde mit Erfolg ein solcher Expressionsvektor hergestellt, der eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein führt, wobei man die Kloniertechnik mit grobem Erfolg einsetzte. Diese neuen Erkenntnisse und Erfolge bilden die Grundlage der vorliegenden Erfindung.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen Expressionsvektor zu entwickeln, der sich durch seine hohe Genexpressionskraft auszeichnet, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Genexpressionsvektors zu entwickeln, und die Verwendung zur Herstellung von Polypeptiden mit hoher Ausbeute unter Einsatz öines Expressionsvektors der vorgenannten Art mittels Genexpression zu schaffen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Expressionsvektor der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß das DNS-Fragment an das Replikon gebunden ist.

Sie wird des weiteren durch ein Verfahren mit folgenden Schritten gelöst:

1) Herstellung einer chromosomal en DNS (DNA) mit einer Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein aus Bakterien, die zur Gruppe der Enterobacterinceen gehören;

2) Aufspaltung der chromosomal en DNS mit Hilfe eines Restriktionsenzyms in DNS-Fragmente;

3) Ligieren der DNS-Fragmente an ein Replikon aus der Gruppe der Plasmide und Bakteriophagen;

4) Transformierung der Zellen eines Bakteriums aus der Gruppe der Enterobacteriaceen mit Hilfe des Replikons, an welches das DNS-Fragment ligiert ist, in Transformationsprodukte, darunter Transformationsprodukte, welche einen Rekombinationsvektor mit dem DNS-Fragment enthalten, das eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein mit sich führt;

5) Auslesen von Transformationsprodukten, welche den Rekombinationsvektor mit dem eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein enthaltenden DNS-Fragment beinhalten, aus den Transformationsprodukten,

6) Isolieren des Rekombinationsvektors mit dem die Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein führenden DNS-Fragment aus den ausgelesenen bzw. selektierten Trans forma ti onsprodukten .

Diese und weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden ausführlichen Beschreibung unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung. Es zeigen:

Fig. 1 die Restriktionsabbildungen der Plasmide pSN401, pSN507, pSN508 und pSN518,
und

Fig. 2 das Ablaufschema für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Plasmids pSN2507, mit den Restriktionsabbildungen der Plasmide pKN402A, pSHIOl und PSN25O7.

In Fig. 1 und 2 ist mit der symbolischen Bezeichnung

"phoS" eine Genkodierung für ein Phosphatbi ndungs-protei η der Enterobacteriaceen angegeben, worüber eine ausführliche Erläuterung an anderer Stelle gegeben wird. Die symbolischen Bezeichnungen "phoT", "pstA" und "phoU" stehen jeweils für Gene, die zusammen mit phoS an der Chromosomen-DNS von E.coli angelagert sind; auch hierüber folgt eine genaue Erläuterung später. Zur Kennzeichnung der Erkennungssequenzen bei den Restriktionsenzymen werden die folgenden Symbole verwendet:

EcoRI, Hpal, Pstl , BgIII, MIuI Hindlll, Aval, Hindi und Smal (wobei die· angehängten Zahlen bei diesen Symbolen gemäß der Zeichnung zur Kennzeichnung der jeweiligen Erkennungsorte für ein Restriktionsenzym eingesetzt sind.)

Weitere Abkürzungen:
R

Tn3(Ap ) (angegeben mit V//////A) ·. Transposon welches eine Genkodierung für die Ampicillinresistenz enthält;

Rep: Replikationsgen

ori: Replikationsausgangspunkt

Kb: 1.000 Nukleotidenpaare

„J: ausgelöschter Teil

Ein Aspekt der. vor! legenden Erfindung besteht darin, daß ein Express.ionsvektor geschaffen wird, der ein DNS-Fragment mit einer Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein und ein Replikon aus der Gruppe der Plasmide und Bakteriophagen enthält, wobei das DNS-Fragment an das Replikon Iigiert ist.

Der Begriff "Replikon" bezeichnet in diesem Zusammenhang einen Vektor, der replikationsfähig ist und ein Gen für ein phänotypisches Merkmal sowie eine Restriktionsstelle

- ίο -

aufweist, die zur Anbindung eines Spender-DNS-Fragments geeignet ist.

Unter einem Replikon versteht man einen Träger der genetischen Information, der als Replikationseinheit einer Nukleotidenkette bekannt ist, so daß bei Beginn eines ReplikationsVorgangs die Replikation nacheinander bis zum Ende der Nukleotidenfolge schrittweise stattfindet. Als Beispiele für ein solches Replikon lassen sich Pias-, mide , Bakteriophagen, Viren und dergleichen nennen. Zu den Replikonen gehören DNS-Replikone und RNS-Replikone, doch werden aus praktischen Erwägungen heraus bei der vorliegenden Erfindung die RNS-Replikone nicht bevorzugt eingesetzt. Als DNS-Replikone lassen sich Plasmide und replikationsfähige DNS-Fragmente nennen, die von DNS-Viren abgeleitet sind, ferner procaryotische und eucaryotische Zellen. Von diesen werden für den Einsatz bei der vorliegenden Erfindung die Plasmide und Bakteriophagen bevorzugt. Herkömmlicherweise werden zum Klonieren verschiedener Gene DNS-Replikone mit weiter Verbreitung eingesetzt, welche ein Gen mit sich führen, das Resistenz gegenüber Antibiotika verleiht. Das weitverbreitete Verfahren zum Klonieren einesGens umfaßt die Auflösung einer Chromosomen-DNS mit einem Restriktionsenzym zur Herstellung eines DNS-Fragments, welches das gewünschte Gen führt, die Ligierung des DNS-Fragments an das DNS-Repl ikon, die Transformierung eines Einzeller-Organismus mit dem DNS-Replikon, welches das DNS-Fragment umfaßt, in Transformationsprodukte, die Isolierung der Transformationsprodukte aus den einzelligen Stammorganismen unter Einsatz der Antibiotikaresistenz, die durch das DNS-Replikon verliehen wird, und Inkubieren der isolierten Transformationsstoffe, wobei das DNS-Replikon mit dem DNS-Fragment Moniert wird.

- li -

Die Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein ist für den Phosphattransport und den Phosphatstoffwechsel verantwortlich und ist von der Entwicklung her in procaryotischen Zellen und einzelligen eucaryotischen Zellen vorhanden. Unter anderem wurde die Genkodierung für ein Protein zur Phosphatbindung bei Escherichia coli relativ eingehend untersucht, und insbesondere wird das Gen bei Escherichia coli als phoS-Gen bezeichnet. Das phoS-Gen ist nicht nur bei Escherichia col i, sondern auch bei Bakterien aus dem Stamm der Enterobacteriaceen vorhanden. Dementsprechend läßt sich das phoS-Gen jedes Bakteriums vom Stamm der Enterobacteriaceen bei der vorliegenden Erfindung verwenden. Das phoS-Gen bei Escherichia coli ist zusammen mit phoT, pstA und phoU bei 83 Minuten auf der genormten Genabbildung für E.coli (Backman, B.J. und K.B. Low, Microbiol.Rev., 44, 1-56 (1980)) angelagert. Die Gene phoT, pstA und phoU sind Gene, deren Funktion im Zusammenhang mit dem Phosphattransport und dem Phosphatstoffwechsel steht. Wie. schon erwähnt, sind die Gene phoS, phoT, pstA und phoU in Haufen auf einem Chromosom von E. e-eli angelagert, und wenn nun aus der Chromosomen-DNS von E.coli mit Hilfe eines Restriktionsenzyms das das phoS-Gen führende DNS-Fragment gewonnen wird, so enthält das DNS-Fragm'ent auch die Gene phoT, pstA und phoU. Die Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein bei λglnlS-Phage wurde ebenfalls untersucht und kann bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.

Außerdem lassen sich Gene, deren Funktion im Zusammenhang mit dem Phos.phattransport und dem Phosphatstoffwechsel steht, bei Hefe und einem anderen Bakterium als einem der Familie der Enterobacteriaceen verwenden. In diesem Fall muß man ein Replikon und einen Wirt suchen, die für £ene geeignet sind, deren Funktion im Zusammenhang mit dem Phosphattransport und dem Phosphatstoffwechsel bei Hefe und

einem anderen Bakterium als einem aus der Familie der Enterobacteriaceen steht.

Entsprechend einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Gewinnung eines Expressionsvektors geschaffen, bei welchem

1) eine Chromosomen-DNS hergestellt wird, die eine Genkodierung für ein Protein zur Phosphatbindung enthält, und zwar aus einem Bakterium der Familie der Enterobacteriaceen;

2) die Chromosomen-DNS mit einem Restriktionsenzym zur Erzeugung von DNS-Fragmenten gespalten wird;

3) die DNS-Fragmente an ein aus der Gruppe der Plasmide und Bakteriophagen gewähltes Replikon ligiert werden;

4) Zellen eines Bakteriums aus der Familie der Enterobacteriaceen mit dem Replikon, an welches die DNS-Fragmente ligiert sind, zur Bildung von Transformationsprodukten transformiert werden,darunter solchen, die einen Rekombinationsvektor enthalten, unter anderem die DNS-Fragmente, welche eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein führen;

5) Transformationsprodukte, welche den Rekombinationsvektor, darunter die eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein führenden DNS-Fragmente, aus den gesamten Transformationsprodukten ausgewählt werden, und

6) der Rekombinationsvektor, einschließlich der die Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein führenden DNS-Fragmente, aus den ausgewählten Transformationsprodukten isoliert wird.

Im Schritt 1 des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt man aus Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceen unter Einsatz einer üblichen Isoliertechnik wie beispielsweise Lyse, Zentrifugieren oder dergleichen eine chromosomale DNS her, welche eine Genkodierung für ein Phosphat-

bindungsρrotein (nachstehend einfach "phoS-Gen" genannt) enthält.

Im zweiten Schritt wird die im ersten Schritt hergestellte Chromosomen-DNS mit einem Restriktionsenzym gespalten, wobei man DNS-Fragmente erhält, welche ein das phoS-Gen führendes DNS-Fragment ^DNA-Fragment) umfassen.

Im dritten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich, wie schon oben erwähnt, jedes Plasmid und jeder Bakteriophage als Replikon verwenden. Die Anbindung der DNS-Fragmente an das Replikon läßt sich unter Verwendung einer Ligase nach dem herkömmlichen Verfahren durchführen (vgl. beispielsweise US-PS 4,237,224). Mindestens eines der ein phoS-Gen und ein Replikon führenden DNS-Fragmente hat ein Gen für ein phänotypisches Merkmal.

Im vorgenannten vierten Schritt werden Zellen eines Bakteriums aus der Gruppe der Enterobacteriaceen mit dem das DNS-Fragment führenden Replikon, welches vorher in Schritt 3 hergestellt wurde, transformieren. Als Bakterium aus der Gruppe der Enterobacteriaceen lassen sich die Stämme Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia und Shigella nennen. Neben den genannten Bakterien lassen sich auch Mutantenzellen all dieser Bakterien verwenden. Selbstverständlich muß das entsprechende Bakterium unter Berücksichtigung der Replikati onsfähigkei t des Replikons in den Zellen eines Bakteriums gewählt werden. Beispielsweise lassen sich in geeigneter Form die Spezies Escherichia coli, Serratia oder Salmonella als Wirt verwenden, wenn als Replikon ein allgemein bekanntes Plasmid vom Entspannungstyp wie pBR322, pBR325, pACYA177 oder pKN410 verwendet wird.

Im vorgenannten fünften Schritt werden die Transformationsprodukte zunächst von den Stammzellen eines Bakteriums aus der Gruppe der Enterobacteriaceen mit Hilfe des phänotypischen Merkmals isoliert, beispielsweise unter Ausnutzung einer Medikamentenresistenz, die durch das Replikon vermittelt wird, welches die entsprechenden Merkmalsgene führt. Anschließend werden die Transformationsprodukte, welche den Rekombinationsvektor enthalten - darunter das DNS-Fragment, welches das phoS-Gen führt - aus den wie vorstehend isolierten Transformationsprodukten selektiert, wobei als Kriterium die Menge des Phosphatbindungsproteins in den Transformationsprodukten eingesetzt wird. Die Menge des Phosphatbindungsproteins in jedem der Transformationsprodukte wird folgendermaßen bestimmt. Zunächst wird das Phosphatbindungsprotein aus dem Transformationsprodukt isoliert und mit Hilfe einer üblichen Technik, z.B. Lyse, Zentrifugieren oder Aussalzen, gereinigt. Dann wird mittels einer üblichen Technik wie beispielsweise der SDS-Agarose-Gelelektrophorese die Menge des gereinigten Phosphatbindungsproteins bestimmt. Die Menge an Phosphatbindungsprotein in jedem der Transformationsprodukte wird mit der Menge an Phosphatbindungsprotein verglichen, die von einer Stammzelle eines Bakteriums aus der Gruppe der Enterobacteriaceen erzeugt wird, welche nicht mit dem das DNS-Fragment führenden Replikon transformiert wurde. Die Transformationsprodukte mit einer größeren Menge an Phosphatbindungsprotein als in der Stammzelle des Bakteriums der Gruppe der Enterobacteriaceen werden dann ausgelesen.

Wenn als Zelle eines Bakteriums der Gruppe der Enterobacteriaceen im vorstehend beschriebenen Schritt 4 eine Mutantenzelle eingesetzt wird, welche nicht nur unter phosphatarmen, sondern auch unter phosphatreichen Bedingungen alkalische Phosphatase erzeugt, so läßt sich die Auslese

der Transformationsprodukte, die das Repiikon mit dem das phoS-Gen führenden DNS-Fragment enthalten, im vorstehend beschriebenen fünften Schritt sehr leicht ausführen, ohne Bestimmung der Menge des Phosphatbindungsproteins in jedem der Transformationsprodukte. Der Grund hierfür ist folgender. Wird eine solche Mutantenzelle mit dem das DNS-Fragment führenden Replikon, wie im vorstehend beschriebenen dritten Schritt hergestellt, transformiert, so erzeugt die Mutantenzelle alkalische Phosphatase unter phosphatarmen Bedingungen, jedoch unter phosphatreichen Bedingungen aufgrund der Funktion des im DNS-Fragment, das an das Replikon ligiert ist, enthaltenen phoS-Gens keine alkalische Phosphatase. Wenn somit die Transformation unter phosphatreichen Bedingungen ausgeführt wird, so werden hinsichtlich der alkalischen Phosphatase negative Transformationsprodukte ausselektiert.

Im vorstehend erläuterten sechsten Schritt wird der Rekombinationsvektor mit dem das phoS-Gen führenden DNS-Fragment aus den im fünften Schritt ausgelesenen Transforma ti ons produkte η mittels einer üblichen Technik wie beispielsweise Lyse, Zentrifugieren oder dergleichen isoliert.

Andererseits ist zu beachten, daß ein Expressionsvektor, der ein Gen führt, dessen Funktion im Zusammenhang mit dem Phosphattransport und dem Phosphatstoffwechsel steht, bei Hefe oder einem anderen Bakterium als einem aus der Gruppe der Enterobacteriaceen im wesentlichen nach dem selben Verfahren wie dem vorbeschriebenen hergestellt werden kann. Des weiteren ist zu beachten, daß anstelle des in Schritt 1 und 2 des vorstehend erläuterten Verfahrens hergestellten DNS-Fragments ein DNS-Fragment eingesetzt werden kann, das aus Phagen wie beispielsweise den AglmS-Phagen gewonnen wurde.

Der nach dem vorstehend erläuterten Verfahren hergestellte Rekombinationsvektor läßt sich hinsichtlich des DNS-Fragmentanteils und/oder des Replikonanteils mit Hilfe eines Restriktionsenzyms teilweise auslöschen, während das phoS-Gen beibehalten wird, worauf der dann entstandene, ausgelöschte Rekombinationsvektor mit Hilfe einer Ligase erneut so angebunden wird, daß sich ein rekonstruierter Rekombinationsvektor mit geringerer Größe bildet. Der rekonstruierte Rekombinationsvektor läßt sich leichter manipulieren, da die Anzahl der Restriktionsstellen im rekonstruierten Rekombinationsvektor gegenüber derselben Anzahl im ursprünglichen Rekombinationsvektor verringert wurde. Wenn außerdem eine Genkodierung für ein bestimmtes Polypeptid an den rekonstruierten Rekombinationsvektor angebunden wird, so wird das Verhältnis der Länge der Polypeptid-Genkodierung zur Gesamtlänge des Rekombinationsvektors größer als bei Anbindung der Polypepti d-Genkodierung an den ursprünglichen Rekombinationsvektor, der nicht rekonstruiert wurde. Es ist gut verstellbar, daß mit zunehmendem Verhältnis zwischen der Länge der Polypeptid-Genkodierung und der Gesamtlänge des Rekombinationsvektors die pro Zelle gewonnene Proteinmenge ansteigt und die pro Zelle entstehende Menge an Nebenprodukten kleiner wird. Wenn somit der vorstehend rekonstruierte Rekombinationsvektor zur Gewinnung eines bestimmten gewünschten Polypeptides eingesetzt wird, so läßt sich nicht nur die hohe Produktivität für das Polypeptid erzielen, sondern auch mühelos eine höhere Reinheit des gewonnenen Polypeptides.

Ein das phoS-Gen führendes DNS-Fragment läßt sich aus dem Rekombinationsvektor herauslösen, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt und an eine andere Art von Replikon als der ursprüngliche Rekombinationsvektor angebunden wurde, um einen anderen Typus eines rekonstruierten Rekombinationsvektors herzustellen. Ein solcher anderer

Typus eines rekonstruierten Rekombinationsvektors läßt sich vorteilhaft einsetzen, wenn eine mühelose Auslese der Transformationsprodukte durch Veränderung eines phänotypischen Merkmals des Replikons und/oder eine Erhöhung der Vervielfältigungszahl eines Rekombinationsvektors beabsichtigt sind. Der Einsatz eines solchen anderen Typus eines rekonstruierten Rekombinationsvektors ist wünschenswert, wenn die mit Hilfe des ursprünglichen Rekombinati.onsvektors hergestellten Transformationsprodukte diejenigen sind, aus denen sich die erwünschten Transformationsprodukte nur mit Mühe auslesen lassen und/oder bei denen die Replikationsfähigkeit des ursprünglichen Replikationsvektors in den Transformationsprodukten niedrig ist.

Die Rekonstruktion des Rekombinationsvektors wird, wie bereits erwähnt, mit einer der üblichen Techniken ausgeführt (vgl. beispielsweise die US-PSen 4,340,674, 4,349,629 und 4,356,270).

Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Expressionsvektor läßt sich durch Aufbau des Restriktionsbildes wie folgt kenntlich machen. Der Expressionsvektor wird zur Gewinnung von DNS-Fragmenten mit verschiedenen Restriktionsenzymen teilweise oder völlig aufgelöst. Die gewonnenen Fragmente werden einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen, wobei Größe und Restriktionsmuster des Expressionsvektors bestimmt werden. DieLageder phoS-Gene auf dem genannten Expressionsvektor wird durch Aufbau einer Vielzahl verschiedener erfindungsgemäß ausgelöschter Expressionsvektoren mittels teilweiser oder vollständiger Auflösung mit einem entsprechenden Restriktionsenzym und mit anschließender Selbstbindung und durch Untersuchung der gelöschten Expressionsvektoren durch Komplementbildungstests bestimmt, bei denen als Wirt die phoS-Gen-ne-

gativen Mutanten verwendet werden.

Der das phoS-Gen führende erfindungsgemäße Expressionsvektor hat die folgenden Vorteile, wenn die Genkodierung für ein gewünschtes Polypeptid an den Expressionsvektor an dessen unterhalb der DNS-Sequenz für den Promotor eines phoS-Gens angebunden wird und durch Gentechniken die Gewinnung des erwünschten Polypeptides durchgeführt wird:

1) Die Ausbeute des vorgenannten erwünschten Polypeptides beträgt 1 χ 10 - 10 Moleküle/Zelle, also mehrere bis 100 Male höher als bei Verwendung des üblicherweise verwendeten Vektors.

2) Die Genexpression des Expressio.nsvektors gemäß der vorliegenden Erfindung läßt sich einschränkungslos durch Einstellung der Phosphatkonzentration im Kulturmedium steuern. Damit läßt sich auch die Produktion des gewünschten Polypeptides durch Einstellen der Phosphatkonzentration im Kulturmedium steuern.

3) Das gewünschte Polypeptid kann zusammen mit dem Anteil an Phosphatbindungsprotein in das Periplasma des Wirts ausscheiden. Damit läßt sich das gewünschte Polypeptid ohne Schwierigkeiten vom Wirt isolieren.

Aus diesem Grunde läßt sich der erfindungsgemäße Expressionsvektor in großem Umfang industriell einsetzen. Nach- · stehend wird nun ein Beispiel für das Verfahren zur Herstel lung eines gewünschten Polypeptides mit Hilfe des erfindungsgemäßen Expressionsvektors beschrieben. Die Genkodierung für das gewünschte Polypeptid wird aus den Genen eucaryotischer Zellen, procaryotischer Zellen oder Viren gewonnen, und das so gewonnene Gen wird an den erfindungsgemäßen Expressionsvektor gebunden. Anschließend wird der Wirt mit dem zuvor gewonnenen Expressionsvektor unter Bildung von Transformationsprodukten umgewandelt. Anschlie-

ßend werden die so erhaltenen Transformationsprodukte im großen inkubiert, um damit die gewünschten Polypeptide mit extrem hoher Ausbeute zu gewinnen.

Somit wird nach einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit Hilfe der Genexpression unter Einschaltung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors geschaffen, welches folgendermaßen abläuft:

1) Ligiereneines eine Genkodierung für ein Polypeptid führenden DNS-Fragmentes an den Expressionsvektor an dessen unterhalb der DNS-Folge eines Promotors für die Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein liegenden Abschnitt;

2) Transformieren einer Zelleeines Bakteriums aus der Gruppe der Enterobacteriaceen mit dem Expressionsvektor, der die Genkodierung für ein daran gebundenes Polypeptid enthält, zur Bildung von Transformationsprodukten;

3) Auslesen der Transformationsprodukte von Stammzellen eines Bakteriums aus der Gruppe der Enterobacteriaceen;

4) Inkubieren der Transformationsprodukte, wobei diese zur Expression der Genkodierung für das Polypeptid und die Produktion des Polypeptides veranlaßt werden, und

5) Isolieren des Polypeptides von den inkubierten Transformati onsprodukten .

Bei praktischer Durchführung des vorbeschriebenen Verfahrens wird zunächst durch organische Synthese ein DNS-Fragment mit einer Genkodierung für ein Polypeptid gewonnen oder durch herkömmliche Techniken wie Lyse, Zentrifugieren, Auflösen mit einem Restriktionsenzym oder dergleichen aus Organismen isoliert. Es ist auch möglich, ein DNS-Fragment mit einer Genkodierung für ein gewünschtes Polypeptid aus einem RNS-Fragment zu gewinnen, das aus einer Boten-

RNS und RNS-Viren durch Umwandeln eines RNS-Fragmentes mit dem gewünschten Gen in das komplementäre DNS-Fragment mit Hilfe allgemein bekannter Umkehr-Transcriptase hergestellt wird. Das eine Genkodierung für ein Polypeptid führende DNS-Fragment wird an einen das erfindungsgemäße phoS-Gen führenden Expressionsvektor an dessen unterhalb der DNS- Sequenz eines Promotors für das phoS-Gen liegenden Abschnitt gebunden. Mindestens eines der eine Genkodierung für ein Polypeptid führenden DNS-Fragmente, eines der das phoS-Gen des Expressionsvektors führenden DNS-Fragmente oder das Replikon des Expressionsvektors hat ein Gen für ein phänotypisches Merkmal, beispielsweise die Resistenz gegenüber Medikamenten, Enzymtätigkeit oder dergleichen. Der Abschnitt, an dem das eine Genkodierung für ein Polypeptid führende DNS-Fragment an den Expressionsvektor ligiert wird, kann zwischen dem proximal und dem distal gelegenen Teil des das phoS-Gen führenden DNS-Fragmentes liegen, so daß ein Verschmelzungs- bzw. Fusionsprotein erzeugt werden kann. Dieser Abschnitt kann auch unterhalb des das phoS-Gen führenden DNS-Fragmentes liegen, so daß ein Hybridprotein erzeugt werden kann. Der vorbeschriebene Vorgang der Anbindung wird mit Hilfe einer Ligase unter Einsatz herkömmlicher Techniken durchgeführt (vgl. beispielsweise US-PS 4,237,224).

Im vorgenannten zweiten Schritt werden Zellen eines Bakteriums aus der Gruppe der Enterobacteriaceen mit dem Expressionsvektor mit der Genkodierung für ein Polypeptid, die mittels herkömmlicher Verfahren daran ligiert ist, transformiert (vgl. beispielsweise US-PS 4,237,224). Als Beispiele für ein Bakterium aus der Gruppe der Enterobacteriaceen lassen sich Erwinia, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia und Shigella nennen.

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Im vorstehend beschriebenen dritten Schritt wird das Transformationsprodukt aus den Stammzellen des Bakteriums aus der Gruppe der Enterobacteriaceen anhand eines phänotypischen Merkmals ausgesondert, wie z.B. Resistenz gegenüber Medikamenten, die durch den Expressions vektor vermittelt wird.

Im vorgenannten vierten Schritt werden die Transformations produkte unter geeigneten Nährbedingungen für diese inkubiert, wodurch die Transformationsprodukte zur Expression der Gene und zur Produktion des gewünschten Polypeptids veranlaßt werden.

Im vorgenannten fünften Schritt erfolgen die Isolierung des gewünschten Polypeptides aus den Transformationsprodukten und die Reinigung der Polypeptide mit Hilfe einer herkömmlichen Technik wie beispielsweise Lyse, Aussalzen, Säulenchromatographie oder dergleichen.

Wenn die Genkodierung für ein gewünschtes Polypeptid an den unterhalb der DNS-Folge, die die Kodierung für das Signalpeptid eines phoS-Gens im ersten Schritt darstellt, liegenden Abschnitt des Expressionsvektors ligiert ist, so wird das gewünschte Polypeptid, das in den Transformationsprodukten im vorgenannten vierten Schritt gewonnen wurde, in .das Periplasma der Transformationsprodukte abgeschieden. Der Grund hierfür ist folgender. Das genannte Signalpeptid ist im phoS-Gen auf der Seite der N-terminalen Aminosäuresequenz eines Phosphatbindungsproteins kodiert und seine Expression erfolgt zusammen mit der eines Phosphatbindungsproteins. Das Signalpeptid ist zur Interaktion mit der Innenmembran einer Zelle und zur Sekretion durch diese erforderlich. Mit anderen Worten, das Signalpeptid spielt bei der Abscheidung eines Phosphatbindungsproteins in das Periplasma einer Zelle durch die Innenmem-

bran ei ne RoI1e.

Wenn somit das Transformationsprodukt, welches den Expressionsvektor enthält, an den die Genkodierung für ein gewünschtes Polypeptid an dem unterhalb der DNS-Sequenzkodierung für das Signalpeptid des phoS-Gens ligiert ist, inkubiert wird, so wird das gewünschte Polypeptid, das im Transformationsprodukt erzeugt wurde, in das Periplasma des Transformationsproduktes aufgrund der Funktion des Signal peptides abgeschieden. Das in das Periplasma abgeschiedene Polypeptid läßt sich ohne Lysierung des Transformationsproduktes isolieren, und damit ist im Vergleich zu der Polypeptidproduktion, bei der keine Abscheidung in das Periplasma erfolgt, die Einzeldarstellung des sekretierten Polypeptides sehr einfach.

Der Expressionsvektor mit einer Genkodierung für ein daran gebundenes Polypeptid, der im ersten Schritt hergestellt wurde, läßt sich im wesentlichen in gleicher Weise wie zuvor im Zusammenhang mit der Rekonstruktion des erfindungsgemäßen Expressionsvektors beschrieben rekonstruieren. Beispielsweise läßt sich der Expressionsvektor mit einer Genkodierung für ein daran gebundenes Polypeptid an einem Abschnitt, der zur Bildung eines Hybridproteins führt, in einen Expressions vektor umwandeln, dessen Genkodierung für ein Polypeptid an einen Abschnitt angebunden ist, der zur Bildung eines Verschmelzungs- bzw. Fusionsproteins führt

Es ist darauf zu achten, daß das phoS-Gen sich an eine Kodierung für ein gewünschtes Polypeptid bei Virengenen ligieren läßt, so daß das im Virusgen kodierte gewünschte Polypeptid mit guter Leistung produziert werden kann.

Wie vorstehend erläutert und beschrieben wurde, läßt sich der Expressions vektor zur Erzeugung physiologisch aktiver Substanzen, von Enzymen, Antigenen, Toxinen, Aminosäuren, Stoffwechselnebenprodukten und dergleichen einsetzen. Als Beispiele für physiologisch aktive Peptide lassen sich Hormone wie Somatostatiη, Insulin, Corticotropin, das Wachstumshormon und dergleichen, Kalmodulin, die ZeI!wachstumsfaktoren, Interferone und dergleichen nennen. Als Enzyme kann man Urokinase, Mutanase, Amylase, Glukose-Isomerase, Hyaluronidase, Umkehr-Transkriptase , Enzyme zur Stickstoffixierung und dergleichen nennen. Unter den Antigenen sind das Antigen für das Grippevirus HA, das Oberflächenantigen für Hepatitis B und dergleichen zu nennen. Als Beispiele für Toxine lassen sich das Toxin für Bordetella pertussis, Schlangengift und dergleichen nennen, und als Beispiele für Aminosäuren seien L-Glutaminsäure, L-Lysin, L-Methionin und dergleichen hier genannt. Antibiotika, Mycotoxine und ähnliches sind Beispiele für Stoffwechsel nebenprodukte, und als Beispiele für andere Proteine als die vorstehend aufgeführten Substanzen seien opioide Peptide, Ovalbumin und ähnliches genannt. Daraus ergibt sich, daß die Erfindung bei der Herstellung von Nahrungsmitteln, Medikamenten, Futtermitteln, fermentierten Erzeugnissen, Energiequellen und dergleichen von großem Nutzen ist.

Nachfolgend wird die Erfindung nun noch eingehender anhand der nachstehenden Beispiele veranschaulicht, die jedoch nicht als Einschränkung für den Umfang der vorliegenden Erfindung aufzufassen sind.

Die in den Beispielen benutzten Kulturmedien, Pufferlösungen, Verfahren zur DNS-Extraktion und Verfahren zur DNS-Reinigung werden jeweils nachstehend zusammengefaßt.

A: Zusammensetzung des T-Mediums

Bacto-Trypton 10 g
NaCl 5 g

beides in 100 ml Wasser aufgelöst.

B: Schnelle Alkali-Extraktion der Plasmid-DNS

0,1 ml einer Lysozym-Lösung (2 mg/ml Lysozym, 50 mM Glukose, 100 mM CDTA (Cyclohexandiamin-Tetraazetat), 25 mM Tris-HCl (pH 8,0)) wurden dem Bakterienzel1granulat zugesetzt, das durch Zentrifugieren von 1,5 ml Kultur nach Inkubation über Nacht hergestellt wurde. Die entstandene Suspension wurde 30 Minuten bei 0 ⁰C inkubiert. Anschließend wurden der Suspension 200 μ! einer alkalischen SDS-Lö'sung (0,2 N NaOH, 1 w/wÄ SDS (Natri um-Dodecyl sul fat) zugesetzt und gerührt. Nach fünfminütigem Inkubieren bei 0 ⁰C wurden der Suspension 150 μΤ 3Μ Natriumazetat (pH 4,8) zugesetzt und vorsichtig damit vermischt. Die entstandene Suspension ließ man 60 Minuten bei 0 ⁰C stehen und zentrifugierte dann die Niederschläge fünf Minuten lang bei bOOO UpM ab. Aus der oberen Schicht des Überstands wurden 0,4 ml Teilmenge mit der Pipette abgezogen. Die Teilmenge wurde mit 1 ml kalten wasserfreien Äthanols zur Ausfällung der DNS vermischt. Das entstehende Gemisch wurde 2 Minuten zentrifugiert und der sich bildende überstand wurde entfernt; dem entstandenen Granulat wurden 100 μΐ einer Natriumazetatlösung (0,1 M Natriumazetat, 0,05 M Tris-HCl (pH 8,0)) zugesetzt. Die entstehende Lösung wurde mit der doppelten Menge eines kalten wasserfreien Äthanols zur erneuten Ausfällung der DNS versetzt. Die ausgefällte DNS wurde in einem entsprechenden Puffer aufgelöst. Die Einzelheiten der vorstehenden Arbeitsgänge sind in Nucleic Acid

Research, Band 7, Nr. 6, S. 1513-1523 (1979) beschrieben. Die nach dem vorstehenden Arbeitsablauf gewonnene Rohplasmid-DNS läßt sich für physikalische Abbildungsanalysen und zu Transformationszwecken verwenden.

C: Entfernen des Ethidiumbromids aus der PNS

Die DNS-Fraktion wurde nach der CsCl-Dichtegradient-Zentrifugation mit der gleichen Volumenmenge einer Isopropanollösung vermischt, die mit wäßriger 5 M NaCl - 10 mM Tris-HCl-1 mM Na₃EDTA (pH 8,3) gesättigt war. Dieser Vorgang wurde bis zur Entfärbung der wäßrigen Phase wiederholt, welche die DNS enthält. Zwei Volumenanteile Wasser und anschließend 6 Volumenanteile wasserfreies Äthanol wurden der entstandenen wäßrigen Phase zugesetzt. Man ließ das Gemisch bei - 20 C eine Stunde bis mehrere Tage zur Ausfällung der DNS stehen. Die ausgefällte DNS wurde durch Zentrifugieren aufgefangen und zur Herstellung einer DNS-Probe getrocknet. Die DNS-Probe wurde in 100 μ! einer Tris-EDTA-Lösung (10 mM Tris-HCl, 1 mM Na₃EDTA (pH 7,5)) aufgelöst und der Verwendung zugeführt. Einzelheiten über dieses Verfahren finden sich in Advanced Bacterial Genetics, S.126, Cold Spring Harbor Laboratory (1980).

D: Zusammensetzung des Puffers für das EcoRI-Restriktionsenzym (fünffach konzentriert)

NaCl 500 mM

Tris-HCl 250 mM (pH 7,4) MgSO₄ 50 mM

E: Zusammensetzung des Ligasepuffers

Tris-HCl 66 mM (pH 7,6)

MgCl₂ 6,6 mM

Dithiothreitol 10 mM

ATP ' 0,5 mM

F: CsCl-Biock-Dichtegradient-Zentrifugation

Unten in ein Zellulosenitrat-Zentrifugenglas mit einem Durchmesser von 0,5 Zoll (12,7 mm) und einer Länge von 2 Zoll (50,8 mm) (von Beckman Instruments Inc., U.S.A. hergestellt und vertrieben) brachte man 1 ml einer 5,0 M-CsCl-Lösung (5,0 M CsCl, 10 mM MgSO₄, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM Na₂EDTA (Schwebdichte = 1,60)) ein. über die Lösung im Glas brachte man 3 ml einer 3,0 M-CsCl-Lösung (3,0 M CsCl, 10 mM MgSO₄, i0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM Na₂EDTA (Schwebdichte = 1,40) ein. Dann wurde über die CsCl-Lösungsschicht 1 ml einer Phagensuspension eingebracht, und das Ganze mit 30.000 UpM in einem Rotor vom Typ SW 50.1 (von Beckman Instruments Inc., U.S.A. hergestellt und vertrieben) bei 20 C eine Stunde lang zentrifugiert. Anschließend wurden mit Hilfe einer lml-Spritze und einer 5/8-Zoll Nadel (Kaliber 25) weniger als 0,5 ml der phagenfraktion von den Seitenwandungen des Glases abgenommen. Einzelheiten dieses Verfahrens sind in Advanced Bacterial Genetics, S. 80-81, Cold Spring Harbor Laboratory (1980) beschrieben.

G: CsCl-Gleichgewichts-Dichtegradient-Zentrifugation

Die nach dem obigen Arbeitsschritt F hergestellte Phagenfraktion wurde mit einer 4,0 M CsCl-Lösung (4,0 M CsCl, 10 mM MgSO₄, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA) versetzt und mit 30.000 UpM in einem Rotor vom Typ SW 50.1 20 Stunden lang zentrifugiert. Mit einer lml-Spritze und einer 5/8-zölligen Nadel (Kaliber 25) wurden von den Seitenwandungen des Zentrifugenglases ganze 0,b ml Phagenfraktion abgenommen. Einzelheiten dieses Verfahrens sind in Advanced Bacterial Genetics, S. 81, Cold Spring Harbor Laboratory (1980) beschrieben.

H: Zusammensetzung des LB-Mediums

Bacto-Pepton 10 g Hefeextrakt 5 g

NaCl 5 g

Diese drei Bestandteile wurden in 1000 ml Wasser aufgelöst und durch Zusatz von NaOH wurde der pH-Wert auf 7,2 eingestellt.

I: Zusammensetzung des T-Agarmediums

Bacto-Tripton 10 g NaCl 5g

Nährboden(Agar) Ib g

Diese drei Bestandteile wurden in Wasser aufgelöst, und dann wurde soviel Wasser zugesetzt, daß insgesamt ein Lösungsvolumen von 1000 ml erreicht wurde.

* (Hinweis)

Nach Sterilisierung des Mediums im Autoklav setzte man 1/1000 Volumen einer wäßrigen TetrazykI in Iösung von 10 mg/ml oder einer wäßrigen Ampiei 11inlösung von 40 mg/ml zu. Die die Antibiotika enthaltenden Medien wurden zur Auslese der gegenüber Antibiotika resistenten Transformationsprodukte verwendet und sollten die Aufrechterhaltung des antibiotika-resistenten Rekombinationsvektors in den Bakterienzellen sicherstellen.

Beispiel 1

Erster Schritt: Gewinnung der DNS für Plasmid pBR322 und

Spaltung der DNS für Plasmid pBR322 mit dem Restriktionsenzym EcoRI

1 1 des T-Mediums wurde mit 10 ml Keimen von Escherichia coli Κ-12-Stamm C600 geimpft (B.J. Bachmann, Bacterial. Rev., 36, 525-557 (1972)) (Träger des Plasmids p'BR322) und unter Schütteln bei 37 ⁰C kultiviert, bis die Trübung der Kulturbouillon bei 600 nm 0,6A erreichte. Der Bouillon wurde Chloramphenicol bis zur Endkonzentration von 250 μg/ml zugesetzt. Anschließend wurde die Kultur 15 Stunden lang bei 37 ⁰C inkubiert und zur Zellgewinnung zentrifugiert. Die so gewonnenen Zellen wurden einmal mit 100 ml Tris-EDTA-Lösung (die 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) und 1 mM EDTA enthielt) gewaschen und schnell alkalisch extrahiert; dies ergab eine Rohplasmid-DNS. In die so hergestellte Rohplasmid-DNS wurde die obige Tris-EDTA-Lösung in solcher Menge zugesetzt, daß das Gesamtvolumen 15 ml betrug. 16 g kristallines CsCl und 2 ml Ethidiumbromid in einer Konzentration von 5 mg/ml wurden der Lösung zu-

25 gesetzt, worauf das spezifische Gewicht d des Gemisches durch Zusatz von Wasser oder kristallinem CsCl auf 1,39 eingestellt wurde. Das so hergestellte Gemisch wurde dann 40 Stunden lang bei 20 ⁰C mit 33.000 UpM zentrifugiert. Die Lage des Pl asmi d-DNS-I3andes wurde mit Hilfe langwelligen UV-Lichtes ermittelt, und die Plasmid-DNS wurde durch Fraktionierung gewonnen. Aus der Plasmid-DNS-Fraktion wurde das Ethidiumbromid nach dem in Punkt C beschriebenen Verfahren herausgelöst. Der auf diese Weise hergestellten pBR322-DNS-Lösung (100 ixg/ml ) von 0,2 ml wurden 0,05 ml

des Restriktionsenzympuffers für EcoRI zugesetzt, und anschließend wurde das Restriktionsenzym EcoRI in solch einer Menge zugesetzt, daß die Aktivität des Restriktionsenzyms EcoRI eine Einheit pro μς der Plasmid-DNS erreichte. Die Enzymreaktion lief bei 37 ⁰C 60 Minuten lang ab. Danach wurde das Gemisch 5 Minuten lang auf 65 ⁰C erwärmt, um das Restriktionsenzym zu inaktivieren. Das Gemisch wurde dann gegen eine Tris-EDTA-Lösung (die 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA enthielt) dialysiert. Nach Beendigung der Dialyse wurden dem Gemisch 4 Einheiten alkalischer Phosphatase von Escherichia coli (von Sigma Chemical Co., U. S.A. hergestellt und vertrieben) zugesetzt, worauf 30 Minuten lang bei 65 ⁰C inkubiert wurde. Eine gleiche Menge Phenollösung (durch Sättigung der obigen Tris-EDTA-Lösung ~mit Phenol hergestellt) wurde dem Gemisch zugesetzt und anschließend wurde geschüttelt. Das geschüttelte Gemisch wurde dann mit niedriger Drehzahl zentrifugiert und in die wäßrige Phase und die Phenolphase getrennt. Die wäßrige Phase wurde aufgefangen. Diese Zentrifugierung mit Auffangen der wäßrigen Phase wurde zweimal wiederholt. * Anschließend wurde der aufgefangenen wäßrigen Phase ein gleiches Volumen der Lösung I (24:1 volumetrisch, Gemisch aus Chloroform und Isoamylalkohol) zugesetzt. Dann wurde gründlich gemischt und die wäßrige Phase wurde aufgefangen. Dieser Vorgang wurde viermal wiederholt, worauf die aufgefangene wäßrige Phase gegen einen Ligasepuffer für die nachfolgende Einbindungsreaktion dialysiert wurde, wobei man eine gespaltene DNS-Lösung für pBR322 erhielt.

Zweiter Schritt: Herstellung der DNS-Fragmente mit einem

das phoS-Gen von Escherichia coli K-12-Stamm führenden DNS-Fragment

1 1 des T-Mediums wurde mit 10 ml Keimen von Escherichia coli Κ-12-Stamm KLF48/KL159 (CGSC Nr. 4302) (E.coli Genetic

Stock Center (CGSC), Yale University, Connecticut, U.S.A.) geimpft und unter Schütteln bei 37 ⁰C kultiviert. Die KuI-turbouillon in der Phase eines logarithmisch ansteigenden Wachstums (Trübung: 0,6A bei 600 nm) wurde zur Zellgewinnung zentrifugiert. Die auf diese Weise gewonnenen Zellen wurden in 10 ml einer Lysozyml ö'sung (die 2 mg/ml Lysozym, 100 mM EDTA und 0,15 M NaCl enthielt) suspendiert und die Suspension wurde 15 Minuten bei 37 ⁰C stehen gelassen. Anschließend wurde die Suspension rasch über einem Trockenei s-/Azetonbad bei - 20 ⁰C gefroren. In die auf diese Weise gefrorene Suspension wurden 50 ml eines Tris-SDS-Puffers (der 0,1 M Tris-HCl (pH 9,0), 1 W/V % SDS (Natriumdodecylsulfat) und 0,1 M NaCl enthielt) gegeben, und das Gemisch wurde bei 60 C geschmolzen. Dieses Frieren über einem Trockeneis-/Azetonbad und Schmelzen bei 60 ⁰C wurde fünfmal wiederholt, wobei die Zellen vollständig lysiert wurden. In die so erhaltene Lösung, in der die Zellen lysiert vorlagen, wurde eine gleiche Menge einer Phenollösung (hergestellt durch Sättigung des vorgenannten Tris-SDS-Puffers mit umdestilliertem Phenol) gegeben und anschließend wurde gerührt. Diese Lösung wurde langsam zentrifugiert, wobei sie in eine wäßrige Rhase und in die Phenolphase getrennt wurde. Die wäßrige Phase wurde aufgefangen. Die auf diese Weise aufgefangene wäßrige Phase wurde mit dem doppelten Volumen wasserfreien Äthanols versetzt. Dieses Gemisch wurde dann 20 Minuten lang mit 12.000 UpM zentrifugiert, worauf man das Granulat erhielt. Dieses Granulat wurde in 20 ml eines Gemisches aus NaCl und Zitronensäure (welches 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumzitrat bei pH 7,0 enthielt) aufgelöst, wodurch sich eine die DNS enthaltende Lösung ergab. In 10 ml der so hergestellten, die DNS enthaltenden Lösung wurde eine gleiche Menge der Lösung I (vgl. Erster Schritt) zugesetzt und anschließend wurde gerührt. Daraus wurde die wäßrige Phase gewonnen. Die so gewonnene wäßrige Phase wurde mit dem doppelten Volumen von Äthanol vermischt und die ausgefällte

DNS wurde in 5 ml Tris-EDTA-Lösung (die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM Na₂EDTA enthielt) aufgelöst. Die vorbeschriebene Ausfällung mit wasserfreiem Äthanol wurde wiederholt und 5 ml der DNS-Lösung wurden angesetzt. 0,05 ml des Restriktionsenzympuffers wurden 0,2 ml der auf diese Weise hergestellten DNS-Lösung (200 ng/ml) zugesetzt, und danach wurde das Restriktionsenzym EcoRI in einer solchen Menge zugesetzt, daß die Aktivität des Restriktionsenzyms EcoRI eine Einheit pro μ9 der DNS erreichte. Anschließend wurde das Gemisch bei 37 ⁰C 60 Minuten lang inkubiert, mit nachfolgender 5minütiger Wärmebehandlung bei 65 C zur Inaktivierung des Restriktionsenzyms. Das Gemisch wurde dann gegen den Ligasepuffer dialysiert, wobei man eine E.coli-DNS-Lösung erhielt.

Dritter Schritt: Ligieren der pBR322-DNS und der DNS-Fragmente von E.coli mit einem phoS-Gen

Die pBR322-DNS-Lösung, die im ersten Schritt hergestellt wurde, wurde auf 30 μg/m^ DNS-Konzentration mit einem Einbaupuffer verdünnt. Die E.coli-DNS-Lösung, die im zweiten Schritt angesetzt wurde, wurde auf 100 μg/m^ DNS-Konzentration mit dem gleichen Einbaupuffer verdünnt. 50 μΐ der pBR322-DNS-Lösung wurden mit 100 μ! der E. coli-DNS-Lösung vermischt. Diesem Gemisch wurde T4-Ligase in einer Menge entsprechend einer T4-Ligase-Einheit pro ^g zu ligierender DNS zugesetzt. Die Enzymreakt i on für die Ligierung der DNSen wurde 8 Stunden lang bei 8 ⁰C durchgeführt. Nach Beendigung der Ligierung wurde die erhaltene Lösung gegen eine Tris-EDTA-Lösung (die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA enthielt) dialysiert.

* w tr «

- 32 -

Vierter Schritt: Auslese der das phoS-Gen führenden Plasmide A : E.-coli-Stamm C75

Der Stamm C75 von E.coli (Garen, Α., und N. Otsuji, J.Mol. Bio!., 8, 841-852 (1964)) wurde in einem LB-Medium unter Schütteln kultiviert, bis die Trübung der Kulturbouillon bei 600 nm den Wert 0,6 A erreichte. Anschließend wurden zur Zellgewinnung 2,5 ml der Bouillon langsam zentrifugiert. Die gewonnenen Zellen wurden in 2,5 ml einer wäßrigen MgCl₂-Lösung von 0,1 M suspendiert, und diese Suspension dann langsam zur Zellgewinnung zentrifugiert. Die gewonnenen Zellen wurden in 1,2 ml einer wäßrigen CaCl₂-Losung von 0,1 M suspendiert und diese Zellsuspension ließ man 30 Minuten lang bei 0 ⁰C stehen, worauf dann zur Zellgewinnung langsam zentrifugiert wurde. Die gewonnenen Zellen wurden erneut in einer wäßrigen CaClg-Lösung von 0,1 M in einer Menge von 0,1 ml suspendiert. Dieser Zensuspension wurden 10 μΐ der im dritten Schritt angesetzten Lösung eingebundener DNS zugesetzt. Dieses Gemisch ließ man 30 Minuten lang auf eisgekühltem Wasser stehen und erwärmte sie dann 5 Minuten lang in einem Wasserbad von 40 C. 1,0 ml des auf 37 ⁰C vorgewärmten LB-Mediums wurden dem erwärmten Gemisch zugesetzt und dann wurde 90 Minuten bei 37 ⁰C inkubiert. Anschließend wurden 0,1 ml der so hergestellten KuIturbouillon und 0,1 ml der 10 mal mit LB-Medium verdünnten Kulturbouillon jeweils auf T-Nährbodenplatten aufgetragen, welche Tetracyclin oder Ampicillin enthielten, worauf man über Nacht bei 37 ⁰C bzw. 30 ⁰C inkubierte, um Kolonien von Transformationsprodukten zu bilden, die gegenüber Tetracyclin bzw. Ampicillin resistent waren. Die so entstandenen Kolonien der Transformationsprodukte wurden mit einer alkalischen Phosphatase-Einfärbelösung besprüht (wel-

ehe 2 mg/ml α- Naphthy]phosphat und 20 mg/ml Fast Blue B Salt (blauer Farbstoff, tetrazotbehandeItes o-Dianisidin) enthielt), die in 0,5 μ Tris-HCl (pH 8,0) aufgelöst war. Die weißen Kolonien von Transformationsprodukten, die sich durch Aufsprühen der FarbstoffIösung nicht braun verfärbt hatten, wurden als die Zellen herausgelöst, welche die Plasmi.de enthielten, in denen das E .col i-phoS-Gen in die pBR322-DNS ligiert war.
B: E.coIi - Stamm C 2

Zur Auslese der weißen Kolonien von Transformationsprodukten, die Plasmide enthielten, in denen ein E.coli-phoS-Gen in die pBR322-DNS einligiert war - allerdings mit dem Unterschied, daß die Transformierung des C2-Stammes von E.coli (Morris, H., M.J. Schlesinger, M.Bracha, und E.Yagi! , J.Bacteriol., 119, 583-592 (1974)) als Indikator bei der Auslese der Plasmide verwendet wurde - wurde im wesentlichen der gleiche Verfahrensablauf wie der soeben beschriebene wiederholt.

Fünfter Schritt: Aufbau der Restriktionsabbildungen für die

ein phoS-Gen führenden Plasmide (pSN401 und pSN402)

Die im vorhergehenden vierten Schritt ausgewählten Transformationsprodukte wurden im LB-Medium kultiviert. Anschließend wurden aus der erhaltenen Zellkultur Plasmid-DNSen wie folgt extrahiert und gereinigt. Zur Extraktion der Plasmid-DNSen aus den zuvor angesetzten Zellkulturen wurde das Verfahren zur raschen alkalischen Extraktion herangezogen. Anschließend wurden die Rohplasmid-DNS-Lösungen durch Gleichgewichts-Dichtegradient-Zentrifugierung in gleicher Weise wie im ersten Schritt gereinigt. Aus den so gereinigten Plasmid-DNS-Lösungen wurde das Ethidiumbromid herausgelöst, und die DNS wurde ausgefällt (vgl. Erster Schritt).

Die auf diese Weise gewonnenen Plasmid-DNSen wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen aufgeschlossen und dann wurde die Länge der DNS-Fragmente durch Elektrophorese auf Agarosegel bestimmt. Die Restriktionsabbildungen der Plasmide wurden dann aufgebaut. Dabei zeigte sich, daß zwei Arten von phoS-Gen-führenden Plasmiden gewonnen worden waren.

Nachstehend wird eines der Plasmide als "pSN401" bezeichnet, und das andere als "pSN402". Die Restriktionsabbildung des Plasmids pSN401 ist in Fig. 1 dargestellt. Das Plasmid pSN402, das EcoRI ^EcoR^-Fragment von pSN402 wurde mit entgegengesetzter Orientierung zum Plasmid pSN401 ein Iigiert.

Beispiel 2

Erster Schritt: Herstellung der DNS-Fragmente mit phoS-Gen für die Bakteriophagen-XglmS-DNS

150 ml des T-Mediums wurden mit 1,5 ml Keimen von Escherichia coli KY7388-Stamm (T. Miki, Annu.Rep.Inst. Virus Res., 21, 1-26 (1978)) geimpft, also einem Lysogen des Bakteriophagen AglniS, und unter Schütteln bei 37 ⁰C kultiviert. In der Mitte der Phase logarithmischen Wachstums wurde der Kultur Mitomycin C bis zu Endkonzentration von 0,5 μg/ml zugesetzt'. Bis zur Lyse wurde noch etwa zwei weitere Stunden kultiviert. Die Kultur wurde auf Eis gekühlt und tropfenweise setzte man (in mehreren Tropfen) Chloroform zu. Danach wurde Luft mit der Pipette in die Kulturbouillon zur Blasenbildung gegeben, wodurch die Zellen in der Kulturbouillon völlig lysiert wurden. Das angesetzte Phagenlysat wurde dann langsam zentrifugiert. Der überstand wurde aufgefangen, während das Ausgefällte, das aus Zellenresten bestand, weggeworfen wurde. Der ge-

wonnene überstand wurde mit 25.000 UpM 90 Minuten lang zur Gewinnung der AglmS-Phagenpartike1 zentrifugiert, die unten im Zentrifugierglas abgelagert wurden. Die gewonnenen Phagenpartikel wurden in 4,0 ml λ-VerdUnner (der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgSO₄ und 0,1 mM Na₂EDTA enthielt) suspendiert. Die angesetzte Phagenpartikelsuspension wurde einer CsCl-Block-Dichtegradient-Zentrifugierung unterzogen, mit anschließender CsCl-Gleichgewichts-Dichte gradient-Zentrifugierung, worauf man eine Fraktion gewann, die nur AglmS-Phagenpartikel enthielt. Aus diesen Phagenparti kel η wurde mit Formamid in nachstehend erläuterter Weise die AgImS-DNS extrahiert. Der aus den AglmS-Phagenpartikelη· bestehenden Fraktion setzte man dann 0,05 ml einer Tris-EDTA-Lösung (die 2 M Tris-HCl (pH 8,5) und 0,2 M Na₂EDTA enthielt) und dann 0,5 ml Formamid zu. Das angesetzte Gemisch ließ man etwa 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Anschließend setzte man nacheinander 0,5 ml destilliertes Wasser und 3 ml wasserfreies Äthanol dem Gemisch zu und vermischte dies zur Ausfällung der Ag ImS-Phagen-DNS. Die ausgefällte AglmS-Phagen-DNS wurde durch Zentrifugieren abgenommen, mit 70 v/v% Äthanol gewaschen und im Vakuum getrocknet, worauf man eine trockene AgImS-DNS erhielt. Die getrocknete AgImS-DNS wurde in 5 ml einer Tris-EDTA-Lösung (die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM Na₂EDTA enthielt) und dann mittels eines Restriktionsenzyms EcoRI gespalten, und in gleicher Weise wie im zweiten Schritt bei Beispiel 1 dialysiert. Auf diese Weise wurde eine Lösung mit das phoS-Gen führenden DNS-Fragmenten angesetzt.

Zweiter Schritt: legierung der pBR322 -DNS und der AgI mS-Phagen-DNS-Fragmente mit dem phoS-Gen

Dies geschah im wesentlichen genauso wie im dritten Schritt bei Beispiel 1, wobei man eine Lösung mit ligierter

DNS erhielt, allerdings mit dem Unterschied, daß die
xglmS-Phagen-DNS-Lösung, wie sie im vorstehenden ersten Schritt angesetzt wurde, anstelle der E . coli-DNS-Lösung ei ngesetzt wurde.

Dritter Schritt: Auslese der das phoS-Gen führenden Plasmide

A: E.coli Stamm C75

Im wesentlichen wurden die gleichen Abläufe wie in Arbeitsschritt 4A bei Beispiel 1 wiederholt, um weiße Kolonien von Transformationsprodukten mit den das phoS-Gen
enthaltenden Plasmiden aus den xglmS-Phagen zu selektieren, allerdings mit dem Unterschied, daß die im obigen
zweiten Schritt angesetzte Lösung mit ligierter DNS
eingesetzt wurde anstelle der Lösung mit ligierter DNS, die nach dem dritten Schritt von Beispiel 1 angesetzt worden war.

B: E.coli Stamm C2

Im wesentlichen wurde genauso gearbeitet wie in Arbeitsschritt 4B bei Beispiel 1, um die weißen Kolonien mit
Transformationsprodukten mit Plasmiden auszulesen, in denen das aus ÄglmS-Phagen gewonnene phoS-Gen in die
pBR322-DNS einl igiert war, mit dem Unterschied allerdings, daß die Lösung mit einligierter DNS, wie sie im vorhergehenden zweiten Schritt angesetzt worden war, verwendet wurde anstelle der im dritten Arbeitsschritt bei Beispiel 1 angesetzten einligierten Lösung.

Vierter Schritt: Aufbau der Restriktionsabbildungen der

das phoS-Gen führenden Plasmide (pSN401 und pSN402) ^

Es wurden im wesentlichen die gleichen Arbeitsgänge wie im fünften Schritt bei Beispiel 1 wiederholt, um die Restrik-

tionsabbildüngen der Plasmide zu erstellen, allerdings mit dem Unterschied, daß die in den vorangegangenen Arbeitsschritten 3A und 3B gewonnenen Plasmide eingesetzt wurden, und nicht die nach Schritt 4A und 4B bei Beispiel 1 hergestellten Plasmide. Dabei wurde festgestellt, daß es sich bei den hier gewonnenen Plasmiden um pSN401 und pSN402 handelte.

Beispiel 3 ·

Erster Schritt: Aufbau des das phoS-Gen führenden Plasmids PSN5O7 aus pSN401

Die pSN401-DNS, wie sie im fünften Schritt bei Beispiel 1 gewonnen wurde, wurde teilweise mit dem Restriktionsenzym Hindlll aufgeschlossen und anschließend mit Hilfe von T4-Ligase im wesentlichen in gleicher Weise wie im dritten Schritt bei Beispiel 1 erläutert erneut einligiert. Mit Hilfe der so gewonennen Lösung mit umligiertem Plasmid wurden die E.coli-Stämme C75 und C90 (Garen, A., und N. Otsuji, J.Mol.Bio!., 8, 841-852 (1964) als Rezipienten im wesentlichen in gleicher Weise wie im vierten Schritt bei Beispiel 1 beschrieben transformiert, worauf man Stämme erhielt, die die phoS -Plasmide führten. Anschließend wurden die Plasmid-DNSen aus den Kulturen der verschiedenen unabhängigen Transformationsprodukte extrahiert und im wesentlichen in gleicher Weise wie beim fünften Schritt in Beispiel 1 gereinigt, worauf eine Restriktionsabbildung der Plasmide aufgebaut wurde. Das gereinigte umligierte Plasmid wird im folgenden mit "pSN5O7" bezeichnet, sein physikalischer Aufbau ist Fig. 1 zu entnehmen.

Zweiter Schritt: Aufbau des das phoS-Gen führenden Plasmids pSN508 aus pSN507

Die pSN507-DNS, die im vorangegangenen ersten Schritt gewonnen worden war, wurde mit dem Restriktionsenzym MTuI aufgeschlossen und anschließend erfolgte die erneute Einligierung des Plasmids und die Transformierung jedes der E. coli-Stämme C75 und C90 mit dem umligierten Plasmid, und zwar im wesentlichen in gleicher Weise wie im dritten Schritt bei Beispiel 2, wobei man Stämme erhielt , die das umligierte Plasmid (das nachstehend als "pSN508" bezeichnet wird) mit sich führten. Die pSN508-DNS wurde aus den Zellkulturen dieser Stämme extrahiert und im wesentlichen in gleicher Weise wie beim Schritt 5 i.n Beispiel 1 gereinigt. Es wurde eine Restriktionsabbi1 dung des Plasmids pSN508 aufgebaut. Das Ergebnis ist Fig. 1 zu entnehmen .

Dritter Schritt: Aufbau des das phoS-Gen führenden Plasmids pSN518 aus pSN508

Die im vorhergehenden zweiten Schritt gewonnene pSN508-DNS wurde mit dem Restriktionsenzym pstl aufgeschlossen und anschließend fand die erneute Ligierung des Plasmids und die Transformierung jedes der E.coli-Stämme C75 und C90 mit dem umligierten Plasmid im wesentlichen in gleicher Weise wie im obigen zweiten Schritt statt, wobei man Stämme mit dem umligierten Plasmid erhielt (das nachstehend als "pSN518" bezeichnet wird). Anschließend wurde aus der Zellkultur der so gewonnenen Stämme die pSN518-DNS extrahiert und im wesentlichen genauso wie im fünften Schritt bei Beispiel 1 gereinigt. Beim Aufbau der Restriktionsabbildung des Plasmids pSN518 erhielt man das aus Fig. 1 zu entnehmende Ergebnis.

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Beispiel 4

Aufbau der das phoS-Gen führenden Plasmide pSN4O7 und p5N408 aus pSN402 ^ ._

Die pSN402-DNS,, die nach Schritt 5 des Beispiels 1 gewonnen wurde, wurde im wesentlichen in gleicher Weise wie im ersten Schritt bei Beispiel 3 umligiert. Das gewonnene Plasmid wird nachstehend als "pSN4O7" bezeichnet. Anschließend wurde eine Restriktionsabbildung des Plasmids pSN407 aufgebaut. Die Restriktionsabbildung von pSN4O7 entspricht im wesentlichen der von pSN5O7, mit dem Unterschied, daß die Orientierung des EcoRIi-EcoRIo-Fragments von pSN407 bei ρSN507 genau entgegengesetzt ist.

Das so gewonnene pSN407 wurde im gleicher Weise wie im zweiten Schritt von Beispiel 3 umligiert. Das gewonnene Plasmid wird nachstehend als "pSN408" bezeichnet. Die Restriktionsabbildung von pSN408 wurde erstellt; sie entspricht im wesentlichen der von pSN508, mit dem Unterschied, daß die Orientierung des EcoRIj-EcoRI^-Fragmentes bei pSN408 genau entgegengesetzt ist zu der bei pSN508.

Beispiel 5

Aufbau der das phoS-Gen führenden Plasmide pSN1507 und

PSN15O8 aus pSN5O7

Im wesentlichen in gleicher Weise wie bei Beispiel 1 wurden die Plasmide pBR325 (Bolivar, F. u.a., Gene, 4, 121 (1978)) und pSN5O7 jeweils mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten. Anschließend wurde das gespaltene Plasmid pBR 325 in das gespaltene Plasmid pSN5O7 im wesentlichen in gleicher Weise wie im dritten Schritt bei Beispiel 1 ein-

1 igiert.Anschließend wurde - im wesentlichen wie im vierten Schritt bei Beispiel 1 - die Auslese der gewonnenen angebundenen DNS unter Verwendung des E.coli-Stammes ANCC75 (ein Transduktionsprodukt vom Typ Pl: E.coli-Stamm C75 X E.coli-Stamm CSH57 (Miller, J.H., Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., S. 13-23 (1972)) als Rezipienten durchgeführt. ■

Im wesentlichen in gleicher Weise wie im fünften Schritt bei Beispiel 1 wurde nun die Extraktion und Reinigung der so gewonnenen Plasmide ausgeführt. Anschließend erstellte man die Restriktionsabbildungen der Plasmide, und stellte fest, daß man zwei Arten von Plasmiden erhalten hatte, die das phoS-Gen enthielten. Eines der Plasmide wird nachfolgend als "pSN1507" und das andere als "pSN1508" bezeichnet. Man stellte außerdem fest, daß das EcoRI-,-EcoRl2-Fragment von pSN507 an die EcoRI-Einbaustel1e bei pBR325 einMgiert worden war, wodurch sich pSN1507 bildete.

Beispiel 6

Aufbau des das phoS-Gen führenden Plasmids pSN2507 und Erstellung einer Restriktionsabbildung des Plasmids pSN25O7

Das Plasmid pKN402A (B.E. UhI in u.a., Gene, 6, 91-106 (1979), dessen DNS in der Restriktionsabbildung in Fig. 2 dargestellt ist, wurde teilweise mit dem Restriktionsenzym Hindi aufgeschlossen und mit Hilfe von T4-Li gase um 1 i giert .Stämme mit umligierten Plasmiden (nachstehend mit "pSHIOl" bezeichnet) wurden im wesentlichen in glei-

eher Weise wie im vierten Schritt bei Beispiel 1 und im fünften Schritt bei Beispiel 1 gewonnen, worauf eine Restriktionsabbildung von pSHIOl aufgebaut wurde. Fig. 2 zeigt diese Restriktionsabbi1 dung. Nun wurden pSHIOl und pSN5O7 jeweils mit EcoRI aufgeschlossen. Die gewonnenen Fragmente von pSHIOl und pSN507 wurden mit Hilfe von T4-Ligase eingebunden. Das gewonnene 1-igi erte Plasmid wurde nun einer Selektierung unterzogen, um die weißen Kolonien der Transformationsprodukte herauszulösen, die das phoS-Gen führende Plasmide enthielten und durch Ligieren des pSN507-Fragmentes' in pSHIOl gebildet wurden. Das entstandene Transformationsprodukt wurde in einer Kultur angesetzt, und es wurden aus den kultivierten Transformationsprodukten die Plasmid-DNSen extrahiert und im wesentlichen genauso wie beim fünften Schritt in Beispiel 1 gereinigt. Nun wurde im wesentlichen genauso wie im fünften Schritt bei Beispiel 1 eine Restriktionsabbildung des Plasmids pSN2507, eines der dabei gewonnenen Plasmide, aufgebaut, und die Lage des phoS-Gens in pSN2507 bestimmt. Fig. 2 zeigt die Restriktionsabbildung von pSN2507. Man stellte fest, daß ein Plasmid, in welchem die Orientierung des das phoS-Gen führenden EcoRI,-EcoRIp-Fragmentes entgegengesetzt zur Orientierung bei pSN2507 war, auch bei der vorstehend beschriebenen Einbindung des pSN507-Fragmentes in pSHIOl hergestellt worden war.

Versuch 1

Durch rechnerische Ermittlung der Anzahl der Moleküle des Phosphatbindungsproteins, die pro Wirtszelle produziert wurden, wurde die Genexpressionskraft des erfindungsgemäßen Expressionsvektors ermittelt. Der Mechanismus der Produktion eines Phosphatbindungsproteins mit Hilfe der phoS-Genexpression wird nachstehend kurz erläutert. Der

Vorläufer des Phosphatbindungsproteins wird zuerst durch Expression des phoS-Gens produziert. Der Vorläufer hat ein Signalpeptid N-terminal am reifen Phosphatbindungsprotein. Das Signalpeptid ist für die Interaktion mit der innenliegenden Zellmembran und für die Sekretion durch diese hindurch erforderlich. Deshalb wird der Vorläufer des Phosphatbindungsproteins zunächst zur Innenmembran trans· portiert, wobei das Signalpeptid in Funktion tritt. Anschließend wird der Signalpeptidtei1 des Proteins abgespalten, während es durch die Innenmembran hindurchtritt, und damit wird in das Periplasma der Zelle das reife Phosphatbindungsprotein im gespaltenen Zustand sekretiert.

Die Anzahl der Moleküle des Phosphatbindungsproteins, die pro Zelle produziert wurden, wurde wie folgt ermittelt.

Der E.coli-Stamm ANCC 75 wurde mit dem Plasmid pSN5O7 transformiert und über Nacht in einem Tris/Glukose-Medium inkubiert, also einer mit Tris/HCI (pH 7,2) gepufferten Minimalsalzlösung, die 0,2% (w/v) Glukose enthielt und mit 0,64 mM KH₂PO. (nachstehend als "Hochphosphatmedium" bezeichnet) aufgefüllt wurde. Nach der Inkubierung wurden die Wirtszellen geerntet und in zweierlei Arten von Kulturmedien suspendiert, nämlich dem vorgenannten Hochphosphatmedium und dem gleichen Tris/Glukose-Medium, wie es oben beschrieben ist, allerdings mit dem Unterschied, daß die Konzentration von KH2PO4 0,064 mM betrug (nachstehend als "Niedrigphosphatmedium" bezeichnet), mit anschließender sechsstündiger Inkubation unter Schütteln bei 37 ⁰C. Die Zelldichte jeder Kultur wurde aus der Absorptionsleistung bei 600 nm durch Schätzung ermittelt. Dabei wurde festgestellt, daß die Anzahl der Zellen in

g
jeder Kultur 1,3 χ 10 betrug. Anschließend wurden die Zellen jeder Kultur durch Zentrifugieren bei 2000 χ g fünf Minuten lang gewonnen.

Die gewonnenen Zellen wurden einmal mit 1 ml Pufferlösung gewaschen, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) und 30 mM NaCl enthielt, und in einem Zentrifugierglas erneut in 0,1 ml 33 mM Tris-HCl (pH 7,5) suspendiert. 0,1 ml der 33 mM Tris-HCl (pH 7,5), 40% (w/v) Sukrose und 0,1 mM EDTA enthaltenden Pufferlösung wurden der vorgenannten ZeI1suspension zugesetzt, rasch vermischt und 10 Minuten lang bei 37 C inkubiert. Die Zellen wurden durch dreiminütiges Zentrifugieren bei 8000 X g gewonnen und sofort erneut in 0,1 ml 0,5 mM wäßriger MgCl-Lösung suspendiert. Die ZeI1 suspension wurde kräftig im Eiswasserbad 10 Minuten lang geschüttelt und anschließend fünf Minuten lang bei 8000 X g abzentrifugiert. Dem so gewonnenen überstand (nachstehend als "Periplasmafraktion" bezeichnet) wurden 20 μΐ einer Probenpufferlösung für die Polyacryl amid-Elektrophorese zugesetzt (die 1 ml 0,5M Tris-HCl (pH 6,8), 1 ml 10 w/v%-iges Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,1 ml ß-Mercaptoäthanol , 1 ml Glyzerin, 2,5 ml 0,1 w/w%-iger wäßriger Bromphenolblaulösung und 4,4 ml Wasser enthielt) mit anschließender fünfminütiger Wärmebehandlung bei 100 ⁰C. Das Granulat (nachstehend als "Intrazellularfraktion" bezeichnet), das bei der vorstehend erläuterten Zentrifugierung entstand, wurde zweimal mit 1 ml 0,5 mM wäßriger MgCl ₂-l-ösung gewaschen und erneut in 20 μΐ der Lysozymlösung (die 2 mg Lysozym in 1 ml Wasser, 50 mM Glukose, 10 mM EDTA und 25 mM Tris-HCl (pH 8,0)) enthielt suspendiert, mit anschließender 30-minütiger Inkubation bei 37 ⁰C. Die auf diese Weise hergestellte Suspension wurde mit 180 μΐ 0,5 M wäßriger MgCl₂-Lösung verdünnt, und das Gemisch wurde gründlich gerührt. Diesem Gemisch wurden 120 μ! der vorgenannten Probenpufferlösung für die Polyacryl amid-Elektrophorese zugesetzt und anschließend eine Wärmebehandlung 5 Minuten lang bei 100 ⁰C durchgeführt.

Die wie vorstehend hergestellten Fraktionen wurden einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach dem Verfahren unterzogen, wie es von Laemrnl i, U.K., Nature, 227", 680-685 (1970) beschrieben wurde, wobei die Ausbeute an Phosphatbindungsprotein in den Zellen bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt .

TABELLE

	Menge ^g/Zelle)	Hochphosphatmedi um
Phosphatbin dungsprotein	Niedrigphosphatmedium	1,0 χ 1011
8,0 χ 10"8

Wie sich aus der obigen Tabelle ergibt, wird die Produktion des Phosphatbindungsproteins und von dessen Vorläufer mit anderen Worten', die Expression der Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein des erfindungsgemäßen Expressionsvektors - durch Einstellen der Phosphatkonzentration im Kulturmedium gezielt beeinflußt.

Anschließend wurde die Anzahl der Moleküle des Phosphatbindungsproteins pro Zelle rechnerisch nach folgender Gleichung ermittelt:

Anzahl der Moleküle pro Zelle =

χ C

wobei A = Ausbeute an Phosphatbindungsprotein

(g/Zelle)

B = Molekulargewicht des Phosphatbindungsproteins (35.000) C = Avogadro'sehe Zahl (6 χ 10 ).

Bei Kultivierung im Niedrigphosphatmedium betrug die Anzahl der Moleküle des Phosphatbindungsproteins pro Zelle 1,3 χ

B e i s ρ i e 1 7

Produktion von ß-Galaktosidase unter Verwendung des das

phoS-Gen führenden Plasmids pSN508

Das wie in Schritt 2 bei Beispiel 3 hergestellte Plasmid pSN508 wurde mit Hilfe von EcoRI gespalten, wobei ein EcoRI-EcoRI-DNS-Fragment mit einem phoS-Gen hergestellt wird..In dieses so gewonnene DNS-Fragment mit dem phoS-Gen wurde das DNS-Fragment ligiert, das durch Spaltung des Plasmids pMC1403 mit der Genkodierung für die ß-Balaktosidase (im Zusammenhang mit dem Plasmid pSN14'03 wird auf das Journal of Bacteriology, 143, 971-980 (1980) verwiesen) mit Hilfe von EcoRI zur Bildung eines Rekombinationsvektors hergestellt wurde.

Anschließend wurde der Rekombinationsvektor (der nachstehend als "pSN5081" bezeichnet wird) selektiert und im wesentlichen in gleicher Weise wie bei den Schritten 4 und 5 in Beispiel 1 isoliert.

Dann wurde mit Hilfe von Hpal das Plasmid pSN5081 teilweise ausgelöscht, worauf die beiden Terminale des dabei entstehenden DNS-Fragments des Plasmids pSN5081 teilweise mit Hilfe der Nuklease BAL31 (Handelsbezeichnung für die von Bethesda Research Laboratories Inc., U.S.A. hergestellte und vertriebene Desoxyribonukelase ) aufgeschlossen und mit Hilfe von Smal gespalten wurden. Das abgespaltene DNS-Fragment des Plasmids wurde mit T4-Ligase erneut ligiert.

Nun wurde der E.coli-Stamm CSH26 (hier kann auf J.H.Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, S.17 (1972) verwiesen werden), der eine Lac~- Mutation darstellt, die Laktose in einem Kulturmedium nicht verarbeiten kann, in einem mit Laktose versetzten Tetrazolbett als Kulturmedium mit dem vorgenannten Rekom-

binationsvektor transformiert, der eine Genkodierung für ß-Galaktosidase mit sich führt, wobei Transformationsprodukte entstanden. Durch Transformation" mit diesem Rekombinationsvektor wurde aus dem phänotypischen Merkmal Lac" beim E.coli-Stamm CSH26 der Phänotyp Lac⁺, und damit wurden die zuvor gewonnenen Transformationsprodukte so verändert, daß sie nun Laktose in dem mit Laktose versetzten Tetrazo!bett verarbeiten konnten. Dementsprechend ließen sich die Transformationsprodukte ohne Schwierigkeit aus den Stammzellen des E.coli-Stammes CSH26 herausfinden, wobei Größe und Farbe der auf dem mit Laktose angereicherten Tetrazolbett als Selektionskriterien dienten und man im wesentlichen in gleicher Weise wie bei den Experimenten vorging, die in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 49 und S. 52-54 (1972) beschrieben sind. Das erneut eingebundene Plasmid wird nachstehend als "pSN5084" bezeichnet.

Beim Plasmid pSN5084 wurde das die Genkodierung für ß-Galaktosidase führende DNS-Fragment in das DNS-Fragment einIiigiert, welches an seinem unterhalb der DNS-Sequenz eines Promotors für das phoS-Gen das phoS-Gen führte, so daß in Form eines Fusionsproteins ß-Galaktosidase gebildet werden konnte.

Anschließend wurde der E.coli-Stamm CSH26 mit dem Plasmid pSN5084 zur Bildung von Transformationsprodukten transformiert. Die Selektierung der Transformationsprodukte aus den Stammzellen vom E.coli-Stamm CSH26 erfolgte in gleicher Weise wie zuvor beschrieben. Die selektierten Transformationsprodukte wurden in Niedrigphosphatmedium inkubiert, wobei in Form des Fusionsproteins ß-Galaktosidase entstand. Anschließend wurde

das spezifische Gewicht der ß-Galaktosidase in den Transformationsprodukten nach dem Verfahren ermittelt, das in Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 352-355 (1972) beschrieben ist. Die Anzahl der Moleküle der ß-Galaktosidase, die in Form des Fusionsproteins entstanden, wurde rechnerisch pro Zelle ermittelt, indem die spezifische Aktivität der in Form des Fusionsproteins erzeugten ß-Galaktosidase mit der spezifischen Aktivität einer Standard-ß-Galaktosidase mit einem Molekulargewicht von 145.000 verglichen wurde. Dabei wurde festgestellt, daß die Anzahl der Moleküle von ß-Galaktosidase, die in Form des Fusionsproteins gebildet wurden, pro Zelle 1 χ ΙΟ⁵ betrug.

Claims (9)

PATENTANWÄLTE · EUROPEAN PATENT ATTORNEYS Zugelassen bei den deutschen und europäischen Patentbehörden Flüggenstraße 17 · D-8000 München 19 The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka university Osaka/ Japan Expressionsvektor, Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung des Expressionsvektors zur Herstellung eines Polypeptids Patentansprüche *

1. Expressionsvektor mit einem DNS-Fragment, welcher eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein und ein Replikon aus der Gruppe der Plasmide und Bakteriophagen enthält, wobei das DNS-Fragment an das Replikon Ii giert ist.

2. Expressionsvektor nach Anspruch 1, dadurch GEKENNZEICHNET, daß das DNS-Fragment mit einer Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein ein DNS-Fragment mit einem von Enterobacteriaceen abstammenden phoS-Gen ist.

3. Verfahren zur Herstellung des Expressionsvektors

nach Ansruch 1, GtKENNZLICHNEI durch die folgenden Schritte

1) Gewinnung einer chromosomal en DNS mit einer Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein aus Bakterien, die zur Gruppe der Enterobacteriaceen gehören;

2) Aufspaltung der Chromosomen-DNS mit Hilfe eines Restriktionsenzyms in DNS-Fragmente;

3) Ligieren der DNS-Fragmente an ein Replikon aus der Gruppe der Plasmide und Bakteriophagen;

4) Transformierung der Zellen eines Bakteriums aus der Gruppe der Enterobacteriaceen mit Hilfe des Replikons, an welches das DNS-Fragment ligiert ist, in Transformationsprodukte, darunter Transformationsprodukte, welche einen Rekombinationsvektor mit dem DNS-Fragment enthalten, das eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein mit sich führt;

5) Auslesen von Transformationsprodukten, welche den Rekombinationsvektor mit dem eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein enthaltenden DNS-Fragment beinhalten, aus den Transformationsprodukten, und

6) Isolieren des' Rekombinationsvektors mit dem die Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein führenden DNS-Fragment aus den ausgelesenen Transformationsprodukten.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch GEKENNZEICHNET, daß die Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein ein von Enterobacteriaceen abgeleitetes phoS-Gen ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch GEKENNZEICHNET, daß der isolierte Rekombinationsvektor mit dem eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein führenden DNS-Fragment teilweise ausgelöscht wird, während die Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein beibehalten wird, und daß der dabei entstehende, teilweise ausgelöschte Rekombinationsvektor mit Hilfe einer Ligase zum Aufbau eines rekonstruierten Expressionsvektors erneut ligiert wird.

6. Verfahren' nach Anspruch 3, dadurch GEKENNZEICHNET, daß das eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein führende DNS-Fragment aus dem isolierten Rekombinationsvektor herausgetrennt wird, und daß das herausgetrennte DNS-Fragment an ein andersgeartetes Replikon als das im isolierten Rekombinationsvektor enthaltene ligiert wird.

7. Verwendung des Expressionsvektors nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Polypeptids mittels einer Genexpression, GEKENNZEICHNET durch die folgenden Schritte:

1) Ligieren eines eine Genkodierung für ein Polypeptid führenden DNS-Fragments an den Expressionsvektor an dessen unterhalb der DNS-Sequenz eines Promotors für die Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein gelegenen Abschnitt;

2) Transformieren der Zellen eines Bakteriums aus der Gruppe der Enterobacteriaceen mit dem Expressionsvektor, an welchen die Genkodierung für ein Polypeptid ligiert ist, in Transformationsprodukte;

3) Auslesen der Transformationsprodukte aus Stammzellen eines Bakteriums aus der Gruppe der Enterobacteriaceen;

4) Inkubieren der Transformationsprodukte, wobei die Transformationsprodukte zur Expression der Genkodierung für

das Polypeptid unter Bildung des Polypeptids veranlaßt werden ;
und

5) Isolieren des Polypeptids aus den inkubierten Transformations ρ rodukten.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch GEKENNZEICHNET, daß im Arbeitsschritt 1) der Abschnitt zwischen dem proximal und dem distal gelegenen Teil des eine Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein führenden DNS-Fragments liegt.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch GEKENNZEICHNET, daß im Arbeitsschritt 1) der Abschnitt unterhalb des eine-Genkodierung für ein Phosphatbindungsprotein führenden DNS-Fragments liegt.