NL8301986A - Expressievector welke een gen draagt dat codeert voor een fosfaatbindend eiwit; werkwijze voor het bereiden daarvan; werkwijze voor het produceren van een polypeptide onder toepassing van genoemde expressievector. - Google Patents

Description

> 4 # * i VO 4869

Titel: Expressievector welke een gen draagt dat codeert voor een fosfaat-bindend eiwit; werkwijze voor het bereiden daarvan; werkwijze voor het produceren van een polypeptide onder toepassing van genoemde expressievector.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een expressievector/ de bereiding daarvan en het gebruik daarvan. Meer in het bijzonder heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een expressievector met een . sterke gen-expressie, welke vector een gen draagt dat codeert voor een 5 fosfaatbindend eiwit, alsmede op een werkwijze voor het bereiden daarvan en een werkwijze voor het produceren van een gewenst polypeptide door middel van gen-expressie, waarbij genoemde expressievector wordt gebruikt.

De hier gebruikte term "gen-expressie" heeft betrekking op de translatie in polypeptide van een gen dat-codeert voor de polypeptide-10 volgorde. In de gen-expressie ondergaat een DNA-keten die voor de polypeptidevoIgorde codeert, eerst transcriptie in een complementair SNA, dat een boodschapper SNA wordt genoemd, waarna het aldus overgeschreven boodschapper SNA translatie in het bovengenoemde polypeptide ondergaat.

15 In 1970 werd de transformatietechniek van Escherichia coli gereali seerd (M. Mandei en A. Higa, Journal of Molecular Biology, 53, 159-162 1970)) en werd een restrictie-enzym gevonden (H.O. Smith en K.W. Wilcox, Journal of Molecular Biology, 51_, 379-391 (1970)). Deze vondsten brachten een snelle voortgang in de gen-manipulatietechniek en celtechnologie.

20 Zo is bijvoorbeeld de fundamentele techniek van genetische recombinatie, die in het Amerikaanse octrooischrift 4.237.224 is beschreven, op dergelijke vindingen gebaseerd. Verder zijn nieuwe vectoren bereid en zijn methoden voorgesteld om nuttige stoffen door gen-manipulatietechnieken te bereiden. De bovenstaand vermelde nieuwe vectoren worden bijvoorbeeld 25 beschreven in de Duitse octrooiaanvrage 2712615, het Franse-octrooi 2.441.659, het Amerikaanse octrooi 4.273.875, de PCT aanvrage publikatie nr. WO 79/01169, het Britse octrooi 2.052.516 en het Europese octrooi 32238. De bovengenoemde werkwijzen voor het bereiden van nuttige stoffen wordaibijvoorbeeld beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.375.514.

30 Al de bovenstaand vermelde publikaties openbaren echter slechts dat gewenste nuttige stoffen door middel van gen-expressie kunnen worden 8301986 I t - 2 -

J

geproduceerd. Een nadeel van de technieken volgens de bovenstaand vermelde publikaties van de stand der techniek is dat de opbrengst van gewenste nuttige stoffen niet voldoende hoog is. Daarom bestaat een ernstige behoefte aan de ontwikkeling van een expressievector die in 5 staat is tot de produktie van nuttige stoffen in hoge opbrengst.

Derhalve is het vanuit het standpunt van industriële toepassing van gen-manipulatietechnieken en verlaging van kosten voor de bereiding van nuttige stoffen gewenst dat een ,expressievector werd ontwikkeld die in vermogen tot gen-expressie excelleert. De fundamentele technieken van 10 genetische recombinatie worden beschreven in Proceedings of the National Academy of Science, U.S.A., 70, 3240-3244 (1973) en ibid., 71, 1743-1747 (1974), maar er is geen algemene werkwijze voorge,steld voor het isoleren van een gen, dat in vermogen tot gen-expressie excelleert uit een groot aantal in de natuur aanwezige genen,, waardoorohefc moeilijk is om het bovenstaand 15 vermelde probleem op te lossen.

De onderhavige uitvinders hebben uitgebreide en intensieve onderzoeken verricht om het bovenstaand vermelde probleem op te lossen. Als resultaat is gevonden dat een gen dat codeert voor een fosfaatbindend eiwit, een expressievector kan geven met een buitengewoon sterke gen-20 expressie vergeleken met die van de conventioneel bekende vectoren. De onderhavige uitvinders slaagden vervolgens in de bereiding met hoog rendement van een dergelijke expressievector, welke een gen draagt dat voor een fosfaatbindend eiwit -codeert, door de techniek van kloneren.

De onderhavige uitvinding is gebaseerd op een dergelijke nieuwe vinding 25 en realiseert het gestelde doel.

Het doel van de onderhavige uitvinding is om een expressievector / te verschaffen die in vermogen tot gen-expressie excelleert-

Een ander doel van de onderhavige uitvinding is om een werkwijze te verschaffen voor het bereiden van een expressievector die in vermogen 30 tot gen-expressie excelleert.

Een ander doel van de onderhavige uitvinding is om een werkwijze te verschaffen voor het produceren van polypeptide in hoge opbrengst door middel van gen-expressie waarbij een expressievector wordt gebruikt van de bovenstaand vermelde soort.

35 -De bovenstaande en andere doeleinden, kenmerken en voordelen van 8301986 t 4 - 3 - de onderhavige uitvinding zullen duidelijk worden uit de volgende gedetailleerde beschrijving, tezamen met de bijgaande tekening genomen, waarin fig. 1 de restrict!ekaarten van plasmiden pSN401, pSN5Q7, pSN508 5 en pSN518 toont en fig. 2 het stroomschema van de werkwijze voor het bereiden van het plasmide pSN2507 toont, tezamen met de restrictiekaarten van de plasmiden pKN402A, pSHlOl en pSN2507.

In de figuren 1 en 2 duidt het symbool phoS op een gen dat codeert 10 voor een fosfaatbindend eiwit van Enterobacteriaceae (waarover later een gedetailleerde uitleg zal worden gegeven). De symbolen phoT, pstA en phoü duiden elk op genen die als een cluster bij elkaar liggen op chromosomaal DNA van E. coli tezamen met phoS (waarover later een gedetailleerde uitleg zal worden gegeven).

15 De volgende symbolen worden gebruikt om herkenningsvolgordeivoor restrictie-enzymen aan te duiden:

EcoRI, Hpal, PstI, BglII, Mlul HindiII, Aval, Hindi en Smal (de in de figuren 1 -en 2 getoonde, met de bovenstaand vermelde 20 symbolen verbonden aanhangende cijfers worden gebruikt om respec tieve herkenningsplaatsen voor een restrictie-enzymi te identificeren) .

Andere afkortingen zijn respectievelijk: £

Tn3(Ap ) (aangegeven door ): transposon dat het voor 25 ampicilline resistentie coderende gen draagt

Rep: replicatie gen ori: replicatie-oorsprong

Kb : 1000 nucleotide paren I |: vernietigd deel.

30 In een aspect van de onderhavige uitvinding wordt een expressie- vector verschaft die een DNA-fragment, waarin zich een voor een fosfaatbindend eiwit coderend gen bevindt, en een uit plasmiden en bacteriofa-gen geselecteerd replicon omvat, welk DNA-fragment met het replicon is geligeerd.

8301986 - 4 - 1 ♦

De hier gebruikte term "replicon" duidt op een vector, die repli-ceerbaar is en een gen heeft voor een fenotypisch kenmerk en een restric-tieplaats heeft die geschikt is om daaraan een donor DNA-fragment te ligeren.

5 Een replicon is een drager van genetische informatie die bekend staat als een replicatie-eenheid van een zodanige keten nucleotiden, dat, warmer de replicatie eenmaal begint, de replicatie achtereenvolgens tot het einde van de nucleotidevolgorde wordt uitgevoerd. Als een dergelijk replicon kunnen plasmiden, bacteriofagen, virussen en dergelijke worden 10 genoemd. De replicons omvatten DNA-replicons en RNA-replicons, maar in de onderhavige uitvinding hebben om praktische redenen de RNA-replicons niet de voorkeur. Als DNA-replicons kunnen plasmiden en repliceerbare DNA-fragmenten die afgeleid zijn van DNA-virussen, prckaryotische cellen * en eukaryotische cellen worden genoemd. Daarvan hebben als replicon dat 15 in de onderhavige uitvinding wordt gebruikt, plasmiden en bacteriofagen de voorkeur. Conventioneel worden DNA-replicons die een antibioticum resistentie tegen gen dragen, op brede schaal gebruikt-'-voor het kloneren van verscheidene genen. De op brede schaal toegepaste methode voor het kloneren van een gen omvat het ontsluiten van chromosomaal DNA met een 20 restrictie-enzynu teneinde een DNA-fragment te verkrijgen dat het gewenste gen draagt, het ligeren van dit DNA-fragment aan het DNA-replicon, het transformeren van een eencellig organisme met het DNA-replicon met inbegrip van het DNA-fragment, teneinde transformanten te vormen, het isoleren van de transformanten van het eencellige ouderorganisme met 25 behulp van de antibioticum resistentie die door het DNA replicon wordt verleend, en het incuberen van de geïsoleerde transformanten, waardoor het DNA replicon met inbegrip van het DNA fragment wordt gekloneerd.

Het voor een fosfaatbindend eiwit coderende gen is verantwoordelijk voor het fosfaattransportsysteem en het fosfaatmetabolismesysteem en 30 komt evolutionair gezien wijd verspreid in prokaryotische cellen en eencellige eukaryotische cellen voor. Daarvan is het voor een fosfaatbindend eiwit van Escherichia coli coderende gen betrekkelijk goed in detail onderzocht en in het bijzonder wordt het gen van Escherichia coli aangeduid als het phoS gen. Het phoS gen komt niet alleen voor in 35 Escherichia coli,maar ook in bacteriën die behoren tot de Enterobacte-riaceae. Derhalve kan het phoS gen van alle tot de Enterobacteriaceae 8301986

Cf .

- 5 - behorende bacteriën in de onderhavige uitvinding worden toegepast. Het phoS van Escherichia coli vormt samen met phoT, pstA en phoCJ een cluster op 83 minuten op de standaard genetische kaart van E. coli (Backman, B.J. en K.B. Low, Microbiol. Rev. 44, 1-56 (1980)). De phoT, pstA en phoU 5 zijn genen waarvan de functie verband houdt met het fosfaattransport en het fosfaatmetabolisme. Zoals bovenstaand vermeld vormen de phoS, phoT, pstA en phoü genen een cluster op een chromosoom van E♦ coli en dus bevinden de phoT, pstA en phoü genen zich, wanneer een DNA fragment dat het phoS gen draagt uit chromasomaal DNA van E. -coli wordt bereid 10 door middel van een restrictie-enzym, eveneens in het DNA fragment.

Het voor een fosfaatbindend eiwit van λ glmS faag coderendegen is eveneens onderzocht, en kan in de onderhavige uitvinding worden toegepast.

Verder kunnen genen, waarvan de functie verband houdt met het fosfaattransportsysteem en het fosfaatmetabolismesysteem van gist en een 15 andere bacterie dan een tot Enterobacteriaceae behorende bacterie worden gebruikt. In dit geval is nodig dat een replicon en een gastheer worden gekozen die geschikt zijn voor genen waarvan de functie verband houdt met het fosfaattransportsysteem en het fosfaatmetabolismesysteem van gist en andere bacteriën dan een tot Enterobacteriac eae behorende bac-20 terie.

In een ander aspect van de onderhavige uitvinding wordt een werkwijze verschaft voor het bereiden van een expressievector, omvattende 1) het bereiden van een chromosomaal DNA dat een voor een fosfaat bindend eiwit coderend gen bevat, uit bacteriën behorend tot 25 de Enterobacteriaceae; 2) het splitsen van het chromosomale DNA met een restrictie-enzym teneinde een DNA fragment te verkrijgen; 3) het ligeren van de DNA fragmenten aan een uit plasmiden en bacteriofagen geselecteerde replicon; 30 4) het transformeren van cellen van een tot Enterobacteriaceae behorende bacterie met genoemd replicon waaraan het DNA fragment is geligeerd, teneinde transformanten te vormen, met inbegrip van transformanten die een recombinantvector bevatten waarin zich de DNA fragmenten bevinden die een voor een fosfaatbindend 35 eiwit coderend gen dragen; 8301986 i v - 6 - 5) het selecteren van transformanten die de recombinantvector bevatten, waarin zich de DNA fragmenten bevinden die een voor fosfaatbindend eiwit coderend gen dragen, uit genoemde transformanten; en 5 6) het isoleren van de recombinantvector waarin zich de DNA frag menten bevinden die het voor een fosfaatbindend eiwit coderende gen dragen, uit de geselecteerde transformanten.

In trap 1 van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding, wordt chromasomaal DNA dat een voor een fosfaatbindend eiwit (verder een-10 voudig aangeduid als "phoS gen" coderend gen bevat, bereid uit bacteriën die behoren tot de Enterobacteriaseae, door een gebruikelijke isola-tietechniek zoals lysis, centrifugeren en dergelijke.

In trap 2 wordt het zoals in trap 1 bereide chromasomale DNA gesplitst met een restrictie-enzym teneinde DNA fragmenten te verkrijgen 15 die een DNA fragment bevatten dat het phoS gen draagt.

In trap 3 van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding, zoals bovenstaand vermeld, kan een plasmide of een bacteriofaag als het replicon worden gebruikt. De ligatie van de DNA fragmenten aan het replicon kan worden uitgevoerd door een ligase te gebruiken volgens de 20 gebruikelijke methode (zie bijvoorbeeld het Amerikaanse octrooischrift 4.237.224). Tenminste een van de DNA fragmenten die een phoS gen en een replicon dragen, heeft een gen voor een fenotypisch kenmerk.

In de bovengenoemde trap 4 worden cellen van een tot Enterobacte- ψ " 1 r'1 riag'eae behorende bacterie getransformeerd met het replicon dat het 25 DNA fragment draagt, bereid in de bovenstaand vermelde trap 3. Als de tot de Enterobacteriaceae behorende bacterie kunnen worden genoemd Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia en Shigella. Verder kunnen behalve de bovenstaand vermelde bacteriën mutantcellen van een van de bovenstaand vermelde bacteriën 30 worden gebruikt. Het is natuurlijk wel nodig dat een geschikte bacterie wordt gekozen, met het oog op het vermogen tot repliceren van het replicon in de cellen van de bacterie. Bijvoorbeeld kunnen geschikt Escherichia coli, Serratia species of Salmonella species als gastheer worden gebruikt, wanneer welbekende .plasmiden van verzwakt type zoals 35 pBR322, pBR325, pACYAl77 of pKN410 als replicon worden gebruikt.

8301986 * * - 7 -

In de bovenstaande trap 5 worden de transformanten eerst geïsoleerd van de oudercellen van de bacterie die tot de Enterobacteriaceae behoort, door middel van een fenotypisch kenmerk zoals geneesmiddelresistentie, verleend door het replicon met een gen voor een fenotypisch kenmerk.

5 Daarna worden transformanten, die de recombinantvector bevatten met inbegrip van het DNA fragment dat het phoS gen draagt, uit de bovenstaand geïsoleerde transformanten geselecteerd waarbij als criterium de hoeveelheid fosfaatbindend eiwit in de transformanten wordt gebruikt. De hoeveelheid fosfaatbindend eiwit in elk van de transformanten wordt 10 als volgt bepaald. Eerst wordt het fosfaatbindend eiwit van de transformant geïsoleerd en met een gebruikelijke techniek gezuiverd, bijvoorbeeld door lysis, centrifugeren, of uitzouten. Daarna wordt de hoeveelheid zuiver fosfaatbindend eiwit bepaald door een gebruikelijke techniek zoals SDA-agarose gel electroforese. De hoeveelheid fosfaatbindend eiwit 15 in elk van de transformanten wordt vergeleken met de hoeveelheid van het fosfaatbindend eiwit die door een oudercel van een tot de Enterobac-teriageae behorende bacterie die niet met het replicon dat het DNA fragment draagt is getransformeerd, wordt geproduceerd. De transformanten met grotere hoeveelheid fosfaatbindend eiwit dan de oudercel van de 20 tot de Enterobacteriac.eae behorende bacterie worden geselecteerd.

In het geval dat een mutantcel, die niet alleen onder fosfaatarme omstandigheden maar ook onder fosfaatrijke omstandigheden basisch fosfa-tase produceert, als de cel van een tot de Enterobacteriaceae behorende bacterie in de bovengenoemde trap 4 wordt gebruikt, kan de selectie van 25 transformanten die het replicon bevatten waarin zich het DNA fragment

bevindt dat het phoS gen draagt, in de bovengenoemde trap 5 zeer gemakkelijk worden uitgevoerd zonder dat de hoeveelheid fosfaatbindend eiwit in elk van de transformanten wordt vastgesteld. De reden hiervoor is als volgt. Wanneer een dergelijke mutantcel wordt getransformeerd met 30 het als in de bovenstaand vermelde trap 3 bereide replicon dat het DNA

fragment draagt, produceert de mutantcel basisch fosfafcase.-.onder fosfaatarme omstandigheden, maar onder fosfaatrijke omstandigheden wordt geen basische fosfatase geproduceerd als gevolg van de functie van het phoS gen in het met het replicon geligeerde DNA fragment. Wanneer de trans-35 formatie wordt uitgevoerd onder fosfaatrijke omstandigheden worden 8301986 - a - daarom basische fosfatase negatieve transformanten geselecteerd.

In de bovenvermelde trap 6 wordt de recombinantvector met het DNA fragment dat het phoS gen draagt geïsoleerd van de in trap 5 geselecteerde transformanten door een gebruikelijke techniek zoals lysis, 5 centrifugeren en dergelijke.

Aan de andere kant moet worden opgemerkt dat een expressievector die een gen draagt waarvan de functie verband houdt met het fosfaat-transportsysteem en het fosfaatmetabolismesysteem, van gist of een andere bacterie dan een t.ot de Enterobacteriaceae behorende bacterie, 10 volgens nagenoeg dezelfde methode als bovenstaand beschreven kan worden bereid. Verder moet worden opgemerkt dat in plaats van het volgens de trappen 1 en 2 van de bovenstaand vermelde werkwijze bereide DNA fragment, een DNA fragment kan worden gebruikt dat bereid is uit fagen, zoals de XglmS faag.

15 De volgens de bovenstaand vermelde werkwijze bereide recombinant vector kan gedeeltelijk vernietigd zijn, in het DNA fragmentdeel en/of het replicondeel, door een restrictie-enzym te gebruiken terwijl het phoS gen wordt behouden, en de resulterende vernietigde recombinantvector te onderwerpen aan hernieuwde ligatiemet behulp van een ligase, 20 waardoor een opnieuw geconstrueerde recombinantvector met een kleinere grootte wordt bereid. De opnieuw geconstrueerde recombinantvector is gemakkelijker te manipuleren omdat het aantal restrictieplaatsen van de opnieuw geconstrueerde recombinantvector is verminderd in vergelijking tot het aantal restrictieplaatsen van de oorspronkelijke recombinant-25 vector. Verder wordt, wanneer een voor een bepaald polypeptide coderend gen geligeerd is aan de opnieuw geconstrueerde recombinantvector, de verhouding van de lengte van het voor het polypeptide coderende gen tot de totale lengte van de recombinantvector groter dan in het geval dat het voor het polypeptide coderende gen geligeerd wordt aan de niet op-30 nieuw geconstrueerde oorspronkelijke recombinantvector. Het is denkbaar dat naarmate de verhouding van de lengte van het voor een polypeptide coderende gen tot de totale lengte van de recombinantvector groter is, de per cel geproduceerde hoeveelheid eiwit groter is en de per cel geproduceerde hoeveelheid bijprodukten kleiner is. Wanneer de bovenstaand 35 vermelde opnieuw geconstrueerde recombinantvector wordt gebruikt voor 8301986 ? « - 9 - het produceren van een bepaald gewenst polypeptide, kan derhalve niet alleen een hogere produktiviteit van het polypeptide worden bereikt, maar kan ook de zuivering van het verkregen polypeptide gemakkelijker worden uitgevoerd.

5 Een DNA fragment dat het phoS gen draagt, kan uit de recombinant- vector, zoals bereid volgens de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding, worden gesneden en worden geligeerd aan het replicon van een andere soort dan het replicon van de oorspronkelijke recombinantvector, teneinde een ander type opnieuw geconstrueerde recombinantvector te 10 bereiden. Een dergelijk ander type opnieuw geconstrueerde recombinantvector kan met voordeel worden gebruikt wanneer een gemakkelijke selectie van de transformanten wordt beoogd door een fenotypisch kenmerk van het replicon te veranderen en/of een toename van het kopie-aantal van een recombinantvector wordt beoogd. Het gebruik van een dergelijk 15 ander type opnieuw gereconstrueerde recombinantvector is gewenst wanneer de transformanten die verkregen worden met behulp van de oorspronkelijke recombinantvector, zodanig zijn dat daaruit de gewenste transformanten moeilijk kunnen worden geselecteerd en/of het vermogen tot repliceren van de oorspronkelijke recombinantvector in de transformanten laag is.

20 De reconstructie van de recombinantvector zoals bovenstaand ver meld wordt uitgevoerd door een gebruikelijke techniek (zie bijvoorbeeld de Amerikaanse octrooischriften 4.340.674, 4.349.629 en 4.356.270).

De volgens de methode volgens de onderhavige uitvinding bereide expressievector kan worden geïdentificeerd door als volgt de restrictie-25 kaart te construeren. De expressievector wordt partieel of volledig ontsloten met verscheidene restrictie-enzymen teneinde DNA fragmenten te verkrijgen. De verkregen fragmenten worden onderworpen aan agarose-gel elektroforese, teneinde de grootte en het restrictiepatroon van de expressievector te bepalen. De positie van het phoS gen op de boven-30 staand vermeide expressievector wordt bepaald door constructie van verscheidene deletie-expressievectoren volgens de onderhavige uitvinding met behulp van partiële of volledige ontsluiting met een geschikt restrictie-enzym en daaropvolgende zelfligatie, een onderzoek van de deletie-expressievectoren door complementeringstests waarbij de phoS 35 gen-negatieve mutant als gastheer wordt gebruikt.

8301986 - 10 -

De expressievector die het phoS gen volgens de onderhavige uitvinding draagt, heeft de volgende voordelen wanneer het voor een gewenst polypeptide coderende gen wordt geligeerd aan genoemde expressievector in zijn stroomafwaarts van de DNA volgorde van een promotor van het 5 phoS gen gelegen gedeelte en de produktie van het gewenste polypeptide door gen-technieken wordt..uitgevoerd: 1) , / De opbrengst van het bovenstaand vermelde gewenste polypeptide be- 5 6 draagt wel 1 x 10 - 10 moleculen/cel, d.w.z. verscheidene malen tot 100 keer zoveel als verkregen wordt met de gebruikelijk toegepaste 10 vector.

2) De gen-expressie van de expressievector volgens de onderhavige.uitvinding kan vrijelijk worden geregeld door de fosfaatconcentratie in het kweekmedium in te stellen. Derhalve kan ook de produktie van het gewenste polypeptide worden geregeld door de fosfaatconcentratie in 15 het kweekmedium in te stellen.

3) Het gewenste polypeptide kan samen met fosfaatbindend eiwitgedeelte in het periplasma van de gastheer worden afgescheiden. Derhalve kan het bovenstaand vermelde gewenste polypeptide gemakkelijk uit de gastheer worden geïsoleerd.

20 Daarom kan de expressievector volgens de onderhavige uitvinding op brede schaal in technische toepassingen worden gebruikt. Een voorbeeld van de werkwijze voor het produceren van een gewenste polypeptide onder toepassing van de expressievector volgens de onderhavige uitvinding zal thans worden gegeven. Het voor het gewenste polypeptide coderende 25 gen wordt bereid uit de genen van eukaryotische cellen, prokaryotische cellen of virussen, en het aldus bereide gen wordt aan de expressievector volgens de onderhavige uitvinding geligeerd. Daarna wordt de gastheer net de bovenstaand verkregen expressievector getransformeerd om transformanten te vormen. Vervolgens worden de aldus verkregen transformanten 30 op grote schaal geïncubeerd, waarbij het gewenste polypeptide in buitengewoon hoge opbrengst wordt geproduceerd.

Derhalve wordt in een verder aspect van de onderhavige uitvinding een werkwijze verschaft voor het produceren van een polypeptide met behulp van gen-expressie waarbij de expressievector volgens de onderhavige 35 uitvinding wordt gebruikt, omvattende 8301986 - 11 - 1) Het'ligeren van een DNA fragment dat een voor een polypeptide coderend gen draagt, aan de expressievector in zijn stroomafwaarts van de DNA volgorde van een promotor van het voor een fosfaatbindend eiwit coderende gen gelegen gedeelte; 5 2) Het transformeren van cellen van een bacterie die tot de Enterobacte- riaceae behoort, met de expressievector waaraan het voor een polypeptide coderende gen is geligeerd, teneinde transformanten te vormen; 3} Het selecteren van de transformanten van oudercellen van een tot de Enterobacteriaceae behorende bacterie; 10 4) Het incuberen van de transformanten, waarbij men de transformanten het voor het polypeptide coderende gen tot expressie laat brengen en het polypeptide laat produceren; en 5) Het isoleren van het polypeptide uit de geïncubeerde transformanten.

In de praktijk van bovenstaand vermelde methode wordt eerst een 15 DNA fragment dat een voor een polypeptide coderend gen draagt, bereid door organische synthese of geïsoleerd uit organismen met behulp van een gebruikelijke techniek zoals lysis, centrifugeren, ontsluiting met een restrictie-enzym en dergelijke. Het is ook mogelijk om een DNA fragment dat een voor een gewenst polypeptide coderend gen draagt, te bereiden 20 uit een RNA fragment, bereid van boodschapper RNA en RNA virussen door een RNA fragment dat een gewenst gen draagt, om te zetten in een complementair DNA fragment onder toepassing van het welbekende reverse transcriptase. Het DNA fragment dat een voor een polypeptide coderend gen draagt, wordt geligeerd aan een expressievector die het phoS gen volgens 25 de onderhavige uitvinding draagt in een stroomafwaarts van de DNA volgorde van een promotor vein het phoS gen gelegen gedeelte. Van het DNA fragment dat een voor een polypeptide coderend gen draagt, het DNA fragment dat het phoS gen van de expressievector draagt en het replicon van de expressievector heeft er tenminste één een gen voor fenotypisch kenmerk zoals 30 geneesmiddelresistentie, enzymatische werkzaamheid en dergelijke. Het gedeelte waarin het DNA fragment dat een voor een polypeptide coderend gen draagt, geligeerd wordt aan de expressievector, kan gelegen zijn tussen het proximale deel en het distale deel van het DNA fragment dat het phoS gen draagt, zodat een fusie-eiwit kan worden geproduceerd.

35 Genoemd gedeelte kan ook stroomafwaarts van het DNA fragment dat het 8301986 - 12 - phoS gen draagt zijn gelegen, zodat een hybride-eiwit kan worden geproduceerd. Het bovenstaand vermelde ligatieproces wordt uitgevoerd onder toepassing van een ligase volgens een gebruikelijke techniek (zie bijvoorbeeld Amerikaans octrooischrift 4.237.224).

5 In de bovenstaande trap 2, worden cellen van een tot de Entero- bacteriaceae behorende bacterie getransformeerd met de expressievector waaraan het voor een polypeptide coderende gen is geligeerd, volgens een gebruikelijke methode (zie bijvoorbeeld Amerikaans octrooischrift 4.237.224). Als een tot de Enterobacteriaceae behorende bacterie, kunnen 10 worden genoemd Erwinia, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia en Shigella.

In de bovenstaande trap 3, wordt de transformant geselecteerd uit oudercellen van de tot de Enterobacteriaceae behorende bacterie door middel van een fenotypisch kenmerk, bijvoorbeeld geneesmiddelresistentie, 15 die door de expressievector wordt verleend.

In de bovengenoemde trap 4, worden de transformanten geincubeerd onder geschikte voedingsomstandigheden voor de transformanten, waardoor de transformanten tot expressie van het gen tot produktie van het gewenste polypeptide daarin worden gebracht.

20 In de bovengenoemde trap 5, worden de isolatie van het gewenste polypeptide uit de transformanten en de zuivering van het polypeptide uitgevoerd volgens gebruikelijke technieken zoals lysis, uitzouten, kolomchromatografie en dergelijke.

In het geval dat het voor een gewenst, polypeptide coderende gen 25 geligeerd is aan de expressievector in het gedeelte, dat stroomafwaarts is gelegen van de DNA volgorde die codeert voor het signaalpeptide van een phoS gen in bovengenoemde trap 1, wordt het in de trans formanten in de bovengenoemde trap 4 geproduceerde gewenste polypeptide in het periplasma van de transformanten afgescheiden. De reden hiervoor is 30 als volgt. Het bovenstaand vermelde signaalpeptide is in het phoS gen gecodeerd aan de kant van de N-terminale aminozuurvolgorde van een fosfaatbindend eiwit en wordt samen met een fosfaatbindend eiwit tot expressie gebracht. Het signaalpeptide is nodig voor interactie met en secretie door het inwendige membraan van een cel. Met andere woorden 35 speelt het signaalpeptide een rol in de secretie van een fosfaatbindend 8301986 - 13 - eiwit door het inwendige membraan in het periplasma vein een cel.

Wanneer de transformant die de expressievector bevat waaraan het voor een gewenst polypeptide coderende gen is geligeerd, in het gedeelte dat stroomafwaarts is gelegen van de DNA volgorde die door het signaal-5 peptide van het phoS gen codeert, wordt geincubeerd, wordt het in de transformant geproduceerde gewenste polypeptide in het periplasma van de transformant afgescheiden door de functie van het signaalpeptide.

Het in het periplasma afgescheiden polypeptide kan zonder lysis van de transformant worden geïsoleerd en dus is de isolatie van het in het 10 periplasma afgescheiden geproduceerde polypeptide zeer gemakkelijk in vergelijking tot de isolatie van het niet in het periplasma afgescheiden polypeptide.

De in de-bovengenoemde trap 1 verkregen expressievector waaraan een voor een polypeptide coderend gen is geligeerd, kan op vrijwel 15 dezelfde wijze worden gereconstrueerd als bovenstaand.is beschreven in verband met de reconstructie van de expressievector volgens de onderhavige uitvinding. Bijvoorbeeld kan de expressievector waaraan een voor een polypeptide coderend gen is geligeerd in een zodanig gedeelte dat een hybride-eiwit wordt verkregen, worden veranderd in een expressie-20 vector, waaraan een voor een polypeptide coderend gen is geligeerd in een zodanig gedeelte, dat een fusie-eiwit wordt verkregen.

Opgemerkt wordt dat het phoS gen geligeerd kan worden aam virale genen die coderen - voor een gewenst polypeptide, zodat het gewenste polypeptide waarvoor het virale gen codeert, op efficiënte wijze kan 25 worden geproduceerd.

Zoals beschreven kan de expressievector worden gebruikt voor het produceren van fysiologisch aktieve stoffen, enzymen, antigenen, toxinen, aminozuren, secundaire metabolieten en dergelijke. Als fysiologisch aktieve peptiden kunnen hormonen zoals somatostatine, insuline, 30 ACTH, groeihormoon en dergelijke, calmoduline, celgroeifactoren, inter-feronen en dergelijke worden genoemd. Als enzymen kunnen urokinase, mutanase, amylase, glucoseisomerase, hyaluronidase, reverse transcriptase., enzymen die betrokken zijn bij de fixatie van stikstof en dergelijke, worden genoemd. Als antigenen kunnen influenzavirus HA antigeen 35 hepatitis 3 oppervlakantigeen en dergelijke worden genoemd. Als toxinen 8301986 - 14 - kunnen Bordetella pertussis toxine, slangenvergif en dergelijke worden genoemd. Als aminozuren kunnen L-glutaminezuur, L-lysine, L-methionine en dergelijke worden genoemd. Als secundaire metabolieten kunnen antibiotica, nicotoxinen en dergelijke worden genoemd. Als andere eiwitten 5 dan de bovenstaand vermelde stoffen kunnen opioide peptiden, ovalbumine en dergelijke worden genoemd. Derhalve is de onderhavige uitvinding zeer goed bruikbaar voor het produceren van voedingsstoffen, geneesmiddelen, veevoeders, gefermenteerde produkten, energiebronnen en dergelijke.

De onderhavige uitvinding zal in groter detail worden geïllustreerd 10 door de volgende voorbeelden, die slechts ter toelichting en niet ter beperking van de uitvinding dienen.

De kweekmedia, bufferoplossingen, methoden voor het extraheren van DNA en methoden voor het zuiveren van DNA die in de voorbeelden worden toegepast, zullen onderstaand kort worden samengevat.

15 A: Samenstelling van T Medium

Bacto-trypton 10 g

NaCL 5 g

De bovenstaand vermelde ingrediënten werden opgelost in 1000 ml water.

B: Snelle alkali-extractie van plasmide DNA 20 0,1 ml van een lysozyme oplossing (2 mg/ml lysozyme, 50 mM glucose, 100 mM CDTA (cyclohexaandiaminetetraacetaat), 25 mM Tris-HCl (pH 8,0)) werd toegevoegd aan een bacteriecelkorrel, verkregen uit een cultuur van 1,5 ml door centrifugeren, welke cultuur gedurende een nacht was ge-incubeerd. De resulterende suspensie werd bij 0°C gedurende 30 minuten 25 geïncubeerd. Daarna werd 200 ƒ11 van een basische SDS oplossing (0,2 NaOH, 1 w/w% SDS (natriumdodecylsulfaat)) aan de suspensie toegevoegd en werd geroerd. Na 5 minuten incuberen bij 0°Cm werd 150 jlI. 3M natriumacetaat (pH 4,8) aan de suspensie toegevoegd, en werd rustig gemengd. De resulterende suspensie werd gedurende 60 minuten op 0°C gehouden, en daarna 30 gedurende 5 minuten met 5000 omwentelingen per minuut gecentrifugeerd om neerslagen te verwijderen. Uit het bovenste deel van de bovenstaande vloeistof werd 0,4 ml vloeistof met een pipet weggenomen. De weggenomen hoeveelheid werd gemengd met 1 ml koude absolute ethanol om het DNA neer te slaan. Het verkregen mengsel werd gedurende 2 minuten gecentrifugeerd 8301986 - 15 - en daarna werd de resulterende bovenstaande vloeistof weggeworpen en aan de resulterende korrel werd 100 ƒ11 van een natriumacetaatoplossing (0,1 M natriumacetaat, 0,05 M Tris-HCl (pH 8,0)).toegevoegd. De verkregen oplossing werd met een tweevoudige volumehoeveelheid koude. .

5 absolute ethanol gemengd om hernieuwdeprecipitatie van het DNA te bewerken. Het neergeslagen DNA werd in een geschikte buffer opgelost. De bijzonderheden van de bovenstaande procedures worden beschreven Nucleic Acid Research, Vt>l. 7 No. 6,blz. 1513-1523 (1979). Het volgens bovenstaand vermelde procedure bereide ruwe plasmide DNA kan worden gebruikt 10 voor fysische kaartanalyses en voor transformatie.

C. verwijdering vam ethidiumbromide uit DNA.

De na CsCl dichtheidsgradiënt centrifugeren verkregen DNA fractie werd gemengd met een gelijke volumehoeveelheid van een isopropanol-oplossing, verzadigd met waterig 5tH NaCl-10 mM tris-HCl-1 mM'Na^EDTA 15 (pH 8,3). De bovenstaande procedure werd herhaald totdat de DNA bevattende waterfase ontkleurd was. Aan de resulterende waterfase werden 2 volumehoeveelheden water en vervolgens 6 volumehoeveelheden absolute ethanol toegevoegd. Het mengsel liet men gedurende één uur tot verscheidene dagen bij -20°C staan om DNA te precipiteren. Het neergeslagen DNA 20 werd door centrifugeren verzameld en gedroogd waarbij een DNA monster werd verkregen. Het DNA monster werd opgelost in 100 ƒ11 van een Tris-EDTA oplossing (10 mM tris-HCl, 1 mM Na^EDTA (pH 7,5)) en toegepast.

De bijzonderheden van de bovenstaande procedures worden beschreven in Advances Bacterial Genetics,blz.126, Cold Spring Harbor Laboratory 25 (1980).

D: Samenstelling van de EcoRI restrictie-enzym buffer (vijfvoudig geconcentreerd) .

NaCl 500 mM

Tris-HCl 250 mM (pH 7,4)

30 MgSO 50 mM

E: Samenstelling van de ligase buffer Tris-HCl 66 mM (pH 7,6)

MgCl2 6,6 mM

Dithiothreitol 10 mM

35 ATP 0,5 mM

8301986 - 16 - F: CsCl blok dichtheidsgradient centrifugering 1 ml van een 5,0 M CsCl oplossing (5,0 M CsCl, 10 mM MgSO^, 10 mM Tris-HcL (pH 8,0), 0,1 mM NajEDTA (opwaartse dichtheid = 1,60)) werd in de bodem van een cellulosenitraat-centrifugebuis geplaatst met 5 een diameter van 1,3 cm en een lengte van 5 cm, (vervaardigd door en in de handel gebracht door Beekman Instruments Inc., U.S.A.). Boven op de oplossing in de buis werd 3 ml 3,0 M CsCl oplossing (3,0 M CsCl, 10 mM MgSO^, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM Na^EDTA (opwaartse dicht-. .! . heid = 1,40)) gelegd. Daarna werd verder 1 ml van een faagsuspensie 10 opde laag van CsCl oplossing gelegd, en werd met 30.000 omwentelingen per minuut gecentrifugeerd gedurende 1 uur bij 20°C. in een SW 50,1 rotor (vervaardigd en in het verkeer gebracht door Beekman Instruments Inc., U.S.A.). Daarna werd vanuit de zijkant van de buis minder dan 0,.5 ml faagfractie verwijderd met behulp van êenll ml spuit en een 15 1,6 cm naald kaliber 25. De bijzonderheden van de bovenstaande procedures worden beschreven in Advanced Bacterial Genetics, biz. 80-81,„Cold: Spring Harbor Laboratory (1980).

G: CsCl evenwicht dichtheidsgradient centrifugering

De boven onder F verkregen faagfractie werd gemengd met een 20 4,0 M CsCl oplossing (4,0 M CsCl, 10 mM MgSO^, 10 mM tris-HCl (pF 8,0), 0,1 mM EDTA), en gedurende 20 uur met 30.000 omwentelingen per minuut gecentrifugeerd in een SW 50,1 rotor. Niet meer dan 0,5 ml faagfractie werd vanaf de zijkant van de buis verwijderd met een 1 ml spuit en een 1,6 cm naald, kaliber 25. De bijzonderheden van bovenstaande procedures 25 worden beschreven in Advanced Bacterial Genetics, biz. 81, Cold Spring Harbor Laboratory (1980).

2 H: Samenstelling van het LB medium Bacto-pepton 10 g gistextract 5 g 30 NaCl 5 g

De bovengenoemde ingrediënten werden in 1000 ml water opgelost, en de pH werd door, toevoeging van NaOH ingesteld op 7,2.

8301986 - 17 -

X

I: Samenstelling van T Agar medium Bacto-:tripton 10 g NaCl 5 g

Agar 15 g 5 De bovenstaande ingrediënten werden in water opgelost, en verder werd water in zodanige mate toegevoegd dat het totale volume van de oplossing 1000 ml werd.

* (Opmerking).

Nadat het medium voor sterilisatie in een autoclaaf was behandeld, 10 werden daaraan 1/1000 volume van een 10 mg/ml waterige tetracycline oplossing of een 40 mg/ml waterige ampicilline oplossing toegevoegd.

De antibiotica bevattende media werden gebruikt voor het selecteren van antibioticum resistente transformanten en om het behoud van de antibioticum resistente recombinantvector in de bacteriecellen te 15 verzekeren.

VOORBEELD I

Trap 1: Bereiding yam, plasmide pBR322 DNA en spliting van het plasmide

pBR322 DNA door het restrictie-enzym EccRI

1 liter T medium werd geënt met 10 ml van een entmateriaal van 20 Escherichia coll K-12 stam C600 (B.J. Bachmann, Bacterial. Rev., 36, 525-557 (1972)) bevatte plasmide pBR322), en bij 37°C gekweekt onder

schudden totdat de troebeling van de kweekvloeistof 0,6A bij 600 nM

bereikte. Aan de kweekvloeistof werd chlooramfenicol toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 250 jiq/ml. De kweekvloeistof werd 25 daarna gedurende 15 uur bij 37°C geincubeerd, en gecentrifugeerd om cellen te verzamelen. De aldus verzamelde cellen werden eenmaal gewassen met 100 ml Tris-EDTA oplossing (die 100 mM Tris-HCl buffer(pH 7,5) en 1 mM EDTA bevatte), en aan een snelle alkaliëxtractie onderworpen om een ruw plasmide DNA te verkrijgen. Aan het aldus verkregen ruwe plasmide 30 DNA werd de bovenstaand vermelde Tris-EDTA oplossing toegevoegd in een zodanige hoeveelheid dat het totale volume 15 ml werd. Men voegde 16 g kristallijn CsCl toe en 2 ml 5 mg/ml ethidiumbromide aan de oplossing 25 toe, en het soortelijk gewicht d van het mengsel werd op 1,39 ingesteld door water of kristallijn CsCl eraan toe te voegen. Het resulte- 8301986 - 18 - rende mengsel werd daarna gecentrifugeerd gedurende 40 uur bij 20°C met 33.000 omwentelingen per minuut. De positie van de band van plasmide DNA werd bepaald met behulp van ultraviolet licht met een lange golflengte, en het plasmide DNA werd door fractioneren verzameld. Uit de 5 plasmide DNA fractie, werd het ethidiumbromide verwijderd door de onder C beschreven methode. Aan 0,2 ml van de aldus verkregen pBR322 DNA oplossing (100 ^ig/ml), werd 0,05 ml restrictie-enzym buffer voor EcoRI toegevoegd en aan het verkregen materiaal werd het restrictie-enzym EcoRI in een zodanige hoeveelheid toegevoegd dat de activiteit van het 10 restrictie-enzym EcoRI een eenheid per jig van het plasmide DNA werd.

De enzymreactie werd uitgevoerd gedurende 60 minuten bij 37°C. Daarna werd het mengsel gedurende 5 minuten op 65°C verwarmd om het restrictie-enzym te inactiveren. Het mengsel werd daarna gedialyseerd tegen Tris-EDTA oplossing (die 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) en 1 mM EDTA bevatte).

15 Na voltooiing vande dialyse, werden vier eenheden basische fosfatase van Escherichia coli (bereid en in de handel gebracht door Sigma Chemical Co., U.S.A.) aan het mengsel toegevoegd gevolgd door 30 minuten incuberen bij 65°C. Een gelijke hoeveelheid van een fenoloplossing (bereid door verzadiging van de bovenstaand vermelde Tris-EDTA oplossing 20 met fenol) werd aan het mengsel toegevoegd, gevolgd door schudden. Het verkregen materiaal werd daarna onderworpen aan centrifugeren met lage snelheid, en gescheiden in een waterfase en een fenolfase. De waterfase werd verzameld. De bovenstaand vermelde centrifugerings- en verzamelings-stappen werden tweemaal herhaald. Daarna werd een gelijk volume van 25 oplossing I (een mengsel van chloroform en isoamylalcohol met een volumeverhouding van 24:1) aan de verzamelde waterfase toegevoegd. Het resulterende materiaal werd goed gemengd, en de waterfase werd verzameld. Een dergelijke bewerking werd viermaal herhaald, en de verzamelde waterfase werd gedialy.seerd tegen ligasebuffer voor de daaropvolgende ligatie-30 reactie, waardoor een oplossing van gesplitst DNA voor pBR322 werd verkregen.

Trap 2: Bereiding van DNA fragmenten die een DNA fragment bevatten dat het phoS gen van de Escherichia coli K-12 stam dragen.

1 liter T medium werd geënt met 10 ml van een entmateriaal van 35 Escherichia coli K-12 stam KLF48/KL159 (CGSC nr. 4302).

3 3 0 1 9 8 6 - 19 - (E. coli Genetic Stock Center (CGSC), Yale University, Connecticut, U.S.A.) en onder schudden bij 37°C gekweekt- De kweekvloeistof in logarithmische gloeifase (troebeling 0,6 A bij 600 nm) werd gecentrifugeerd om cellen te verzamelen. De aldus verzamelde cellen werden gesuspen-5 deerd in 10 ml lysozyme oplossing (die 2 mg/ml lysozyme, 100 mM EDTA en 0,15 M NaCl bevatte) en de suspensie liet men gedurende 15 minuten bij 37°c staan. De suspensie werd daarna snel ingevroren op een vast kooldioxide:acetonbad bij -20°C. Aan de aldus ingevroren suspensie werd 50 ml van een Tris-SDS buffer (die 0,1 M Tris-HCl (pH 9,0), 1 w/v % SDS 10 (natriumdodecylsulfaat) en 0,1 M NaCl bevatte) toegevoegd, en het verkregen materiaal werd bij 60°C gesmolten. De bovengenoemde trappen van invriezen op een vast kooldioxide:acetonbad en smelten bij 60°C werden vijf keer herhaald, waardoor een vollledige lysis van de cellen werd bereikt. Aan de resulterende Oplossing met., daarin de cellen die lysis 15 hadden ondergaan, werd een gelijke hoeveelheid van een fenoloplossing (bereid door verzadiging van de bovenstaand vermelde Tris-SDS buffer met opnieuw gedestilleerd fenol) toegevoegd, gevolgd door roeren. Het verkregen materiaal werd daarna onderworpen aan centrifugeren met lage snelheid, waardoor het gescheiden werd in een waterfase en een fenolfase.

20 De waterfase werd verzameld. De aldus verzamelde waterfase werd gemengd met twee keer het volume absolute ethanol. Het resulterende mengsel werd daarna gedurende 20 minuten bij 12.000 omwentelingen per minuut gecentrifugeerd, en korrels werden verzameld. De aldus verzamelde korrels werden opgelost in 20 ml van een mengsel van NaCl en citroenzuur (dat 25 0,15 M NaCl en 0,015 M natriumcitraat bevatte, pH 7,0), waardoor een op lossing werd verkregen die DNA bevatte. Aan 10 ml van de aldus verkregen DNA-bevattende oplossing, werd een gelijke hoeveelheid van oplossing I (zoals vermeld in trap 1) toegevoegd, gevolgd door roeren. Uit het resu-terende materiaal werd de waterfase verzameld. Verder werd de aldus ver-30 zamelde waterfase gemengd met twee keer het volume ethanol, en het neergeslagen DNA werd opgelost in 5 ml van een Tris-EDTA oplossing (10 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 1 mM Na2EDTA bevatte). De precipitatie met absolute ethanol zoals bovenstaand vermeld werd herhaald, en men bereidde 5 ml DNA oplossing. Aan 0,2 ml van de aldus verkregen DNA oplossing (200 ^ig/ml) 35 werd 0,05 ml restrictie-enzym buffer toegevoegd, en aan het resulterende materiaal werd het restrictie-enzym EcoRI toegevoegd in een zodanige 8301986 - 20 - hoeveelheid dat de activiteit van het restrictie-enzym EcoRI één eenheid per ^ig.'DNA werd. Daarna werd het mengsel gedurende 60 minuten bij 37°C gelncubeerd, gevolgd door 5 minuten warmtebehandeling bij 65°C om het restrictie-enzym te inactiveren. Het mengsel werd daarna gedialyseerd 5 tegen de ligasebuffer, waardoor een oplossing van E. coli DNA werd verkregen.

Trap 3: Ligatie van pBR322 DNA en E. coli DNA fragmenten die een phoS

gen bevatten.

De pBR322 DNA oplossing zoals bereid in trap 1, werd verdund tot 10 30 ^ig/ml in DNA concentratie met een ligatiebuffer. De E. coli DNA

oplossing als bereid in trap 2 werd verdund tot 100 ^ig/ml in DNA concentratie mét dezelfde ligatiebuffer als bovenstaand vermeld. 50 ƒ11 van de pBR322 DNA oplossing en 100 ƒ11 van de E. coli DNA oplossing werden gemengd. Men voegde T4 ligase aan het resulterende mengsel toe in een hoeveel-15 heid van één eenheid T4 ligase per jxq te ligeren DNA. De enzymreactiè voor het ligeren van de DNA moleculen werd gedurende 8 uur bij 8°C uitgevoerd. Na voltooiing van de ligatie, werd de resulterende oplossing gedialyseerd tegen Tris-EDTA oplossing (die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 1 mM edta bevatte).

20 Trap 4: Selectie van plasmiden die het phoS gen bevatten A: E. coli C75 stam.

De E. coli C75 stam (Garen, A., en N. Otsuji, J. Mol. Biol., 8, 841-852 (19*64)) werd in LB medium gekweekt terwijl geschud werd totdat de troebeling van de kweekvloeistof 0,6 A bij 600 nM werd. Daarna werd 25 2,5 ml van de kweekvloeistof onderworpen aan centrifugeren met lage snelheid om cellen te verzamelen. De verzamelde cellen werden in 2,5 ml 0,1 M waterige MgCl^ oplossing gesuspendeerd. De celsuspensie werd daarna onderworpen aan centrifugeren met lage snelheid om cellen te verzamelen. De cellen werden gesuspendeerd in 1,2 ml 0,1 M waterige CaC^ 30 oplossing en de verkregen celsuspensie liet men gedurende 30 minuten bij 0°C staan, gevolgd door centrifugeren met lage snelheid om cellen te verzamelen. De verzamelde cellen werden opnieuw gesuspendeerd in 0,1 ml 0,1 M waterige CaCl^ oplossing. Aan de resulterende celsuspensie werd 10 ƒ11 van de ligeerde DNA oplossing zoals bereid in trap 3 toegevoegd.

35 Men liet het resulterende mengsel gedurende 30 minuten op ijswater 8301986 - 21 - staan en verwarmde vervolgens in een 40°C waterbad gedurende 5 minuten. Men voegde 1,0 ml LB medium voorverwarmd op 37°C, toe aan het verwarmde mengsel, gevolgd door 90 minuten incuberen bij 37°C. Daarna werden 0,1 ml van de verkregen kweekvloeistof en 0,1 ml van de kweekvloeistof , 5 10 keer verdund met LB medium, uitgespreid op T agarplaten die tetracy cline of ampicilline bevatten en daarna bij 37°C of bij 30°C gedurende een nacht geïncubeerd om kolonies te vormen van transformanten die tegen tetracycline of ampicilline resistent waren. De gevórmde transformant- . kolonies werden besproeid met een basisch fosfatase detecterende kleur-10 stofoplossing (die 2 mg/ml cc-naftalylfosfaat en 20 mg/ml Fast Blue B zout (getetrazotiseerd o-dianisidine). bevatte) opgelost, in 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0). De witte transfórmantkolonies die door de besproeiing met de kleurstofoplossing niet bruin waren geworden, werden geselecteerde, als cellen die de plasmiden dragen waarin het E. coli phoS gen aan 15 pBR322 DNA was geligeerd.

B: E. coli C2 stam

Nagenoeg dezelfde procedures als zo juist vermeld werden herhaald om witte transformantkolonies te selecteren die plasmiden bevatten waarin een E. coli phoS gen geligeerd was aan pBR322 DNA, behalve dat 20 de transformatie van de E. coli C2 stam (Morris, H., M.J. Schlesinger, M. Bracha en E. Yagil, J. Bacteriol-, 119, 583-592 (1974)) als indicator voor de selectie van plasmiden werd gebruikt.

Trap 5: Constructie van restrictiekaarten van plasmiden (pSN401 en pSN402) die een phoS gen dragen.

25 De transformanten zoals geselecteerd in de bovenstaande trap 4, werden in LB medium gekweekt. Daarna werden plasmiden DNA moleculen uit de verkregen gekweekte cellen geextraheerd en als volgt gezuiverd. Plas-mide.. DNA moleculen werden uit de bovenstaand verkregen gekweekte cellen geëxtraheerd volgens de snelle alkaliëxtractiemethode. Daarna werden de 30 ruwe plasmide DNA oplossingen gezuiverd door evenwichtdichtsheidsgradiënt centrifugeren op dezelfde wijze als in trap 1. Ethidiumbromide werd uit de aldus gezuiverde plasmide DNA oplossingen verwijderd en DNA werd neergeslagen (zie trap 1). De aldus verkregen plasmide DNA moleculen werden ontsloten men verscheidene restrictie-enzymen en daarna werden de leng-35 ten van DNA fragmenten door electroforese op agarosegel gesteld. De 8301936 - 22 - restrictiekaarten van de plasmiden werden geconstrueerd. Als resultaat werd gevonden dat twee soorten plasmiden die het phoS gen droegen, waren bereid.

Een van de plasmiden wordt hierna aangeduid als "pSN401" en het 5 andere als "pSN402":. De restrictiekaart van het plasmide pSN401 wordt in fig. 1 getoond. In het plasmide pSN402, was het EcoRI^- EcoRI^ fragment van pSN402 in de omgekeerde oriëntatie ten opzichte van het plasmide pSN401.ingevoegd.

VOORBEELD II

10 Trap 1: Bereiding van bacteriofaag XglmS DNA fragmenten, die het phoS gen bevatten.

15Q ML T medium werd geënt met 1,5 ml van een entmateriaal van Escherichia coli KÏ7388 stam (T. Miki, Annu. Rep. Inst. Virus Res., 21, 1-26 (1978)) dat een lysogeen is van de bacteriofaag XglmS, en ge-15 kweekt bij 37°C onder schudden. In de middelste logarithmische groeifase werd mitocyne C aan de kweekvloeistof toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,5 jiq/ml. De kweek werd nog eens ongeveer 2 uur tot lysis voortgezet. De cultuurvloeistof werd op ijs gekoeld, en druppelsgewijze werd chloroform daaraan toegevoegd (verscheidene druppels). Daarna werd 20 lucht met een pipet in de kweekvloeistof gebracht om de kweekvloeistof te doen borrelen,waardoor de cellen in de kweekvloeistof een volledige lysis ondergingen. Het resulterende faaglysaat werd daarna onderworpen aan centrifugeren met lage snelheid. De bovenstaande vloeistof werd verzameld terwijl het neergeslagen materiaal dat uit celresten bestond, 25 werd weggeworpen. De verkregen bovenstaande vloeistof werd onderworpen aan centrifugeren met hoge snelheid gedurende 90 minuten bij een toerental van 25.000 omwentelingen per minuut om XglmS faagdeeltjes te verzamelen die aan de bodem van de centrifugatiebuis waren neergeslagen. De verzamelde faagdeeltjes werden gesuspendeerd in 4,0 ml X-verdunnings-30 middel (dat 10 mM Tris-HCl (pH 7,5),10 mM MgSO^ en 0,1 mM Na2EDTA bevatte .). De resulterende suspensie van faagdeeltjes werd onderworpen aan CsCl blokdichtheidsgradiënt centrifugering, gevolgd door CsCl even-wichtdichtsheidsgradiënt centrifugering teneinde een fractie te verkrijgen die alleen XglmS' faagdeeltjes bevatten. XglmS DNA werd uit de bovenstaand 35 verkregen XglmS faagdeeltjes geëxtraheerd met behulp van formamide op 3301986 - 23 - de onderstaand beschreven wijze. In het bijzonder werden aan 0,5 ml van de fractie van AglmS faagdeeltjes 0,05 ml van een Tris-EDTA oplossing (die 2M Tris-HCl (pH 8,5) en 0,2 M Na2EDTA bevatte) en vervolgens 0,5 ml formamide toegevoegd. Het resulterende mengsel liet men gedurende onge-5 veer drie uur bij kamertemperatuur staan. Daarna werden achtereenvolgens 0,5 ml gedestilleerd water en 3 ml absolute ethanol aan het mengsel toegevoegd en werd gemengd om AglmS faag DNA te precipiteren. Het neergeslagen AglmS faag DNA werd verzameld door centrifugeren, gewassen met 70 v/v % ethanol en vacuumgedroogd waardoor een gedroogd AglmS DNA werd 10 verkregen. Het gedroogde AglmS DNA werd opgelost in 5 ml van een Tris-EDTA oplossing (die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 1 mM Na2EDTA bevatte) en daarna gesplitst door een restrictie-enzym EcoRI en op dezelfde wijze als in trap 2 van Voorbeeld I gedialyseerd. Aldus werd een oplossing bereid die DNA fragmenten bevatte welke het phoS gen droegen.

15 Trap 2: Ligatie van pBR322 DNA en AglmS faag DNA fragmenten die phoS gen bevatten.

Nagenoeg dezelfde procedures als in trap 3 van Voorbeeld I werden herhaald voor het bereiden van een oplossing van geligeerd DNA, behalve dat de faag DNA oplossing, zoals bereid in bovenstaande trap 1, 20 werd gebruikt in plaats van de E. Coli DNA oplossing.

Trap 3: Selectie van plasmiden die het phoS gen dragen.

A: E. coli C75 stam.

Vrijwel dezelfde procedures als in trap 4-A van Voorbeeld I werden herhaald voor het selecteren van witte transformantkolonies die de phoS 25 gen-houdende plasmiden droegen, bereid uit AglmS faag, behalve dat de oplossing van geligeerd DNA zoals bereid in bovenstaande trap 2 werd gebruikt in plaats van de geligeerde oplossing zoals bereid in trap 3 van Voorbeeld I.

3: E. coli C2 stam

30 Vrijwel dezelfde procedures zoals in trap 4-3 van Voorbeeld I

werden herhaald door het selecteren van witte transformantkolonies die plasmiden bevatten, waarin het van AglmS faag bereide phoS gen aan pBR322 DNA was geligeerd, behalve dat de oplossing van geligeerd DNA zoals bereid in bovenstaande trap 2 werd gebruikt, in plaats van de 8301986 - 24 - geligeerde oplossing zoals bereid in trap 3 van Voorbeeld I.

Trap 4: Constructie van restrictiekaarten van plasmiden (pSN401 en pSN402) die het phoS gen dragen.

Nagenoeg dezelfde procedures als in trap 5 van Voorbeeld I werden 5 herhaald door het construeren van restrictiekaarten van plasmiden, behalve dat de plasmiden zoals in de bovenstaande trap 3-A en trap 3-B werden gebruikt in plaats van de plasmiden zoals verkregen in de trappen 4-A en 4-B van Voorbeeld I. Als resultaat werd gevonden dat de in bovenstaande trappen verkregen plasmiden pSN401 en pSN402 waren.

10 VOORBEELD III

Trap 1: Constructie van plasmide pSN507 dat het phoS gen van pSN401 draagt.

Het pSN401 DNA zoals verkregen in trap 5 van Voorbeeld I, werd partieel ontsloten met restrict!e-enzyme. .HindlII en vervolgens opnieuw 15 geligeerd door T4 ligase te gebruiken op nagenoeg dezelfde wijze als beschreven in trap 3 van Voorbeeld I. Gebruikmakend van de aldus verkregen oplossing van het opnieuw geligeerd plasmide, werden E. coli C75 stam en C90 stam (Garen, A., en N. Otsuji, J. Mol. Bial., 8_, 841-852 (1964)) * als ontvangers getransformeerd op nagenoeg dezelfde wijze als in trap 4 20 van Voorbeeld I is beschreven voor het verkrijgen van stammen die de phoS+ droegen. Daarna werden plasmiden DNA moleculen uit de kweekvloei-stoffen van de verscheidene onafhankelijke transformanten geëxtraheerd en op nagenoeg dezelfde wijze gezuiverd als beschreven in trap 5 van Voorbeeld I en werd een restrictiekaart van de plasmiden geconstrueerd. 25 Het gezuiverde opnieuw geligeerde plasmide wordt hierna aangeduid als "pSN507", waarvan de fysische kaart in fig. 1 in ..getoond.

Trap 2: Constructie van plasmide pSN508, dat het phoS gen van pSN507 draagt.

Het in de bovenstaande trap 1 verkregen pSN507 DNA werd ontsloten 30 met het restrictie-enzym Mlul en daarna werden de hernieuwe ligatie van het plasmide en de transformatie van elk van E. coli C75 stam en E. coli C 90 stam met het opnieuw geligeerde plasmide uitgevoerd op nagenoeg dezelfde wijze als beschreven in trap 3 van Voorbeeld II, teneinde stammen te verkrijgen die het resulterende gereconstrueerde plasmide 8301986 - 25 - bevatten (verder aangeduid als "pSN508"). Daarna werd pSN508 DNA uit de gekweekte cellen van de aldus verkregen stammen geëxtraheerd en op nagenoeg dezelfde wijze als beschreven in trap 5 van Voorbeeld I gezuiverd. Een restrictiekaart van het plasmide pSN5Q8 werd geconstrueerd.

5 Het resultaat is getoond in fig. 1.

Trap 3: Constructie van plasmide pSN518 dat het phoS gen van pSN508 .draagt.

Het in de bovenstaande trap 2 verkregen pSN508 DNA werd ontsloten met het restrictie-enzym PstI en daarna werden de hernieuwde ligatie 10 Vein het plasmide en de transformatie van elk van E. coli C75 stam en E. coli C90 stam met het opnieuw geligeerde plasmide uitgevoerd op nagenoeg dezelfde wijze als beschreven in bovenstaande trap 2 teneinde stammen te verkrijgen met het gereconstrueerde plasmide (hierna aangeduid als "pSN518"). Daarna werd pSN518 DNA geëxtraheerd uit de kweek-15 cellen van de aldus verkregen stammen en op nagenoeg dezelfde wijze als beschreven in trap 5 van voorbeeld I gezuiverd. Een restrictiekaart van het plasmide pSN518 werd geconstrueerd. Het resultaat wordt getoond in fig. 1.

VOORBEELD IV

20 Constructie van de plasmiden pSN4Q7 en pSN408 die het phoS gen van pSN402 dragen.

Het in trap 5 van voorbeeld I verkregen pSN402 DNA werd op nagenoeg dezelfde wijze als beschreven in trap 1 van voorbeeld III gereconstrueerd. Het resulterende plasmide wordt hierna aangeduid als "pSN4Q7".

25 Daarna werd een restrictiekaart van het plasmide pSN407 geconstrueerd.

De restrictiekaart van pSN407 was nagenoeg gelijk aan die van pSN507, behalve dat de oriëntatie van het EcoRI^-EcoRI^ fragment van pSN407 tegengesteld was aan de oriëntatie van dat van pSN507.

Het bovenstaand verkregen pSN407 werd op dezelfde wijze gereconstru-30 eerd als in trap 2 van voorbeeld III. Het resulterende plasmide wordt hierna aangeduid als "pSN408". De restrictiekaart van pSN408 werd geconstrueerd. De restrictiekaart van pSN408 was nagenoeg gelijk aan die van pSN508, behalve dat de oriëntatie van het EcoRI^-EcoRI^ fragment van pSN408 tegengesteld was aan de oriëntatie van dat van pSN508.

8301986 - 26 -

VOORBEELD V

Constructie van plasmiden pSN!5Q7 en pSN!5Q8, die het phoS gen van pSN507 dragen.

Op nagenoeg dezelfde wijze als beschreven in voorbeeld I, werden 5 zowel plasmide pBR325 (Bolivar, F. et al., Gene, _4, 121 (1978)) als plasmide pSN507 gesplitst met het restrictie-enzym EcoRI-.· Daarna werd het gesplitste pBR325 aan het gesplitste pSN507 geligeerd :op vrijwel dezelfde wijze als beschreven in trap 3 van voorbeeld I. Vervolgens werd op nagenoeg dezelfde wijze als beschreven in trap 4 van voorbeeld I 10 een selectie van het verkregen .geligeerde DNA uitgevoerd onder toepassing van E« coli ANCC75 -stam (een Pl transductie produkt: E. coli C75 stam X E. coli CSH57 stam (Miller, J.H., Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., biz. 13-23 (1972)) als ontvanger.

15 Nagenoeg dezelfde procedures als in trap 5 van voorbeeld I werden herhaald voor het extraheren en zuiveren van de bovenstaand verkregen plasmiden. De restrictiekaarten van de plasmiden werden geconstrueerd. Als resultaat werd gevonden dat twee soorten plasmiden die het phoS gen bevatten, waren verkregen. Een van de plasmiden wordt hierna aange-20 duid als "pSNl507" en het andere als "pSNlSOS”. Tevens werd gevonden dat het EcoRI ^-EcoRI^ fragment van pSN507 in de EcoRI plaats van pBR325 was ingevoegd onder vorming van pSNl507.

VOORBEELD VI

Constructie van plasmide pSN2507 dat het phoS gen draagt en constructie 25 van een restrictiekaart van het plasmide pSN2507.

Plasmide pKN402A (B.E. Uhlin et al., 6_, 91-106 (1979)) DNA waarvan de restrictiekaart in fig. 2 wordt getoond, werd partieel ontsloten met het restrict! e-enzym Hindi en opnieuw geligeerd met T4 ligase. Stammen met opnieuw geligeerde plasmiden (verder aangeduid als "pSHlOl") werden 30 op nagenoeg dezelfde wijze verkregen als beschreven in trap 4 van voorbeeld 1 en trap 5 van voorbeeld 1 en er. werd een restrictiekaart van het pSHlOl geconstrueerd. De restrictiekaart wordt getoond in fig·.· 2. pSHlOl en pSN5Q7 werden elk ontsloten met EcoRI. De verkregen fragmenten van pSHlOl en pSN507 werden geligeerd onder toepassing van T4 ligase.

35 Het verkregen geligeerde plasmide werd onderworpen aan selectie om witte 8301986 -27- transformantkolonies te verkrijgen met plasmiden die het phoS gen droegen en gevormd door ligatie van het fragment van pSN507 aan pSHlOl. De verkregen transformantkolonies werden gekweekt en plasmide DNA moleculen werden geëxtraheerd uit de gekweekte transformanten en op nagenoeg de-5 zelfde wijze als beschreven in trap 5 van voorbeeld 1.gezuiverd. Een restrictiekaart van het plasmide pSN2507, een van de aldus verkregen plasmiden, werd geconstrueerd op nagenoeg dezelfde wijze als beschreven in trap 5 van voorbeeld Iv De plaats van het phoS gen in pSN2507 werd vastgesteld. De restrictiekaart van pSN2507 wordt in fig. 2 getoond.

10 Gevonden werd dat een plasmide waarin de oriëntatie van het EcoRI^-EcoRI2 fragment, dat het phoS gen droeg in de omgekeerde oriëntatie ten opzichte van pSN2507 was ingevoegd, ook in de bovengenoemde ligatie van het pSN507 fragment aan pSHlOl was bereid.

Experiment 1.

15 De sterkte van de gen-expressie van de expressievector volgens de onderhavige uitvinding werd bepaald door het aantal moleculen per gastheercel gevormde fosfaatbindende eiwit te berekenen. Het mechanisme van de produktie van een fosfaatbindend eiwit door middel van de expressie van het phoS gen zal onderstaand kort worden uitgelegd. De voorloper 20 vein het fosfaatbindende eiwit wordt eerst geproduceerd door de expressie van het phoS gen. De voorloper heeft een signaalpeptide aan het N-éinde van het rijpe fosfaatbindende eiwit. Het signaalpeptide is nodig voor interaktie met een secretie door het inwendige membraan. Daarom wordt de voorloper van het fosfaatbindende eiwit eerst door de functie van 25 het signaalpeptide naar het inwendige membraan getransporteerd. Vervolgens wordt het signaalpeptidedeel van het eiwit afgesplitst terwijl het door het inwendige membraan passeert en wordt het gesplitste rijpe fosfaatbindende eiwit in het periplasma van de cel afgescheiden.

De bepaling van het aantal moleculen per cel gevormd fosfaatbindend 30 eiwit werd als volgt uitgevoerd.

Ξ. coli ANCC 75 stam werd getransformeerd met het plasmide pSN507 en gedurende een nacht geincubeerd in Tris/glucosemedium, hetwelk een minimale zoutoplossing is gebufferd met Tris/HCl (pH 7,2), welke 0,2% (w/v) glucose bevat en aangevuld is met 0,64 mM KE^PO^ (verder aangeduid 35 als "hoge fosfaatmedium"). Na incubatie werden de gastheercellen geoogst 8301986 - 28 - en in twee soorten cultuurmedia gesuspendeerd, namelijk het bovenstaand vermelde hoge fosfaatmedium en hetzelfde Tris/glucosemedium als boven beschreven, behalve dat de concentratie van KH^PO^ 0,064 mM bedroeg (verder aangeduid als "laag fosfaatmedium"), gevolgd door incubatie bij 5 37°C met schudden gedurende 6 uur. De celdichtheid van elke kweekvloei- stof werd uit de absorbantie bij 600 nm geschat. Asl resultaat werd ge- 9 vonden dat het aantal cellen in elke kweekvloeistof 1,3 x 10 bedroeg. Daarna werden de cellen in elke kweekvloeistof door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 2000 X g verzameld.

10 De verzamelde cellen werden eenmaal met 1 ml bufferoplossing, die » 10 mM tris-HCl (pH 7,2) en 30 mM NaCl bevatte, gewassen en opnieuw gesuspendeerd in 0,1 ml 33 mM Tris-HCl (pH 7,5) in een centrifugatiebuis.

Men voegde 0,1 ml bufferoplossing, die 33 mM Tris-HCl (pH 7,5), 40% (w/v) sucrose en 0,1 mM EDTA bevatte, toe aan de bovenstaand vermelde cells suspensie, mengde snel en incubeerde gedurende 10 minuten bij 37°C. De cellen werden verzameld door centrifugeren gedurende 3 minuten bij 8000 X g en onmiddellijk opnieuw gesuspendeerd in 0,1 ml 0,5 mM waterige · MgC^ oplossing. De celsuspensie werd hevig geschud in een ijswaterbad gedurende 10 minuten, gevolgd door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 20 8000 X g. Aan de aldus verkregen bovenstaande vloeistof (verder aange duid als "periplasmische fractie") werd 20 jil toegevoegd van een monster bufferoplossing voor polyacrylamide electroforese (die 1 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 1 ml 10 w/v% natriumdodecylsulfaat (SDS), 0,1 ml β-mercaptoethanol, 1 ml glycerol, 2,5 ml 0,1 w/v% waterige oplossing van 25 broomfenol blauw en 4,4 ml water bevatte), gevolgd door een warmtebehandeling van 5 minuten bij 100°C. De in de bovenstaand vermelde centrifugering verkregen korrel (verder aangeduid als "intracellulaire fractie") werd tweemaal gewassen met 1 ml 0,5 mM waterige MgC^ oplossing en opnieuw gesuspendeerd in 20 ^il van de lysozyme oplossing (die 2 mg 30 lysozyme in 1 ml water, 50 mM glucose, 10 mM EDTA en 25 mM Tris-HCl bevatte' (pH 8,0)) gevolgd door incubatie gedurende 3Q minuten bij 37°C.

De aldus verkregen suspensie werd verdund met 180 ^il van een 0,5 M waterige MgC^ oplossing en het mengsel werd voldoende geroerd. Daarna werd aan het mengsel 120 jil van de bovenstaand vermelde monsterbuffer-35 oplossing voor polyacrylamide electroforese toegevoegd, gevolgd door 8301986 t. J* - 29 - een warmtebehandeling gedurende 5 minuten bij 100°C.

De als bovenstaand bereide fracties werden onderworpen aan SDS-polyacrylamide gel electroforese volgens de procedure, beschreven in Laemmli, U.K., Nature, 227, 680-685 (1970), waardoor de opbrengst van 5 het fosfaatbindende eiwit in de cellen werd bepaald. De resultaten worden in onderstaande tabel getoond.

TABEL

hoeveelheid (^ig/cel) laag fosfaat medium hoog fosfaat medium 10 Fosfaatbindend eiwit 8,0 X 10 ^ 1,0 X 10 11

Zoals uit bovenstaande tabel blijkt, wordt de produktie van het fosfaatbindende eiwit en de voorloper daarvan, met andere woorden de expressie van het gen dat codeert voor een fosfaatbindend eiwit van de expressievector volgens de onderhavige uitvinding geregeld door de con-15 centratie van fosfaat in het kweekmedium in te stellen.

Vervolgens werd het aantal moleculen van het fosfaatbindende eiwit per cel berekend met de volgende vergelijking:

Het aantal moleculen per cel =

A X C

20 B

waarin A de opbrengst van het fosfaatbindende eiwit (g/cel) is; B het molecuulgewicht van het fosfaatbindende eiwit is (35.000); en 23 C het getal van Avogadro is (6 x 10 ).

Het aantal moleculen van het fosfaatbindende eiwit bedroeg 1,3 x 10^ 25 per cel, indien gekweekt in laagfosfaat medium.

VOORBEELD VII

Produktie van. Srgalactosidase onder toepassing van het plasmide pSN5Q8 dat het phoS gen draagt.

Het plasmide pSN508 zoals bereid in trap 2 van voorbeeld III werd 30 gesplitst onder toepassing van EcoRI, teneinde een EcoRI-EcoRI DNA fragment te bereiden dat een phoS gen draagt. Aan het aldus bereide DNA fragment dat het phoS gen draagt, werd het DNA fragment geligeerd, 8301986 - 30 - dat bereid was door het plasmide pMC14Q3 te splitsen, dat een gen bevat dat codeert voor 3-galactosidase (voor plasmide pSNl403 wordt verwezen naar Journal of Bacteriology, 143, 971-980 (1980)) met behulp van EcoRI, waardoor een recombinantvector werd gevormd.

5 Vervolgens werd de recombinantvector (verder aangeduid als "pSN5Q81") geselecteerd en geïsoleerd op vrijwel dezelfde wijze als beschreven in trap 4 en trap 5 van voorbeeld I.

Daarna werd het plasmide pSN5081 partieel vernietigd door gebruik van Hpal. Daarna werden de beide uiteinden van het resulterende DNA 10 fragment van plasmide pSN5081 partieel ontsloten onder toepassing van Nuclease BAL31 (merknaam voor deoxyribonuclease, dat bereid en in de handel gebracht wordt door Bethesda Research Laboratories Inc., U.S.A.) en onderworpen aan splitsing met behulp van Smal . Het gesplitste DNA fragment van het plasmide werd onder toepassing van T4 ligase opnieuw 15 geligeerd.

Vervolgens werd de E. coli CSH26 stam (verwezen wordt naar J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, biz. 17 (1972)) die een Lac mutant.is, die niet in staat is om lactose in een kweekmedium te gebruiken, getransformeerd in een 20 tetrazoliumplaat met toegevoegde lactose als kweekmedium met de bovenstaand verkregen recombinantvector, die een gen draagt dat codeert voor 3-galactosidase teneinde transformanten te vormen. Het fenotype Lac van de E. coli CSH26 stam werd Lac+ door transformatie met de recombinantvector en de bovenstaand verkregen transformanten waren der-25 halve zodanig veranderd, dat ze in staat waren om lactose in de tetrazoliumplaat met toegevoegde lactose te gebruiken. Dienovereenkomstig werden de transformanten gemakkelijk geselecteerd van oudercellen van de E. coli CSH26 stam, waarbij als.criterium de grootte en kleur van de op de tetrazoliumplaat met toegevoegde lactose gevormde kolonies werd 30 gebruikt op nagenoeg dezelfde wijze als beschreven in Experiments in

Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, biz. 49 en biz.52-54 (1972). Het opnieuw geligeerde plasmide wordt hierna aangeduid als "PSN5084".

In het plasmide pSN5084, werd het DNA_fragment dat het voor 35 β-galactosidase coderende gen draagt, geligeerd aan het DNA fragment 8301986 - 31 - dat het phoS gen draagt in het gedeelte dat stroomafwaarts is gelegen van de DNA volgorde van een promotor van het phoS gen, zodat 0-galacto-sidase in de vorm van een fusieëiwit kon worden geproduceerd.

Daarna werd de E« coli CSC26 stam getransformeerd met het plasmide 5 pSN5084 om transformanten te vormen. De selectie van de transformanten van oudercellen van E. coli CSH26 stam werd op dezelfde wijze als bovensta eind is beschreven uitgevoerd. De geselecteerde transformanten werden geïncubeerd in laagfosfaat medium, waardoor 3-galactosidase in de vorm van een fusieëiwit werd geproduceerd. Daarna werd de specifieke werk-10 zaamheid van 3-galactosidase in de transformanten bepaald volgens de procedure die beschreven is in Experiments in Molecular Genetics,

Cold Spring Harbor laboratory, biz. 352-355 (1972). Het aantal moleculen 3-galactosidase dat in de vorm van het fusieëiwit per cel werd geproduceerd, werd berekend door de specifieke activiteit van het in de vorm 15 van het fusieëiwit geproduceerde 3-galactosidase te vergelijken met de specifieke activiteit van een standaard β-galactosidase met een mole-cuulgewicht van 145.000. Als resultaat werd gevonden dat het aantal moleculen in de vorm van het fusieëiwit per cel geproduceerde 3-galactosidase 1 x 1Q~* was.

8301986

Claims (9)

1. Expressievector, welke een DNA fragment waarin zich een voor een fosfaatbindend eiwit coderend gen bevindt enr een uit plasmiden en bacte-riofagen geselecteerd replicon omvat, welk DNA fragment aan het replicon is geligeerd.

2. Expressievector volgens conclusie 1, waarin het DNA fragment waarin zich een voor fosfaatbindend eiwit coderend gen bevindt, een DNA fragment is dat een phoS gen van Enterobacteriaceae bevat.

3. Werkwijze voor het bereiden van een expressievector, omvattende 1. een chromosomaal DNA dat een voor een fosfaatbindend eiwit coderend 10 gen bevat, uit bacteriën die behoren tot de Enterobacteriageae; 2. het splitsen van het chromosomale DNA met een restrictie-enzym teneinde DNA fragmenten te verkrijgen; 3. het ligeren van DNA fragmenten aan een uit plasmiden en bacteriofagen geselecteerd replicon; 15/ 4) het transformeren van cellen van een bacterie die behoort tot de Enterobacteriaceae met het replicon waaraan het DNA fragment geligeerd is, teneinde transformanten te vormen met inbegrip van transformanten die een recombinantvector bevatten waarin zich het DNA fragment bevindt dat een voor een fosfaatbindend eiwit coderend gen 20 draagt; 5. het selecteren van transformanten die de recombinantvector bevatten waarin zich het DNA fragment bevindt dat een voor een fosfaatbindend eiwit coderend gen draagt, uit genoemde transformanten; en 6. het isoleren van de recombinantvector waarin zich het DNA fragment 25 bevindt dat het voor een fosfaatbindend eiwit coderend gen draagt, van de geselecteerde transformanten.

4. Werkwijze volgens conclusie 3 waarin het voor een fosfaatbindend eiwit coderende gen een phoS gen van Enterobacteria, eae is-.·

5. Werkwijze volgens conclusie 3, verder omvattende het partieel 30 vernietigen van de geïsoleerde recombinantvector waarin zich het DNA fragment bevindt dat een voor een fosfaatbindend eiwit coderend gen draagt, terwijl het voor een fosfaatbindend eiwit coderende gen wordt 8301986 - 33 - behouden, en het onderwerpen van de resulterende partieel vernietigde recombinantvector aan hernieuwde ligatie met behulp van een ligase om een gereconstrueerde expressievector te bereiden.

6. Werkwijze volgens conclusie 3, verder omvattende het uitsnijden 5 van het DNA fragment dat een voor een fosfaatbindend eiwit.· coderend gen draagt, uit de geïsoleerde recombinantvector, en het ligeren van het uitgesneden DNA fragment aan een replicon van een andere soort dan het replicon van de geïsoleerde recombinantvector.

7. Werkwijze voor het produceren van een polypeptide door middel van 10 gen-expressie, waarbij een expressievector wordt gebruikt zoals ge definieerd in conclusie 1, omvattende 1. het ligeren van een DNA fragment dat een voor een polypeptide coderend gen draagt, aan de expressievector in het gedeelte stroomafwaarts van 'de DNA volgorde van een promotor van het voor een fosfaatbindend 15 eiwit coderende gen; 2. het transformeren van cellen van een bacterie die behoort tot de Enterobacteriac eae met genoemde expressievector waaraan het voor eeh polypeptide coderende gen is geligeerd, teneinde transformanten te vormen; 20 3) het selecteren van transformanten uit oudercellen van een bacterie die behoort tot de Enterobacteriac eae; 4. het incuberen van de transformanten, waarbij men de transformanten het voor het polypeptide coderende gen tot expressie laat brengen en het polypeptide laat produceren; en 25 5) Het isoleren van het polypeptide van de geïncubeerde transformanten.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, waarin in trap 1 het genoemde gedeelte gelegen is tussen het proximale deel en het distale deel van het DNA fragment dat een voor een fosfaatbindend eiwit coderende gen draagt.

9. Werkwijze volgens conclusie 7, waarin in trap 1 het genoemde ge deelte stroomafwaarts is gelegen van het DNA fragment dat een voor een fosfaatbindend eiwit coderende gen draagt. Ji» 8301986