SE459816B - Vektor med stark genexpression - Google Patents

Description

459 10 15 20 ZS 30 35 816 Z genexpression. Tekniken enligt ovannämnda tidigare publice- rade skrifter uppvisar sådana olägenheter som att utbytet av önskvärda användbara substanser ej är tillräckligt högt.

Följaktligen finns det inom denna teknik ett mycket stort behov av utvecklandet av en expressionsvektor som kan bilda användbara substanser i högt utbyte.

Från synpunkten på industriell användning av gen- ingeniörsarbete och reduktion av kostnaden för framställning av användbara substanser har man inom denna teknik följ- aktligen önskat utveckla en expressionsvektor uppvisande utmärkt effekt med avseende på genexpression. Den fundamen- tala tekniken för genetisk rekombínation beskrives i Proceedings of the National Academy of Science, USA, ZQ_, 3240-3244 (1973) och ibid., Zl_, 1743-1747 (1974), men nå- got annat förfarande för isolering av en gen med utmärkt effekt med avseende på genexpression från ett stort antal naturen, har ej föreslagits, vilket vid lösandet av ovanstående problem.

Föreliggande uppfinning är baserad på omfattande och intensiva studier för lösande av ovanstående problem. Där- gener som förekommer i leder till svårigheter vid har det visat sig att en gen, som kodar ätt fosfat- bindningsproteín och benämnas EB2§-gen, kan tillhandahålla 'en expressionsvektor uppvisande ytterst stark genexbression 'vid jämförelse med sådana hos konventionellt kända vektorer.

Enligt föreliggande uppfinning har man lyckats framställa en 'sådan expressionsvektdr dppbärande denna.gen som kodar ett fosfatbindningsprotein medelst Eloningsteknik med hög verk- ningsgrad. Förelíggande uppfinning är baserad på sådana nya upptäckter och framgångar. -'I Ett syfte med föreliggande uppfinning är följaktli- gen att tillhandahålla en expnessionsvektor som uppvisar ut- märkt effekt med avseendepå pEg§-genexpression.

Ett annat syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett förfarande för framställning av en ex- pressionsvektor som uppvisar utmärkt effekt med avseende på phoS-genexpressíon. 10 15 20 25 30 3 459 816 Vidare är ett syfte enligt föreliggande uppfinning att till- handahålla ett förfarande_för framställning av polypeptider í högt utbyte medelst EQg§;genexpression*næd användning av-en expressionsvektor av dvannämnda slag.

Ovannämnda syften och andra syften, kännetecken och fördelar enligt föreliggande uppfinning är uppenbara av föl- jande ingående beskrivning samt de bifogade rítningarna, varpå fig.1 belyser restriktionskartorna för plasmider pSN401, pSN5D7, pSN508 och PSN518; och fig.2 belyser flödesschemat för förfarandet för framställning av plasmíden pSN2507, som är visad med restriktíonskartor för plasmíderna pKN402A, pSH101 och pSN2507.

I Fíg_1 och 2 betecknar eåldnda symbolen Pbgâ en gen, som koder: ' (för v11- ken en ingående förklaring kommer att anges senare). Symbo- ett fosfatbindningsproteín från Enterobacteriaceae lerna phoT, pstA och phoU betecknar var och en gener som är grupperade på kromosomalt DNA i E.coli tillsammans med phoS (för vilken en ingående förklaring kommer att givas se- nare). Följande symboler användes för beteckning av igen- kännandesekvenser för restriktíonsenzymer: and » anal, 21.1, ny: »fia . ëindlll, êyal , fiingll och §maI (suffíxsiffrorna efter ovannämnda symboler som är visa- de i fig.1 och 2 användes för identifiering av respek- tive igenkännande-platser för ett restriktionsenzym).

Andra förkortningar är respektive: Tn3(ApR) (índikerad med gïzzz ): transposon uppbärande ampícillínresistenskodande gen Rep: replikationsgen ori: replikationsursprung Kb: 1.000 nukleotídpar

[2222] utstruket parti.

Enligt Föreliggande uppfinning tillhandahålléš sâlunda'V in \O 10 15 20 25 30 35 en expressionsvekton som innefattar ett DNA-fragment inne-" fattanöe'en EQg§=gen ooh en replikon utvald bland*plasmidef och bakteriofager, vilket DNA-fragment är bundet vid repli- konen.

Uttrycket "replikon“ användes här'i betydelsen en vektor som är replikerbar och uppvisar en typt kännetecken och en restriktionsplats ning av ett donator-DNA-fragment därtill. gen för ett feno- En replikon är en bärare av genetisk information som är känd såsom en replikationsenhet av en kedja av nukleo- tider sådana att när väl replikationen börjar genomföres replikation successivt till slutet av nukleotidsekvensen.

Såsom en sådan replikon kan nämnas plasmider, bakteriofager, virus och liknande.

Replikonerna innefattar DNA-replikoner och RNA-replikoner men enligt föreliggande uppfinning är RNA-replikonerna ej att föredraga från praktisk synpunkt.

Såsom DNA-replikonerna kan nämnas plasmider och repliker- bara DNA-fragment härstammande från DNA-virus, prokaryota celler och eukaryota celler. Bland dessa föredrages såsom replikon som kan användas enligt föreliggande uppfinning, plasmíder och bakteriofager. en Konventionellt användes DNA- replikoner uppbärande en gen tilldelande antibiotisk resis- tens i stor utsträckning för kloning av olika gener. Det i stor utsträckning använda förfarandet för kloning av en gen innefattar uppslutning av kromosomalt DNA med ett restrik- tionsenzym för erhållande av ett DNA-fragment uppbärande den önskvärda genen, bindning av DNA-fragmentet till DNA- replikonen, transformering av en encellig organism med DNA- replikonen innefattande DNA-fragmentet för bildning av transformationsprodukter, isolering av transformationspro- dukterna från den encelliga utgångsorganismen med hjälp av den antibiotiska resistensen tilldelad genom DNA-repli- konen och ínkubering av de isolerade transformationsproduk- terna, varigenom DNA-replikonen inklusive DNA~fragmentet klonas. anpassad för bind- 10 15 20 25 30 S 459 816 Genen som kodar ett fosfatbindningsprotein är ansvarigt för fosfattransportsystemet och fosfatmetabolismsystemet och har utvecklats i manga prokaryota celler och encelliga eukaryota celler. Av dessa har genen som kodar ett fosfat- bindningsprotein från Escherichia coli studerats jämförel- sevis ingàende och speciellt då genen från Escherichia coli som betecknas ghoS -gen. 2hoS-genen finns ej endast i Escherichia coli utan också i bakterier tillhörande Entero- bacteriaceae. Följaktligen kan Rhgå-genen från vilken som helst bakterie tillhörande Enterobacteriaceae användas en- ligt föreliggande uppfinning. På en genetisk karta av standardtyp för E. coli (Backman, B.J. och K.B. Low, Microbiol. Rev. §í_, 1-56 (1980) ) är Eho§_ från Escherchia ggli grupperad tillsammans med ghgj. 2335 83 minuter. Nämnda_2hgI, 2§t§_ och Eh9Q_ utgör gener vars funktion är relaterad till fosfattransport och fosfatmeta- bolism. Såsom nämnts ovan är phoSg phol, pstAfoch phoU-ge- och följaktli- gen innefattas även Bhgïf, Rstê- och Bhog-generna i DNA- och Rhgg vid ner grupperade på en kromosom från E. coli fragmentet när ett DNA-regment uppbärande 2hg§-genen fram- ställes av kromosomalt DNA från E. coli medelst ett restrik- tionsenzym. i ' ' 1 ' Föreliggande uppfinning avser även ett förfarande för framställning av en expressionsvektor som innefattar: (1) framställning av kromosomalt DNA innehållande en QQg§-gen från bakterier tillhörande Enterobacteriaceae; w-(22'spjälkníng av kromosomalt DNA med ett restriktione- enzym för tillhandahållande av DNA-fragment; (3) bindning av DNA-fragmenten vid en replikon utvald bland plasmíder och bakteríofager; (A) transformation av celler från en bakterie tillhö- rande Enteriobacteriaceae med replikonen uppvisande DNA-segmentet bundet därvid för bildning av transfor- mationsprodukter inklusive sådana som innehåller en rekombinant vektor innefattande DNA-fragmentet upp~ bärande en phoS-gen; 10 15 20 OD _; O\ (5) utväljande av transformationsprodukter innehållan- de rekombinantvektorn inklusive DNA-Fragmentet uppbä- rande en phoS-gen bland transformationsprodukterna; och (6) isolering av rekombinantvektorn inklusive DNA- Fragmentet uppbärande Efi2§-genen från de utvalda transFormationsprodukterna.

I steget (1) i förfarandet enligt föreliggande uppfinning fram- ställes kromosomalt DNA innehållande en gen som kodar ett fosfatbíndningsproteín (betecknas härefter helt enkelt "gngë-gen") från bakterier tillhörande Enterobacteríaceae medelst konventionell isoleringsteknik gering eller liknande.

I steg (Z) spjälkas kromosomalt DNA som framställts i ovannämnda steg (1) med ett restriktionsenzym för till- handahållande av DNA-fragment innehållande ett DNA-frag- ment uppbärande ɧg§-genen. , såsom lys,centrifu- I steget (3) av förfarandet enligt föreliggande upp- finning, såsom nämnts ovan, kan vilka som helst plasmíder och bateríofager användas såsom replíkonen. Bindníngen av DNA-fragmenten till replikonen kan genomföras med använd- ning av ett ligas enligt den konventionella tekniken (se exempelvis den amerikanska patentskrïften 4.237.224). 10 15 20 25 30 35 Enterobacteriaceae 7 459 816 Åtminstone ett av DNA-fragmenten uppbärande en phoS-gen och replikon uppvisar en gen för ett fenotypkännetecken.

I ovanstående steg (4) transformeras celler av en bakterie tillhörande Enterobacteriaceae med replikonen uppbärande DNA-fragmentet såsom detta framställts i ovan- nämnda steg (3). Såsom bakterie tillhörande Enterobactería- ceae kan nämnas Escheríchia,Enterobacter, Erwinia, Kleb- síella, Proteus, Salmonella, Serratia och Shigella. Förutom ovannämnda bakterier kan vidare mutantceller användas av någon som helst av ovan nämnda bakterier. Det är naturligt- vis nödvändigt att utvälja lämpliga bakterier, varvid man skall ta hänsyn till replikerbarheten av replikonen i cellerna i en bakterie. Exempelvis kan Escherichia coli, Serratia - arter eller Salmonella-arter lämpligen användas såsom värden när en välkänd plasmid av avspänningstyp, såsom pBR32Z, pBR3Z5, pACYA177 eller pKN410 användes såsom replikonen. ” I ovanstående steg (5) isoleras transformationspro- dukten först från utgångsceller av en bakterie tillhörande med hjälp av fenotypkännetecknet, så- som läkemedelsresistens tilldelad genom replikonen uppvisan- de en gen för ett fenotypkännetecken. Därefter utväljes transformationsprodukter innehållande rekombinantvektorn inklusive DNA-fragmentet uppbärande ph2§¿ genen från ovan isolerade transformationsprodukter med användning av mängd- en fosfatbíndningsprotein i transformatíonsprodukterna så- som ett kriterium. Mängden av fosfatbindningsprotein i var och en av transformatíonsprodukterna bestämmas på följande sätt. Först isoleras fosfatbíndningsprotcinet från transformationsprodukten och renas genom konventionell tek- nik, såsom lys, centrifugering ellerutsaltníng.Därefter bestämmes mängden renat fosfatbindningsprotein med konven- 'tíonell teknik, såsom SDS-agarosgel-elektrofores. Mängden fosfatbindningsprotein i var och en av transformatíonspro- dukterna jämföres med mängden av fosfatbindningsprotein ...'5- (71 MO 10 15 20 25 robacteriaceae _______________ (Û __:- bildat av en utgàngscell av en bakterie tillhörande Énte- som ej transformerats med replikonen upp- bärande DNA-fragmentet. Transformationsprodukterna uppvisan~ de större mängd fosfatbindningsproteín än utgångscellen av bakterien tillhörande Enterobacteriaceae utväljes.

För fallet en mutantcell som bildar alkalísk fosfatas ej enbart under FosFatutarmnihgsbetingelser u-tan ä-.ven under .fosffat- rika betingelser, användes såsom cellen av en bakterie tillhörande Enterobacteriaceae i ovanstående steg (4), ____________________ kan utväljandet av transformationsprodukter innehållande re- plíkonen innefattande DNA~fragmentet uppbärande 2hoS-genen i ovanstående steg (S) genomföras mycket enkelt utan bestämning av mängden av fosfatbindningsprotein i var och en av trans- formationsprodukterna. Skälet därför är följande. När en sådan mutant cell transformeras med replikonen uppbärande DNA-fragmentet som framställts i ovanstående steg (3) ger mutantcellen alkalísk fosfatas under fosfatutarmningsbe- tingelser men ger ej alkalisk fosfatas under fosfatrika betingelser på grund av verkan av Bh9§_ -genen ingående i DNA-fragmentet bundet till replíkonen. När transformationen genomföras under fosfatrika betingelser utväljes följaktligen alkalisk-fosfatas-negativa transformatíonsprodukter.

I ovanstående steg (6) isoleras rekombinantvektorn innefattande DNA-fragmentet uppbärande Bhoâ-genen från trans- formationsprodukterna utvalda i steget (5) medelst konven- tionell teknik, såsom lys, centrifugering och liknande. __... 10 Z0 30 35 9 459 816 Rekombinantvektorn som framställts med förfarandet som nämnts ovan kan vara partiellt utstruken med avseende på DNA~fragmentpartiet och/eller replikonpartiet med använd- ning av ett restriktionsenzym under bibehållande av pho§ - genen och utsättande av erhållen utstruken rekombinant vek- tor för förnyad bindning med hjälp av en ligas, varigenom en rekonstruerad rekombinant vektor framställes uppvisande reducerad storlek. Den rekonstruerade rekombinantvektorn blir enklare att hantera på grund av att antalet restrik- tionsplatser i den rekonstruerade rekombínantvektorn minskats i jämförelse med den ursprungliga rekombinantvektorn. När vidare en gen som kodar.en viss polypeptid bindes till den rekonstruerade rekombinantvektorn blir förhållandet av läng- den av genen som kodar för polypeptiden till den totala längden av rekombinantvektorn högre än för det fallet då genen som kodar polypeptiden binds till den ursprungliga re- kombinantvektorn som ej är rekonstruerad. Man kan förmoda att ju högre förhållandet av längden av genen som kodar en polypeptid till den totala längden av rekombinantvektorn äf desto större är mängden av proteinet som bildas per cell oeh desto mindre blir mängden av biprodukter som bildas per cell. När följaktligen ovannämnda rekonstruerade rekombínant- _vektor«användes-för bildning av en viss-önskvärd pelypeptid kan ej endast den höga produktionsförmågan för polypeptiden uppnås utan även reningen av den erhållna polypeptiden kan enkelt uppnås.

Ett DNA-fragment uppbärande phgå-gen kan skäras ut från rekombinantvektorn framställd enligt förfarandet enligt föreliggande uppfinning och bindas till en annan typ av replikon än typen av replikon i den ursprungliga rekombi- nantvektorn för framställning av en annan typ av rekonstrue~ rad rekombinantvektor. En sådan annan typ av rekonstruerad rekombinantvektor kan med fördel användas när enkelt utväl- jande av transformationsprodukterna avses genom ändring av ett fenotypkännetecken i replíkonen och/eller en ökning avses av kopieantalet av en rekombinantvektor. Användningen _459 816 10 15 20 25 30 35 10 av en sådan annan typ av rekonstruerad rekombinantvektor är önskvärd när transformatíonsprodukterna som erhålles medelst den ursprungliga rekombinantvektorn är sådana vari- från de önskvärda transformatíonsprodukterna är svåra att utvälja och/eller replikerbarheten av den ursprungliga re- kombinantvektorn i transformationsprodukterna är låg. ~_ Rekonstruktionen av rekombinantvektorn som nämnts ovan genomföres med konventionell teknik (se exempelvis den ame- rikanska patentskríften 4.340.674, 4.349.629 och 4.35É.270).

Expressionsvektorn som framställts med förfarandet enligt föreliggande uppfinning kan identifieras genom kon- struktion av restriktionskartan på följande sätt. Expres- sionsvektorn uppslutes partiellt eller fullständigt med olika restriktionsenzymer för erhållande av DNA-fragment.

De erhållna fragmenten utsättes för agaros varigenom storleken och restríktíonsmönst vektorn bestämmes. Läget av ph2_- sionsvektor bestämmes genom konst ningsexpressionsvektorer enligt f elst partiell eller fullständig u ligt restriktionsenzym och efter undersökning av utstrykningsexpr plementtester med användning av såsom värden. -gel~elektrofores, ret för expressions- genen på ovannämnda expres- ruktion av olika utstryk- öreliggande uppfinning med- ppslutníng med ett lämp- följande självbindníng och essionsvektorerna genom kom- phg§-gen-negativa mutanter Expressíonsvektorn som uppbär phg§-genen enligt före- de uppfinning uppvisar följande fördelar när genen som kodar en önskvärd polypeptid bindes till expressionsvektorn vid dettas parti nedströms DNA-sekvensen i en promotor till ph9§-genen och bildningen av de tiden genomföres med genteknik: (1) Utbytet av ovannämnda önskvärda polypeptid är så högt som 1 x 105 - 106 hundra gånger det som e líggan n önskvärda polypep- -molekyler/cell son: åf Flera rhålles med användning av den konventionellt använda vektorn. (2) Genexpressíonen i expressíonsvektorn enligt föreliggande uppfinning kan regleras fritt ge- 10 15 20 Z5 30 35 ll 459 816 nom justering av koncentrationen av fosfat i odlingsmediet. Följaktligen kan bildningen av den önskvärda polypeptiden också regleras genom justering av koncentrationen av fosfat i odlings- mediet. (3) Den önskvärda polypeptiden kan utsöndras tillsam- mans med fosfatbindningsproteinpartiét i värdens periplasma. Följaktligen kan ovannämnda önskvärda polypeptid isoleras lätt från värden.\ Följaktligen kan expressionsvektorn enligt föreliggande uppfinning användas i stor utsträckning inom området för in- dustriell tillämpning. Ett exempel på förfarandet för fram- ställning av en önskvärd polypeptid med användning av expres- sionsvektorn enligt föreliggande uppfinning förklaras i det följande. Genen som kodar den önskvärda polypeptiden fram- ställes av generna av eukaryota celler, prokaryota celler eller virus och den sålunda framställda genen bindes till expressionsvektorn enligt föreliggande uppfinning. Därefter transformeras värden med ovan erhållna expressionsvektor för bildning av transformationsprodukter. Sedan inkuberas de sålunda erhållna transformationsprodukterna i stor skala varigenom den önskvärda polypeptiden bildas med extremt högt utbyte.

Enligt ytterligare en aspekt av föreliggande uppfin- ning tillhandahållas följaktligen ett förfarande för fram- ställning av en polypeptid medelst genexpression med använd- ning av expressionsvektorn enligt föreliggande uppfinning, vilket innefattar: (1) bindning av ett DNA~fragment uppbärande en gen, som kodar *för en p0lypeptid,vid expressionsvek- torn i ett parti nedströms-DNA-sekvensen.För en; promotor för ggg§-genen; (2) transformation av celler av en bakterie tillhöran- de Enterobacteriaceae med expressionsvektorn-. uppvisande gcnen, som kodar För en polvpeptid, .Ä _::|' 459 816 12 10 15 20 ZS 30 35 bunden därvid för bildning av transformatíons- produkter; (3) utväljande av transformationsprodukterna från utgångsceller av en bakterie tillhörande Enterobacteriaceae; __________________ (4) inkubation av transformationsprodukterna vilket medför att transformationsprodukterna uttrycker genen som kodar polypeptíden och bildar poly- peptíden; och (5) isolering av polypeptiden från de inkuberade transformatíonsprodukterna.

Vid tillämpning av ovannämnda förfarande framställes först ett DNA-fragment som uppbär en gen som kodar en poly- peptid genom organisk syntes eller isoleras denna från or- ganismer medelst konventionell teknik , såsom lys, centrifu- gering, uppslutning med ett restriktionsenzym och liknande.

Det är också möjligt att framställa ett DNA-fragment upp- bärande en gen som kodar en önskvärd polypeptid från ett RNA-fragment framställt av budbärar-RNA och RNA-virus genom överföring av ett RNA-fragment som uppbär en önskvärd gen till komplementärt DNA- fragment med användning av välkänd omvänd transkriptas.

DNA-fragmentet som uppbär en gen som kodar en polypeptid är bundet vid en expressionsvektor som uppbär pbg_-genen enligt föreliggande uppfinning vid ett parti nedströms DNA-sekvensen av en promotor för phgê-genen. Åtminstone endera av DNA-fragmentet som uppbär en gen som kodar en polypeptíd, DNA-fragmentet som uppbär p§g§-genen i expressionsvektorn och replikonen för expressionsvektorn uppvisar en gen för ett fenotypt kännetecken, såsom läkeme- delsresistens, enzymatisk aktivitet och liknande. Partiet varvid DNA-fragmentet som uppbär en gen som kodar en poly- peptid är bundet vid expressionsvektorn kan vara anordnat mellan den proximala delen och den dístala delen av DNA- fragmentet som uppbär pbgâ-genen så att ett fusionsprotein kan bildas. Detta parti kan också vara anordnat nedströms DNA-fragmentet som uppbär pbgâ-genen så att ett hybrídpro- tein kan bildas. Ovanstående bindningsförlopp genomföres med 10 15 20 25 30 35 13 459 816 användning av en ligas medelst konventionell teknik (se exempelvis den amerikanska patentskriften 4.237.224).

I ovanstående steg (2) transformeras celler av en bakterie tillhörande Enterobacteríaceae med expressions- vektorn uppvisande genen som kodar en polypeptid bunden därvid medelst ett konventionellt förfarande (se exempel- vis amerikanska patentskriften 4.237.224). Såsom en bak- terie tillhörande Enterobacteriaceae kan nämnas Erwinía, Enterobacter, Escherichía, Klebsíella, Proteus, Salmonella, Serratia och Shigella.

I ovanstående steg (3) utväljes transformationspro- dukten från utgångscellerna av bakterier tillhörande Entero- bacteriaceae medelst ett fenotypkännetecken, såsom läkeme- delsresistens, som tilldelats genom expressionsvektorn.

I ovanstående steg (4), inkuberas transformations- produkterna under lämpliga näringsmedelsbetingelser till transformationsprodukterna som medför att transformations- produkterna uttrycker genen och bildar den önskade poly- peptiden däri.

I ovanstående steg (S) genomföres isoleringen av den' önskvärda polypeptiden från transformationsprodukterna och rening av polypeptiden medelst konventionell teknik, såsom lys, utsaltníng, kolonnkromatografi och liknande.

För fallet då genen som kodar för en önskad polypeptid är bunden i'expresšáonsvektorn yid ett,parti därav nedströms DNA- sekvensen som kodar signalpeptiden för en Rhg§-gen i ovan- stående steg (1) utsöndras den önskvärda polypeptiden bildad i transformationsprodukterna i ovanstående steg (4) i periplasman av transformationsprodukterna. Skälet till detta är följande. Ovannämnda signalpeptid är kodad i Bhg§-genen vid sidan av den N-ändstående aminosyrasekven- sen för ett fosfatbindníngsprotein och uttryckes tillsam- mans med ett fosfatbíndningsprotein. Signalpeptiden er- fordras för växelverkan med och utsöndring genom inner- membranet i en cell. Med andra ord har signalpeptiden be- tydelse för utsöndring av ett fosfatbindningsprotein i periplasman av en cell genom innermembranet. När följakt- 459 815 M 10 15 20 25 30 35 ligen transformatíonsprodukten innehållande expressionsvek- torn varvid genen som kodar den önskade polypeptiden är bun- den vid dettas parti nedströms DNA-sekv ensen som kodar sig- nalpeptiden av phg§-genen, inkuberas, utsöndras den önsk- värda polypeptiden bildad i transforma plasmat i transformationsprodukten ge peptiden. tionsprodukten i peri- nom verkan av signal- Polypeptiden som utsöndrats i periplasmat kan isoleras utan lys av transformationsprodukten och följakt- ligen är isoleringen av den bildade polypeptiden som ut- söndrats i periplasmat mycket enkel i jämförelse med den för polypeptíden som ej utsöndrats i periplasmat.

Expressionsvektorn uppvisande en gen som kodar en poly- bunden därvid som erhållits i ovanstående steg (1) kan rekonstrueras på väsentligen samma sätt som beskri- vits tidigare med hänsyn till rekonstruktionen av expres- sionsvektorn enligt föreliggande uppfinning. Exempelvis kan expressíonsvektorn uppvisande en gen som kodar en polypep- tid bunden därvid vid ett parti sådant som gerett hybrid- protein ändras till en expressionsvektor uppvisande en gen som kodar en polypeptid bunden därvid vid ett parti sådant som ger ett fusionsprotein. peptíd Man bör lägga märke till att phg§-genen kan bindas vid gener som kodarsen önskad polypeptid så att den önsk- värda polypeptiden kodad genom den vira effektivt. virala la genen kan bildas Såsom beskrivits tidigare kan expressionsvektorn ut- nyttjas för framställning av fysiologiskt aktiva substan- ser, enzymer, antigener, toxiner, aminosyror, sekundära metaboliter och liknande. Såsom de fysiologískt aktiva pep- tiderna kan nämnas hormoner, såsom somatostat ACTH, tillväxthormon och liknande, faktorer, in, insülín, kalmodulin, celltillväxt- interferoner och liknande.

Såsom enzymer kan näm- nas'urokinas, mutanas, amylas, glukosisomeras, hyaluronidas, omvänd transkriptas, enzymeršför kvävefixering och liknande.

Såsom antigener kan nämnas ínfluensavirus HA-antigen, hepa- tit B-ytaantigen och*liknande. Såsom toxiner kan nämnas 10 15 20 30 35 15 459 816 Bordetella pertussis -toxín, ormgift och liknande. Såsom aminosyror kan nämnas L-glutamínsyra, L-lysin, L-metionin och liknande. Såsom sekundära metaboliter kan nämnas antibiotika, mykotoxiner och liknande. Såsom proteiner andra än ovan- nämnda substanser kan nämnas opioidpeptider, ovalbumin och liknande. Följaktligen är föreliggande uppfinning mycket användbar för framställning av livsmedel, läkemedel, foder- medel, jästa produkter, energikällor och liknande.

Föreliggande uppfinning belyses närmare med hänvisning till följande exempel vilka dock ej är begränsande.

Odlingsmedier, buffertlösningar, förfaranden för ex- traktion av DNA och förfaranden för rening av DNA som använ- des i följande exempel finns sammanställda nedan.

A: Komposition av T-medium Bakto-trypton 10 g NaC1 5 g.

Dessa beståndsdelar löstes i 1000 ml vatten.

B: Snabb alkaliextraktion av plasmid-DNA 0,1 ml av en lysozymlösning (Z mg/ml lysozym, 50 mM glykos, 100 mM CDTA (cyklohexandiamíntetraacetat), 25 mM tris-HCl (pH 8,0) ) sattes till bakteriecellpelletten som er- hållits från en 1,5 ml kultur genom centrifugering, vilken kultur hade inkuberats över natten. Erhållen suspension in- kuberades vid OOC under 30 min. Därefter tillsattes 200 /ul av en alkalisk SDS-lösning (0,2N NaOH, 1 % (vikt/vikt) SDS (natriumdodekylsulfat) )ti1l suspensionen och det hela om- rördes. Efter inkuberingen vid OOC under S min. sattes 150/ul 3-M natriumacetat (pH 4,8) till suspensionen och det hela blandades försiktigt. Erhållen suspension hölls vid OOC under 60 min. vid 5000 rpm under S min. för avlägsnande av utfällda pro- och utsattes därefter för centrifugering dukter. Från det övre partiet av övervätskan pipetterades 0,4 ml av en alikvot av. Denna akikvota del blandades med l ml av kall absolut etanol för utfällning av DNA. Erhållen blandning centrifugerades under 2 min. och därefter bort- 10 15 20 25 35 459 815 de kastades erhållen övervätska och i erhållen pellettsattes 100/ul av en natriumacetatlösning (0,1-M natriumacetat, 0,05-M tris-HCl (pä 8,0) ). Erhâllen lösning blandades med dubbla volymen kall absolut etanol för åstadkommande av återutfällning av DNA. Utfällt DNA löstes i en lämplig buffert. De speciella kännetecknen för ovanstående förfaran- den finns beskrivna i Nucleic Acid Research, vol. 7, nr 6, sid. 1513-1523 (1979). Rätt plasmid-DNA framställt med ovannämnda förfarande kan användas för fysikaliska kart- analyser och för transformation.

C: Avlägsnande av Etidiumbromid från DNA DNA-fraktíonen från CsCl-densitet-gradient-centrifu- geringen blandades med en lika stor volym av en isopropanol- lösning mättad med vattenhaltig 5 M NaCl-10 mM tris-HCl~ 1 mM Na3EDTA (pH 8,3). Ovanstående förfarande upprepades tills den vattenhaltiga fasen innehållande DNA avfärgats.

Två volymer vatten och därefter 6 volymer absolut etanol sattes till erhållen vattenhaltig fas. Blandningen fick stå vid -20°C under en timme flera dagar för utfällning av DNA. Utfällt DNA tillvaratogs genom centrifugering och tor- kades för erhållande av ett DNA-prov. DNA-provet löstes i 100/ul tris-EDTA-lösning (10 mM tris-HCl, 1 mM Na3EDTA [p§{7,5) ) och användes därefter. Ovanstående förfaranden finns mer detaljerat beskrivna i Advanced Bacterial Genetícs, sid.126, Cold Spring Harbor Laboratory (1980). ' D: Kompositíon av EcoRI restriktionsenzymbuffert (5~faldigt koncentrerad) Nacl soo mm Tris-Hcl zso mn (pH 7,4) Mgso4 se mm 10 15 20 25 30 35 H 459 816 E: Komposition av ligasbuffert Trís-HCl 66 mM (pH 7,6) MgCl2 6,6 mM Ditiotreítol 10 mM ATP 0,5 mm F: CsCl~blockdensítet-gradíentcentrifugering 1 ml av en 5,0-M CsCl-lösning (5,0-M CsCl , 10 mM HgSO4, 10-mM tris-HC1 (pH 8,0) , 0,1-mN Na2EDTA (flytden- sitet=1,60) ] placerades i botten av ett cellulosanítrat- centrífugrör uppvisande en diameter av 13 mm och en längd av 51 mm (tillverkat och sålt genom Beckman Instruments Inc., USA). Over lösningen i röret lades 3 ml av 3,0-M CsCl-lösning (3,0-M CsCl, 10-mM MgSO4, 10-mM trís-HCl (pH 8,0), 0,1-mM NaZEDTA (f1ytdensitet=1,40] ). Därefter lades dessutom 1 ml av en fagsuspension på CsCl-lösnings- skiktet och det hela centrifugerades vid 30.000 rpm i en SW 50,1-rotor (tillverkad och såld genom Beckman In- struments Inc., USA) vid 20°C under 1 timme. Därefter ut- togs mindre än 0,5 ml av en fagfraktion från sidan av röret med en 1-ml spruta och en 16-mm, 67um nål. Dessa förfaranden finns mer detaljerat beskrivna í Advanced Bacterial Genetics, sid.80~81, Cold Spring Harbor Laboratory (1980).

G: CsCl-jämviktsdensitet-gradíentcentrifugering Fagfraktionen som erhölls under punkt F ovan blandades med 4,0 -M CsCl-lösning (4,0-M CsCl, 10-mM MgS04, 10-mM tris-HCl (pH 8,0), 0,1-mM EDTA) och centrifugerades vid 30.000 rpm i en SW 50,1-rotor under 20 timmar. Högst 0,5 ml fagfraktion uttogs från sidan av röret med en 1-ml spruta och en 16-mm, 67um nål. Ovanstående förfaranden finns när- mare beskrivna i Advanced Bacterial Genetícs, sid.81, Cold Spring Harbor Laboratory (1980). 459 815 18 10 15 ZO ZS 30 35 H: Komposition av LB-medium * Bakto-pepton 10 g Jästextrakt 5 g NaCl 5 g Ovanstående beståndsdelar löstes i 1000 ml vatten och pH justerades till 7,2 genom tillsats av Na0H. i: I: Komposition av T~agarmedium Bakto-tripton 10 g NaCl S g Agar 15 g Ovanstående beståndsdelar löstes i vatten och vatten sattes dessutom till i:en sådan utsträckning att hela vo- lymen av lösningen uppgick till 1000 ml.

* (Anmärkning) Efter det att mediet autoklaverats för sterilisering tillsattes 1/1000 volym av en 10 mg/ml vatten- haltig tetracyklinlösning eller 40 mg/ml vattenhaltig ampicíllinlösning därtill. Medierna innehållande antibioti- ka användes för utväljande av antibiotikaresistenta trans- formationsprodukter och för att det skulle garanteras att den antibiotikaresistenta rekombinantvektorn bibehålles i bakteriecellerna. §xemEel 1 Steg 1: Framställning av plasmid-pBR322-DNA och spjälkníng av plasmíd-pBR322-DNA genom restríktionsenzym- EcoRI 1 liter T-medium ympades med 10 ml av ett ympmaterial av Éscheríchia coli K-12-stam C600 (B.J. Bachmann, Bacterial. Rev., šâ, S25-S57 (1972) ), (uppbärande plasmíd pBR322), och odlades vid 37°C under skakning tills turbidi- teten av odlingslösningen nådde 0,6A vid 600nm. Kloramfeni- kol sattes till odlingslösningen till en slutkoncentration av 250/ug/ml. Odlingslösningen inkuberades därefter vid 37°C under 15 timmar och utsattes för centrifugering för 15 20 25 30 35 19 459 816 tillvaratagande av celler. De sålunda tíllvaratagna cellerna tvättades en gång med 100 ml tris-EDTA-lösning (innehållan- de 100-mM tris-HCl-buffert (pH 7,5) och 1-mM EDTA) och ut- sattes för snabb alkaliextraktion för erhållande av rått plasmid-DNA. I sålunda erhållet rått plasmid-DNA införes ovannämnda tris-EDTA-lösning i en sådan mängd att den totala volymen blev 15 ml. Till lösningen sattes 16 g kristallin CsCl och 2 ml 5 mg/ml etidiumbromid och den specifika vikten dzs av blandningen justerades till 1,39 genom tillsats av vatten eller kristallin CsCl. Erhållen blandning utsattes därefter för centrífugering vid 33.000 rpm vid ZOOC under 40 timmar. Läget av bandet av plasmid-DNA bestämdes medelst ultraviolett ljus av lång våglängd och plasmid-DNA tillvara- togs genom fraktionering. Från plasmid-DNA-fraktionen av- lägsnades etídiumbromiden med förfarandet beskrivet i punkt C.

Till 0,2 ml av den sålunda erhållna PBRSZZ-DNA-lösning (100/ug/ml) sattes 0,05 ml restriktionsenaymbuffert för ÉQQRI och till erhållen lösning sattes restriktionsenzym ÉEQRI i en sådan mängd att aktiviteten av restriktionsenzym- et EEQRI blev en enhet per/ug plasmid-DNA. Enzymreaktionen genomfördes vid 37°C under 60 minuter. Därefter upphettades blandningen vid 6S°C under 5 minuter för inaktivering av re- striktionsenzymet. Blandningen dialyserades sedan mot tris- EDTA-lösning (innehållande 10-mM tris-HC1 (pH 8,0) och 1-mM EDTA). Efter fullbordande av dialysen sattes 4 enheter av alkaliskt fosfatas av Escherichia coli (framställt och tillverkat genom Sigma Chemical Co., USA) till blandningen följt av inkubering vid 6S°C under 30 minuter. En lika stor mängd av en fenollösning (framställd genom mättnad av ovan- nämnda tris-EDTA-lösning med fenol) sattes till blandningen följt av skakning. Därefter utsattes erhâllen lösning för låghastighetscentrífugering och uppdelades i den vattenhal- tiga fasen och fenolfasen. Den vattenhaltiga fasen tillvara- togs. Ovannämnda centrifugering- och tillvaratagníngssteg upprepades två gånger. Därefter sattes en lika stor volym av 459 81ö m 15 20 25 lösning I (24:1 baserat på volym blandning av kloroform och isoamylalkohol) till den tillvaratagna vattenhaltiga fasen. Erhållen lösning blandades och den vattenha ltiga fa- sen tillvaratogs.

En sådan operation upprepades fyra gånger och den tillvaratagna vattenhaltiga fasen ddalyserades mot ligasbuffert för efterföljande bindningsreaktion, nom en lösning av spjälkad DNA för pBR322 erhölls.

Steg 2: Framställning av DNA-fragment innehållande DNA-fragment uppbärande phoS-genen från Escherichía coli-K-12-stam varige- 1 liter av T- Escherichia coli K-12-stam KLF48/KLlS9 (CGSC nr 4302) (E. coli Genetic Stock Center (CGSC), Yale University, Connec- ticut,USA) och odlades vid 37°C under skakning. Odlingslös- ningen utsattes i logaritmiskt tillväxtfas (turbiditet: O,6A vid 600 nm) för centrifugering för t illvaratagande av celler. tDe sålunda tillvaratagna cellerna uppslammades i 10 ml lysozym-lösning (innehållande 2 mg/ml lysozym, 100-mM»EDTA och 0,15-M NaCl) och suspensionen fick stå vid 370C under 15 minuter. Suspensionen frös därefter snabbt i ett bad av torris och aceton vid na suspensionen sattes 50 ml tris-SDS-buffert (innehållande 0,1-M tris-HCl (pH 9,0), sulfat) och 0,1-M NaCl) och erhållet material utsattes för smältning vid 60°C. Ovannämnda steg av frysning i ett torr- is/acetonbad och smältning vid 60°C upprepades 5 gånger var- vid cellerna lyserades fullständigt.

Till erhállen lösning, vari cellerna var lyserade , sattes en lika stor mängd av en fenollösning (framställd genom mättnad av ovannämnda tris- SDS-buffert med omdestillerad fenol) följt av omröring. Er- hållet material utsattes därefter för låg hastíghetscentri- fugering, varigenom det separerades i den vattenh altiga fa- sen och fenolfasen.

Den vattenhaltíga fasen tíllvaratogs.

Sålunda tíllvaratagen vattenhaltig fas blandades med dubb- la volymen absolut etanol. Erhållen blandning utsattes där- medium ympades med 10 ml av ympmaterial av -zo°c. Till den sålunda frus- 1% (vikt/volym) SDS (natriumdodecyl- 15 20 25 30 35 21 459 816 efter för centrifugering vid 12.000 rpm under 20 minuter och pelletter tillvaratogs. De sålunda erhållna pelletterna löstes i 20 ml av en blandning av NaCl och citronsyra (innehållande 0,15-M NaCl och 0,015~M natríumcitrat, pH 7,0), varvid en lösning erhölls innehållande DNA. Till 10 ml av den sålunda erhållna DNA-haltiga lösningen sattes en lika stor mängd av lösning I (såsom nämnts i steg 1) följt av omröring. Från erhållet material tillvaratogs tiga fasen. Vidare blandades den sålunda tíllvaratagna vat- tenhaltiga fasen med dubbla volymen etanol och utfällt DNA löstes i 5 ml tris-EDTA-lösning (innehållande 10-mM trís-HCl (pH 7,5) och 1-mM Na2EDTA). Utfällningen med ab- solut ctanol såsom nämnts ovan upphettades och 5 ml DNA- lösning framställdes. Till 0,2 ml av sålunda erhållen DNA- lösning (200/ugfiml) sattes 0,05 ml restriktionsenzymbuffert och till erhållen lösning sattes restriktionsenzym ÉEQRI i en sådan mängd att aktiviteten av restriktionsenzym ÉEQRI blev en enhet per/ug DNA. Därefter inkuberades blandningen vid 37°C under 60 minuter, följt av värmebehandling vid 65°C under S minuter för inaktivering av restriktionsen- zymet. Blandningen dialyserades därefter mot lígasbufferten, varigenom en E.colí-DNA-lösning erhölls.

Steg 3: Bindning av pBR322 DNA och E.coli -DNA-fragment innehållande en BhoS-gen Lösningen av pBR322-DNA framställd i steg 1 utspäddes till 30 pg/ml DNA-koncentration med en bindningsbuffert.

Lösningen av E.coli-DNA framställd i steg 2 späddes till 100/ug/ml DNA-koncentration med samma bindníngsbuffert som nämnts ovan. S0/ul av pBR32Z-DNA-lösningen och 100/ul av E.coli-DNA-lösningen blandades. T4-ligas sattes till er- hållen blandning i en mängd av en enhet T4 ligas per/ug DNA som skall bindas. Enzymreaktíonen för bindning av DNA genomfördes vid 8°C under 8 timmar. Efter fullbordande av 10 20 25 459 816 H bindningen dialyserades erhållen lösning mot tris-EDTA- lösning (innehållande 10-mM tris-HCl (pH 7,5) och 1 mM EDTA).

Steg 4: Utväljande av plasmíder uppbärande 2hoSegenen A: E.coli C75-stam E.coli C75-stam (Garen, A., och N. Otsuji, J. MolÄ Biol., 8, 841-852 (1964) ) odlades i LB-medium under skak- ning tills turbíditeten av odlíngslösningen blev 0,6 A vid 600 nm. Därefter utsattes 2,5 ml av odlingslösningen för låg- hastighetscentrifugering för tillvaratagande av celler. De tillvaratagna cellerna uppslammades i 2,5 ml 0,1-M vatten- haltig MgCl2-lösning. Cellsuspensionen utsattes därefter för låghastighetscentrifugering för tillvaratagande av celler.

Cellerna uppslammades i 1,2 ml 0,1-M vattenhaltig CaCl2- lösning och erhâllen cellsuspension fick stå vid OOC under 30 minuter följt av låghastighetscentrífugering för tillva- ratagande av celler. De tíllvaratagna cellerna uppslamma- des på nytt i 0,1 ml av 0,1-M vattenhaltig CaCl2-lösning.

Till erhållen cellsuspension sattes 10/ul av lösningen av bundet DNA som framställtsi steg 3. Erhállen blandning fick stå på iskylt vatten under 30 minuter och upphettades där- efter-i ett »Mage-va-ttenbad under s minuter. -1,o-~m1 LB- medium i förväg värmt till 37°C sattes till den upphettade blandningen följt av inkubering vid 37°C under 90 minuter.

Därefter spreds 0,1 ml av den erhållna odlingslösningen och 0,1 ml av odlingslösningen spädd 10 gånger med LB- medíum var och en på T-agarplattor innehållande tetracyklin eller ampicíllin och inkuberades därefter vid 37°C eller 30°C över natten för bildning av kolonier av transformations- produkter resistenta mot tetracyklin eller ampicillin.

De bildade transformationskolonierna sprutades med en al- kalisk-fosfatasdetekterande färglösning (innehållande Z mg/ml =( -naftylfosfat och 20 mg/ml Fast Blue B salt (tetrazoterad o-dianisidin) J löst i 0,5-M tris-HCl (pH 8,0).

De vita transformatíonskolonierna som ej hade ändrats 10 15 20 ZS 30 35 23 459 816 till brunt genom sprutning med färglösningen utvaldes såsom cellerna uppbärande plasmiderna vari E. coli - 2hg§-genen var bunden till pBR322-DNA.

B: §. coli C2-stam Väsentligen samma förfarande som angivits ovan upprepa- des för utväljande av vita transformationskolonier innehål- lande plasmider, vari en E. coli- Ehgë-gen var bunden vid pBR3ZZ-DNA förutom att transformationen av E. coli CZ-stam (Morris, H., M.J. Schlesinger, M. Bracha, och E. Yagil, J. Bacteriol., 119, 583-592 (1974) ) användes såsom indika- tor för utväljande av plasmiderna' Steg 5: Konstruktion av restriktionskartor för plasmider (pSN40l och pSN40Z) uppbärande en 2hoS-gen Transformationsprodukterna utvalda i ovanstående steg 4 odlades i LB-medium. Därefter extraherades plasmid-DNA från de erhållna odlade cellerna och renades på följande sätt.

Plasmid-DNA extraherades från ovan erhållna odlade celler en- ligt det snabba alkali-extraktionsförfarandet. Därefter re- nades de råa plasmid-DNA-lösningarna genom jämvikt-densítets- gradíentcentrifugering på samma sätt som i steg 1. Etídium- bromíd avlägsnades från sålunda renadc plasmid~DNA-lösningar och DNA utfälldes (se steg 1). Sålunda erhållet plasmid- DNA uppslöts med olika restriktionsenzymer och därefter be- stämdes längderna av DNA-fragmenten genom elektrofores på agarosgel. Restriktionskartorna för plasmiderna konstruera- des. Såsom ett resultat därav visade det sig att wá typer av plasmider uppbärande Rhgå-genen hade framställts.

En av plasmíderna betecknas hädanefter "pSN401" och den andra "pSN40Z". Restriktionskartan för plasmíden pSN401 är visad i fig.1. I plasmiden pSN402 infördes ESQRI1-ÉEQRIZ-fragmentet från pSN402 i motsatt orientering till den í plasmiden pSN401. 10 15 20 ZS 30 35 459 816 24 Exempel 2 Steg 1: Framställning av bakteriofag)5g1mS DNA-fragment innehållande pho egenen 150 ml av T-medium ympades med 1,5 ml av ett ympma- teríal av Escherichia coli KY7388-stam (T. Mili, Annu. Rep.

Inst. Virus Res.,ål, 1-26 (1978) J, som är en lysogen av bakteríofag ÉÄglmS och odlades vid I den logaritmíska míttentillväxtfa till kulturen till en slutkoncentra lingen fortsattes under ca 2 timmar Odlingen kyldes på is och kloroform droppar) därtill. 31°c under skakning. sen sattes mítomycín C tion av 0,5/ug/ml. Od- tills lys uppträtt. sattes droppvis (flera Därefter pipetterades luft ned i odlings- lösningen så att odlingslösningen bringades att bubbla, vari- genom cellerna i odlíngslösningen lyserades fullständigt.

Erhållet faglysat utsattes därefter för lâghasti ghetscentri- fugeríng. Overvätskan tíllvarato gs under det att utfäll- ningen bestående av cellavfallsmaterial bortkastades. Er- hållen övervätska utsattes för h geringsröret. De tíllvaratagna fagpartiklarna uppslammades i 4,0 ml av )\ -spädningsmedel (innehållande 10-mM tris- HCl (pH 7,5), 10-mM MgS(ä och 0,1-mM Na2EDTA). Erhållen fag- partikelsuspensíon utsattes för CsCl blockdensítetsgradient- centrifugeríng följt av CsCl-jämvíktsdensítets- nehöll partiklar av ÃcglmS-fag. ArglmS-DNA extraherades från ovan erhållna Å.glmS-fag-partiklar med användning av formamid på nedan beskrivet sätt. Speciellt sattes till 0,5 ml av Å.glmS-fag-partíkelfraktionen 0,05 ml av en tris-EDTA-lösning (innehållande ZM tris-HCl (pH 8,5) och 0,2-M Na2EDTA) och därefter 0,5 ml formamíd.Erhállen bland- ning fick stå vid rumstemperatur under ca 3 timmar. Där- efter sattes 0,5 ml destillerat vatten och 3 ml absolut eta- l nol successivt till blandningen och blandades för utfäll- 10 15 20 25 30 35 .Du UT \O a) -\ Ö\ 25 ning av >»glmS-fag-DNA. Utfällt.ÄglmS-fag-DNA tíllvaratogs genom centrifugeríng, tvättades med 70 % (volym/volym) eta- nol och vakuumtorkades för erhållande av torkat Å.glmS- DNAJ Torkat l,glmS-DNA löstes í S ml av en tris-EDTA~ lösning (innehållande 10-mM tris-HCl (pH 7,5) och 1-mM Na2BDTA) och spjälkades därefter medelst ett restriktions- enzym med §cgRI och dialyserades på samma sätt som i steg 2 i exempel 1. Sålunda framställdes en lösning innehållande DNA~fragment uppbärande phgâ-gen. steg 2; Bindnin av ßR3zzDNA- och R- lms-fa -DNA-fra men: 8 P g 2 2 innehållande phoS-genen Väsentligen samma förfarande som i steg 3 i exempel 1 upprepades för framställning av en bunden DNA~lösníng förutom att Ä,g1mS-fag-DNA-lösningen som framställts i steg 1 ovan användes i stället för E. coli-DNA-lösningen.

Steg 3: Utväljande av plasmider uppbärande pho§~genen A: f. coli C 75-stam Väsentligen samma förfaranden som i steg 4-A i exempel 1 upprepades för utväljande av vita transformationskolonier uppbärande plasmíderna innehållande phoë-genen framställd från Ä.glmS-fag förutom att lösningen av bunden DNA som fram- ställts i steg 2 ovan användes i stället för den bundna lös- ningen som framställts i steg 3 i exempel 1.

B: E. coli C2-stam _ Väsentligen samma förfaranden som i steg 4-B-i exempel 1 upprepades för utväljande av vita transformationskolonier innehållande plasmider vari phg§-genen framställd från )Lg1ms-fag bunaics till pßnszz-DNA förutom att bunden DNA- lösning framställd í ovanstående steg Z användes i stället för bunden lösning framställd i steg 3 i exempel 1.

Steg 4f Konstruktion av restríktionskartor över plasmider (pSN40l och pSN402) uppbärande phoS -gencn väsentligen samma förfaranden som i steg 5 í exempel 1 10 15 Z0 25 30 35 26 459 816 upprepades för konstruktion av restriktíonskartor av plas- mider förutom att plasmiderna som erhållits i ovanstående steg 3-A och steg 3-B användes i stället för plasmiderna som erhållits i steg 4-A och steg 4-B i exempel 1. Därvid visade det sig att plasmiderna som erhållits i ovanstående steg utgjordes av pSN401 och pSN402.

Exempel 3 Steg 1: Uppbyggnad av plasmid pSN507 uppbärande phoS-genen från pSN401 I steg 5 i exempel 1 erhållet pSN40I-DNA uppslöts partiellt med restriktionsenzym HindIII och bands därefter på nytt med användning av T4-ligas på väsentligen samma sätt som beskrivits i steg 3 i exempel 1. Med användning av den sålunda erhållna på nytt bundna plasmidlösníngen transforme- rades E. coli C75-stam och C90-stam (Garen, A. och N. Otsuji, J. Mol. Biol., §, 841-852 (1964) ) såsom'recipienter på väsentligen samma sätt som beskrivits i steg 4 i exempel 1 för erhållande av stammar uppbärande phg§+- plasmiderna.

Därefter extraherades plasmid-DNA från odlingarna av de flera oberoende transformationsprodukterna och renades på väsentligen samma sätt som beskrivits i steg 5 i exempel 1 och en restriktionskarta över plasmidérna"konstruerades. Den renade på nytt bundna plasmiden betecknas hädanefter "pSN507" vars fysikaliska karta är visad i fig.1.

Steg 2: Uppbyggnad av plasmid pSNS08 uppbärande phoS-genen från pSNS07 I ovanstående steg 1 erhàllen pSNS07-DNA uppslöts med restríktíonsenzym Mluï och därefter genomfördes nybindning av plasmíden och tranšformationen av vardera av E. coli C75-stam och §. coli C90-stam med den nybundna plasmíden på väsentligen samma sätt som beskrivits i steg 3 i exempel Z för erhållande av stammar uppbärande erhållen nykonstrue- . f..-.- '_-:.-.a<2.e«.--=.-.'~;Äæ3ail{. 10 15 20 25 35 27 459 816 rad plasmid (betecknas härefter "pSN508". Från de odlade cellerna av de sålunda erhållna stammarna extraherades pSN508-DNA därefter och renades på väsentligen samma sätt som beskrivits i steg 5 i exempel 1. En restriktionskarta över plasmiden pSN508 konstruerades. Resultatet är visat i fign.

Steg 3 2 Uppbyggnad av plasmíd pSN518 uppbärande phéâ- .genen från pSN508 I ovanstående steg 2 erhållen pSN508-DNA uppslöts med restriktionsenzym pstl och därefter genomfördes nybind- ning av plasmiden och transformationen av vardera av E. coli C75-stammen och E. coli C90-stam med den nybundna plasmiden på väsentligen samma sätt som beskrivits i ovanstående steg 2 för erhållande av stammar uppvisande den rekonstruerade plasmiden (betecknas härefter "pSN518").

Därefter extraherades pSN518-DNA från de odlade cellerna av de sålunda erhållna stammarna och renades på väsentligen samma sätt som beskrivits i steg 5 i exempel 1. En restrik- tionskarta över plasmiden pSN518 konstruerades. Resultatet är visat i fíg.1.

Exempel 4 Uppbyggnad av plasmider pSN407 och pSN408 uppbäran- de phošïgenen från pSN40Z I steg 5 i exempel 1 erhållet pSN402-DNA rekonstrue- rades pà väsentligen samma sätt som beskrivits i steg 1 i exempel 3. Erhållen plasmíd betecknas härefter "pSN407“. Där- efter konstruerades en restriktíonskarta över plasmiden pSN407. Restriktionskartan över pSN407 var väsentligen samma som den för pSNS07 förutom att orienteringen av EcoRI1- EcoRIZ-fragmentet i pSN407 var motsatt till orienteringen av detta i pSNS07.

Ovan erhållna pSN407 rekonstruerades på samma sätt som i steg 2 i exempel 3. Erhållen plasmid betecknas härefter "pSN408". Restriktionskartan över pSN408 konstruerades. Re- 459 816 28 Striktionskartan över pSN408 var väsentligen samma som den ' för-pSN508 förutom att orienteringen av EcoRI1-EcoRI2-frag- mentet i pSN408 var motsatt till orienteringen av detta frag- ment í pSN508.

Exempel 5 Konstruktion av plasmider pSN1507 och pSN1508 uppbärande phoS-genen från pSN507 På väsentligen samma sätt som beskrivits i exempel 1 spjälkades plasmid pBR3Z5 (Bolivar, F. et al., Gene, 4, 121 (1978) ) och plasmid pSN507 var och en med restrik- tionsenzym EEQRI. Därefter bands den spjälkade pBR32S vid den spjälkade pSN507 på väsentligen samma sätt som beskri- vits i steg 3 i exempel T. Därefter genomfördes sållning på väsentligen samma sätt som beskrivits i steg 4 i exempel I av erhàllen bunden DNA med användning av E. coli ANCC75- stam (en Pl-transduktionsprodukt: E. coli.C75-stam X E. coli CSH57-stam (Miller, J.H., Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., sid. 13-23 (1972) ) såsom recipient. väsentligen samma förfaranden som i steg S i exempel 1 upprepades för extraktion och rening av ovan erhållna plas- mider. Restriktionskartorna över plasmiderna konstruerades.

Såsom ett resultat därav visade det sig att två typer av plasmider innehållande ph9§¿ genen hade erhållits. Den ena av plasmiderna betecknas härefter "pSN1S07“ och den andra "pSN1S08". Det visade sig också att EEQRI1-§§gRI2-fragmenten i pSN507 hade införts i ÉEQRI-platsen i pBR325 under bild- ning av pSN1SO7.

Exempel 6 Uppbyggnad av plasmid pSN2507 üppbärande phoS- genen och konstruktion av en restríktionskarta över plasmiden pSNZ507 Plasmid pKN402A (B.E. Uhlín et al., Gene, §,91-106, (1979) ) -DNA för vilken restriktionskartan är visad i fig.2 uppglötg partiellt med restriktionsenzym fiingll och Tlfißfl. 10 15 20 25 30 35 29 459 816 bands på nytt med T4-ligas. Stammar uppvisande nybundna plasmíder (betecknas hädanefter "pSH101") erhölls på väsent- ligen samma sätt som beskrivits i steg 4 i exempel 1 och steg S i exempel 1 och en restriktionskarta över pSH 101 kon- struerades. Restriktionskartan är visad i fig.2. Var och en av pSH101 och pSNSO7 uppslöts med ÉEQRI. Erhållna fragment av pSH101 och pSNSO7 bands med användning av T4-lígas. Den erhållna bundna plasmiden utsattes för sållning för erhållan- de av vita transformationskolonier uppvisande plasmider upp- bärande phoå-genen och bildade genom bindning av fragmentet av pSNSO7 vid pSH101. De erhållna transformationskoloníerna odlades och plasmid-DNA extraherades från de odlade trans- formatíonsprodukterna och renades på väsentligen samma sätt som beskrivits i steg S i exempel 1. En restriktionskarta över plasmíden pSN2507, som är en av de sålunda erhållna plasmiderna, konstruerades på väsentligen samma sätt som be- skrivits i steg 5 i exempel 1. Läget av phoå-genen i pSN2507 bestämdes. Restriktionskartan över pSN2507 är visad i fig.2.

Det visade sig att en plasmíd vari orienteringen av §ggRI1- ÉEQRIZ-fragmentet uppbärande phg§-genen var införd i motsatt orientering till den i pSNZ507 hade framställts också vid ovan angivna bindning av pSNSO7-fragmentet vid pSH101.

'Experiment 1 Effekten av genexpression i expressionsvektorn enligt föreliggande uppfinning bestämdes genom beräkning av antalet molekyler av fosfatbindningsproteinet som bildades per värd- cell. Mekanismen för bildningen av ett fosfatbindningsprotein genom expressíonen av pho§-genen förklaras kort i det följan- de. Utgångsämnet till fosfatbindningsproteinet framställdes först genom expressionen av phgâ-genen. Utgångsämnet uppvisa- de en signalpeptid i den N-innehållande änden av det färdi- ga fosfatbindningsproteinet. Signalpeptiden fordras för växel- verkan med och utsändning genom innermembranet. Följaktligen fransporteras först utgångsämnet för fosfatbindningsproteinet till innermembranet genom inverkan av signalpeptiden.Därefter 10 15 20 25 30 35 4559 8'16 30 spjälkas signalpeptidpartiet av proteinet när detta passe- rar genom innermembranet och det spjälkade färdiga fosfat- bindningsproteinet utsöndras i cellens períplasma.

Bestämningen av antalet molekyler av fosfatbindnings- proteinet som bildas per cell genomföres på följande sätt.

E.coli ANCC 75-stam transformerades med plasmiden pSN507 och ínkuberades över natten i tris/glukosmedíum som är en minimal saltlösning buffrad med tris/HCl (pH 7,2) innehållande 0,2% (vikt/volym) glukos kompletterad med 0,64 mM av KHZPO4 (betecknas hädanefter "hög-fosfatmedíum").

Efter ínkubering skördades värdcellerna och uppslammades i två typer av odlingsmedel, nämligen ovannämnda hög-fos- fatmedium och samma tris/glukosmedíum som beskrivits ovan förutom att koncentrationen av KHZPO4 var 0,064 mM (beteck- nas hädanefter "låg-fosfatmedium“), följt av inkuberíng vid 3706 med skakning under 6 timmar. Celldensiteten för varje odling uppskattades genom absorbansen vid 600 nm. Det visa- de sig därvid att antalet celler i vardera odlingen var 1,3 x 109. Därefter uppsamlades cellerna i vardera odlingen genom centrifugering vid 2000 x g under 5 minuter.

De tillvaratagna cellerna tvättades en gång med 1 ml buffertlösning innehållande 10 mM trís-HCl (pH 7,2] och 30 mM av NaCl och uppslammades på nytt i 0,1 ml 33 mM tris- Hcihfph- 7,5) i et: eentrifugeringsrör. 'fin ovannämnda cen- suspension sattes 0,1 ml buffertlösníng innehållande 33 mM tris-HCl (7,5) , 40% (vikt/volym) sackaros och 0,1 mM EDTA, det hela blandades snabbt och inkuberades vid 37°C under 10 minuter. Cellerna tillvaratogs genom centrifugering vid 8000 X g under 3 minuter och uppslammades omedelbart på nytt i 0,1 ml av 0,5 mM vattenhaltíg MGCI-lösning. Cell- suspensionen skakades kraftigt i ett iskylt vattenbad under 10 minuter, följt av centrifugering vid 8000 X g under S mi- nuter. Till den sálunda erhållna övervätskan (betecknas hädanefter "periplasmafraktion“]'sattes 20/ul av en prov- buffertlösning för polyakrylamidëlektrofores (innehållande 1 ml av 0,5M tris-HCl (pH 6,8), 1 ml 10 % (vikt/volym) na- 10 15 Z0 25 30 M 459 316 triumdodecylsulfat (SDS), 0,1 ml 13-merkaptoetanol, 1 ml glycerol, 2,5 ml 0,1 % (vikt/vikt) vattenhaltig lösning av bromfenolblått och 4,4 ml vatten) följt av värmebehandling vid 100°C under S minuter. Pelletten(betecknas hädanefter "intracellulär fraktion") som erhölls vid ovannämnda centri- fugering tvättades två gånger med 1 ml av 0,5 mM vatten- haltíg MgCl2-lösning och uppslammades på nytt i 20 /ul av lysozymlösningen(innehållande Z mg lysozym i 1 ml vatten, su mm glukos, 10 mn EDTA øeh 25 mn :ris-Hcl (pH s,o) ) följ: av inkuberíng vid 37°C under 30 minuter. Den sålunda erhåll- na suspensionen späddes med 180/ul 0,5 M vattenhaltig MgClz-lösning och blandningen omrördes tillräckligt. Där- efter sattes till blandníngen 120/ul av ovannämnda provbuf- fertlösning för polyakrylamíd-elektrofores följt av värme~ behandling vid 100°C under 5 minuter.

Ovan framställda fraktioner utsattes för SDS poly- akrylamidgel~elektrofores enligt förfarandet beskrivet i 680-685 (19?0), varigenom ut- bytet av fosfatbindningsproteinet i cellerna bestämdes.

Laemmlí, U.K., Nature, gål, Resultaten visas i tabellen nedan.

TABELL Mängd (/ug/cell) låg-fosfatmedíum hög-fosfatmedium Fosfatbindníngsprotein 8,0 X 10-8 1,0 X 10-11 Såsom är uppenbart av ovanstående tabell regleras bildningen av fosfatbíndningsproteínet och utgångsämnet därtill, dvs expressíonen av genen som kodar ett fosfatbindningsprotein i expressionsvektorn enligt föreliggande uppfinning genom justeringen av koncentrationen av fosfat i odlingsmediet.

Därefter beräknades antalet molekyler fosfatbindníngs- protein per cell med följande ekvation: Antalet molekyler per cell = A xc B 10 15 20 25 30 35 459 816 32 vari A är utbytet av fosfatbindníngsproteínet (g/cell); B är molekylvikten av fosfatbíndníngsproteinet (35.000); och C är Avogadro's tal (6 x 1023) Antalet molekyler av fosfatbindningsproteinet var 1,3 x 106 per cell vid odling i låg-fosfatmedíum.

Exempel 7 Framställning av jš-galaktosidas med användning av plasmid pSN508 nppbärande phoS-genen Plasmíd pSN508 framställd i steg 2 i exempel 3 spjälka- des med användning av §E2RI för framställning av ett §ggRI- E59-RI-DNA-fragment uppbärande en Bhgå-gen.Vid det sålunda framställda DNA-fragmentet uppbärande Bhg§:genen bands DNA- fragmentet framställt genom spjälkning av plasmíden pMC1403 innehållande en gen som kodare för B -galaktosidas (med ave seende på plasmid pSN1403, hänvisning till Journal of Bacterio- logy, lgš, 971-980 (1980) ) medelst ÉEQRI, varigenom en rekom- binantvektor bildas.

Därefter utvaldes rekombinantvektorn (betecknas hädan- efter "pSNS081") och isolerades på väsentligen samma sätt som beskrivits i steg 4 och steg S i exempel 1.

Plasmid pSN5081 utströks därefter partíellt med an- vändning av Hpal. Därefter uppslöts de bägge ändstàende par- tiernaflav erhållet DNA-fragment av plasmíd pSN5081 nartíellt med användning av Nuclease BAL31 (handelsbeteckning för deoxi- ribonukleas framställd och såld av Bethesda Research Labora- tories Inc., USA) och utsattes för spjälkníng med använd- ning av §maI. Det spjälkade DNA-fragmentet av plasmiden bands på nytt med användning av T4-ligas.

Efteråt transformerades E. coli CSHZ6-stammen (det kan hänvisas till J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, sid.17 (1972) ), som är en Lac-mutant som ej kan utnyttja laktos i ett odlingsmedium, i'en laktos-kompletterad tetrazoliumplatta såsom odlingsme- dium med ovan erhållna rekombínantvektor uppbärande en gen som kodar [3-galaktosidase för bildning av transformations- 10 15 20 25 30 .Cn (Ii UD CD ...à Ch 33 produkter. Fenotypen Lac' av E. coli CSH26-stammen övergår till Lac+ genom transformation med rekombinant- vektorn och följaktligen förändrades ovan erhållna trans- formationsprodukter sålunda att de kunde utnyttja laktosen i den laktos-kompletterade tetrazoliumplattan. Följaktligen utvaldes transformationsprddukterna lätt från utgångsceller-' na av E. coli CSH26-stam med användning av storleken och färgen på kolonierna som bildats på den laktos-komplette- rade tetrazoliumplattan såsom ett kriterium pâ väsentligen samma sätt som beskrivits i Experiments in Molecular Gene- tics, Cold Spring Harbor Laboratory, sid.49 och sid. 52-54 (1972) . Den nybundna plasmiden betecknas hädanefter som "pSNS084".

I plasmiden pSN5084 bands DNA-fragmentet uppbärande genen som kodar ß -galaktosidase vid DNA-fragmentet uppbär- ande pboë-genen vid ett parti nedströms DNA-sekvensen för en promotor för phgå-genen så att /3-laktpsidase kunde bil- das i form av ett fusionsprotein.

Därefter transformerades E.coli CSH26-stammen med plasmid pSN5084 för bildning av transformationsprodukter.

Utväljandet av transformationsprodukterna från utgángsceller av E. coli CSH26-stam genomfördes på samma sätt som beskrivits ovan. De utvalda_1ransformationsprodukterna"inkuberades i ett låg-fosfatmedium,varigenom ß -galaktosidas bildades i form av ett fusionsprotein. Därefter bestämdes den specifika aktiviteten av fiš-galaktosidas för transformationsprodukter- na med förfarandet som beskrivits i Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, sid. 352-355 (1972). Antalet molekyler av' P-galaktosidas som bildats i form av fusionsproteinet per cell beräknades genom jämförel- se av den specífika aktiviteten av' F-galaktosidasen som bildats i form av fusionsproteinet med den specifika aktivi- 'teten av lä-galaktosidas av standardtyp uppvisande en mole- kylvikt av 145.000. Det visade sig därvid att antalet moleky- ler av' Q-galaktosidas som bildats i form av fusionsprote- inet per cell var 1 x 105. - ....f..r..-_f.-.~=c-_.. _.

Claims (7)

10 15 20 25 30 35 5% 459 816 Patentkrav

1. l. Expressionsvektor, k ä n n e t e c k n a d av ett DNA-fragment innefattande en gëgë-gen och en replikon utvald bland plaemider och bakteriofager, vilket DNA-fragment är bun- det vid replikonen.

2. Förfarande för framställning av en expressionsvektor, k ä n n e t e c k n a t av: (1) framställning av kromoeomalt DNA innehållande en Engš-gen fran bakterier tillhörande Enterebacteriaceae: <2) spjälkning av detta kromosomala DNA med ett restrik- tionsenzym för tillhandahållande av DNA-fragment; (3) bindning av dessa DNA-fragment vid en replikon utvald bland plasmider och bakteriofager; (4) transformation av celler av en bakterie tillhörande Enterobacteriaceae med replikonen uppvisande DNA-fragmentet bundet därvid för bildning av transformationsprodukter inne- fattande sådana som innehåller en rekombinantvektor innefat- tande DNA-fragmentet uppbärande en phoS-gen; (5) utvâljande av transformatíonsprodukter innehållande rebombinantvektorn innefattande DNA-fragmentet uppbärande en phoS-gen bland transformationsprodukterna; och (6) isolering av rekombinantvektorn innefattande DNA- -fragmentet uppbärande phoS-genen från de utvalda transforma- tioneprodukterna.

3. Förfarande enligt krav 2, k Ä n n e t e c k n a t av partiell utstrykning i den isolerade rekombinantvektorn innefattande NBA-fragmentet uppbärande en phoS-gen under bibe- hållande av phcS-genen och utsättande av erhallen partiellt utstruken rekømbinantvektor för bindning pà nytt medelst en ligas för framställning av en rekonatruerad expreeeionsvektor.

4. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att DNA-fragmentet uppbärande en 2§2§-gen skärs ut från den isolerade rekombinantvektorn och att det utskurna DNA- -fragmentet bindes vid en annan typ av repligon än den typ av replikon som den isolerade rekombinantvektern utgör.

5. Förfarande för framställning av en polypeptid genom genexpression med användning av en expressionsvektor defi- nierad i krav 1, k ä n n e t e c k n a t av 10 15 20 35 459 816 (1) bindning av ett DNA-fragment upbärande en gen som kodar en polypeptid vid expreseionsvektorn vid ett parti därav nedströms en DNA-sekvens för en promotor för Bggåfgenen; (2) transformation av celler av en bakterie tillhörande Enterobacteriaceae med expreasionsvektorn uppvisande genen som kodar en polypeptid bunden därvid för bildning av transforma- tionsprodukter; (3) utväljande av traneformationsprodukter från utgångs- celler av en bakterie tillhörande Enterobacteriaceae; (4) inkubering av transformationsprodukterna varigenom transformationsprodukterna bringas att uttrycka genen som ko- dar polypeptiden och att bilda polypeptiden; och (5) isolering av polypeptiden från de inkuberade trans- formationsprodukterna.

6. Förfarande enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att i steg (1) nämnda parti är anordnat mellan den proximala delen och den distala delen av DNA-fragmentet som uppbär en gggå-gen.

7. Förfarande enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att i steg (1) är nämnda parti anordnat nedströms DNA-fragmentet som uppbär en phoS-gen.