CN101743312A - 克隆核酸序列的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了在较不适于常规的核酸操作的微生物(例如与大肠杆菌相比)中有效地克隆目的核酸序列的装置和方法。本发明能够使目的核酸在第一种微生物中高通量地进行克隆(和优选进行表达)，而目的核酸的初始(优选高通量)克隆是在第二种微生物中进行的。

Description

克隆核酸序列的装置和方法
本发明涉及分子生物学领域。
微生物是用于扩增和表达核酸的有吸引力的宿主。编码蛋白质的核酸的表达是产生足够量的目的蛋白质(例如如(治疗性)酶)的一种重要工具。已确立的表达宿主为大肠杆菌和酵母。但是，这一方式产生的蛋白质并非总具有天然的构型，或者它们根本无法产生。例如，蛋白质并非总能由产生它们的微生物正确地折叠，并有可能包含不想要的翻译后修饰。异源表达处于功能性感受态的大的多组件和膜蛋白质通常在已确立的表达宿主大肠杆菌和酵母中存在问题。因此急需替代的表达系统来克服结构基因组工程中的这一主要障碍。经常地，有效的DNA操作成为探索新型宿主的蛋白质表达可能性的瓶颈，因而阻碍了快速和例行的筛选。在大肠杆菌及替代的宿主中复制的穿梭载体提供了一条出路，但是由于需要双重复制因子(dual replicationfactor)和多个选择标记而使得它们的使用非常复杂。这增大了质粒的大小，且通常损害其稳定增殖。例如，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)被广泛认为可作为基于大肠杆菌和酵母的表达系统的吸引人的一种替代。但是，生物体中基因操作的低效率以及乳酸乳球菌-大肠杆菌穿梭载体的不稳定性严重阻碍了乳酸乳球菌中的表达筛选。此外，缺乏有效的克隆程序已经限制了在乳酸乳球菌中用于定向进化研究的大的基因文库的制备；类似的局限性还阻碍了完全地利用其它微生物作为表达和筛选宿主。
本发明的目的在于提供在微生物中克隆目的核酸的替代的装置和方法。优选地，本发明提供了在微生物中克隆目的核酸的装置和方法，与大肠杆菌相比，该微生物较不适于常规的核酸操作。
因此，本发明提供了在第一种微生物中克隆目的核酸序列的方法，该方法包括：
-将所述目的核酸插入核酸载体，该载体包含第二种微生物的复制起点；
-在所述第二种微生物的培养中克隆所述载体；
-分离包含所述目的核酸序列的克隆载体；
-使用所述第一种微生物的复制起点取代载体的第二种微生物的复制起点；和
-在所述第一种微生物的培养中克隆得到的载体。
优选地，所述第一种生物体不同于第二种生物体，例如，它们可能需要截然不同的因子来稳定地增殖克隆的载体。最优选地，与所述第二种微生物相比，所述第一种生物体属于另一种和/或属。因此，优选的实施方式提供了本发明的方法，其中，所述第一种生物体和所述第二种生物体互不相同。它们优选属于不同的种和/或属。通过本发明的方法，有可能在与大肠杆菌相比较不适于常规核酸操作的微生物中有效地克隆目的核酸序列。本发明使得能够在第一种微生物中高通量地克隆(和优选地表达)目的核酸，而目的核酸的初始(优选高通量)克隆是在第二种微生物中进行的。优选地，第二种生物体使用本领域可获得其复制起点(ori)的，和/或可获得其选择标记(例如如抗生素选择标记)的生物体。所述第二种微生物优选为大肠杆菌。所述第一种微生物优选为大肠杆菌以外的任何微生物。不需要穿梭载体。通过本发明的方法，有可能利用所述第一种和所述第二种微生物两者的克隆性质。所述第二微生物优选为具有高克隆效率的一种微生物，例如大肠杆菌。所述第一种微生物优选包含所关注的表达性质。所述第一种微生物例如优选能够产生具有理想的构型的目的蛋白质。
在本发明的方法的第一步中，目的核酸被插入核酸载体中，该载体包含第二种微生物的复制起点(ori)。核酸载体的定义为包含核酸的化合物。优选地，所述核酸载体由核酸组成。术语“核酸”包括包含天然核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和/或尿嘧啶)和/或非天然核苷酸(例如如肌苷)的序列。术语“核酸”还包括人工的核酸类似物，例如如但不局限于肽核酸(PNA)。
所述核酸载体优选包括质粒或载体。在这一第一步骤中，使用包含第二种微生物的复制起点的核酸载体。所述复制起点为开始核酸载体复制必需的核酸区域。第二种微生物的复制起点被所述第二种微生物的核酸复制机构识别。不同的微生物需要不同种类的复制起点；微生物的起点识别蛋白质(例如大肠杆菌中的DnaA)能够结合复制起点。识别之后开始进行复制，这需要对特定的微生物具有特异性的附加蛋白质。因此，必须选择被所选择的微生物识别的复制起点。如果选择大肠杆菌作为第二种微生物，使用例如来自pBR322、pSC101或p15A的大肠杆菌复制起点。如果选择枯草芽孢杆菌(B.subtilis)作为第二种微生物，则使用例如来自pAMβ1或pC194的枯草芽孢杆菌复制起点。但是，所选择的微生物的任何复制起点都是合适的。
使用本领域中的任何克隆方法将目的核酸插入核酸载体中。在一个优选实施方式中，使用选自非连接依赖克隆(Ligation IndependentCloning)(LIC)方法、Gateway、通用载体质粒融合系统(UnivectorPlasmid-fusion System)(UPS)和源自LIC的方法例如无酶克隆(Enzyme-Free Cloning)(EFC)或非序列和连接依赖克隆(Sequenceand Ligation Independent Cloning)(SLIC)的方法，所述目的核酸被插入所述第一载体，并在所述第二种微生物的培养中进行克隆。在一个实施方式中，使用非连接依赖克隆(LIC)方法(Aslanidis和de Jong，1990)。与依赖于重组事件的方法(例如Gateway(Walhout等人，2000)或通用载体质粒融合系统(UPS)(Liu等人，1998))相反，非连接依赖克隆在设计基因的侧翼序列时限制较小。因此，连接到重组蛋白质上的克隆相关序列可被最小化。图1B示意性地描绘了LIC方法的一个实施方式。LIC克隆方法的这个实施方式包括通过在LIC盒(cassette)中间的唯一SwaI位点上的限制使得载体线性化，然后使用T4DNA聚合酶进行处理来产生与核酸序列(例如PCR产物)的悬端互补的长的、限定的单链悬端。混合产生的载体和核酸序列，并通过例如使用CaCl2的化学转化将其转化到表达宿主中。LIC盒之前是对于预期的表达宿主特异性的启动子区。核酸产物的非连接依赖克隆证实了其对于大肠杆菌载体的高有效性，表明了载体和插入物的互补悬端的长度和组成足以形成稳定的异源双链。与之相反的是，用LIC载体和匹配(compatible)的插入物的稳定异源双链直接转化乳酸乳球菌不产生或只产生非常少的阳性克隆。因此，第二种微生物优选选择允许有效地进行克隆的微生物，例如但不局限于大肠杆菌。
在本发明的方法的第二步骤中，分离了包含目的核酸的克隆的载体。这是使用本领域已知的任何核酸分离方法进行的，例如如Birnboim和Doly(1979)的方法。
接下来，克隆的载体的复制起点由第一种微生物的复制起点进行替代。这优选使用重组酶或甚至更优选使用限制性酶进行。在这种情况下，载体被设计成为重组酶位点或限制性酶识别序列位于第二种微生物的复制起点之前。第二重组酶位点或限制性酶识别序列优选位于所述复制起点之后。在与重组酶或识别所述序列的限制性酶一起进行孵育时，识别位点被从载体上切除掉。随后，第一微生物的复制起点插入到载体中。得到的载体优选基本不含源自所述第二种微生物的元件，以使得载体在所述第一种微生物中有效克隆和稳定性最大化。因此，使用本发明的方法，不是必需使用穿梭载体。这是有利的，因为任何附加的序列都会增加得到的载体的大小。为了能够有效地进行克隆，得到的载体的大小优选尽可能的小。此外，越小的载体越稳定。因此，附加的外源序列的存在不必要地增大了得到的载体，降低了稳定性，并降低了允许具有的目的核酸序列的最大大小。因而其中得到的载体基本上不含源自所述第二种微生物的元件的本发明的实施方式是优选的。基本上不含是指得到的载体包含不多于15个、优选不多于10个源自所述第二种微生物的核苷酸。此外，得到的载体优选包含不多于100个、更优选不多于50个、最优选不多于30个起源自原始载体的重组酶识别位点和/或限制性酶识别位点的“外源”核苷酸。
图1A示意性地示出了非限制性的、优选的实施方式。根据这个实施方式，目的核酸被插入包含大肠杆菌复制起点的第一载体中。所述载体在大肠杆菌中进行扩增。接下来，分离载体并使用SfiI限制性酶切割，优选在包含侧翼为相似的SfiI位点的乳酸乳球菌复制起点的另一载体的存在下。使用T4DNA连接酶和ATP处理时，第一载体的大肠杆菌复制起点随后在载体的相当部分被乳酸乳球菌复制起点替代。当然，本发明的范围内还包括许多替代的实施方式。任何交换复制起点的方式都是合适的。
在本发明方法的接下来的步骤中，将得到的包含目的核酸序列和第一种微生物的复制起点的核酸载体转化到所述第一种微生物中。所述目的核酸序列优选在所述第一种微生物中表达。在可获得质粒的任何微生物中有效克隆和表达目的核酸的这种方式已经成为可能。由于本发明允许使用更适于(高通量)克隆的第二种微生物，许多第一种微生物的克隆效率的局限性至少可以部分地得以避免。
在一个优选的实施方式中，使用至少两种核酸载体。一种载体包含第一种微生物的复制起点，一种载体包含第二种微生物的复制起点。将目的核酸序列插入包含第二种微生物的复制起点的载体中，并将产生的载体转化到所述第二种微生物中。接下来，包含目的核酸序列的载体的复制起点被其它载体的复制起点替代，然后将产生的载体转化到第一种微生物中。因此，优选的实施方式提供了本发明的方法，包括：
-提供包含所述第二种微生物的复制起点的第一核酸载体；
-向所述第一载体引入目的核酸序列；
-提供包含所述第一种微生物的复制起点的第二核酸载体；和
-使用所述第二载体的包含所述第一微生物的所述复制起点的部分替代所述第一载体的包含所述第二微生物的所述复制起点但不包含所述目的核酸的部分。
优选地，所述第二载体包含所述第一种微生物的完整复制起点。在一个替代的实施方式中，所述第二载体包含所述第一种微生物的复制起点的一部分。在这一实施方式中，所述第一载体优选还包含所述第一种微生物的所述复制起点的一部分，该部分优选不存在于所述第二载体中。在目的核酸被插入到所述第一载体之后，包含所述第一种微生物的所述复制起点一部分的所述第二载体的序列优选被插入所述第一载体中。在一个实施方式中，存在于所述第一载体中的所述第一种微生物的所述复制起点的部分与存在于所述第二载体中的所述第一种微生物的所述复制起点的部分功能性地连接在一起，因而所述部分能够在一起发挥作用。所述第二载体优选包含所述第一种微生物的所述复制起点的主要部分，更优选包含其功能性部分。
本发明还提供了用于进一步优化核酸操作效率的装置和方法。本发明人已认识到，为了提高克隆效率，优选使用产生互不匹配的不同的、非回文悬端的限制性酶。这样的限制性酶的非限定性的例子为SfiI、SapI、Ksp632I、AarI、BglI、PflMI和BstXI。所述限制性酶优选识别在原核生物和真核生物基因组中很少出现的核酸序列，因此很好地避免目的核酸插入物的非目的性切割。原则上，识别位点具有越特异性的碱基对，其出现在特定的核酸序列中的几率就越小。Ksp632I、BglI、PflMI和BstXI的识别位点具有6个特异性的碱基对，SapI和AarI的识别位点具有7个特异性的碱基对，而SiiI的识别位点具有8个特异性的碱基对。因此，为了更好地避免目的核酸插入物序列的非目的性切割，本发明的方法优选使用SapI、AarI或SfiI进行。最优选地，使用SfiI。使用SfiI是特别优选的，因为对于本领域中可获得的产生互不匹配的不同的、非回文悬端的其它限制性酶而言，基因组中更频繁地出现被识别的核酸序列，和/或其突出序列(protrudingsequences)的最大组合少于SfiI的突出序列的最大组合。因此，使用SfiI是特别有效的。此外，优选使用在其中T4DNA连接酶有活性的同种缓冲液中有活性的限制性酶，从而在一个实施方式中，进行使用至少一种限制性酶的切割反应和使用T4DNA连接酶的连接反应而不需改变反应缓冲液，仅向缓冲液补充T4连接酶和ATP便足以开始连接反应。SfiI在其中T4DNA连接酶有活性的同种缓冲液中是有活性的。因此，由于此种性质，SfiI也是优选的。
匹配是指由于两个核酸序列由于包含足够长的单链互补序列而能够互相结合。因此，互不匹配的核酸序列不能相互退火，因为它们不包含足够长的单链互补序列。
特别优选的限制性酶为SfiI。SfiI识别5’GGCCNNNNNGGCC 3’序列(N为任意核苷酸)。该序列被切割在：
5’GGCCNNNN^NGGCC 3’
3’CCGGN^NNNNCCGG5’
因此，产生了NNN的悬端。因此，如图1C所示，SfiI的核酸切割产生可以由三个核苷酸的任意组合组成的3’悬端。在本发明的方法的优选实施方式中，使用的第一核酸载体优选包含两个不同的SfiI位点，其为第二种微生物的复制起点的侧翼，该SfiI位点在与SfiI一起孵育时产生互不匹配的不同的、非回文悬端。与SfiI的孵育产生不含所述第二种微生物的复制起点的切割载体。已被SfiI切割的该载体的两个末端不会相互发生退火。根据进一步优选的实施方式，所述两个末端能够与包含不同的复制起点的第二核酸发生退火。这样，所述第二核酸被非常高效地引入所述载体中。
包含不同复制起点的所述第二核酸优选源自包含所述侧邻SfiI位点的复制起点的第二核酸载体。选择SfiI位点使得产生的悬端与已经过SfiI切割的上述载体的SfiI悬端匹配。与SfiI一起孵育时，第二载体被切割，并得到了包含带有能与已经过SfiI切割的所述第一载体发生退火的SfiI悬端的第一种微生物的复制起点的核酸序列。
因此，一个优选的实施方式提供了在第一种微生物中克隆目的核酸序列的方法，该方法包括：
-提供包含所述第二种微生物的复制起点的第一核酸载体；
-向所述第一载体引入目的核酸序列；
-提供包含所述第一种微生物的复制起点的第二核酸载体；和
-使用所述第二载体的包含所述第一微生物的所述复制起点的部分代替所述第一载体的包含所述第二微生物的所述复制起点但不包含所述目的核酸的部分，其中所述第一载体的所述部分具有互不匹配的不同的、非回文悬端。优选地，所述悬端与所述第二载体的所述部分的悬端匹配。
所述部分优选用SfiI切割所述载体而获得。
本发明的方法的优势在于，所述第一和第二载体的操作无需纯化载体片段即可进行。因此，本发明的方法使得样品处理最少化以及允许方法自动化。
本发明的方法包括将目的核酸序列转化到微生物中。为了选择包含目的核酸序列的微生物，优选使用选择标记。优选地，使用包含第一种微生物的复制起点和第一选择标记的核酸序列。另外地，或可选地，优选使用包含第二种微生物的复制起点和第二选择标记的核酸序列。合适的选择标记的非限定的例子为提供对酶和/或抗生素作用的耐受性的基因，例如如氯霉素耐药性基因或β-内酰胺抗生素耐药性基因。可选地，或另外地，使用的选择标记在核酸序列优选被表达的微生物中补充营养缺陷(例如生物合成缺陷)(例如如编码丙氨酸消旋酶的alr基因(Bron等人，2002))，或者使得能够基于可选的选择过程进行选择(例如如编码小热休克蛋白质的shsp基因(El Demerdash等人，2003))。如果核酸序列与选择标记相结合，则通过确定是否存在选择标记来确定微生物中所述核酸序列的存在。例如，第二种微生物的复制起点与β-内酰胺酶耐受性基因相结合。转化之后，得到的微生物在β-内酰胺酶的存在下进行增殖。明显增殖的微生物携带β-内酰胺酶耐受性基因，这说明它们也携带了第二种微生物的复制起点。
图1A示意性地描述的使用选择标记的非限定性例子。包含大肠杆菌复制起点的载体具有目的核酸序列，并被转化到大肠杆菌中。该载体同时具有氯霉素耐药性基因(cat)和β-内酰胺酶耐受性基因(bla)。携带该载体的大肠杆菌微生物对β-内酰胺酶有耐药性。之后，大肠杆菌复制起点被乳酸乳球菌复制起点取代。产生的载体不再包含β-内酰胺酶耐受性基因，但是包含乳酸乳球菌复制起点。因此，对氯霉素耐受的乳酸乳球菌克隆包含含有氯霉素耐药性基因和乳酸乳球菌复制起点的核酸载体，乳酸乳球菌复制起点使得能够在乳酸乳球菌中进行核酸的增殖。当然，许多其它的选择标记(选择标记的组合)也适于选择目的微生物。
因此，进一步提供了在第一种微生物中克隆目的核酸序列的方法，该方法包括：
-提供包含第二种微生物的复制起点的第一核酸载体；
-向所述第一载体引入目的核酸序列；
-提供包含所述第一种微生物的复制起点的第二核酸载体；和
-使用所述第二载体的包含所述第一微生物的所述复制起点的部分代替所述第一载体的包含所述第二微生物的所述复制起点但不包含所述目的核酸的部分，其中包含所述第二微生物的复制起点的所述第一载体的部分包含选择标记，例如如耐受性基因。在一个实施方式中，包含所述第一微生物的复制起点的所述第二载体包含不同的选择标记，例如如不同的耐受性基因。
本发明的方法特别适于提高目的核酸序列在目的微生物中的克隆和表达的效率。优选地，进行第一克隆步骤，其中目的核酸被高效地插入核酸载体中，并在与最终在其中表达目的核酸的微生物相比具有更好的克隆性质的另一种微生物中进行克隆。优选地，使用第二种与所述第一种微生物相比能够更有效地克隆目的核酸的第二种生物体。例如，优选使用其复制起点(ori)是本领域可获得的和/或选择标记(例如如抗生素选择标记)是本领域可获得的第二种生物体。因此，一个实施方式提供了在第一种微生物中克隆目的核酸序列的方法，该方法包括：
-提供包含第二种微生物的复制起点的第一核酸载体；
-向所述第一载体引入目的核酸序列；
-在所述第二种微生物的培养中克隆所述载体；
-提供包含所述第一种微生物的复制起点的第二核酸载体；
-使用所述第二载体的包含所述第一微生物的所述复制起点的部分代替所述第一载体的包含所述第二微生物的所述复制起点但不包含所述目的核酸的部分；和
-在所述第一种微生物的培养中克隆产生的载体；
其中，与将所述目的核酸插入所述第二载体并在所述第一种微生物的培养中进行克隆的方法相比，将所述目的核酸插入所述第一载体并在所述第二种微生物的培养中进行克隆的方法更加有效。
在一个优选实施方式中，所述第一种和所述第二种微生物为细菌。优选地，所述第二种微生物为大肠杆菌，且所述第一种微生物为不同于大肠杆菌的微生物。
本发明的方法特别适于高效地克隆目的核酸，并在本领域中没有高效克隆方法的微生物中进行所述目的核酸的表达。这样的微生物在此被称为顽固性微生物(recalcitrant micro-organisms)。顽固性微生物在此被定义为使用现有的技术很难在其中克隆目的核酸的微生物。正如此处所使用的，如果在克隆过程中形成每微克核酸少于1000菌落形成单位的话，克隆目的核酸通常是非常困难的。通过顽固性微生物，难以以中至高通量的速率制备基因构建体，意味着用连接混合物转化这些微生物通常得到低的转化效率(通常每微克DNA小于1000菌落形成单位)。正如此处所使用的，基因构建体包含但不局限于待插入载体的同源基因和/或核酸序列。在一些实施方式中，所述基因构建体包含已发生突变，例如通过易错PCR，和需要筛选大的质粒文库的核酸序列。
与现有技术方法，例如WO 96/40724和WO 00/29000中公开的方法(其中，得到的目的载体在常规使用的大肠杆菌中克隆之后在载体之间进行核酸序列交换)相反，本发明优选的方法包括高效地克隆目的核酸，并在本领域没有有效的克隆方法的大肠杆菌以外的微生物中、优选为顽固性细菌中表达所述目的核酸。使用本发明的方法使得在顽固性微生物中进行高通量表达过程成为可能。
表3给出了本领域公知的顽固性微生物的非限定性列表。但是，还知道更多其它顽固性微生物。与大肠杆菌相比，在顽固性微生物中核酸操作和/或核酸克隆更难和/或更低效。例如，在最近的研究中，使用了现有的技术(Surade等人，2006)对大肠杆菌和乳酸乳球菌中的基因克隆进行了比较。对于大肠杆菌而言，成功率为222中成功216，而对于乳酸乳球菌而言，成功率仅为71中成功39。因此，即使作者Surade等人进行了大量的尝试，未能在乳酸乳球菌中克隆32种基因。
相反地，如果使用本发明的方法可以得到好得多的结果。例如，如实施例所示，在其中所述第一种微生物为乳酸乳球菌和其中所述第二种微生物为大肠杆菌的本发明实施方式中，初始的克隆步骤具有与标准大肠杆菌载体相同的高效性；在至今为止根据本发明方法已完成的试验中，在转化过程中还未发现一例失败，目前已经得到了超过300种基因构建体。
因此本发明的优选实施方式提供了本发明的方法，其中，所述第一种微生物为顽固性微生物。在一个实施方式中，所述第一种微生物为表3中列举的公知微生物中的一种。
在一个实施方式中，所述第一微生物为例如乳酸乳球菌、链霉菌(Streptomyces sp)或硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)，但是大部分现今已知的微生物与本内容相关。大肠杆菌以外的微生物通常是优选的，因为与大肠杆菌相比，这些微生物更好地表达各种不同的蛋白质。例如，与大肠杆菌相比，由于其它微生物的细胞环境，各种不同的蛋白质能够获得更好的构型和/或翻译后修饰。此外，其它参数，例如它们的密码子选择、蛋白伴侣(chaperone)的类型和数量、对大肠杆菌毒性蛋白质的表达的耐受性以及质膜的脂质组成，通常与大肠杆菌相比更利于表达功能态的蛋白质。如果产生的蛋白质在其接近自身的细胞环境时更稳定，大肠杆菌以外的微生物也优选用于表达蛋白质。因此，尽管常规的克隆方法(例如LIC方法)在例如乳酸乳球菌、链霉菌或硫磺矿硫化叶菌中比在大肠杆菌中的效率要低得多，通常仍然优选在大肠杆菌以外的微生物中克隆和表达核酸序列。使用本发明的方法，在顽固性微生物中有效地克隆和表达核酸序列成为可能。
优选提供其中所述第二微生物为大肠杆菌的本发明的方法，因为这种微生物已知具有高的转化效率，并且也已特别地对于这种生物体开发和优化了各种不同的基因操作工具。除了其它因素以外，这特别是由于本领域中存在的合适的复制起点和质粒系统的事实。将目的核酸插入这样的质粒系统以及克隆产生的质粒已在大肠杆菌中证明是非常有效的。因此，这种微生物非常适合用于本发明方法的第一克隆步骤中。
因此，在一个特别优选的实施方式中，第二微生物为大肠杆菌。正如实施例表明的那样，大肠杆菌非常适于在本发明方法的第一阶段进行有效的核酸克隆。
本发明的方法特别适于通过选择的微生物、优选通过顽固性微生物有效地克隆和表达目的核酸序列。因此同时还提供本发明的方法，其进一步包括允许通过所述第一种微生物的培养表达所述目的核酸。一旦目的核酸根据本发明的方法在微生物中进行表达，优选获得用于进一步使用的这样的表达产物。例如，制备、分离并使用用于制备药物的治疗性蛋白质。获得、分离和/或纯化已被微生物产生的蛋白质的许多方法是本领域已知的。非限定性的例子包括使用亲和标记物(例如寡-His-标记物)与金属-螯合物亲和色谱法结合，MBP-标记物与直链淀粉-树脂亲和色谱法结合以及其它通用色谱方法来纯化蛋白质。因此，在此还提供了进一步包括获得所述目的核酸序列的表达产物的本发明的方法，以及通过本发明的方法获得的表达产物。
在一个实施方式中，所述目的核酸编码多区域蛋白质和/或膜蛋白质。异源表达功能性感受态的这类蛋白质通常在已建立的表达宿主大肠杆菌和酵母中存在问题。但是，使用本发明的方法使得在替代的表达宿主中有效地克隆和表达编码这类蛋白质的核酸序列成为可能。
既然在多种微生物中有效地克隆和表达核酸序列已经成为可能，本发明的方法可用于多种应用中。例如，核酸序列可发生突变(例如使用易错PCR)且产生的核酸序列进行克隆和表达。为了寻找改进的变异体的突变蛋白质的高通量筛选已经成为可能。已被良好确立的大肠杆菌以外的微生物现在用于高通量表达。在大肠杆菌中未获得理想的构型或翻译后修饰的突变蛋白质现在使用其它种类的微生物进行有效地表达。因此，本发明还提供了一种克隆分析，其中，使用本发明的方法克隆和表达目的核酸。所述克隆分析优选为高通量克隆分析。
本发明进一步提供一种试剂盒，包含：
-包含第二种微生物的复制起点的第一核酸载体；和
-包含第一种微生物的复制起点的第二核酸载体；
其中各载体包含至少两个重组酶位点和/或限制性酶切位点，其中所述重组酶位点和/或限制性酶切位点优选不在所述复制起点内。这样，复制起点被从载体中切除，并可根据意愿由其它种类的复制起点替换。
优选地，各载体包含至少两个限制性酶切位点，其在切割时产生两个互不匹配的不同的、非回文悬端，因而已被切割的载体的两个末端不会相互发生退火。这样，克隆效率被进一步提高了。当使用非互补性非回文悬端时，目的核酸序列原则上仅能够以一个方向插入到核酸载体中。因此，为了获得带有正确定向的目的核酸序列的核酸载体，非互补性非回文悬端为优选的。优选地，所述第一种微生物不同于所述第二种微生物。更优选地，所述第一种微生物属于与第二种微生物相比的另一种和/或属。所述第一种微生物优选包括大肠杆菌以外的微生物。在一个特别优选的实施方式中，所述第一种微生物为顽固性微生物。
在一个实施方式中，所述第一核酸载体包含编码亲和标记物(例如如His-标记物)和/或另一种融合伴体(fusion partner)(例如如GFP)的序列，该亲和标记物或融合伴体将与目的核酸序列编码的蛋白质相连接。这样的亲和标记物或融合伴体有利于分离、和/或检测、和/或纯化所述蛋白质。
这样的试剂盒特别适合用于本发明的方法，其中目的核酸序列被引入到所述第一载体中，而后产生的载体在所述第二种微生物培养中进行克隆，而后克隆的载体的复制起点被所述第二载体的复制起点取代，而后产生的载体在所述第一种微生物培养中进行克隆。所述复制起点优选由重组酶或一种或多种限制性酶的作用与最初存在的载体分离。因此，重组酶位点和/或限制性酶切位点优选是在所述复制起点的侧翼区域中。
本发明的试剂盒优选包含第一和第二载体，其中各载体包含相同种类的限制性酶切位点，其在切割时产生互不匹配的两个不同的、非回文悬端，因而已被切割的载体的两个末端不会相互发生退火。这样，克隆效率进一步得以提高。载体的限制性酶位点优选是这样选择的，在与所述限制性酶一起孵育时，意图相互连接的载体的部分具有互补的单链悬端。优选地，本发明的试剂盒的至少一种载体具有至少两个SfiI切割位点。最优选地，本发明的试剂盒的所有载体具有至少两个SfiI切割位点。
一个优选的实施方式提供了本发明的试剂盒，其中所述第一载体包含大肠杆菌复制起点。正如前面已经描述的那样，大肠杆菌特别适于本发明的方法的第一克隆步骤。在一个实施方式中，所述大肠杆菌复制起点源自pBR322。
本发明的试剂盒的第二载体优选包含大肠杆菌以外的微生物的复制起点，优选是顽固性微生物的复制起点。正如前面所讨论的那样，这些微生物优选用于制备各种类型的(人)蛋白质。在一个实施方式中，使用源自pSH71的乳酸乳球菌复制起点。
本发明的试剂盒第一载体优选包含选择标记，例如如抗生素耐药性基因。此外，所述试剂盒的第二载体优选包含选择标记，例如如抗生素耐药性基因。正如前面所说明的那样，选择标记用于选择携带核酸载体的微生物。
使用本发明的方法，有可能使用较不适用于常规核酸操作的微生物种类有效地克隆目的核酸。例如，已经得到其中每微克用于所述方法的核酸的菌落形成单位的量为至少105CFU/μg DNA的乳酸乳球菌培养物。
因此，本发明进一步提供了通过本发明的方法得到的乳酸乳球菌培养物，其中每微克用于所述方法的目的核酸的菌落形成单位的量为至少105CFU/μg DNA。
本发明还提供了包含核酸载体的重组微生物，该载体包含：
-所述种类微生物的复制起点；
-目的核酸序列；和
-至少两个限制性酶切位点，其在切割时产生两个互不匹配的不同的、非回文悬端，且其中所述限制性酶切位点不在所述复制起点内。所述微生物优选为大肠杆菌以外的微生物。在一个优选实施方式中，所述微生物为顽固性微生物。在一个实施方式中，所述微生物为乳酸乳球菌。
此外，所述限制性酶切位点优选为SfiI、SapI、Ksp632I、AarI、BglI、PflMI和/或BstXI切割位点，更优选为SapI、AarI或SfiI切割位点。最优选地，所述限制性酶切位点为SfiI切割位点。正如前面所描述的那样，使用SfiI、SapI、Ksp632I、AarI、BglI、PflMI和/或BstXI允许核酸载体被切割，由此已被切割的载体的两个末端不会相互发生退火。SfiI、SapI、Ksp632I、AarI、BglI、PflMI和/或BstXI切割位点是这样设计的，从而意在相互连接的两种不同载体的部分具有互补的单链悬端。使用SfiI进一步提供了额外的优势，即它在T4DNA连接酶具有活性的相同种类的缓冲液中是具有活性的。因此，在一个使用T4DNA连接酶和SfiI的优选的实施方式中，无需更换反应缓冲液即可进行切割反应和连接反应(意味着除了添加SfiI、T4DNA连接酶和ATP以外无需进行其它活动)。
本发明进一步通过下面的实施例进行阐述。这些实施例无意于限制本发明的范围，仅用于阐明本发明。
实施例
我们现在提供了一种与高通量操作兼容的通用克隆策略，产生了对于表达宿主优化和去除外源(例如大肠杆菌来源的)元件的天然质粒载体。这里描述的载体骨架交换(Vector Backbone Exchange)(VBEx)方法是具体用于在乳酸乳球菌中的克隆，但是它很容易适用于已存在质粒、选择标记和转化方法的所有生物体。VBEx已被用于产生了超过300种基因构建体，且在乳酸乳球菌中的基因克隆至表达筛选正在以每周48种的速度进行。
为了便于初始步骤用于大量开放阅读框的克隆，我们使用了非连接依赖克隆(LIC)方法(Aslanidis和de Jong，1990)。与依赖于重组事件的方法(例如Gateway(Walhout等人，2000)或通用载体质粒融合系统(UPS)(Liu等人，1998))相比，非连接依赖克隆在基因侧翼的序列的设计上限制较少。因此，连接到重组蛋白质上的克隆相关的序列可被最小化。克隆过程包括通过在LIC盒中间的唯一SwaI位点上的限制性酶切使得载体线性化，然后使用T4DNA聚合酶进行处理来产生与PCR产物的那些悬端互补的长的、确定的单链悬端(图1B)。LIC盒之前是对预期表达宿主特异性的启动子区域。因此，我们分别使用大肠杆菌和乳酸乳球菌表达质粒pBAD24(Guzman等人，1995)和pNZ8048(de Ruyter等人，1996)的PBAD和PNIS启动子。PCR产物的非连接依赖克隆证明对于大肠杆菌载体是高效的，表明载体和插入物的互补悬端的长度和组成足以形成稳定的异源双链。与之相反，用源自pNZ8048的LIC载体和匹配的插入物的稳定异源双链直接转化乳酸乳球菌不产生或仅产生非常少的阳性克隆(未显示数据)。
为了克服乳酸乳球菌中差的克隆效率，设计了新的策略(VBEx)，使得在大肠杆菌中进行初始(高通量)克隆，但是又避免使用穿梭载体。尽管我们与LIC结合使用VBEx，但是本策略与Gateway、UPS以及LIC变化形式(例如无酶克隆(de Jong等人，2007)和SLIC(Li和Elledge，2007))完全相容。该方法依赖于将表达宿主的真正的质粒载体对切(bisection)成两个部分，因而将选择标记和复制起点分离。对于乳酸乳球菌而言，pNZ8048质粒的复制起点(pSH71复制子)与氯霉素耐药性基因(cat)分开(图1a)。包含cat和LIC序列的片段与包含大肠杆菌复制起点和β-内酰胺酶耐受性基因(bla)的载体的骨架相融合。产生的质粒pRExLIC使得在大肠杆菌中进行LIC操作。包含乳酸乳球菌复制起点的片段与红霉素选择标记相融合(产生质粒pERL)，其使得能够在表达宿主中进行复制和选择。
来自相关pRExLIC和pERL片段的原始乳酸乳球菌表达质粒的快速和高通量相容性重建通过使每一半的末端侧邻不同的SfiI限制性位点(图1a中的SfiIX和SfiIY)确保。SfiI的DNA切割产生了由三个核苷酸的任意组合组成的3’悬端。使用的两个SfiI位点产生了互不匹配的不同的、非回文悬端(图1c)。i)原始表达载体的两半具有可被选择的性质和ii)在各质粒片段的任一侧进行SfiI消化后不同的3’悬端的组合确保了最少的样品处理，并允许该方法的自动化。由于表达载体的每一半具有独特的可选择性质，不需要SfiI片段的凝胶电泳和纯化。在氯霉素的存在下选择质粒在乳酸乳球菌中的复制能力允许独特的回收仅来自SfiI消化的pRExLIC和pERL质粒的复合混合物的原始表达载体。此外，不需要在消化和连接反应之间更换缓冲液。仅仅向SfiI缓冲液中补充ATP即足以使T4DNA连接酶完全活化。
实践中，全部的过程可以在单管中3小时内发生。在pRExLIC和pERL共同的SfiI消化(50℃下80分钟)、然后热灭活限制性酶(80℃下20分钟)之后，通过加入ATP和T4DNA连接酶开始片段的连接(20℃下60分钟)。加热灭活T4DNA连接酶(65℃下20分钟)之后，可使用等分的混合物进行(电)转化而无需进一步纯化(图1)。对于乳酸乳球菌而言，我们常规地观察到了高的可再现的转化效率(～106CFU/μg DNA)，这与传统的限制-连接克隆的效率低的和变化的转化效率(～102CFU/μg DNA；例如参见Surade等人，2006)形成对比。值得注意的是，使用VBEx方法，得到的所有的乳酸乳球菌转化体都携带插入pNZxLIC中的目的基因。使用这一系统，我们产生了超过300种表达构建体，并在不使用机器人的条件下以每周48种构建体的速率评估蛋白质的水平。一个膜蛋白质的小亚群在乳酸乳球菌中的过表达示于图1d中。
重要地，来自实质上所有测序的基因组中的DNA序列都与本克隆策略相容，因为SfiI位点(5’GGCCNNNN^NGGCC 3’)非常罕见(图2a)。分别在NCBI数据库(2007年2月)和Ensembl(版本43)中的492种古细菌和细菌染色体及30种真核基因组的所有预计基因转录体的分析表明：超过92％的这些转录体都不含任何SfiI位点(表1)。此外，本发明的使用并不局限于不含SfiI位点的转录体。由于在SfiI消化后可产生64种不同的3’悬端，带有不与载体的悬端匹配的3’悬端的内SfiI位点将会造成三向或多向的连接，而不会形成该方法的瓶颈。如果需要的话，载体很容易适应以用于天然不存在(non-occuring)或极其罕见的悬端。在89％所分析的基因组中，至少两种类型的SfiI悬端未出现(图2b)。剩余的11％的基因组包含几种类型的低出现率的SfiI悬端。
为了保证本策略对于不同大小的插入物的普遍性，我们比较了带有高达3.7kb的插入物的pRExLIC衍生物的SfiI消化率(数据未显示)，并观察到80分钟孵育后的完全消化。此外，我们使用基于敏感性活性的分析(数据未显示)证明了在克隆的宿主大肠杆菌中不存在来自PNIS启动子的表达。来自细菌、植物和哺乳动物来源的重组DNA在pRExLIC和pNZxLIC载体中的成功装配和稳定性被证明非常高，且至今为止未观察到基因重排(n＞300)。
总而言之，我们已经发展了LIC-VBEx，一种具有空前的高效率的用于乳酸乳球菌的高通量相容的克隆系统，其可容易地适应于任何其它表达宿主。穿梭载体产生的问题可以通过使用正源的(genuine)表达质粒得以避免。产生的LIC盒使得能够用在N-或C末端用可切割的十His-标记物标记目的蛋白质(带有这些盒的载体和具有替代的标记物或融合伴体的衍生物示于材料和方法部分中)。因此，描述的方法已在我们实验室被用于高效地制备超过300种基因构建体(～90％为LIC；～100％为VBEx(数据未显示))。在非自动化的设置中，在大肠杆菌和乳酸乳球菌中从克隆到表达筛选的完整过程以大约每周48种构建体的速度进行。
材料和方法
非连接依赖克隆(LIC)。使用Phusion DNA聚合酶(Finnzymes)和LIC特异性尾在5’端延长的基因特异性引物(表A)进行插入物的扩增。使用质粒分离试剂盒(
Figure G2008800228773D00181
Plus，Promega)纯化包含LIC盒的载体。使用苯酚：氯仿和氯仿提取来进一步纯化DNA，以去除痕量蛋白质。使用25单位的SwaI(Roche)在25℃下消化载体(～5μg的DNA)过夜。然后使用凝胶纯化PCR产物和消化的载体(GFX PCRDNA & Gel Band纯化试剂盒，GE)，在10mM Tris-HCl，pH 7.5，0.2mMNa-EDTA中进行洗脱，并在4℃下储存。
在20℃、分别2.5mM dCTP和2.5mM dGTP的存在下，使用0.5UT4DNA聚合酶(Roche)单独处理200ng SwaI消化的载体和等摩尔量的插入物30分钟，然后加热灭活T4DNA聚合酶(75℃下20分钟)。现在处于“LIC-备用(LIC-ready)”状态的材料可于4℃保存较长的时间(超过6个月)。LIC-备用的载体(1μl)和插入物(3μl)进行混合，并在室温下孵育5分钟后转化到75μl化学感受态大肠杆菌MC1061中。细胞在氨苄青霉素(100μg/ml)补充的Luria肉汤培养基上进行接种。
表A.非连接依赖克隆需要的引物延伸
  引物类型  序列(5’→3’)
  nLIC正向  AT GGT GAG AAT TTA TAT TTT CAA GGT+基因特异性的
  nLIC反向  T GGG AGG GTG GGA TTT TCA TTA+基因特异性的
  引物类型  序列(5’→3’)
  cLIC正向  ATG GGT GGT GGA TTT GCT+基因特异性的
  cLIC反向  TTG GAA GTA TAA ATT TTC+基因特异性的
载体骨架交换。源自pRExLIC的载体的载体骨架交换是在带有加热盖的PCR仪中少量(10μl)地进行以防止缩合。将pERL载体(包含乳酸乳球菌复制起点)和源自pRExLIC的载体(包含乳酸乳球菌cat基因)进行混合(各～125ng)，并通过加入1μl 10X缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 7.5，100mM MgCl2，500mM NaCl，1mg/ml BSA)、5U SfiI(Fermentas)和足量的milliQ将体积调节到10μl。样品在50℃下孵育80分钟并在80℃下孵育20分钟以灭活SfiI。冷却至室温之后，通过加入1.5μl的8mM Na2-ATP，pH 7和0.5U的T4DNA连接酶(Roche)来启动连接反应。样品在20℃下孵育1小时并在65℃下孵育20分钟以灭活T4DNA连接酶。然后，将2μl样品转移到30μl电感受态乳酸乳球菌NZ9000中(参见下面)中，将等分试样接种在补充有0.5％葡萄糖、0.5M蔗糖、5μg/ml氯霉素的M17板上(Terzaghi和Sandine，1975)(Difco)。封口膜(Parafilm)密封的板在30℃下进行孵育直至出现菌落(～18小时)。
乳酸乳球菌的电转化。电感受态的乳酸乳球菌NZ9000的制备基本上按照描述(Holo和Nes，1989；Wells等人，1993)进行，但是经过一些关键的改进。简而言之，细胞在补充有0.5％葡萄糖、0.5M蔗糖和2％甘氨酸的M17中在30℃下生长至OD600＝～0.5。在4℃下通过5000xg离心15分钟收获细胞。在使用1体积的冰冷溶液A(在milliQ中制备的0.5M蔗糖和10％甘油)、0.5体积的补充50mMNa-EDTA，pH 7.5的溶液A和0.25体积的溶液A洗涤后，细胞重新悬浮在0.01体积的溶液A中。40μl的等分试样在液氮中快速冷冻，并储存在-80℃直至使用。用于电穿孔时，细胞在冰上解冻，与质粒DNA合并，并转移到冰冷的电穿孔小杯(2mm间隙)中。细胞置于具有2kv场强、25μF电容和200Q电阻的单电脉冲中。放电之后立即将细胞与1ml冰冷的补充有0.5％葡萄糖、0.5M蔗糖、20mM MgCl2和2mM CaCl2的M17相混合，然后置于冰上10分钟。然后，细胞在30℃下孵育2小时，并将等分试样接种在补充有0.5％葡萄糖、0.5M蔗糖和5μg/ml氯霉素的M17琼脂上。密封板，并在30℃下孵育过夜。
表1.SfiI位点在原核和真核基因转录体中的分布分析。对于原核和真核数据点，分析了1,484,533和745,558种基因转录体。
Figure G2008800228773D00201
LIC方法的详细总结。
nLIC盒：制备了包含N末端的10个His-标记物的，然后是TEV蛋白酶切割位点和你的目标蛋白质(Your Favorite Protein)(YFP)的构建体。使用T4DNA聚合酶的3’→5’核酸外切酶活性和专用的尾部序列，产生了长的限定的悬端。这些悬端具有足够高的退火温度，因而仅仅混合互补悬端就足以产生稳定的DNA序列，准备用于细胞转化。
载体带有包含SwaI位点的nLIC盒。SwaI消化之后，在dCTP的存在下使用T4DNA聚合酶处理载体，以产生nLIC-备用的悬端(如下所示)。
1.nLIC盒
N  Met His His His His His His His His His His Gly Glu Asn Leu Tyr
5′ATG CAT CAT CAC CAT CAT CAC CAT CAC CAT CAT GGT GAG AAT TAT TAT TTAAATCCCACCCTCCCAG
3′TAC GTA GTA GTG GTA GTA GTG GTA GTG GTA GTA CCA CTC TTA AAT ATA AATTTAGGGTGGGAGGGTC
2.使用SwaI消化之后
N  Met His His His His His His His His His His Gly Glu Asn Leu Tyr
5′ATG CAT CAT CAC CAT CAT CAC CAT CAC CAT CAT GGT GAG AAT TTA TAT TT AAATCCCACCCTCCCAG
3′TAC GTA GTA GTG GTA GTA GTG GTA GTG GTA GTA CCA CTC TTA AAT ATA AA TTTAGGGTGGGAGGGTC
3.使用T4DNA聚合酶+dCTP处理之后
N  Met His His His His His His His His His His Gly Glu Asn Leu Tyr
5′ATG CAT CAT CAC CAT CAT CAC CAT CAC CAT C                          AAATCCCACCCTCCCAG
3′TAC GTA GTA GTG GTA GTA GTG GTA GTG GTA GTA CCA CTC TTA AAT ATA AA                 C
使用带有专用的nLIC尾的引物来对插入物进行PCR。去除引物和核苷酸以后，在dGTP的存在下使用T4DNA聚合酶处理插入物，以产生nLIC-备用的悬端(如下所示)。
1.PCR
N  is Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Met      X   X
5′AT GGT GAG AAT TTA TAT TTT CAA GGT ATG YFP TAA TGA AAA TCC CAC CCT CCC A
3′TA CCA CTC TTA AAT ATA AAA GTT CCA TAC YFP ATT ACT TTT AGG GTG GGA GGG T
2.使用T4DNA聚合酶+dGTP处理之后
N  is Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly      X   X
5′AT GGT GAG AAT TTA TAT TTT CAA GGT YFP TAA TG
3′                           GTT CCA YFP ATT ACT TTT AGG GTG GGA GGG T
然后，将nLIC-备用的载体和插入物进行混合。限定的悬端退火成稳定的结构，对于基因的5’和3’末端Tm分别为大约44℃和58℃。留下的小的一个碱基对的间隙将会在体内进行填补。
a.退火之前的5’末端
N  Met His His His His His His His His His H                               is Gly Giu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
5′ATG CAT CAT CAC CAT CAT CAC CAT CAC CAT C                               AT GGT GAG AAT TTA TAT TTT CAA GGT YFP
3′TAC GTA GTA GTG GTA GTA GTG GTA GTG GTA GTA CCA CTC TTA AAT ATA AA.                                GTT CCA YFF
b.退火之后的5’末端
N  Met His His His His His His His His His His Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
5′ATG CAT CAT CAC CAT CAT CAC CAT CAC CAT CAT GGT GAG AAT TTA TAT TTT CAA GGT YFP
3′TAC GTA GTA GTG GTA GTA GTG GTA GTG GTA GTA CCA CTC TTA AAT ATA AA. GTT CCA YFP
1.退火之前的3’末端
N  Met       X   X
5′ATG YFP TAA TG                         AAA TCC CAC CCT CCC AG
3′TAC YFP ATT ACT TTT AGG GTG GGA GGG T                       C
2.退火之后的3’末端
N  Met       X   X
5′ATG YFP TAA TG. AAA TCC CAC CCT CCC AG
3′TAC YFP ATT ACT TTT AGG GTG GGA GGG TC
cLIC盒：制备了包含相对较小的N末端修饰(MGGGFA)、你的目标蛋白质(YFP)和C末端TEV蛋白酶切割位点，然后是10个His-标记物的构建体。使用T4DNA聚合酶的3’→5’核酸外切酶活性和专用的尾部序列，产生了长的确定的悬端。这些悬端具有足够高的退火温度，从而仅混合互补的悬端就足以产生稳定的DNA序列，准备用于细胞转化。载体带有包含SwaI位点的cLIC盒。SwaI消化之后，在dCTP的存在下使用T4DNA聚合酶处理载体，以产生nLIC-备用的悬端(如下所示)。
1.cLIC盒
      M   G   G   G   F     N   L   Y   F   Q   G   H   H   H   H   H   H   H   H   H   H   X
5′C ATG GGT GGT GGA TTT A AAT TTA TAC TTC CAA GGT CAT CAT CAC CAT CAT CAC CAT CAC CAT CAT TAA
3′G TAC CCA CCA CCT AAA T TTA AAT ATG AAG GTT CCA GTA GTA GTG GTA GTA GTG GTA GTG GTA GTA ATT
2.使用SwaI消化之后
       M   G   G   G   F          N   L   Y   F   Q   G   H   H   H   H   H   H   H   H   H   H   X
5′C ATG GGT GGT GGA TTT      A AAT TTA TAC TTC CAA GGT CAT GAT CAC CAT CAT CAC CAT CAC CAT CAT TAA
3′G TAC CCA CCA CCT AAA      T TTA AAT ATG AAG GTT CCA GTA GTA GTG GTA GTA GTG GTA GTG GTA GTA ATT
3.使用T4DNA聚合酶+dCTP处理之后
      M   G   G   G   F            N   L   Y   F   O   G   H   H   H   H   H   H   H   H   H   H   X
5′C                            A AAT TTA TAC TTC CAA GGT CAT CAT CAC CAT CAT CAC CAT CAC CAT CAT TAA
3′G TAC CCA CCA CCT AAA                              CCA GTA GTA GTG GTA GTA GTG GTA GTG GTA GTA ATT
使用带有专用的cLIC尾的引物来对插入物进行PCR。去除引物和核苷酸以后，在dGTP的存在下使用T4DNA聚合酶处理插入物，以产生cLIC-备用的悬端(如下所示)。
    M  G    G   G   F   A       E   N   L   Y   F   Q
5′ATG GGT GGT GGA TTT GCT YFP GAA AAT TTA TAC TTC CAA
3′TAC CCA CCA CCT AAA CGA YFP CTT TTA AAT ATG AAG GTT
2.使用T4DNA聚合酶+dGTP处理之后
    M   G   G   G   F   A       E   N   L   Y   F   Q
5′ATG GGT GGT GGA TTT GCT YFP G
3′                     GA YFP CTT TTA AAT ATG AAG GTT
然后，将cLIC-备用的载体和插入物进行混合。限定的悬端被退火成稳定的结构，对于基因的5’和3’末端Tm分别为大约41℃和31℃。留下的小的一个碱基对的间隙将会在体内进行填补。
a.退火之前的5’末端
      M   G   G   G   F  A
5′C                          ATG GGT GGT GGA TTT GCT YFP
3′G TAC CCA CCA CCT AAA                           GA YFP
b.退火之后的5’末端
      M   G   G   G   F   A
5′C ATG GGT GGT GGA TTT GCT YFP
3′G TAC CCA CCA CCT AAA .GA YFP
1.退火之前的3’末端
       F  N  L  Y  F  Q              N   L   Y   F   Q   G   H   H   H   H   H   H   H   H   H   H   X
5′YFP G                          A AAT TTA TAC TTC CAA GGT CAT CAT CAC CAT CAT CAC CAT QAC CAT CAT TAA
3′YFP CTT TTA AAT ATG AAG GTT                          CCA GTA GTA GTG GTA GTA GTG GTA GTG GTA GTA ATT
2.退火之后的3’末端
        E   N   L   Y   F   Q   G   H   H   H   H   H   H   H   H   H   H   X
5′YFP G.A AAT TTA TAC TTC CAA GGT CAT CAT CAC CAT CAT CAC CAT CAC CAT CAT TAA
3′YFP CTT TTA AAT ATG AAG GTT CCA GTA GTA GTG GTA GTA GTG GTA GTG GTA GTA ATT
附图简述
图1.LIC-VBEx策略的概述。(a)示出了乳酸乳球菌表达载体pNZxLIC的对切的示意图。包含cat和LIC序列的片段被置于大肠杆菌的骨架中，从而产生了pRExLIC。然后这一载体可用于LIC过程中(b中描绘的)。(b)包含插入物的pRExLIC衍生物通过VBEx过程转化成pNZxLIC衍生物。(c)质粒载体的两个片段侧翼的SfiI位点产生不同的悬端。(d)乳酸乳球菌中膜蛋白质的过表达。左图代表了考马斯染色的蛋白质凝胶，右图为抗His抗体染色的免疫印迹。减号和正号标记表示未经乳酸链球菌肽A(nisin A)诱导和经乳酸链球菌肽A诱导的样品。实心和空心箭头分别表示His标记的和非标记的亚基/蛋白质。标志物带为170、130、100、70、55、40、35、25和15kDa。从左至右显示的分别为：来自乳酸乳球菌的ABC运载体(transporter)和二级核黄素运载体、来自金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的ABC运载体，以及来自流感嗜血杆菌的TRAP运载体的整合膜组分；登录号显示在图下方。
图2.SfiI特性的分析。(a)在492种原核基因组和30种真核生物的多联基因转录体中SfiI位点的出现几率随DNA的GC含量变化。由于SfiI消化后会产生64种不同的悬端，互补的SfiI位点的频率甚至更低(图3)。(b)在基因组或组合的基因转录体中不存在的SfiI悬端的数目随与DNA的GC含量变化(最多64种)。在插入物包含干扰VBEx过程的SfiI位点的罕见情况中，可以使用不存在的悬端邻接载体的两个片段。
图3.在基因组和组合的转录体中产生相同的悬端的SfiI位点出现率随DNA的GC含量变化的分析。对于各DNA而言，显示该种类最常出现的SfiI位点的数据点。
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表2
可获得的LIC载体
  载体名称   蛋白质序列  TEV蛋白酶切割之后的蛋白质序列   表达宿主
  pREnLIC   M-His10-G-TEV位点-蛋白质  G-蛋白质   乳酸乳球菌NZ9000
  pREcLIC   MGGGFA-蛋白质-TEV位点-His10  MGGGFA-蛋白质-ENLYFQ   乳酸乳球菌NZ9000
  载体名称   蛋白质序列  TEV蛋白酶切割之后的蛋白质序列   表达宿主
  pREcLIC-GFP   MGGGFA-蛋白质-TEV位点-GFP-His10  MGGGFA-蛋白质-ENLYFQ   乳酸乳球菌NZ9000
  pRE-USP45-nLIC   M-ssUSP451)-His10-G-TEV位点-蛋白质  G-蛋白质   乳酸乳球菌NZ9000
  pBADnLIC   M-His10-G-TEV位点-蛋白质  G-蛋白质   大肠杆菌
  pBADcLIC   MGGGFA-蛋白质-TEV位  MGGGFA-蛋白质   大肠杆菌
  点-His10   -ENLYFQ
  pBADcLIC-GFP   MGGGFA-蛋白质-TEV位点-GFP-His10   MGGGFA-蛋白质-ENLYFQ   大肠杆菌
  pBAD-OmpA-nLIC   M-ssOmpA452)-His10-G-TEV位点-蛋白质   G-蛋白质   大肠杆菌
1)ssUSP45是指乳酸乳球菌USP45蛋白质的信号序列。如果预测目的膜蛋白质的N末端位于细胞质膜外，那么使用pRE-USP45-nLIC载体，或者使用ssUSP45取代目的蛋白质的信号序列。
2)ssOmpA是指大肠杆菌OmpA蛋白质的信号序列。如果预测目的膜蛋白质的N末端位于细胞质膜外，那么使用pBAD-OmpA-nLIC载体，或者使用ssOmpA取代目的蛋白质的信号序列。
表3
  对于基因克隆(例如基因文库的构建)而言的顽固性微生物
  乳酸乳球菌
  乳杆菌属种类(例如保加利亚乳杆菌(bulgaricus)、瑞士乳杆菌(helveticus)、植物乳杆菌(plantarum))
  硫磺矿硫化叶菌
  对于基因克隆(例如基因文库的构建)而言的顽固性微生物
  一般的古细菌(包括嗜盐古菌(haloarchaea)和其它)
  链球菌属种类(例如嗜热链球菌、化脓性链球菌、变形链球菌)
  明串珠菌种
  嗜热杆菌、热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)

Claims (26)

1.一种用于在第一种微生物中克隆目的核酸序列的方法，该方法包括：
-将所述目的核酸插入核酸载体，该载体包含第二种微生物的复制起点；
-在所述第二种微生物的培养中克隆所述载体；
-分离包含所述目的核酸序列的克隆的载体；
-用所述第一种微生物的复制起点取代载体的第二种微生物的复制起点；和
-将形成的载体在所述第一种微生物的培养中克隆。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述形成的载体基本上不含来自所述第二种微生物的元件。
3.根据权利要求1或2所述的方法，包括：
-提供包含所述第二种微生物的复制起点的第一核酸载体；
-向所述第一载体引入目的核酸序列；
-提供包含所述第一种微生物的复制起点的第二核酸载体；和
-使用所述第二载体的包含所述第一微生物的所述复制起点的部分代替所述第一载体的包含所述第二微生物的所述复制起点但不包含所述目的核酸的部分。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第一载体的所述部分具有互不匹配的不同的、非回文悬端，该回文悬端与所述第二载体的所述部分的悬端匹配。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述这些部分是由SfiI切割所述载体获得的。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中含有所述第二微生物的复制起点的所述第一载体的部分包含选择标记，例如如抗生素耐药性基因，且其中含有所述第一微生物的复制起点的所述第二载体的部分包含选择标记，例如如抗生素耐药性基因。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，通过使用选自非连接依赖克隆(LIC)法、Gateway、通用载体质粒融合系统(UPS)和LIC变化形式如无酶克隆(EFC)和非序列和连接依赖克隆(SLIC)的方法，所述目的核酸被插入所述第一载体并在所述第二种微生物的培养中进行克隆。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其中，将所述目的核酸插入所述第一载体并在所述第二种微生物的培养中进行克隆的方法比将所述目的核酸插入所述第二载体并在所述第一种微生物的培养中进行克隆的方法更有效。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述第二种微生物为大肠杆菌。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述第一种微生物为大肠杆菌以外的微生物，优选为顽固性微生物。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，进一步包括通过所述第一种微生物的培养使得所述目的核酸表达。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，进一步包括获得所述目的核酸序列的表达产物。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述目的核酸编码多结构域蛋白质和/或膜蛋白质。
14.通过权利要求1-13中任一项所述的方法所获得的表达产物。
15.一种克隆方法，其中，目的核酸通过权利要求1-13中任一项所述的方法进行克隆和表达。
16.一种试剂盒，包括：
-包含第二种微生物的复制起点的第一核酸载体；和
-包含第一种微生物的复制起点的第二核酸载体；
其中各载体包含至少两个重组酶位点和/或限制性酶切位点，且其中所述重组酶位点和/或限制性酶切位点优选不在所述复制起点内。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中，各载体包含至少两个限制性酶切位点，其在切割时产生互不匹配的两个不同的、非回文悬端。
18.根据权利要求16或17所述的试剂盒，其中，所述第一载体和所述第二载体包含相同种类的限制性酶切位点，其在切割时产生互不匹配的两个不同的、非回文悬端。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的试剂盒，其中，所述限制性酶切位点为SfiI切割位点。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一载体包含大肠杆菌复制起点的至少一部分。
21.根据权利要求16-20中任一项所述的试剂盒，其中，所述第二载体包含大肠杆菌以外的微生物的复制起点的至少一部分，优选顽固性微生物的复制起点的至少一部分。
22.根据权利要求16-21中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一载体包含选择标记，例如如抗生素耐药性基因，且其中，所述第二载体包含选择标记，例如如抗生素耐药性基因。
23.根据权利要求1-13中任一项所述的方法获得的乳酸乳球菌培养物，其中，用于所述方法中的每微克目的核酸的菌落形成单位量为至少105CFU/μg DNA。
24.一种包含核酸载体的重组微生物，该载体包含：
-所述种类微生物的复制起点；
-目的核酸序列；和
-至少两个限制性酶切位点，其在切割时产生互不匹配的两个不同的、非回文悬端，且其中，所述限制性酶切位点不在所述复制起点内。
25.根据权利要求24所述的微生物，其是大肠杆菌以外的微生物，优选为顽固性微生物。
26.根据权利要求24或25所述的微生物，其中，所述限制性酶切位点为SfiI切割位点。
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