JP2590422B2 - ラン藻を用いた大腸菌の遺伝子産物の製造方法 - Google Patents
ラン藻を用いた大腸菌の遺伝子産物の製造方法Info
- Publication number
- JP2590422B2 JP2590422B2 JP6026255A JP2625594A JP2590422B2 JP 2590422 B2 JP2590422 B2 JP 2590422B2 JP 6026255 A JP6026255 A JP 6026255A JP 2625594 A JP2625594 A JP 2625594A JP 2590422 B2 JP2590422 B2 JP 2590422B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cyanobacteria
- gene
- sequence
- medium
- gene product
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子組換えによっ
て、ラン藻から遺伝子産物を細胞外に放出せしめて製造
する方法に関する。
て、ラン藻から遺伝子産物を細胞外に放出せしめて製造
する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】大腸菌、枯草菌などを宿主とする遺伝子組
換えにより、成長ホルモンやインシュリンなどの有用物
質を生産することは、広く行われるようになった。これ
ら遺伝子産物を細胞外に放出させるには、分泌タンパク
質や外膜、ペリプラズムに存在するタンパク質の、所謂
シグナル配列を利用することが行われている。
換えにより、成長ホルモンやインシュリンなどの有用物
質を生産することは、広く行われるようになった。これ
ら遺伝子産物を細胞外に放出させるには、分泌タンパク
質や外膜、ペリプラズムに存在するタンパク質の、所謂
シグナル配列を利用することが行われている。
【０００３】しかし、このような従属栄養の微生物で
は、培地組成がバクトトリプトンや酵母抽出物など複雑
なものからなるために、折角細胞外に遺伝子産物を放出
させることが出来ても、これら遺伝子産物の分離精製過
程が十分に簡略化できなかった。
は、培地組成がバクトトリプトンや酵母抽出物など複雑
なものからなるために、折角細胞外に遺伝子産物を放出
させることが出来ても、これら遺伝子産物の分離精製過
程が十分に簡略化できなかった。
【０００４】しかも、遺伝子組換え微生物の大きな応用
分野として固定化微生物によるバイオセンサーが期待さ
れているが、やはり複雑な培地組成が、センサーの鍵に
なる酵素反応を不安定にする、ということが障害になっ
ていた。
分野として固定化微生物によるバイオセンサーが期待さ
れているが、やはり複雑な培地組成が、センサーの鍵に
なる酵素反応を不安定にする、ということが障害になっ
ていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、分離精製が
容易な遺伝子産物の製造方法を提供することを目的とす
る。
容易な遺伝子産物の製造方法を提供することを目的とす
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、ラン藻が高
等植物と同じような光合成を営む独立栄養生物であり、
大量培養も容易であることから、ラン藻を利用して有用
物質を生産することに興味を持ち、従来より遺伝子組換
え技術の開発を進めてきた。
等植物と同じような光合成を営む独立栄養生物であり、
大量培養も容易であることから、ラン藻を利用して有用
物質を生産することに興味を持ち、従来より遺伝子組換
え技術の開発を進めてきた。
【０００７】そのような研究のなかで、ラン藻を宿主と
すると、培地が簡単な無機塩類からなるために、遺伝子
産物の分離精製を容易にでき、また酵素反応の阻害が起
こりにくくできる特徴があることに着目した。
すると、培地が簡単な無機塩類からなるために、遺伝子
産物の分離精製を容易にでき、また酵素反応の阻害が起
こりにくくできる特徴があることに着目した。
【０００８】そして、外的操作により遺伝子産物を細胞
外に放出させる方法を鋭意研究した結果、浸透圧ショッ
クを与えると、遺伝子産物が放出されることを見出し、
本発明を完成するに至った。
外に放出させる方法を鋭意研究した結果、浸透圧ショッ
クを与えると、遺伝子産物が放出されることを見出し、
本発明を完成するに至った。
【０００９】
【００１０】本発明は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉのペリプラズムに存在するタンパク質であるβ−ラ
クタマーゼ、アルカリ性フォスファターゼ、マルトース
結合タンパク質、またはアラビノース結合タンパク質の
遺伝子のシグナル配列、あるいはシグナル配列とそれに
続くいくつかのアミノ酸をコードする部分配列を、目的
産物の構造遺伝子のＮ末端に挿入したラン藻の組換え用
ベクターをラン藻に導入した形質転換体を通常培地で成
育させてから、低張液に移すことを特徴とする遺伝子産
物の製造方法である。
ｌｉのペリプラズムに存在するタンパク質であるβ−ラ
クタマーゼ、アルカリ性フォスファターゼ、マルトース
結合タンパク質、またはアラビノース結合タンパク質の
遺伝子のシグナル配列、あるいはシグナル配列とそれに
続くいくつかのアミノ酸をコードする部分配列を、目的
産物の構造遺伝子のＮ末端に挿入したラン藻の組換え用
ベクターをラン藻に導入した形質転換体を通常培地で成
育させてから、低張液に移すことを特徴とする遺伝子産
物の製造方法である。
【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】本発明において、ペリプラズムとは、大腸
菌などのグラム陰性菌の、細胞表層における外膜−ペプ
チドグリカン層と細胞質膜との間の空間のことをいい、
これは、同じグラム陰性菌であるラン藻にも、全細胞容
量の２０−４０％存在する。
菌などのグラム陰性菌の、細胞表層における外膜−ペプ
チドグリカン層と細胞質膜との間の空間のことをいい、
これは、同じグラム陰性菌であるラン藻にも、全細胞容
量の２０−４０％存在する。
【００１３】β−ラクタマーゼ、アルカリ性フォスファ
ターゼ、マルトース結合タンパク質、アラビノース結合
タンパク質は、上記大腸菌のペリプラズムに存在するも
のであるが、これらタンパク質は、合成後、ペリプラズ
ムへ分泌される時、細胞質膜外へ分泌されるのに必要な
シグナルペプチドを有することが特徴であり、このシグ
ナルペプチドは、細胞質膜外へ分泌される際に切除され
る。本発明も、このシグナルペプチドを利用し、ペリプ
ラズムへ目的産物を分泌できるようにする。
ターゼ、マルトース結合タンパク質、アラビノース結合
タンパク質は、上記大腸菌のペリプラズムに存在するも
のであるが、これらタンパク質は、合成後、ペリプラズ
ムへ分泌される時、細胞質膜外へ分泌されるのに必要な
シグナルペプチドを有することが特徴であり、このシグ
ナルペプチドは、細胞質膜外へ分泌される際に切除され
る。本発明も、このシグナルペプチドを利用し、ペリプ
ラズムへ目的産物を分泌できるようにする。
【００１４】本発明において目的産物とは、遺伝子を導
入して得られる全てのタンパク質またはポリペプチドで
あり、具体例としては、インシュリン、インターフェロ
ン（α，β，γ）、成長ホルモン、プロテアーゼ（トリ
プシン、キモトリプシン等）、キモシン、ソマトスタチ
ン、β−エンドルフィン、インベルターゼ等である。
入して得られる全てのタンパク質またはポリペプチドで
あり、具体例としては、インシュリン、インターフェロ
ン（α，β，γ）、成長ホルモン、プロテアーゼ（トリ
プシン、キモトリプシン等）、キモシン、ソマトスタチ
ン、β−エンドルフィン、インベルターゼ等である。
【００１５】また、目的産物として、β−ラクタマーゼ
などのマーカーとしても使用可能なタンパク質（抗生物
質耐性遺伝子）を用いることもできる。
などのマーカーとしても使用可能なタンパク質（抗生物
質耐性遺伝子）を用いることもできる。
【００１６】次に、目的産物を細胞外に放出するために
必要なベクターについて説明する。 １．宿主とするラン藻のベクターは、シネココッカスや
シネコキスチス由来のものは、アメリカン タイプ ア
ンド カルチャー コレクション（American Type and
Culture Collection）や遺伝子バンクから入手でき、こ
のようなベクターとしては、例えば、ｐＵＣ３０３、ｐ
ＤＦ３０、ｐＳＧ１１１、ｐＰＵＣ２９等が挙げられ
る。 ２．入手したベクターに、転写開始点より下流で、翻訳
開始より上流に、下記表１に示すようなアミノ酸配列を
コードしたＤＮＡ配列（シグナル配列と呼ぶ）を挿入
し、次に目的物質の構造遺伝子をコドンフレームが合う
ように接続する。この際、シグナル配列と構造遺伝子と
の間を橋渡しする介在配列があってもよい。表１．シグナル配列 アルカリフォスファターゼ Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Arg β−ラクタマーゼ Met Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His マルトース結合タンパク質 Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys アラビノース結合タンパク質 Met Lys Thr Lys Leu Val Leu Gly Ala Val Ile Leu Thr Ala Gly Leu Ser Gly Ala Ala Glu 宿主とするラン藻のベクターがない場合は、Ｅ．ｃｏｌ
ｉのプラスミドベクターを用いて上記のものを作り、該
ラン藻の内在プラスミドを取り出して、Ｅ．ｃｏｌｉの
プラスミドベクターにつなげるか、あるいはリニアーに
してから、その両端に宿主の核ＤＮＡのランダムフラグ
メントをつなげたものを使用してもよい。 ３．構造遺伝子の下流に転写終結配列を入れておく。 ４．通常は目的の遺伝子のほかに、形質転換体を選別す
るために、クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼなど、抗生物質耐性遺伝子を同じベクターに乗せ
ておく。 ５．プロモーターや転写終結配列は、大腸菌用のベクタ
ーのものを使うことができる。
必要なベクターについて説明する。 １．宿主とするラン藻のベクターは、シネココッカスや
シネコキスチス由来のものは、アメリカン タイプ ア
ンド カルチャー コレクション（American Type and
Culture Collection）や遺伝子バンクから入手でき、こ
のようなベクターとしては、例えば、ｐＵＣ３０３、ｐ
ＤＦ３０、ｐＳＧ１１１、ｐＰＵＣ２９等が挙げられ
る。 ２．入手したベクターに、転写開始点より下流で、翻訳
開始より上流に、下記表１に示すようなアミノ酸配列を
コードしたＤＮＡ配列（シグナル配列と呼ぶ）を挿入
し、次に目的物質の構造遺伝子をコドンフレームが合う
ように接続する。この際、シグナル配列と構造遺伝子と
の間を橋渡しする介在配列があってもよい。表１．シグナル配列 アルカリフォスファターゼ Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Arg β−ラクタマーゼ Met Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His マルトース結合タンパク質 Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys アラビノース結合タンパク質 Met Lys Thr Lys Leu Val Leu Gly Ala Val Ile Leu Thr Ala Gly Leu Ser Gly Ala Ala Glu 宿主とするラン藻のベクターがない場合は、Ｅ．ｃｏｌ
ｉのプラスミドベクターを用いて上記のものを作り、該
ラン藻の内在プラスミドを取り出して、Ｅ．ｃｏｌｉの
プラスミドベクターにつなげるか、あるいはリニアーに
してから、その両端に宿主の核ＤＮＡのランダムフラグ
メントをつなげたものを使用してもよい。 ３．構造遺伝子の下流に転写終結配列を入れておく。 ４．通常は目的の遺伝子のほかに、形質転換体を選別す
るために、クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼなど、抗生物質耐性遺伝子を同じベクターに乗せ
ておく。 ５．プロモーターや転写終結配列は、大腸菌用のベクタ
ーのものを使うことができる。
【００１７】以上をまとめると、ベクターの構成は下図
のようになる。
のようになる。
【００１８】
【表１】 注１）プロモーターはそれに続く転写開始部位を含む。 注２）介在配列は入れなくてもよい。 注３）転写終結配列は、目的タンパク質の構造遺伝子の
下流ならば、距離は問わない。 注４）これとは独立に、クロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼなど、抗生物質耐性遺伝子を入れる
こともできる。
下流ならば、距離は問わない。 注４）これとは独立に、クロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼなど、抗生物質耐性遺伝子を入れる
こともできる。
【００１９】本発明において、宿主として使用されるラ
ン藻としては、シネコキスチス属、シネココッカス属、
ノストック属、スピルリナ属、アナベナ属が挙げられる
が、特に好ましいものとしては、シネコキスチス属、シ
ネココッカス属が挙げられる。
ン藻としては、シネコキスチス属、シネココッカス属、
ノストック属、スピルリナ属、アナベナ属が挙げられる
が、特に好ましいものとしては、シネコキスチス属、シ
ネココッカス属が挙げられる。
【００２０】次に、上記のように調製したＤＮＡを、以
下のようにして宿主に導入して形質転換を行う。
下のようにして宿主に導入して形質転換を行う。
【００２１】本発明におけるＤＮＡの導入法としては、
自然取込法、リポソーム法、パーティクルガン法など色
々あるが、電気穿孔法が最も一般的であり、形質転換効
率も高いため、この方法を用いるのが好ましい。
自然取込法、リポソーム法、パーティクルガン法など色
々あるが、電気穿孔法が最も一般的であり、形質転換効
率も高いため、この方法を用いるのが好ましい。
【００２２】上記電気穿孔を行なう場合、宿主となるラ
ン藻が、シネコキスチス、シネココッカスなどの単細胞
の場合は、そのまま１ｍＭ ＨＥＰＥＳ （N-2-hydrox
yethylpeperazine-N'-2-ethanesulfonic acid,pH 7.2）
溶液に懸濁し、ベクターＤＮＡを混ぜて、氷で冷やしな
がら電極間に５−１０ KV/cmの電気パルスを数回加えて
行なう。
ン藻が、シネコキスチス、シネココッカスなどの単細胞
の場合は、そのまま１ｍＭ ＨＥＰＥＳ （N-2-hydrox
yethylpeperazine-N'-2-ethanesulfonic acid,pH 7.2）
溶液に懸濁し、ベクターＤＮＡを混ぜて、氷で冷やしな
がら電極間に５−１０ KV/cmの電気パルスを数回加えて
行なう。
【００２３】一方、ノストック、スピルリナやアナベナ
などの糸状体ラン藻の場合は、超音波で糸状体をバラバ
ラにしてから上記と同様にして、電気穿孔を行う。
などの糸状体ラン藻の場合は、超音波で糸状体をバラバ
ラにしてから上記と同様にして、電気穿孔を行う。
【００２４】このようにして得られた形質転換体は、ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなど抗
生物質を含む寒天プレートに播いて、形質転換株を分離
する。
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなど抗
生物質を含む寒天プレートに播いて、形質転換株を分離
する。
【００２５】次に、このようにして得た形質転換体から
遺伝子産物を細胞外に放出する方法について説明する。
遺伝子産物を細胞外に放出する方法について説明する。
【００２６】上記で得られたラン藻の形質転換体は、ラ
ン藻の形質転換体１ｇ当たり、０．１〜１０リットルの
培養液で、２０℃〜４０℃で、２４〜１２０時間培養す
る。次に、遠心により、細胞を沈殿させ上清を除く。
ン藻の形質転換体１ｇ当たり、０．１〜１０リットルの
培養液で、２０℃〜４０℃で、２４〜１２０時間培養す
る。次に、遠心により、細胞を沈殿させ上清を除く。
【００２７】通常使用する上記培養液の組成は、Ｎ源と
して、例えばＮＯ3 −を使用する場合は、ＮＯ3 −を２
０〜３０００mg／Ｌ、ＰＯ4 3-を５〜１０００mg／Ｌ、
Ｋ+を５〜１５００mg／Ｌ、Ｍｇ2+を２〜１０００mg／
Ｌ、Ｃａ2+を５〜５００mg／Ｌ、ＳＯ4 2-を５〜２５０
０mg／Ｌ程度を含み、更に微量元素として、Ｆｅ、Ｍ
ｎ、Ｂ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｃｌ、Ｍｏを含み、必要に応じ
て、Ｃｏ、Ｎｉ、ＥＤＴＡ、ビタミン類等を含む。海洋
性ラン藻では、ＮａＣｌを必要に応じ、５０ｇ／Ｌ程度
まで加える。このような培地の代表例として、淡水性ラ
ン藻用のＢＧ−１１、海洋性ラン藻用のＭｅｄｉｕｍＡ
が挙げられる。
して、例えばＮＯ3 −を使用する場合は、ＮＯ3 −を２
０〜３０００mg／Ｌ、ＰＯ4 3-を５〜１０００mg／Ｌ、
Ｋ+を５〜１５００mg／Ｌ、Ｍｇ2+を２〜１０００mg／
Ｌ、Ｃａ2+を５〜５００mg／Ｌ、ＳＯ4 2-を５〜２５０
０mg／Ｌ程度を含み、更に微量元素として、Ｆｅ、Ｍ
ｎ、Ｂ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｃｌ、Ｍｏを含み、必要に応じ
て、Ｃｏ、Ｎｉ、ＥＤＴＡ、ビタミン類等を含む。海洋
性ラン藻では、ＮａＣｌを必要に応じ、５０ｇ／Ｌ程度
まで加える。このような培地の代表例として、淡水性ラ
ン藻用のＢＧ−１１、海洋性ラン藻用のＭｅｄｉｕｍＡ
が挙げられる。
【００２８】次に、上記培地成分の塩類を除いて浸透圧
を下げるようにした培地（低張培地）を用意し、上記の
細胞に加えて懸濁させる。該低張液は、塩類を除くこと
によって浸透圧を下げるように調製したものであるが、
必ずしも塩類を全て除く必要はなく、塩類の総量として
０〜５００ｍＭ含んでいてもよい。
を下げるようにした培地（低張培地）を用意し、上記の
細胞に加えて懸濁させる。該低張液は、塩類を除くこと
によって浸透圧を下げるように調製したものであるが、
必ずしも塩類を全て除く必要はなく、塩類の総量として
０〜５００ｍＭ含んでいてもよい。
【００２９】また、本発明における、低張液とは、上記
溶液に限らず、それまで培養に使用していた培地より塩
濃度が低い全ての培養液を含み、目的産物の放出を有効
に行わせるためには、もとの培養液の濃度の２分の１以
下のものが望ましい。
溶液に限らず、それまで培養に使用していた培地より塩
濃度が低い全ての培養液を含み、目的産物の放出を有効
に行わせるためには、もとの培養液の濃度の２分の１以
下のものが望ましい。
【００３０】またグルコース、ショ糖などの有機物質を
培地に加えて成育させている場合は、無機塩の濃度を下
げなくても、該有機物質の濃度を下げたものも、本発明
における低張液に含まれる。この場合の該有機物質の低
張液中の濃度は、０〜５００ｍＭが望ましい。
培地に加えて成育させている場合は、無機塩の濃度を下
げなくても、該有機物質の濃度を下げたものも、本発明
における低張液に含まれる。この場合の該有機物質の低
張液中の濃度は、０〜５００ｍＭが望ましい。
【００３１】以上のような操作により、低張液で培養
後、数分以内で遺伝子産物の放出が起こり、一時間でほ
ぼ放出が完了し、そして遺伝子産物は一定濃度に達す
る。
後、数分以内で遺伝子産物の放出が起こり、一時間でほ
ぼ放出が完了し、そして遺伝子産物は一定濃度に達す
る。
【００３２】放出された目的産物は、種々のタンパク質
分離法、例えば、ゲル濾過、イオン交換カラム等の公知
の方法に従い、分離精製する。
分離法、例えば、ゲル濾過、イオン交換カラム等の公知
の方法に従い、分離精製する。
【００３３】上記目的物質であるタンパク質は、宿主と
するラン藻や使用するシグナルペプチドによっても、そ
の生成能が異なり、ラン藻とシグナルペプチドの好まし
い組合わせとしては、シネココッカスとβ−ラクタマー
ゼ、シネコキスティスとβ−ラクタマーゼ、アナベナと
アルカリフォスファターゼ、ノストックとアルカリフォ
スファターゼが挙げられ、特に好ましいのは、シネココ
ッカスとβ−ラクタマーゼである。
するラン藻や使用するシグナルペプチドによっても、そ
の生成能が異なり、ラン藻とシグナルペプチドの好まし
い組合わせとしては、シネココッカスとβ−ラクタマー
ゼ、シネコキスティスとβ−ラクタマーゼ、アナベナと
アルカリフォスファターゼ、ノストックとアルカリフォ
スファターゼが挙げられ、特に好ましいのは、シネココ
ッカスとβ−ラクタマーゼである。
【００３４】本発明の別の側面として、目的物質を繰り
返し回収することができる。即ち、一度、使用した培養
細胞を、再び正常培地に戻して、前記と同様の条件で、
再び培養をし、再び低張液に移すことで目的物質を生成
することができる。
返し回収することができる。即ち、一度、使用した培養
細胞を、再び正常培地に戻して、前記と同様の条件で、
再び培養をし、再び低張液に移すことで目的物質を生成
することができる。
【００３５】この場合、該形質転換体を、１日〜５日
間、同様の条件で培養することで、活力を回復し、再び
低張培地に代えることで、前記と同様、目的物質を細胞
外へ放出させることができる。このような操作を繰り返
せば、長期間継続的に放出を繰り返すことができる。
間、同様の条件で培養することで、活力を回復し、再び
低張培地に代えることで、前記と同様、目的物質を細胞
外へ放出させることができる。このような操作を繰り返
せば、長期間継続的に放出を繰り返すことができる。
【００３６】従来の、例えば大腸菌では、繰り返し培養
すると、目的の遺伝子産物が止まってしまうことに比
べ、ラン藻では長い寿命が期待できるということは、本
発明によって奏される極めて顕著な効果である。
すると、目的の遺伝子産物が止まってしまうことに比
べ、ラン藻では長い寿命が期待できるということは、本
発明によって奏される極めて顕著な効果である。
【００３７】上記に必要なラン藻は多くの株が内外のカ
ルチャーコレクションに登録されており、利用可能であ
る。浸透圧の変化を利用するものであるから海洋性、好
塩性の株、例えば、シネココッカス sp.PCC 7002、アナ
ベナ sp.ATCC 33047、オシラトリア sp.PCC 6401、シュ
ードアナベナ sp.CCAP 1464/3 、スピルリナ サブサル
サ CCAP 1475/2などが望ましい。
ルチャーコレクションに登録されており、利用可能であ
る。浸透圧の変化を利用するものであるから海洋性、好
塩性の株、例えば、シネココッカス sp.PCC 7002、アナ
ベナ sp.ATCC 33047、オシラトリア sp.PCC 6401、シュ
ードアナベナ sp.CCAP 1464/3 、スピルリナ サブサル
サ CCAP 1475/2などが望ましい。
【００３８】ラン藻はＥ．ｃｏｌｉと同じくグラム陰性
菌に属し、細胞外壁と細胞質膜の間に全細胞容量の２０
−４０％に及ぶペリプラズム空間が存在する。本発明は
Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムに蓄積されるタンパク質を
ラン藻で遺伝子工学的につくるとラン藻においてもペリ
プラズムに蓄積され、細胞を低張液中に移すとそれが細
胞外に放出されるという、本発明で初めて見出された知
見に基づいている。
菌に属し、細胞外壁と細胞質膜の間に全細胞容量の２０
−４０％に及ぶペリプラズム空間が存在する。本発明は
Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムに蓄積されるタンパク質を
ラン藻で遺伝子工学的につくるとラン藻においてもペリ
プラズムに蓄積され、細胞を低張液中に移すとそれが細
胞外に放出されるという、本発明で初めて見出された知
見に基づいている。
【００３９】ラン藻は元来、貧栄養環境下で生息し、耐
久性において勝れている。中には砂漠のような劣悪環境
でも数十年間生存する種が発見されている。従って応用
面で期待されるのは固定化してバイオリアクターやバイ
オセンサーとすることである。従来のたとえば大腸菌で
は菌がすぐに弱って、目的の遺伝子産物が止まってしま
うが、ラン藻では長い寿命が期待できる。
久性において勝れている。中には砂漠のような劣悪環境
でも数十年間生存する種が発見されている。従って応用
面で期待されるのは固定化してバイオリアクターやバイ
オセンサーとすることである。従来のたとえば大腸菌で
は菌がすぐに弱って、目的の遺伝子産物が止まってしま
うが、ラン藻では長い寿命が期待できる。
【００４０】
【発明の効果】本発明では、遺伝子工学的手法で生産す
る外来遺伝子の産物を、ラン藻を用いることにより精製
を容易にし、さらに、該遺伝子産物を細胞外に、繰り返
し放出することができるようになった。
る外来遺伝子の産物を、ラン藻を用いることにより精製
を容易にし、さらに、該遺伝子産物を細胞外に、繰り返
し放出することができるようになった。
【００４１】以下、本発明を実施例により具体的に説明
する。
する。
【００４２】
【実施例】大腸菌のβ−ラクタマーゼ遺伝子をラン藻シ
ネココッカスに導入して形質転換を行い、β−ラクタマ
ーゼを細胞外に放出させる例を示す。シネココッカスは
パスツール研究所カルチャーコレクションに保存されて
いるPCC7002 株を用いた。 （１）Synechococcus sp.PCC7002の菌株を、Medium A培
地(J.Physol.,9,427 (1973))300ml に加え、500ml のエ
ーレンマイヤーフラスコ中で蛍光灯照射下、1%ＣＯ2 の
空気を通じながら、ＯＤ550 ２まで培養する。 （２）この細胞から、公知の方法でプラスミドを分離(M
ethods in Enzymology,153,199,(1987)) し、アガロー
スゲル電気泳動にかけて、最小サイズのプラスミドpAQ1
のバンドを切り取り、ジーンクリーン（バイオラッド）
で精製して約１μg の該バンドを得た。 （３）β−ラクタマーゼ遺伝子をコードしているE.coli
プラスミドベクターpBR322（ファルマシア）２μg を制
限酵素Hind IIIで切断し、アルカリフォスファターゼ(C
alf Intestine,宝酒造）で脱リン酸処理をしてジーンク
リーンで精製した。またpAQ1プラスミド１μg を制限酵
素Hind IIIで切断し、ジーンクリーンで精製した。この
両者の混合液をＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）で処理し
てライゲーション反応を行った。その反応液を用いてE.
coli DH5αMCR(Bethesda ResearchLab.) をカルシウム
法により形質転換した。この液をアンピシリン50μg/ml
を含む寒天プレートに播いて形質転換株を選抜した。そ
の一株を10ml培養して公知の方法で（村松正 編：ラボ
マニュアル遺伝子工学、丸善（１９８８））プラスミド
pAQE1 を１０μg 得た。 （４）Synechococcus sp.PCC7002株をＯＤ550 １まで
培養し、この3ml を集菌し、１mM HEPES溶液で３回洗浄
してから３mlの1mM HEPES に懸濁した。この0.8ml を電
気穿孔装置（エレクトリックセルボーラー、理工学研究
所）のセルに入れ、３μｇのプラスミドpAQE1 を混ぜ、
氷で冷やしながら、6.5 KV/cm（半減期2msec) の電気
パルスを２回加えた。これを１％寒天−Medium Aプレー
トに塗布し、減光下、３０℃で終夜置いた後、アンピシ
リン（２．５μｇ／ｍｌ）を含む０．６％寒天を重層し
て３７℃、2000 lx の蛍光灯下で培養し、形質転換体コ
ロニーを得た。 （５）こうして得たSynechococcus sp. PCC7002 の形質
転換株はまず、アンピシリンを含まないMedium Aで一日
培養し、次に、アンピシリンを加えて終濃度０．５μｇ
／ｍｌとし、増殖させた。 （６）成長期の培養液を10mlとって遠心し、上清を捨て
る。Medium AからNaCl(300 mM)を除いた低張培地を用意
し、10ml加え、室温に所定の時間（１０分−１８０分）
放置した。 （７）培養液１mlを採取し、遠心し、上清 0.3mlをとっ
た。それに0.2ml の300mM リン酸バッファー（60mM Ｋ
2 ＨＰＯ4 ，40mM ＫＨ2 ＰＯ4 ，300mM ＮａＣｌ，ｐ
Ｈ７) 、0.1ml の0.5mg/mlニトロセフィン（ユニパス）
を加えて３０℃、１０分インキュベートした。その溶液
を分光計（日立分光光度計Ｕ１１００）のセルに移し、
４９５nmの吸光度を測定したところ、β−ラクタマーゼ
の活性を示す顕著な吸収があった。 （８）（６）の低張培地のカルチャーを遠心し、上清を
除き、通常のMedium A培地10 ml を加え、一昼夜培養し
て後、再び、（６）と同じように低張培地に代え、ニト
ロセフィンによるβ−ラクタマーゼの活性を測った。最
近の測定とほぼ同程度の活性が得られた。また、細胞密
度を比較しても殆ど変化はなく、殆どの細胞が生存して
いることが示された。
ネココッカスに導入して形質転換を行い、β−ラクタマ
ーゼを細胞外に放出させる例を示す。シネココッカスは
パスツール研究所カルチャーコレクションに保存されて
いるPCC7002 株を用いた。 （１）Synechococcus sp.PCC7002の菌株を、Medium A培
地(J.Physol.,9,427 (1973))300ml に加え、500ml のエ
ーレンマイヤーフラスコ中で蛍光灯照射下、1%ＣＯ2 の
空気を通じながら、ＯＤ550 ２まで培養する。 （２）この細胞から、公知の方法でプラスミドを分離(M
ethods in Enzymology,153,199,(1987)) し、アガロー
スゲル電気泳動にかけて、最小サイズのプラスミドpAQ1
のバンドを切り取り、ジーンクリーン（バイオラッド）
で精製して約１μg の該バンドを得た。 （３）β−ラクタマーゼ遺伝子をコードしているE.coli
プラスミドベクターpBR322（ファルマシア）２μg を制
限酵素Hind IIIで切断し、アルカリフォスファターゼ(C
alf Intestine,宝酒造）で脱リン酸処理をしてジーンク
リーンで精製した。またpAQ1プラスミド１μg を制限酵
素Hind IIIで切断し、ジーンクリーンで精製した。この
両者の混合液をＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）で処理し
てライゲーション反応を行った。その反応液を用いてE.
coli DH5αMCR(Bethesda ResearchLab.) をカルシウム
法により形質転換した。この液をアンピシリン50μg/ml
を含む寒天プレートに播いて形質転換株を選抜した。そ
の一株を10ml培養して公知の方法で（村松正 編：ラボ
マニュアル遺伝子工学、丸善（１９８８））プラスミド
pAQE1 を１０μg 得た。 （４）Synechococcus sp.PCC7002株をＯＤ550 １まで
培養し、この3ml を集菌し、１mM HEPES溶液で３回洗浄
してから３mlの1mM HEPES に懸濁した。この0.8ml を電
気穿孔装置（エレクトリックセルボーラー、理工学研究
所）のセルに入れ、３μｇのプラスミドpAQE1 を混ぜ、
氷で冷やしながら、6.5 KV/cm（半減期2msec) の電気
パルスを２回加えた。これを１％寒天−Medium Aプレー
トに塗布し、減光下、３０℃で終夜置いた後、アンピシ
リン（２．５μｇ／ｍｌ）を含む０．６％寒天を重層し
て３７℃、2000 lx の蛍光灯下で培養し、形質転換体コ
ロニーを得た。 （５）こうして得たSynechococcus sp. PCC7002 の形質
転換株はまず、アンピシリンを含まないMedium Aで一日
培養し、次に、アンピシリンを加えて終濃度０．５μｇ
／ｍｌとし、増殖させた。 （６）成長期の培養液を10mlとって遠心し、上清を捨て
る。Medium AからNaCl(300 mM)を除いた低張培地を用意
し、10ml加え、室温に所定の時間（１０分−１８０分）
放置した。 （７）培養液１mlを採取し、遠心し、上清 0.3mlをとっ
た。それに0.2ml の300mM リン酸バッファー（60mM Ｋ
2 ＨＰＯ4 ，40mM ＫＨ2 ＰＯ4 ，300mM ＮａＣｌ，ｐ
Ｈ７) 、0.1ml の0.5mg/mlニトロセフィン（ユニパス）
を加えて３０℃、１０分インキュベートした。その溶液
を分光計（日立分光光度計Ｕ１１００）のセルに移し、
４９５nmの吸光度を測定したところ、β−ラクタマーゼ
の活性を示す顕著な吸収があった。 （８）（６）の低張培地のカルチャーを遠心し、上清を
除き、通常のMedium A培地10 ml を加え、一昼夜培養し
て後、再び、（６）と同じように低張培地に代え、ニト
ロセフィンによるβ−ラクタマーゼの活性を測った。最
近の測定とほぼ同程度の活性が得られた。また、細胞密
度を比較しても殆ど変化はなく、殆どの細胞が生存して
いることが示された。
【００４３】ＭｅｄｉｕｍＡの組成 ＮａＣｌ １８．０ （ｇ／Ｌ） ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ５．０ （ 〃 ） ＮａＮＯ3 １．０ （ 〃 ） ＫＣｌ ０．６ （ 〃 ） ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ０．３７ （ 〃 ） Trizma base １．０ （ 〃 ） Ｎａ2 ＥＤＴＡ ０．０３ （ 〃 ） Ｈ3 ＢＯ3 ３４．３ （ｍｇ／Ｌ） ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ ４．３ （ 〃 ） ＦｅＣｌ3 ・６Ｈ2 Ｏ ３．８９ （ 〃 ） ＺｎＣｌ2 ０．３１５ （ 〃 ） ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ０．０１２２（ 〃 ） ＭｏＯ3 ０．０３ （ 〃 ） ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．００３ （ 〃 ） vitamin Ｂ12 ０．００４ （ 〃 ）
【００４４】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr 1 5 10 15 Pro Val Thr Lys Ala Arg 20 配列番号：２ 配列の長さ：２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala 1 5 10 15 Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His 20 配列番号：３ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr 1 5 10 15 Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys 20 25 配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Lys Thr Lys Leu Val Leu Gly Ala Val Ile Leu Thr Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ser Gly Ala Ala Glu 20
【図１】Synechococcus sp.PCC7002中でβ−ラクタマー
ゼを発現するプラスミドベクターpAQE1.
ゼを発現するプラスミドベクターpAQE1.
【図２】Synechococcus sp.PCC7002形質転換体によるβ
−ラクタマーゼの細胞外放出 形質転換株（○）、野性株（△）
−ラクタマーゼの細胞外放出 形質転換株（○）、野性株（△）
【図３】Synechococcus sp.PCC7002形質転換体によるβ
−ラクタマーゼの細胞外放出の繰返しと細胞密度
−ラクタマーゼの細胞外放出の繰返しと細胞密度
Claims (1)
- 【請求項１】 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのペ
リプラズムに存在するタンパク質であるβ−ラクタマー
ゼ、アルカリ性フォスファターゼ、マルトース結合タン
パク質、またはアラビノース結合タンパク質の遺伝子の
シグナル配列、あるいはシグナル配列とそれに続くいく
つかのアミノ酸をコードする部分配列を、目的産物の構
造遺伝子のＮ末端に挿入したラン藻の組換え用ベクター
をラン藻に導入した形質転換体を通常培地で成育させて
から、低張液に移すことを特徴とする遺伝子産物の製造
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6026255A JP2590422B2 (ja) | 1994-01-27 | 1994-01-27 | ラン藻を用いた大腸菌の遺伝子産物の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6026255A JP2590422B2 (ja) | 1994-01-27 | 1994-01-27 | ラン藻を用いた大腸菌の遺伝子産物の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07203949A JPH07203949A (ja) | 1995-08-08 |
| JP2590422B2 true JP2590422B2 (ja) | 1997-03-12 |
Family
ID=12188160
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6026255A Expired - Lifetime JP2590422B2 (ja) | 1994-01-27 | 1994-01-27 | ラン藻を用いた大腸菌の遺伝子産物の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2590422B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021100642A1 (ja) * | 2019-11-21 | 2021-05-27 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | 改変シアノバクテリア、改変シアノバクテリアの製造方法、及び、タンパク質の製造方法 |
-
1994
- 1994-01-27 JP JP6026255A patent/JP2590422B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| DATABASE BIOSIS ON DIALOG.BIOSIS * |
| EUR J.BIOCHEM=1989 * |
| J.BACTERIOL=1989 * |
| MOL GEN GENET=1989 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07203949A (ja) | 1995-08-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2963695B2 (ja) | クローン化リゾスタフィン遺伝子の発現 | |
| JP2980626B2 (ja) | ペクチン酸リアーゼのシグナル配列を含む新規プラスミドベクター | |
| JP5591447B2 (ja) | ペプチドを直接発現させるための改良型細菌宿主細胞 | |
| JP2002501379A (ja) | 培地へのペプチドの直接発現 | |
| EP0460709B1 (en) | AraB promoters and method of producing polypeptides, including cecropins, by microbiological techniques | |
| JPH0714348B2 (ja) | 細菌生産物の外在化に用いるｄｎａフラグメントおよび細菌 | |
| PT97081B (pt) | Processo para a preparacao de vectores bacterianos | |
| EP0587427B1 (en) | Process for the production of human growth hormone | |
| EP1019487A1 (en) | Expression control sequences | |
| WO2008100833A2 (en) | Production of recombinant collagenases colg and colh in escherichia coli | |
| CN117126754A (zh) | 重组i型胶原蛋白毕赤酵母工程菌及其构建方法与应用 | |
| JP2590422B2 (ja) | ラン藻を用いた大腸菌の遺伝子産物の製造方法 | |
| SE459816B (sv) | Vektor med stark genexpression | |
| EP1252291B1 (en) | Flavobacterium heparinum expression system | |
| RU2376368C2 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHINS21 - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА С ПРОИНСУЛИНОМ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА | |
| CA1275954C (en) | 3'-expression enhancing fragments and method | |
| RU2153535C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк psav27, кодирующая синтез растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii, и бактериальный штамм escherichia coli - продуцент растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii | |
| US20030077830A1 (en) | Ketogulonigenium endogenous plasmids | |
| RU2144082C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок-предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка-предшественника инсулина человека (варианты) и способ получения инсулина человека | |
| US5047334A (en) | Novel prokaryotic expression and secretion system | |
| Ben-Gurion et al. | New antibiotic substance produced by Salmonella Typhimurium LT2 | |
| RU1770359C (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК pJDB (MSIL), обеспечивающа синтез интерлейкина-2 человека в клетках дрожжей SасснаRомUсеS ceReUISIaL, способ ее получени и штамм дрожжей SасснаRомYсеS ceReUISIaL - продуцент интерлейкина-2 человека | |
| JPH03130088A (ja) | 組み替えｄｎａ法によるポリペプチドの製造法 | |
| JPH04349888A (ja) | マルトテトラオース生成酵素遺伝子を含有するプラスミド及び該プラスミドを有する微生物並びに該微生物を用いるマルトテトラオース生成酵素の製造法 | |
| JPH0779781A (ja) | 蛋白排出遺伝子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |